WO2023128714A1 - 바이오리액터 및 관련 장치 - Google Patents

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WO2023128714A1
WO2023128714A1 PCT/KR2022/021762 KR2022021762W WO2023128714A1 WO 2023128714 A1 WO2023128714 A1 WO 2023128714A1 KR 2022021762 W KR2022021762 W KR 2022021762W WO 2023128714 A1 WO2023128714 A1 WO 2023128714A1
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WO
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cell culture
bioreactor
medium
wells
culture plate
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PCT/KR2022/021762
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English (en)
French (fr)
Inventor
노인섭
바타차리야아미타바
Original Assignee
주식회사 매트릭셀바이오
서울과학기술대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C12M1/32—Inoculator or sampler multiple field or continuous type
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present invention relates to a bioreactor and a related device, and more particularly, to a bioreactor using mechanical stimulation such as pressure, torsion, and expansion and/or physical stimulation such as electrical stimulation. More specifically, the present invention relates to a multi-purpose bioreactor for individually or simultaneously delivering various physical stimuli to cells including hydrogels, bioinks, tissue engineering scaffolds, cells, cell masses or tissue engineering structures, and related devices. will be.
  • a bioreactor refers to a system capable of artificially reproducing a biochemical reaction process such as physical stimulation, decomposition, synthesis, or chemical conversion of a substance, which is occurring in the body of a living organism.
  • Bioreactors can be used for biomimetics, operating conditions and environmental factors, which can be used for cell culture, 3D tissue growth, bioink, in vitro tissue regeneration and tissue engineering, stem cell differentiation, cell therapy, 3D bioprinting, medical devices, and regeneration. It plays an important role in fields such as medicine.
  • the physical stimulation applied to the patient includes mechanical stimulation in which hydrostatic pressure generated as the compression and restoration of cartilage tissue by body load is repeated, such as knee cartilage, is applied to cartilage; electric stimulation of the chewing function of teeth in dentistry and the osseous-nervous tissue of the spine; torsional stimulation of tendon tissue caused by exercise; Induction of differentiation and proliferation of stem cells by electric/compressive stimulation; There is repetitive physical stimulation of expansion and contraction movements that occur in the cardiovascular system and cardiovascular muscle tissue.
  • bioreactors bioreactors
  • the hydrostatic load generated in cartilage is primarily a mechanical stimulus for the purpose of generating variable, repetitive pressure on a scaffold seeded with cells, a hydrogel material, or direct (in the absence of a scaffold) uniform pressure on the cells.
  • a study on improving the physical properties of human cartilage tissue regeneration using a biaxial load mechanical stimulation bioreactor system 2017, Scientific Report
  • stress of dynamic mechanical stimulation using a membrane micro device array capable of transforming mechanical-biological stimulation
  • Body stimulation pulsesating pressure, shear force, torsional force, etc.
  • blood vessel growth factor cartilage growth factor
  • nerve Neurons chondrocytes
  • osteocytes etc.
  • a study on the application of cell differentiation technology using physical stimulation such as a method for acquiring differentiated cells, and applying various modes of electrical stimulation such as direct current and square wave stimulation to control the level of calcium ions through the calcium ion channel in the cell wall.
  • Studies on the regulation of cell activity, skin cell protein enzyme (Akt) polarization, and endothelial cell elongation have been reported (J Biological Eng, 2015).
  • Akt skin cell protein enzyme
  • Korean Patent Registration No. 10-2040690 discloses an automated bioreactor for precise control of cell proliferation and differentiation using gas and medium replacement, that is, pressure.
  • Korean Patent Registration No. 10-1814440 is an invention related to tissue regeneration using centrifugal force, and discloses a method for producing bead-shaped cartilage tissue by coagulating costal chondrocytes and culturing the cells in 96 wells.
  • the present inventors applied pressure difference (differential pressure) applied to a specific microscopic structure of a tissue engineering scaffold, which was not attempted in the prior art, compression applied to a defective part of a complex shape such as bone-cartilage composite tissue, physical stimulation that simulates twist, Electrical stimulation, physical stimulation-electric stimulation can be applied simultaneously, physical stimulation by multiaxial extension, twisting, etc. is applied to the same device, that is, by directly modifying, modifying, and utilizing the in vitro cell culture plate to achieve the above physical stimulation.
  • bioreactor of the present invention various physical stimuli can be applied to cells at the same time, and different physical stimuli can be applied depending on the location, so that cells can be trained and differentiated more closely to the in vivo system, and biomimetic environment. tissue can be regenerated.
  • Hydrostatic loading is primarily used to create uniform pressure directly on cell-loaded scaffolds or gel materials or cells in the absence of scaffolds.
  • Direct compression pressure on tissue engineering scaffolds has been used in some bioreactors, but differential pressure on a particular construct has never been attempted using the same device, such as a cell culture plate.
  • the used medium is replaced with a fresh cell culture medium manually by the researcher at regular time intervals, and the automation of the programmed cell culture timing and fresh medium exchange It has no function, and there are problems such as not being able to maintain a constant freshness of the cell culture medium for the entire period of cell culture, as well as the problem of not being able to exchange (circulate / recycle) the used medium.
  • the present inventors have proposed such mechanical and electrical physical stimulation, stimulation applicable to complex shapes, cyclic stimulation of torsion, cyclic stimulation of expansion-contraction, simultaneous provision of electrical stimulation-physical stimulation, and replacement of in vitro cell culture medium. It has led to the development of cell culture plate assemblies specifically designed to solve the problem of medium delivery and recycling.
  • An object of the present invention is to provide an in vitro bioreactor that mechanically and electrically stimulates cells, including hydrogels, bioinks (hydrogels containing cells), tissue engineering scaffolds, cells, cell masses, scaffolds, or tissue engineering structures. It is to do.
  • Another object of the present invention is to provide an in vitro bioreactor that provides physical and electrical stimulation by connecting drives having various shapes and heights to a cover of a cell culture plate and deforming the base plate.
  • Another object of the present invention is to provide a bioreactor capable of applying differential pressure (different pressures), physical stimulation applicable to various shapes, expansion and compression, torsion stimulation, electrical stimulation, and physical stimulation in combination thereof.
  • differential pressure differential pressure
  • physical stimulation applicable to various shapes, expansion and compression, torsion stimulation, electrical stimulation, and physical stimulation in combination thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a bioreactor capable of precisely controlling the amount of strain (stress deformation, mechanical physical stimulation) due to applied physical stimuli, and the stress level and stress waveform.
  • Another object of the present invention is a bioreactor capable of applying electrical physical stimulation capable of providing electrical stimulation in addition to mechanical physical stimulation such as compression, expansion, and twisting. It is to provide a reactor.
  • Another object of the present invention is to provide cell differentiation and tissue regeneration induction technology and results by applying stimuli such as pressure, extension, twist, and electricity to cell systems such as growth factors, drugs, and cells contained in cell culture wells. it is for
  • Another object of the present invention is compressive load, electrical stimulation, differential pressure and expansion, mechanical mechanical stimulation,
  • a mechanical control system that can be created by imitating mechanical torque, etc., it is possible to implement compression and expansion application modes, and can control the amount of mechanical physical stimulation deformation from a very low level to a high level. It is to provide a bioreactor capable of applying any type of pressure, such as square, sawtooth, etc., to cells and a support containing cells according to a set program.
  • Another object of the present invention is to obtain an in vitro regenerated tissue by providing physical stimulation to cells included in a tissue regeneration scaffold by providing physical stimulation of expansion and twisting force to a Petri dish plate.
  • Another object of the present invention is to provide a bioreactor in which electrical stimulation can be transmitted to cells through a provided channel, and all stimulations can be applied to cells, tissue engineering scaffolds, gels, etc. for a specific period of time or periodically.
  • Another object of the present invention is a bioreactor capable of delivering electrical stimulation to cells on the sample surface (1-dimensional), inside the sample bulk (3-dimensional), well surface or dish surface by delivering electrical stimulation to an electrically conductive sample. is to provide
  • Another object of the present invention is to provide a miniaturized bioreactor in which all components are included in a single main body (case).
  • Another object of the present invention is to provide a bioreactor that is operated with a power supply that has a low risk of heat generation and is easy to replace.
  • Another object of the present invention is to provide a bioreactor plate compatible with all commercial cell culture plates used for in vitro cell culture and custom cell culture plates manufactured by methods such as 3D printing.
  • Another object of the present invention is to provide a bioreactor that can be freely moved, can be sterilized, and can be easily placed inside an incubator.
  • Another object of the present invention is to provide a technique for inducing attachment, proliferation and differentiation, re-differentiation, de-differentiation, and extracellular matrix production of (stem) cells using a combination of various physical and biostimuli-physical stimuli, and to provide results. it is for
  • Another object of the present invention is to induce tissue regeneration in a scaffold containing cells using various physical stimuli to obtain a tissue regeneration product (film, particle, cell aggregate, etc.) to which various physical stimuli have been applied, At this time, the obtained products (eg, film-type regenerated tissue) are stacked and mixed to obtain a composite regenerated tissue composed of one or more tissues, heterogeneous tissue, or a composite (eg, cell mass mixture).
  • a tissue regeneration product film, particle, cell aggregate, etc.
  • Another object of the present invention is to provide biomaterial composites containing cells, cell masses, cells, growth factors, exosomes, nano-micro particles, bioactive substances, drugs, etc., hydrogels, bioinks, tissue engineering scaffolds, and cells. It is to provide a cell culture plate well (cell culture plate well) and a cell culture Petri dish comprising.
  • a bioreactor includes a cell culture plate including one or more wells; A base frame having a fixing table for fixing cell culture plates of different sizes; and a stimulus transmission unit transmitting a physical stimulus to the biomaterial in the well.
  • the stimulation delivery unit and a cover plate detachably coupled to the reciprocating device and having one or more replaceable heads, the replaceable heads periodically compressing the biomaterial in the well according to the reciprocating motion of the reciprocating device.
  • a plurality of replaceable heads may be coupled to the cover plate, and at least one of the plurality of replaceable heads may include an electrode for applying electrical stimulation to the biomaterial in the well.
  • a plurality of replaceable heads are coupled to the cover plate, and the plurality of replaceable heads include heads having cross sections of various shapes, section heads including surfaces having different heights due to steps, and a surface applying pressure to a horizontal surface. It includes at least one of a uniform head made of a material, a differential head including a surface having a gradually different height to apply differential pressure, and a head provided with electrodes to simultaneously apply compression and electrical stimulation.
  • the surface of the head can be adjusted in various ways, such as a lattice, a curve, a height difference, a step shape, a pyramid, etc., as needed.
  • the holder is configured to hold cell culture plates of various specifications, including 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 or 96 well plates or Petri dishes.
  • the fixing base includes a cross shape in which four straight bars intersect at the center, and a screw hole is provided at an end of the straight bar to which a fixing screw is installed so as to advance or retreat in a threaded manner.
  • the bioreactor is assembled with a solenoid drive, and the solenoid drive includes a disk-type magnet for applying an impact load to the biomaterial.
  • the stimulation transmission unit includes an expansion applying mechanism coupled to a lower end of the reciprocating mechanism.
  • the expansion applying mechanism is rotatably installed at the lower end of the reciprocating mechanism and a pair of holders holding both ends of the sample in order to provide periodic expansion in the uniaxial direction to the sample immersed in the culture medium in the well.
  • the expansion applying mechanism includes a pair of guiders connected to the pair of holders, and the pair of guiders convert the up and down reciprocating motion of the reciprocating mechanism into uniaxial expansion and contraction motion of the sample.
  • the extension applying mechanism is rotatable at the lower end of the reciprocating mechanism and two pairs of holders holding the four ends of the sample in order to provide periodic expansion in the biaxial direction to the sample immersed in the culture medium in the well. It is installed and includes two pairs of guiders connected to the two pairs of holders at the bottom, and the two pairs of guiders convert the up and down reciprocation of the reciprocating mechanism into biaxial expansion and contraction movements of the sample.
  • the stimulation transmission unit includes a twist applying mechanism coupled to a lower end of the reciprocating mechanism, and the twist applying mechanism includes a fixed holder that can contact the cell culture plate and fixes one side of the sample, and the reciprocating movement. It includes a movable holder that is connected to a driver coupled in a crank manner to the lower end of the mechanism, each rotates by the reciprocating motion of the reciprocating mechanism, fixes the other side of the sample, and applies twist to the sample.
  • the stimulation transmission unit further includes a power supply device, a controller, and a timer relay to control a period of periodically stimulating the biomaterial and a stimulation application period.
  • the cell culture plate includes a plurality of wells, a supply unit for supplying recirculated or fresh medium from the outside, an inlet formed on the inner upper part of each well through which medium is injected, an outlet formed on the inner lower part of each well, and a recirculated medium. Includes a drain through which the medium is discharged to the outside.
  • the supply unit and the drain are connected to a supply line and a discharge line connected to the circulation pump and the medium storage tank to complete the medium circulation system.
  • the cell culture plate includes a perfusion path sequentially connecting the plurality of wells between the supply unit and the drain.
  • the cell culture plate includes a plurality of supply parts and a plurality of drains, and the cell culture plate includes an upper flow path connecting inlets of two neighboring wells between two neighboring wells and two neighboring wells between two neighboring wells. It includes a lower flow path connecting between outlets of the plurality of supply units, each of which is connected to the upper flow path, and each of the plurality of drains is connected to the lower flow path.
  • An electrode for applying electrical stimulation may be positioned in each of the wells.
  • the bioreactor further includes a cage for holding the electrode within the well.
  • the inlet or the outlet is covered with a stopper structure in the form of a screen, semi-permeable membrane, woven or non-woven material, micro/nano fiber sheet or gel.
  • a cell culture plate assembly is provided according to another aspect of the present invention, wherein the cell culture plate assembly includes: a cell culture plate comprising one or more wells; and at least one recirculation system coupled with the cell culture plate for recirculation or replacement of media in the wells, the cell culture plate comprising: One or more wells, a supply unit for supplying recirculated or fresh medium from the outside, an inlet formed on the inner upper part of each well through which the medium is injected, an outlet formed on the inner lower part of each well, and a medium to be recycled to the outside. Including the discharged drain.
  • the medium circulation system includes a medium storage tank, a supply line connected to the supply unit,
  • the cell culture plate includes a perfusion path sequentially connecting the one or more wells between the supply unit and the drain.
  • the cell culture plate includes one or more supply parts and one or more drains, and the cell culture plate has an upper flow path connecting inlets of two neighboring wells between two neighboring wells and a neighboring one between two neighboring wells. It includes a lower passage connecting the outlets of the two wells, each of the one or more supply parts is connected to the upper passage, and each of the one or more drains is connected to the lower passage.
  • the present invention is freely movable in use, sterilizable, versatile, easy to assemble and operate, easy to clean, and can easily apply and control mechanical and electrical stimuli individually and simultaneously, the user
  • multiple physical stimulation effects can be applied at once to effectively promote tissue regeneration and stem cell differentiation that require physical stimulation. More specifically, by simultaneously/comprehensively providing various physical stimuli to the existing tissue engineering scaffold (cell-bioactive material-tissue engineering scaffold) and stem cells that provided growth factors, drugs, exosomes, and cells, in vitro tissue It can promote regeneration and stem cell proliferation and differentiation.
  • Body load such as cartilage, meniscus, spine, tendon, ligament, muscle, etc.
  • physical muscle exercise by exercise muscle exercise such as heart/vascular by blood circulation, or physical stimulation such as esophagus where peristalsis of food is applied
  • It can provide an in vitro tissue regeneration system and technology that mimics, and has the expected effect of inducing cell attachment, proliferation, differentiation and tissue regeneration by providing physical stimulation to cells, stem cells, etc. using various physical stimuli. .
  • 1) the expected effect of changing the behavior of nerve cells in nerve tissue and maxillofacial tissue by simultaneously applying electrical stimulation or electrical stimulation and differential pressure and 2) the expected effect of differentiating into nerve cells and regenerating nerve tissue.
  • the technology that has been available to date includes a mechanical or electrical method, a direct compression method and a hydrostatic pressure method as the mechanical method, and a compression or expansion application mode in the direct pressure method.
  • a mechanical or electrical method includes a mechanical or electrical method, a direct compression method and a hydrostatic pressure method as the mechanical method, and a compression or expansion application mode in the direct pressure method.
  • the present invention it is possible to provide compression and twist in a uniaxial or biaxial direction.
  • available technologies have not been able to provide adjustable and precise control over the deformation range and differential pressure generation for the same sample, but the present invention provides adjustable and precise control over the deformation range and differential pressure generation for the same sample. It is possible.
  • the present invention has the advantage of being versatile (precise, adjustable and positive control over compression or expansion of the sample), portable, sterile, and can easily fit into the interior of any cell culture incubator. And the present invention can deliver programmed mechanical and electrical stimuli to the sample using a single setup. The number of samples, type and intensity of stimulation can also be changed as desired.
  • the present invention makes it easy to individually and simultaneously control mechanical and electrical stimuli in a series of samples, and allows researchers to apply various physical stimuli to tissue engineering scaffolds at once in multiple wells of one plate. Help.
  • the present invention has an effect of promoting tissue regeneration by providing physical stimuli under various conditions to bioprinting or cell-containing scaffolds.
  • the present invention can promote in vitro tissue regeneration such as cartilage and dental by applying a compressive load to the tissue engineering scaffold.
  • multi-layered tissue eg, cartilage
  • cartilage can be regenerated by providing a compressive load to a multi-layered biodegradable scaffold containing cells and providing different physical stimuli for each layer.
  • in vitro tissue regeneration of tendons and ligaments can be promoted by periodically providing torsional physical stimulation.
  • the present invention can promote in vitro tissue regeneration by providing various and complex physical stimuli by freely replacing and providing cover heads of various shapes.
  • the present invention can promote tissue regeneration, such as the esophagus, blood vessel airway, etc., by periodically providing an expansion stimulus to the tissue engineering scaffold.
  • the present invention can shorten the in vitro tissue regeneration time and reduce the risk of contamination that may occur during tissue regeneration by promoting tissue regeneration by periodically providing physical-electrical stimulation to the tissue engineering scaffold.
  • the present invention can be applied to induce differentiation of stem cells in vitro because compression, expansion, twisting, and electrical stimulation can be provided.
  • regenerated cells in single or multiple steps with various cell lineages differentiated from potent cells (or stem cells) to produce functionally active multi-layered tissues or organs.
  • tissue can be applied to tissue engineering scaffolds for tissue engineering and regenerative medicine (eg in vivo ).
  • the cell culture plate assembly presented in the present invention can simultaneously apply mechanical and electrical stimulation along with programmed perfusion through a counter electrode fixed at an exact position. Furthermore, the present invention is portable, sterilizable, can easily fit inside any incubator, and can be used without causing internal temperature rise in delivering continuous supply and recirculation of fluid or cell culture medium. Additionally, a single setup can be used to deliver programmed perfusion to the sample and serve as an appropriately placed counter electrode for tissue engineering configurations, and the flow rate, duration, and type of circulation can also be varied as desired.
  • the cell culture plate assembly of the present invention can not only be used by itself or in combination with a commonly used cell culture well plate cover, but also can be combined with the disclosed elements in Korean Patent Application No. 10-2021-0192557 to provide electrical and physical stimulation. At the same time as zooming, the medium can be automatically replaced/recirculated during the cell culture process.
  • the cell culture plate assembly of the present invention and the bioreactor including the same can simultaneously apply mechanical and electrical stimuli together with programmed perfusion of a counter electrode fixed at an accurate position, and deliver continuous supply and recirculation of fluid or cell culture medium. It is portable, sterile, fits easily inside any incubator, uses a single setup to deliver programmed perfusion to samples, and has the effect of being properly positioned for tissue engineering configurations.
  • the effects of the present invention are mentioned above, but are not limited to the effects. It should be understood that the effects of the present invention include all effects that can be inferred from the following description.
  • Figure 1 shows a bioreactor assembled with a specially designed cover plate to apply pressure and electrical stimulation as mechanical stimulation to the tissue regeneration scaffold.
  • Figure 2 shows a bioreactor assembled with an expansion application mechanism specially designed for the expansion mode.
  • FIG. 3 is a perspective view from above of a universal base frame, a reciprocating piston coupled thereto, and a specially designed cover plate, which are part of the bioreactor shown in FIG. 1;
  • FIG. 4 is a perspective view of the structure shown in FIG. 3 viewed from below.
  • FIG. 5 shows a state in which various heads are coupled to holes of the specially designed cover plate shown in FIGS. 3 and 4 .
  • FIG. 6 is a view showing various examples of a head coupled to a specially designed cover plate.
  • FIG. 7 shows a bioreactor and accessories assembled with a solenoid drive mounted on a cell culture plate to which a specially designed cover plate is coupled.
  • 9 to 14 are photographs showing the results over time after applying electrical stimulation or mechanical stimulation to the sample.
  • 15 and 16 are diagrams for explaining a bioreactor including a uniaxial expansion applying mechanism.
  • 17 is a view for explaining a bioreactor including a biaxial extension applying mechanism.
  • FIGS. 18 and 19 are views for explaining a bioreactor including a torsion applying mechanism.
  • 21 and 25 are diagrams for explaining an embodiment of a cell culture plate for a bioreactor in which a perfusion mechanism for recirculating and replacing cell culture medium in programmed multi-wells is integrated.
  • 26 to 28 are diagrams for explaining another embodiment of a cell culture plate for a bioreactor in which a perfusion mechanism for recycling and replacement of cell culture medium in programmed multi-wells is integrated.
  • 29 to 32 show an example applied to the bioreactor described above using the cell culture plate 1000 described above, wherein cells are loaded in the alginate gel and then a compressive load of a certain thickness is applied to the cell inside the alginate gel.
  • FIG. 1 shows a bioreactor assembled with a specially designed cover plate 200 to apply pressure and electrical stimulation as mechanical stimulation to a tissue regeneration scaffold
  • FIG. 2 shows a specially designed expansion application mechanism 300 for an expansion mode. Shows the assembled bioreactor.
  • the bioreactor includes a universal base frame 100 as shown in FIGS. 1 and 2 .
  • the bioreactor also includes a stimulation delivery unit for delivering mechanical stimulation, electrical stimulation or mechanical stimulation and/or electrical stimulation to the cells or any sample in the cell culture plate.
  • the stimulation delivery unit in the mode of applying pressure or electrical stimulation to the sample with various head(s), includes a motor 10, an adjustable cam 20, a reciprocating piston 30, Together with the power supply 40, the controller 50, the timer relay 60, and the power source 70 for the timer relay, with the help of these, it operates to reciprocate up and down periodically, and the sample is subjected to pressure stimulation and/or Alternatively, it may include a cover plate 200 applying electrical stimulation.
  • the stimulus transmission unit in the extended application mode for applying the expanded stimulus to the sample, includes a motor 10, an adjustable cam 20, a reciprocating piston 30, and a power supply 40 ), the controller 50, the timer relay 60, and the power supply 70 for the timer relay, and with the help of them, an expansion application mechanism 300 for applying an expansion force to the sample.
  • the expansion application mechanism 300 may be a uniaxial direction expansion application mechanism, or alternatively, a biaxial expansion application mechanism.
  • the stimulation transmission unit includes a motor 10, an adjustable cam 20, a reciprocating piston 30, a power supply 40, a controller 50,
  • a twist applying mechanism for applying twist to the sample with the help of these may be included.
  • the cell culture plate 2000 shown in FIG. 1 is preferably a 6, 12, 24, 48 or 96 well plate formed in an approximately rectangular or square shape and containing a plurality of wells
  • the cell culture plate shown in FIG. 2 ( 3000) is preferably an approximately circular Petri dish containing one well.
  • the stimulation transmission unit provides mechanical stimulation and / Alternatively, electrical stimulation may be delivered to the sample according to a program.
  • the controller 50 may control the RPM of the motor 10.
  • a power source 70 for operating the timer relay 60 is additionally provided.
  • FIG. 3 is a perspective view from above of a universal base frame, a reciprocating piston coupled thereto, and a specially designed cover plate, which are part of the bioreactor shown in FIG. 1, and
  • FIG. 4 is a perspective view of the structure shown in FIG. 3 viewed from below. 5 shows a state in which various heads are coupled to holes of the specially designed cover plate shown in FIGS. 3 and 4, and
  • FIG. 6 is a view showing various examples of heads coupled to the specially designed cover plate.
  • the universal base frame 100 is 1, 6, 12, 24, 48 or 96 well plates or various cell culture plates including petri dishes (2000 or 3000; see Figs. 1 and 2).
  • a fixing table 120 capable of fixing.
  • the fixing table 120 may have a cross shape in which four straight bars intersect at the center, and at the end of the straight bar, a jaw 122 having a screw hole 123 in which a fixing screw is installed to advance or retreat in a threaded manner is provided. do.
  • a screw hole 124 into which an adjustment screw is installed may be formed at the center of the holder 120 to adjust the height of the cell culture plate (2000 or 3000; see FIGS. 1 and 2).
  • the universal base frame 100 or the cell culture plate may serve as a ground for electrical signals.
  • the universal base frame 100 includes a platform capable of receiving cell culture plates from 5 mm to 300 mm or other vessels for cell culture/tissue engineering purposes with dimensions from 5 mm to 300 mm in all three directions.
  • the overall dimension of the universal base frame 100 is less than 500 mm.
  • the universal base frame 100 includes an upper support 140 located at a predetermined interval above the fixing table 120, and a guide 142 in the form of a hollow cylinder is formed on the upper support 140.
  • the reciprocating piston 30 is installed to be reciprocating up and down along the guide 142 .
  • a guide 142 guides the press actuator to an intended sample placed within a cell culture well (or vessel or container).
  • a connection portion 32 connected to an adjustable drive cam 20 (see FIGS. 1 and 2) connected to the motor shaft is formed at an upper end of the reciprocating piston 30.
  • a motor support 170 for holding the motor 10 is formed on one side of the universal base frame 100.
  • the universal base frame 100 may further include one or more supports for fixing a controller, a timer, a display, an electrical signal input generator, and a power supply.
  • the bioreactor includes a stimulation delivery unit for delivering mechanical stimulation, electrical stimulation or mechanical stimulation and/or electrical stimulation to the cells or any sample in the cell culture plate.
  • the stimulation transmission unit cooperates with the power supply 40, the controller 50, the motor 10, and the adjustable drive cam 20 as a reciprocating driving means.
  • the specially designed cover plate 200 is connected to the adjustable drive cam 20 installed on the motor shaft and is controlled by “+” so that the weight of the sample is not loaded.
  • the specially designed cover plate 200 may provide electrical stimulation to the sample from the power supply 40 .
  • the specially designed cover plate 200 has detachable pressure/extension heads 202 at the bottom to compress or expand the sample.
  • the head 210 may be connected to the power supply 40, and electrical stimulation may be applied to the sample through the head 210.
  • the number, shape and location of the replaceable heads 210 can be varied according to the researcher's requirements.
  • the replaceable head 210 includes a section head (a) including surfaces having different heights by steps to apply pressure with different heights, and surfaces having gradually different heights from the central portion to the edge portion.
  • the same universal base frame 100 can be used with a microcontroller 50 and power supply 40 to deliver a square wave or impulse pressure using a solenoid drive. Also, the universal base frame 100 can be used as a ground for electrical signals.
  • the entire configuration of the bioreactor is portable, sterilizable, and can be easily secured inside the incubator by clips, clamps, or other suitable fixing means that operate without vibration.
  • the universal base frame 100 includes one or more guides 142 and input electrical signal grounds for guiding compression actuators to intended samples located in wells or vessels of a cell culture plate, and having an overall dimension of less than 500 mm. It may include features.
  • At least one adjustable drive cam 20 is installed on the shaft of the motor 10 to enable screw adjustment, and displacement control of 0 to 20 mm is possible using a guide screw for position adjustment. .
  • positioning accuracy can be less than 0.01mm.
  • position control may be implemented using other mechanisms such as slots, worms, worm-worm wheels, pins, and racks.
  • the adjustable drive cam 20 may further include an adjustable connection that can adjust the distance between the cam positions to drive the drive head using screws or other types of adjustments.
  • a controlled mechanical stimulus may be applied to the sample and the cells located inside the cell culture plate by using an arbitrary reciprocating driving mechanism such as a solenoid or a piezoelectric actuator.
  • At least one reciprocating piston 30 may be coupled with a cam or other drive mechanism to achieve reciprocating motion.
  • the lower end of the reciprocating piston 30 is threaded at the bottom to connect to a cover plate 200 specially designed for cell culture plates, an expansion application mechanism 300, or many other specially designed compression or expansion heads or electrodes, or both.
  • Any mechanism such as a slot, clip, etc. may be used to attach the reciprocating piston to the pressure/expansion head, electrode or both.
  • the cover plate 200 for a cell culture plate (specifically, a 6, 12, 24, 48 or 96 well plate) includes a reciprocating piston 30 that reciprocates.
  • attached to the bottom of The cover plate 200 is a metal or non-metal for the purpose of growing an object in a cell culture plate, that is, living cells, hydrogels, biomolecules, or functionally active tissue regeneration in vitro by pressing pressure electrodes or electrical stimulation or both.
  • a screw may be provided in the hole 202 to hold the replaceable head 210 and provide an electrical pulse.
  • the replaceable compression head 210 can be assembled by fitting into the hole 202 of the cover plate 200 .
  • the interchangeable compression heads 210 have dimensions from 1 mm to 300 mm in one, two or three directions.
  • the interchangeable compression heads 210 may be cylindrical, cuboidal, cuboidal, pyramidal, conical, or in the shape of a living cell, hydrogel, biomolecule, metal for the purpose of growing functionally active tissue regeneration in vitro, It has any three-dimensional shape specially designed to be applied to objects having non-metals, alloys, polymers, or combinations thereof.
  • the replaceable heads 210 have any shape specifically designed to apply differential compression pressure to an object.
  • the replaceable heads 210 have a partially filled, solid or hollow shape to give the intended stimulus to the object.
  • the replaceable heads 210 have one or more electrodes for transmitting electrical signals to the object.
  • the replaceable head 210 includes a section head (a) including surfaces having different heights by steps to apply pressure with different heights, and a surface for applying pressure to apply uniform pressure is a horizontal plane
  • the head surface may be manufactured by adjusting various shapes such as a lattice, a curve, a height difference, a stair shape, and a star.
  • the electrode 211 is for transmitting various electrical signals, and for example, one or more holes may be drilled in the head 210 to provide the electrode 211 or a wire connected thereto.
  • the lower surface of the head 210 can be designed in various ways and its height adjusted to provide differential pressure or differential load to the object.
  • the bioreactor includes a universal base frame capable of fixing various cell culture plates and combined with various stimulation delivery units.
  • FIGS. 3 and 4 show a specially designed cover plate 200 corresponding to a 24-well cell culture plate as part of a 24-well stimulation delivery unit and a universal equipped with a mechanism for reciprocating the cover plate 200.
  • the base frame 100 is shown as an example.
  • the universal base frame 100 includes a fixing base 120 and an upper support 140 positioned above the fixing base 120 at a predetermined interval.
  • a guide 142 in the form of a hollow cylinder is formed on the upper support 140 .
  • a reciprocating piston 30 connected to an adjustable driver cam, which is a reciprocating driving mechanism, is installed to be capable of reciprocating up and down along the guide 142 .
  • a guide 142 guides the press actuator to an intended sample placed within a cell culture well (or vessel or container). As the motor rotates, the adjustable drive cam connected to the motor shaft reciprocates the reciprocating piston 30.
  • the fixing table 140 may have a cross shape in which four straight bars intersect at the center, and at the end of the straight bar, a jaw 122 having a screw hole 123 in which a fixing screw is installed to advance or retreat in a threaded manner is provided. do.
  • a screw hole 124 into which an adjusting screw is installed may be formed at the center of the holder 120 to adjust the height of the cell culture plate.
  • the bioreactor 7 shows a bioreactor and accessories assembled by mounting a solenoid drive 10' on a cell culture plate 2000 to which a specially designed cover plate 200 is coupled.
  • the solenoid driver 10' disk-type magnets with a weight of 3 grams (weight/magnet) are used to apply an impact load to the sample. The magnet number is used to impart the proper load to the sample.
  • the bioreactor includes a bioreactor power source connected to the solenoid driver 10', that is, a power supply device 40', and a power supply device 40' connected to the power supply device 40' and a solenoid driver ( 10'), a timer relay 60', and a power supply 70' for timer relay.
  • 8 shows a bioreactor setup operating in a CO 2 incubator.
  • 8 (a) is electrical stimulation, (b) is mechanical stimulation, (c) is gel compression according to cyclic load test, and (d) is various examples of compression heads used during the study (mechanical stimulation from the third to the left).
  • 8 (e) shows the gel in a 24-well plate after cyclic mechanical compression for 1 day (an impression of the compression head is shown).
  • FIG. 8 (a) and (b) For mechanical stimulation and electrical stimulation studies, two bioreactors were set in an incubator and used (Fig. 8 (a) and (b)). 2 mm at 25 oC for cylindrical gel samples (18.5 mm in height and 10 mm in diameter, similar in volume to a 24-well cell culture plate) using a texture analyzer analysis instrument (Stable Micro Systems model, TA.XT plus, Surrey, UK). Cyclic compression was applied at a rate of /min to evaluate the mechanical properties of the samples.
  • Figure 4 (d) shows the shapes of various heads and ends to which a 2.3 mm compressive load is applied, which provides a 1 N load to the sample for compression study, and the bioink containing cells under the condition corresponding to a 12.7 kPa pressure load.
  • the short electrostimulation head 2ml solution (height 13.4 mm, 10 mm diameter cylindrical sample) was used, and for the long electrostimulation head, 1 ml solution (height 6.7 mm, diameter 10 mm cylindrical sample) was used.
  • the resistance of the gel was observed to be 105 ⁇ 5 k ⁇ and 85 ⁇ 5 k ⁇ , respectively. Therefore, the amperage was observed to be around 50 ⁇ A (thick sample) and 60 ⁇ A (thin sample) for 5V and 20 ⁇ A (thick sample) and 25 ⁇ A (thin sample) for 2V power supply.
  • osteoblast cell lines Passage 13, MC3T3-E1 cell line, Young Science Inc., Korea
  • ⁇ -MEM Minimum essential media
  • fetal bovine serum Gibco Korea, Korea
  • penicillin-streptomycin 100 unit/mL
  • 37 °C the 24 well plate was connected to a mechanical and electrical bioreactor setup as shown in Figure 1. All alginate solutions were mixed with 1 million/ml cells and cross-linked with CaCl 2 solution (100 ⁇ l/ml). Control samples had no electrical or mechanical stimulation applied.
  • the plate was incubated for 30 minutes in the dark. Live and dead cells were imaged using different filters on a fluorescence microscope (Leica DMLB, Germany) and merged using the LAS-X Leica microsystem software (Fig. 9-A1, A2).
  • Figure 9 shows the cell behavior inside the bioink after 1 day of electrical stimulation, (a) control, (b) thin sample, (c) thick sample, (d) thick sample with a probe inserted at a distance of 7 mm in cross section. indicate The scale bar is 1 mm.
  • FIG. 10 shows cell behavior inside bioink 3 days after applying electric stimulation, (a) control, (b) thin sample, (c) thick sample, (d) thick sample with a probe inserted at a distance of 7 mm in cross section. indicates The scale bar is 1 mm.
  • 11 shows the cell behavior inside the bioink after 7 days of applying electric stimulation, (a) control, (b) thin sample, (c) thick sample, (d) thick sample with a probe inserted at a distance of 7 mm from the cross section. indicates The scale bar is 1 mm.
  • FIG. 12 shows cell proliferation after 1 day, and it was observed that there was a distinct growth difference between the high pressure region and the low pressure region of the section head (Fig. 12(b)). Cells in the high pressure region were observed to grow and proliferate faster than those in the low pressure region. However, higher pressures can lead to cell death, as in differential heads where more cell death is observed in the high pressure region. It was observed that uniform pressure led to more uniform cell proliferation over the entire sample area.
  • FIG. 13 shows changes in the behavior of bioink according to the application of mechanical (compressive) load on day 3.
  • (a) is a control group
  • (b) is a load applied with a section head
  • (c) is a uniform head (uniform). head)
  • (d) shows a differential head
  • (e) shows a less compressed (1 mm) sample.
  • the scale bar is 1 mm.
  • FIG. 13 shows the results of cell culture after 3 days.
  • the high pressure region of the section head shows a much broader cytoplasm than the low pressure region.
  • a uniform head delivering a cyclic compressive load of 1N shows very good cell proliferation.
  • a low load was not very effective as shown in FIG. 13(f).
  • the differential compression head showed a tendency for cell damage in the higher section of the compression load region.
  • an expansion application mechanism 300 as an attachment to the reciprocating piston 30 is fabric, sheet, fabric (woven, non-woven, knitted, braided and others), mesh, hollow
  • at least two or more holders 320 and 320 may be included to generate expansion force by holding ends at two or more points.
  • the holder 320 can accommodate a structure for periodic longitudinal extension of 10 mm to 200 mm in length, 0.001 mm to 50 mm in thickness and 0.001 mm to 50 mm in width, and may be partially or completely submerged in a liquid such as a cell culture medium.
  • 15 and 16 are diagrams for explaining a bioreactor for uniaxial expansion including the aforementioned universal frame 100, the Petri plate 3000, and the expansion applying mechanism 300 for uniaxial expansion.
  • the extension applying mechanism 300 for uniaxial extension is coupled to the lower end of the reciprocating piston 30 .
  • the expansion applying mechanism 300 for uniaxial expansion is a pair of holders 340 holding both ends of the sample in order to provide periodic expansion in the uniaxial direction to the sample submerged in the culture medium in the Petri plate 3000, which is a cell culture plate. , 340), and a pair of holder guiders (or sliders; 320, 320) rotatably installed at the lower end of the reciprocating piston 30 and connected to the pair of holders 340 and 340 at the lower end. do.
  • a pair of guiders (or sliders) 320 and 30 for the holder can convert the up and down reciprocating motion of the reciprocating piston 30 into expansion and contraction motions of the sample, that is, the structure.
  • the surface of the holder 340 in contact with the sample may have a flat surface, a nano/micro structure, an inclination, and the like.
  • a pair of holders (340, 340) is within the cell culture plate, more specifically, the petri dish (3000).
  • the sample may be periodically stretched in one axis direction.
  • the pair of guiders 320 and 320 push the pair of holders 340 and 340 outward or pull them inward by the up and down reciprocation of the reciprocating piston 30, and thus, the pair of holders 340 and 340 ), the sample fixed at both ends is periodically subjected to an extension force in the uniaxial direction.
  • FIG. 17 is a view for explaining a bioreactor for biaxial expansion including the aforementioned universal frame 100, a Petri plate 3000, and an expansion applying mechanism 300' for biaxial expansion.
  • an extension applying mechanism 300' for two-axis extension is coupled to the lower end of the reciprocating piston 30.
  • the expansion application mechanism 300' for biaxial expansion provides periodic stretching in two axial directions, that is, in the X-axis direction and in the Y-axis direction orthogonal thereto, to the sample at least partially submerged in the culture medium in the Petri plate 3000.
  • two pairs of holders 340 ' holding the left and right four ends of the sample and two pairs of holders 340' rotatably installed at the bottom of the reciprocating piston 30 and connected to the two pairs of holders 340' at the bottom It includes a guider (or slider; 320') for the holder.
  • the two pairs of guiders (or sliders) 320' for holders allow the up and down reciprocation of the reciprocating piston 30 to be converted into biaxial expansion and contraction movements of the sample, that is, the structure.
  • the surface of the holder 340' that contacts the sample may have a flat surface, a nano/micro structure, or an inclined surface.
  • the two pairs of holders 340' are cell culture plates, more specifically, within the Petri dish 3000.
  • the sample can be periodically stretched in the biaxial direction.
  • the two pairs of guiders 320' push the two pairs of holders 340' outward or pull them in, and thus, by the two pairs of holders 340'
  • the sample fixed at the four ends of the left and right sides is periodically applied with an expansion force in two axial directions intersecting each other.
  • FIGS. 18 and 19 are views for explaining a bioreactor for applying twist including the universal frame 100, the Petri plate 3000, and the twist applying mechanism 400 described above.
  • a torsional application mechanism 400 as an attachment to the reciprocating piston 30 may be fabric, sheet, fabric (woven, non-woven, knitted, braided and others), mesh, hollow tube, cylinder and at least two holders 420 and 440 to hold both ends and apply twist to the sample, which may have a different structure.
  • At least one holder 420 of the two holders is a fixed holder 420 and the other at least one is connected by a hinge 432 to a driver 430 connected to the reciprocating piston 30 and a crank type to reciprocate It is a movable holder 440 that rotates each rotation according to the reciprocating motion of the motion piston 30.
  • the fixing holder 420 may fix one side of the sample S while being fixed to the cell culture well plate 3000 or the Petri dish 3000 .
  • the up and down reciprocating motion of the reciprocating piston 30 is converted into a periodic torsional motion of the sample S by the driver 430 and the moving holder 440 to apply a torsional force.
  • the fixed holder 420 is provided with a first fixing pin 422 for fixing one side of the sample (S), and the movable holder 440 has a second fixing pin 442 for fixing the other side of the sample (S). ) may be provided.
  • 19 shows an action of applying twist to the sample (S) by rotating the movable holder 440 from Position 1 to Position 2 by the reciprocating piston 30 and the driver 430 connected in a cranked manner thereto.
  • the holder can accommodate regular or irregularly shaped structures ranging from 10 mm to 200 mm in length, 0.001 mm to 50 mm in thickness, and 0.001 mm to 50 mm in width, which are partially or completely immersed in a liquid such as a cell culture medium.
  • FIG. 20 shows various forms of various bioreactors by way of example.
  • a drive cover accommodating drive elements that drive a stimulus transmission unit such as a motor, a power supply, and a controller is integrated into a universal base frame.
  • 20(b) shows a bioreactor including a cell culture plate made of a rectangular single container or well
  • FIG. 20(c) shows mechanical stimulation (compression, expansion) by a stimulus delivery unit. or torsion) and/or a cover covering a cell culture plate to which electrical stimulation is applied.
  • the aforementioned bioreactor and/or elements constituting the bioreactor may be metal, non-metal or plastic.
  • bioreactor and/or components comprising the bioreactor may be sterilized by one or more of the conventional sterilization protocols in a cell culture laboratory.
  • the sterile bioreactor and/or elements constituting the bioreactor may be covered with an appropriate cover.
  • Process materials to which mechanical stimulation and electrical stimulation are applied are living cells, cell masses, gels, nano or micro particles, biomolecules, hydrogels, polymers, crosslinking agents, tissue engineering scaffolds, 3D printed structures, 3D bioprinted structures, and elastomers. and mixtures thereof.
  • a bioreactor comprising the foregoing components may be assembled and installed inside a laboratory incubator by means of clips, clamps, or other suitable fixing means that operate without vibration, intended, without an external power supply, intended, controlled and It can be operated for programmed stimulus application.
  • mechanical and electrical stimulation is applied to structures or cell delivery systems having multi-component materials including polymers, gels, nano and micro particles, biomolecules, bioinks and living cells.
  • mechanical and electrical stimuli may be applied to bioinks or structures having multi-component materials including polymers, gels, nano and microparticles, biomolecules and living cells.
  • the molding material of the aforementioned components may be metal, non-metal, alloy, plastic or composite.
  • the aforementioned components may be sterilized through one or more conventional sterilization protocols used in cell culture laboratories.
  • the process material for applying mechanical and electrical stimulation is a living cell, cell mass, gel, nano or micro particle, biomolecule, polymer, crosslinking agent, bioink, tissue engineering scaffold, 3D printed structure, 3D bioprinted structure , elastomers, and mixtures thereof.
  • an electrical stimulus may be delivered to the sample and applied to cells in or on the sample, cells on the surface of a well plate or on the surface of a petri dish.
  • the sample may have electrical conductivity, and more specifically, it may be an electrically conductive gel containing electrically conductive carbon nanotubes in a hydrogel.
  • the entire assembly of the above-mentioned components and process materials can be housed inside a laboratory incubator, capable of intended control, and operated for programmed stimulation application without an external power supply.
  • the present invention provides a structure having multi-component materials including polymers, gels, nano- and micro-particles, biomolecules, cell masses and living cells for the purpose of regenerating functionally active tissue in an incubator (bio ink or support) may include a method of applying mechanical and electrical stimuli.
  • the present invention provides multi-component materials, including polymers, gels, nano- and micro-particles, biomolecules, cell masses and living cells, for purposes other than regenerating functionally active tissue in an incubator. It may include a method of applying mechanical and electrical stimulation to a structure (bioink or scaffold) having a structure.
  • the present invention can apply materials and shapes capable of physical stimulation to biomaterials, hydrogels, bioinks, cell carriers, and tissue engineering scaffolds.
  • the cell culture plate of the present invention includes plates having various wells (6, 12, 24, 48, 96 wells) and cell culture dishes (5 cm, 10 cm, culture dishes manufactured in other sizes, etc.) can include
  • the power supply may be a 0 to 9 volt battery that has a low risk of overheating and is easy to replace.
  • a shock load may be applied to the sample using a disc-shaped magnet weighing 3 g per solenoid driven attachment to the bioreactor and a 24-well cell culture plate.
  • the number of the disk-shaped magnets can be adjusted to deliver an appropriate load, such as a body load, to the sample.
  • Electrical stimulation can use a 0 to 9 volt battery, voltage can be controlled by rpm/power controller, pulse, duration, etc. can be controlled by a program controlled by a time relay. there is.
  • the entire configuration can be miniaturized by including all in one case.
  • the bioreactor induces tissue regeneration in a cell-containing scaffold using physical stimulation to obtain tissue regeneration samples (film, particle, etc.) to which various conditions of physical stimulation are applied, and each sample (eg, film) obtained at this time
  • tissue regeneration samples film, particle, etc.
  • a single regenerated tissue can be obtained by stacking the regenerated tissue).
  • cartilage is composed of several layers (epidermal layer, middle layer, lower layer, bone-cartilage interface, etc.), and when physically stimulated layers are stacked, a composite layer of cartilage tissue can be obtained, which is used to replace lost cartilage tissue. can be applied
  • the cell culture plate assembly of the present invention described below may be applied to the aforementioned bioreactor(s), or may be used alone or in combination with other types of bioreactors.
  • FIG. 21 is a schematic view showing an example in which the cell culture plate assembly according to an embodiment of the present invention is applied to the bioreactor described above, and FIG. 22 is a view for explaining the cell culture plate in more detail.
  • the cell culture plate assembly for a bioreactor has a biodegradable tissue engineering structure (support), provides mechanical stimulation and electrical stimulation to the tissue engineering structure (support), and the tissue engineering structure includes cells or cells It is a system that can culture cells while applying physical stimulation to biomaterials, tissue engineering structures, or cells without containing
  • a cell culture plate assembly for a bioreactor includes a cell culture plate 1000, wherein the cell culture plate 1000 includes a plurality of wells or containers 1110 and a supply unit 1120 into which recirculated or fresh medium is introduced. ), a supply inlet 1130 covered with a screen on the inside of the well, a supply control cap 1140, a cage 1150 for fixing the electrode, an electrode fixing channel 1160, and a medium to prevent backflow It includes a siphon (1170) adjustable to the water, a discharge port (1180) at the bottom covered with a screen or membrane, and a drain (1190) through which the waste medium solution or the medium solution to be recycled is discharged.
  • the medium provided through the supply line moves the medium from the well 1110 to the other well 1110 through the siphon 1170 and moves out of the cell culture plate 1100 through the medium discharge line L1, thereby discharging the used medium. sent to the medium reservoir (1001).
  • the medium in the medium storage tank 1001 is transferred to the medium supply line L2 through the circulation pump 1002 and fresh medium is continuously passed through the cell culture plate 1000 to induce circulation of the medium.
  • the cell culture plate assembly includes a power supply 1003 for supplying power to the circulation pump 1002, a controller 1004 for controlling the circulation pump 1002 and the power supply 1003, It may include a timer relay 1005, a power supply 1006 for the timer relay, and a display.
  • FIG. 23 (a) and (b) are perspective views showing a height adjusting cap 1140 for a medium supply line and a siphon 1170 for a medium delivery or medium drain line, respectively.
  • the 24 shows an inner cage (or nest; 1150) for fixing electrodes provided in a cell culture plate.
  • the inner cage 1150 for fixing the electrode is divided into an inlet, which is an empty space in the upper membrane structure, and an outlet made of a screen or membrane.
  • An inner cage (nest) for electrical stimulation may be located at a distance of 0 mm to 100 mm from the inner surface of the well 1110 (see FIG. 21 ).
  • the cage 1150 is provided with an electrode 1152, and the electrode 1152 may be, for example, stainless steel or platinum.
  • the current supply model shown in (a) of FIG. 25 generates a lateral flow of current across the sample.
  • the + electrode is provided from the top head (not shown) and the sample is sandwiched between the bottom metal electrode and the top head electrode and provides current along the entire volume of the sample (following the cross-section).
  • the current supply model shown in (b) of FIG. 25 generates a longitudinal flow of current in a two-dimensional sample.
  • a sample is sandwiched between the + electrode and the - electrode, and the electrons provide current along the sample in the form of a film, for example, in the longitudinal direction of the sample.
  • the cell culture plate 1000 includes one or more wells or containers 1110 having a cylindrical, cubic, cuboidal, conical, spherical, regular or irregular shape for cell culture or tissue engineering. do.
  • the cell culture plate 1000 is 5 to 300 mm, and the dimensions of each well 1110 are 1 mm to 300 mm in one, two or three dimensions.
  • the well or container 1100 includes at least one perfusion pathway, channel or pipe.
  • the cell culture plate 1000 may be used alone or may be used in combination with a cover.
  • the cover may be a generally commercially available cover or a cover capable of applying mechanical stimulation such as compressive load stimulation or electrical stimulation separately or simultaneously, that is, the cover plate described above.
  • the pump 1002 for perfusion or circulation uses a medium inlet tubing connected to a vacuum pump to introduce fresh medium, or to discharge used medium to the outside using tubing after a suction pump. .
  • pump 1002 for perfusion or circulation may operate on 0 to 50V direct current.
  • the inner cage 1150 for fixing the electrode is divided into an inlet, which is an empty space in the upper membrane structure, and an outlet made of a screen or membrane.
  • the siphon 1170 is for transferring and discharging the medium between the wells 1110 and the wells 1110 and can prevent the medium used in the wells 1110 from flowing backward.
  • the siphon 1170 is positioned higher than the medium to prevent the medium from moving from well 1110 to well 1110, and a suction pump is used to aspirate the medium in the lower position to the next well. is injected into and discharged from
  • At least one electrode fixed at a specific location in the cell culture container or cell culture well (and electrical connection is connected to the tissue engineering structure while electrical pulses are delivered). It acts as a counter electrode or ground electrode.
  • the present invention includes two or more electrodes and electrical connections fixed at specific locations in a well or container to act as electrode pairs while delivering longitudinal or two-dimensional electrode stimulation to a tissue engineered construct.
  • the at least one perfusion pathway attached to the circulation pump comprises a regular or irregularly shaped channel or pipe having a diameter of 0 to 20 mm and a length of 0 to 1000 mm.
  • At least one pipe or channel of the well or container 1110 has a fluid adjustable or non-adjustable opening.
  • the well or container 1110 has at least one opening for a supply or discharge line of a pipe or channel.
  • the openings of the channels in well 1110 are covered in one or two dimensions with a 0.001 mm to 1 mm perforated screen.
  • the openings of the channels in the well 1110 may be covered with a semipermeable membrane, a woven or non-woven material, a micro/nano fiber sheet, or a gel-type stopper structure in addition to the screen.
  • the cell culture plate 1000 is cylindrical, cuboidal, conical, spherical, or regular for cell culture or tissue engineering purposes for securing electrodes inside the wells 1110. It contains one well or container with an irregular shape.
  • the inner cage 1150 for electrical stimulation is located at a distance of 0 mm to 100 mm from the inside of the well 1110.
  • the cell culture plate 1000 has at least one electrical connection to fixed or movable electrodes that can act as a ground or counter electrode for electrical stimulation in a transverse direction.
  • the cell culture plate 1000 has at least two or more electrical connection parts for fixed or movable electrodes that can serve as electrodes for giving electrical stimulation in a longitudinal direction.
  • the cell culture plate 1000 has a length, width and height of 1 mm to 300 mm in one, two or three dimensions.
  • the cell culture plate 1000 has one or more drains for draining fluid.
  • the channel opening of the well 1110 is covered with a screen having pores having a size of 0.001 mm to 1 mm in one dimension or two dimensions.
  • the opening of the channel is a structure covered with a structure other than a semi-permeable membrane, a non-woven or woven structure, a micro/nano porous sheet, a non-porous sheet or a gel-type structure for the purpose of tissue engineering.
  • connection between the channel and the circulation pump 1002 may or may not use a separate storage tank and treatment device, and may be unidirectional or bidirectional.
  • the supply unit or the input line connection unit of the channel may be connected to a storage tank composed of at least one section to supply a desired fluid to a specific well through a circulation pump.
  • the channel's medium delivery or discharge line connection is separate from the supply line and can be connected to a medium reservoir or pump for recirculation.
  • the medium delivery or drain line originates from the well and the opening, and at least one or more of the openings is located at a height of 0 to 20 mm from the bottom of the well.
  • the media delivery or drain line is designed so that fluid is only expelled when the fluid level rises to an adjustable level or is forced out of the well.
  • the material of manufacture of the components making up the cell culture plate may be metal, non-metal or plastic.
  • the components constituting the cell culture plate may be sterilized through any one or more of the conventional sterilization protocols used in cell culture laboratories.
  • processing materials for mechanical and electrical stimulation include living cells, gels, nano or micro membranes, arrayed fibers, porous or non-porous sheets, nano or micro particles, biomolecules, polymers, crosslinkers, and the like. It may be selected from the group consisting of mixtures of.
  • the components and processing materials that make up the cell culture plate can be housed inside a laboratory cell culture apparatus and operate for controlled, programmed perfusion with controlled and programmed stimulation application without an external power supply.
  • a method includes applying a controlled, programmed perfusion to a tissue engineered construct having processing materials for the purpose of growing functionally active tissue in vitro or otherwise.
  • the process material is selected from the group consisting of polymers, gels, micro/nanofibrous membranes, aligned fibers, porous or non-porous sheets, nano and micro particles, biomolecules and living cells.
  • a method of applying mechanical or electrical stimulation in a set, controlled, and programmed perfusion bioreactor to a tissue-engineered construct including processing materials with polymers, gels, micro/nanofibrous membranes, arrayed fibers, porous or non-porous sheets, nano and micro particles, biomolecules and living cells for functional growth or otherwise.
  • the bioreactor may be used as a single module, and any combination of such modules may be oriented in a specific orientation for controlled, programmed stimulation application with or without an external power supply.
  • stem cells, differentiated cells, tissue engineering products, or regenerated tissues in which stem cell differentiation is induced by physical stimulation may be generated using a bioreactor including a cell culture plate.
  • FIGS. 26 and 27 Another embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 26 and 27 .
  • the cell culture plate assembly comprises a cell culture plate 1000 comprising one or more containers or wells 1110 having a cylindrical, cubic, cuboidal, conical, spherical, or other regular or irregular shape for cell culture or tissue engineering purposes.
  • a cell culture plate 1000 comprising one or more containers or wells 1110 having a cylindrical, cubic, cuboidal, conical, spherical, or other regular or irregular shape for cell culture or tissue engineering purposes.
  • well is intended to include a container as well as a well in the general sense.
  • the cell culture plate 1000 includes a plurality of wells 1110 in a matrix arrangement.
  • the cell culture plate 1000 has a length, a width, and a width within a range of 5 mm to 300 mm, and three dimensions of each well, that is, a length, a width, and a width are within a range of 1 mm to 300 mm.
  • a plurality of circulation pumps 1002 are independently connected to a cell culture plate 1000 composed of a plurality of wells 1110 (12 in this embodiment), thereby providing a plurality of medium circulation systems. It is configured to supply a medium through.
  • a cell culture plate or well plate 10000 including 12 wells 1110
  • 4 medium circulation systems each including 4 circulation pumps 1002 are provided in a cell culture plate (or well plate 10000) including 12 wells 1110.
  • each of the three medium circulation systems (A1) among the four medium circulation systems including each circulation pump 1002 is a pair of neighboring wells 1002 and 1002. That is, the medium is circulatively supplied to the two wells, and the other medium circulation system A2 is configured to cyclically supply the medium to the two pairs of wells, that is, four wells.
  • the circulation pump 1002 for perfusion or circulation can be operated by a 0 to 50 v direct current supply.
  • Each of the four medium circulation systems corresponding to one cell culture plate may include a medium storage tank 1001, a circulation pump 1002, a controller for fluid circulation control, and a power supply unit.
  • each badge circulation system may further include a timer relay, a timer relay power supply, and a display.
  • one or more supports may be provided to hold the circulation pump, power supply, controller, timer relay, power supply, and the like.
  • the cell culture plate assembly may include the following configuration.
  • Cell culture plate 1100 includes one or more perfusion pathways for directing fluid to intended structures located in specific cell culture wells (or vessels) 1110 .
  • a perfusion pathway may include a channel or pipe.
  • Each well 1110 includes an upper inlet 1130 and a lower outlet 1180, and the lower outlet 1180 is connected to an independent medium circulation system A1 or A2 through a discharge line L1 connected to the drain 1190.
  • the upper inlet 1130 is connected to an independent medium circulation system through a supply line (L2) connected to the supply unit 1120.
  • L2 supply line
  • Two neighboring upper inlets 1130 and 1130 between two neighboring wells 1110 and 1110 are connected to each other by an upper flow path, and two neighboring lower outlets 1180 and 1180 between two neighboring wells 1110 and 1110 ) are connected to each other by a lower flow path.
  • the supply unit 1120 is connected to the upper flow path and the drain 1190 is connected to the lower flow path, completing the independent medium circulation system A1 for the two wells.
  • the medium supplied to the two wells 1110 through each supply line L2 and the upper inlet by the driving of the circulation pump 1002 passes through the lower inlet of the two wells 1110 and each discharge line L1 to the cells.
  • Moved out of the culture plate 1100 the used medium is sent to the medium reservoir 1001.
  • the medium in the medium storage tank 1001 is delivered to the supply line L2 again through the circulation pump 1002 to deliver fresh medium so that the medium continuously passes through the cell culture plate 1000 to induce circulation of the medium.
  • the supply unit 1120 and the drain 1190 are formed between the two neighboring wells 1110 and 1110, respectively, and the two neighboring pairs of wells are adjacent to each other.
  • the two lower outlets 1180 and 1180 adjacent to each other between the two wells are connected to the two upper inlets 1130 and 1130 adjacent to each other between the two adjacent wells by the two upper flow channels, respectively.
  • the supply unit 1120 is connected to the two upper flow channels and the drain 1190 is connected to the two lower flow channels, completing the independent medium circulation system A2 for 4 wells.
  • the medium supplied to the four wells 1110 through the supply lines L2 and L2 and the upper inlet by the circulation pump 1002 is driven by the lower inlet of the corresponding four wells 1110 and the discharge lines L1 and L1. ) through the cell culture plate 1100, and the used medium is sent to the medium reservoir 1001.
  • the medium in the medium storage tank 1001 is again delivered to the supply lines L2 and L2 through the circulation pump 1002 to deliver fresh medium so that the medium continuously passes through the cell culture plate 1000 to induce medium circulation.
  • a cell culture plate assembly for a bioreactor includes a cell culture plate 1000, wherein the cell culture plate 1000 includes a plurality of wells or containers 1110 and a plurality of supply units into which recirculated or fresh medium is introduced.
  • the cell culture plate 1000 includes a plurality of wells or containers 1110 and a plurality of supply units into which recirculated or fresh medium is introduced.
  • 1120, an upper inlet 1130 covered with a screen at the upper inner side of the well, a lower inlet 1180 covered with a screen at the lower inner side of the well, and the upper inlet 1130 adjacent to the two neighboring wells are connected to each other, and the supply unit It may include an upper flow path connected to and a lower flow path connected between two neighboring lower injection ports 1180 of two neighboring wells and connected to a drain.
  • the cell culture plate 1000 may further include a supply control cap as described in the previous embodiment, a cage for fixing electrodes, and an electrode fixing channel.
  • the cell culture plate 1000 can also include one or more electrodes and electrical connections that can act as counter (opposite) or ground electrodes while delivering transverse electrical pulses to tissue engineering constructs within the wells. These electrodes and electrical connections can be fixed at specific locations on the cell culture well (or vessel). Transversal electrical pulses may be applied for tissue (eg, nerve tissue, bone tissue) regeneration by electrical stimulation.
  • tissue eg, nerve tissue, bone tissue
  • Two or more electrodes and electrical connections are secured at specific locations within a cell culture well (or vessel) to act as electrode pairs while delivering longitudinal or two-dimensional electrical pulses to the tissue engineering construct. This is to maintain a constant distance between the tip of the cover drive in the well, the gel sample, and the medium.
  • the overall dimension of the cell culture well plate is 1000 mm on each of the three sides.
  • the perfusion path to which the circulation pump is coupled includes regular or irregularly shaped channels or pipes having a diameter of 0 to 20 mm and a length of 0 to 1000 mm.
  • the perfusion pathway includes an opening in a channel or pipe within the well for forming a supply line to the well (or vessel), which opening may be flow regulated or non-flow regulated.
  • the perfusion path to which the circulation pump is coupled includes at least one opening for a discharge drain or delivery or drain line of a pipe or channel of a well (or vessel) for recirculation purposes.
  • the delivery or drain line may have an adjustable siphon arrangement to maintain fluid within the well to a desired height.
  • the openings of the channels in the well may be covered by a filtering means.
  • the openings of the channels in the well may be covered with a screen having a pore size of 0.001 to 1 mm.
  • the channel openings of the wells 1110 may be covered with a structure other than a screen, such as a semi-permeable membrane, a nonwoven or woven structure, a micro/nano fiber sheet, or a gel type plug.
  • the at least one retaining means for holding the electrode inside the well may be a well shape (or container shape) having a cylindrical, cubic, cuboidal, conical, spherical or other regular or irregular shape for cell culture or tissue engineering purposes. there is.
  • the well shape may or may not be similar to the shape of the well described above.
  • At least one retaining means for holding the electrode inside the well may be located inside the well at a distance of 0 mm to 100 mm from the inner wall of the well.
  • At least one retaining means for retaining the electrode within the well has one or more electrical connections to the fixed or movable electrode so that the fixed or movable electrode serves as a ground or counter electrode for transverse electrical stimulation.
  • the means for holding the electrodes within the well may have two or more electrical connections to the fixed or movable electrodes so that the fixed or movable electrodes act as an electrode pair for longitudinal electrical stimulation.
  • At least one holding means for holding the electrode inside the well has a length, width and height of 1 mm to 300 mm in one, two or three dimensions.
  • One holding means for holding the electrode inside the well has a drain hole for draining the fluid.
  • the openings of the channels in the retaining means are covered with a screen having an air gap of 0.001 to 1 mm in one or two dimensions.
  • the openings of the channels in the retaining means may be covered with structures other than screens, such as semi-permeable membranes, non-woven or woven structures, micro/nanofiber sheets, non-porous sheets, or gel-type plugs for tissue engineering purposes.
  • Channel connections to pumps or circulating pumps may or may not have separate storage tanks and used liquid disposal units in one or both directions.
  • Separate independent pumps for individual wells or groups of wells may be accommodated in one or more circulation pathways.
  • the supply or infusion line connections of the aforementioned channels may be connected to a storage tank, which includes one or more sections for supplying fluid intended into a particular well via a circulating pump.
  • the delivery or discharge line connection of the channel is separate from the supply line and can be connected to a used liquid disposal unit or pump for recirculation.
  • the delivery or discharge line originates from a hole formed in the aforementioned well or the aforementioned retaining means.
  • One or more drain holes are located at a height of 0-20 mm from the bottom of the well.
  • the delivery or discharge line from the well is designed so that the fluid level rises to an intended adjustable height or exits the well when forced pumped.
  • a material for fabricating the parts of the cell culture well plate described above may be metal, non-metal or plastic.
  • Components of the cell culture well plate described above may be sterilized through one or more of the common sterilization protocols used in cell culture laboratories.
  • the processing materials to which mechanical and electrical stimulation are applied are micro/nanofiber membranes, aligned fibers, porous or non-porous sheets, nano or micro particles, biomolecules, polymers, crosslinking agents, and mixtures thereof. It may be any of living or non-living things including.
  • the entire assembly including the cell culture plate described above and the process materials described above can be accommodated inside a laboratory incubator and controlled perfusion for programmed perfusion and intended control of programmed stimulatory action without an external power supply. can work with
  • a medium circulation method using the above-described cell culture plate and the above-described process materials wherein the medium circulation method is provided for the purpose of growing a functionally active tissue in vitro, a polymer, A mechanical, electrical or any other stimulus is applied to a structure having multi-component materials including gels, micro/nanofibrous membranes, aligned fibers, porous or non-porous sheets, nano and micro particles, biomolecules and living cells.
  • a structure having multi-component materials such as polymers, gels, micro/nanofibrous membranes, aligned fibers, porous or non-porous sheets, nanoparticles and microparticles, biomolecules, and living cells for in vitro functionally active tissue
  • a method for growing by applying electrical stimulation to is provided.
  • a method of applying electrical stimulation to a structure having multi-component materials such as polymers, gels, micro/nanofibrous membranes, aligned fibers, porous or non-porous sheets, nanoparticles and microparticles, biomolecules, and living cells is provided. .
  • the entire assembly of the foregoing components can be used as a single module, any number of such modules being intentionally controlled and controlled, with programmed stimulation applications with or without an external power supply. It can be arranged in any particular orientation for programmed perfusion.
  • FIG. 28 shows an example in which the cell culture plate 1000 described above is applied to the bioreactor described above. It is fixed by the fixing screws shown.
  • a stimulus transmission mechanism capable of transmitting electrical and/or mechanical stimuli may be coupled to the reciprocating piston 30 installed to be reciprocating on the upper support 140 of the universal base frame 100 .
  • the stimulus cutting instrument may be a cover plate 200 with interchangeable heads capable of applying pressure and/or electrical stimulation to the sample in the well 1110 (see FIG. 27 ).
  • a case in which various elements for driving the stimulation transmission unit are accommodated may be integrally connected to the universal base frame 100 .
  • FIG. 29 shows an example applied to the bioreactor described above using the cell culture plate 1000 described above, and cell behavior changes of cells inside the alginate gel by loading the cells in the alginate gel and then applying a compressive load. This is the result of observing changes in viability, cell proliferation, and production of extracellular matrix such as collagen and GAG.
  • Figure 29 shows the results of cell behavior according to application of static cell culture (static) and bioreactor (dynamic) for 1 day
  • Figure 30 shows cell behavior according to application of static cell culture (static) and bioreactor (dynamic) for 3 days.
  • 31 is a measurement result of collagen production according to static and bioreactor (dynamic) application for 4 days
  • FIG. 32 is GAG production according to static and bioreactor (dynamic) application for 4 days Indicates the measurement result.
  • Alginate gel was dissolved in 100 mL of deionized water by continuously stirring 4 g of the Na salt of alginic acid on a magnetic stirrer overnight at 400 rpm.
  • a 100 mM CaCl 2 solution in phosphate buffered saline (PBS) (1.1 g in 100 ml PBS) was prepared with constant stirring for 1 hour.
  • PBS phosphate buffered saline
  • For alginate gel preparation 100 ⁇ l of CaCl 2 solution was used per 1 ml of alginate solution.
  • the bioreactor compression load was applied periodically, and the amount of collagen and GAG (glycosaminoglycan) was measured while the cell culture was in progress for 4 days.
  • the bioreactor application conditions were 20% strain, load application cycle 0.5 Hz, 2 hours/day, 90 seconds stop and 30 seconds load application cycle.
  • the cells were cultured for 7 days, the density of 250,000 cells/ml, the pre-incubation time before applying the bioreactor was 24 hours, and the total culture period was 7 days. was added well and mixed by hand.
  • the amount of collagen and GAG produced during the cell culture process under static cell culture and the compressive load of the bioreactor were compared and analyzed.

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Abstract

압축하중과 전기 자극을 제공하는 바이오리액터가 개시된다. 개시된 바이오리액터는, 하나 이상의 웰을 포함하는 세포 배양 플레이트; 다른 크기의 세포 배양 플레이트를 고정하는 고정대를 구비한 베이스 프레임; 및 상기 웰 내의 바이오 물질에 물리적 자극을 전달하는 자극 전달 유닛을 포함한다.

Description

바이오리액터 및 관련 장치
본 발명은 바이오리액터 및 관련 장치에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 압력, 비틀림, 확장 등의 기계적 자극 및/또는 전기적 자극 등의 물리 자극을 이용한 바이오리액터(bioreactor)에 관한 것이다. 보다 더 구체적으로, 본 발명은 하이드로젤, 바이오잉크, 조직공학 지지체, 세포, 세포 덩어리 또는 조직공학 구조물을 포함하는 세포에 다양한 물리 자극을 각각 혹은 동시에 전달하기 위한 다목적 바이오리액터 및 이와 관련된 장치에 관한 것이다.
바이오리액터는 생물의 체내에서 이루어지고 있는 물리적 자극, 물질의 분해, 합성 또는 화학적인 변환 등의 생화학적 반응 과정을 인공적으로 재현할 수 있는 시스템을 지칭한다. 바이오리액터는 생체모사, 동작 조건 및 환경인자의 조절이 가능하여, 세포 배양이나 3D 조직 성장, 바이오잉크, in vitro 조직재생과 조직공학, 줄기세포 분화, 세포치료제, 3D 바이오프린팅, 의료기기, 재생의학 등의 분야에 있어서 중요한 역할을 하고 있다.
in vitro 조직재생과 조직공학 재생의학 분야에서 물리 자극은 스캐폴드(scaffold) 내에서 또는 스캐폴드가 없는 환경에서 세포가 성장하고 증식하여 활성 조직을 형성하는 데 도움이 된다는 것이 입증되었으며, 경우에 따라 강력한 세포주를 특정 계통으로 분화하거나 재분화하는 데 도움이 된다. 특히 조직재생을 생체환경을 모사하는 물리 자극을 제공함으로써, in vitro 조직의 재생을 촉진을 유도함으로써 정적인 조건에서의 인체조직재생 기간과 비교하여 인체조직을 재생하는 기간을 현저히 단축시키며, 또한 재생조직을 인체조직과 유사한 조직으로 유도하는데 유용한 기술이다. 이러한 물리 자극 중에서 기계적 및 전기적 자극은 연구자뿐만 아니라 임상의도 많이 사용하는 기술이다.
환자에게 적용되는 물리 자극은 무릎연골과 같이 신체 하중에 의한 연골조직의 압축과 복원이 반복되면서 발생하는 정수압(hydrostatic pressure)이 연골에 적용되는 기계적인 자극; 치과의 치아의 저작기능 과정과 척추의 골-신경조직으로의 전기자극; 운동에 의해 발생되는 건 조직의 비틀림 자극; 전기/압축 자극에 의한 줄기세포의 분화와 증식유도; 심혈관, 심혈관의 근 조직에서 발생하는 확장과 수축운동의 반복적인 물리 자극 등이 존재한다. 이러한 환자 신체의 물리자극을 모사할 수 있는 in vitro 물리 자극을 제공하기 위해 연구자들은 실험실 환경에서 다양한 모델의 바이오리액터(생물반응기)를 사용하여 세포의 분화, 조직이나 특정 기관의 재생을 유도하는 과정에서 물리자극을 사용하고 있다.
예를 들면, 연골에서 발생되는 정수압 하중은 주로 세포가 접종된 지지체, 하이드로젤 재료에 다양하고, 반복적인 압력을 생성하거나 세포에 직접(지지체가 없는 경우) 균일한 압력을 생성하는 목적으로 기계적 자극 연구로서, 2축 하중 기계자극 바이오리액터 시스템을 활용하여 인체 연골조직재생 물성향상 연구(2017, Scientific Report), 기계-생물자극을 변형 가능한 막 마이크로 기기 어레이를 이용하여 역학적(dynamic) 기계자극의 응력(strain)을 통한 중간엽줄기세포(기질세포)의 중간엽줄기세포 기질 생성 촉진이 보고되었다(Sci Adv, 2021). 어깨, 발목, 혈관, 심장 등과 같은 조직에서 근-골, 골-골을 연결하는 고밀도의 조직인 건(ligament), 인대(tendon), 근육 등과 같은 조직재생에 대해서는 신체의 자극(박동압력, 전단력, 비틀림력 등)을 모사할 수 있는 물리자극을 조직재생 과정에서 제공하는 것에 대한 연구(Birth Defects Res C Embryo Today, 2013, 99(3): 203-222), 혈관 성장인자, 연골성장인자, 신경성장인자와 단백질 혹은 약물 등과 같은 생체활성인자들을 (중간엽/배아) 줄기세포 혹은 분화세포와 함께 포함시켜 구성된 시스템에 전기자극, 기계자극, 확장자극을 적용하여 신경세포, 연골세포, 골세포 등과 같은 분화된 세포를 획득하는 방법 등과 같은 물리자극을 이용한 세포분화기술 적용에 대한 연구 및 직류, 사각 파형자극 등과 같은 다양한 모드의 전기자극을 가해서 세포벽의 칼슘이온 채널을 통한 칼슘이온 수준을 조절하여 신경세포활성, 피부세포 단백질효소(Akt)의 극성화, 내피세포 확장(elongation) 등의 조절에 대한 연구(J Biological Eng, 2015)가 보고된 바 있다.
한국 등록특허 제10-2040690호는 가스와 배지 교체 즉, 압력을 이용한 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터를 개시한다.
한국 등록특허 제10-1814440호는 원심력을 이용한 조직재생에 관한 발명으로 늑연골세포를 응집시켜 96웰에 세포 배양하여 웰 형태에 따라 구슬형태의 연골조직 제조 방법을 개시한다.
이처럼 종래의 기술은 조직공학 구조물(지지체)에 직접적인 압력, 비틀림, 확장 등의 기계적 자극 및 전기적 자극 등의 물리 자극 중 하나만을 바이오리액터에서 사용하였을 뿐, 상기 물리 자극의 조합을 동시에 이용한 조직재생, 세포조절 등은 개시하지 않고 있다.
이에, 본 발명자는 종래기술에서 시도하지 않았던 조직공학 지지체의 미세한 특정 구조에 적용 압력 차이(차압), 골-연골 복합조직과 같은 복잡한 형상의 결손부위에 적용되는 압축, 비틀림을 모사하는 물리자극, 전기자극, 물리자극-전기자극의 동시 적용이 가능한 자극, 다축 확장, 비틀림 등에 의한 물리자극을 동일한 장치에 적용하는 즉, in vitro 세포 배양 플레이트를 직접적으로 수정, 개질 및 활용하여 상기의 물리자극을 전달하는 바이오리액터의 개발에 이른 것이다. 본 발명의 바이오리액터를 이용하면 세포에 다양한 물리자극을 동시에 적용할 수 있고, 위치에 따라 서로 다른 물리자극을 적용할 수 있어 생체 내 시스템에 보다 가깝게 세포를 훈련과 분화시킬 수 있고, 생체모사 환경에서 조직을 재생할 수 있을 것이다.
정수압 하중은 주로 세포 로딩된 스캐폴드 또는 스캐폴드가 없는 경우 젤 재료 또는 세포에 직접 균일한 압력을 생성하는데 사용된다. 일부 바이오리액터에서 조직공학 스캐폴드에 대한 직접적인 압착 압력이 사용된 바 있지만, 특정 구조체에 대한 차압(differential pressure)을 예컨대, 세포 배양 플레이트와 같은 동일한 장치를 사용하여 시도한 적은 없다.
한편, 기존의 세포배양 웰 플레이트(cell culture well plate) 및 패트리디시(patridish)는 그 자체에서 전기자극이나 기계자극을 제공하지 않고 정적인 상태에서 세포를 배양하거나 셰이커(shaker) 또는 폴리우레탄과 같은 탄성을 가진 소재를 사용하여 외부에서 강제적으로 자극을 받게 된다. 또한, 복잡한 형상과 높이에 따라 다르게 구성된 다양한 형상의 결손부위로의 압축하중, 전기자극과 동적 하중을 동시에 적용한 경우가 없으며, 세포배양 배지의 순환과 사용배지의 제거에 대한 관류(perfusion) 시스템이 없다. 이에 따라, 종래의 세포배양 웰 플레이트는 사용된 배지를 신선한 세포배양 배지로의 교체를 연구자가 일정한 시간 간격으로 직접 수동작업으로 조작하여 진행하고 있으며, 프로그램화 된 세포배양 시기와 신선한 배지교환의 자동화 기능이 없으며, 세포배양 전 기간 동안 일정한 신선도의 세포배양 배지를 유지하지 못하는 문제 등 있을 뿐만 아니라 사용된 배지의 교환(순환/재순환)을 할 수 없다는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명자는 이러한 기계적, 전기적 물리자극, 복잡한 형상에 적용가능한 자극, 비틀림의 사이클적 자극, 확장-수축의 사이클적인 자극, 전기자극-물리자극의 동시 제공과 in vitro 세포배양 배지 교체를 위한 배지 전달 및 재순환 문제를 해결하기 위해 특별히 설계된 세포 배양 플레이트 조립체를 개발하기에 이른 것이다.
본 발명의 목적은 하이드로젤, 바이오잉크(세포가 포함된 하이드로젤), 조직공학 지지체, 세포, 세포 덩어리, 지지체 또는 조직공학 구조물을 포함하는 세포에 기계적, 전기적 자극을 주는 in vitro 바이오리액터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포배양 플레이트의 커버에 다양한 형상과 높이를 가진 드라이브들을 연결하고, 베이스플레이트 변형시켜 물리자극과 전기자극을 제공하는 in vitro 바이오리액터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 차압(서로 다른 압력), 다양한 형상에 적용가능한 물리적 자극, 확장 및 압축, 비틀림 자극, 전기자극 및 이들이 조합된 물리자극 적용이 가능한 바이오리액터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 적용되는 물리자극에 의한 스트레인(응력 변형, 역학적 물리자극)에 대한 양의 제어, 응력 수준 및 응력 파형에 대한 정밀한 제어 기능의 바이오리액터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 압축, 확장, 비틀림과 같은 기계적 물리자극 이외에도, 전기자극을 제공할 수 있는 전기적 물리자극 적용이 가능한 바이오리액터이며, 이때 기계적 자극과 전기자극을 동시에 제공가능한 단일 설정의 바이오리액터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 압력, 확장, 비틀림, 전기와 같은 자극을 세포 배양 웰에 포함된 성장인자, 약물, 세포 등의 세포 시스템에 적용하여 세포분화, 조직재생유도 기술과 결과물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 무릎 반월상연골, 건, 식도, 연골, 근, 심근, 심장, 척추 등과 같은 특정 조직에 필요한 신체의 물리자극인 압축하중, 전기자극, 차압과 확장, 역학적 기계자극, 역학적 비틀림(torque) 등을 모방하여 생성할 수 있는 역학적 제어 시스템으로, 압축 및 확장 인가 모드 구현이 가능하며, 매우 낮은 수준에서부터 높은 수준까지의 역학적 물리자극 변형량을 제어할 수 있으며, 또한 사인파형, 정사각형, 톱니형 등과 같은 모든 유형의 압력을 설정된 프로그램에 따라 세포와 세포를 함유하는 지지체에 적용할 수 있는 바이오리액터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 페트리디시 플레이트에 확장 및 비틀림력의 물리자극을 제공하여 조직재생 지지체에 포함된 세포에 물리자극을 제공하여 in vitro 재생조직을 얻고자 하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 전기자극이 제공된 채널을 통해서 세포에 전달될 수 있으며, 모든 자극이 세포, 조직공학 지지체, 젤 등에 특정기간 동안 혹은 주기적 적용이 가능한 바이오리액터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 전기전도성 샘플에 전기자극을 전달하여 샘플 표면(1차원), 샘플 벌크의 내부(3차원), 웰 표면 또는 디시 표면에 있는 세포들에게 전기자극을 줄 수 있는 바이오리액터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 전체 구성이 하나의 본체(케이스) 내에 모두 포함되어 실행되고 소형화된 바이오리액터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 발열의 위험이 적고 교체가 용이한 전원 공급장치로 실행되는 바이오리액터를 제공하기 위한 것 이다.
본 발명의 또다른 목적은 in vitro 세포 배양에 사용되는 상업용의 모든 세포 배양 플레이트 및 3D 프린팅 등과 같은 방법으로 제조된 주문형 세포 배양 플레이트와 호환을 할 수 있는 바이오리액터 플레이트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 자유롭게 이동이 가능하고, 멸균이 가능하고, 인큐베이터 내부에 쉽게 배치할 수 있는 바이오리액터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 다양한 물리자극 및 생물자극-물리자극이 복합된 자극을 이용하여 (줄기)세포의 부착, 증식과 분화, 재분화, 역분화 및 세포 외 기질 생성 유도 기술 및 결과물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 다양한 물리자극을 이용하여 세포가 함유된 지지체를 조직재생을 유도하여 여러 조건의 물리자극이 적용된 조직재생 생성물[필름, 입자, 세포 덩어리(cell aggregate) 등]을 얻고, 이때 얻어진 각 생성물(예, 필름형태의 재생조직)을 적층 및 혼합하여 하나 이상의 조직으로 구성된 복합재생조직, 이종조직 혹은 복합체(예, 세포 덩어리 혼합물)를 얻기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 세포, 세포 덩어리, 세포, 성장인자, 엑소좀, 나노-마이크로 입자, 생체활성물질, 약물 등을 함유하는 생체재료 복합체, 하이드로젤, 바이오잉크, 조직공학 지지체 및 세포를 포함하는 세포 배양 플레이트 웰(cell culture plate well) 및 세포 배양 페트리디시를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일측면에 따른 바이오리액터는, 하나 이상의 웰을 포함하는 세포 배양 플레이트; 다른 크기의 세포 배양 플레이트를 고정하는 고정대를 구비한 베이스 프레임; 및 상기 웰 내의 바이오 물질에 물리적 자극을 전달하는 자극 전달 유닛을 포함한다.
상기 자극 전달 유닛은. 왕복운동기구에 분리할 수 있게 결합되고 하나 이상의 교체식 헤드를 구비한 커버 플레이트를 포함하며, 상기 교체식 헤드는 상기 왕복운동기구의 왕복운동에 따라 상기 웰 내의 바이오 물질을 주기적으로 압축시킨다.
복수의 교체식 헤드가 상기 커버 플레이트에 결합되며, 상기 복수의 교체식 헤드 중 적어도 하나는 상기 웰 내의 바이오 물질에 전기적 자극을 인가하기 위한 전극을 포함할 수 있다.
복수의 교체식 헤드가 상기 커버 플레이트에 결합되며, 상기 복수의 교체식 헤드는, 다양한 형상의 단면을 가지는 헤드, 단차에 의해 높이가 다른 면을 포함하는 섹션 헤드와, 압력을 가하는 면이 수평면으로 이루어진 균일 헤드와, 높이가 점차 달라지는 면을 포함하여 차등 압력을 가하는 차등 헤드와, 전극을 구비하여 압축과 전기 자극을 동시에 가하는 헤드 중 적어도 하나를 포함한다.
상기 헤드의 표면은 필요에 따라 격자, 굴곡, 높낮이 차이, 계단형, 피라미드 등 다양하게 조절할 수 있다.
상기 고정대는 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 또는 96 웰 플레이트 또는 페트리디시를 포함하는 다양한 규격의 세포 배양 플레이트를 고정시키도록 구성된다.
상기 고정대는 중앙에서 4개의 직선 바가 교차하는 십자가 형태를 포함하며, 상기 직선 바의 단부에는 나사식으로 전진 또는 후퇴하도록 고정나사가 설치되는 나사홀이 형성된 턱이 구비된다.
상기 바이오리액터는 솔레노이드 드라이브가 장착 조립되며, 상기 솔레노이드 드라이브는 바이오 물질에 임팩트 하중을 가하기 위한 디스크 타입의 마그네트를 포함한다.
상기 자극 전달 유닛은 왕복운동기구의 하단에 결합된 확장 인가 기구를 포함한다.
상기 확장 인가 기구는, 상기 웰 내 배양액에 잠겨 있는 샘플에 1축 방향으로 주기적 확장을 제공하기 위해, 샘플의 양끝을 잡는 한 쌍의 홀더와, 상기 왕복운동기구의 하단에 회동 가능하게 설치되고 하단에서 상기 한 쌍의 홀더와 연결된 한 쌍의 가이더를 포함하며, 상기 한 쌍의 가이더는 상기 왕복운동기구의 상하 왕복운동이 상기 샘플의 1축 방향 확장 및 수축 운동으로 변환되도록 한다.
상기 확장 인가 기구는, 상기 웰 내 배양액에 잠겨 있는 샘플에 2축 방향으로 주기적 확장을 제공하기 위해, 샘플의 전후좌우 네 끝을 잡는 2쌍의 홀더와, 상기 왕복운동기구의 하단에 회동 가능하게 설치되고 하단에서 상기 두 쌍의 홀더와 연결된 두 쌍의 가이더를 포함하며, 상기 두 쌍의 가이더는 상기 왕복운동기구의 상하 왕복운동이 상기 샘플의 2축 방향 확장 및 수축 운동으로 변환되도록 한다.
상기 자극 전달 유닛은 상기 왕복운동기구의 하단에 결합된 비틀림 인가 기구를 포함하며, 상기 비틀림 인가 기구는, 상기 세포 배양 플레이트에 접촉될 수 있으며, 샘플의 일측을 고정하는 고정 홀더와, 상기 왕복운동기구의 하단에 크랭크식으로 결합된 드라이버와 연결되어 상기 왕복운동기구의 왕복운동에 의해 각 회전하며, 샘플의 타측을 고정하여, 샘플에 비틀림을 인가하는 이동 홀더를 포함한다.
상기 자극전달유닛이 바이오 물질을 주기적으로 자극하는 타임과 자극적용 주기를 제어하도록 전원공급 장치와 컨트롤러와 타이머 릴레이를 더 포함한다.
상기 세포 배양 플레이트는 복수 개의 웰과, 외부에서 재순환 또는 신선한 배지를 공급하기 위한 공급부와, 각 웰의 내측 상부에 형성되어 배지가 주입되는 주입구와, 각 웰의 내측 하부에 형성된 배출구와, 재순환될 배지가 외부로 배출되는 드레인을 포함한다.
상기 공급부와 상기 드레인이 순환펌프 및 배지 저장조와 연결된 공급라인 및 배출라인에 연결되어 배지 순환 시스템이 완성된다.
상기 세포 배양 플레이트는 상기 공급부와 상기 드레인 사이에서 상기 복수 개의 웰을 차례로 연결하는 관류 경로를 포함한다.
상기 세포 배양 플레이트는 복수 개의 공급부와 복수 개의 드레인을 포함하며, 상기 세포 배양 플레이트는 이웃하는 두 웰 사이에서 이웃하는 두 웰의 주입구 사이를 연결하는 상부 유로와 이웃하는 두 웰 사이에서 이웃하는 두 웰의 배출구 사이를 연결하는 하부 유로를 포함하며, 상기 복수 개의 공급부 각각이 상기 상부 유로와 연결되고, 상기 복수 개의 드레인 각각이 상기 하부 유로에 연결된다.
상기 웰 각각에는 전기 자극 인가를 위한 전극이 위치할 수 있다.
상기 바이오리액터는 상기 전극을 상기 웰 내에 유지시키기 위한 케이지를 더 포함한다.
상기 주입구 또는 상기 배출구는 스크린, 반투과막, 직조 또는 비직조물(non-woven), 마이크로/나노 섬유시트 또는 젤 형태의 마개 구조로 덮인다.
본 발명의 다른 측면에 따라 세포 배양 플레이트 조립체가 제공되며, 상기 세포 배양 플레이트 조립체는, 1개 이상의 웰을 포함하는 세포 배양 플레이트; 및 웰 내 배지의 재순환 또는 대체를 위해 상기 세포 배양 플레이트와 연결된 하나 이상이 재순환 시스템을 포함하며, 상기 세포 배양 플레이트는. 1개 이상의 웰과, 외부에서 재순환 또는 신선한 배지를 공급하기 위한 공급부와, 각 웰의 내측 상부에 형성되어 배지가 주입되는 주입구와, 각 웰의 내측 하부에 형성된 배출구와, 재순환될 배지가 외부로 배출되는 드레인을 포함한다.
상기 배지 순환 시스템은, 배지 저장조와, 상기 공급부에 연결된 공급라인과,
상기 드레인에 연결된 배출라인과, 상기 공급 라인을 통해 배지 저장조의 배지를 상기 세포 배양 플레이트로 공급하고 상기 배출 라인을 통해 상기 세포 배양 플레이트 내의 배지를 상기 배지 저장조로 회수하도록 배지를 순환시키는 순환 펌프를 포함한다.
상기 세포 배양 플레이트는 상기 공급부와 상기 드레인 사이에서 상기 1개 이상의 웰을 차례로 연결하는 관류 경로를 포함한다. 상기 세포 배양 플레이트는 1개 이상의 공급부와 1개 이상의 드레인을 포함하며, 상기 세포 배양 플레이트는 이웃하는 두 웰 사이에서 이웃하는 두 웰의 주입구 사이를 연결하는 상부 유로와 이웃하는 두 웰 사이에서 이웃하는 두 웰의 배출구 사이를 연결하는 하부 유로를 포함하며, 상기 1개 이상의 공급부 각각이 상기 상부 유로와 연결되고, 상기 1개 이상의 드레인 각각이 상기 하부 유로에 연결된다.
본 발명은 사용할 때 자유롭게 이동이 가능하고, 살균 가능하고, 다목적이며, 조립과 작동이 용이하고, 세척이 용이하며, 기계적 및 전기적 자극을 개별적으로 그리고 동시에 쉽게 적용하고, 제어할 수 있기 때문에, 사용자가 물리자극 적용을 통한 조직재생 연구에 있어서 여러 물리적 자극효과를 한 번에 적용하여 물리자극이 요구되는 조직재생과 줄기세포 분화를 효과적으로 촉진할 수 있다. 보다 구체적으로, 성장인자, 약물, 엑소좀, 세포를 제공하던 기존의 조직공학 지지체(세포-생체활성물질-조직공학 지지체)와 줄기세포에 다양한 물리자극을 추가적으로 동시에/종합적으로 제공하여 in vitro 조직재생 및 줄기세포 증식과 분화를 촉진할 수 있다. 연골, 반월상연골, 척추, 건, 인대, 근육 등과 같은 신체하중 부하, 운동에 의한 신체근육운동, 혈액순환에 의한 심장/혈관 등의 근 운동 혹은 음식물의 연동운동이 적용되는 식도와 같은 물리자극을 모방하는 in vitro 조직재생 시스템과 기술 제공할 수 있고, 다양한 물리자극을 이용하여 세포, 줄기세포 등에게 물리자극을 제공하여 세포의 부착, 증식, 분화 및 조직재생 등을 유도하는 기대효과를 갖는다. 예를 들면, 1) 전기자극 혹은 전기자극과 차압을 동시에 가하여 신경조직, 악안면조직의 신경세포의 거동을 변화시킬 수 있는 기대효과, 또한 2) 신경세포로의 분화와 신경조직재생 기대효과. 3) 건, 인대의 경우에는 혈관이 없기 때문에 한번 끊어지면 복원이 어렵기 때문에 비틀림/확장 자극을 이용하여 건과 인대의 조직재생 기대효과, 4) 연골의 경우에는 신체하중을 이용한 연골재생을 촉진하고 생체거동 모사 자극에 의한 조직재생 기대효과, 5) 혈관, 심장, 식도나 기도의 경우에는 박동운동, 연동운동에서 발생하는 자극을 제공에 의한 근 조직재생을 유도하는 기대효과, 6) 웰 플레이트를 구성하는 각각의 웰 혹은 하나의 웰에 서로 다른 물리자극을 동시에 적용할 수 있는 기대효과를 갖는다.
현재까지 사용 가능했던 기술은 기계적 또는 전기적 방식이 있고, 기계적 방식은 직접 압착 방식과 정수압 방식이 존재하고, 직접 압력 방식에는 압축 또는 확장 인가 모드가 있다. 반면, 본 발명은 1축 또는 2축 방향으로 압축 및 비틀림을 제공하는 것이 가능하다. 현재까지 사용 가능했던 기술은 변형 범위에 대한 조절 가능한 정밀한 제어 및 동일한 샘플에 대한 차압 생성 제공이 불가능하였지만 본 발명은 변형 범위에 대한 조절 가능한 정밀한 제어 및 동일한 샘플에 대한 차압 생성 제공이 가능하다.
본 발명은 다용도(샘플의 압축 또는 확장에 대한 정확하고 조정 가능하며 긍정적인 제어), 휴대 가능, 살균 가능하며, 모든 세포 배양 인큐베이터의 내부에 쉽게 맞출 수 있다는 장점이 있다. 그리고 본 발명은 단일 설정을 사용하여 프로그래밍된 기계적 및 전기적 자극을 샘플에 전달할 수 있다. 자극의 샘플 수, 유형 및 강도도 원하는 대로 변경할 수 있다.
또한, 본 발명은 일련의 샘플에서 기계적 및 전기적 자극을 개별적으로 그리고 동시에 제어하는 것이 용이하며, 연구원이 조직공학 지지체에 다양한 물리적 자극을 하나의 플레이트의 여러 개의 웰에서 한 번에 적용하는 연구를 하는데 도움을 준다.
본 발명은 바이오프린팅 혹은 세포가 포함된 스캐폴드에 다양한 조건의 물리적 자극을 제공하여 조직재생을 촉진할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 압축하중을 조직공학 스캐폴드에 적용함으로써, 연골, 치과 등의 in vitro 조직재생을 촉진할 수 있다.
본 발명은 세포가 포함된 여러 층의 생분해성 스캐폴드에 압축하중을 제공하여 층별로 서로 다른 물리자극으로 제공함으로써 여러 층으로 된 조직(예, 연골)을 재생할 수 있다.
본 발명은 비틀림 물리 자극을 주기적으로 제공하여 건, 인대 등의 in vitro 조직재생을 촉진할 수 있다.
본 발명은 다양한 형상의 커버 헤드를 자유로이 교체 및 제공하여 다양하고, 복잡한 물리자극을 제공하여 in vitro 조직재생을 촉진할 수 있다.
본 발명은 확장 자극을 조직공학 스캐폴드에 주기적으로 제공하여 식도, 혈관 기도 등의 조직재생을 촉진할 수 있다.
본 발명은 물리-전기 자극을 조직공학 스캐폴드에 주기적으로 제공하여 조직재생을 촉진함으로써 in vitro 조직재생 시간을 단축하고, 조직재생 동안에 발생할 수 있는 오염가능성 위험을 줄일 수 있다.
본 발명은 압축, 확장, 비틀림 및 전기자극의 제공이 가능하여 줄기세포의 in vitro 분화유도에 적용할 수 있다.
미래 관점에서, 본 발명의 바이오리액터 구성을 사용하여, 기능적으로 활성인 다층 조직 또는 기관을 생산하기 위해서, 강력한 세포(또는, 줄기세포)에서 분화된 다양한 세포 계통을 가진 단일 혹은 여러 단계로 재생된 in vitro 조직을 조직공학 스캐폴드를 조직공학 및 재생의학(예, in vivo)에 적용할 수 있다.
본 발명에서 제시하는 세포 배양 플레이트 조립체는 정확한 위치에 고정된 상대 전극을 통해 프로그래밍된 관류와 함께 기계적, 전기적 자극을 동시에 적용할 수 있다. 나아가, 본 발명은 유체 또는 세포 배양 배지의 지속적인 공급 및 재순환을 전달하는 데 있어 이동가능하고, 멸균 가능하며, 모든 인큐베이터 내부에 쉽게 들어갈 수 있고, 내부온도 상승을 유발하지 않고 사용될 수 있다. 또한, 단일 설정을 사용하여 샘플에 프로그래밍된 관류를 전달하고 조직공학 구성에 대해 적절하게 배치된 상대 전극 역할을 할 수 있고, 유량, 기간 및 순환 유형도 원하는 대로 변경할 수 있다. 본 발명의 세포 배양 플레이트 조립체는 그 자체 또는 일반적으로 사용되는 세포 배양 웰 플레이트 덮개와 결합하여 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 한국 특허출원 10-2021-0192557에서 개시 요소들과 결합하여 전기자극과 물리자극을 줌과 동시에 세포배양과정에서 배지를 자동으로 교체/재순환 시킬 수 있다.
본 발명의 세포 배양 플레이트 조립체 및 이를 포함하는 바이오리액터는 정확한 위치에 고정된 상대 전극을 프로그래밍된 관류와 함께 기계적, 전기적 자극을 동시에 적용할 수 있고, 유체 또는 세포배양 배지의 지속적인 공급 및 재순환을 전달하는 데 있어 이동가능하고, 멸균 가능하며, 모든 인큐베이터 내부에 쉽게 들어갈 수 있으며, 단일 설정을 사용하여 샘플에 프로그래밍된 관류를 전달하고 조직공학 구성에 대해 적절하게 배치할 수 있는 효과를 갖는다. 본 발명의 효과는 이상에서 언급하나 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급하나 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 조직재생 스캐폴드에 기계적 자극으로서의 압력과 전기적 자극을 적용하기 위해 특수 설계된 커버 플레이트가 조립된 바이오리액터를 나타낸다.
도 2는 확장 모드를 위해 특수 설계된 확장 인가 기구가 조립된 바이오리액터를 나타낸다.
도 3은 도 1에 도시된 바이오리액터의 일부인 유니버설 베이스 프레임 및 이에 결합된 왕복운동 피스톤 및 특수 설계된 커버 플레이트를 위에서 본 사시도이다.
도 4는 도 3에 도시된 구조를 아래에서 본 사시도이다.
도 5는 도 3 및 도 4에 도시된 특수 설계된 커버 플레이트의 홀들에 다양한 헤드가 결합된 상태를 나타낸다.
도 6은 특수 설계된 커버 플레이트에 결합되는 헤드의 다양한 예를 나타낸 도면이다.
도 7은 특별히 설계된 커버 플레이트가 결합된 세포 배양 플레이트 상에 솔레노이드 드라이브가 장착, 조립된 바이오리액터와 부속품을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실험예를 설명하기 위한 것이다.
도 9 내지 도 14는 샘플에 대한 전기적 자극 또는 기계적 자극을 가한 후 시간 경과에 따른 결과를 보여주는 사진들이다.
도 15 및 도 16은 1축 확장 인가 기구를 포함하는 바이오리액터를 설명하기 위한 도면들이다.
도 17은 2축 확장 인가 기구를 포함하는 바이오리액터를 설명하기 위한 도면이다.
도 18 및 도 19는 비틀림 인가 기구를 포함하는 바이오리액터를 설명하기 위한 도면들이다.
도 20은 본 발명에 따른 바이오리액터의 여러 다양한 형태들을 예시적으로 나타낸다.
도 21 및 도 25는 프로그래밍된 멀티 웰에서 세포 배양액의 재순환 및 대체를 위한 관류 메커니즘이 통합된 바이오리액터용 세포 배양 플레이트의 일 실시예를 설명하기 위한 도면들이다.
도 26 내지 도 28은 프로그래밍된 멀티 웰에서 세포 배양액의 재순환 및 대체를 위한 관류 메커니즘이 통합된 바이오리액터용 세포 배양 플레이트의 다른 실시예를 설명하기 위한 도면들이다.
도 29 내지 도 32는 위에서 설명한 세포 배양 플레이트(1000)를 이용하여 위에서 설명한 바이오리액터에 적용된 예를 보여주며, 알긴산 젤에 세포를 로딩한 다음에 일정 두께의 압축하중을 적용하여 알긴산 젤 내부의 세포들의 거동변화에 따른 세포생존성, 세포증식, 콜라겐 및 GAG 와 같은 세포외기질생성량 변화를 관찰한 결과를 보여주는 사진들이다.
이하에서, 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들에 대하여 상세히 살펴본다.
도 1은 조직재생 스캐폴드에 기계적 자극으로서의 압력과 전기적 자극을 적용하기 위해 특수 설계된 커버 플레이트(200)가 조립된 바이오리액터를 나타내고, 도 2는 확장 모드를 위해 특수 설계된 확장 인가 기구(300)가 조립된 바이오리액터를 나타낸다.
바이오리액터는, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이 유니버설 베이스 프레임(100)을 포함한다.
또한 바이오리액터는, 세포 배양 플레이트 내에 있는 세포 또는 임의의 샘플에 기계적 자극, 전기적 자극 또는 기계적 자극 및/또는 전기적 자극을 전달하기 위해 자극 전달 유닛을 포함한다.
다양한 헤드(들)를 샘플에 압력 또는 전기적 자극을 가하는 모드에서, 자극 전달 유닛은, 도 1에 도시된 바와 같이, 모터(10), 어드저스터블 캠(20), 왕복운동 피스톤(30), 전원 공급 장치(40)와, 컨트롤러(50), 타이머 릴레이(60), 타이머 릴레이용 전원(70)과 더불어, 이들의 도움을 받아, 주기적으로 상하 왕복 운동하도록 작동하고, 샘플에 압력 자극 및/또는 전기적 자극을 가하는 커버 플레이트(200)를 포함할 수 있다.
샘플에 확장 자극을 인가하는 확장 인가 모드에서, 자극 전달유닛은, 도 2에 도시된 바와 같이, 모터(10), 어드저스터블 캠(20), 왕복운동 피스톤(30), 전원 공급 장치(40)와, 컨트롤러(50), 타이머 릴레이(60), 타이머 릴레이용 전원(70)과 더불어, 이들의 도움을 받아, 샘플에 확장력을 인가하는 확장 인가 기구(300)를 포함할 수 있다. 확장 인가 기구(300)는 1축 방향 확장 인가 기구일 수 있으며, 대안적으로, 2축 방향 확장 인가 기구일 수 있다.
샘플에 비틀림 자극을 인가하는 비틀림 인가 모드에서, 자극 전달유닛은, 모터(10), 어드저스터블 캠(20), 왕복운동 피스톤(30), 전원 공급 장치(40)와, 컨트롤러(50), 타이머 릴레이(60), 타이머 릴레이용 전원(70)과 더불어, 이들의 도움을 받아 샘플에 비틀림을 인가하는 비틀림 인가 기구를 포함할 수 있다.
전술한 모드들 사이의 전환은 동일 왕복운동 피스톤(30)에 조립되는 기구를 교체하고 유니버설 베이스 프레임(100)에 의해 분리 가능하게 고정되는 세포 배양 플레이트(2000, 3000)를 바꿔주는 것에 의해 달성될 수 있다. 도 1에 도시된 세포 배양 플레이트(2000)는 대략 직사각형 또는 정사각형으로 형성되고 다수의 웰을 포함하는 6, 12, 24, 48 또는 96 웰 플레이트인 것이 선호되고, 도 2에 도시된 세포 배양 플레이트(3000)는 하나의 웰을 포함하는 대략 원형인 페트리디시인 것이 선호된다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 자극 전달 유닛은 왕복운동 피스톤(30)과 연결된 특수 설계된 커버 플레이트(200), 또는 왕복운동 피스톤(30)과 연결된 확장 인가 기구(300)를 통해, 기계적 자극 및/또는 전기적 자극을 프로그램에 따라 샘플에 전달할 수 있다.
컨트롤러(50), 더 구체적으로는, 마이크로 컨트롤러(50)는 모터(10)의 RPM을 제어할 수 있다. 타이머 릴레이(60) 작동을 위한 전원(70)이 추가로 구비된다.
도 3은 도 1에 도시된 바이오리액터의 일부인 유니버설 베이스 프레임 및 이에 결합된 왕복운동 피스톤 및 특수 설계된 커버 플레이트를 위에서 본 사시도이고, 도 4는 도 3에 도시된 구조를 아래에서 본 사시도이며, 도 5는 도 3 및 도 4에 도시된 특수 설계된 커버 플레이트의 홀들에 다양한 헤드가 결합된 상태를 나타내며, 도 6은 특수 설계된 커버 플레이트에 결합되는 헤드의 다양한 예를 나타낸 도면이다.
도 3 내지 도 6을 참조하면, 유니버설 베이스 프레임(100)은 1, 6, 12, 24, 48 또는 96 웰 플레이트 또는 페트리디시를 포함하는 다양한 세포 배양 플레이트(2000 또는 3000; 도 1, 도 2 참조)를 고정할 수 있는 고정대(120)를 포함한다. 고정대(120)는 중앙에서 4개의 직선 바가 교차하는 십자가 형태를 가질 수 있으며, 직선 바의 단부에는 나사식으로 전진 또는 후퇴하도록 고정나사가 설치되는 나사홀(123)이 형성된 턱(122)이 구비된다. 고정대(120)의 중앙에는 세포 배양 플레이트(2000 또는 3000; 도 1 및 도 2 참조)의 높이를 조절할 수 있도록 조절나사가 설치되는 나사홀(124)이 형성될 수 있다.
유니버설 베이스 프레임(100) 또는 세포 배양 플레이트는 전기 신호의 접지로 제공될 수 있다. 유니버설 베이스 프레임(100)은 5mm 내지 300mm인 세포 배양 플레이트 또는 모든 세 방향에서 치수가 5mm ~ 300mm인 세포 배양/조직공학 목적을 위한 기타 용기를 수용할 수 있는 플랫폼을 포함한다. 유니버설 베이스 프레임(100)의 전체 규격이 500mm 미만이다.
또한 유니버설 베이스 프레임(100)은 고정대(120)의 상측에 일정 간격 이격되어 위치한 상부 지지대(140)를 포함하고, 상부 지지대(140)에는 중공 실린더 형태의 가이드(142)가 형성된다. 프레스 액추에이터의 일부로서, 왕복운동 피스톤(30)이 가이드(142)를 따라 상하 왕복 운동 가능하게 설치된다. 가이드(142)는 세포 배양 웰(또는, 베셀 또는 컨테이너) 내에 위치하는 의도된 샘플에 대하여 프레스 액추에이터를 가이드한다.
왕복운동 피스톤(30)의 상단에는 모터 샤프트와 연결된 어드저스터블 드라이브 캠(20; 도 1 및 도 2 참조)과 연결되는 연결부(32)가 형성된다. 유니버설 베이스 프레임(100)의 일측에는 모터(10; 도 1 및 도 2 참조)를 유지하는 모터 서포트(170)가 형성된다. 도시하지 않았지만, 유니버설 베이스 프레임(100)은 컨트롤러, 타이머, 디스플레이, 전기 신호 입력 생성기 및 전원 공급 장치를 고정하는 하나 이상의 서포트를 더 포함할 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이 바이오리액터는 세포 배양 플레이트 내에 있는 세포 또는 임의의 샘플에 기계적 자극, 전기적 자극 또는 기계적 자극 및/또는 전기적 자극을 전달하기 위해 자극 전달 유닛을 포함한다.
도 1, 도 3 내지 도 6을 참조하면, 자극 전달 유닛은, 전원 공급 장치(40), 컨트롤러(50) 및 모터(10)와, 왕복 구동수단으로서의 어드저스터블 드라이브 캠(20)와 협력하여, 기계적 자극과 전기적 자극 모두를 샘플에 전달하기 위한, 특수 설계된 커버 플레이트(200)를 포함할 수 있다.
특수 설계된 커버 플레이트(200)는 모터 샤프트에 설치된 어드저스터블 드라이브 캠(adjustable drive cam)(20)과 연결되어 샘플에 무게가 실리지 않도록 "+"로 제어된다. 또한 특수 설계된 커버 플레이트(200)는 전원 공급장치(40)로부터 샘플에 전기 자극을 제공할 수 있다.
특수 설계된 커버 플레이트(200)는 바닥부에 분리 가능한 압축/확장 헤드들(pressure/extension heads)(202)들을 구비하여 샘플을 압축하거나 확장할 수 있다. 헤드(210)가 전원 공급장치(40)에 연결될 수 있으며, 헤드(210)를 통해 샘플에 전기 자극이 가해질 수 있다. 교체식 헤드(210)의 수, 모양 및 위치는 연구원의 요구 사항에 따라 변경될 수 있다. 이하 설명되는 바와 같이, 교체식 헤드(210)로는 높낮이가 다른 압력을 가하기 위해 단차에 의해 높이가 다른 면을 포함하는 섹션 헤드(a)와, 중앙 부분에서 가장자리 부분까지 높이가 점차 달라지는 면을 포함하여 차압을 가할 수 있는 차등 헤드(b)와, 균일 압력을 가하도록 압력을 가하는 면이 수평면으로 이루어진 균일 헤드(c)와, 전기 자극을 가할 수 있도록 전술한 헤드의 형상을 구비하면서 전극을 구비한 헤드(d, e, f)들이 있을 수 있다.
솔레노이드 드라이브를 사용하여 구형파(square wave) 또는 충격 압력을 전달하기 위해, 마이크로 컨트롤러(50)와 전원 공급 장치(40)와 함께 동일 유니버설 베이스 프레임(100)이 이용될 수 있다. 또한 유니버설 베이스 프레임(100)이 전기 신호용 접지로 사용될 수 있다.
바이오리액터의 전체 구성은 휴대가 가능하고, 멸균이 가능하며, 클립, 클램프 또는 진동 없이 작동하는 기타 적절한 고정 수단에 의해 인큐베이터 내부에 쉽게 고정할 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이 유니버설 베이스 프레임(100)은 압축 액추에이터를 세포 배양 플레이트의 웰 또는 용기에 위치한 의도한 샘플로 안내하는 하나 이상의 가이드(142) 및 입력 전기신호 접지를 포함하고, 전체 규격이 500mm 미만인 것을 특징으로 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 어드저스터블 드라이브 캠(20)은 나사 조절이 가능하게 모터(10)의 샤프트에 설치되며, 위치 조정을 위해 가이드 나사를 사용하여 0 내지 20mm의 변위 제어가 가능하다. 더 미세 또는 정밀한 나사산을 포함하는 드라이브 나사를 사용하면 위치 정확도가 0.01mm 이하가 될 수 있다. 대안적으로, 위치 제어는 슬롯(slot), 웜(worm), 웜-웜 휠, 핀 및 랙(rack) 등과 같은 다른 메커니즘을 사용하여 구현될 수 있다. 어드저스터블 드라이브 캠(20)은 나사 또는 기타 유형의 조정을 사용하여 드라이브 헤드를 구동하기 위해 캠 위치 사이의 거리를 조정할 수 있는 조정 가능한 연결부를 더 포함할 수 있다.
전술한 나사 조절식 어드저스터블 캠(20) 외에 솔레노이드, 압전 액추에이터와 같은 임의의 왕복 구동기구를 이용하여, 세포 배양 플레이트 내부에 위치한 샘플과 세포에 제어된 기계적 자극을 가할 수 있다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 적어도 하나의 왕복운동 피스톤(30)은 왕복구동을 얻기 위하여 캠 또는 기타 구동 메커니즘과 연결될 수 있다. 또한 왕복운동 피스톤(30)의 하단은 세포 배양 플레이트용으로 특별히 설계된 커버 플레이트(200), 확장 인가 기구(300) 또는 그 외 많은 특수 설계된 압축 또는 확장 헤드 또는 전극 또는 이들 모두에 연결하기 위해 하단 나사부를 포함한다. 특별 설계된 커버 플레이트(200), 확장 인가 기구(300), 또는, 전극을 구비하거나 전극이 없을 수 있는 기타 압축 헤드는 왕복운동 피스톤(30)의 하단에 부착되어, 살아있는 세포, 하이드로젤, 생체분자, 시험관 내에서 기능적으로 활성인 조직재생을 성장시키기 위한 목적인 금속, 비금속, 합금, 고분자 또는 이들의 조합을 갖는 대상에 기계적 자극, 전기적 자극 또는 기계적 자극과 전기적 자극을 모두 가할 수 있다. 슬롯(slot), 클립 등과 같은 임의의 기구를 사용하여, 왕복운동 피스톤을 압력/확장 헤드, 전극 또는 이들 모두에 부착할 수 있다.
도 1, 도 3 내지 도 6에 도시된 바와 같이, 세포 배양 플레이트(구체적으로는, 6, 12. 24, 48 또는 96 웰 플레이트)용 커버 플레이트(200)는 왕복 운동하는 왕복운동 피스톤(30)의 하단에 부착된다. 커버 플레이트(200)는 압착 압력 전극 또는 전기적 자극 또는 이들 모두를 세포 배양 플레이트 내 대상물, 즉, 살아있는 세포, 하이드로젤, 생체분자, 시험관 내에서 기능적으로 활성인 조직재생을 성장시키기 위한 목적인 금속, 비금속, 합금, 고분자 또는 이들의 조합을 갖는 대상물에 가하기 위한 교체식 헤드(210)들을 부착하기 위한 하나 이상의 홀(202)들을 구비한다. 이 홀(202)들은 세포 배양 플레이트(2000)들의 표준 세포 배양 웰의 중심에 위치한다. 홀(202)에 교체식 헤드(210)를 유지하고 전기 펄스를 제공하기 위한 스크루가 제공될 수 있다.
도 5 및 도 6은 조직재생 스캐폴드 위에 다양한 압력을 적용하기 위한 여러 압축 헤드, 즉, 교체식 압축 헤드(210)를 나타낸다. 교체식 압축 헤드(210)는 커버 플레이트(200)의 홀(202)에 끼워져 조립될 수 있다. 교체식 압축 헤드(210)들은 한 방향, 두 방향 또는 세 방향에서 1 mm 내지 300 mm 치수를 갖는다. 교체식 압축 헤드(210)들은 원통형, 직육면체형, 정육면체형, 피라미드형, 원추형 또는 의도한 자극을 살아있는 세포, 하이드로젤, 생체분자, 시험관 내에서 기능적으로 활성인 조직재생을 성장시키기 위한 목적인 금속, 비금속, 합금, 고분자 또는 이들의 조합을 갖는 대상물에 가할 수 있도록 특수 설계된 임의의 3차원 형상을 갖는다. 교체식 헤드(210)들은 대상물에 차등 압착 압력을 가하도록 특수 설계된 임의의 형상을 갖는다. 교체식 헤드(210)들은, 대상물에 의도한 자극을 주기 위해, 부분적으로 채워진 형상, 중실형 또는 중공형 형상을 갖는다. 교체식 헤드(210)들은 대상물에 전기적 신호를 전달하기 위한 하나 이상의 전극을 갖는다.
도 6에 잘 나타낸 바와 같이, 교체식 헤드(210)는 높낮이가 다른 압력을 가하기 위해 단차에 의해 높이가 다른 면을 포함하는 섹션 헤드(a)와, 균일 압력을 가하도록 압력을 가하는 면이 수평면으로 이루어진 균일 헤드(b)와, 중앙 부분에서 가장자리 부분까지 높이가 점차 달라지는 면을 포함하여 차압을 가할 수 있는 차등 헤드(c)와, 전극(211)을 구비하여 압축과 전기자극을 가하는 헤드(d, e, f), 전기자극을 가하는 헤드를 포함할 수 있다. 상기 헤드 표면은 헤드 제조할 때에 격자, 굴곡, 높낮이 차이, 계단형, 별 등 다양한 형상으로 조절하여 제조할 수 있다.
전극(211)은, 다양한 전기 신호를 전달하기 위한 것이며, 예컨대, 헤드(210)에 하나 이상의 구멍을 뚫어 전극(211) 또는 그와 연결되는 배선을 제공할 수 있다. 헤드(210)의 하부 표면을 다양하게 디자인하고, 높낮이를 조절하여 대상물에 차등 압력 또는 차등 하중을 제공할 수 있다.
바이오리액터는 다양한 세포 배양 플레이트를 고정할 수 있고 다양한 자극 전달 유닛과 결합되는 유니버설 베이스 프레임을 포함한다.
위에서 간략히 언급한 바와 같이, 도 3 및 도 4는 24웰 자극 전달 유닛의 일부로서 24웰 세포 배양 플레이트에 대응하는 특수 설계된 커버 플레이트(200) 및 커버 플레이트(200)를 왕복 운동시키는 기구가 설치된 유니버설 베이스 프레임(100)을 예시적으로 나타낸다.
위에서 간략히 언급한 바와 같이, 유니버설 베이스 프레임(100)은 고정대(120) 및 고정대(120)의 상측에 일정 간격 이격되어 위치한 상부 지지대(140)를 포함한다. 상부 지지대(140)에는 중공 실린더 형태의 가이드(142)가 형성된다. 왕복 구동기구인 어드저스터블 드라이버 캠과 연결된 왕복운동 피스톤(30)이 가이드(142)를 따라 상하 왕복 운동 가능하게 설치된다. 가이드(142)는 세포 배양 웰(또는, 베셀 또는 컨테이너) 내에 위치하는 의도된 샘플에 대하여 프레스 액추에이터를 가이드 한다. 모터의 회전에 따라 모터 샤프트에 연결된 어드저스터블 드라이브 캠이 왕복운동 피스톤(30)을 왕복운동 시킨다.
고정대(140)는 중앙에서 4개의 직선 바가 교차하는 십자가 형태를 가질 수 있으며, 직선 바의 단부에는 나사식으로 전진 또는 후퇴하도록 고정나사가 설치되는 나사홀(123)이 형성된 턱(122)이 구비된다. 고정대(120)의 중앙에는 세포 배양 플레이트의 높이를 조절할 수 있도록 조절나사가 설치되는 나사홀(124)이 형성될 수 있다.
도 7은 특별히 설계된 커버 플레이트(200)가 결합된 세포 배양 플레이트(2000) 상에 솔레노이드 드라이브(10')가 장착, 조립된 바이오리액터와 부속품을 나타낸다. 솔레노이드 드라이버(10')에 있어서, 3그램 (중량/마그네트)을 가진 디스크 타입의 마그네트들은 샘플에 임팩트 하중을 적용하는데 사용된다. 마그네트 숫자는 샘플에 적절한 하중을 전달하기 위해 사용된다. 또한, 바이오리액터는 솔레노이드 드라이버(10')와 연결되는 바이오리액터 전원, 즉, 전원 공급장치(40')와, 전원 공급장치(40')과 연결되어 전원 공급장치(40') 및 솔레노이드 드라이버(10')를 제어하는 컨트롤러(50)와, 타이머 릴레이(60')와 타이머 릴레이용 전원(70')을 포함한다.
[실험예]
세포배양을 위해, 알긴산의 Na 염 4g을 마그네틱 교반기에서 밤새 400 rpm으로 계속 교반하여 탈이온수 100mL에 용해하였다. 인산염 완충 식염수(PBS)(PBS 100ml 중 1.1g)에 100mM CaCl2 을 첨가하여 용액을 제조한 다음에, 1시간 동안 일정하게 교반하면서 준비한다. 알지네이트 젤 준비를 위해서, 알지네이트 용액 1ml 당 CaCl2 용액 100 μl를 사용하였다.
도 8은 CO2 인큐베이터 내에서 작동하는 바이오리액터 셋업을 나타낸다. 도 8의 (a)는 전기적 자극, (b)는 기계적 자극, (c)는 주기적 부하 테스트에 따른 젤 압축, (d)는 연구 중에 사용된 압축 헤드의 다양한 예(좌측에서 3번째까지는 기계적 자극을 주는 헤드, 우측에서 세 번째 까지는 전기적 자극도 주는 헤드), 도 8의 (e)는 1일 주기적인 기계적 압축 후 24 웰 플레이트 내 젤(압축 헤드의 인상이 보임)을 나타낸다.
기계자극 및 전기자극 연구를 위해 두 개의 바이오리액터를 인큐베이터 안에 설정하여 사용하였다(도 8의 (a) 및 (b)). 텍스처 분석기 분석 장비(Stable Micro Systems 모델, TA.XT plus, Surrey, UK)를 사용하여 원통형 젤 샘플(높이 18.5mm 및 직경 10mm, 24웰 세포 배양 플레이트 부피와 유사함)에 대하여 25 ºC에서 2 mm/min의 속도로 주기적인 압축을 적용하여 샘플의 기계적 특성을 평가했다. 도 4 (d)는 압축 연구를 위해 샘플에 1N 하중을 제공하는 2.3mm 압축하중을 적용하는 다양한 헤드와 말단의 형상을 보여주고 있으며, 12.7kPa 압력하중에 해당하는 조건에서 세포가 포함된 바이오잉크(세포가 포함된 하이드로젤)의 거동과 세포반응을 평가하였다(사용 가능한 문헌과 일치). 처음 세 개의 압축 헤드가 적용되었을 때 바이오잉크가 주기적인 압축하중 적용에도 주기적 회복 이력을 보여주고 있다. 한 세트의 샘플에서 샘플 높이를 조정하여 1mm 압축 하중(저압 샘플)을 제공했다. 기계식 압축하중이 적용된 바이오리액터의 구동 캠 주파수는 2.3mm를 사용하여 1Hz로 조정되었다. 그림 1e는 하이드로젤에 압축에 따른 형상이 보이고 있음을 관찰함으로써, 바이오리액터를 샘플에 적용되었음을 보이는 압축 헤드 모양이 젤에 존재하고 있음이 관찰되었다.
필요한 전압의 양을 이해하기 위해 문헌 참조를 기반으로 실험조건을 선정하였으며, in vitro 세포 배양 1일까지, 5V (d. c)를 적용하였을 때 7일까지 2V로 감소되는 것이 관찰되었다. 프로그래밍 가능한 타이머 릴레이는 5초 정지와 함께 5초 펄스를 전달하도록 조정되었다. 세포배양 연구는 조합 세포배양 배지(MEM 알파 용액 + FBS(10%) + ABAM(1%)(sigma Aldrich))를 사용하였다. 이 실험에서 이온 전도도가 전기 전도도의 주요 원인이므로 젤 샘플을 통과하는 전류의 양을 배지 매체를 사용하여 측정했다. 짧은 전기자극 헤드의 경우 2ml 용액(높이 13.4mm, 직경 10mm 원통형 샘플)을 사용했고, 긴 전기자극 헤드의 경우 1ml 용액(높이 6.7mm, 직경 10mm 원통형 샘플)을 사용했다. 배지에 1시간 담근 후 젤의 저항은 각각 105±5 kΩ 및 85±5 kΩ인 것으로 관찰되었다. 따라서 전류량은 5V의 경우 약 50μA(두꺼운 샘플) 및 60μA(얇은 샘플), 2V 전원 공급장치의 경우 20μA(두꺼운 샘플) 및 25μA(얇은 샘플)로 관찰되었다.
세포배양 연구를 위해 쥐의 두개골에서 유래한 조골세포주(Passage 13, MC3T3-E1 cell line, Young Science Inc., Korea)를 24웰 플레이트에 계대배양하였다. 10% fetal bovine serum(Gibco Korea, Korea)과 penicillin-streptomycin(100 unit/mL)을 포함하는 α-MEM(Minimum essential media)(Sigma Aldrich, USA)을 각 웰에 첨가하고 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 37 °C에서, 24개의 웰 플레이트는 그림 1과 같이 기계식 및 전기식 바이오리액터에 설정에 연결하였다. 모든 알지네이트 용액은 100만/ml 세포와 혼합되었고 CaCl2 용액(100 μl/ml)과 가교시켰다. 대조군 샘플은 전기적 또는 기계적 자극을 적용하지 않았다.
In vitro 세포 배양 연구는 최대 7일 동안 수행되었으며, 샘플은 1일, 3일 및 7일에 관찰되었다. Live/dead 염색은 LIVE/DEAD　 Viability/Cytotoxicity Kit(Invitrogen, USA)를 사용하였고, 녹색 형광 calcein-AM 염색을 결합하여 세포내 에스테라제 활성을 적색 형광 ethidium homodimer-1 염색과 결합하여 원형질막 무결성의 손실을 확인하였다. 살아있는 세포와 죽은 세포의 이미지는 1.2μL의 2mM ethidium homodimer-1(EthD-1)과 0.3μL의 4mM calcein AM을 600μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 첨가한 후 촬영되었다. 상기 2가지 제제를 첨가한 후, 플레이트를 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 살아있는 세포와 죽은 세포는 형광 현미경(Leica DMLB, 독일)에 있는 다른 필터를 사용하여 이미지를 캡처하고 LAS-X Leica 마이크로시스템 소프트웨어를 사용하여 병합했다 (도9-A1, A2).
[전기적 펄스 인가 실험]
도 9는, 전기 자극 적용하고 1일 후 바이오잉크 내부 세포 거동을 나타내는 것으로, (a) 대조군, (b) 얇은 샘플, (c) 두꺼운 샘플, (d) 프로브가 단면 7mm 거리 삽입된 두꺼운 샘플을 나타낸다. 스케일 바(scale bar)는 1mm 이다.
도 9를 참조하면, 5v 펄스 절단 후 1일 후, 뾰족한 프로브를 사용한 차등(differential) 헤드로 인해 샘플(이 경우 얇은 샘플이 사용됨)의 열화 및 손상이 발생하고 모든 세포가 죽는 것이 관찰되어서 해당 샘플 세트는 실험에서 제외하였다. 샘플 세트의 나머지 부분은 대조군과 비교하여 세포 증식의 영역 개선을 보여주었다. 그러나 얇은 샘플의 성장과 차등 헤드 실험의 실패를 관찰함으로써, 이후에는 실험이 끝날 때까지 전압을 2v로 줄여 실험을 진행하였다.
도 10은, 전기자극을 적용하고 3일 후 바이오잉크 내부 세포 거동을 나타내는 것으로, (a) 대조군, (b) 얇은 샘플, (c) 두꺼운 샘플, (d) 프로브가 단면 7mm 거리 삽입된 두꺼운 샘플을 나타낸다. 스케일 바(scale bar)는 1mm 이다.
도 10을 참조하면, 3일 후, 세포 성장이 충분하지 않음이 관찰되었다. 전류량이 20μA 미만인 두꺼운 샘플에서 약간의 성장이 관찰될 수 있지만 세포 수는 감소되는 것이 관찰되었다.
도 11은, 전기자극을 적용하고 7일 후 바이오잉크 내부 세포 거동을 나타내는 것으로, (a)대조군, (b)얇은 샘플, (c)두꺼운 샘플, (d) 프로브가 단면 7mm 거리 삽입된 두꺼운 샘플을 나타낸다. 스케일 바(scale bar)는 1mm 이다.
도 11을 참조하면, 7일차에서 얇은 젤 샘플 내부의 세포가 죽고 샘플도 자신의 구조를 잃는 것이 관찰되었고, 더 두꺼운 샘플만 세포의 증식이 관찰되었다.
이 실험으로부터 전기 펄스가 세포의 성장과 증식에 상당한 영향을 미친다는 결론을 내릴 수 있었다. 프로브 거리는 20μA이하의 전류를 전달하기에 적합해야 하며, 거리가 짧으면 전류가 높아져 세포와 젤이 손상될 수 있었다. 고전압 및 전류는 1일과 같은 짧은 기간 동안 유용하다는 것이 관찰되었다. 더 오랜 시간 동안 낮은 전압과 전류를 사용하는 것이 타당한 것으로 분석되었으며, 샘플의 전기적 스트레스를 줄이기 위해 펄스 주기를 조절하였다.
[기계적 압력 인가 실험]
도 12는 1일차 기계적(압축) 하중 적용에 따른 바이오잉크의 거동 변화를 나타낸 것으로, (a)는 대조군, (b)는 섹션 헤드(section head)로 하중 적용, (c)는 균일 헤드(uniform head)로 하중 적용, (d)는 차등 헤드(differential head), (e)는 덜 압축된(1mm) 샘플을 나타낸다. 스케일 바(scale bar)는 1mm 이다.
도 12는 1일 후의 세포 증식성을 보여주고 있으며, 섹션 헤드가 고압 영역과 저압 영역 사이에 뚜렷한 성장 차이가 있음이 관찰되었다(도 12의 (b)). 고압 영역의 세포는 저압 영역보다 빠르게 성장하고 증식하는 것이 관찰되었다. 그러나 고압 영역에서 더 많은 세포 사멸이 관찰되는 차등 헤드에 있어서와 같이, 더 높은 압력은 세포 사멸을 초래할 수 있다. 균일한 압력은 전체 샘플 영역에 더 균일한 세포 증식성을 유도하는 것이 관찰되었다.
도 13은 3일차 기계적(압축) 하중 적용에 따른 바이오잉크의 거동 변화를 나타낸 것으로, (a)는 대조군, (b)는 섹션 헤드(section head)로 하중 적용, (c)는 균일 헤드(uniform head)로 하중 적용, (d)는 차등 헤드(differential head), (e)는 덜 압축된(1mm) 샘플을 나타낸다. 스케일 바(scale bar)는 1mm이다.
도 13은 3일 후의 세포배양 결과를 보여준다. 섹션 헤드의 고압 영역은 저압 영역보다 훨씬 더 넓은 세포 상정을 보여준다. 1N의 주기적 압축 하중을 전달하는 균일 헤드는 매우 우수한 세포증식을 보여준다. 하지만 낮은 하중은 도 13의 (f)와 같이 그다지 효과적이지 않은 것으로 관찰되었다. 차등 압축 헤드는 더 높은 부분의 압축하중 영역에서 세포 손상 경향을 보여주었다.
도 14는 7일차 기계적(압축) 하중 적용에 따른 바이오잉크의 거동변화를 나타낸 것으로, (a)는 대조군, (b)는 섹션 헤드(section head)로 하중 적용, (c)는 균일 헤드(uniform head)로 하중 적용, (d)는 차등 헤드(differential head), (e)는 덜 압축된(1mm) 샘플을 나타낸다. 스케일 바(scale bar)는 1mm이다.
7일 이후에 발견된 결과는 압력이 젤 매트릭스에 넣은 세포의 성장 및 증식을 촉진하는데 상당한 영향을 미친다는 것을 확인시켜 주었다. 모든 헤드에서의 가압 영역은 도 14에서 관찰되는 바와 같이 훨씬 더 나은 세포 증식을 나타낸다.
이 연구로 압축하중 자극이 세포 성장을 향상시키는데 사용될 수 있다는 결론에 도달하였다. 압축 하중 부하 주기와 그 크기를 최적화하는 연구가 이후에 수행되었다.
이하에서는 1축 또는 2축 확장 인가 모드와 비틀림 인가 모드에 이용되는 바이오리액터를 설명한다. 위와 같은 여러 모드에서도, 유니버설 베이스 프레임, 모터, 어드저스터블 캠, 왕복운동 피스톤을 포함하는 왕복운동을 위한 기구는 위에서 이미 설명한 것을 그대로 또는 거의 그대로 이용할 수 있다.
도 2 및 도 15, 도16을 참조하면, 왕복운동 피스톤(30)에 대한 부착물로서의 확장 인가 기구(300)는 섬유, 시트, 직물(직포, 부직포, 편직물, 편조물 및 기타), 메쉬, 중공 튜브, 실린더 및 기타 다른 구조에 대하여, 끝을 두 지점 이상에서 잡아 확장력을 발생시키는 적어도 2개의 이상의 홀더(320, 320)를 포함할 수 있다. 상기 홀더(320)는 10mm 내지 200mm 길이, 0.001mm 내지 50mm 두께 및 0.001mm 내지 50mm 너비의 길이 방향 주기적 확장(extension)을 위한 구조를 수용할 수 있으며 세포 배양 배지와 같은 액체에 부분적으로 또는 완전히 잠길 수 있다.
도 15 및 도 16은 전술한 유니버설 프레임(100)과 페트리 플레이트(3000)와 1축 확장용 확장 인가 기구(300)를 포함하는 1축 확장용 바이오리액터를 설명하기 위한 도면이다.
도 15 및 도 16에 도시된 바와 같이, 왕복운동 피스톤(30)의 하단에는 1축 확장용 확장 인가 기구(300)가 결합된다. 1축 확장용 확장 인가 기구(300)는, 세포 배양 플레이트인 페트리 플레이트(3000) 내 배양액에 잠겨 있는 샘플에 1축 방향으로 주기적 확장을 제공하기 위해, 샘플의 양끝을 잡는 한 쌍의 홀더(340, 340)와, 왕복운동 피스톤(30)의 하단에 회동 가능하게 설치되고, 하단에서 한 쌍의 홀더(340, 340)와 연결된 한 쌍의 홀더용 가이더(또는, 슬라이더; 320, 320)를 포함한다. 한 쌍의 홀더용 가이더(또는, 슬라이더; 320, 30)는 왕복운동 피스톤(30)의 상하 왕복운동이 샘플, 즉, 구조물의 확장 및 수축 운동으로 변환되도록 할 수 있다. 그리고 샘플과 접촉하는 홀더(340)의 표면은 평면, 나노/마이크로 구조, 경사 등을 가지도록 하는 것일 수 있다. 한 쌍의 홀더(340, 340)는 세포 배양 플레이트, 더 구체적으로는, 페트리디시(3000) 내에서. 섬유, 시트, 직물(직포, 부직포, 편직물, 편조물 및 기타), 메쉬, 중공 튜브, 실린더 및 기타 다른 구조를 포함하는 샘플의 양쪽 끝을 잡아, 왕복운동 피스톤(30)의 왕복운동 및 그로 인한 한 쌍의 가이더(320, 320)의 이동에 의해, 샘플의 1축 방향으로 늘이는 것을 주기적으로 할 수 있다. 왕복운동 피스톤(30)의 상하 왕복운동에 의해 한 쌍의 가이더(320, 320)가 한 쌍의 홀더(340, 340)를 외측으로 밀거나 안으로 당기며, 따라서, 한 쌍의 홀더(340, 340)에 의해 양끝이 고정된 샘플은 주기적으로 1축 방향으로 확장력을 인가받는다.
도 17은 전술한 유니버설 프레임(100)과 페트리 플레이트(3000)와 2축 확장용 확장 인가 기구(300')를 포함하는 2축 확장용 바이오리액터를 설명하기 위한 도면이다. 도 17에 도시된 바와 같이, 왕복운동 피스톤(30)의 하단에는 2축 확장용 확장 인가 기구(300')가 결합된다. 2축 확장용 확장 인가 기구(300')는, 페트리 플레이트(3000) 내 배양액에 적어도 부분적으로 잠겨 있는 샘플에 2축 방향, 즉, X축 방향 및 그와 직교하는 Y축 방향으로 주기적 늘임을 제공하기 위해, 샘플의 좌우전후 네 끝을 잡는 두 쌍의 홀더(340')와, 왕복운동 피스톤(30)의 하단에 회동 가능하게 설치되고 하단에서 두 쌍의 홀더(340')와 연결된 두 쌍의 홀더용 가이더(또는, 슬라이더; 320')를 포함한다. 두 쌍의 홀더용 가이더( 또는, 슬라이더; 320')는 왕복운동 피스톤(30)의 상하 왕복운동이 샘플, 즉, 구조물의 2축 방향 확장 이동 및 수축 운동으로 변환되도록 할 수 있다. 그리고 샘플과 접촉하는 홀더(340')의 표면은 평면, 나노/마이크로 구조, 경사 등을 가지도록 하는 것일 수 있다. 두 쌍의 홀더(340')는 세포 배양 플레이트, 더 구체적으로는, 페트리디시(3000) 내에서. 섬유, 시트, 직물(직포, 부직포, 편직물, 편조물 및 기타), 메쉬, 중공 튜브, 실린더 및 기타 다른 구조를 포함하는 샘플의 전후좌우 네 끝을 잡아, 왕복운동 피스톤(30)의 왕복운동 및 그로 인한 한 쌍의 가이더(320')의 이동에 의해, 샘플을 2축 방향으로 늘이는 것을 주기적으로 할 수 있다. 왕복운동 피스톤(30)의 상하 왕복운동에 의해 두 쌍의 가이더(320')가 두 쌍의 홀더(340')를 외측으로 밀거나 안으로 당기며, 따라서, 두 쌍의 홀더(340')에 의해 좌우전후 네 끝이 고정된 샘플은 주기적으로 서로 교차하는 2축 방향으로 확장력을 인가받는다.
도 18 및 도 19는 전술한 유니버설 프레임(100)과 페트리 플레이트(3000)와 비틀림 인가 기구(400)를 포함하는 비틀림 인가용 바이오리액터를 설명하기 위한 도면이다.
도 18 및 도 19를 참조하면, 왕복운동 피스톤(30)에 대한 부착물로서의 비틀림 인가 기구(400)는 섬유, 시트, 직물(직포, 부직포, 편직물, 편조물 및 기타), 메쉬, 중공 튜브, 실린더 및 기타 다른 구조일 수 있는 샘플에 대하여, 양쪽 끝을 잡아 비틀림을 가하기 위해 적어도 2개의 홀더(420, 440)를 포함할 수 있다.
여기에서, 두 개의 홀더 중 적어도 하나의 홀더(420)는 고정 홀더(420)이고 다른 적어도 하나는 왕복운동 피스톤(30)과 크랭크식으로 연결된 드라이버(430)에 힌지(432)에 의해 연결되어 왕복운동 피스톤(30)의 왕복운동에 따라 각 회전운동 하는 이동 홀더(440)이다. 고정 홀더(420)는 세포 배양 웰 플레이트(3000) 또는 페트리디시(3000)에 고정된 상태로 샘플(S)의 일측을 고정할 수 있다. 왕복운동 피스톤(30)의 상하 왕복운동이 드라이버(430)와 이동 홀더(440)에 의해 샘플(S)에 대한 주기적 비틀림 운동으로 변환되어 비틀림 힘을 가할 수 있다. 고정 홀더(420)에는 샘플(S)의 일측을 고정하기 위한 제1 고정핀(422)이 구비되고, 상기 이동 홀더(440)에는 샘플(S)의 타측을 고정하기 위한 제2 고정핀(442)이 구비될 수 있다. 도 19는 이동 홀더(440)가 왕복운동 피스톤(30) 및 이와 크랭크식으로 연결된 드라이버(430)에 의해 Position 1로부터 Position 2로 각 회전하여 샘플(S)에 비틀림을 인가하는 작용을 보여준다.
홀더는 길이 세포배양 배지와 같은 액체에 부분적 또는 완전히 잠기는, 10mm ~ 200mm, 두께 0.001mm ~ 50mm, 너비 0.001mm ~ 50mm의 규칙적 또는 불규칙적 형태의 구조물을 수용할 수 있다.
도 20은 다양한 바이오리액터의 다양한 형태를 예시적으로 나타내는 것으로, 도 20의 (a)는 모터, 전원 공급장치, 컨트롤러 등 자극 전달 유닛을 구동하는 드라이브 요소들을 수용하는 드라이브 커버가 유니버설 베이스 프레임에 일체로 연결된 바이오리액터를 나타내고, 도 20의 (b)는 사각형의 단일 용기 또는 웰로 이루어진 세포 배양 플레이트를 포함하는 바이오리액터를 나타내고, 도 20의 (c)는 자극 전달 유닛에 의해 기계적 자극(압축, 확장 또는 비틀림) 및/또는 전기적 자극이 인가되는 세포 배양 플레이트를 덮는 커버를 포함하는 바이오리액터를 나타낸다
한편, 전술한 바이오리액터 및/또는 바이오리액터를 구성하는 요소들은 금속, 비금속 또는 플라스틱일 수 있다.
또한 바이오리액터 및/또는 바이오리액터를 구성하는 요소들은 세포 배양 연구실에서 통상적인 멸균 프로토콜 중 하나 이상에 의해 멸균될 수 있다.
이와 같은 멸균 상태를 보호하기 위해, 멸균 상태의 바이오리액터 및/또는 바이오리액터를 구성하는 요소들이 적절한 덮개로 덮일 수 있다.
전술한 기계적 자극 및 전기적 자극이 가해지는 공정 재료들은 살아있는 세포, 세포덩어리, 젤, 나노 또는 마이크로 입자, 생체 분자, 하이드로젤, 중합체, 가교제, 조직공학 지지체, 3D 프린팅 구조체, 3D 바이오프린팅 구조체, 탄성체 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
전술한 구성요소들을 포함하는 바이오리액터는 조립되어 클립, 클램프 또는 진동 없이 작동하는 기타 적절한 고정 수단에 의해 연구실 인큐베이터 내부에 설치될 수 있으며, 의도되고, 외부 전원 공급장치 없이, 의도된, 제어된 그리고 프로그램된 자극 인가를 위해 작동될 수 있다.
일 실시예에서, in vitro 활성 조직 기능적 성장을 목적으로, 중합체, 젤, 나노 및 마이크로 입자, 생체분자, 바이오잉크 및 살아있는 세포를 포함하는 다성분 물질을 갖는 구조물 혹은 세포전달체에 기계적 및 전기적 자극을 적용할 수 있다. 위 목적 외의 목적으로 중합체, 젤, 나노 및 마이크로 입자, 생체분자 및 살아있는 세포를 포함하는 다성분 물질을 갖는 바이오잉크 혹은 구조물에 기계적 및 전기적 자극을 적용할 수도 있다.
일 실시예에서, 상기 언급된 구성요소의 성형재료는 금속, 비금속, 합금, 플라스틱 또는 콤포지트(composite) 일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 언급된 구성요소는 세포 배양 실험실에서 사용되는 하나 이상의 통상적인 멸균 프로토콜을 통해 멸균할 수 있다.
일 실시예에서, 기계적 및 전기적 자극적용을 위한 공정 재료는 살아있는 세포, 세포덩어리, 젤, 나노 또는 마이크로 입자, 생체 분자, 중합체, 가교제, 바이오잉크, 조직공학 지지체, 3D 프린팅 구조체, 3D 바이오프린팅 구조체, 탄성체 및 이들의 혼합물을 포함하는 생체 또는 무생물 중 임의의 것일 수 있다.
일 실시예에서, 전기적 자극은 샘플에 전달되어 샘플 내부 혹은 표면의 세포, 웰 플레이트 표면 또는 페트리디시 표면에 있는 세포들에 적용될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 샘플은 전기전도성을 갖는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 전기전도성 탄소나노튜브를 하이드로젤에 함유시킨 전기전도성을 갖는 젤일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 언급된 구성요소의 전체 어셈블리 및 공정 재료는 실험실 인큐베이터(incubator) 내부에 수용될 수 있고, 의도된 제어가 가능하고, 외부 전원공급 장치가 없이 프로그래밍 된 자극적용을 위해서 작동될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 인큐베이터 내에서 기능적으로 활성인 조직을 재생시키기 위한 목적으로 중합체, 젤, 나노 및 마이크로 입자, 생체분자, 세포덩어리 및 살아있는 세포를 포함하는 다성분 물질을 갖는 구조물(바이오잉크 혹은 지지체)에 기계적 및 전기적 자극을 적용하는 방법을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 인큐베이터 내에서 기능적으로 활성인 조직을 재생시키기 위한 것 이외의 목적을 위해 중합체, 젤, 나노 및 마이크로 입자, 생체분자, 세포덩어리 및 살아있는 세포를 포함하는 다성분 물질을 갖는 구조물(바이오잉크 혹은 지지체)에 기계적 및 전기적 자극을 적용하는 방법을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 생체재료, 하이드로젤, 바이오잉크, 세포전달체, 조직공학 지지체는 물리자극이 가능한 소재와 형태를 적용할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 세포 배양 플레이트는 다양한 웰(6, 12, 24, 48, 96 웰)을 가진 플레이트와 세포 배양 디시(5 cm, 10 cm, 기타 크기로 제조된 배양디시 등)를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 전원 공급장치는 발열의 위험이 적고, 교체가 용이한 0 내지 9볼트 건전지일 수 있다.
일 실시예에서, 바이오리액터 및 24웰 세포 배양 플레이트에 솔레노이드 구동용 부착물, 한 개 당 3g 중량의 디스크형 자석을 사용하여 샘플에 충격하중을 적용할 수 있다. 상기 디스크형 자석의 수는 샘플에 신체하중과 같은 적절한 하중을 전달하도록 조정될 수 있다. 전기자극은 0 내지 9볼트 건전지를 사용할 수 있고, 전압(voltage)은 rpm/파워 컨트롤러에 의해 조절될 수 있으며, 펄스, 지속시간 등은 타임 릴레이(time relay)에 의해 조절되는 프로그램으로 조절될 수 있다.
일 실시예에서, 전체 구성을 하나의 케이스 내에 모두 포함하여 소형화할 수 있다.
일 실시예에서, 바이오리액터는 물리적 자극을 이용하여 세포함유 된 지지체를 조직재생을 유도하여 여러 조건의 물리자극이 적용된 조직재생 샘플(필름, 입자 등)을 얻고, 이때 얻어진 각 샘플(예, 필름형태의 재생조직)을 적층하여 하나의 재생조직을 얻을 수 있다. 예를 들어, 연골이 여러 층으로 구성되어 있는데(표피층, 중간층, 아래층, 골-연골 계면 등) 물리자극된 층들을 적층하면 복합층의 연골조직을 얻을 수 있고, 이를 손실된 연골조직을 대체하는데 적용할 수 있다.
이하에서는 위에서 설명한 바이오리액터의 다양한 응용 또는 위에서 설명한 다양한 바이오리액터에 적용될 수 있는 바이오리액터용 세포 배양 플레이트 조립체를 설명한다.
이하 설명되는 본 발명의 세포 배양 플레이트 조립체는 전술한 바이오리액터(들)에 적용되어 있을 수도 있고, 단독으로 또는 다른 형식의 바이오리액터와 함께 이용될 수도 있다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 플레이트 조립체가 위에서 설명한 바이오리액터에 적용된 예를 나타낸 모식도이고, 도 22는 세포 배양 플레이트를 보다 구체적으로 설명하기 위한 도면이다.
본 실시예에 따른 바이오리액터용 세포 배양 플레이트 조립체는 생분해성 조직공학 구조체(지지체)가 존재하고, 조직공학 구조체(지지체)에 기계자극과 전기자극을 제공하고, 조직공학 구조체는 세포를 포함하거나 세포를 포함하지 않은 상태에서 생체재료, 조직공학 구조체 또는 세포에 물리자극을 가하면서 세포배양을 할 수 있는 시스템이다.
일 실시예에서, 바이오리액터용 세포 배양 플레이트 조립체는 세포 배양 플레이트(1000)를 포함하며, 세포 배양 플레이트(1000)는 복수개의 웰 또는 컨테이너(1110)와, 재순환 또는 신선한 배지가 유입되는 공급부(1120)와, 웰 내측 상부에서 스크린으로 덮여 있는 공급 주입구(1130)와, 공급 조절 캡(1140)과, 전극 고정을 위한 케이지(1150)와, 전극 고정 채널(1160)과, 배지의 역류를 방지하기 위해 조정 가능한 사이펀(syphon; 1170)과, 스크린 또는 멤브레인으로 덮여 있는 하부의 배출구(1180)와, 폐 배지액 또는 재순환될 배지액이 배출되는 드레인(1190)을 포함한다.
공급라인을 통해서 제공된 배지는 사이펀(1170)을 통해서 웰(1110)에서 다른 웰(1110)로 배지를 이동시키고, 배지 배출라인(L1)을 통해서 세포 배양 플레이트(1100) 밖으로 이동시켜, 사용한 배지를 배지 저장조(1001)로 보낸다. 배지 저장조(1001)의 배지는 다시 순환펌프(1002)를 통해 배지 공급라인(L2)으로 신선한 배지를 전달하여 연속적으로 배지가 세포 배양 플레이트(1000)를 지나게 되어 배지 순환을 유도한다.
일 실시예에 따라, 세포 배양 플레이트 조립체는 순환펌프(1002)에 전원을 공급하는 전원 공급장치(1003)과, 순환펌프(1002) 및 전원 공급장치(1003)를 제어하는 컨트롤러(1004)와, 타이머 릴레이(1005)와 타이머 릴레이용 전원(1006)과 디스플레이 등을 포함할 수 있다.
도 23의 (a) 및 (b) 각각은 배지 공급 라인을 위한 높이 조절 캡(1140)을 나타낸 사시와 배지 전달 또는 배지 드레인 라인용 사이펀(1170)을 나타낸 사시도이다.
도 24는 세포 배양 플레이트에 구비되는 전극 고정을 위한 내부 케이지(또는, 네스트; 1150)를 나타낸다. 전극 고정을 위한 내부 케이지(1150)는 상부 막 구조에서 빈 공간인 주입구 및 스크린 또는 멤브레인으로 이루어진 배출구로 구분된다. 웰(1110; 도 21 참조)의 내부면에서 0mm 내지 100mm의 거리로 떨어진 위치에 전기자극을 위한 내부 케이지(네스트)가 위치할 수 있다. 케이지(1150)에는 전극(1152)가 구비되며, 전극(1152)은 예컨대, 스테인리스 스틸 또는 백금(platinum)일 수 있다.
도 25의 (a) 및 (b)는 전극 고정 채널에 의해 고정된 전극에 의한 3차원 샘플에 대한 전류 공급 모델 및 2차원 샘플에 대한 전류 공급 모델을 설명하기 위한 것이다.
도 25의 (a)에 나타낸 전류 공급 모델은 샘플에 대한 전류의 횡적 흐름을 발생시킨다. + 전극은 상부 헤드로부터 제공되고(보이지 않음), 샘플은 하부의 금속 전극과 상부 헤드 전극 사이에 샌드위치 식으로 개재되고 샘플 전체 부피에 따라 전류를 제공한다(횡단면 따라서).
도 25의 (b)에 나타낸 전류 공급 모델은 2차원 샘플에 해 전류의 길이 방향 흐름을 발생한다. + 전극과 - 전극 사이에 샘플이 샌드위치 식으로 개재되며, 전자가 예컨대 필름 형태의 샘플을 따라서 샘플 길이 방향으로 전류를 제공한다.
다시 도 21 및 도 22를 참조하면, 세포 배양 플레이트(1000)는 세포배양 또는 조직공학을 위한 원통형, 입방체, 직육면체, 원추형, 구형 또는 규칙적이거나 불규칙한 모양을 가진 하나 이상의 웰 또는 컨테이너(1110)를 포함한다.
일 실시예에서, 세포 배양 플레이트(1000)는 5 내지 300mm이고, 각 웰(1110)의 치수는 1, 2 또는 3차원에서 1mm 내지 300mm 이다.
일 실시예에서, 웰 또는 컨테이너(1100)는 적어도 하나 이상의 관류 경로, 채널 또는 파이프를 포함한다.
일 실시예에서, 세포 배양 플레이트(1000)는 단독적으로 사용될 수 있고 또는 커버와 결합되어 사용될 수도 있다.
일 실시예에서, 상기 커버는 일반적으로 상용화되는 커버이거나 압축하중자극과 같은 기계적 자극 또는 전기적 자극을 각각 또는 동시에 줄 수 있는 커버, 즉, 위에서 설명한 커버 플레이트일 수 있다.
일 실시예에서, 관류 또는 순환을 위한 펌프(1002)는 진공펌프에 연결된 배지 유입 튜빙을 사용하여 신선한 배지를 유입하거나, 석션 펌프 이후의 튜빙을 사용하여 사용된 배지를 외부로 배출할 수 있도록 한다.
일 실시예에서, 관류 또는 순환을 위한 펌프(1002)는 0 내지 50V 직류에서 작동할 수 있다.
일 실시예에서, 전극 고정을 위한 내부 케이지(1150)는 상부 막 구조에서 빈 공간인 주입구 및 스크린 또는 멤브레인으로 이루어진 배출구로 구분된다.
일 실시예에서, 사이펀(1170)은 웰(1110)과 웰(1110) 사이에 배지의 전달 및 배출을 위한 것으로 웰(1110)에서 사용한 배지가 역류하는 것을 방지할 수 있다.
일 실시예에서, 사이펀(1170)은 배지보다 높게 위치하여 배지가 웰(1110)에서 웰(1110)로 이동하는 것을 방지하고, 석션(suction) 펌프를 이용하여 낮은 위치의 배지를 흡입시켜 다음 웰의 내부로 주입하고 배출시킨다.
일 실시예에서, 본조직공학 구조체에 횡단하여 전기자극을 전달할 경우, 세포배양 용기 또는 세포배양 웰(의 특정 위치에 고정된 적어도 하나 이상의 전극과 전기연결은 조직공학 구조체에 전기펄스를 전달하는 동안 카운터 전극 또는 접지전극으로 작동한다.
일 실시예에서, 본 발명은 조직공학 구조체에 대해 종축 또는 2차원 전극자극을 전달하는 동안에 전극 쌍으로 작동할 수 있도록 웰 또는 컨테이너의 특정 위치에 고정된 2개 이상의 전극 및 전기적 연결을 포함한다.
일 실시예에서, 순환펌프에 부착된 적어도 하나의 관류 경로는 직경이 0 내지 20mm이고, 길이가 0 내지 1000mm인 규칙적이거나 불규칙한 모양의 채널 또는 파이프를 포함한다.
일 실시예에서, 웰 또는 컨테이너(1110)의 파이프 또는 채널 적어도 하나의 유체 조절이 가능하거나 조절할 수 없는 개구를 가진다.
일 실시예에서, 웰 또는 컨테이너(1110)의 파이프 또는 채널의 공급부 또는 배출 라인을 위하여 적어도 하나의 개구를 가진다.
일 실시예에서, 공급부 또는 배출 라인을 통하여 각각의 웰을 위한 채널들의 개구는 1개 이상이 될 수 있다.
일 실시예에서, 웰(1110)에 있는 채널들의 개구부는 1차원 또는 2차원적으로 0.001mm 내지 1mm 크기의 구멍을 가지는 스크린으로 덮여 있다.
일 실시예에서, 웰(1110)에 있는 채널의 개구들은 스크린 이외에 반투과막, 직조 혹은 비직조물(non-woven), 마이크로/나노 섬유시트 혹은 젤 형태의 마개 구조로 덮여질 수 있다.
일 실시예에서, 세포 배양 플레이트(1000)는 웰(1110) 내부에 전극을 고정하기 위하여 세포 배양 또는 조직공학을 목적으로 세포 배양 또는 조직공학을 목적으로 원통형, 정육면체형, 원뿔형, 구형 또는 규칙적이거나 불규칙한 형태를 가진 하나의 웰 또는 컨테이너를 포함한다.
일 실시예에서, 웰(1110)의 내부로부터 0mm 내지 100mm의 거리로 떨어진 위치에 전기자극을 위한 내부 케이지(1150)가 위치하게 된다.
일 실시예에서, 세포 배양 플레이트(1000)는 횡방향으로 전기자극을 위한 접지 혹은 상대 전극으로 작용할 수 있는 고정된 또는 이동가능한 전극들에 대하여 적어도 1개 이상의 전기 연결부를 갖는다.
일 실시예에서, 세포 배양 플레이트(1000)는 세로방향으로 전기자극을 주기 위한 전극으로 작용할 수 있는 고정된 또는 이동가능한 전극에 대하여 적어도 2개 이상의 전기 연결부를 갖는다.
일 실시예에서, 세포 배양 플레이트(1000)는 1차원, 2차원 또는 3차원에서 1mm 내지 300mm의 길이, 너비 및 높이를 갖는다.
일 실시예에서, 세포 배양 플레이트(1000)는 유체를 배출하기 위한 하나 이상의 드레인을 갖는다.
일 실시예에서, 웰(1110)의 채널 개구가 1 차원 또는 2차원에서 0.001mm 내지 1mm 크기의 기공을 가지는 스크린으로 덮여 있는 구조를 갖는다.
일 실시예에서, 채널의 개구는 조직공학을 목적으로 반투과막, 비직조 또는 직조의 구조, 마이크로/나노 기공 시트, 비(non)기공시트 또는 젤 형태의 구조를 제외한 구조체로 덮여있는 구조를 갖는다.
일 실시예에서, 채널과 순환펌프(1002)의 연결은 별도의 저장 탱크 및 처리장치를 사용하거나 사용하지 않을 수 있고, 한 방향이거나 양방향일 수 있는 구조이다.
일 실시예에서, 채널의 공급부 또는 입력 라인 연결부는 적어도 하나 이상의 섹션으로 구성된 저장탱크에 연결하여 원하는 유체를 순환펌프를 통해 특정 웰에 공급할 수 있다.
일 실시예에서, 채널의 배지 전달 또는 배출 라인 연결부는 공급 라인과 분리되어 있으며 재순환을 위해 배지 저장조 또는 펌프에 연결할 수 있다.
일 실시예에서, 배지 전달 또는 배출 라인은 웰과 개구에서 시작되고, 적어도 하나 이상의 개구가 웰 바닥에서 0 내지 20mm 높이에 위치한다.
일 실시예에서, 배지 전달 또는 배출 라인은 유체의 레벨이 조정 가능한 높이로 상승하거나 웰에서 강제로 배출될 때만 유체가 배출되도록 설계된다.
일 실시예에서, 세포 배양 플레이트를 이루는 구성요소의 제작 재료는 금속, 비금속 또는 플라스틱일 수 있다.
일 실시예에서, 세포 배양 플레이트를 이루는 구성요소는 세포배양 실험실에서 사용되는 통상적인 멸균 프로토콜 중 어느 하나 이상의 프로토콜을 통해 멸균할 수 있다.
일 실시예에서, 기계적 및 전기적 자극을 위한 공정 재료는 살아있는 세포, 젤, 나노 또는 마이크로 막, 배열된 섬유, 다공성 또는 비(non) 다공성 시트, 나노 또는 마이크로 입자, 생체 분자, 고분자, 가교제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 실시예에서, 세포 배양 플레이트를 이루는 구성요소와 공정 재료는 실험실 세포배양기기 내부에 수용될 수 있고, 외부 전원 공급장치 없이 조절되고 프로그래밍된 자극 적용과 함께 제어되고, 프로그램 된 관류를 위해 작동할 수 있다.
일 실시예에서, in vitro 시험관 내에서 기능적으로 활성인 조직을 성장시키기 위한 목적 또는 그 외의 목적으로 공정 재료를 갖는 조직공학 구조체에 설정되고, 제어되며, 프로그래밍된 관류를 적용하는 방법을 포함한다. 공정 재료는 고분자, 젤, 마이크로/나노섬유 막, 배열된 섬유, 다공성 또는 비다공성 시트, 나노 및 마이크로 입자, 생체 분자 및 살아있는 세포로 이루어진 군에서 선택된다.
일 실시예에서, 기능적 성장을 위한 또는 그 외의 목적으로 고분자, 젤, 마이크로/나노섬유 막, 배열된 섬유, 다공성 또는 비다공성 시트, 나노 및 마이크로 입자, 생체 분자 및 살아있는 세포를 갖는 공정 재료를 포함하는 조직공학 구조체에 설정되고, 제어되며, 프로그래밍된 관류 바이오리액터에서의 기계적 또는 전기적 자극을 가하는 방법을 포함한다.
일 실시예에서, 바이오리액터는 하나의 모듈로 사용될 수 있고, 이러한 모듈 중 어떤 모듈 조합은 외부의 전원공급이 있거나 또는 전원공급 없이 조절된, 프로그램된 자극적용을 위해 특정방향으로 배열될 수 있다.
일 실시예에서, 세포 배양 플레이트를 포함하는 바이오리액터를 이용하여 물리자극에 의한 줄기세포분화가 유도된 줄기세포, 분화세포, 조직공학 생성물 또는 재생조직을 생성할 수 있다.
한편, 위에서 설명한 실시예에서, 복수개의 웰을 포함하는 웰 플레이트, 즉, 세포 배양 플레이트에 사이펀으로 배지를 공급하는 것은 사이펀의 성능을 조절하는데 어려움이 있고, 오염이 발생하면 6개가 동시에 오염이 될 수 있다. 아래에 설명되는 실시예는 위의 문제점을 해결하기 위한 것이다.
도 26 및 도 27을 참조하여 본 발명의 다른 실시예를 설명한다.
이하 실시예에서 설명되지 않은 내용은 앞선 실시예와 같다. 또한, 앞선 실시예의 설명과 이하 실시예의 설명이 일부 중복될 수 있다는 점에 유의한다. 또한, 이하에서 설명되는 실시예의 특정 구성 요소가 앞선 실시예에 포함될 수도 있고, 반대로, 앞선 실시예에 설명된 특정 구성요소가 이하 실시예에 포함될 수도 있다. 더 나아가, 당업자에게 자명한 범위 내에서 하나의 실시예에 포함된 구성요소는 다른 실시예에 포함된 구성요소를 대신하여 다른 실시예에 적용될 수 있다.
세포 배양 플레이트 조립체는, 세포 배양 또는 조직공학을 목적으로, 원통형, 입방체, 직육면체, 원추형, 구형 또는 기타 규칙적이거나 불규칙한 모양을 가진 하나 이상의 컨테이너 또는 웰(1110)을 포함하는 세포 배양 플레이트(1000)를 포함한다. 이하 설명에서, 용어 "웰"은 일반적인 의미의 웰은 물론이고 용기(container)를 포함하는 의미로 해석된다.
세포 배양 플레이트(1000)는 행렬 배열로 복수개의 웰(1110)을 포함한다.
세포 배양 플레이트(1000)는 길이, 너비 및 폭이 모두 5 mm ~ 300 mm 범위 내에 있으며, 각 웰의 3 방향 치수, 즉 길이, 너비 폭은 1 mm ~ 300 mm 범위 내에 있다.
본 실시예에 따르면, 여러개(본 실시예에서는 12개)의 웰(1110)들로 구성된 세포 배양 플레이트(1000)에 대하여 복수개의 순환 펌프(1002)를 독립적으로 연결하여, 복수개의 배지 순환 시스템을 통해 배지를 공급하도록 구성된다. 예컨대, 도 27에 도시된 바와 같이, 12개의 웰(1110)을 포함하는 세포 배양 플레이트(또는, 웰 플레이트; 10000)에 있어서, 4개의 순환펌프(1002)를 각각 포함하는 4개의 배지 순환 시스템이 작용하여, 각 순환펌프(1002)를 포함하는 4개의 배지 순환 시스템은 중 3개의 배지 순환 시스템 각각(A1)은 이웃하는 한 쌍의 웰(1002, 1002). 즉, 두 개의 웰에 배지를 순환적으로 공급하도록 구성되고, 나머지 하나의 배지 순환 시스템(A2)은 두 쌍의 웰, 즉, 4개의 웰에 배지를 순환적으로 공급하도록 구성된다.
관류 또는 순환을 위한 순환펌프(1002)는 0 ~ 50 v 직류 공급에 의해 작동할 수 있다.
하나의 세포 배양 플레이트에 대응되는 4개의 배지 순환 시스템 각각은, 배지 저장조(1001)과, 순환 펌프(1002)와, 유체 순환 제어를 위한 컨트롤러와 전원 공급 장치를 포함할 수 있다. 이에 더하여, 배지 순환 시스템 각각은 타이머 릴레이 및 타이머 릴레이 전원, 디스플레이 등을 더 포함할 수 있다. 도시하지는 않았지만, 순환펌프와, 전원 공급장치와, 컨트롤러와, 타이머 릴레이와, 전원 공급장치 등을 유지하기 위해 하나 이상의 서포트가 제공될 수 있다.
세포 배양 플레이트 조립체의 앞선 두 실시예들에 있어서, 세포 배양 플레이트 조립체는 이하의 구성을 포함할 수 있다.
세포 배양 플레이트(1100)는 특정 세포 배양 웰(또는, 용기; 1110)에 위치한 의도된 구조물로 유체를 안내하기 위한 하나 이상의 관류 경로를 포함한다. 관류 경로는 채널 또는 파이프를 포함할 수 있다.
각 웰(1110)은 상부 주입구(1130)와 하부 배출구(1180)를 포함하며, 하부 배출구(1180)는 드레인(1190)과 연결된 배출라인(L1)을 통해 독립된 배지 순환 시스템(A1 또는 A2)과 연결되고, 상부 주입구(1130)는 공급부(1120)와 연결된 공급 라인(L2)을 통해 독립된 배지 순환 시스템 연결된다. 이웃하는 두 웰(1110, 1110) 사이에서 이웃하는 두 상부 주입구(1130, 1130)가 상부 유로에 의해 서로 연결되고, 이웃하는 두 웰(1110, 1110) 사이에서 이웃하는 두 하부 배출구(1180, 1180)가 하부 유로에 의해 서로 연결된다. 상기 공급부(1120)가 상부 유로에 연결되고 드레인(1190)이 상기 하부 유로에 연결되어, 2 웰에 대한 독립된 배지 순환 시스템(A1)이 완성된다. 순환펌프(1002) 구동에 의해 각 공급라인(L2)과 상부 주입구를 통해 두 개의 웰(1110)에 공급된 배지는 해당 두 개의 웰(1110)의 하부 주입구와 각 배출라인(L1)를 통해서 세포 배양 플레이트(1100) 밖으로 이동되어, 사용한 배지가 배지 저장조(1001)로 보내진다. 배지 저장조(1001)의 배지는 다시 순환펌프(1002)를 통해 공급라인(L2)으로 신선한 배지를 전달하여 연속적으로 배지가 세포 배양 플레이트(1000)를 지나게 되어 배지 순환을 유도한다.
나머지 하나의 배지 순환 시스템은 서로 이웃하는 두 쌍의 웰 각각이 이웃하는 두 웰(1110, 1110) 사이 각각에 공급부(1120)와 드레인(1190)이 형성되고, 이웃하는 두 쌍의 웰은 이웃하는 두 웰 사이에서 이웃하는 두 하부 배출구(1180, 1180)가 두 하부 유로 각각에 의해 서로 이웃하는 두 웰 사이에서 이웃하는 두 상부 주입구(1130, 1130)가 두 상부 유로 각각에 의해 연결된다. 상기 공급부(1120)가 두 상부 유로에 연결되고 드레인(1190)이 두 하부 유로에 연결되어, 4 웰에 대한 독립된 배지 순환 시스템(A2)이 완성된다. 순환펌프(1002) 구동에 의해 각 공급라인(L2, L2)과 상부 주입구를 통해 4개의 웰(1110)에 공급된 배지는 해당 4개의 웰(1110)의 하부 주입구와 각 배출라인(L1, L1)를 통해서 세포 배양 플레이트(1100) 밖으로 이동되어, 사용한 배지가 배지 저장조(1001)로 보내진다. 배지 저장조(1001)의 배지는 다시 순환펌프(1002)를 통해 공급라인(L2, L2)으로 신선한 배지를 전달하여 연속적으로 배지가 세포 배양 플레이트(1000)를 지나게 되어 배지 순환을 유도한다.
일 실시예에서, 바이오리액터용 세포 배양 플레이트 조립체는 세포 배양 플레이트(1000)를 포함하며, 세포 배양 플레이트(1000)는 복수개의 웰 또는 컨테이너(1110)와, 재순환 또는 신선한 배지가 유입되는 복수개의 공급부(1120)와, 웰 내측 상부에서 스크린으로 덮여 있는 상부 주입구(1130)와 웰 내측 하부에서 스크린으로 덮여 있는 하부 주입구(1180), 이웃하는 두 웰의 이웃하는 상부 주입구(1130) 사이를 연결하고 공급부와 연결된 상부 유로와, 이웃하는 두 웰의 이웃하는 두 하부 주입구(1180) 사이를 연결하고 드레인과 연결된 하부 유로를 포함할 수 있다.
상기 세포 배양 플레이트(1000)는 앞선 실시예에서 설명된 것과 같은 공급 조절 캡과, 전극 고정을 위한 케이지와, 전극 고정 채널 등을 더 포함할 수 있다.
또한 세포 배양 플레이트(1000)는, 웰 내에 조직공학 구조물에 횡단 전기 펄스를 전달하는 동안에, 카운터(반대) 또는 접지 전극으로 작동할 수 있는 하나 이상의 전극 및 전기 연결부를 포함할 수 있다. 이 전극 및 전기 연결부는 세포 배양 웰(또는, 용기)의 특징 위치에 고정될 수 있다. 횡단 전기 펄스는 전기자극에 의한 조직(예, 신경조직, 골조직) 재생을 위해 인가될 수 있다.
2개 이상의 전극 및 전기 연결부는, 조직공학 구조물에 길이 방향 또는 2차원의 전기 펄스를 전달하는 동안 전극 쌍으로 작동하도록, 세포 배양 웰(또는 용기) 내 특정 위치에 고정된다. 이는 웰에 있는 커버 드라이브 끝과 젤 샘플과 배지의 거리를 일정하게 유지하기 위함이다. 세포 배양 웰 플레이트의 전체 규격은 3면 각각이 1000mm 이이다.
순환펌프가 결합되는 관류 경로는 직경 0~20mm, 길이 0~1000mm의 규칙적이거나 불규칙한 모양의 채널 또는 파이프를 포함한다. 관류 경로는 웰(또는, 용기)로의 공급 라인 형성을 위해 웰 내에 채널 또는 파이프의 개구부를 포함하며, 이 개구부는 흐름 조절 가능한 것이거나 또는 유체 흐름 조절 불가능한 것일 수 있다.
순환펌프가 결합되는 관류 경로는 배출 드레인 또는 재순환 목적을 위한 웰(또는, 용기)의 파이프 또는 채널의 전달 또는 드레인 라인을 위한 적어도 하나의 개구부를 포함한다. 상기 전달 또는 드레인 라인은 의도한 높이까지 웰 내부의 유체를 유지하기 위해 조정 가능한 사이펀 배열을 가질 수 있다.
공급 및 드레인 라인을 통하는 개별 웰을 위한 별도의 독립된 채널 개구부가 하나 이상일 수 있다.
웰 내에 있는 채널들의 개구부들은 거름 수단에 의해 덮여 있을 수 있다. 구체적으로, 웰 내에 있는 채널들의 개구부들은 0.001~1mm 크기의 공극을 가진 스크린으로 덮여있을 수 있다. 대안적으로, 웰(1110)의 채널 개구부는 반투막(semi-permeable membrane), 부직포 또는 직조 구조, 마이크로/나노 섬유 시트 또는 젤 유형 플러그와 같은 스크린 이외의 구조로 덮을 수도 있다.
웰 내부에 전극을 유지하기 위한 적어도 하나의 유지 수단은 세포배양 또는 조직공학을 목적으로 원통형, 입방체, 직육면체, 원추형, 구형 또는 기타 규칙적이거나 불규칙한 모양을 가진 하나의 웰 형상물(또는 용기 형상물)일 수 있다. 웰 형상물은 전술한 웰의 형상과 유사하거나 유사하지 않을 수 있다. 웰 내부에 전극을 유지하기 위한 적어도 하나의 유지 수단은 웰의 내부 벽으로부터 0 mm 내지 100 mm 거리를 두고 웰 내부에 위치될 수 있다.
웰 내부에 전극을 유지하기 위한 적어도 하나의 유지 수단은 고정 또는 이동형 전극이 횡단 방향 전기자극을 위한 접지 또는 카운터 전극으로 작용하기 위해 고정 또는 이동형 전극에 대한 하나 이상의 전기 연결부를 구비한다.
웰 내부에 전극을 유지하는 수단은 고정 또는 이동형 전극들이 길이 방향 전기자극을 위한 전극 쌍으로 작용하기 위해 고정 또는 이동 전극들에 대하여 둘 이상의 전기 연결부를 구비할 수 있다.
웰 내부에 전극을 유지하기 위한 적어도 하나의 유지 수단은 1차원, 2차원 또는 3차원에서 1mm ~ 300mm의 길이, 너비 및 높이를 갖는다.
웰 내부에 전극을 유지하기 위한 저거도 하나의 유지 수단은 유체를 배출하기 위한 배출 구멍을 구비한다.
유지 수단 내 채널의 개구부는 1차원 또는 2차원에서 0.001 내지 1mm의 공극을 갖는 스크린으로 덮여 있다. 대안적으로, 유지 수단 내 채널의 개구부는 반투과성 막, 부직포 또는 직조 구조, 마이크로/나노섬유 시트, 비다공성 시트 또는 조직공학 목적의 젤 유형 플러그와 같은 스크린 이외의 구조로 덮일 수 있다.
펌프 또는 순환펌프에 대한 채널 연결부들은 일방향 또는 양방향에 별도의 저장 탱크 및 사용용액 폐기 유닛이 있거나 또는 없을 수 있다.
개별 웰 또는 웰 그룹을 위한 별도의 독립된 펌프는 하나 이상의 순환 경로에 수용될 수 있다.
전술한 채널의 공급 또는 주입 라인 연결부는 저장 탱크에 접속될 수 있고, 저장 탱크는 순환 펌프를 통해 특정 웰 내로 의도한 유체를 공급하기 위해 하나 이상의 섹션을 포함한다.
채널의 전달 또는 배출 라인 연결부는 공급 라인과 분리되어 있으며 재순환을 위해 사용용액 폐기 유닛 또는 펌프에 연결될 수 있다. 상기 전달 또는 배출 라인은 전술한 웰 또는 전술한 유지 수단에 형성된 홀로부터 시작된다. 하나 이상의 배출 홀이 웰의 바닥에서 0~20mm 높이에 위치한다. 웰로부터의 전달 또는 배출 라인은 유체 레벨이 의도된 조정 가능한 높이로 상승하거나 또는 강제로 펌핑될 때 웰로부터 나올 수 있도록 설계된다.
전술한 세포 배양 웰 플레이트의 부품들 제작을 위한 재료는 금속, 비금속 또는 플라스틱일 수 있다.
전술한 세포 배양 웰 플레이트의 구성요소들은 세포 배양 실험실에서 사용되는 통상의 멸균 프로토콜 중 하나 이상을 통해 멸균될 수 있다.
전술한 세포 배양 웰 플레이트에 있어서, 기계적 및 전기적 자극이 가해지는 공정 재료는 마이크로/나노섬유 막, 정렬된 섬유, 다공성 또는 비다공성 시트, 나노 또는 마이크로 입자, 생체 분자, 폴리머, 가교제 및 이들의 혼합물을 포함하는 생체 또는 무생물 중 임의의 것일 수 있다.
전술한 세포 배양 플레이트를 포함하는 전체 조립체와 전술한 공정 재료는 실험실 인큐베이터 내부에 수용될 수 있으며, 외부 전원 공급장치 없이 프로그래딩된 자극 작용을 하는 의도된 제어와 프로그래밍된 관류를 위해 제어된 관류로 작동될 수 있다
본 발명의 일측면에 따라, 전술한 세포 배양 플레이트와 전술한 공정 재료를 이용한 배지 순환 방법이 제공되며, 이 배지 순환 방법은 시험관 내에서 기능적으로 활성인 조직을 성장시키기 위한 목적을 위하여, 중합체, 젤, 마이크로/나노섬유 막, 정렬된 섬유, 다공성 또는 비다공성 시트, 나노 및 마이크로 입자, 생체분자 및 생세포를 포함하는 다성분 물질을 갖는 구조물에 기계적, 전기적 또는 임의의 다른 자극을 인가한다.
본 발명에 따라, in vitro 기능 활성 조직을 위하여, 고분자, 젤, 마이크로/나노섬유막, 정렬섬유, 다공성 또는 비다공성 시트, 나노입자 및 마이크로입자, 생체분자, 살아있는 세포 등의 다성분 물질을 갖는 구조물에 전기자극을 가하여 성장시키는 방법이 제공된다.
전술한 목적 외에, 고분자, 젤, 마이크로/나노섬유막, 정렬섬유, 다공성 또는 비다공성 시트, 나노입자 및 마이크로입자, 생체분자, 생세포 등의 다성분 물질을 갖는 구조물에 전기자극을 가하는 방법이 제공된다.
전술한 세포 배양 웰 플레이트 등을 포함하는 전술한 구성요소들의 전체 조립체는 하나의 모듈로 사용될 수 있으며, 이러한 모듈의 임의 개수는 외부 전원 공급장치가 있거나 없는 프로그래밍된 자극 적용과 함께, 의도되게 제어되고 프로그래밍된 관류를 위해 임의의 특정 방향으로 배열될 수 있다.
도 28은 위에서 설명한 세포 배양 플레이트(1000)가 위에서 설명한 바이오 리엑터에 적용된 예를 보여주며, 도시된 바와 같이, 세포 배양 플레이트(1000)는 유니버설 베이스 프레임(100)에 구비된 고정대(120) 상에서 미도시된 고정나사들에 의해 고정된다. 유니버설 베이스 프레임(100)의 상부 지지대(140)에 왕복운동 가능하게 설치된 왕복운동 피스톤(30)에 전기적 및/또는 기계적 자극을 전달할 수 있는 자극 전달 기구가 결합될 수 있다. 자극 절단 기구는 압력 및/또는 전기적 자극을 웰(1110; 도 27 참조)의 샘플에 가할 수 있는 교체식 헤드가 구비된 커버 플레이트(200)일 수 있다. 자극 전달 유닛을 구동시키기 위한 여러 요소들이 수용되는 케이스가 유니버설 베이스 프레임(100)에 일체로 연결되어 있을 수 있다.
도 29는 위에서 설명한 세포 배양 플레이트(1000)를 이용하여 위에서 설명한 바이오리액터에 적용된 예를 보여주며, 알긴산 젤에 세포를 로딩한 다음에 압축하중을 적용하여 알긴산 젤 내부의 세포들의 거동변화에 따른 세포생존성, 세포증식, 콜라겐 및 GAG 와 같은 세포외기질생성량 변화를 관찰한 결과이다. 도 29는 1일 정적 세포배양(static)과 바이오리액터(dynamic) 적용에 따른 세포거동을 나타낸 결과이고, 도 30은 3일 정적 세포배양(static)과 바이오리액터(dynamic) 적용에 따른 세포거동을 나타낸 결과이며, 도 31은 4일 동안 정적(static) 및 바이오리액터(dynamic) 적용에 따른 콜라겐 생성량 측정결과이고, 도 32는 4일 동안 정적(static) 및 바이오리액터(dynamic) 적용에 따른 GAG 생성량 측정결과를 나타낸다. 알긴산 젤은 알긴산의 Na 염 4g을 자기 교반기에서 밤새 400rpm으로 계속 교반하여 탈이온수 100mL에 용해하였다. 인산염 완충 식염수(PBS)(PBS 100ml 중 1.1g) 중 100mM CaCl2 용액을 1시간 동안 일정하게 교반하면서 준비하였다. 알지네이트 겔 준비를 위해 알지네이트 용액 1ml당 CaCl2 용액 100μl를 사용하였다. 바이오리액터 압축하중은 주기적으로 적용하였고, 세포배양을 4일동안 진행하면서 콜라겐 양과 GAG(glycosaminoglycan)의 양을 측정하였다. 바이오리액터 적용조건은 20% 변형, 하중적용 사이클 0.5Hz, 2시간/일, 90초 정지와 30초 하중적용 주기로 진행했고, 하중적용은 샘플 2mm 깊이, 압력 헤드는 차등압력을 사용했고, 모든 샘플은 7일 동안 세포배양 하였고, 25만세포/ml 밀도, 바이오리액터 적용하기 전 사전 배양 시간은 24시간이었고, 전체 배양 기간은 7일이었으며, 웰에 추가된 1mL 고분자용액에 골 세포를 100 μl 배지에 잘 첨가하고 손으로 혼합하였다. 정적인 상태의 세포배양과 바이오리액터 압축하중에 따른 세포배양과정에서 생성된 콜라겐양과 GAG 양을 비교분석 하였다.
본 발명은 전술한 실시예들에 의해 제한되지 않고 다양하게 변형되어 실시될 수 있다.
[부호의 설명]
10: 모터
20: 어드저스터블 캠
30: 왕복운동 피스톤
1000, 2000, 3000: 세포 배양 플레이트
100: 유니버설 베이스 프레임
200: 커버 플레이트
300: 1축 확장 인가 기구
300': 2축 확장 인가 기구
400: 비틀림 인가 기구

Claims (23)

  1. 하나 이상의 웰을 포함하는 세포 배양 플레이트;
    다른 크기의 세포 배양 플레이트를 고정하는 고정대를 구비한 베이스 프레임; 및
    상기 웰 내의 바이오 물질에 물리적 자극을 전달하는 자극 전달 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자극 전달 유닛은.
    왕복운동기구에 분리가능하게 결합되고 하나 이상의 교체식 헤드를 구비한 커버 플레이트를 포함하며,
    상기 교체식 헤드는 상기 왕복운동기구의 왕복운동에 따라 상기 웰 내의 바이오 물질을 주기적으로 압축시키는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  3. 제2항에 있어서,
    복수의 교체식 헤드가 상기 커버 플레이트에 결합되며, 상기 복수의 교체식 헤드 중 적어도 하나는 상기 웰 내의 바이오 물질에 전기적 자극을 인가하기 위한 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  4. 제2항에 있어서,
    복수의 교체식 헤드가 상기 커버 플레이트에 결합되며,
    상기 복수의 교체식 헤드는,
    단차에 의해 높이가 다른 면을 포함하는 섹션 헤드와,
    압력을 가하는 면이 수평면으로 이루어진 균일 헤드와,
    높이가 점차 달라지는 면을 포함하여 차등 압력을 가하는 차등 헤드와,
    전극을 구비하여 압축과 전기 자극을 동시에 가하는 헤드 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 고정대는 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 또는 96 웰 플레이트 또는 페트리디시를 포함하는 다양한 규격의 세포 배양 플레이트를 고정시키도록 구성된 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 고정대는 중앙에서 4개의 직선 바가 교차하는 십자가 형태를 포함하며, 상기 직선 바의 단부에는 나사식으로 전진 또는 후퇴하도록 고정나사가 설치되는 나사홀이 형성된 턱이 구비된 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  7. 제2항에 있어서, 솔레노이드 드라이브가 장착 조립되며, 상기 솔레노이드 드라이브는 바이오 물질에 임팩트 하중을 가하기 위한 디스크 타입의 마그네트를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  8. 제2항에 있어서.
    상기 자극 전달 유닛은 왕복운동기구의 하단에 결합된 확장 인가 기구를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  9. 제8항에 있어서.
    상기 확장 인가 기구는, 상기 웰 내 배양액에 잠겨 있는 샘플에 1축 방향으로 주기적 확장을 제공하기 위해, 샘플의 양끝을 잡는 한 쌍의 홀더와, 상기 왕복운동기구의 하단에 회동 가능하게 설치되고 하단에서 상기 한 쌍의 홀더와 연결된 한 쌍의 가이더를 포함하며, 상기 한 쌍의 가이더는 상기 왕복운동기구의 상하 왕복운동이 상기 샘플의 1축 방향 확장 및 수축 운동으로 변환되도록 하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 확장 인가 기구는, 상기 웰 내 배양액에 잠겨 있는 샘플에 2축 방향으로 주기적 확장을 제공하기 위해, 샘플의 전후좌우 네 끝을 잡는 2쌍의 홀더와, 상기 왕복운동기구의 하단에 회동 가능하게 설치되고 하단에서 상기 두 쌍의 홀더와 연결된 두 쌍의 가이더를 포함하며, 상기 두 쌍의 가이더는 상기 왕복운동기구의 상하 왕복운동이 상기 샘플의 2축 방향 확장 및 수축 운동으로 변환되도록 하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  11. 제2항에 있어서,
    상기 자극 전달 유닛은 상기 왕복운동기구의 하단에 결합된 비틀림 인가 기구를 포함하며,
    상기 비틀림 인가 기구는,
    상기 세포 배양 플레이트 표면에 접촉될 수 있고, 샘플의 일측을 고정하는 고정 홀더와,
    상기 왕복운동기구의 하단에 크랭크식으로 결합된 드라이버와 연결되어 상기 왕복운동기구의 왕복운동에 의해 각 회전하며, 샘플의 타측을 고정하여, 샘플에 비틀림을 인가하는 이동 홀더를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 자극전달유닛이 바이오 물질을 주기적으로 자극하는 타임과 자극적용 주기를 제어하도록 전원 공급장치와 컨트롤러와 타이머 릴레이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  13. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 플레이트는.
    하나 이상의 웰과,
    외부에서 재순환 또는 신선한 배지를 공급하기 위한 공급부와,
    각 웰의 내측 상부에 형성되어 배지가 주입되는 주입구와,
    각 웰의 내측 하부에 형성된 배출구와,
    재순환될 배지가 외부로 배출되는 드레인을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 공급부와 상기 드레인이 순환펌프 및 배지 저장조와 연결된 공급라인 및 배출라인에 연결되어 배지 순환 시스템이 완성되는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  15. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 웰을 가진 세포 배양 플레이트는 상기 공급부와 상기 드레인 사이에서 상기 복수개의 웰을 차례로 연결하는 관류 경로를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  16. 제13항에 있어서, 상기 세포 배양 플레이트는 복수개의 공급부와 복수개의 드레인을 포함하며, 상기 세포 배양 플레이트는 이웃하는 두 웰 사이에서 이웃하는 두 웰의 주입구 사이를 연결하는 상부 유로와 이웃하는 두 웰 사이에서 이웃하는 두 웰의 배출구 사이를 연결하는 하부 유로를 포함하며, 상기 복수개의 공급부 각각이 상기 상부 유로와 연결되고, 상기 복수개의 드레인 각각이 상기 하부 유로에 연결되는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  17. 제16항에 있어서, 상기 웰 각각에는 전기 자극 인가를 위한 전극이 위치하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 전극을 상기 웰 내에 유지시키기 위한 케이지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 주입구 또는 상기 배출구는 스크린, 반투과막, 직조 또는 비직조물(non-woven), 마이크로/나노 섬유시트 또는 젤 형태의 마개 구조로 덮이는 것을 특징으로 하는 바이오리액터.
  20. 복수개의 웰을 포함하는 세포 배양 플레이트; 및
    웰 내 배지의 재순환 또는 대체를 위해 상기 세포 배양 플레이트와 연결된 하나 이상이 재순환 시스템을 포함하며,
    상기 세포 배양 플레이트는.
    복수개의 웰과,
    외부에서 재순환 또는 신선한 배지를 공급하기 위한 공급부와,
    각 웰의 내측 상부에 형성되어 배지가 주입되는 주입구와,
    각 웰의 내측 하부에 형성된 배출구와,
    재순환될 배지가 외부로 배출되는 드레인을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 플레이트 조립체.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 배지 순환 시스템은,
    배지 저장조와,
    상기 공급부에 연결된 공급라인과,
    상기 드레인에 연결된 배출라인과,
    상기 공급 라인을 통해 배지 저장조의 배지를 상기 세포 배양 플레이트로 공급하고 상기 배출 라인을 통해 상기 세포 배양 플레이트 내의 배지를 상기 배지 저장조로 회수하도록 배지를 순환시키는 순환 펌프를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 플레이트 조립체.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 세포 배양 플레이트는 상기 공급부와 상기 드레인 사이에서 상기 복수개의 웰을 차례로 연결하는 관류 경로를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 플레이트 조립체.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 세포 배양 플레이트는 복수개의 공급부와 복수개의 드레인을 포함하며, 상기 세포 배양 플레이트는 이웃하는 두 웰 사이에서 이웃하는 두 웰의 주입구 사이를 연결하는 상부 유로와 이웃하는 두 웰 사이에서 이웃하는 두 웰의 배출구 사이를 연결하는 하부 유로를 포함하며, 상기 복수개의 공급부 각각이 상기 상부 유로와 연결되고, 상기 복수개의 드레인 각각이 상기 하부 유로에 연결되는 것을 특징으로 세포 배양 플레이트 조립체.
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