WO2023136229A1 - 薬剤の、心筋細胞に対する作用を評価する方法 - Google Patents

薬剤の、心筋細胞に対する作用を評価する方法 Download PDF

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WO2023136229A1
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cardiomyocytes
culture
drug
methyl
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久陽 矢内
淳 ▲高▼橋
任信 西條
徹 角田
勝弘 江刺家
寛 宮廻
賢太郎 石田
有香 田中
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Mitsui Chemicals Inc
Myoridge Co Ltd
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Mitsui Chemicals Inc
Myoridge Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • One aspect of the present invention relates to a method for evaluating the effect of a drug on cardiomyocytes.
  • Candidate drugs for new drugs are evaluated for the presence or absence of the expected action (main action) in an in vitro test system, and only those with high efficacy proceed to the next development process. Therefore, it is important that an in vitro test system be able to detect the action of a drug at low concentrations and have few false positive detections.
  • a drug that has advanced to clinical development may be discontinued as a new drug if serious side effects are found.
  • Cardiotoxicity especially lethal arrhythmia
  • drugs that have been put on the market not only drugs in the field of cardiovascular drugs, but also anti-allergic drugs, drugs for gastrointestinal treatment, antibacterial drugs, etc. are often withdrawn from the market due to the occurrence of cardiotoxicity. Therefore, in the early stages of drug discovery, it is necessary not only to detect the main effects of drugs, but also to assess cardiotoxicity.
  • Non-Patent Document 1 cardiomyocytes differentiated from iPS cells are treated with a trypsin solution, seeded in a culture medium for cardiomyocytes, and cultured to create beating sheet-like cardiomyocytes. and exposing the resulting sheet-like cardiomyocytes to a drug within a certain concentration range, and measuring electrophysiological changes in the cardiomyocytes by extracellular potential recording. Further, Patent Literature 1 discloses a drug responsiveness test method for cardiomyocytes, in which the rate of oxygen supply to cardiomyocytes is increased by a configuration for increasing the amount of oxygen supplied to cardiomyocytes.
  • in vitro test systems capable of accurately evaluating cardiotoxicity as well as detecting the main effects of drugs are needed. I thought construction was an important issue.
  • the conventional in vitro test system depending on the drug, it was sometimes impossible to evaluate the effect on cardiomyocytes.
  • the effects of certain drugs cannot be detected at low drug concentrations, and are difficult to detect in in vitro test systems, since cardiomyocyte pulsation is halted at high drug concentrations.
  • the proarrhythmia effect of bepridil is an example of this.
  • the sensitivity is not sufficiently high, for example, the effect on cardiomyocytes cannot be detected unless the concentration of the drug is increased.
  • many false positives were detected, such as detection of non-specific effects.
  • One aspect of the present invention provides a method capable of accurately evaluating the action of a drug on myocardial cells.
  • a method for evaluating the effect of a drug on cardiomyocytes comprising: a step of seeding cardiomyocytes on the culture surface of the culture vessel (A); step (B) of culturing the cardiomyocytes obtained in step (A); A step (D) of exposing the cultured cardiomyocytes to the agent, and a step (E) of analyzing and evaluating the cell function index of the cardiomyocytes obtained in the step (D), A method, wherein at least a portion of the culture surface of the culture vessel is formed from a substrate comprising a 4-methyl-1-pentene polymer.
  • the medium ( ⁇ ) further contains 1 to 100 ⁇ g/mL lysophosphatidylcholine, 1 to 100 ⁇ g/mL triacylglyceride, 1 to 100 ⁇ g/mL phosphatidylcholine, 1 to 100 ⁇ g/mL phosphatidic acid, and 0.1 to 10 ⁇ g cholesterol.
  • the 4-methyl-1-pentene polymer is at least one selected from 4-methyl-1-pentene, ethylene and ⁇ -olefins having 3 to 20 carbon atoms (excluding 4-methyl-1-pentene)
  • the action of a drug on cardiomyocytes can be evaluated with high accuracy. More specifically, according to one aspect of the present invention, the effects of drugs can be evaluated even at low concentrations. Further, according to one aspect of the present invention, false positives can be reduced. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to one aspect of the present invention, it is possible to detect the action of a drug, which was considered difficult to detect in a conventional in vitro test system using iPS cell-derived cardiomyocytes or the like.
  • FIG. 1 shows the results of comparing the expression levels of cTnT, MYL2, Kir2.1, and PGC1 ⁇ when using a C plate or a T plate.
  • FIG. 2 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 0.1% DMSO was added. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 3 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 1 ⁇ M bepridil was added. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second. Arrows in the figure indicate EAD-like waveforms.
  • FIG. 4 shows an enlarged EAD-like waveform in the calcium ion waveform of FIG. FIG.
  • FIG. 5 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 2 ⁇ M bepridil was added. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 6 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 4 ⁇ M bepridil was added. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 7A shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 11.1 ⁇ M pentamidine was added to the T-plate. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second. Results before addition (pre), 10 minutes after addition (10 min), 24 hours after addition (24 h), and 48 hours after addition (48 h) are shown.
  • FIG. 7B shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 11.1 ⁇ M pentamidine was added to the C plate.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • Results before addition (pre), 10 minutes after addition (10 min), 24 hours after addition (24 h), and 48 hours after addition (48 h) are shown.
  • FIG. 8A shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 33.3 ⁇ M pentamidine was added to the T-plate.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • Results before addition (pre), 10 minutes after addition (10 min), 24 hours after addition (24 h), and 48 hours after addition (48 h) are shown.
  • FIG. 8B shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 33.3 ⁇ M pentamidine was added to the C plate.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • Results before addition (pre), 10 minutes after addition (10 min), 24 hours after addition (24 h), and 48 hours after addition (48 h) are shown.
  • FIG. 9A shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 100 ⁇ M pentamidine was added to the T-plate.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • Results before addition (pre), 10 minutes after addition (10 min), 24 hours after addition (24 h), and 48 hours after addition (48 h) are shown.
  • FIG. 9B shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 100 ⁇ M pentamidine was added to the C plate.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second. Results before addition (pre), 10 minutes after addition (10 min), 24 hours after addition (24 h), and 48 hours after addition (48 h) are shown.
  • FIG. 10 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 20 nM isoproterenol was added. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 11 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 100 nM isoproterenol was added. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 12 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 500 nM isoproterenol was added.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 13 shows photographs of myocardial cells observed under a microscope using a G plate, a T plate, and a V plate. The upper row is a photograph of observation in a bright field, and the lower row is a photograph of fluorescence of GCaMP observed with a fluorescence microscope. The objective magnification is 4x for both the upper limit and the lower level.
  • FIG. 14 shows the calcium ion waveform of myocardial cells when 0.1% DMSO was added using a T plate. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 15 shows the calcium ion waveform of myocardial cells when 0.1% DMSO was added using a G plate. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 16 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 0.06 ⁇ M bepridil was added using a T plate. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 17 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 0.06 ⁇ M bepridil was added using G plate. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 18 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 0.25 ⁇ M bepridil was added using a T plate.
  • FIG. 19 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 0.25 ⁇ M bepridil was added using G plate.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 20 shows calcium ion waveforms of cardiomyocytes when 1 ⁇ M bepridil was added using a T plate.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 21 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 1 ⁇ M bepridil was added using G plate.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 22 shows the calcium ion waveform when 4 ⁇ M bepridil was added using the T-plate.
  • FIG. 23 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when 4 ⁇ M bepridil was added using G plate. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 24 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when verapamil was added at a final concentration of 10 nM. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 25 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when verapamil was added at a final concentration of 100 nM. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 26 is a conceptual diagram explaining CAD30 and CAD80. FIG.
  • FIG. 27 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when verapamil was added at 60 nM to 4 ⁇ M.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 28A is a graph showing CAD30 with verapamil added at 60 nM to 4 ⁇ M and
  • FIG. 28B shows CAD80 with verapamil added.
  • FIG. 29 shows calcium ion waveforms of cardiomyocytes when E-4031 was added at 1 nM to 1000 nM.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 30A is a graph showing CAD30 when E-4031 was added at 1 nM to 1000 nM
  • FIG. 30B is a graph showing CAD80 when E-4031 was added.
  • FIG. 31 shows calcium ion waveforms of cardiomyocytes when bepridil was added at 60 nM to 4 ⁇ M.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 32A is a graph showing CAD30 when bepridil was added at 60 nM to 4 ⁇ M and
  • FIG. 32B is a graph showing CAD80 when bepridil was added at 60 nM to 4 ⁇ M.
  • FIG. 33 shows calcium ion waveforms of cardiomyocytes when bepridil was added at 312 nM to 20 ⁇ M. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 32A is a graph showing CAD30 when bepridil was added at 60 nM to 4 ⁇ M
  • FIG. 32B is a graph showing CAD80 when bepridil was added at 60 nM to 4 ⁇ M.
  • FIG. 33 shows calcium ion waveforms of cardiomyocytes when be
  • FIG. 34A is a graph showing CAD30 when bepridil was added at 312 nM to 20 ⁇ M and FIG. 34B is a graph showing CAD80 when bepridil was added at 312 nM to 20 ⁇ M.
  • FIG. 35 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when risperidone was added at 1 nM to 1 ⁇ M. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 36A is a graph showing CAD30 when risperidone was added at 1 nM to 1 ⁇ M and FIG. 36B is a graph showing CAD80 when risperidone was added at 1 nM to 1 ⁇ M.
  • FIG. 36A is a graph showing CAD30 when risperidone was added at 1 nM to 1 ⁇ M
  • FIG. 36B is a graph showing CAD80 when risperidone was added at 1 nM to 1 ⁇ M.
  • FIG. 37 shows the calcium ion waveform of cardiomyocytes when risperidone was added at 60 nM to 4 ⁇ M.
  • the shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 38A is a graph showing CAD30 when risperidone was added at 60 nM to 4 ⁇ M and
  • FIG. 38B is a graph showing CAD80 when risperidone was added at 60 nM to 4 ⁇ M.
  • FIG. 39 shows calcium ion waveforms of cardiomyocytes when terfenadine was added from 0.25 nM to 16 nM. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • FIG. 38A is a graph showing CAD30 when risperidone was added at 60 nM to 4 ⁇ M
  • FIG. 38B is a graph showing CAD80 when risperidone was added at 60 nM to 4 ⁇ M.
  • FIG. 39 shows calcium
  • FIG. 40A is a graph showing CAD30 with addition of terfenadine from 0.25 nM to 16 nM and FIG. 40B is a graph showing CAD80 with addition of terfenadine.
  • FIG. 41 shows calcium ion waveforms of cardiomyocytes when ranolazine was added at 10 nM to 10000 nM. The shooting time is 20 seconds and the frame rate is 14.23 frames/second.
  • Figure 42A is a graph showing CAD30 with addition of ranolazine from 10 nM to 10000 nM and Figure 42B is a graph showing CAD80 with addition of ranolazine.
  • the vertical axis on the left is Intensity.
  • the vertical axis on the right side is Movement
  • the horizontal axis is Time (frame)
  • the graph shows Fluorescence. 7 to 9
  • the vertical axis represents Intensity
  • the horizontal axis represents Time (frame)
  • the graphs represent Fluorescence. 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, and 42
  • the vertical axis of A indicates CAD30
  • the vertical axis of B indicates CAD80.
  • One aspect of the present invention is a method for evaluating the effect of a drug on cardiomyocytes, comprising the step (A) of seeding cardiomyocytes on the culture surface of a culture vessel, and the cardiomyocytes obtained in step (A)
  • a culture vessel in which at least part of the culture surface is formed from a substrate containing a 4-methyl-1-pentene polymer is referred to as a culture vessel (X).
  • the drug in one aspect of the present invention is not particularly limited, but may be a substance known to act on cardiomyocytes, such as isoproterenol, pentamidine, bepridil, verapamil, E-4031, terfenadine, astemizole, chromanol 293b, mexiletine, nifedipine, propranolol, milrinone, drugs described in Non-Patent Document 1, and the like.
  • isoproterenol, pentamidine, bepridil, verapamil, and E-4031 are preferable because the method of one embodiment of the present invention can accurately evaluate the action on cardiomyocytes.
  • Isoproterenol is a nonselective ⁇ -agonist with tachycardia and cardiotonic effects.
  • Pentamidine which is one of antibacterial agents, has an arrhythmogenic effect.
  • Bepridil is one of the calcium antagonists used for the treatment of angina pectoris, and is known to induce lethal ventricular arrhythmia called torsade de pointes (TdP) and QT prolongation as side effects.
  • Milrinone is a phosphodiesterase III inhibitor and also has tachycardia and cardiotonic effects.
  • Verapamil is an L-type calcium channel inhibitor.
  • E-4031 is a hERG-type potassium channel inhibitor.
  • Terfenadine is an antiallergic drug known to cause QT prolongation.
  • Chromanol 293b is a voltage-gated potassium channel KCNQ1 inhibitor.
  • Mexiletine is a voltage-gated sodium channel inhibitor.
  • Nifedipine is an L-type calcium channel inhibitor.
  • Propranolol is a beta-blocker and has a bradycardic effect.
  • Agents in one aspect of the present invention include, for example, the 28 agents evaluated in Reference A: ibutilide, dl-sotalol, azimilide, dofetilide, quinidine, disopyramide, vandetanib, bepridil, domperidone, ondansetron, astemizole.
  • cisapride pimozide, clarithromycin, risperidone, terfenadine, chlorpromazine, clozapine, ranolazine, metoprolol, mexiletine, loratadine, tamoxifen, nitrendipine, nifedipine, diltiazem, verapamil can also be used.
  • drugs whose risk level is difficult to predict in conventional proarrhythmic models using cardiomyocytes differentiated from iPS cells are preferable, and those whose clinical TdP risk level is high or intermediate risk.
  • the drug may be a substance whose effect on cardiomyocytes is unknown, such as a new drug candidate substance, a substance suspected of having cardiotoxicity, or a candidate substance expected to have a main effect on cardiomyocytes.
  • the drug may be a low-molecular-weight compound included in low-molecular-weight drugs, or a high-molecular-weight compound such as proteins, antibodies, nucleic acids, and polysaccharides included in high-molecular-weight drugs.
  • a drug may be a new substance or a known substance.
  • the action of a drug includes main actions and side effects of the drug.
  • the primary action of a drug on cardiomyocytes is the action that is originally expected among the pharmacological actions of the drug, such as bradycardia action (negative chronotropic action) and tachycardia action (positive chronotropic action). , cardiotonic (positive inotropy), and weak (negative inotropy).
  • the primary effect of the drug on myocardial cells is preferably tachycardia or bradycardia, since the method of the present invention can detect the drug even at low concentrations.
  • a side effect of a drug on cardiomyocytes is a pharmacological action that the drug has that is not related to or interferes with treatment.
  • Side effects on myocardial cells include, for example, cardiotoxicity, and cardiotoxicity includes proarrhythmia, myocardial injury, and the like.
  • Proarrhythmia effects are those that exacerbate existing arrhythmias or cause new arrhythmias, e.g. ), triggered activity arrhythmias, and reentry arrhythmias.
  • Myocardial damaging effects may be irreversible or reversible myocardial damage.
  • the side effect is preferably proarrhythmic, more preferably QT prolongation and early post-depolarization (EAD), since it can be detected with high accuracy by the method of one aspect of the present invention.
  • the side effect is preferably myocardial injury, more preferably mitochondrial toxicity, since it can be detected with high accuracy by the method of one embodiment of the present invention.
  • the method that is one aspect of the present invention can be used to evaluate the safety and efficacy of pharmaceuticals in the drug discovery process. That is, when a substance with an unknown effect on myocardial cells is used as a drug, the main effect or side effect of the substance can be evaluated even at a low concentration, and false positives are difficult to detect. In addition, substances that may be cardiotoxic in subsequent in vivo tests can be detected as predictive cardiotoxic substances in earlier in vitro test systems. In addition, when a substance with a known effect on myocardial cells is used as a drug, the known main effects or side effects of the substance can be confirmed even at low concentrations, or new main effects or side effects of the substance can be evaluated. and false positives are hard to detect. In particular, when a substance that is reported or suspected to have cardiotoxicity in vivo is used as a drug, cardiotoxicity can be detected more easily than in vivo tests, and the mechanism of cardiotoxicity can be analyzed.
  • Cardiomyocytes may be cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells, or primary cultured cardiomyocytes isolated from the heart of an organism.
  • cardiomyocytes obtained by differentiating commercially available pluripotent stem cells for example, iCell Cardiomyocytes from FUJIFILM Cellular Dynamics, MiraCell Cardiomyocytes v2 from Takara Bio, Cor. 4U, Myoridge's CarmyA, REPROCELL's ReproCardio2, and the like may be used.
  • Pluripotent stem cells are a general term for stem cells that have the ability to differentiate into cells of any tissue (pluripotency).
  • Pluripotent stem cells include, for example, embryonic stem cells (ES cells), embryonic carcinoma cells (EC cells), trophoblast stem cells (TS cells), epiblast stem cells ( epiblast stem cells (EpiS cells), embryonic germ cells (EG cells), multipotent germline stem cells (mGS cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells) , Muse cells (Multi-lineage differentiating Stress Enduring cells) and the like.
  • Pluripotent stem cells are preferably ES cells or iPS cells.
  • the cardiomyocyte is preferably a cardiomyocyte obtained by differentiating a pluripotent stem cell, more preferably a cardiomyocyte obtained by differentiating an induced pluripotent stem cell, and still more preferably a cardiomyocyte obtained by differentiating an induced pluripotent stem cell.
  • These are mature cardiomyocytes.
  • Cardiomyocytes obtained by differentiating induced pluripotent stem cells can be prepared by a known cardiomyocyte differentiation induction method, for example, a protein-free cardiomyocyte differentiation induction (PFCD) method can be used (WO 2015/182765). ).
  • Cardiomyocytes are preferably cardiomyocytes obtained by differentiating induced pluripotent stem cells by a protein-free cardiomyocyte differentiation induction (PFCD) method.
  • Mature cardiomyocytes differentiated from induced pluripotent stem cells is a term used in the art in contrast to immature cardiomyocytes from differentiated induced pluripotent stem cells. They have higher ion channel function than immature cardiomyocytes.
  • Mature cardiomyocytes obtained by differentiating induced pluripotent stem cells are, for example, cells that have passed 14 days or more, preferably 20 days or more, more preferably 30 days or more after initiation of differentiation induction of induced pluripotent stem cells. .
  • the day on which the induction of differentiation of induced pluripotent stem cells was started is the day on which the induced pluripotent stem cells maintained in an undifferentiated state were exposed to a treatment for transitioning to a differentiated state, and this day was set to 0. day.
  • the upper limit of the number of days after initiation of differentiation induction is not particularly limited, and mature cardiomyocytes can be maintained in a differentiated state. It may be cultured or stored for a long period of time.
  • mature cardiomyocytes may be cells that have passed 365 days or more after initiation of differentiation induction of induced pluripotent stem cells.
  • Mature cardiomyocytes obtained by differentiating induced pluripotent stem cells preferably refer to cells that have passed 30 days or more after initiation of induction of differentiation of induced pluripotent stem cells by a protein-free myocardial differentiation induction (PFCD) method.
  • PFCD protein-free myocardial differentiation induction
  • Mature cardiomyocytes obtained by differentiating induced pluripotent stem cells are more preferable than immature cardiomyocytes obtained by differentiating induced pluripotent stem cells because their properties are closer to those of cardiomyocytes isolated from the heart of an organism.
  • Cardiomyocytes are not particularly limited in origin, and may be derived from mammals, birds, amphibians, reptiles, fish, etc., preferably mammals, more preferably humans, monkeys, mice, rats, pigs, It is derived from dogs, sheep, cats, and goats, more preferably from humans.
  • Cardiomyocytes may be normal cardiomyocytes, cardiomyocytes containing genetic mutations, or disease model cardiomyocytes. Cardiomyocytes may be introduced with various genes so as to transiently or permanently express sensor proteins and the like. Cardiomyocytes that transiently or constitutively express sensor proteins are preferred because indicators of cell function can be detected by fluorescence or chemiluminescence.
  • sensor proteins include calcium sensors such as GCaMP, cameleon, pericam, G-GECO, B-GECO, R-GECO, GEX-GECO, GEM-GECO, CEPIA; mito-MaLion, MaLionB, MaLionG, MaLionR, ATeam Magnesium sensors such as MARIO; Glucose sensors such as Green Glifon and Red Glifon; Lactate sensors such as Green Lindoblum; Pyruvate sensors such as Green Pegassos;
  • the sensor protein is preferably a calcium sensor or an ATP sensor, more preferably a calcium sensor, even more preferably GCaMP.
  • Cardiomyocytes may be used in the form of single cells, in the form of cardiomyocyte clusters, or in the form of cardiomyocyte sheets.
  • the cardiomyocytes can efficiently supply oxygen in the culture vessel (X), so they may be either adherent cardiomyocytes or floating cardiomyocytes, but are preferably adherent cardiomyocytes.
  • the culture vessel means all vessels used for culturing cells.
  • various known culture vessels can be used, and the shape and size are not particularly limited. Examples of the culture vessel include dishes, flasks, plates, bottles, bags, tubes and the like.
  • the culture vessels are typically used in devices such as incubators, mass culture devices, or perfusion culture devices.
  • the culture surface means a surface with which the medium and/or the cells are in contact, or a surface to be contacted with the medium and/or the cells when the cells are cultured.
  • the culture vessel (X) "at least part of the culture surface of the culture vessel is formed from a base material containing a 4-methyl-1-pentene polymer” means that at least a part of the culture surface is It means that it is formed from a substrate containing a 4-methyl-1-pentene polymer, and the entire area of the culture surface may be formed from a substrate containing a 4-methyl-1-pentene polymer. .
  • the culture vessel (X) is preferably a culture vessel whose bottom surface includes a culture surface in order to hold or store the culture medium.
  • the culture vessel (X) is a dish, flask, or plate
  • the bottom surface includes the culture surface. Therefore, of these bottom surfaces, side surfaces, and top surfaces, at least part or all of the bottom surface contains 4-methyl-1-pentene. It is formed from a substrate containing a polymer.
  • oxygen is efficiently introduced into the medium via the 4-methyl-1-pentene polymer. can be supplied, facilitating efficient growth and differentiation of cells in the culture medium. In addition, it becomes easier to culture cells at a high density while maintaining cell functions.
  • the entire culture surface of the culture vessel (X) is preferably formed from a base material containing a 4-methyl-1-pentene polymer. That is, when the culture vessel (X) is a dish, flask or plate, the inner side of the bottom is the culture surface. It is preferably formed from a base material containing
  • the thickness of the substrate containing the 4-methyl-1-pentene polymer is not particularly limited, it is preferably 20 ⁇ m to 400 ⁇ m, more preferably 20 ⁇ m to 300 ⁇ m, still more preferably 20 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the thickness of the base material containing the 4-methyl-1-pentene polymer is appropriately selected according to the form of the culture vessel. By adjusting the thickness to the above range, the appropriate medium necessary for cell growth and differentiation can be obtained. It is easy to obtain the oxygen concentration inside, and it is easy to obtain sufficient strength as a culture vessel.
  • the culture vessel (X) is preferably a culture vessel having at least one well, more preferably a plate having at least one well, 6 wells, 12 wells, 24 wells, 48 wells, 96 wells, A plate with wells such as 384 wells and 1536 wells is more preferable.
  • a culture vessel having a concave bottom surface such as a well needs to have a thick bottom surface in order to stabilize the complex shape of the bottom surface, and it is difficult to sufficiently supply oxygen to the cells.
  • wells such as 1 well, 6 wells, 12 wells, 24 wells, 48 wells, 96 wells, 384 wells, 1536 wells, etc., where the bottom surface is formed from a substrate comprising a 4-methyl-1-pentene polymer Even with a plate having a
  • the shape of the bottom surface of the culture container (X) is not particularly limited, and includes flat bottom, round bottom (U bottom), flat bottom (F bottom), conical bottom (V bottom), flat bottom + curved edge, and the like.
  • general injection molding or press molding may be performed at once, or film Alternatively, it is also possible to prepare a sheet and perform secondary processing such as vacuum forming or pressure forming.
  • the shape of the bottom is selected according to the purpose of culture, but when cells are cultured two-dimensionally, a flat bottom is usually desirable, and when cells are cultured three-dimensionally, a round bottom (U bottom) or conical bottom is preferred. (V bottom) is usually desirable.
  • the portion of the culture vessel (X) other than the culture surface may be composed of a material other than the base material containing the 4-methyl-1-pentene polymer.
  • the material is not particularly limited, and known materials can be used. Such materials include, for example, polystyrene (PS), polydimethylsiloxane (PDMS), thermosetting resins, cyclic olefin polymers, cyclic olefin copolymers, glass, and the like.
  • At least the culture surface of the culture vessel (X) may be coated with a coating agent containing a natural polymeric material, a synthetic polymeric material, or an inorganic material. Coating can be performed by a known method.
  • the coated culture vessel (X) has superior cardiomyocyte adhesiveness and proliferation. This is probably because the component coated on the culture surface serves as a scaffold for the cells. Therefore, when the cardiomyocytes are adhered and cultured, the culture surface of the culture vessel (X) is preferably coated with a coating agent containing a natural polymer material, a synthetic polymer material, or an inorganic material.
  • natural polymeric materials, synthetic polymeric materials, or inorganic materials are not particularly limited, but natural polymeric materials include collagen, gelatin, alginic acid, hyaluronic acid, glycosaminoglycans such as chondroitin sulfate, fibronectin, laminin, fibrinogen, Osteopontin, tenascin, vitronectin, thrombospondin, agarose, elastin, keratin, chitosan, fibrin, fibroin, sugars; synthetic polymer materials such as polyglycolic acid, polylactic acid, polyethylene glycol, polycaprolactone, synthetic peptides, synthetic proteins , polyhydroxyethyl methacrylate, polyethyleneimine; inorganic materials include ⁇ -tricalcium phosphate, calcium carbonate, and the like.
  • the natural polymer material, synthetic polymer material, or inorganic material may be used after being processed such as vitrification.
  • processing such as vitrification include vitrigel, which is obtained by rehydrating a conventional hydrogel such as an extracellular matrix component after vitrification, and collagen composed of a high-density collagen fiber network made from collagen. vitrigel and the like.
  • the coating agent is preferably a protein such as collagen, gelatin, laminin, or polylysine, or a peptide, from the viewpoint of improving cardiomyocyte adhesion and cardiomyocyte proliferation and maintaining cardiomyocyte function for a longer period of time. More preferably laminin, collagen, polylysine, and more preferably laminin. That is, the culture surface of the culture vessel (X) is preferably coated with a coating agent containing laminin.
  • the coating agent may contain the above components singly or in combination of two or more.
  • the coating agent may be used for coating as it is, but it can be used for coating after being diluted with a solvent such as water, PBS, or a medium. From the viewpoint of cardiomyocyte adhesion, the coating agent is preferably diluted with a solvent such as water, PBS, or a medium before use for coating, more preferably after being diluted with a medium before use for coating.
  • the medium used for diluting the coating agent is not particularly limited, and may be the same as or different from the medium used in step (A).
  • the medium used for diluting the coating agent is preferably a medium containing no animal serum or alternative serum, more preferably DMEM, and particularly preferably a special basal medium described later in Examples.
  • the coating agent may be removed from the culture vessel (X) or left in the culture vessel (X). preferably left in
  • At least the culture surface of the culture vessel (X) may be processed.
  • Surface processing includes, for example, uneven structure forming processing, surface modification processing such as hydrophilic processing, and hydrophobic processing.
  • the method used for the surface modification treatment is not particularly limited, but for example, hydrophilic treatment such as corona treatment, plasma treatment, ozone treatment, ultraviolet treatment; hydrophobic treatment such as esterification, silylation, and fluorination; Vapor deposition, etching, or addition of specific functional groups such as hydroxyl group, amino group, sulfone group, thiol group, carboxyl group; treatment with specific functional groups such as silane coupling, titanium coupling, zirconium coupling; oxidizing agent surface roughening by means such as; physical treatment such as rubbing and sandblasting; These surface modification treatments may be performed singly or in combination of two or more. In addition, when surface modification treatment is performed, it is preferable to perform it at least on the culture surface.
  • At least the culture surface of the culture vessel (X) is preferably hydrophilized, more preferably corona-treated or plasma-treated.
  • hydrophilizing the surface of the culture vessel (X) the wettability of the surface of the culture vessel (X) is increased, the adhesion between the culture vessel (X) and the cardiomyocytes is improved, and the culture vessel (X) is improved. Cardiomyocytes can proliferate uniformly on the surface.
  • by hydrophilizing the surface of the culture vessel (X) it becomes easier to coat the culture surface of the culture vessel (X) with the coating agent.
  • the coating agent is uniformly loaded on the culture surface of the culture vessel (X), making it easier to adhere. It does not come off and can be used for cell culture while maintaining a stable initial state.
  • nitrogen, hydrogen, helium, oxygen, argon, or the like is used as the accompanying gas, and at least one gas selected from nitrogen, helium, and argon is preferably selected.
  • the culture vessel (X) may be disinfected or sterilized to prevent contamination.
  • the method of disinfection or sterilization is not particularly limited, and physical disinfection methods such as the circulation steam method, boiling method, intermittent method, and ultraviolet method; chemical disinfection methods using gases such as ozone and disinfectants such as ethanol; Heat sterilization methods such as high pressure steam method and dry heat method; irradiation sterilization methods such as gamma ray method, electron beam method and high frequency method; gas sterilization methods such as ethylene oxide gas method and hydrogen peroxide gas plasma method.
  • ethanol sterilization, autoclave sterilization, gamma ray sterilization, electron beam sterilization, or ethylene oxide gas sterilization is preferred because of its simple operation and sufficient sterilization.
  • the culture surface of the culture vessel (X) preferably has a water contact angle of 50° or more, more preferably 55° or more, and still more preferably 60° or more.
  • the culture surface of the culture vessel (X) preferably has a water contact angle of 100° or less, more preferably 90° or less, and even more preferably 84° or less.
  • the culture surface of the culture vessel (X) is uniformly coated with a natural polymer material, a synthetic polymer material, or an inorganic material to facilitate adhesion.
  • the natural polymer material, synthetic polymer material, or inorganic material does not peel off and can be used for cell culture while maintaining a stable initial state.
  • the method for measuring the water contact angle is not particularly limited, and a known method can be used, preferably the sessile drop method.
  • the shape of the water droplet can be regarded as spherical under constant temperature and humidity conditions of 25 ⁇ 5 ° C. and 50 ⁇ 10% according to Japanese Industrial Standard JIS-R3257 (test method for wettability of substrate glass surface).
  • a water droplet with a volume of 4 ⁇ L or less is dropped on the surface of a measurement sample made using the same material as the culture vessel (X), and the sessile drop method is used to remove the water droplet within 1 minute immediately after contact with the measurement sample surface. It can be measured by a method of measuring the angle of the contact interface between the measurement sample and the water droplet.
  • the manufacturing method of the culture vessel (X) is not particularly limited, nor is the equipment used for manufacturing.
  • the entire culture vessel (X) is formed from a base material containing a 4-methyl-1-pentene polymer, for example, a film or sheet containing the 4-methyl-1-pentene polymer is formed, and the necessary Depending on the conditions, the film or sheet can be formed into a desired shape to produce a culture vessel (X).
  • the culture vessel (X) can also be obtained by direct molding by methods such as extrusion molding, solution casting molding, injection molding, and blow molding.
  • the culture vessel (X) can be obtained by appropriately bonding the film or sheet to another base material.
  • the bonding method is not particularly limited, and the substrate containing the 4-methyl-1-pentene polymer and another substrate may be integrally formed, or they may be adhered to each other via an adhesive or pressure-sensitive adhesive. good.
  • the extrusion temperature is preferably 100°C to 400°C, particularly preferably 200°C to 300°C.
  • the roll temperature is preferably 45°C to 75°C, particularly preferably 55°C to 65°C.
  • the film or sheet may be produced by a solution casting method in which a 4-methyl-1-pentene polymer is dissolved in a solvent, poured onto a resin or metal, slowly dried while leveling, and formed into a film (sheet). good.
  • the solvent used is not particularly limited, but hydrocarbon solvents such as cyclohexane, hexane, decane and toluene may be used. Two or more solvents may be mixed in consideration of the solubility and drying efficiency of the 4-methyl-1-pentene polymer.
  • a polymer solution is applied by a method such as table coating, spin coating, dip coating, die coating, spray coating, bar coating, roll coating, or curtain flow coating, dried, and peeled off to form a film or sheet.
  • [4-methyl-1-pentene polymer] 4-methyl-1-pentene homopolymers and copolymers of 4-methyl-1-pentene and other monomers are collectively referred to as "4-methyl-1-pentene polymers ”.
  • Copolymers of 4-methyl-1-pentene which is an example of 4-methyl-1-pentene polymers, with other monomers include random copolymers, alternating copolymers, block copolymers, and grafts. Any copolymer may be used.
  • Copolymers of 4-methyl-1-pentene with other monomers include 4-methyl-1-pentene, ethylene and ⁇ -olefins having 3 to 20 carbon atoms (excluding 4-methyl-1-pentene A copolymer with at least one olefin selected from ) is preferable because it has high strength, is resistant to breakage and cracking even when used as a base material, and has little deflection.
  • the 4-methyl-1-pentene polymer includes 4-methyl-1-pentene homopolymer, 4-methyl-1-pentene, ethylene and an ⁇ -olefin having 3 to 20 carbon atoms (4-methyl-1 - is preferably at least one polymer selected from copolymers with at least one olefin selected from (excluding pentene), 4-methyl-1-pentene, ethylene and 3 to 20 carbon atoms is more preferably a copolymer with at least one olefin selected from ⁇ -olefins (excluding 4-methyl-1-pentene).
  • olefin examples include ethylene, propylene, 1-butene, 1-hexene, 1-heptene, 1-octene, 1-decene, 1-tetradecene, 1-hexadecene, 1-heptadecene, 1-octadecene, and 1-eicosene. is mentioned.
  • the olefin can be appropriately selected depending on the physical properties required for the base material.
  • the olefins are preferably ⁇ -olefins having 8 to 18 carbon atoms from the viewpoint of appropriate oxygen permeability and excellent rigidity, such as 1-octene, 1-decene, 1-dodecene, 1-tetradecene, At least one selected from 1-hexadecene, 1-heptadecene and 1-octadecene is more preferred.
  • the number of carbon atoms in the olefin is within the above range, the processability of the polymer will be better, and the appearance of the base material due to cracks or cracks at the edges will tend to be less likely to occur. In addition, the defective product rate of the base material is reduced.
  • the olefin can be used alone or in combination of two or more.
  • the olefin preferably has 2 or more carbon atoms, more preferably 10 or more carbon atoms, from the viewpoint of strength of the material.
  • the content of structural units derived from 4-methyl-1-pentene in the 4-methyl-1-pentene polymer is preferably 60 to 100 mol%, more preferably 80 to 99.5 mol%, still more preferably 85 to 98 mol %.
  • the 4-methyl-1-pentene polymer is at least one selected from 4-methyl-1-pentene, ethylene and ⁇ -olefins having 3 to 20 carbon atoms (excluding 4-methyl-1-pentene)
  • it is a copolymer with an olefin
  • it is derived from at least one olefin selected from ethylene and ⁇ -olefins having 3 to 20 carbon atoms (excluding 4-methyl-1-pentene) in the copolymer
  • the content of the structural units is preferably 0.1 to 40 mol%, more preferably 0.5 to 20 mol%, still more preferably 2 to 15 mol%.
  • the content of these structural units is based on 100 mol % of all repeating structural units in the 4-methyl-1-pentene polymer.
  • the content of the structural unit is within the above range, a uniform culture surface with excellent workability can be obtained, and the toughness and strength of the substrate are well balanced, so that the substrate is less flexed.
  • the 4-methyl-1-pentene polymer is derived from the structural unit derived from 4-methyl-1-pentene and the ethylene and the ⁇ -olefin having 3 to 20 carbon atoms within a range that does not impair the effects of the present invention. It may have structural units other than structural units (hereinafter also referred to as "other structural units"). The content of other structural units is, for example, 0 to 10.0 mol %. When the 4-methyl-1-pentene polymer has other structural units, the other structural units may be one or two or more.
  • Examples of monomers from which other structural units are derived include cyclic olefins, aromatic vinyl compounds, conjugated dienes, non-conjugated polyenes, functional vinyl compounds, hydroxyl group-containing olefins, and halogenated olefins.
  • Cyclic olefins, aromatic vinyl compounds, conjugated dienes, non-conjugated polyenes, functional vinyl compounds, hydroxyl group-containing olefins and halogenated olefins include, for example, paragraphs [0035] to [0041] of JP-A-2013-169685. compounds can be used.
  • the 4-methyl-1-pentene polymer may be used singly or in combination of two or more.
  • a commercial product can also be used as the 4-methyl-1-pentene polymer.
  • TPX MX001, MX002, MX004, MX0020, MX021, MX321, RT18, RT31 or DX845 (all registered trademarks) manufactured by Mitsui Chemicals, Inc. may be used.
  • 4-methyl-1-pentene polymers manufactured by other manufacturers can be preferably used as long as they satisfy the above requirements. These commercial products may be used singly or in combination of two or more.
  • the 4-methyl-1-pentene polymer usually has a melting point of 200°C to 240°C and high heat resistance. Further, since it does not undergo hydrolysis and has excellent water resistance, boiling water resistance and steam resistance, a substrate containing a 4-methyl-1-pentene polymer can be subjected to autoclave sterilization.
  • the 4-methyl-1-pentene polymer also has a high visible light transmittance (usually 90% or more) and does not emit autofluorescence, so it is formed from a base material containing a 4-methyl-1-pentene polymer.
  • a culture vessel that is designed to facilitate observation of cardiomyocytes.
  • the 4-methyl-1-pentene polymer can be heat-sealed, and can be easily heat-sealed not only with itself but also with other materials.
  • it since it can be thermoformed, it can be easily formed into a culture vessel of any shape, such as by imprinting or inserting.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the 4-methyl-1-pentene polymer is preferably 10,000 to 2,000,000, more preferably 20,000. ⁇ 1,000,000, more preferably 30,000 to 500,000.
  • the sample concentration for GPC measurement can be, for example, 1.0 to 5.0 mg/ml.
  • the molecular weight distribution (Mw/Mn) of the 4-methyl-1-pentene polymer is preferably 1.0-30, more preferably 1.1-25, still more preferably 1.1-20.
  • the solvent used in GPC is preferably ortho-dichlorobenzene.
  • the conditions shown in Examples to be described later can be cited, but the measurement conditions are not limited to these.
  • the film produced by melt molding in the molding method of the 4-methyl-1-pentene polymer described later can easily suppress the occurrence of defects such as gel. It becomes easier to form a film with a uniform surface.
  • the solubility in the solvent is improved, so that problems such as film gel can be easily suppressed, making it easier to form a film with a uniform surface.
  • the weight average molecular weight (Mw) to the above lower limit or more, the strength of the culture vessel (X) tends to be sufficient. Furthermore, by setting the molecular weight distribution within the above range, it is easy to suppress the stickiness of the surface of the prepared culture vessel, the toughness of the culture vessel tends to be sufficient, and the occurrence of cracks during bending and cutting during molding is suppressed. easier to suppress.
  • the weight-average molecular weight (Mw) and molecular weight distribution (Mw/Mn) of the 4-methyl-1-pentene polymer are different from each other when two or more types are used as the 4-methyl-1-pentene polymer. , Mw and Mw/Mn should be within the above ranges.
  • the 4-methyl-1-pentene polymer preferably has an oxygen permeability coefficient of 100 to 2500 cm 3 ⁇ mm/(m 2 ⁇ 24h ⁇ atm), more preferably 1000 to 2500 cm 3 ⁇ mm/(m 2 ⁇ 24h ⁇ atm). ) is more preferable.
  • the oxygen permeability coefficient is in the above range, the oxygen permeability is excellent, so that the cardiomyocytes maintain good morphology, are likely to proliferate efficiently according to the culture period, and are easy to detect the action of the drug.
  • the oxygen permeability coefficient can be measured by the following method.
  • a measurement sample was prepared from a substrate composed of a 4-methyl-1-pentene polymer, and the oxygen permeability coefficient [cm 3 ⁇ mm/( m 2 ⁇ 24h ⁇ atm)].
  • the instrument used for the measurement is not particularly limited as long as it uses a differential pressure type gas permeability measurement method.
  • the measurement sample was prepared by cutting a 90 ⁇ 90 mm test piece from a 50 ⁇ m-thick base material composed of a 4-methyl-1-pentene polymer, and the diameter of the measurement part was 70 mm (the transmission area was 38.46 cm 2 ). is preferable.
  • the oxygen permeability is high, it is more preferable to apply an aluminum mask to the sample in advance so that the actual permeation area is 5.0 cm 2 .
  • the sample to be measured may or may not have been subjected to microfabrication or surface modification treatment, but it is preferable that the sample has not been subjected to any treatment.
  • a value obtained by dividing the oxygen permeability coefficient by the thickness ( ⁇ m) of the base material is defined as the oxygen permeability [cm 3 /(m 2 ⁇ 24h ⁇ atm)].
  • a culture vessel having at least a culture surface formed of a base material containing the 4-methyl-1-pentene polymer is suitable for culture. It has good shape stability, light transmittance, molding processability, oxygen permeability, can be sterilized, cultures cardiomyocytes, and evaluates the effects of drugs. It is very excellent as a culture vessel used for
  • the method for producing the 4-methyl-1-pentene polymer may be any method as long as it can polymerize 4-methyl-1-pentene, olefins, and other monomers.
  • a chain transfer agent such as hydrogen may also be used to control the molecular weight or molecular weight distribution.
  • the equipment used for manufacturing is also not limited.
  • the polymerization method may be a known method such as a gas phase method, a slurry method, a solution method, or a bulk method. A slurry method and a solution method are preferred.
  • the polymerization method may be a single-stage polymerization method or a multi-stage polymerization method such as a two-stage polymerization method, in which a plurality of polymers having different molecular weights are blended in a polymerization system.
  • hydrogen When hydrogen is used as a chain transfer agent in either a single-stage polymerization method or a multi-stage polymerization method, it may be charged all at once or dividedly, for example, at the beginning, middle and end of the polymerization.
  • the polymerization may be carried out at normal temperature, or may be heated if necessary, but from the viewpoint of polymerization efficiency, it is preferably carried out at 20°C to 80°C, and particularly preferably at 40°C to 60°C. .
  • the catalyst used for production is also not limited, but from the viewpoint of polymerization efficiency, for example, the solid titanium catalyst component (I) described in WO 2006/054613 or the transition metal compound described in WO 2014/050817 It is preferable to use an olefin polymerization catalyst (metallocene catalyst) containing (A).
  • the substrate containing the 4-methyl-1-pentene polymer is a composition containing the 4-methyl-1-pentene polymer
  • 4-methyl-1- The pentene polymer is preferably 90% by mass or more and less than 100% by mass, more preferably 95% by mass or more and less than 100% by mass, and particularly preferably 99% by mass or more and less than 100% by mass.
  • the 4-methyl-1-pentene polymer in the composition is 90% by mass or more, the oxygen permeability, transparency, strength, etc. of the substrate are further improved.
  • components other than the 4-methyl-1-pentene polymer include a heat stabilizer, a light stabilizer, a processing aid, a plasticizer, an antioxidant, a lubricant, an antifoaming agent, an antiblocking agent, and a coloring agent. agents, modifiers, antibacterial agents, antifungal agents, antifogging agents, and other additives.
  • Step (A) is a step of seeding cardiomyocytes on the culture surface of the culture vessel (X).
  • the method of seeding the cardiomyocytes on the culture surface of the culture vessel (X) is not particularly limited. After rocking the container (X) to evenly disperse the myocardial cells in the culture container (X), it is allowed to stand still in an incubator.
  • the cardiomyocyte seeding density is not particularly limited as long as the cardiomyocytes can be maintained or proliferated, but is preferably 0.1 ⁇ 10 5 cells/cm 2 to 10.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , More preferably 0.3 ⁇ 10 5 cells/cm 2 to 5.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , still more preferably 0.5 ⁇ 10 5 cells/cm 2 to 3.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 . It is preferable that the cardiomyocyte seeding density is within the above range because the cardiomyocytes easily adhere to the culture vessel (X) and proliferate more efficiently.
  • the medium used in step (A) is not particularly limited as long as it allows myocardial cells to survive, and may be appropriately selected according to the cell type used.
  • the medium used for seeding is, for example, any cell culture basal medium, differentiation medium, primary culture medium, etc.
  • serum-free medium described later
  • medium described later
  • Eagle essential small medium EMEM
  • Dulbecco's modified Eagle's medium DMEM
  • ⁇ -MEM Glasgow MEM
  • IMDM IMDM
  • RPMI1640 Ham F-12
  • MCDB medium Williams medium E
  • special maintenance medium special basal medium, which will be described later in the examples
  • Examples include iCell cardiomyocyte maintenance medium (manufactured by FUJIFILM Cellular Dynamics), iCell cardiomyocyte thawing medium (manufactured by FUJIFILM Cellular Dynamics), and mixed medium thereof.
  • the medium used in step (A) is preferably iCell cardiomyocyte thawing medium, serum-free medium ( ⁇ ) described later in Examples, more preferably Serum-free medium ( ⁇ ).
  • the amount of medium used in step (A) is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the cell type and medium type. Cultivation conditions are not particularly limited, and a known method can be used, but usually the temperature is about 25 to 40° C. and the carbon dioxide concentration is about 5%.
  • Serum-free medium ( ⁇ ) is a medium that does not contain animal serum, but contains alternative serum.
  • a serum-free medium ( ⁇ ) can be prepared by adding serum replacement to the basal medium.
  • the serum substitute means a serum substitute that replaces animal serum added as a nutrient necessary for cell survival during cell culture, and is referred to as Serum Protein Substitute (SPS), Serum Substitute Supplement (SSS), and the like. Sometimes it is done.
  • the substitute serum is not particularly limited, and known ones can be used.
  • Commercially available alternative serums include Knockout Serum Replacement (manufactured by ThermoFisher SCIENTIFIC, No.
  • the content of the replacement serum in the serum-free medium ( ⁇ ) is not particularly limited, but is preferably 1-20% (v/v), more preferably 5-15% (v/v), still more preferably 8-12%. % (v/v).
  • the basal medium is not particularly limited as long as it is a cell culture medium containing no animal serum.
  • Examples of the basal medium include Grace medium, IPL-41 medium, Schneider's medium, Opti-PRO TM SFM medium, Opti-MEM TM I medium, VP-SFM medium, CD293 medium, 293SFMII medium, and CD-CHO medium.
  • CHO-S-SFMII medium FreeStyle TM 293 medium, CD-CHO, AGT TM medium, RPMI medium, DMEM medium, MEM medium, GMEM medium, Eagle's MEM medium, BME medium, DME medium, ⁇ MEM medium, IMEM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, ASF103 medium, ASF104 medium, ASF301 medium, TC-100 medium, Sf-900II medium, Ex-cell405 medium, Express-Five medium, Drosophila medium, Ham 'sF-12K medium and mixed medium thereof.
  • the basal medium is preferably DMEM medium, RPMI medium, or MEM medium, more preferably DMEM medium, since cardiomyocytes easily adhere to the culture vessel (X).
  • the serum-free medium ( ⁇ ) is preferably DMEM medium, RPMI medium, or MEM medium containing Knockout Serum Replacement, more preferably DMEM medium containing Knockout Serum Replacement.
  • serum-free medium ⁇
  • various growth factors, differentiation inducers, antibiotics, hormones, amino acids, sugars, salts, minerals, metals, vitamins, etc. may be added to the serum-free medium ( ⁇ ).
  • Step (B) is a step of culturing the cardiomyocytes seeded in step (A).
  • a method for culturing cardiomyocytes is not particularly limited, and may be performed according to a known protocol.
  • the details of the medium used for culture in step (B) are the same as those for the medium used in step (A).
  • the medium used in step (B) may be the same as or different from the medium used in step (A), but is preferably the same because cardiomyocytes proliferate more easily.
  • the amount of medium used in step (B) is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the cell type and medium type.
  • the frequency of medium replacement is not particularly limited, but it is preferable not to replace the medium during the culture period in step (B) except for the day after seeding.
  • Cultivation conditions are not particularly limited, and a known method can be used, but usually the temperature is about 25 to 40° C. and the carbon dioxide concentration is about 5%.
  • the culture period in step (B) is not particularly limited, but is preferably 6 hours to 3 days, more preferably 10 hours to 2 days, still more preferably 12 to 36 hours.
  • the end of the culture period in step (B) can be determined, for example, by whether the myocardial cells have sufficiently adhered to the culture vessel (X). Whether the cardiomyocytes sufficiently adhere to the culture vessel (X) can be evaluated, for example, by microscopic observation.
  • the culture in step (B) can be either adherent culture or suspension culture because oxygen can be supplied efficiently in the culture vessel (X), but adherent culture is preferred.
  • Steps (A) and (B) are preferably performed in a serum-free medium ( ⁇ ).
  • steps (A) and (B) are performed in a serum-free medium ( ⁇ )
  • cardiomyocytes easily adhere to the culture vessel (X).
  • Step (C) is a step of further culturing the cardiomyocytes obtained in step (B).
  • the method of one aspect of the present invention preferably includes step (C) of further culturing the cardiomyocytes cultured in step (B). If step (C) is included, it is easy to accurately evaluate the action of the drug.
  • a method for culturing cardiomyocytes is not particularly limited, and may be performed according to a known protocol.
  • the medium used for culture in step (C) is not particularly limited as long as it is a medium in which cardiomyocytes can survive, and may be appropriately selected according to the cell type used.
  • the medium used for culture is, for example, any cell culture basal medium, differentiation medium, primary culture medium, etc.
  • serum-free medium ⁇
  • medium ⁇
  • EMEM Eagle's small essential medium
  • DMEM Dulbecco modified Eagle medium
  • GMEM Glasgow MEM
  • IMDM IMDM
  • RPMI1640 Ham F-12
  • MCDB medium Williams medium E
  • CardioGro manufactured by Funakoshi
  • FUJIFILM iCell cardiomyocyte maintenance medium
  • iCell cardiomyocyte thawing medium manufactured by FUJIFILM Cellular Dynamics
  • the medium used in step (C) is preferably iCell cardiomyocyte maintenance medium or medium ( ⁇ ) described later, and more preferably, because cardiomyocytes grow more efficiently and the action of the drug can be detected with high accuracy. is the medium ( ⁇ ) described later.
  • the medium used for culture in step (C) may be changed during the culture period in step (C), and two or more may be used in combination. It is preferable to use the medium ( ⁇ ) for at least part of the culture period in step (C), since cardiomyocytes grow more efficiently and the action of the drug can be detected with high accuracy.
  • the order and duration of using medium ( ⁇ ) are not limited, but medium ( ⁇ ) is preferably used as the second and subsequent media.
  • the culture period using the medium ( ⁇ ) is preferably 30% or more, more preferably 40% or more, even more preferably 50% or more, and particularly preferably 60% or more of the culture period in step (C).
  • the amount of medium used in step (C) is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the cell type and medium type.
  • the frequency of medium replacement is not particularly limited, but it is preferably performed every day or every two or three days.
  • Cultivation conditions are not particularly limited, and a known method can be used, but usually the temperature is about 25 to 40° C. and the carbon dioxide concentration is about 5%.
  • the culture period in step (C) is not particularly limited, but is preferably 3 to 30 days, more preferably 7 to 20 days, still more preferably 10 to 16 days.
  • the end of the culture period in step (C) can be determined, for example, by whether the myocardial cells are sufficiently synchronized, more specifically, by whether the myocardial cells exhibit a stable beating pattern. Whether cardiomyocytes exhibit a stable beating pattern can be evaluated, for example, by calcium ion waveforms.
  • Medium ( ⁇ ) is a medium containing 1-100 ⁇ g/mL of free fatty acids. Other components of the medium ( ⁇ ) are not particularly limited as long as it contains 1 to 100 ⁇ g/mL free fatty acid.
  • a free fatty acid means a non-esterified fatty acid, and the carbon number of the fatty acid is not limited.
  • the type of free fatty acid is not limited, and examples include short-chain fatty acids with 2 to 6 carbon atoms such as acetic acid, butyric acid, and caproic acid; medium-chain fatty acids with 8 to 10 carbon atoms, such as caprylic acid and capric acid; and lauric acid. , myristic acid, myristoleic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid.
  • the fatty acids may be saturated fatty acids or unsaturated fatty acids.
  • the medium ( ⁇ ) may contain the above free fatty acids singly or in combination of two or more.
  • the free fatty acid content of the medium ( ⁇ ) is preferably 1 to 70 ⁇ g/mL, more preferably 2 to 50 ⁇ g/mL, still more preferably 10 to 50 ⁇ g/mL.
  • the medium ( ⁇ ) contains free fatty acid in an amount within the above range, the action of the drug can be evaluated with higher accuracy.
  • the method for measuring the content of free fatty acids in the medium ( ⁇ ) is not particularly limited, and the concentration of free fatty acids can be measured, for example, by a method using a coupled enzymatic reaction.
  • Medium ( ⁇ ) preferably further contains lysophosphatidylcholine 1-100 ⁇ g/mL, triacylglyceride 1-100 ⁇ g/mL, phosphatidylcholine 1-100 ⁇ g/mL, phosphatidic acid 1-100 ⁇ g/mL, cholesterol 0.1-10 ⁇ g/mL. mL, and at least one selected from 0.1 to 10 ⁇ g/mL of sphingomyelin.
  • the content of lysophosphatidylcholine is more preferably 1-50 ⁇ g/mL, still more preferably 1-20 ⁇ g/mL.
  • the content of triacylglycerides is more preferably 1-50 ⁇ g/mL, more preferably 1-20 ⁇ g/mL.
  • the content of phosphatidylcholine is more preferably 1-50 ⁇ g/mL, more preferably 1-25 ⁇ g/mL.
  • the content of phosphatidic acid is more preferably 1-50 ⁇ g/mL, more preferably 1-10 ⁇ g/mL.
  • the cholesterol content is more preferably 0.1 to 8 ⁇ g/mL, still more preferably 0.1 to 5 ⁇ g/mL.
  • the content of sphingomyelin is more preferably 0.1-8 ⁇ g/mL, still more preferably 0.1-5 ⁇ g/mL.
  • the method for measuring the lipid content of the medium ( ⁇ ) is not particularly limited, and can be measured by a known method.
  • Step (D) is a step of exposing the cultured myocardial cells to the agent.
  • the cultured cardiomyocytes are the cardiomyocytes cultured in step (B) when there is no step (C), and the cardiomyocytes cultured in step (C) when there is step (C). is.
  • the method of exposing cardiomyocytes to the drug is not particularly limited.
  • the drug may be directly added to the medium, or the drug may be dispersed or dissolved in an appropriate solvent and then added to the medium.
  • the solvent include, but are not particularly limited to, water, ethanol, methanol, and DMSO.
  • the concentration of the drug to be added may be determined according to the type of drug.
  • the action of the drug can be easily detected even when the concentration of the drug is low. It can be a concentration lower than the concentration.
  • the drug can be added to the medium to a final concentration ranging, for example, from 0.001 nM to 10 mM.
  • the duration of exposing the cardiomyocytes to the drug is not particularly limited as long as the drug can exert its effect on the cardiomyocytes, and can be appropriately determined according to the type of cardiomyocytes or the drug.
  • the period of exposure is preferably 1 second to 5 days, more preferably 1 minute to 3 days, still more preferably 5 minutes to 3 days.
  • Cultivation conditions are not particularly limited, and a known method can be used, but usually the temperature is about 25 to 40° C. and the carbon dioxide concentration is about 5%.
  • step (D) The details of the medium used in step (D) are the same as the medium used in step (B) when there is no step (C), and when there is step (C), it is used in step (C). Same as medium.
  • the medium used in step (D) may be the same as or different from the medium used in step (C) or the medium used in step (B). is preferred.
  • the method that is one aspect of the present invention preferably includes step (C), and steps (C) and (D) are performed in medium ( ⁇ ).
  • steps (C) and (D) are carried out in medium ( ⁇ )
  • drug effects, particularly cardiotoxicity can be evaluated more accurately, and proarrhythmia, particularly EAD-like waveforms can be easily detected.
  • steps (A) and (B) are performed in serum-free medium ( ⁇ ) and steps (C) and (D) are performed in medium ( ⁇ ).
  • the cardiomyocytes can easily adhere to the culture vessel (X), and more stably, the action of the drug, especially the cardiotoxicity, can be evaluated with higher accuracy. It is easy to detect similar waveforms.
  • Step (E) is a step of analyzing and evaluating an index of cell function of cardiomyocytes exposed to the agent in step (D).
  • the indicator of cardiomyocyte cell function is not particularly limited as long as it indicates cardiomyocyte function, and may be an indicator of general cell function or an indicator of cardiomyocyte-specific function. good.
  • Indicators of cellular function of cardiomyocytes include, for example, action potential, gene expression, contractility, sarcomere length, intracellular concentrations of sodium ions, potassium ions, or calcium ions or changes thereof, pulsation, cell viability, and mitochondrial function. Indicators include concentrations of energy-related substances such as glucose, pyruvate, lactate, and ATP, or changes thereof.
  • the index of cell function of cardiomyocytes is preferably the concentration of calcium ions or changes in calcium ion concentration, since the measurement is simple and the movement of ions that cause heart muscle cells to beat can be analyzed.
  • a change in the intracellular concentration of calcium ions can be detected as a waveform representing changes in calcium ion concentration. That is, the indicator of cardiomyocyte cellular function is preferably the calcium ion waveform.
  • the method of analyzing the index of cardiomyocyte cell function is not particularly limited.
  • Action potentials can be analyzed by, for example, extracellular potential analysis using a multi-electrode system, MEA (Multi-electrodearray) analysis, intracellular potential analysis using whole-cell patch clamping, and the like.
  • Gene expression can be analyzed, for example, by RT-PCR for cardiomyocyte-specific gene expression.
  • Contractility can be analyzed, for example, by measuring the velocity of displacement from the movement of the cardiomyocyte margins with a motion analyzer.
  • Sarcomere length can be analyzed, for example, by GFP-labeling ⁇ -actinin present in sarcomere and visualizing it.
  • the intracellular concentration of calcium ions or changes thereof can be analyzed, for example, by calcium imaging methods. Beats can be analyzed, for example, by a motion analyzer. Cell viability can be analyzed, for example, by a cell survival assay using a tetrazolium compound or a mitochondrial membrane potential-dependent dye, measurement of ATP amount, and the like.
  • the index of mitochondrial function can be analyzed by, for example, mitochondrial toxicity, for example, swelling assay as an index of mitochondrial permeability transition (MPT), activity measurement of electron transport chain enzyme complex, and the like.
  • concentration of energy-related substances such as glucose, pyruvate, lactate, and ATP or their changes can be analyzed, for example, by imaging methods such as glucose, pyruvate, lactate, and ATP.
  • step (E) By analyzing calcium ion waveforms, e.g., QT prolongation, bradycardia (negative chronotropic effect), tachycardia (positive chronotropic effect), cardiotonic (positive inotropic effect), weak heart (negative inotropic effect), early Later depolarizations (EAD), delayed after depolarizations (DAD), torsades de pointes (TdP), triggered activity arrhythmias, or reentry arrhythmias can be detected.
  • early post-depolarization (EAD) is preferably detected by analyzing the calcium ion waveform.
  • tachycardia or bradycardia is preferably detected by analyzing the calcium ion waveform.
  • step (F) The method of one aspect of the present invention may include, after step (E), step (F) of comparing the analysis results obtained in step (E) with the analysis results in the absence of the drug.
  • Step (F) is, in other words, a step of comparing the index of cell function obtained in step (E) in the presence and absence of the drug to determine whether the action of the drug is high or low. Criteria for determination utilize that the index of cell function in the presence of the drug is high, low, or has a change compared to the index of cell function in the absence of the drug.
  • “Absence of drug” usually means before addition of the drug or when only a solvent for dispersing or dissolving the drug is added.
  • ⁇ Apparatus Gel permeation chromatograph HLC-8321GPC/HT type (manufactured by Tosoh Corporation) ⁇ Data analysis software: Empower3 (manufactured by Waters) ⁇ Detector: Differential refractometer ⁇ Series-connected columns: TSKgelGMH6-HT (2) and TSKgelGMH6-HTL (2) ⁇ Column temperature: 140°C ⁇ Flow rate: 1.0 mL/min ⁇ Sample concentration: 1.5 mg/mL
  • the oxygen permeability coefficient [cm 3 ⁇ mm/(m 2 ⁇ 24 h x atm)] was measured.
  • the diameter of the measuring portion was 70 mm (transmission area was 38.46 cm 2 ). Since the oxygen permeability coefficient was expected to be large, the sample was masked with aluminum in advance to set the actual permeation area to 5.0 cm 2 .
  • the oxygen permeability coefficient was 1912 cm 3 ⁇ mm/(m 2 ⁇ 24h ⁇ atm).
  • the film 1 was plasma-treated using an atmospheric plasma surface treatment apparatus (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) with the chamber filled with a nitrogen stream (treatment speed 2 m/min, output 4.5 kW, 2 reciprocations).
  • the water contact angle was measured using the plasma-treated film 1 as a measurement sample.
  • the water contact angle was measured according to Japanese Industrial Standards JIS-R3257 (testing method for wettability of substrate glass surface). Under constant temperature and humidity conditions of 25 ⁇ 5 ° C and 50 ⁇ 10%, a water droplet of a volume of 4 ⁇ L or less that can be regarded as a spherical water droplet is dropped on the surface of the measurement sample. The angle of the contact interface between the measurement sample and the water droplet was measured within 1 minute from immediately after the contact. The water contact angle of plasma-treated Film 1 was 60.3°.
  • TCPS tissue Currure Polystyrene 96-well plate
  • C plate Corning, product number 3300, also referred to as "C plate”
  • PDMS Polydimethylsiloxane 96-well plate
  • VECELL product number V96WGPB
  • oxygen permeability coefficient 19121 [cm 3 ⁇ mm/(m 2 ⁇ 24 h ⁇ atm)] bottom thickness 350 ⁇ m
  • TCPS 96-well plate manufactured by Greiner, product number 655090, “G plate” ) was used.
  • CDI maintenance medium iCell cardiomyocyte maintenance medium, manufactured by FUJIFILM Cellular Dynamics, 557-33591
  • CDI thawing/seeding medium iCell cardiomyocyte thawing medium, manufactured by FUJIFILM Cellular Dynamics, 550-33581
  • ⁇ Special maintenance medium (CarmyA maintenance medium UG, manufactured by Myoridge, ME-01A00241, supplied separately into liquid medium and attached supplements, and used after mixing the liquid medium and attached supplements. In medium ( ⁇ ) applicable.) Contains 11.3 ⁇ g/mL lysophosphatidylcholine, 9.79 ⁇ g/mL triacylglycerides, 5.29 ⁇ g/mL phosphatidylcholine, 2.07 ⁇ g/mL phosphatidic acid, 0.88 ⁇ g/mL cholesterol, and 0.80 ⁇ g/mL sphingomyelin . It also contains 35.29 ⁇ g/mL of free fatty acids.
  • CarmyA special seeding medium (CarmyA seeding medium kit UG, manufactured by Myoridge, ME-02A00211. Corresponds to serum-free medium ( ⁇ ).)
  • ⁇ Special basal medium (CarmyA seeding medium kit UG, manufactured by Myoridge, serum-free medium attached to ME-02A00211)
  • Cardiomyocyte-Specific Gene Expression levels were compared using a C plate (Reference Example 1) and a T plate (Reference Example 2) as test plates.
  • ⁇ Culture schedule> Cell culture was performed according to the following schedule. The day after cell wakeup is defined as Day 0, and subsequent days are represented.
  • Day-1 Reagent preparation and preparation Day0: Frozen myocardial cell sleep, precoating of plate, seeding on test 96-well plate, culture Day1-5: medium exchange with 150 ⁇ L of CDI maintenance medium every other day and culture Day7 ⁇ 13: Culturing with 200 ⁇ L of CDI maintenance medium every other day Day 14: Gene expression analysis
  • ⁇ iMatrix-511silk coating method for test plate 70 ⁇ L of iMatrix-511silk was added to 9 mL of PBS( ⁇ ) for dilution to prepare a coating solution. The coating liquid was added to the test 96-well plate at 100 ⁇ L/well (concentration used: 1.21 ⁇ g/cm 2 ) and allowed to stand in a 37° C. incubator for 1 hour. Cells were removed by aspiration before seeding.
  • Y-27632 was added to the CDI thawing/seeding medium to a final concentration of 10 ⁇ M and used as the thawing medium. It was used after warming to 37 degreeC at the time of use.
  • Frozen myocardial cells were thawed in a 37° C. water bath and suspended in a thawing medium. Centrifuge at 300 ⁇ g for 5 minutes and remove the supernatant. Cells were suspended in a thawing medium, adjusted to 2 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 6 cells/mL, then counted and plated at 8 ⁇ 10 4 cells/well on an iMatrix-511silk-coated test 96-well plate. Cells were seeded and placed in a 37° C., 5% CO 2 incubator. Experiments were performed in triplicate.
  • RNA extraction miRNeasyMiniKit (product number 217004, manufactured by Qiagen)
  • cDNA synthesis ReverTraAce (R)
  • qPCR RT MasterMix with gDNA Remover product number FSQ-301, manufactured by TOYOBO
  • qPCR reaction PowerUp SYBRGreenMasterMix (product number A25776, ThermoFisher) QuantStudio6 FlexReal-time PCR system (manufactured by ThermoFisher) Nanophotometer spectrophotometer C40 (manufactured by Wakenby Tech Co., Ltd.)
  • RNA Extraction After removing the culture supernatant of cardiomyocytes, QIAZOL (manufactured by Qiagen) was added and suspended to lyse the cells, and the lysate was collected in a tube. Thereafter, RNA was extracted according to the protocol attached to the miRNeasyMiniKit, and the RNA concentration was measured with a Nanophotometer spectrophotometer C40.
  • FIG. 1 shows the results of gene expression level analysis.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Examples 1 to 9 Changes in drug responsiveness due to differences in test plate material (Method) Using C plates (Comparative Examples 1 to 9) and T plates (Examples 1 to 9) as test plates, drugs were added and calcium transients were analyzed.
  • ⁇ Culture schedule> Cell culture was performed according to the following schedule. The day after cell wakeup is defined as Day 0, and subsequent days are represented.
  • Day-1 Reagent preparation and preparation Day0: Frozen cardiomyocyte sleep, plate precoating, and seeding on test 96-well plate (step (A)), culture (step (B))
  • Day 1 Culture by exchanging the medium with CDI maintenance medium (step (C))
  • Day 4 to 13 Culturing by exchanging the medium with a special maintenance medium every 2 days (step (C))
  • Day 14 Using a special maintenance medium, drug addition and calcium transient analysis (step (D), step (E))
  • ⁇ iMatrix-511silk coating method for test plate 19.2 ⁇ L of iMatrix-511silk was added to 3 mL of the special basal medium and diluted to prepare a coating solution. The coating solution was added to the test 96-well plate at 100 ⁇ L/well (concentration used: 1 ⁇ g/cm 2 ) and allowed to stand in a 37°C incubator for 1 hour. Myocardial cells were seeded without removing the coating solution.
  • Y-27632 was added to CarmyA's special seeding medium to a final concentration of 10 ⁇ M and used as a special thawed seeding medium. It was used at room temperature before use. Frozen cardiomyocytes were thawed in a 37° C. water bath and suspended in a special thaw seeding medium. Centrifuge at 300 ⁇ g for 5 minutes and remove the supernatant. Cells were suspended in a special thawing and seeding medium, adjusted to 2 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 6 cells/mL, and then counted. Cells were seeded in wells (medium volume: 200 ⁇ L) and allowed to stand in a 37° C., 5% CO 2 incubator. Experiments were performed in triplicate.
  • the drugs were DMSO at a final concentration of 0.1%, bepridil at a final concentration of 1 ⁇ M, 2 ⁇ M and 4 ⁇ M, pentamidine at a final concentration of 11.1 ⁇ M, 33.3 ⁇ M and 100 ⁇ M, and isoproterenol at a final concentration of 20 nM, 100 nM and 500 nM.
  • Bepridil at a final concentration of 1 ⁇ M, 2 ⁇ M and 4 ⁇ M, pentamidine at a final concentration of 11.1 ⁇ M, 33.3 ⁇ M and 100 ⁇ M, and isoproterenol at a final concentration of 20 nM, 100 nM and 500 nM were added to the T plate, respectively.
  • Bepridil at a final concentration of 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, and 4 ⁇ M, pentamidine at a final concentration of 11.1 ⁇ M, 33.3 ⁇ M, and 100 ⁇ M, and isoproterenol at a final concentration of 20 nM, 100 nM, and 500 nM were added to the C plate for comparison.
  • Figure 2 shows the results for 0.1% DMSO
  • Figure 3 shows the results for 1 ⁇ M bepridil
  • Figure 4 shows the enlarged EAD-like waveforms for the results for 1 ⁇ M bepridil
  • Figure 5 shows the results for 2 ⁇ M bepridil
  • Figure 6 shows the results for 4 ⁇ M bepridil.
  • 7A, 7B for 11.1 ⁇ M pentamidine
  • FIGS. 8A, 8B for 33.3 ⁇ M pentamidine
  • FIGS. 9A, 9B for 100 ⁇ M pentamidine
  • Results for telenol are shown in FIG.
  • Bepridil is one of the calcium channel blockers used to treat angina pectoris, but it is known to induce lethal ventricular arrhythmia called torsadedepointes (TdP) as a side effect.
  • TdP lethal ventricular arrhythmia
  • its proarrhythmic action is considered difficult to detect in an in vitro test system using cardiomyocytes or the like differentiated from iPS cells.
  • Example 1 it was revealed that an EAD-like waveform that triggers torsadedepointes (TdP) could be detected, and that the proarrhythmic action of bepridil could be detected.
  • Pentamidine is one of the antibacterial drugs, but it is known to induce arrhythmia, and its mechanism of action is hERG (human ether-a-go-go related gene) protein membrane translocation (traffic) inhibition. It is assumed. Therefore, pentamidine is known to require long-term exposure in order to develop its proarrhythmic action. The fact that arrhythmia was detected 24 hours after the addition of pentamidine in Example 4 is reasonable considering the action mechanism of pentamidine. It is considered that the effect can be detected.
  • the acute arrhythmia detected on the C plate was 10 minutes after the addition of pentamidine, so it is highly possible that it is a non-specific action different from the hERG protein membrane translocation (trafficking) inhibitory action. . No such non-specific effects were seen with the T-plate, suggesting that the use of the T-plate can reduce false positives when assessing drug effects.
  • Isoproterenol is a ⁇ 1, ⁇ 2 receptor agonist and has a heart rate increasing effect (tachycardiac effect).
  • the use of the T plate enabled stable detection of the heart rate-increasing effect (tachycardia effect) even at a lower concentration of isoproterenol. It is believed that the use of the T-plate allows the evaluation of drug effects with higher sensitivity than the C-plate.
  • test plates with high oxygen permeability (method) Using a test plate made of PDMS with high oxygen permeability, the effect on cardiomyocyte culture was examined.
  • G plate manufactured by TCPS, Reference Example 3
  • T plate Reference Example 4
  • V plate manufactured by PDMS, Reference Example 5
  • ⁇ Culture schedule> Cell culture was performed according to the following schedule. The day after cell wakeup is defined as Day 0, and subsequent days are represented.
  • Day 6 Microscopic observation
  • iMatrix-511silk coating of test plates frozen cardiomyocyte initiation and seeding were performed as in Examples 1-9, except that a special thaw seeding medium was used.
  • the cells were observed under a bright field using a microscope and photographed. Moreover, it observed also with the fluorescence microscope, and the moving image and the still image were image
  • FIG. 13 shows a photograph of cells observed 6 days after seeding.
  • the left is a photograph of Reference Example 3 using a G plate
  • the center is a photograph of Reference Example 4 using a T plate
  • the right is a photograph of Reference Example 5 using a V plate.
  • the cardiomyocytes were sufficiently adhered to the test plate.
  • a synchronized beat-like waveform was detected.
  • Reference Example 5 using the V plate cardiomyocytes were not sufficiently adhered to the test plate, and cell clusters were observed. Further, when fluorescence observation was performed, no synchronized beat-like waveform was detected.
  • test plate is made of PDMS with high oxygen permeability, it is impossible to culture cardiomyocytes, especially to detect beat-like waveforms.
  • Example 10 to 17 Study of medium (method) A T plate or G plate was used as a test plate, and a special maintenance medium or CDI maintenance medium was added as a medium after the first day of seeding, and calcium transients were analyzed.
  • Day-1 Reagent preparation and preparation Day0: Using a special basal medium, precoating the plate, using a special thawing seeding medium, frozen cardiomyocytes sleep, seeding into a 96-well plate for testing (step (A )), culture (step (B))
  • Day 1 Culture by exchanging the medium with a special maintenance medium or CDI maintenance medium (step (C))
  • step (C)) Day 3 to 13: Culturing by replacing the medium with a special maintenance medium or CDI maintenance medium every 2 days (step (C))
  • Day 14 medium exchange, drug addition, calcium transient analysis (step (D), step (E))
  • ⁇ Culture medium> The iMatrix-511 silk coating of the test plates was done with a special basal medium. Sleeping and seeding of frozen cardiomyocytes was performed using a special thawing seeding medium. A special maintenance medium or a CDI maintenance medium was used for medium exchange, drug addition, and calcium transient analysis after the first day of seeding.
  • DMSO DMSO was added at a final concentration of 0.1%
  • bepridil at a final concentration of 0.06 ⁇ M, 0.25 ⁇ M, 1 ⁇ M and 4 ⁇ M.
  • a special maintenance medium was used as the medium after the first day of seeding, and bepridil was added to a final concentration of 0.06 ⁇ M, 0.25 ⁇ M, 1 ⁇ M, and 4 ⁇ M, respectively, in Examples 10 to 13,
  • Examples 14 to 17 were obtained by using a CDI maintenance medium as the medium after the first day of seeding and adding bepridil to final concentrations of 0.06 ⁇ M, 0.25 ⁇ M, 1 ⁇ M and 4 ⁇ M.
  • Comparative Examples 10 to 13 Comparative Examples 14 to 17 were obtained by using a CDI maintenance medium as a medium after the first day of seeding, and adding bepridil to final concentrations of 0.06 ⁇ M, 0.25 ⁇ M, 1 ⁇ M and 4 ⁇ M.
  • a drug (verapamil) was added to the plates subjected to medium exchange A or B approximately 30 minutes after the medium exchange.
  • Drugs were dissolved in DMSO to make 10 mM stock solutions and diluted with special maintenance medium to make 10 mM stock solutions 10 times the target final concentration to serve as supplemental drug solutions.
  • the drug solution for addition was added to the measurement medium in an amount of 1/10 of the amount of the measurement medium. For example, when adding verapamil at a final concentration of 10 nM, a 10 mM stock solution was diluted with a special maintenance medium to prepare a 100 nM additive drug solution, and 15 ⁇ L of the additive drug solution was added to 150 ⁇ L of the measurement medium.
  • DMSO was added to the control group at a final concentration of 0.1%.
  • Examples 18 and 19 were obtained by performing medium exchange A or B and adding verapamil to a final concentration of 10 nM, respectively.
  • Examples 20 and 21 were obtained by performing medium exchange A or B and adding verapamil to a final concentration of 100 nM, respectively.
  • FIG. 24 shows the results of adding verapamil at a final concentration of 10 nM
  • FIG. 25 shows the results of adding verapamil at a final concentration of 100 nM.
  • Pre indicates the value before addition of the drug
  • Post indicates the value after addition of the drug.
  • 24A is the result of Pre of medium exchange A
  • FIG. 24B is the result of Pre of medium exchange B
  • FIG. 24C is the result of Post of medium exchange A
  • FIG. 24D is the result of Post of medium exchange B
  • 25A is the result of Pre of medium exchange A
  • FIG. 25B is the result of Pre of medium exchange B
  • FIG. 25C is the result of Post of medium exchange A
  • FIG. 25D is the result of Post of medium exchange B.
  • FIG. 25A is the result of Pre of medium exchange A
  • FIG. 25B is the result of Pre of medium exchange B
  • FIG. 25C is the result of Post of medium exchange A
  • FIG. 25D is the result of Post of medium exchange B.
  • Verapamil is a calcium ion channel blocker. Verapamil is known to have a weak heart effect (negative inotropic effect) and a QT shortening effect, which lowers the calcium ion concentration in myocardial cells and attenuates the contractility of myocardial cells. Verapamil is a drug that has a low clinical TdP risk level and is predicted to have a low TdP risk level even in a conventional arrhythmogenic model using cardiomyocytes differentiated from iPS cells. The method according to one aspect of the present invention made it possible to detect a weak heart effect (negative inotropic effect) of verapamil.
  • the conventional arrhythmia-promoting model using cardiomyocytes differentiated from iPS cells predicts a low TdP risk level.
  • Bepridil, risperidone, and terfenadine were used as representative examples of antiviral drugs.
  • the clinical TdP risk level is low, conventional arrhythmia-promoting models using cardiomyocytes differentiated from iPS cells predict a high TdP risk level. Ranolazine was used.
  • Drugs were added in the same manner as in Examples 18-21.
  • Examples 22, 23, 24 and 25 were obtained by adding verapamil to final concentrations of 60 nM, 250 nM, 1000 nM and 4000 nM, respectively.
  • Examples 26, 27, 28 and 29 were obtained by adding E-4031 to final concentrations of 1 nM, 10 nM, 100 nM and 1000 nM, respectively.
  • Examples 30, 31, 32 and 33 were obtained by adding bepridil to final concentrations of 60 nM, 250 nM, 1 ⁇ M and 40 ⁇ M, respectively.
  • Examples 34, 35, 36 and 37 were obtained by adding bepridil to final concentrations of 312 nM, 1.25 ⁇ M, 5 ⁇ M and 20 ⁇ M, respectively.
  • Example 38, Example 39, Example 40 and Example 41 were prepared by adding risperidone to final concentrations of 1 nM, 10 nM, 0.1 ⁇ M and 1 ⁇ M, respectively.
  • Example 42, Example 43, Example 44 and Example 45 were prepared by adding risperidone to final concentrations of 60 nM, 250 nM, 1 ⁇ M and 4 ⁇ M, respectively.
  • Examples 46, 47, 48 and 49 were obtained by adding terfenadine to final concentrations of 0.25 nM, 1 nM, 4 nM and 16 nM, respectively.
  • Examples 50, 51, 52 and 53 were obtained by adding ranolazine to final concentrations of 10 nM, 100 nM, 1000 nM and 10000 nM, respectively.
  • the minimum value of the peak is 0 and the maximum value of the peak is 1
  • the elapsed time from t0 to the time when the value (0.7), which is 30% less than the peak maximum value, was measured was reduced by CAD 30, 80%
  • the elapsed time from t0 to the time when the value (0.2) was measured was taken as CAD80.
  • a conceptual diagram is shown in FIG.
  • CAD30 and CAD80 are values that serve as indexes of the QT time, as shown in the conceptual diagram of FIG.
  • QT is prolonged
  • CAD30 and CAD80 or either one is shortened
  • QT is shortened.
  • E-4031 is a potassium ion channel blocker and is known to induce EAD and TdP.
  • E-4031 has a high clinical TdP risk level, and is a drug that is predicted to have a high TdP risk level even in a conventional arrhythmogenic model using cardiomyocytes differentiated from iPS cells. 29 and 30, QT prolongation was observed from 10 nM, and the QT prolongation was more pronounced at 100 nM, and the proarrhythmic action of E-4031 could be detected in a concentration-dependent manner.
  • the method according to one aspect of the present invention allowed detection of the proarrhythmia effect of E-4031.
  • Bepridil is a calcium channel blocker originally approved as an antianginal drug, but is also a Group IV antiarrhythmic drug (according to the Vaughan Williams classification). Bepridil has a so-called multi-ion channel blocking action that inhibits not only calcium ion channels but also sodium ion channels and potassium ion channels. Bepridil is known to induce QT prolongation and torsades de pointes (TdP) based on potassium ion channel inhibition. 31 and 32, QT prolongation was detected by addition of 60 nM to 4000 nM bepridil, but concentration dependence was not observed. At 1 ⁇ M, an EAD-like waveform was detected.
  • Risperidone an atypical antipsychotic drug with dopamine 2 receptor and serotonin 2A receptor antagonism, is known to induce QT prolongation.
  • concentration-dependent QT prolongation was detected by addition of 1 nM to 1 ⁇ M risperidone. Therefore, an experiment was conducted by changing the concentration range of risperidone. 37 and 39, addition of 60 nM, 250 nM, and 1000 nM of risperidone detected concentration-dependent QT prolongation, and particularly at 250 nM, an EAD-like waveform was also detected (arrow in FIG. 37).
  • the method according to one aspect of the present invention made it possible to detect the proarrhythmia effect of risperidone.
  • concentration-dependent QT prolongation was not detected by addition of 0.25 nM to 16 nM terfenadine. However, at 4 nM, an abnormal waveform was detected (arrow in FIG. 39).
  • the method according to one aspect of the present invention made it possible to detect the proarrhythmia effect of terfenadine.
  • Ranolazine is a sodium ion channel blocker. Ranolazine has a low risk of causing arrhythmia in vivo, but QT prolongation is detected in myocardial cells differentiated from iPS cells, and it is known to be determined to have proarrhythmic action. That is, ranolazine is known to be determined as a false positive in a conventional arrhythmogenic model using cardiomyocytes differentiated from iPS cells.
  • ranolazine was not evaluated as having proarrhythmic effects. That is, according to the method of one aspect of the present invention, even a drug that is determined as a false positive in a conventional proarrhythmia model using cardiomyocytes differentiated from iPS cells can be correctly determined as negative. can reduce false positives.

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Abstract

本発明の一態様は、心筋細胞に対する作用を評価する方法に関し、該方法は、薬剤の、心筋細胞に対する作用を評価する方法であって、培養容器の培養面に心筋細胞を播種する工程（Ａ）、前記工程（Ａ）で得られた心筋細胞を培養する工程（Ｂ）、前記培養された心筋細胞を前記薬剤に曝露させる工程（Ｄ）、及び前記工程（Ｄ）で得られた心筋細胞の細胞機能の指標を分析して評価する工程（Ｅ）を含み、前記培養容器の培養面の少なくとも一部が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されている、方法。

Description

薬剤の、心筋細胞に対する作用を評価する方法
　本発明の一態様は、薬剤の、心筋細胞に対する作用を評価する方法に関する。
　新薬の候補薬剤は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験系により、期待される作用（主作用）の有無を評価され、効果の高いものだけが次の開発過程に進む。そのため、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験系は、薬剤の濃度が低くてもその作用を検出でき、また偽陽性の検出が少ないことが重要である。
　臨床開発まで進んだ薬剤は、深刻な副作用が見つかると、新薬としての開発が中止となり得る。心毒性（特に、致死性の不整脈）は、肝毒性及び神経毒性と共に最も深刻な副作用である。また、上市された薬剤の中でも、循環器薬領域の薬剤ばかりではなく、抗アレルギー薬、消化器治療薬、抗菌薬などが、心毒性の発生により市場から撤退していることも少なくない。従って、創薬の初期段階において、薬剤の主作用を検出するだけでなく、心毒性も評価することが必要とされている。
　近年、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化誘導したヒト心筋細胞を用いて、薬剤の主作用及び心毒性を評価する手法が開発されている。例えば、非特許文献１は、ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を、トリプシン溶液で処理した後、心筋細胞用の培養液に播種し、培養することで、拍動するシート状の心筋細胞を作成し、得られたシート状の心筋細胞を一定の濃度範囲の薬剤に曝露し、心筋細胞の電気生理学的変化を細胞外電位記録によって測定することを開示する。また、特許文献１には、心筋細胞に対する酸素供給量を高めるための構成により、心筋細胞への酸素供給速度を高めて行う、心筋細胞の薬剤応答性試験方法が開示されている。
国際公開第２０１９／１３１８０６号
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｏｘｉｃｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７　Ｍａｒ－Ａｐｒ；８４：１１１－１２７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｓｃｎ．２０１６．１２．００３．Ｅｐｕｂ、２０１６、Ｄｅｃ１０．
　本発明者らは、創薬の初期段階において安全性の高い化合物を効率よく選択するためには、薬剤の主作用を検出するだけでなく、心毒性を精度良く評価し得るｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験系の構築が重要な課題であると考えた。
　従来のｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験系では、薬剤によっては、心筋細胞に対する作用を評価できないことがあった。例えば、ある種の薬剤は、薬剤の濃度が低いとその作用が検出されず、また、薬剤の濃度が高いと心筋細胞の拍動が停止してしまい、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験系では検出が難しかった。ベプリジルの催不整脈作用がこの例である。また、薬剤の濃度を高くしないと、心筋細胞に対する作用を検出できない等、感度が充分に高くない場合もあった。さらに、非特異的な作用も検出してしまうなど、偽陽性を多く検出する場合もあった。
　本発明の一態様は、薬剤の、心筋細胞に対する作用を精度良く評価することができる方法を提供する。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した。その結果、以下の構成を有することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明の態様は、例えば以下の〔１〕～〔１７〕に関する。
〔１〕　薬剤の、心筋細胞に対する作用を評価する方法であって、
　培養容器の培養面に心筋細胞を播種する工程（Ａ）、
　前記工程（Ａ）で得られた心筋細胞を培養する工程（Ｂ）、
　前記培養された心筋細胞を前記薬剤に曝露させる工程（Ｄ）、及び
　前記工程（Ｄ）で得られた心筋細胞の細胞機能の指標を分析して評価する工程（Ｅ）を含み、
　前記培養容器の培養面の少なくとも一部が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されている、方法。
〔２〕　前記工程（Ｂ）で得られた心筋細胞をさらに培養する工程（Ｃ）を含み、
　前記工程（Ｃ）及び（Ｄ）が、遊離脂肪酸１～１００μｇ／ｍＬを含有する培地（β）中で行われる、〔１〕に記載の方法。
〔３〕　前記培地（β）が、更に、リゾホスファチジルコリン１～１００μｇ／ｍＬ、トリアシルグリセリド１～１００μｇ／ｍＬ、ホスファチジルコリン１～１００μｇ／ｍＬ、ホスファチジン酸１～１００μｇ／ｍＬ、コレステロール０．１～１０μｇ／ｍＬ、及びスフィンゴミエリン０．１～１０μｇ／ｍＬから選ばれる少なくとも１種を含有する、〔２〕に記載の方法。
〔４〕　前記工程（Ａ）及び（Ｂ）が、代替血清を含有する無血清培地（α）中で行われる、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕　前記４－メチル－１－ペンテン重合体が、４－メチル－１－ペンテンとエチレン及び炭素数３～２０のα－オレフィン（４－メチル－１－ペンテンを除く）から選ばれる少なくとも１種のオレフィンとの共重合体である、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕　前記培養容器の培養面全体が、４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されている、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕　前記培養面が、ラミニンを含むコーティング剤でコートされている、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕　前記心筋細胞が、人工多能性幹細胞を分化させた心筋細胞である、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕　前記心筋細胞が、人工多能性幹細胞をプロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法により分化させた心筋細胞である、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕　前記作用が、心毒性である、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕　前記心毒性が、催不整脈作用である、〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕　前記心毒性が、心筋傷害作用である、〔１０〕に記載の方法。
〔１３〕　前記細胞機能の指標が、ミトコンドリア機能の指標である、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕　前記細胞機能の指標が、カルシウムイオン波形である、〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕　前記工程（Ｅ）において、早期後脱分極（ＥＡＤ）を検出する、〔１〕～〔１１〕、〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕　前記作用が、頻脈作用又は徐脈作用である、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕　前記細胞機能の指標が、カルシウムイオン波形である、〔１６〕に記載の方法。
　本発明の一態様によれば、薬剤の、心筋細胞に対する作用を精度良く評価することができる。より具体的には、本発明の一態様によれば、低濃度でも薬剤の作用を評価することができる。また、本発明の一態様によれば偽陽性を減らすことができる。本発明の一態様によれば、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞等を用いた従来のｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験系では検出が難しいとされていた薬剤の作用を検出できる。
図１は、Ｃプレート又はＴプレートを用いた場合における、ｃＴｎＴ、ＭＹＬ２、Ｋｉｒ２．１、ＰＧＣ１αの発現量を比較した結果を示す。 図２は、０．１％ＤＭＳＯを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図３は、１μＭベプリジルを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。図中の矢印は、ＥＡＤ様波形を示す。 図４は、図３のカルシウムイオン波形におけるＥＡＤ様波形を拡大して示す。 図５は、２μＭベプリジルを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図６は、４μＭベプリジルを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図７Ａは、Ｔプレートに１１．１μＭペンタミジンを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。添加前（ｐｒｅ）、添加１０分後（１０ｍｉｎ）、添加２４時間後（２４ｈ）、添加４８時間後（４８ｈ）の結果を示す。 図７Ｂは、Ｃプレートに１１．１μＭペンタミジンを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。添加前（ｐｒｅ）、添加１０分後（１０ｍｉｎ）、添加２４時間後（２４ｈ）、添加４８時間後（４８ｈ）の結果を示す。 図８Ａは、Ｔプレートに３３．３μＭペンタミジンを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。添加前（ｐｒｅ）、添加１０分後（１０ｍｉｎ）、添加２４時間後（２４ｈ）、添加４８時間後（４８ｈ）の結果を示す。 図８Ｂは、Ｃプレートに３３．３μＭペンタミジンを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。添加前（ｐｒｅ）、添加１０分後（１０ｍｉｎ）、添加２４時間後（２４ｈ）、添加４８時間後（４８ｈ）の結果を示す。 図９Ａは、Ｔプレートに１００μＭペンタミジンを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。添加前（ｐｒｅ）、添加１０分後（１０ｍｉｎ）、添加２４時間後（２４ｈ）、添加４８時間後（４８ｈ）の結果を示す。 図９Ｂは、Ｃプレートに１００μＭペンタミジンを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。添加前（ｐｒｅ）、添加１０分後（１０ｍｉｎ）、添加２４時間後（２４ｈ）、添加４８時間後（４８ｈ）の結果を示す。 図１０は、２０ｎＭイソプロテレノールを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図１１は、１００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図１２は、５００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図１３は、Ｇプレート、Ｔプレート、Ｖプレートを用いて、心筋細胞を顕微鏡で観察した写真である。上段は明視野で観察した写真であり、下段は蛍光顕微鏡でＧＣａＭＰの蛍光を観察した写真である。上限、下段共に、対物倍率は４倍である。 図１４は、Ｔプレートを用いて、０．１％ＤＭＳＯを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図１５は、Ｇプレートを用いて、０．１％ＤＭＳＯを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図１６は、Ｔプレートを用いて、０．０６μＭベプリジルを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図１７は、Ｇプレートを用いて、０．０６μＭベプリジルを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図１８は、Ｔプレートを用いて、０．２５μＭベプリジルを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図１９は、Ｇプレートを用いて、０．２５μＭベプリジルを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図２０は、Ｔプレートを用いて、１μＭベプリジルを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図２１は、Ｇプレートを用いて、１μＭベプリジルを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図２２は、Ｔプレートを用いて、４μＭベプリジルを添加した場合のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図２３は、Ｇプレートを用いて、４μＭベプリジルを添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図２４は、ベラパミルを終濃度１０ｎＭで添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図２５は、ベラパミルを終濃度１００ｎＭで添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である 図２６は、ＣＡＤ３０、ＣＡＤ８０を説明する概念図である。 図２７は、ベラパミルを６０ｎＭ～４μＭで添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図２８Ａは、ベラパミルを６０ｎＭ～４μＭで添加した場合のＣＡＤ３０、図２８Ｂは、ベラパミルを添加した場合のＣＡＤ８０を示すグラフである。 図２９は、Ｅ－４０３１を１ｎＭ～１０００ｎＭで添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図３０Ａは、Ｅ－４０３１を１ｎＭ～１０００ｎＭで添加した場合のＣＡＤ３０、図３０Ｂは、Ｅ－４０３１を添加した場合のＣＡＤ８０を示すグラフである。 図３１は、ベプリジルを６０ｎＭ～４μＭで添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図３２Ａは、ベプリジルを６０ｎＭ～４μＭで添加した場合のＣＡＤ３０、図３２Ｂは、ベプリジルを６０ｎＭ～４μＭで添加した場合のＣＡＤ８０を示すグラフである。 図３３は、ベプリジルを３１２ｎＭ～２０μＭで添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図３４Ａは、ベプリジルを３１２ｎＭ～２０μＭで添加した場合のＣＡＤ３０、図３４Ｂは、ベプリジルを３１２ｎＭ～２０μＭで添加した場合のＣＡＤ８０を示すグラフである。 図３５は、リスペリドンを１ｎＭ～１μＭで添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図３６Ａは、リスペリドンを１ｎＭ～１μＭで添加した場合のＣＡＤ３０、図３６Ｂは、リスペリドンを１ｎＭ～１μＭで添加した場合のＣＡＤ８０を示すグラフである。 図３７は、リスペリドンを６０ｎＭ～４μＭで添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図３８Ａは、リスペリドンを６０ｎＭ～４μＭで添加した場合のＣＡＤ３０、図３８Ｂは、リスペリドンを６０ｎＭ～４μＭで添加した場合のＣＡＤ８０を示すグラフである。 図３９は、テルフェナジンを０．２５ｎＭ～１６ｎＭで添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図４０Ａは、テルフェナジンを０．２５ｎＭ～１６ｎＭで添加した場合のＣＡＤ３０、図４０Ｂは、テルフェナジンを添加した場合のＣＡＤ８０を示すグラフである。 図４１は、ラノラジンを１０ｎＭ～１００００ｎＭで添加した場合の心筋細胞のカルシウムイオン波形を示す。撮影時間は２０秒、フレーム率は１４．２３フレーム／秒である。 図４２Ａは、ラノラジンを１０ｎＭ～１００００ｎＭで添加した場合のＣＡＤ３０、図４２Ｂは、ラノラジンを添加した場合のＣＡＤ８０を示すグラフである。
　なお、図２～図６、図１０～１２、図１４～図２５、図２７、図２９、図３１、図３３、図３５、図３７、図３９、図４１において、左側の縦軸はＩｎｔｅｎｓｉｔｙ、右側の縦軸はＭｏｖｅｍｅｎｔ、横軸はＴｉｍｅ（ｆｒａｍｅ）であり、グラフはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅを示す。また、図７～図９において、縦軸はＩｎｔｅｎｓｉｔｙ、横軸はＴｉｍｅ（ｆｒａｍｅ）であり、グラフはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅを示す。また、図２８、図３０、図３２、図３４、図３６、図３８、図４０、図４２において、Ａの縦軸はＣＡＤ３０、Ｂの縦軸はＣＡＤ８０を示す。
　次に本発明について具体的に説明する。
　本発明の一態様は、薬剤の、心筋細胞に対する作用を評価する方法であって、培養容器の培養面に心筋細胞を播種する工程（Ａ）、前記工程（Ａ）で得られた心筋細胞を培養する工程（Ｂ）、前記培養された心筋細胞を前記薬剤に曝露させる工程（Ｄ）、及び前記工程（Ｄ）で得られた心筋細胞の細胞機能の指標を分析して評価する工程（Ｅ）を含み、前記培養容器の培養面の少なくとも一部が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されている。
　培養面の少なくとも一部が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されている培養容器を培養容器（Ｘ）と称する。
［薬剤の、心筋細胞に対する作用を評価する方法］
　本発明の一態様における薬剤は、特に制限されないが、心筋細胞への作用が既知の物質であってもよく、例えば、イソプロテレノール、ペンタミジン、ベプリジル、ベラパミル、Ｅ－４０３１、テルフェナジン、アステミゾール、クロマノール２９３ｂ、メキシレチン、ニフェジピン、プロプラノール、ミルリノン、非特許文献１に記載の薬剤などである。本発明の一態様である方法により、心筋細胞に対する作用を精度良く評価することができることから、これらの中でも、イソプロテレノール、ペンタミジン、ベプリジル、ベラパミル、Ｅ－４０３１が好ましい。
　イソプロテレノールは、非選択的β作動薬で、頻脈効果、強心効果を有する。ペンタミジンは、抗菌薬の１つであるが、不整脈を誘発する作用を有する。ベプリジルは、狭心症の治療に用いられるカルシウム拮抗薬の一つであるが、副作用としてｔｏｒｓａｄｅ　ｄｅ　ｐｏｉｎｔｅｓ（ＴｄＰ）といわれる致死性の心室性不整脈及びＱＴ延長を誘発することが知られている。ミルリノンは、ホスホジエステラーゼＩＩＩ阻害剤で、同じく頻脈効果、強心効果を有する。ベラパミルは、Ｌ型カルシウムチャネル阻害剤である。Ｅ－４０３１は、ｈＥＲＧ型カリウムチャネル阻害剤である。テルフェナジンは、抗アレルギー薬で、ＱＴ延長を引き起こすことが知られている。アステミゾールは、抗アレルギー薬で、ＱＴ延長を引き起こすことが知られている。クロマノール２９３ｂは、電位依存性カリウムチャネルＫＣＮＱ１阻害剤である。メキシレチンは、電位依存性ナトリウムチャネル阻害剤である。ニフェジピンは、Ｌ型カルシウムチャネル阻害剤である。プロプラノールは、β遮断薬で、徐脈効果を有する。
　Ｋｓｅｎｉａ　Ｂ．　ｅｔ．ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｆｏｒ　Ｄｒｕｇ　Ｐｒｏａｒｒｈｙｔｈｍｉｃ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　２４、２０１８　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２５、３５８２－３５９２（以下、「文献Ａ」という）には、ｉＰＳ細胞を分化させたヒト心筋細胞を用いて、薬剤の催不整脈作用を評価する方法について、多施設において国際的な検証試験が行われた結果が報告されている。本発明の一態様における薬剤としては、例えば、文献Ａにおいて評価された２８の薬剤、すなわち、イブチリド、ｄｌ－ソタロール、アジミリド、ドフェチリド、キニジン、ジソピラミド、バンデタニブ、ベプリジル、ドンペリドン、オンダンセトロン、アステミゾール、シサプリド、ピモジド、クラリスロマイシン、リスペリドン、テルフェナジン、クロルプロマジン、クロザピン、ラノラジン、メトプロロール、メキシレチン、ロラタジン、タモキシフェン、ニトレンジピン、ニフェジピン、ジルチアゼム、ベラパミルを用いることもできる。これらの中でも、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた、従来の催不整脈モデルではリスクレベルの予測が困難である薬剤が好ましく、臨床的なＴｄＰのリスクレベルが高リスク又は中リスクであるのに、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた、従来の催不整脈モデルではＴｄＰのリスクレベルが低く予測されてしまう薬剤、臨床的なＴｄＰのリスクレベルは低リスクであるのに、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた、従来の催不整脈モデルではＴｄＰのリスクレベルが高く予測されてしまう薬剤がより好ましく、ベプリジル、リスペリドン、テルフェナジン、ラノラジンがさらに好ましい。
　薬剤は、心筋細胞への作用が未知の物質であってもよく、例えば、新薬候補物質、心毒性を有することが疑われる物質、又は心筋細胞への主作用が期待される候補物質である。
　薬剤は、低分子医薬品に包含される低分子化合物であってもよいし、高分子医薬品に包含される、タンパク質、抗体、核酸、多糖などの高分子化合物であってもよい。薬剤は、新規な物質でも公知の物質でもよい。
　薬剤の作用とは、薬剤の有する主作用及び副作用を包含する。
　薬剤の、心筋細胞に対する主作用とは、該薬剤が有する薬理作用の中で、本来期待される作用であり、例えば、徐脈作用（陰性変時作用）、頻脈作用（陽性変時作用）、強心作用（陽性変力作用）、弱心作用（陰性変力作用）である。薬剤の、心筋細胞に対する主作用は、本発明の方法により、薬剤が低濃度であっても検出できることから、好ましくは頻脈作用又は徐脈作用である。
　薬剤の、心筋細胞に対する副作用とは、該薬剤が有する、治療に関係がない、又は治療の妨げとなる薬理作用のことである。心筋細胞に対する副作用としては、例えば、心毒性が挙げられ、心毒性としては、催不整脈作用、及び心筋傷害作用等が挙げられる。催不整脈作用は、既にある不整脈を悪化させる、又は新たな不整脈を起こす作用であり、例えば、ＱＴ延長、早期後脱分極（ＥＡＤ）、遅延後脱分極（ＤＡＤ）、トルサード・ド・ポワント（ＴｄＰ）、トリガードアクティビティ不整脈、及びリエントリー不整脈を引き起こす作用が挙げられる。心筋傷害作用は、不可逆的心筋障害であっても、可逆的心筋障害であってもよい。
　本発明の一態様である方法により、精度良く検出できることから、前記副作用は、好ましくは催不整脈作用、さらに好ましくはＱＴ延長、早期後脱分極（ＥＡＤ）を引き起こす作用である。
　本発明の一態様である方法により、精度良く検出できることから、前記副作用は、好ましくは心筋傷害作用であり、より好ましくはミトコンドリア毒性である。
　本発明の一態様である方法は、創薬プロセスにおいて、医薬品の安全性及び有効性を評価するために利用することができる。すなわち、心筋細胞への作用が未知の物質を薬剤として用いると、低濃度であっても該物質の主作用又は副作用を評価することができ、また、偽陽性を検出しにくい。さらに、後のｉｎ　ｖｉｖｏ試験で心毒性が問題となるであろう物質を、より早い段階のｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験系において、心毒性が予測される物質として検出することができる。また、心筋細胞への作用が既知の物質を薬剤として用いると、低濃度であっても該物質の既知の主作用又は副作用を確認し、又は、該物質の新たな主作用又は副作用を評価することができ、また、偽陽性を検出しにくい。特に、ｉｎ　ｖｉｖｏで心毒性が報告されている又は疑いがある物質を薬剤として用いると、ｉｎ　ｖｉｖｏ試験よりも簡便に心毒性を検出でき、また心毒性を生じるメカニズムの解析を行うことができる。
［心筋細胞］
　心筋細胞は、多能性幹細胞を分化させた心筋細胞であってもよいし、生物の心臓から単離された初代培養心筋細胞であってもよい。また、市販されている多能性幹細胞を分化させた心筋細胞、例えば、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ社のｉＣｅｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ、タカラバイオ社のＭｉｒａＣｅｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｖ２、Ａｘｏｇｅｎｅｓｉｓ社のＣｏｒ．４Ｕ、マイオリッジ社のＣａｒｍｙＡ、ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ社のＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏ２などであってもよい。
　多能性幹細胞とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称である。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、栄養芽幹細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ｅｐｉｂｌａｓｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌ）等が挙げられる。多能性幹細胞は、好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。
　心筋細胞は、好ましくは、多能性幹細胞を分化させた心筋細胞であり、より好ましくは、人工多能性幹細胞を分化させた心筋細胞であり、さらに好ましくは、人工多能性幹細胞を分化させた成熟心筋細胞である。人工多能性幹細胞を分化させた心筋細胞は、公知の心筋細胞分化誘導法で作製することができ、例えばプロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法を用いることができる（国際公開第２０１５／１８２７６５号を参照）。
　心筋細胞は、好ましくは、人工多能性幹細胞をプロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法により分化させた心筋細胞である。
　人工多能性幹細胞を分化させた成熟心筋細胞は、当該技術分野で、人工多能性幹細胞を分化させた未熟心筋細胞と対比して使用される用語であり、人工多能性幹細胞を分化させた未熟心筋細胞と比べて、高いイオンチャネル機能を有する。
　人工多能性幹細胞を分化させた成熟心筋細胞は、例えば、人工多能性幹細胞の分化誘導を開始してから１４日以上、好ましくは２０日以上、より好ましくは３０日以上経過した細胞である。ここで、人工多能性幹細胞の分化誘導を開始した日は、未分化状態で維持された人工多能性幹細胞を、分化状態に移行させるための処理に晒した日であり、この日を０日目とする。また、成熟心筋細胞は、分化状態を維持したまま長期間培養することが可能であるため、分化誘導を開始してからの日数の上限は特に限定されず、成熟心筋細胞を、分化状態を維持したまま長期間培養ないし保管してもよい。例えば、成熟心筋細胞は、人工多能性幹細胞の分化誘導を開始してから３６５日以上経過した細胞であっても問題ない。人工多能性幹細胞を分化させた成熟心筋細胞は、好ましくは、プロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法により人工多能性幹細胞の分化誘導を開始してから３０日以上経過した細胞をいう。
　人工多能性幹細胞を分化させた成熟心筋細胞は、人工多能性幹細胞を分化させた未熟心筋細胞に比べて、生物の心臓から単離された心筋細胞に性質が近いため、好ましい。
　心筋細胞の由来は特に制限されず、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類等の由来であってもよいが、好ましくは、哺乳類由来であり、より好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ヒツジ、ネコ、ヤギ由来であり、さらに好ましくはヒト由来である。
　心筋細胞は、正常な心筋細胞であってもよいし、遺伝子変異を含む心筋細胞又は疾患モデル心筋細胞であってもよい。
　心筋細胞は、センサータンパク質等を一過性に又は恒常的に発現するように、各種の遺伝子を導入していてもよい。心筋細胞は、センサータンパク質を一過性に又は恒常的に発現していると、細胞機能の指標を蛍光又は化学発光により検出できるため好ましい。
　センサータンパク質としては、例えば、ＧＣａＭＰ、ｃａｍｅｌｅｏｎ、ｐｅｒｉｃａｍ、Ｇ－ＧＥＣＯ、Ｂ－ＧＥＣＯ、Ｒ－ＧＥＣＯ、ＧＥＸ－ＧＥＣＯ、ＧＥＭ－ＧＥＣＯ、ＣＥＰＩＡ等のカルシウムセンサー；ｍｉｔｏ－ＭａＬｉｏｎ、ＭａＬｉｏｎＢ、ＭａＬｉｏｎＧ、ＭａＬｉｏｎＲ、ＡＴｅａｍ等のＡＴＰセンサー；ＭＡＲＩＯ等のマグネシウムセンサー；Ｇｒｅｅｎ　Ｇｌｉｆｏｎ、Ｒｅｄ　Ｇｌｉｆｏｎ等のグルコースセンサー、Ｇｒｅｅｎ　Ｌｉｎｄｏｂｌｕｍ等の乳酸センサー；Ｇｒｅｅｎ　Ｐｅｇａｓｓｏｓ等のピルビン酸センサー等が挙げられる。センサータンパク質は好ましくはカルシウムセンサー又はＡＴＰセンサーであり、より好ましくはカルシウムセンサーであり、さらに好ましくはＧＣａＭＰである。
　心筋細胞は、単一細胞の形態で用いてもよいし、心筋細胞塊の形態で用いてもよく、心筋細胞シートの形態で用いてもよい。
　心筋細胞は、培養容器（Ｘ）では酸素を効率的に供給できるので、接着性の心筋細胞、浮遊性の心筋細胞のいずれであってよいが、好ましくは接着性の心筋細胞である。
［培養容器（Ｘ）］
　培養容器（Ｘ）は、培養容器の培養面の少なくとも一部が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されている。
　本発明の一態様において、培養容器とは、細胞の培養に用いられる容器全てを意味する。前記培養容器としては、公知の各種の培養容器を用いることができ、形状及び大きさは特に制限されない。前記培養容器としては、例えば、ディッシュ、フラスコ、プレート、ボトル、バッグ、チューブ等が挙げられる。前記培養容器は通常、インキュベーター、大量培養装置、又は灌流培養装置などの装置内で用いられる。
　ここで培養面とは、細胞を培養する際に、培地及び／又は細胞が接触している面、若しくは培地及び／又は細胞が接触する予定の面を意味する。
　培養容器（Ｘ）において、「前記培養容器の培養面の少なくとも一部が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されている」とは、培養面の少なくとも一部の範囲が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されていることを意味し、培養面の全ての範囲が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されていてもよい。
　培養容器（Ｘ）は、培地を保持あるいは貯留するため、底面が培養面を含む培養容器であることが好ましい。培養容器（Ｘ）が、ディッシュ、フラスコ又はプレートの場合、底面が培養面を含むので、これらの底面、側面、上面のうち、少なくとも、底面の一部又は全部は、４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されている。少なくとも、底面の一部又は全部が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されていると、前記４－メチル－１－ペンテン重合体を介して培地中に酸素を効率的に供給でき、培地中にある細胞を効率的に増殖及び分化させやすくなる。また、細胞の機能を保持したまま、細胞を高密度で培養しやすくなる。
　培養容器（Ｘ）は、培養面全体が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されていることが好ましい。すなわち、培養容器（Ｘ）が、ディッシュ、フラスコ又はプレートの場合、底面の内側が培養面であるので、これらの底面、側面、上面のうち、底面の全部が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されていることが好ましい。
　４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材の厚さは特に限定されないが、好ましくは２０μｍ～４００μｍ、より好ましくは２０μｍ～３００μｍ、さらに好ましくは２０μｍ～２００μｍである。４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材の厚さは、培養容器の形態に応じて適宜選ばれるが、前記範囲に調整することで細胞が増殖及び分化する上で必要な適度な培地中の酸素濃度が得られやすく、また、培養容器としての強度も充分に得やすい。
　培養容器（Ｘ）は、少なくとも１つのウェルを有する培養容器であることが好ましく、少なくとも１つのウェルを有するプレートであることがさらに好ましく、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェル等のウェルを有するプレートであることがさらに好ましい。一般にウェルのようなくぼみ形状を底面に有する培養容器は、底面の複雑な形状を安定させるために底面を厚くする必要があり、細胞への酸素供給が充分に行われ難い。しかし、底面が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されていると、１ウェル、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェル等のウェルを有するプレートであっても、形状が安定しており、細胞への酸素供給も充分である。
　培養容器（Ｘ）の底面の形状は特に制限されず、平底、丸底（Ｕ底）、平底（Ｆ底）、円錐底（Ｖ底）、平底＋カーブエッジ等が挙げられる。丸底（Ｕ底）、平底（Ｆ底）、円錐底（Ｖ底）、平底＋カーブエッジ等に加工する場合には、一般の射出成形又はプレス成形で一度に加工してもよいし、フィルム又はシートを作成しておき、真空成形又は圧空成形などで２次加工を行い作成することも可能である。底面の形状は培養の目的に応じて選択されるが、細胞を２次元培養する際には、平底であることが通常は望ましく、３次元培養する際には丸底（Ｕ底）又は円錐底（Ｖ底）であることが通常は望ましい。
　培養容器（Ｘ）の培養面以外の部分は、４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材以外の材料で構成してもよい。前記材料は特に制限されず、公知の材料を用いることができる。かかる材料としては、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、熱硬化性樹脂、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ガラス等が挙げられる。
　培養容器（Ｘ）は、少なくともその培養面を、天然高分子材料、合成高分子材料、又は無機材料を含むコーティング剤でコートしてもよい。コートは公知の方法により行うことができる。
　コートされた培養容器（Ｘ）は、心筋細胞の接着性、増殖性がより優れる。これは、培養面にコートされている成分が、細胞の足場となるためと考えられる。したがって、心筋細胞を付着させて培養する際には、培養容器（Ｘ）の培養面は、天然高分子材料、合成高分子材料、又は無機材料を含むコーティング剤でコートされていることが好ましい。
　前記天然高分子材料、合成高分子材料、又は無機材料は特に制限されないが、天然高分子材料として、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリノーゲン、オステオポンチン、テネイシン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、アガロース、エラスチン、ケラチン、キトサン、フィブリン、フィブロイン、糖類；合成高分子材料として、ポリグルコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、合成ペプチド類、合成タンパク質類、ポリヒドロキシエチルメタクリラート、ポリエチレンイミン；無機材料として、β-リン酸三カルシウム、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
　前記天然高分子材料、合成高分子材料、又は無機材料は、ガラス化等の加工をしてから用いてもよい。ガラス化等の加工の例としては、従来の細胞外マトリックス成分等のハイドロゲルをガラス化した後に再水和して得られるビトリゲル、コラーゲンから作製された高密度のコラーゲン繊維網で構成されるコラーゲンビトリゲル等が挙げられる。
　心筋細胞の接着性及び心筋細胞の増殖性を向上させる、心筋細胞の機能をより長期に維持させるなどの観点から、コーティング剤は、好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ポリリジン等のタンパク質、又はペプチドを含み、より好ましくは、ラミニン、コラーゲン、ポリリジンを含み、さらに好ましくは、ラミニンを含む。すなわち、培養容器（Ｘ）の培養面が、ラミニンを含むコーティング剤でコートされていることが好ましい。
　コーティング剤は、上記の成分を、１種単独でもよいし、２種以上を組み合わせて含んでもよい。
　コーティング剤は、そのままコートに用いてもよいが、水、ＰＢＳ、培地等の溶媒で希釈してから、コートに用いることができる。心筋細胞の接着性の観点から、コーティング剤は、好ましくは、水、ＰＢＳ、培地等の溶媒で希釈してからコートに用い、より好ましくは培地で希釈してからコートに用いる。コート剤の希釈に用いる培地は特に制限されず、工程（Ａ）に用いる培地と同じであってもよく、異なる培地であってもよい。コート剤の希釈に用いる培地は、好ましくは動物血清及び代替血清を含まない培地であり、さらに好ましくはＤＭＥＭであり、特に好ましくは実施例において後述する特製基礎培地である。
　コーティング剤は、コートに用いた後、培養容器（Ｘ）から除去してもよく、培養容器（Ｘ）中に残してもよいが、心筋細胞の接着性の観点から、培養容器（Ｘ）中に残すことが好ましい。
　培養容器（Ｘ）は、少なくともその培養面の表面を加工してもよい。表面の加工としては、例えば、凹凸構造の形成加工、親水化処理、疎水化処理等の表面改質処理が挙げられる。
　表面改質処理に用いる方法は特に限定されないが、例えばコロナ処理、プラズマ処理、オゾン処理、紫外線処理等の親水化処理；エステル化、シリル化、フッ化等の疎水化処理；表面グラフト重合、化学蒸着、エッチング、又は、ヒドロキシル基、アミノ基、スルホン基、チオール基、カルボキシル基等の特定の官能基付加；シランカップリング、チタンカップリング、ジルコニウムカップリング等の特定の官能基による処理；酸化剤等による表面粗化；ラビング、サンドブラスト等の物理的処理等が挙げられる。これらの表面改質処理は、単独で行ってもよいし、２種以上を組み合わせて行ってもよい。なお、表面改質処理を行う場合には、少なくとも培養面に行うことが好ましい。
　培養容器（Ｘ）は、少なくともその培養面を親水化処理することが好ましく、コロナ処理、又はプラズマ処理することがより好ましい。培養容器（Ｘ）の表面を親水化処理することで、培養容器（Ｘ）の表面の濡れ性が上がり、培養容器（Ｘ）と心筋細胞との接着性が良くなり、培養容器（Ｘ）の表面で心筋細胞が均一に増殖できる。また、培養容器（Ｘ）の表面を親水化処理することで、培養容器（Ｘ）の培養面上にコーティング剤をコートしやすくなる。特に、培養容器（Ｘ）の培養面上に均一にコーティング剤を積載し、密着させやすくなり、また、積載処理後においても、生理食塩水による洗浄又は、細胞培養の環境において、コーティング剤の成分が剥がれず、安定な初期状態を保って細胞培養に用いることができる。
　プラズマ処理を行う場合には、同伴させるガスとして、窒素、水素、ヘリウム、酸素、アルゴンなどが用いられ、好ましくは、窒素、ヘリウム、アルゴンから選択される少なくとも一種のガスが選ばれる。
　培養容器（Ｘ）は、コンタミネーション防止のために、消毒又は滅菌処理を施してもよい。消毒又は滅菌処理の方法としては、特に制限されず、流通蒸気法、煮沸法、間歇法、紫外線法等の物理的消毒法；オゾン等の気体、エタノール等の消毒薬を用いる化学的消毒法；高圧蒸気法、乾熱法等の加熱滅菌法；ガンマ線法、電子線法、高周波法等の照射滅菌法；酸化エチレンガス法、過酸化水素ガスプラズマ法等のガス滅菌法等が挙げられる。中でも操作が簡便で、充分に滅菌が行えることから、エタノール消毒法、高圧蒸気滅菌法、ガンマ線滅菌法、電子線滅菌法、又は酸化エチレンガス滅菌法が好ましい。これらの消毒又は滅菌処理は、１種単独で行ってもよいし、２種以上を組み合わせて行ってもよい。
　培養容器（Ｘ）の培養面は、水接触角が好ましくは５０°以上、より好ましくは５５°以上、さらに好ましくは６０°以上である。また、培養容器（Ｘ）の培養面は、水接触角が好ましくは１００°以下、より好ましくは９０°以下、さらに好ましくは８４°以下である。
　培養容器（Ｘ）の培養面の水接触角を上記上限以下、又は上記下限以上に調整することで、例えば心筋細胞が培養面に接着しやすくなり、培養面で均一に増殖しやすい。また、培養容器（Ｘ）の培養面上に均一に天然高分子材料、合成高分子材料、又は無機材料をコートし、密着させやすくなり、また、コート後においても、生理食塩水による洗浄又は、細胞培養の環境において、天然高分子材料、合成高分子材料、又は無機材料が剥がれず、安定な初期状態を保って細胞培養に用いることができる。
　水接触角の測定方法は特に制限されず、公知の方法を用いることができるが、好ましくは静滴法である。水接触角は、例えば、日本工業規格ＪＩＳ－Ｒ３２５７（基板ガラス表面のぬれ性試験方法）に準じて、２５±５℃、５０±１０％の恒温恒湿条件下で水滴の形状を球形とみなせる４μＬ以下の容量の水滴を、培養容器（Ｘ）と同一の材料を用いて作成された測定サンプルの表面に滴下し、静滴法により、測定サンプル表面に水滴が接触した直後から１分以内の測定サンプルと水滴の接触界面の角度を計測する方法で測定することができる。
　培養容器（Ｘ）の製造方法は、特に制限されず、製造に用いる機器も制限されない。培養容器（Ｘ）の全部が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成される場合には、例えば、４－メチル－１－ペンテン重合体を含むフィルム又はシートを形成し、必要に応じてそのフィルム又はシートを成形して所望の形状として培養容器（Ｘ）を作製することができる。また、培養容器（Ｘ）は、押出成形、溶液キャスト成形、射出成形、ブロー成形等の方法により、直接成形することによっても得られる。培養容器（Ｘ）の一部が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成される場合には、例えば、４－メチル－１－ペンテン重合体を含むフィルム又はシートを形成し、該フィルム又はシートと、その他の基材とを、適宜接合することにより培養容器（Ｘ）を得ることができる。接合する方法としては特に制限はなく４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材と、その他の基材とを一体で形成してもよく、接着剤又は粘着剤を介して密着させてもよい。
　前記フィルム又はシートを形成する方法としては、具体的には、例えば、通常のインフレーション法、Ｔ－ダイ押出法などが採用される。製造は通常加温して行う。Ｔ－ダイ押出法を採用する場合、押出温度は１００℃～４００℃が好ましく、２００℃～３００℃が特に好ましい。また、ロール温度は４５℃～７５℃が好ましく、５５℃～６５℃が特に好ましい。
　また、前記フィルム又はシートは４－メチル－１－ペンテン重合体を溶剤に溶解し、樹脂又は金属上に流し、レベリングしながらゆっくりと乾かしフィルム化（シート化）する溶液キャスト法で製造してもよい。用いられる溶剤は特に制限ないが、シクロヘキサン、ヘキサン、デカン、トルエンなどの炭化水素溶剤を用いてもよい。また、溶剤は、前記４－メチル－１－ペンテン重合体の溶解性及び乾燥効率を考慮して２種類以上を混合してもよい。テーブルコート、スピンコート、ディップコート、ダイコート、スプレーコート、バーコート、ロールコート、カーテンフローコートなどの方法でポリマー溶液を塗布し、乾燥、剥離することでフィルム又はシートに加工することができる。
［４－メチル－１－ペンテン重合体］
　本発明の一態様においては、４－メチル－１－ペンテン単独重合体、及び４－メチル－１－ペンテンと他のモノマーとの共重合体を総称して「４－メチル－１－ペンテン重合体」と称する。
　４－メチル－１－ペンテン重合体の一例である、４－メチル－１－ペンテンと、他のモノマーとの共重合体としては、ランダム共重合体、交互共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体のいずれであってもよい。４－メチル－１－ペンテンと、他のモノマーとの共重合体としては、４－メチル－１－ペンテンと、エチレン及び炭素数３～２０のα－オレフィン（４－メチル－１－ペンテンを除く）から選ばれる少なくとも１種のオレフィンとの共重合体が、強度が高く、基材として用いても破れにくく割れにくく、撓みも少ないため好ましい。
　４－メチル－１－ペンテン重合体としては、４－メチル－１－ペンテン単独重合体並びに、４－メチル－１－ペンテンと、エチレン及び炭素数３～２０のα－オレフィン（４－メチル－１－ペンテンを除く）から選ばれる少なくとも１種のオレフィンとの共重合体から選択される少なくとも１種の重合体であることが好ましく、４－メチル－１－ペンテンと、エチレン及び炭素数３～２０のα－オレフィン（４－メチル－１－ペンテンを除く）から選ばれる少なくとも１種のオレフィンとの共重合体であることがより好ましい。
　前記オレフィンとしては、例えば、エチレン、プロピレン、１－ブテン、１－ヘキセン、１－ヘプテン、１－オクテン、１－デセン、１－テトラデセン、１－ヘキサデセン、１－ヘプタデセン、１－オクタデセン、１－エイコセンが挙げられる。前記オレフィンは、基材に必要な物性に応じて適宜選択することができる。例えば、前記オレフィンとしては、適度な酸素透過度と、優れた剛性という観点からは、炭素数８～１８のα－オレフィンが好ましく、１－オクテン、１－デセン、１－ドデセン、１－テトラデセン、１－ヘキサデセン、１－ヘプタデセン及び１－オクタデセンから選ばれる少なくとも１種がより好ましい。オレフィンの炭素数が上記範囲にあると、重合体の加工性がより良好になり、クラック又は端部の割れによる基材の外観不良が生じにくくなる傾向にある。また、基材の不良品発生率が低くなる。
　前記オレフィンは、１種又は２種以上を用いることができる。異なる２種以上のオレフィンを組み合わせる場合には、材料の強度の観点から、該オレフィンの炭素数は２以上が好ましく、炭素数１０以上がより好ましい。異なる２種以上のα－オレフィンを組み合わせる場合には、１－テトラデセン及び１－ヘキサデセンから選ばれる少なくとも１種と、１－ヘプタデセン及び１－オクタデセンから選ばれる少なくとも１種とを組み合わせることが特に好ましい。
　前記４－メチル－１－ペンテン重合体における４－メチル－１－ペンテンに由来する構成単位の含有量は、好ましくは６０～１００モル％、より好ましくは８０～９９．５モル％、さらに好ましくは８５～９８モル％である。
　また、４－メチル－１－ペンテン重合体が、４－メチル－１－ペンテンと、エチレン及び炭素数３～２０のα－オレフィン（４－メチル－１－ペンテンを除く）から選ばれる少なくとも１種のオレフィンとの共重合体である場合は、その共重合体におけるエチレン及び炭素数３～２０のα－オレフィン（４－メチル－１－ペンテンを除く）から選ばれる少なくとも１種のオレフィンに由来する構成単位の含有量は、好ましくは０．１～４０モル％、より好ましくは０．５～２０モル％、さらに好ましくは２～１５モル％である。なお、これら構成単位の含有量は、４－メチル－１－ペンテン重合体中の全繰返し構成単位量を１００モル％とする。構成単位の含有量が上記範囲内にあると、加工性に優れ均質な培養面が得られ、また基材の靭性と強度のバランスが良いため、撓みも少なくなる。
　前記４－メチル－１－ペンテン重合体は、本発明の効果を損なわない範囲で、４－メチル－１－ペンテンに由来する構成単位及び前記エチレン及び炭素数３～２０のα－オレフィンに由来する構成単位以外の構成単位（以下「その他の構成単位」ともいう）を有してもよい。その他の構成単位の含有量は、例えば０～１０．０モル％である。前記４－メチル－１－ペンテン重合体がその他の構成単位を有する場合、その他の構成単位は、１種でも２種以上であってもよい。
　その他の構成単位の由来となるモノマーとしては、例えば、環状オレフィン、芳香族ビニル化合物、共役ジエン、非共役ポリエン、官能ビニル化合物、水酸基含有オレフィン、ハロゲン化オレフィンが挙げられる。環状オレフィン、芳香族ビニル化合物、共役ジエン、非共役ポリエン、官能ビニル化合物、水酸基含有オレフィン及びハロゲン化オレフィンとしては、例えば、特開２０１３－１６９６８５号公報の段落［００３５］～［００４１］に記載の化合物を用いることができる。
　前記４－メチル－１－ペンテン重合体は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　４－メチル－１－ペンテン重合体としては市販品を使用することもできる。具体的には、三井化学（株）製のＴＰＸ　ＭＸ００１、ＭＸ００２、ＭＸ００４、ＭＸ００２０、ＭＸ０２１、ＭＸ３２１、ＲＴ１８、ＲＴ３１又はＤＸ８４５（いずれも登録商標）などが挙げられる。また、その他のメーカー製でも上記の要件を満たす４－メチル－１－ペンテン重合体であれば、好ましく使用できる。これらの市販品は１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合せて使用することもできる。
　４－メチル－１－ペンテン重合体は、通常、融点２００℃～２４０℃であり耐熱性が高い。また加水分解を起こさず、耐水性、耐沸水性、耐スチーム性が優れているため、４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材は高圧蒸気滅菌処理が可能である。４－メチル－１－ペンテン重合体は、また可視光線透過率が高く（通常９０％以上）、自家蛍光を発しない特徴を有するので、４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成される培養容器は心筋細胞の観察がしやすい。さらに、ほとんどの薬品に優れた耐薬品性を示し、薬剤を収着しにくいため、心筋細胞を維持するための物質の効果を妨げず、また、作用を評価する薬剤の濃度も変化しにくい。４－メチル－１－ペンテン重合体は、ヒートシールが可能であり、自材同士の熱融着のみならず他の材料との熱接着も容易である。また、熱成形が可能であるため、任意の形状の培養容器に成形することが容易であり、例えばインプリント法又はインサート法を用いた成形も容易である。
　４－メチル－１－ペンテン重合体の、標準ポリスチレンを基準物質としたゲルパーミュエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定される、重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１００００～２００００００、より好ましくは２００００～１００００００、さらに好ましくは３００００～５０００００である。ここで、ＧＰＣ測定の際の試料濃度は、例えば１．０～５．０ｍｇ／ｍｌとすることができる。また、４－メチル－１－ペンテン重合体の分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、好ましくは１．０～３０、より好ましくは１．１～２５、さらに好ましくは１．１～２０である。ＧＰＣで用いられる溶剤は、オルトジクロロベンゼンが好ましい。また、測定条件の一例としては、後述する実施例に示した条件が挙げられるが、該測定条件に限定されるものではない。
　重量平均分子量（Ｍｗ）を上記上限以下とすることにより、後述する４－メチル－１－ペンテン重合体の成形法において、溶融成形で作製したフィルムは、ゲル等の不具合の発生を抑制しやすく、表面が均一な製膜をしやすくなる。また、溶液キャスト法で作製する際は溶剤への溶解性をより良好にし、フィルムのゲル等の不具合を抑制しやすく、表面均一な製膜がしやすくなる。
　また、重量平均分子量（Ｍｗ）を上記下限以上とすることにより、培養容器（Ｘ）は強度が十分となる傾向にある。さらに、分子量分布を上記の範囲内とすることで、作製した培養容器表面のベタツキを抑えやすく、培養容器の靭性も充分となる傾向にあり、成形時の曲げ及び裁断時のクラックの発生などを抑制しやすくなる。
　前記４－メチル－１－ペンテン重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、４－メチル－１－ペンテン重合体として、２種以上を用いた場合には、それぞれの、Ｍｗ及びＭｗ／Ｍｎが、上記範囲にあればよい。
　４－メチル－１－ペンテン重合体は、酸素透過係数が１００～２５００ｃｍ3×ｍｍ／（ｍ2×２４ｈ×ａｔｍ）であることが好ましく、１０００～２５００ｃｍ3×ｍｍ／（ｍ2×２４ｈ×ａｔｍ）であるとより好ましい。酸素透過係数が前記範囲にあると、酸素透過性に優れるので、心筋細胞は良好な形態を保ち、培養期間に応じて効率良く増殖しやすく、また薬剤の作用を検出しやすい。
　酸素透過係数は、具体的には以下の方法で測定できる。４－メチル－１－ペンテン重合体で構成される基材から測定サンプルを作成し、差圧式ガス透過率測定法により、温度２３℃、湿度０％での酸素透過係数［ｃｍ3×ｍｍ／（ｍ2×２４ｈ×ａｔｍ）］を測定する。測定に用いる機器は差圧式ガス透過率測定法を用いたものであれば特に制限されないが、例えば東洋精機製作所製の差圧式ガス透過率測定装置ＭＴ－Ｃ３が挙げられる。測定サンプルは、４－メチル－１－ペンテン重合体で構成される厚さ５０μｍの基材から９０×９０ｍｍの試験片を切り出して作成し、測定部径は７０ｍｍ（透過面積は３８．４６ｃｍ2）とすると好ましい。酸素透過度が大きいため、予めサンプルにアルミニウムマスクを施し、実透過面積を５．０ｃｍ2とすることがより好ましい。測定サンプルは、微細加工、表面改質処理を行ったものでもよいし、行っていないものでもよいが、何も処理を行っていないものが好ましい。酸素透過係数を基材の厚さ（μｍ）で除した値を酸素透過度［ｃｍ3／（ｍ2×２４ｈ×ａｔｍ）］とする。
　４－メチル－１－ペンテン重合体は以上のような優れた特性を有しているので、少なくとも培養面が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材で形成された培養容器は、培養に悪い影響を与えることも無く、また形状安定性、光透過性、成形加工性、酸素透過性が良好で、滅菌処理を行うことができ、心筋細胞を培養し、薬剤の作用を評価するために用いる培養容器として非常に優れている。
　前記４－メチル－１－ペンテン重合体を製造する方法は、４－メチル－１－ペンテン、オレフィン、その他のモノマーを重合させられれば、いずれの方法であってもよい。また、分子量又は分子量分布を制御するために連鎖移動剤、例えば水素を共存させてもよい。製造に用いる機器も制限されない。重合法は公知の方法でもよく、気相法、スラリー法、溶液法、バルク法であってもよい。好ましくはスラリー法、溶液法である。また、重合法は単段重合法、又は二段等の多段重合法で、分子量の異なる複数の重合体を重合系中にブレンドする方法であってもよい。単段、多段重合法の何れであっても、連鎖移動剤として水素を用いる場合には、一括投入しても、分割投入、例えば重合初期、中期、終期に投入してもよい。重合は常温で行ってもよく、必要に応じて加温してもよいが、重合の効率の観点から、２０℃～８０℃で行うことが好ましく、４０℃～６０℃で行うことが特に好ましい。製造に用いる触媒も制限されないが、重合の効率の観点から、例えば国際公開公報２００６／０５４６１３に記載される固体状チタン触媒成分（Ｉ）又は、国際公開公報２０１４／０５０８１７に記載される遷移金属化合物（Ａ）を含有するオレフィン重合用触媒（メタロセン触媒）を用いることが好ましい。
　なお、４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材が、４－メチル－１－ペンテン重合体を含む組成物である場合には、組成物１００質量％中に、４－メチル－１－ペンテン重合体が、好ましくは９０質量％以上１００質量％未満であり、より好ましくは９５質量％以上１００質量％未満であり、特に好ましくは９９質量％以上１００質量％未満である。組成物中の４－メチル－１－ペンテン重合体が９０質量％以上であると、基材の酸素透過性、透明性、強度などがより向上する。
　この場合、４－メチル－１－ペンテン重合体以外の成分としては、耐熱安定化剤、耐光安定化剤、加工助剤、可塑剤、酸化防止剤、滑剤、消泡剤、アンチブロック剤、着色剤、改質剤、抗菌剤、抗黴剤、防曇剤などの添加剤が挙げられる。
［工程（Ａ）］
　工程（Ａ）は、培養容器（Ｘ）の培養面に心筋細胞を播種する工程である。培養容器（Ｘ）の培養面に心筋細胞を播種する方法は特に制限されず、例えば、培地に懸濁した心筋細胞をピペット等で培養容器（Ｘ）内に添加し、必要に応じて該培養容器（Ｘ）を揺動させて培養容器（Ｘ）内に心筋細胞を均等に散らした後、インキュベーター内で静置する。
　心筋細胞を播種する密度は、前記心筋細胞を維持又は増殖させることができれば特に制限されないが、好ましくは０．１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2～１０．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であり、より好ましくは０．３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2～５．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であり、さらに好ましくは０．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2～３．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2である。
　心筋細胞の播種密度が上記の範囲であると、心筋細胞が培養容器（Ｘ）に接着しやすく、より効率よく増殖するため好ましい。
　工程（Ａ）で用いる培地は、心筋細胞が生存できる培地であれば特に制限されず、使用細胞種に合わせて適宜選択すればよい。播種に用いる培地は、例えば、任意の細胞培養基本培地、分化培地、初代培養専用培地等、具体的には、後述する無血清培地（α）、後述する培地（β）、イーグル細小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α－ＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ－１２、ＭＣＤＢ培地、ウィリアムス培地Ｅ、実施例において後述する特製維持培地、特製基礎培地、ｉＣｅｌｌ心筋細胞維持用培地（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　ＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社製）、ｉＣｅｌｌ心筋細胞解凍用培地（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　ＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社製）、及びこれらの混合培地等が挙げられる。これらの培地にさらに、血清、各種成長因子、分化誘導因子、抗生物質、ホルモン、アミノ酸、糖、塩類、ミネラル、金属、ビタミン等を添加した培地を使用してもよい。
　心筋細胞が培養容器（Ｘ）に接着しやすいことから、工程（Ａ）で用いる培地は、好ましくはｉＣｅｌｌ心筋細胞解凍用培地、実施例において後述する無血清培地（α）であり、より好ましくは無血清培地（α）である。
　工程（Ａ）で用いる培地の量は特に制限されず、細胞種及び培地の種類に応じて適宜決定することができる。
　培養条件は特に制限されず、公知の方法で行うことができるが、通常、温度は２５～４０℃程度、二酸化炭素濃度５％程度で培養する。
［無血清培地（α）］
　無血清培地（α）は、動物血清を含有しないが、代替血清を含有する培地である。無血清培地（α）は、基礎培地に代替血清を添加することにより作製することができる。
　前記代替血清とは、細胞培養の際に、細胞の生存に必要な栄養素として添加させる動物血清に代わる、血清代用品を意味し、Ｓｅｒｕｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＰＳ）、Ｓｅｒｕｍ　Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＳＳ）等と称されることもある。前記代替血清は特に限定されず、公知のものを使用することができる。市販の代替血清としては、ＫｎｏｃｋｏｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、ＮＯ．１０８２８０２８）、ＳｔｅｍＳｕｒｅTM　血清代替品（ＳＳＲ、富士フイルム和光純薬株式会社製）、ＰＬ　ＳＯＬＵＴＩＯＮ（ＰＬ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＰＬ　ＭＡＴＲＩＸ（ＰＬ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｒｕｍ（株式会社細胞科学研究所社製）などが挙げられる。これらの中でも、ＫｎｏｃｋｏｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔが好ましい。
　無血清培地（α）における代替血清の含有量は、特に制限されないが、好ましくは１～２０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは５～１５％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは８～１２％（ｖ／ｖ）である。
　前記基礎培地は、動物血清を含まない細胞培養用の培地であれば、特に制限されない。前記基礎培地としては、例えば、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ－４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ'ｓ培地、Ｏｐｔｉ－ＰＲＯTMＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭTMＩ培地、ＶＰ－ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ－ＣＨＯ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３培地、ＣＤ－ＣＨＯ、ＡＧＴTM培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＧＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ'ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ－１００培地、Ｓｆ－９００ＩＩ培地、Ｅｘ－ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地、Ｈａｍ'ｓＦ－１２Ｋ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
　心筋細胞が培養容器（Ｘ）に接着しやすいことから、前記基礎培地は、好ましくはＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地であり、より好ましくはＤＭＥＭ培地である。
　無血清培地（α）は、好ましくは、ＫｎｏｃｋｏｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを含有する、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、又はＭＥＭ培地であり、より好ましくはＫｎｏｃｋｏｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを含有するＤＭＥＭ培地である。
　無血清培地（α）には、代替血清以外に各種成長因子、分化誘導因子、抗生物質、ホルモン、アミノ酸、糖、塩類、ミネラル、金属、ビタミン等を添加してもよい。
［工程（Ｂ）］
　工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で播種した心筋細胞を培養する工程である。心筋細胞を培養する方法は特に制限されず、公知のプロトコルに従って行えばよい。
　工程（Ｂ）で培養に用いる培地についての詳細は、工程（Ａ）に用いる培地と同様である。工程（Ｂ）で用いる培地は、工程（Ａ）で用いる培地と同じであっても、異なってもよいが、心筋細胞がより増殖しやすいことから、同じであることが好ましい。
　工程（Ｂ）で用いる培地の量は特に制限されず、細胞種及び培地の種類に応じて適宜決定することができる。
　培地交換の頻度は、特に制限されないが、播種翌日に培地交換を行う以外は工程（Ｂ）での培養期間中は行わないことが好ましい。
　培養条件は特に制限されず、公知の方法で行うことができるが、通常、温度は２５～４０℃程度、二酸化炭素濃度５％程度で培養する。
　工程（Ｂ）での培養期間は特に制限されないが、好ましくは６時間～３日間であり、より好ましくは１０時間～２日間であり、さらに好ましくは１２～３６時間である。
　工程（Ｂ）での培養期間の終期は、例えば、心筋細胞が培養容器（Ｘ）に充分に接着したかにより決めることができる。心筋細胞が培養容器（Ｘ）に充分に接着したかは、例えば、顕微鏡観察により評価することができる。
　工程（Ｂ）の培養は、培養容器（Ｘ）では酸素を効率的に供給できるので、接着培養、浮遊培養のいずれであってもよいが、好ましくは接着培養である。
　工程（Ａ）及び（Ｂ）は、無血清培地（α）中で行われることが好ましい。工程（Ａ）及び（Ｂ）が無血清培地（α）中で行われると、心筋細胞が培養容器（Ｘ）に接着しやすい。
［工程（Ｃ）］
　工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で得られた心筋細胞をさらに培養する工程である。
　本発明の一態様である方法は、好ましくは、工程（Ｂ）で培養した心筋細胞をさらに培養する工程（Ｃ）を含む。工程（Ｃ）を含むと、薬剤の作用を精度良く評価しやすい。
　心筋細胞を培養する方法は特に制限されず、公知のプロトコルに従って行えばよい。
　工程（Ｃ）で培養に用いる培地は、心筋細胞が生存できる培地であれば特に制限されず、使用細胞種に合わせて適宜選択すればよい。培養に用いる培地は、例えば、任意の細胞培養基本培地、分化培地、初代培養専用培地等、具体的には、無血清培地（α）、後述する培地（β）、イーグル細小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α－ＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ－１２、ＭＣＤＢ培地、ウィリアムス培地Ｅ、ＣａｒｄｉｏＧｒｏ（フナコシ社製）、ｉＣｅｌｌ心筋細胞維持用培地（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　ＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社製）、ｉＣｅｌｌ心筋細胞解凍用培地（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　ＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社製）及びこれらの混合培地等が挙げられる。これらの培地に、さらに、血清、各種成長因子、分化誘導因子、抗生物質、ホルモン、アミノ酸、糖、塩類、ミネラル、金属、ビタミン等を添加した培地を使用してもよい。
　心筋細胞がより効率よく増殖し、また、薬剤の作用を精度良く検出できることから、工程（Ｃ）で用いる培地は、好ましくはｉＣｅｌｌ心筋細胞維持用培地又は後述する培地（β）であり、より好ましくは後述する培地（β）である。
　工程（Ｃ）で培養に用いる培地は、工程（Ｃ）での培養期間の途中で変更し、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　心筋細胞がより効率よく増殖し、また、薬剤の作用を精度良く検出できることから、工程（Ｃ）での培養期間の少なくとも一部で培地（β）を用いることが好ましい。工程（Ｃ）で培養に用いる２種以上の培地のうち、培地（β）を用いる順序及び期間は制限されないが、培地（β）は、２番目以降に用いる培地として用いることが好ましい。培地（β）を用いて培養する期間は、工程（Ｃ）での培養期間の好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上である。
　工程（Ｃ）で用いる培地の量は特に制限されず、細胞種及び培地の種類に応じて適宜決定することができる。
　培地交換の頻度は、特に制限されないが、毎日又は２、３日おきに行うことが好ましい。
　培養条件は特に制限されず、公知の方法で行うことができるが、通常、温度は２５～４０℃程度、二酸化炭素濃度５％程度で培養する。
　工程（Ｃ）での培養期間は特に制限されないが、好ましくは３～３０日間であり、より好ましくは７～２０日間であり、さらに好ましくは１０～１６日間である。
　工程（Ｃ）での培養期間の終期は、例えば、心筋細胞が充分に同期したか、より具体的には、心筋細胞が安定した拍動パターンを示すかにより決めることができる。心筋細胞が安定した拍動パターンを示すかは、例えば、カルシウムイオン波形により評価することができる。
［培地（β）］
　培地（β）は、遊離脂肪酸１～１００μｇ／ｍＬを含有する培地である。培地（β）は、遊離脂肪酸１～１００μｇ／ｍＬを含有する培地であれば、その他の成分については特に制限されない。
　遊離脂肪酸とは、非エステル化脂肪酸の意味であり、脂肪酸の炭素数は制限されない。
　遊離脂肪酸の脂肪酸の種類は制限されず、例えば、酢酸、酪酸、カプロン酸等の炭素数２～６の短鎖脂肪酸；カプリル酸、カプリン酸等の炭素数８～１０の中鎖脂肪酸；ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の炭素数１２～２２の長鎖脂肪酸である。前記脂肪酸は飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよい。
　培地（β）は、上記の遊離脂肪酸を、１種単独でもよいし、２種以上を組み合わせて含んでもよい。
　培地（β）の遊離脂肪酸の含有量は、好ましくは１～７０μｇ／ｍＬ、より好ましくは２～５０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０～５０μｇ／ｍＬである。
　培地（β）が、遊離脂肪酸を上記範囲内の量で含有すると、薬剤の作用をより精度良く評価することができる。
　培地（β）の遊離脂肪酸の含有量を測定する方法は特に制限されず、例えば共役酵素反応を利用した方法により遊離脂肪酸濃度を測定することができる。
　培地（β）は、好ましくは、更に、リゾホスファチジルコリン１～１００μｇ／ｍＬ、トリアシルグリセリド１～１００μｇ／ｍＬ、ホスファチジルコリン１～１００μｇ／ｍＬ、ホスファチジン酸１～１００μｇ／ｍＬ、コレステロール０．１～１０μｇ／ｍＬ、及びスフィンゴミエリン０．１～１０μｇ／ｍＬから選ばれる少なくとも１種を含有する。
　リゾホスファチジルコリンの含有量は、より好ましくは１～５０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１～２０μｇ／ｍＬである。トリアシルグリセリドの含有量は、より好ましくは１～５０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１～２０μｇ／ｍＬである。ホスファチジルコリンの含有量は、より好ましくは１～５０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１～２５μｇ／ｍＬである。ホスファチジン酸の含有量は、より好ましくは１～５０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１～１０μｇ／ｍＬである。コレステロールの含有量は、より好ましくは０．１～８μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１～５μｇ／ｍＬである。スフィンゴミエリンの含有量は、より好ましくは０．１～８μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１～５μｇ／ｍＬである。
　培地（β）が、上記の脂質を上記範囲内で含有すると、薬剤の作用をより精度良く評価することができる。
　培地（β）の上記脂質の含有量を測定する方法は特に制限されず、公知の方法により測定することができる。
［工程（Ｄ）］
　工程（Ｄ）は、前記培養された心筋細胞を前記薬剤に曝露させる工程である。前記培養された心筋細胞とは、工程（Ｃ）がない場合には、工程（Ｂ）で培養した心筋細胞であり、工程（Ｃ）がある場合には、工程（Ｃ）で培養した心筋細胞である。
　心筋細胞を薬剤に曝露させる方法は特に制限されず、例えば、薬剤を直接培地中に添加してもよいし、薬剤を適当な溶媒に分散又は溶解させてから培地中に添加してもよい。
　前記溶媒としては、特に制限されないが、例えば、水、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯが挙げられる。
　薬剤の添加濃度は、薬剤の種類に応じて決定すればよい。本発明の一態様である方法は、薬剤の濃度が低くてもその作用を検出しやすいので、薬剤の添加濃度は、例えば、非特許文献１等に記載された公知の濃度を参考にし、その濃度よりも低い濃度とすることができる。薬剤は、培地中に、例えば０．００１ｎＭ～１０ｍＭの範囲の終濃度となるように添加することができる。
　心筋細胞を薬剤に曝露させる期間は特に制限されず、薬剤が心筋細胞に対してその作用を発揮できればよく、心筋細胞又は薬剤の種類に応じて適宜決定することができる。
　曝露させる期間は、好ましくは１秒～５日間であり、より好ましくは１分～３日間であり、さらに好ましくは５分～３日間である。
　培養条件は特に制限されず、公知の方法で行うことができるが、通常、温度は２５～４０℃程度、二酸化炭素濃度５％程度で培養する。
　工程（Ｄ）で用いる培地についての詳細は、工程（Ｃ）がない場合には、工程（Ｂ）に用いる培地と同様であり、工程（Ｃ）がある場合には、工程（Ｃ）に用いる培地と同様である。工程（Ｄ）で用いる培地は、工程（Ｃ）で用いる培地又は工程（Ｂ）に用いる培地と同じであっても、異なってもよいが、薬剤の作用を精度良く評価できることから、同じであることが好ましい。
　本発明の一態様である方法は、好ましくは、工程（Ｃ）を含み、工程（Ｃ）及び（Ｄ）は、培地（β）中で行われる。工程（Ｃ）及び（Ｄ）が培地（β）中で行われると、薬剤の作用、特に心毒性をより精度良く評価することができ、催不整脈性、特にＥＡＤ様波形を検出しやすい。
　工程（Ａ）及び（Ｂ）は、無血清培地（α）中で行われ、かつ、工程（Ｃ）及び（Ｄ）は、培地（β）中で行われることがより好ましい。このような培地条件で行うと、心筋細胞が培養容器（Ｘ）に接着しやすく、さらに安定して、薬剤の作用、特に心毒性をより精度良く評価することができ、催不整脈性、特にＥＡＤ様波形を検出しやすい。
［工程（Ｅ）］
　工程（Ｅ）は、工程（Ｄ）で薬剤に曝露させた心筋細胞の細胞機能の指標を分析して評価する工程である。
　心筋細胞の細胞機能の指標は、心筋細胞の機能を示すものであれば特に制限されず、細胞の一般的な機能の指標であっても、心筋細胞に特異的な機能の指標であってもよい。心筋細胞の細胞機能の指標は、例えば、活動電位、遺伝子発現、収縮性、サルコメア長、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はカルシウムイオンの細胞内濃度又はその変化、拍動、細胞生存率、ミトコンドリア機能の指標、グルコース、ピルビン酸、乳酸、ＡＴＰ等のエネルギー関連物質の濃度又はその変化が挙げられる。
　測定が簡便であり、また、心筋細胞の拍動を引き起こすイオンの動きを解析できることから、心筋細胞の細胞機能の指標は、好ましくはカルシウムイオンの濃度又はその変化である。カルシウムイオンの細胞内濃度の変化は、カルシウムイオンの濃度変化を示す波形として検出することができる。すなわち、心筋細胞の細胞機能の指標は、好ましくはカルシウムイオン波形である。
　心筋細胞の細胞機能の指標を分析する方法は、特に制限されない。活動電位は、例えば多電極システムによる細胞外電位解析、ＭＥＡ（Ｍｕｌｔｉ－ｅｌｅｃｔｒｏｄｅａｒｒａｙ）解析、ホールセルパッチクランプによる細胞内電位解析などにより分析することができる。遺伝子発現は、例えば、心筋細胞に特異的な遺伝子の発現をＲＴ－ＰＣＲ法により分析することができる。収縮性は、例えば、モーションアナライザーにより心筋細胞の辺縁の動きから偏位速度を測定することにより分析することができる。サルコメア長は、例えば、サルコメアに存在するα－ａｃｔｉｎｉｎをＧＦＰ標識して可視化することにより分析することができる。カルシウムイオンの細胞内濃度又はその変化は、例えば、カルシウムイメージング法により分析することができる。拍動は、例えば、モーションアナライザーにより分析することができる。細胞生存率は、例えば、テトラゾリウム化合物又はミトコンドリア膜電位依存的色素を用いた細胞生存アッセイ、ＡＴＰ量の測定等により分析することができる。ミトコンドリア機能の指標は、例えば、ミトコンドリア毒性、例えば、ミトコンドリア膜透過性遷移（ＭＰＴ）の指標となるｓｗｅｌｌｉｎｇアッセイ、電子伝達系酵素複合体の活性測定等により分析することができる。グルコース、ピルビン酸、乳酸、ＡＴＰ等のエネルギー関連物質の濃度又はその変化は、例えば、グルコース、ピルビン酸、乳酸、ＡＴＰ等のイメージング法により分析することができる。
　カルシウムイオン波形を分析することにより、例えば、ＱＴ延長、徐脈（陰性変時作用）、頻脈（陽性変時作用）、強心（陽性変力作用）、弱心（陰性変力作用）、早期後脱分極（ＥＡＤ）、遅延後脱分極（ＤＡＤ）、トルサード・ド・ポワント（ＴｄＰ）、トリガードアクティビティ不整脈、又はリエントリー不整脈を検出することができる。
　工程（Ｅ）においては、好ましくは、カルシウムイオン波形を分析することにより、早期後脱分極（ＥＡＤ）を検出する。また、工程（Ｅ）においては、好ましくは、カルシウムイオン波形を分析することにより、頻脈又は徐脈を検出する。
［その他の工程：工程（Ｆ）］
　本発明の一態様である方法は、工程（Ｅ）の後に、工程（Ｅ）で得られた分析結果を、薬剤の非存在下における分析結果と比較する工程（Ｆ）を含んでもよい。工程（Ｆ）は、換言すると、工程（Ｅ）で得られた薬剤の存在下及び非存在下における細胞機能の指標を比較し、薬剤が有する作用の高低を判定する工程である。
　判定の基準は、薬剤の存在下における細胞機能の指標が、薬剤の非存在下における細胞機能の指標と比較して高い又は低いこと、若しくは変化があることを利用する。
　薬剤の非存在下とは、通常、薬剤の添加前、若しくは薬剤を分散又は溶解させる溶媒のみを添加する場合をいう。
　次に本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［重量平均分子量（Ｍｗ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）の測定］
　実施例に用いた４－メチル－１－ペンテン重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）、及び、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）をゲルパーミュエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した。
　具体的には、下記の条件で、オルトジクロロベンゼンに溶解したポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）及び数平均分子量（Ｍｎ）を、標準ポリスチレンによって分子量を較正して測定した。
・装置：ゲル浸透クロマトグラフＨＬＣ－８３２１ＧＰＣ／ＨＴ型(東ソー社製)
・データ解析ソフト：Ｅｍｐｏｗｅｒ３（Ｗａｔｅｒｓ社製）
・検出器：示差屈折計
・直列連結カラム：ＴＳＫｇｅｌＧＭＨ６－ＨＴ（２本）、及び、ＴＳＫｇｅｌＧＭＨ６－ＨＴＬ（２本）
・カラム温度：１４０℃
・流量：１．０ｍＬ／分
・試料濃度：１．５ｍｇ／ｍＬ
［製造例１］基材の製造
　４－メチル－１－ペンテン重合体であるＴＰＸ（登録商標）（三井化学株式会社製：分子量（Ｍｗ）＝４２８０００、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）＝４．１、４－メチル－１－ペンテンから導かれる構成単位の含有量が９７．２モル％であり、炭素数１６のα－オレフィンから導かれる構成単位の含有量と炭素数１８のα－オレフィンから導かれる構成単位の含有量の合計が２．８モル％である）を使用し、基材層を押し出すフルフライト型のスクリューを備えたＴダイ付き押出機へ投入し、押出し温度を２７０℃、ロール温度を６０℃に設定し、ロール回転速度の条件を変えて押出し成形することで、厚さ５０μｍのフィルム１を得た。
　前記フィルム１を測定サンプルとして、東洋精機製作所製差圧式ガス透過率測定装置ＭＴ－Ｃ３を用いて温度２３℃、湿度０％の環境下にて酸素透過係数［ｃｍ3×ｍｍ／（ｍ2×２４ｈ×ａｔｍ）］を測定した。測定部径は７０ｍｍ（透過面積は３８．４６ｃｍ2）とした。酸素透過係数が大きいことが予想されたため、予めサンプルにアルミニウムマスクを施し、実透過面積を５．０ｃｍ2とした。酸素透過係数は、１９１２ｃｍ3×ｍｍ／（ｍ2×２４ｈ×ａｔｍ）であった。
　前記フィルム１は常圧プラズマ表面処理装置（積水化学工業製）を用いて、チャンバー内を窒素の気流で満たしプラズマ処理した（処理速度２ｍ／ｍｉｎ、出力４．５ｋＷ、２往復）。
　プラズマ処理済のフィルム１を測定サンプルとして、水接触角の測定を行った。水接触角の測定は、日本工業規格ＪＩＳ－Ｒ３２５７（基板ガラス表面のぬれ性試験方法）に準じて行った。２５±５℃、５０±１０％の恒温恒湿条件下で水滴の形状を球形とみなせる４μＬ以下の容量の水滴を、測定サンプルの表面に滴下し、静滴法により、測定サンプル表面に水滴が接触した直後から１分以内の測定サンプルと水滴の接触界面の角度を測定した。プラズマ処理済のフィルム１の水接触角は、６０．３°であった。
［製造例２］培養容器の作製
　前記プラズマ処理済のフィルム１を８ｃｍ×１２ｃｍサイズにカットし、ポリスチレン（ＰＳとも称す）製９６ウェル容器枠の底面に、医療用粘着剤（スリーエム製）を介して密着させて９６ウェルの培養プレートを作製した。その後、耐ガンマ線袋に梱包して１０ｋＧｙのガンマ線を照射し滅菌した。これをＴプレートとした。１ウェルの培養面積は約０．３２ｃｍ2であった。
　Ｔプレートの比較対照として、ＴＣＰＳ（ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｒｕｒｅＰｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ）製９６ウェルプレート（ＣｅｌｌＢＩＮＤ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、製品番号３３００、「Ｃプレート」ともいう）、ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）製９６ウェルプレート（ＶＥＣＥＬＬ社製、製品番号Ｖ９６ＷＧＰＢ、Ｖプレートともいう、酸素透過係数１９１２１［ｃｍ3×ｍｍ／（ｍ2×２４ｈ×ａｔｍ）］、底面厚さ３５０μｍ）、ＴＣＰＳ製９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製、製品番号６５５０９０、「Ｇプレート」ともいう）を用いた。
[培地・試薬の調製]
　液体窒素中で凍結保存したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞ＧＣａＭＰ導入株（株式会社マイオリッジ製、製品番号Ｇ－０１１１０６）を用いた。この細胞は、ヒトｉＰＳ細胞をプロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法により分化誘導開始して３７日目の心筋細胞であり、カルシウムセンサーとして、ＧＣａＭＰを恒常的に発現するように遺伝子導入されている。
　使用試薬は以下の通りである。すべて冷蔵保存した。
・ＣＤＩ維持培地（ｉＣｅｌｌ心筋細胞維持用培地、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　ＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社製、５５７－３３５９１）
・ＣＤＩ解凍／播種用培地（ｉＣｅｌｌ心筋細胞解凍用培地、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　ＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社製、５５０－３３５８１）
・特製維持培地（ＣａｒｍｙＡ維持用培地ＵＧ、マイオリッジ社製、ＭＥ－０１Ａ００２４１、液体培地と付属サプリメントとに分けて供給され、液体培地と付属サプリメントとを混合してから使用する。培地（β）に該当する。）
　リゾホスファチジルコリン１１．３μｇ／ｍＬ、トリアシルグリセリド９．７９μｇ／ｍＬ、ホスファチジルコリン５．２９μｇ／ｍＬ、ホスファチジン酸２．０７μｇ／ｍＬ、コレステロール０．８８μｇ／ｍＬ、及びスフィンゴミエリン０．８０μｇ／ｍＬを含有する。また、遊離脂肪酸３５．２９μｇ／ｍＬを含有する。
・ＣａｒｍｙＡ特製播種用培地（ＣａｒｍｙＡ播種用培地キットＵＧ、マイオリッジ社製、ＭＥ－０２Ａ００２１１。無血清培地（α）に該当する。）
・特製基礎培地（ＣａｒｍｙＡ播種用培地キットＵＧ、マイオリッジ社製、ＭＥ－０２Ａ００２１１に付属する無血清培地）
・ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ｓｉｌｋ（製品番号３８７－１０１３１、Ｎｉｐｐｉ社製）
・ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅTMＹ－２７６３２（製品番号０３４－２４０２４、富士フィルム和光純薬社製、ロット番号ＫＣＧ７０２５）
・イソプロテレノール（Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ）（東京化成工業社製）
・ベプリジル（Ｂｅｐｒｉｄｉｌ）（キッセイ薬品工業社製）
・ペンタミジン（Ｐｅｎｔａｍｉｄｉｎｅ）（キッセイ薬品工業社製）
・Ｅ－４０３１　キッセイ薬品工業社製
・ベラパミル（Ｖｅｒａｐａｍｉｌ）キッセイ薬品工業社製
・リスペリドン（Ｒｉｓｐｅｒｉｄｏｎｅ）富士フイルム和光純薬株式会社製
・テルフェナジン（Ｔｅｒｆｅｎａｄｉｎｅ）Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製
・ラノラジン（Ｒａｎｏｌａｚｉｎｅ）東京化成工業株式会社製
・ＤＭＳＯ（富士フイルム和光純薬社製）
[カルシウムトランジェント解析方法]
　蛍光顕微鏡システムＩＸ８３（オリンパス社製）を用いて、ＧＣａＭＰ蛍光強度の変化をカルシウムトランジェントとして測定し、解析にはＣａｒｍｙ－Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（マイオリッジ社製）を使用した。
［参考例１、２］試験用プレートの材質の違いによる、心筋細胞特異的な遺伝子発現量の変化
（方法）
　試験用プレートとして、Ｃプレート（参考例１）、Ｔプレート（参考例２）を用いて、心筋細胞特異的な遺伝子発現量を比較した。
＜培養スケジュール＞
　細胞培養は下記のスケジュールで行った。細胞起眠日をＤａｙ０として以降の日を表す。
Ｄａｙ－１：試薬調製及び準備
Ｄａｙ０：凍結心筋細胞起眠、プレートのプレコート、試験用９６ウェルプレートへの播種、培養
Ｄａｙ１～５：１日おきに１５０μＬのＣＤＩ維持培地で培地交換して培養
Ｄａｙ７～１３：１日おきに２００μＬのＣＤＩ維持培地で培地交換して培養
Ｄａｙ１４：遺伝子発現解析
＜試験用プレートのｉＭａｔｒｉｘ－５１１ｓｉｌｋコーティング方法＞
　ＰＢＳ（－）９ｍＬに７０μＬのｉＭａｔｒｉｘ－５１１ｓｉｌｋを添加して希釈し、コーティング液とした。コーティング液を１００μＬ／ｗｅｌｌ（使用濃度１．２１μｇ／ｃｍ2）で試験用９６ウェルプレートに添加し、３７℃インキュベーター中で１時間静置した。細胞を播種する前に、アスピレーションで除去した。
＜凍結心筋細胞の起眠と播種＞
　ＣＤＩ解凍／播種用培地にＹ－２７６３２を終濃度１０μＭになるように添加し、解凍用培地として用いた。使用時に３７℃に加温してから使用した。
　凍結心筋細胞を３７℃のウォーターバスで解凍し、解凍用培地に懸濁した。３００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。解凍用培地で細胞を懸濁し、２×１０6～５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整後、細胞数をカウントし、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ｓｉｌｋコーティングした試験用９６ウェルプレートに８×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内に静置した。実験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで行った。
＜ＲＮＡ抽出とＲＴ－ｑＰＣＲ＞
　ｃＴｎＴ、ＭＹＬ２、Ｋｉｒ２．１、ＰＧＣ１α（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ）及びＧＡＰＤＨを解析対象とした。
（１）試薬及び機器
ＲＮＡ抽出：ｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（製品番号２１７００４、キアゲン社製）
ｃＤＮＡ合成：ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（Ｒ）ｑＰＣＲ　ＲＴ　ＭａｓｔｅｒＭｉｘ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖｅｒ（製品番号ＦＳＱ－３０１、ＴＯＹＯＢＯ社製）
ｑＰＣＲ反応：ＰｏｗｅｒＵｐ　ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（製品番号Ａ２５７７６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６　ＦｌｅｘＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）
Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ分光光度計Ｃ４０（ワケンビーテック株式会社製）
（２）ＲＮＡ抽出
　心筋細胞の培養上清を除去した後、ＱＩＡＺＯＬ（キアゲン社製）を添加し、懸濁して細胞を溶解し、溶解物をチューブに回収した。以降はｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔに添付のプロトコルに従ってＲＮＡを抽出し、Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ分光光度計Ｃ４０でＲＮＡ濃度を測定した。
（３）ＲＴ－ｑＰＣＲ
　上記で抽出したＲＮＡ２５３ｎｇを用いて、ＰｏｗｅｒＵｐＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘに添付のプロトコルに従って逆転写反応を行いｃＤＮＡの合成を行った。その後、６ｎｇのｃＤＮＡを用いてスタンダード法にてｑＰＣＲ反応を行った。検量線は１０ｎｇ／μＬの各ｃＤＮＡサンプルを１０μＬずつ集め、そこから１／１０希釈して５点作製した。
＜遺伝子発現の評価＞
　細胞から抽出したＲＮＡを用い、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６ＦｌｅｘＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍにて遺伝子発現量の解析を行った。使用したプライマーの配列を表１に、ＰＣＲの条件を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（結果）
　遺伝子発現量を解析した結果を図１に示す。遺伝子発現量は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の遺伝子発現量を１とした場合の相対値とし、±ＳＤ（ｎ＝３）で示した。
　Ｔプレートを用いた場合（参考例２）は、ｃＴｎＴ、ＭＹＬ２、Ｋｉｒ２．１、及びＰＧＣ１α（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ）の発現量は、Ｃプレート（参考例１）よりも多かった。この結果から、Ｔプレートを用いて心筋細胞を培養すると、心筋細胞特異的な遺伝子の発現が上昇し、心筋細胞の機能を向上させ得ることが明らかになった。
［実施例１～９、比較例１～９］試験用プレートの材質の違いによる、薬剤応答性の変化（方法）
　試験用プレートとして、Ｃプレート（比較例１～９）、Ｔプレート（実施例１～９）を用いて、薬剤を添加し、カルシウムトランジェントを解析した。
＜培養スケジュール＞
　細胞培養は下記のスケジュールで行った。細胞起眠日をＤａｙ０として以降の日を表す。
Ｄａｙ－１：試薬調製及び準備
Ｄａｙ０：凍結心筋細胞起眠、プレートのプレコート、及び試験用９６ウェルプレートへの播種（工程（Ａ））、培養（工程（Ｂ））
Ｄａｙ１：ＣＤＩ維持培地で培地交換して培養（工程（Ｃ））
Ｄａｙ４～１３：２日おきに特製維持培地で培地交換して培養（工程（Ｃ））
Ｄａｙ１４：特製維持培地を用いて、薬剤添加、及びカルシウムトランジェント解析（工程（Ｄ）、工程（Ｅ））
＜試験用プレートのｉＭａｔｒｉｘ－５１１ｓｉｌｋコーティング方法＞
　特製基礎培地３ｍＬに１９．２μＬのｉＭａｔｒｉｘ－５１１ｓｉｌｋを添加して希釈し、コーティング液とした。コーティング液を１００μＬ／ｗｅｌｌ（使用濃度１μｇ／ｃｍ2）で試験用９６ウェルプレートに添加し、３７℃インキュベーター中で１時間静置した。コーティング液は除去せずに、コーティング液を残したまま、心筋細胞を播種した。
＜凍結心筋細胞の起眠と播種＞
　ＣａｒｍｙＡ特製播種用培地にＹ－２７６３２を終濃度１０μＭになるように添加し、特製解凍播種用培地として用いた。使用時に室温して使用した。
　凍結心筋細胞を３７℃のウォーターバスで解凍し、特製解凍播種用培地に懸濁した。３００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。特製解凍播種用培地で細胞を懸濁し、２×１０6～５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整後、細胞数をカウントし、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ｓｉｌｋコーティングした試験用９６ウェルプレートに６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（培地量２００μＬ）で細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内に静置した。実験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで行った。
＜薬剤添加＞
　薬剤は、ＤＭＳＯを終濃度０．１％、ベプリジルを終濃度１μＭ、２μＭ、４μＭ、ペンタミジンを終濃度１１．１μＭ、３３．３μＭ、１００μＭ、イソプロテレノールを終濃度２０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭとなるように添加した。
　Ｔプレートにおいて、ベプリジルを終濃度１μＭ、２μＭ、４μＭ、ペンタミジンを終濃度１１．１μＭ、３３．３μＭ、１００μＭ、イソプロテレノールを終濃度２０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例１～９とした。
　Ｃプレートにおいて、ベプリジルを終濃度１μＭ、２μＭ、４μＭ、ペンタミジンを終濃度１１．１μＭ、３３．３μＭ、１００μＭ、イソプロテレノールを終濃度２０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭとなるように添加したものをそれぞれ、比較例１～９とした。
（結果）
　０．１％ＤＭＳＯの結果を図２、１μＭベプリジルの結果を図３、１μＭベプリジルの結果のＥＡＤ様波形を拡大した結果を図４、２μＭベプリジルの結果を図５、４μＭベプリジルの結果を図６、１１．１μＭペンタミジンの結果を図７Ａ、図７Ｂ、３３．３μＭペンタミジンの結果を図８Ａ、図８Ｂ、１００μＭペンタミジンの結果を図９Ａ、図９Ｂ、２０ｎＭイソプロテレノールの結果を図１０、１００ｎＭイソプロテレノールの結果を図１１、５００ｎＭイソプロテレノールの結果を図１２に示す。Ｐｒｅは薬剤添加前、Ｐｏｓｔは薬剤添加後を示す。
　ＤＭＳＯ、ベプリジル、又はペンタミジンを添加した場合は、添加１０分後の結果を示す。イソプロテレノールを添加した場合は、添加１０分後、２４時間後、４８時間後の結果を示す。
　０．１％ＤＭＳＯを添加しても、Ｔプレート、Ｃプレートのいずれの場合も、わずかに蛍光強度が増加したが、カルシウムイオン波形には影響しないことを確認した（図２）。
　Ｔプレートにおいて、１μＭベプリジルを添加したところ（実施例１）、３ウェル中２ウェルで、微弱ではあるがＥＡＤ（早期後脱分極、ｅａｒｌｙａｆｔｅｒｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）様波形が検出された（図３、図４）。Ｔプレートにおいてベプリジルの濃度を２μＭに増加させても（実施例２）、ＥＡＤ様波形がより顕著に検出されることはなく（図５）、４μＭに増加させると（実施例３）、拍動様波形は検出されなくなった（図６）。一方、Ｃプレートにおいては、ベプリジルの濃度を１μＭ、２μＭ、４μＭと変化させても（比較例１～３）、ＥＡＤ様波形は検出されなかった（図３、図４、図５、図６）。
　ベプリジルは、狭心症の治療に用いられるカルシウム拮抗薬の一つであるが、副作用としてｔｏｒｓａｄｅｄｅｐｏｉｎｔｅｓ（ＴｄＰ）といわれる致死性の心室性不整脈を誘発することが知られている。しかし、その催不整脈作用はｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞等を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏの試験系では検出が難しいとされている。しかし、実施例１においては、ｔｏｒｓａｄｅｄｅｐｏｉｎｔｅｓ（ＴｄＰ）のきっかけとなるＥＡＤ様波形を検出することができ、ベプリジルの催不整脈作用を検出できることが明らかになった。
　１１．１μＭペンタミジンを添加したところ、Ｔプレートでは（実施例４）、添加２４時間後に不整脈が検出されたが（図７Ａ）、Ｃプレートでは（比較例４）不整脈は検出されなかった（図７Ｂ）。ペンタミジンの濃度を３３．３、１００μＭとあげると、Ｔプレートにおいても不整脈は検出できなかった（実施例５、６、図８Ａ、図９Ａ）。Ｃプレートでは１００μＭペンタミジンを添加したところ（比較例６）、１０分後に、急性の不整脈が検出された（図９Ｂ）。
　ペンタミジンは、抗菌薬の１つであるが、不整脈を誘発する作用が知られており、その作用メカニズムは、ｈＥＲＧ（ｈｕｍａｎ　ｅｔｈｅｒ－ａ－ｇｏ－ｇｏ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ）タンパク質の膜移行（トラフィッキング）阻害によるものとされている。そのため、ペンタミジンが、催不整脈作用を発現するためには、長時間曝露を必要とすることが知られている。
　実施例４で不整脈が検出されたのがペンタミジン添加２４時間後であることは、ペンタミジンの作用メカニズムを考慮すると合理的であるため、Ｔプレートにおいては、ペンタミジンのｈＥＲＧタンパク質の膜移行（トラフィッキング）阻害作用を検出できていると考えられる。一方、Ｃプレート（比較例６）で検出された急性の不整脈は、ペンタミジン添加１０分後であったから、ｈＥＲＧタンパク質の膜移行（トラフィッキング）阻害作用とは異なる非特異的な作用の可能性が高い。Ｔプレートでは、このような非特異的な作用が見られなかったことから、Ｔプレートを用いると、薬剤の作用を評価する際に偽陽性を減らすことができることが示唆された。
　２０ｎＭイソプロテレノールを添加したところ、Ｔプレート（実施例７）では、頻脈化が安定して確認できた（図１０）。一方、Ｃプレート（比較例７）では頻脈化は確認できたものの、カルシウムイオン波形が乱れ、安定していなかった。１００、５００ｎＭとイソプロテレノールの濃度をあげた場合には、Ｔプレート（実施例８、９）においては頻脈化が安定して確認でき、Ｃプレート（比較例８、９）においても頻脈化のパターンが安定して確認できた（図１１、図１２）。
　イソプロテレノールは、β１、β２受容体アゴニストであり、心拍数増加作用（頻脈化作用）を有する。Ｔプレートを用いると、Ｃプレートに比べ、イソプロテレノールが低濃度であっても、心拍数増加作用（頻脈化作用）を安定して検出することができた。Ｔプレートを用いると、Ｃプレートに比べて、薬剤の作用をより高感度で評価できると考えられる。
［参考例３、４、５］酸素透過性の高い試験用プレートの検討（方法）
　酸素透過性の高いＰＤＭＳ製の試験用プレートを用いて、心筋細胞培養への影響を検討した。試験用プレートとしてＧプレート（ＴＣＰＳ製、参考例３）、Ｔプレート（参考例４）、Ｖプレート（ＰＤＭＳ製、参考例５）を用いた。
＜培養スケジュール＞
　細胞培養は下記のスケジュールで行った。細胞起眠日をＤａｙ０として以降の日を表す。
Ｄａｙ－１：試薬調製及び準備
Ｄａｙ０：特製解凍播種用培地を用いて、凍結心筋細胞起眠、プレートのプレコート、試験用９６ウェルプレートへの播種、培養
Ｄａｙ１：特製維持培地で培地交換して培養
Ｄａｙ３～１３：２日おきに特製維持培地で培地交換して培養
Ｄａｙ６：顕微鏡観察
　試験用プレートのｉＭａｔｒｉｘ－５１１ｓｉｌｋコーティング、凍結心筋細胞の起眠と播種は、特製解凍播種用培地を用いたこと以外は、実施例１～９と同様にして行った。
　播種６日後に顕微鏡を用いて明視野で細胞を観察し、写真を撮影した。また、蛍光顕微鏡でも観察して動画及び静止画を撮影した。
（結果）
　播種６日後において細胞を観察した写真を図１３に示す。左は、Ｇプレートを用いた参考例３、中央はＴプレートを用いた参考例４、右はＶプレートを用いた参考例５の写真である。Ｇプレートを用いた参考例３、Ｔプレートを用いた参考例４では、心筋細胞は試験用プレートに充分に接着していた。また、蛍光観察したところ、同期した拍動様波形が検出された。一方、Ｖプレートを用いた参考例５では、心筋細胞は試験用プレートに充分に接着しておらず、細胞塊が見られた。また、蛍光観察したところ、同期した拍動様波形は検出されなかった。
　この結果から、試験用プレートが酸素透過性の高いＰＤＭＳ製であっても、心筋細胞の培養、特に拍動様波形の検出は不可能であることが明らかになった。
［実施例１０～１７、比較例１０～１７］培地の検討
（方法）
　試験用プレートとしてＴプレート又はＧプレートを用い、播種１日目以降の培地として、特製維持培地又はＣＤＩ維持培地を用いて薬剤添加し、カルシウムトランジェントを解析した。
＜培養スケジュール＞
　細胞培養は下記のスケジュールで行った。細胞起眠日をＤａｙ０として以降の日を表す。
Ｄａｙ－１：試薬調製及び準備
Ｄａｙ０：特製基礎培地を用いて、プレートのプレコートをおこない、特製解凍播種用培地を用いて、凍結心筋細胞起眠、試験用９６ウェルプレートへの播種（工程（Ａ））、培養（工程（Ｂ））
Ｄａｙ１：特製維持培地または、ＣＤＩ維持培地で培地交換して培養（工程（Ｃ））
Ｄａｙ３～１３：２日おきに特製維持培地又はＣＤＩ維持培地で培地交換して培養（工程（Ｃ））
Ｄａｙ１４：培地交換、薬剤添加、カルシウムトランジェント解析（工程（Ｄ）、工程（Ｅ））
＜培地＞
　試験用プレートのｉＭａｔｒｉｘ－５１１ｓｉｌｋコーティングは、特製基礎培地でおこなった。凍結心筋細胞の起眠と播種は、特製解凍播種用培地を用いて行った。
　播種１日目以降の培地交換、薬剤添加、及びカルシウムトランジェント解析に用いる培地を特製維持培地又はＣＤＩ維持培地とした。
＜薬剤添加＞
　薬剤は、ＤＭＳＯを終濃度０．１％、ベプリジルを終濃度０．０６μＭ、０．２５μＭ、１μＭ、４μＭとなるようにそれぞれ添加した。
　Ｔプレートにおいて、播種１日目以降の培地として特製維持培地を用いて、ベプリジルを終濃度０．０６μＭ、０．２５μＭ、１μＭ、４μＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例１０～１３、播種１日目以降の培地としてＣＤＩ維持培地を用いて、ベプリジルを終濃度０．０６μＭ、０．２５μＭ、１μＭ、４μＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例１４～１７とした。
　Ｇプレートにおいて、播種１日目以降の培地として特製維持培地を用いて、ベプリジルを終濃度０．０６μＭ、０．２５μＭ、１μＭ、４μＭとなるように添加したものをそれぞれ、比較例１０～１３、播種１日目以降の培地としてＣＤＩ維持培地を用いて、ベプリジルを終濃度０．０６μＭ、０．２５μＭ、１μＭ、４μＭとなるように添加したものをそれぞれ、比較例１４～１７とした。
（結果）
　結果を図１４～図２３に示す。「特製維持培地」とは、播種１日目以降の培地として特製維持培地を用いた場合、「ＣＤＩ」とは播種１日目以降の培地としてＣＤＩ維持培地を用いた場合を示す。Ｐｒｅは薬剤添加前、Ｐｏｓｔは薬剤添加後を示す。
　０．１％ＤＭＳＯを添加すると、Ｔプレートの場合、わずかに蛍光強度が増加したが、カルシウムイオン波形には影響しなかった（図１４）が、Ｇプレートの場合、カルシウムイオン波形に乱れが観察された（図１５の特製維持培地Ｐｏｓｔの一番下）。
　Ｔプレートの方が、Ｇプレートよりも拍動様波形が安定しており、シグナルが増強されていた。また、Ｔプレートにおいて播種１日目以降の培地として特製維持培地を用いた場合、ＣＤＩ維持培地を用いた場合よりもさらに拍動様波形が安定して検出され、シグナルが増強されていた。
　Ｔプレートにおいて、ベプリジルを０．０６μＭ又は０．２５μＭ添加した場合（実施例１０、１１、１４、１５）も、Ｇプレートにおいて、ベプリジルを０．０６μＭ又は０．２５μＭ添加した場合（比較例１０、１１、１４、１５）も、カルシウムイオン波形の乱れは検出されなかった（図１６、図１７、図１８、図１９）。
　Ｔプレートにおいて、播種１日目以降の培地として特製維持培地を用いた場合、ベプリジルを１μＭ添加すると（実施例１２）、微弱ではあるがＥＡＤ（早期後脱分極、ｅａｒｌｙ　ａｆｔｅｒ　ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）様波形が検出された（図２０）。Ｔプレートにおいて、播種１日目以降の培地としてＣＤＩ維持培地を用いた場合、ベプリジルを１μＭ添加すると（実施例１６）、ＥＡＤ様波形は検出されなかったが、ＱＴ延長は検出された（図２０）。
　Ｇプレートにおいて、播種１日目以降の培地として特製維持培地を用いた場合、ベプリジルを１μＭ添加すると（比較例１２）、ウェルによっても異なるが、カルシウムイオン波形が乱れ、拍動様波形は検出されなくなり、ＥＡＤ様波形も、ＱＴ延長も検出されなかった。Ｇプレートにおいて、播種１日目以降の培地としてＣＤＩ維持培地を用いた場合、ベプリジルを１μＭ添加すると（比較例１６）、カルシウムイオン波形は安定していたが、ＥＡＤ様波形も、ＱＴ延長も検出されなかった（図２１）。
　Ｔプレートにおいてベプリジルの濃度を４μＭに増加させると（実施例１４、１７）、培地の種類にかかわらず、拍動様波形は検出されなくなった（図２２）。Ｇプレートにおいても同様に、ベプリジルの濃度を４μＭに増加させると（比較例１４、１７）、培地の種類にかかわらず、拍動様波形は検出されなくなった（図２３）。
［実施例１８～実施例２１］薬剤添加直前における培地交換及びベラパミルの検討
　試験用プレートとしてＴプレートを用い、薬剤添加直前における培地交換の影響を検討した。また、試験用プレートとしてＴプレートを用い、ベラパミルの、心筋細胞に対する作用を評価できるかを検討した。
（方法）
＜試験スケジュール＞
Ｄａｙ－１：試薬調製及び準備
Ｄａｙ０：特製基礎培地を用いて、Ｔプレートのプレコートをおこない、特製解凍播種用培地を用いて、凍結心筋細胞起眠、試験用９６ウェルプレートへの播種（工程（Ａ））、培養（工程（Ｂ））
Ｄａｙ１：特製維持培地で培地交換して培養（工程（Ｃ））
Ｄａｙ４～１３：２日おきに特製維持培地で培地交換して培養（工程（Ｃ））
Ｄａｙ１４：培地交換、薬剤添加、カルシウムトランジェント解析（工程（Ｄ）、工程（Ｅ））
＜Ｄａｙ１４の詳細＞
＜培地交換＞
　培地交換Ａ：プレート内の特製維持培地を除去し、新しい特製維持培地を添加した。
　培地交換Ｂ：プレート内の特製維持培地を除去し、新しい特製維持培地を添加して、すぐに除去した後、再度、新しい特製維持培地を添加した。
＜薬剤添加＞
　培地交換ＡまたはＢを行ったプレートに、培地交換の約３０分後に薬剤（ベラパミル）を添加した。薬剤は、ＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭストックソリューションを作製し、１０ｍＭストックソリューションを目標とする最終濃度の１０倍濃度となるように特製維持培地で希釈して、添加用薬剤液とした。添加用薬剤液は、測定培地量の１０分の１量を測定培地中に添加した。例えば、終濃度１０ｎＭでベラパミルを添加する場合、１０ｍＭストックソリューションを特製維持培地で希釈して１００ｎＭの添加用薬剤液を作製し、測定培地１５０μＬに対して、添加用薬剤液を１５μＬ添加した。対照群にはＤＭＳＯを終濃度０．１％で添加した。
　培地交換ＡまたはＢを行い、ベラパミルを終濃度１０ｎＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例１８、１９とした。
　培地交換ＡまたはＢを行い、ベラパミルを終濃度１００ｎＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例２０、２１とした。
＜カルシウムトランジェント解析＞
　薬剤添加の１０～３０分後にカルシウムトランジェント解析を行った。
（結果）
　ベラパミルを終濃度１０ｎＭで添加した結果を図２４、ベラパミルを終濃度１００ｎＭで添加した結果を図２５に示す。Ｐｒｅは薬剤添加前、Ｐｏｓｔは薬剤添加後を示す。図２４Ａは培地交換ＡのＰｒｅ、図２４Ｂは培地交換ＢのＰｒｅ、図２４Ｃは培地交換ＡのＰｏｓｔ、図２４Ｄは培地交換ＢのＰｏｓｔの結果である。図２５Ａは培地交換ＡのＰｒｅ、図２５Ｂは培地交換ＢのＰｒｅ、図２５Ｃは培地交換ＡのＰｏｓｔ、図２５Ｄは培地交換ＢのＰｏｓｔの結果である。
　１０ｎＭベラパミルを添加したところ、培地交換ＡおよびＢのいずれの場合も波形の変化は見られなかった（図２４）。１００ｎＭベラパミルを添加したところ、培地交換ＡおよびＢのいずれの場合も、Ｐｒｅに比べｔＰｏｓｔでは、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙが小さく変化、言い換えると、心筋細胞の収縮性が減弱しており、ベラパミルの弱心作用（陰性変力作用）が検出された（図２５）。
　ベラパミルは、カルシウムイオンチャネルブロッカーである。ベラパミルは、心筋細胞内のカルシウムイオン濃度を低下させ、心筋細胞の収縮性を減弱させる弱心作用（陰性変力作用）、及びＱＴ短縮作用を有することが知られている。ベラパミルは、臨床的なＴｄＰのリスクレベルが低リスクであり、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた、従来の催不整脈モデルでもＴｄＰのリスクレベルが低く予測される薬剤である。
　本発明の一態様である方法により、ベラパミルの弱心作用（陰性変力作用）を検出することができた。
　培地交換ＡとＢによる差は見られなかった。
［実施例２２～実施例５３］その他の薬剤の検討
　次に、試験用プレートとしてＴプレートを用い、播種１日目以降の培地として特製維持培地を用いて、その他の薬剤の、心筋細胞に対する作用を評価できるかを検討した。
　文献Ａでは、臨床的なＴｄＰのリスクレベル（高リスク、中リスク、低リスクまたは無リスク）が知られている２８の薬物について、電気生理学的反応の濃度依存性と変動要因を評価し、ヒトｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ催不整脈モデルとしての有用性を評価している。
　臨床的なＴｄＰのリスクレベルと、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた催不整脈モデルで推測されるリスクレベルとは、相関する薬剤が多いが、例外的な薬剤、すなわち、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた、従来の催不整脈モデルではリスクレベルの予測が困難である薬剤も存在している（文献Ａ　Ｆｉｇｕｒｅ６）。そこで、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた、従来の催不整脈モデルではリスクレベルの予測が困難である薬剤の作用を、本発明の一態様である方法で評価した。
　具体的には、臨床的なＴｄＰのリスクレベルが高リスク又は中リスクであるのに、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた、従来の催不整脈モデルではＴｄＰのリスクレベルが低く予測されてしまう薬剤の代表例としてベプリジル、リスペリドン、テルフェナジンを用いた。また、臨床的なＴｄＰのリスクレベルは低リスクであるのに、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた、従来の催不整脈モデルではＴｄＰのリスクレベルが高く予測されてしまう薬剤の代表例としてラノラジンを用いた。
（方法）
＜試験スケジュール＞
Ｄａｙ－１：試薬調製及び準備
Ｄａｙ０：特製基礎培地を用いて、Ｔプレートのプレコートをおこない、特製解凍播種用培地を用いて、凍結心筋細胞起眠、試験用９６ウェルプレートへの播種（工程（Ａ））、培養（工程（Ｂ））
Ｄａｙ１：特製維持培地で培地交換して培養（工程（Ｃ））
Ｄａｙ４～１３：２日おきに特製維持培地で培地交換して培養（工程（Ｃ））
Ｄａｙ１４：培地交換、薬剤添加、カルシウムトランジェント解析（工程（Ｄ）、工程（Ｅ））
＜薬剤添加＞
　実施例１８～２１と同様の方法で薬剤を添加した。
　ベラパミルを終濃度６０ｎＭ、２５０ｎＭ、１０００ｎＭ、４０００ｎＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例２２、実施例２３、実施例２４、実施例２５とした。
　Ｅ－４０３１を終濃度１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例２６、実施例２７、実施例２８、実施例２９とした。
　ベプリジルを終濃度６０ｎＭ、２５０ｎＭ、１μＭ、４０μＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例３０、実施例３１、実施例３２、実施例３３とした。
　ベプリジルを終濃度３１２ｎＭ、１．２５μＭ、５μＭ、２０μＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例３４、実施例３５、実施例３６、実施例３７とした。
　リスペリドンを終濃度１ｎＭ、１０ｎＭ、０．１μＭ、１μＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例３８、実施例３９、実施例４０、実施例４１とした。
　リスペリドンを終濃度６０ｎＭ、２５０ｎＭ、１μＭ、４μＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例４２、実施例４３、実施例４４、実施例４５とした。
　テルフェナジンを終濃度０．２５ｎＭ、１ｎＭ、４ｎＭ、１６ｎＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例４６、実施例４７、実施例４８、実施例４９とした。
　ラノラジンを終濃度１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ、１００００ｎＭとなるように添加したものをそれぞれ、実施例５０、実施例５１、実施例５２、実施例５３とした。
＜カルシウムトランジェント解析＞
　実施例１８～２１と同様の方法でカルシウムトランジェント解析を行った。
＜ＣＡＤ３０及びＣＡＤ８０＞
　カルシウムトランジェント解析で得られた波形から、ＣＡＤ３０（ＣａＤ３０、ｃａｌｃｉｕｍ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｄｕｒａｔｉｏｎ　ａｔ　３０％）及びＣＡＤ８０（ＣａＤ８０、ｃａｌｃｉｕｍ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｄｕｒａｔｉｏｎ　ａｔ　８０％）を算出した。Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙのピークの最小値が測定された時間をｔ０とした。ピークの最小値を０、ピーク最大値を１としたときの、ピーク最大値から３０％減少した値（０．７）が測定された時間までのｔ０からの経過時間をＣＡＤ３０、８０％減少した値（０．２）が測定された時間までのｔ０からの経過時間をＣＡＤ８０とした。概念図を図２６に示す。
　ＣＡＤ３０及びＣＡＤ８０は、図２６にその概念図を示す通り、ＱＴ時間の指標となる値である。対照に比べて、ＣＡＤ３０とＣＡＤ８０の両方、またはどちらか一方が延長している場合はＱＴ延長、ＣＡＤ３０とＣＡＤ８０の両方、またはどちらか一方が短縮している場合は、ＱＴ短縮しているといえる。
（結果）
　結果を図２７～図４２に示す。Ｐｒｅは薬剤添加前、Ｐｏｓｔは薬剤添加後を示す。
（ベラパミルについて）
　図２７より、６０ｎＭ、２５０ｎＭベラパミルではＩｎｔｅｎｓｉｔｙがＰｒｅとＰｏｓｔでほとんど変化がなかった。データは示していないが、対照群（ＤＭＳＯを添加）では、Ｐｒｅに比べてＰｏｓｔでＩｎｔｅｎｓｉｔｙが増加したことを考慮すると、６０ｎＭ、２５０ｎＭベラパミルではＩｎｔｅｎｓｉｔｙの増加が抑制されたといえる。つまり、ベラパミルはＩｎｔｅｎｓｉｔｙを小さく、言い換えると、心筋細胞の収縮性を減弱させており、ベラパミルの弱心作用（陰性変力作用）が検出された。１０００ｎＭでは、ベラパミルの弱心作用（陰性変力作用）がはっきりと検出された（図２７）。図２８より、１０００ｎＭ、４０００ｎＭ　ベラパミルでは、Ｐｒｅに比べてＰｏｓｔでは、ＣＡＤ３０及びＣＡＤ８０が減少した。すなわち、ベラパミルはＱＴを短縮した。また、これらの作用はベラパミルの濃度依存的であった。
　本発明の一態様である方法により、ベラパミルの弱心作用（陰性変力作用）及びＱＴ短縮作用を検出することができた。
（Ｅ－４０３１について）
　Ｅ－４０３１はカリウムイオンチャネルブロッカーであり、ＥＡＤ及びＴｄＰを誘発することが知られている。Ｅ－４０３１は、臨床的なＴｄＰのリスクレベルが高リスクであり、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた、従来の催不整脈モデルでもＴｄＰのリスクレベルが高く予測される薬剤である。
　図２９、図３０より、１０ｎＭからＱＴ延長が観察され、１００ｎＭにおいて、ＱＴ延長はより顕著であり、Ｅ－４０３１の催不整脈作用を濃度依存的に検出できた。
　本発明の一態様である方法により、Ｅ－４０３１の催不整脈作用を検出することができた。
（ベプリジルについて）
　ベプリジルは、元々は抗狭心症薬として承認されたカルシウム拮抗薬であるが、ＩＶ群に分類される抗不整脈薬（Ｖａｕｇｈａｎ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ分類による）でもある。ベプリジルは、カルシウムイオンチャネルだけでなく、ナトリウムイオンチャネル及びカリウムイオンチャネルも抑制する、いわゆるｍｕｌｔｉ－ｉｏｎｃｈａｎｎｅｌ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ作用を持つ。ベプリジルは、カリウムイオンチャネル抑制作用に基づくＱＴ延長及びｔｏｒｓａｄｅｓ　ｄｅ　ｐｏｉｎｔｅｓ（ＴｄＰ）を誘発することが知られている。
　図３１、図３２より、６０ｎＭ～４０００ｎＭのベプリジル添加により、ＱＴ延長が検出されたが、濃度依存性は見られなかった。１μＭにおいては、ＥＡＤ様波形が検出された。次に、ベプリジルの濃度範囲をより狭くして実験を行った。図３３、図３４より、３１２ｎＭ、１２５０ｎＭのベプリジル添加により、ＱＴ延長が検出された。
　本発明の一態様である方法により、ベプリジルの催不整脈作用を検出することができた。
（リスペリドンについて）
　リスペリドンは、ドーパミン２受容体とセロトニン２Ａ受容体の拮抗作用を有する非定型抗精神病薬であるが、ＱＴ延長を誘発することが知られている。
　図３５、図３６より、１ｎＭ～１μＭのリスペリドン添加により、濃度依存的なＱＴ延長が検出された。そこで、リスペリドンの濃度範囲を変更して実験を行った。図３７、図３９より、６０ｎＭ、２５０ｎＭ、１０００ｎＭのリスペリドン添加により、濃度依存的なＱＴ延長が検出され、特に２５０ｎＭにおいては、ＥＡＤ様波形も検出された（図３７矢印）。
　本発明の一態様である方法により、リスペリドンの催不整脈作用を検出することができた。
（テルフェナジンについて）
　テルフェナジンは、ヒスタミンＨ１受容体拮抗薬であるが、ＱＴ延長、ＴｄＰを起こし、心停止を起こす報告が相次いだために市場から撤退した。現在では、テルフェナジンの活性代謝物であり、催不整脈作用のないフェキソフェナジンが後継の抗アレルギー薬として汎用されている。
　図３９、図４０より、０．２５ｎＭ～１６ｎＭのテルフェナジン添加により、濃度依存的なＱＴ延長は検出されなかった。しかし、４ｎＭにおいては、異常波形が検出された（図３９矢印）。
　本発明の一態様である方法により、テルフェナジンの催不整脈作用を検出することができた。
（ラノラジンについて）
　ラノラジンはナトリウムイオンチャネルブロッカーである。ラノラジンは、ｉｎ　ｖｉｖｏで不整脈を引き起こすリスクは低いが、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞ではＱＴ延長が検出され、催不整脈作用を有するものとして判定されてしまうことが知られている。すなわち、ラノラジンは、従来のｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた催不整脈モデルでは偽陽性として判定されることが知られている。
　図４１、図４２より、１０ｎＭ～１００００ｎＭの広範囲の濃度でラノラジンを添加しても、波形の変化は見られず、ＱＴ延長は検出されなかった。
　本発明の一態様である方法によれば、ラノラジンは催不整脈作用を有するものとは評価されなかった。すなわち、本発明の一態様である方法によれば、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞を用いた従来の催不整脈モデルでは偽陽性として判定される薬剤であっても、正しく陰性として判定することができ、偽陽性を減らすことができる。
　実施例３０～５３より、本発明の一態様によれば、ｉＰＳ細胞を分化させた心筋細胞等を用いた従来のｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験系では検出が難しいとされていた薬剤の作用を検出できることが明らかになった。
＜参照による援用＞
　この出願は、２０２２年１月１１日に日本国特許庁に出願された特願２０２２－００２５５６号及び２０２２年６月２９日に日本国特許庁に出願された特願２０２２－１０４６１３号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims (17)

  1. 　薬剤の、心筋細胞に対する作用を評価する方法であって、
    　培養容器の培養面に心筋細胞を播種する工程（Ａ）、
    　前記工程（Ａ）で得られた心筋細胞を培養する工程（Ｂ）、
    　前記培養された心筋細胞を前記薬剤に曝露させる工程（Ｄ）、及び
    　前記工程（Ｄ）で得られた心筋細胞の細胞機能の指標を分析して評価する工程（Ｅ）を含み、
    　前記培養容器の培養面の少なくとも一部が４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されている、方法。
  2. 　前記工程（Ｂ）で得られた心筋細胞をさらに培養する工程（Ｃ）を含み、
    　前記工程（Ｃ）及び（Ｄ）が、遊離脂肪酸１～１００μｇ／ｍＬを含有する培地（β）中で行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記培地（β）が、更に、リゾホスファチジルコリン１～１００μｇ／ｍＬ、トリアシルグリセリド１～１００μｇ／ｍＬ、ホスファチジルコリン１～１００μｇ／ｍＬ、ホスファチジン酸１～１００μｇ／ｍＬ、コレステロール０．１～１０μｇ／ｍＬ、及びスフィンゴミエリン０．１～１０μｇ／ｍＬから選ばれる少なくとも１種を含有する、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記工程（Ａ）及び（Ｂ）が、代替血清を含有する無血清培地（α）中で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　前記４－メチル－１－ペンテン重合体が、４－メチル－１－ペンテンとエチレン及び炭素数３～２０のα－オレフィン（４－メチル－１－ペンテンを除く）から選ばれる少なくとも１種のオレフィンとの共重合体である、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　前記培養容器の培養面全体が、４－メチル－１－ペンテン重合体を含む基材から形成されている、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 　前記培養面が、ラミニンを含むコーティング剤でコートされている、請求項１又は２に記載の方法。
  8. 　前記心筋細胞が、人工多能性幹細胞を分化させた心筋細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
  9. 　前記心筋細胞が、人工多能性幹細胞をプロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法により分化させた心筋細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
  10. 　前記作用が、心毒性である、請求項１又は２に記載の方法。
  11. 　前記心毒性が、催不整脈作用である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記心毒性が、心筋傷害作用である、請求項１０に記載の方法。
  13. 　前記細胞機能の指標が、ミトコンドリア機能の指標である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記細胞機能の指標が、カルシウムイオン波形である、請求項１又は２に記載の方法。
  15. 　前記工程（Ｅ）において、早期後脱分極（ＥＡＤ）を検出する、請求項１又は２に記載の方法。
  16. 　前記作用が、頻脈作用又は徐脈作用である、請求項１又は２に記載の方法。
  17. 　前記細胞機能の指標が、カルシウムイオン波形である、請求項１６に記載の方法。
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