WO2023068192A1 - 膜タンパク質を含む人工生体膜 - Google Patents

膜タンパク質を含む人工生体膜 Download PDF

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WO2023068192A1
WO2023068192A1 PCT/JP2022/038358 JP2022038358W WO2023068192A1 WO 2023068192 A1 WO2023068192 A1 WO 2023068192A1 JP 2022038358 W JP2022038358 W JP 2022038358W WO 2023068192 A1 WO2023068192 A1 WO 2023068192A1
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憲一 森垣
文夫 林
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国立大学法人神戸大学
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to artificial biological membranes containing membrane proteins, and more particularly to artificial biological membranes containing membrane proteins that retain lateral diffusibility. Furthermore, the present invention relates to a method for producing artificial biological membranes containing membrane proteins.
  • Non-Patent Document 1 Patent Document 1 and 2
  • nanofluidic device that includes a nanogap structure type substrate using patterned artificial biological membrane technology
  • Patent Document 3 a substrate containing a nanospace (nanogap structure) with a controlled thickness of 5 to 200 nm is shown between the lipid membrane and the solid phase, and biosensors and biochips capable of highly sensitive measurement of biomolecules are shown. is shown to be available for However, membranes containing membrane proteins are not described.
  • Membrane proteins play a very important role in vivo and are also major target molecules for pharmaceuticals, etc., but they have correct structures and functions only when they are incorporated into lipid membranes.
  • attempts have been made to measure the physical properties and functions of membrane proteins by fabricating artificial biomembranes that mimic biomembranes on the surface of a substrate, which is a support.
  • it has been difficult to reconstitute membrane proteins in artificial biomembranes while maintaining intramembrane diffusibility, functions, etc. like biomembranes.
  • Patent Document 4 There is a disclosure of a substrate in which a membrane fraction containing membrane-bound cytochrome P450 (P450) is immobilized on a fluid lipid membrane portion using patterned artificial biomembrane technology. Immobilization of the membrane-bound P450 to the membrane is carried out by diluting the protein-containing membrane fraction with a buffer containing 20% glycerol and 2-mercaptoethanol (2-ME) to an appropriate concentration, and applying it to the patterned pseudo-biological membrane. It was done by adding Although immobilization of P450 on the membrane is demonstrated here, there is no indication of fluidity or lateral diffusibility.
  • 2-ME 2-mercaptoethanol
  • Non-Patent Document 2 There is a disclosure of a technique for introducing a membrane protein (rhodopsin) solubilized in a surfactant into a patterned artificial biomembrane by rapidly diluting it in an aqueous solution.
  • the transfection efficiency is low (membrane protein density is low)
  • the percentage of immobilized membrane proteins is high
  • the action of surfactants causes membrane (4) non-specific adsorption of membrane proteins to the polymer lipid membrane surface; (5) membrane proteins aggregate and lose activity when the surfactant is diluted.
  • Nanodiscs are disc-shaped nanoparticles in which a membrane scaffold protein (MSP) surrounds a lipid bilayer membrane in a belt-like shape. Dynamically reconstituted disc-shaped nanoparticles are known. There is a disclosure of a surface-active peptide that makes it possible to prepare Nanodiscs simply and in a short time without using a surfactant (Patent Document 5). There is also a report on lipid nanodiscs surrounded by an amphipathic peptide (A18 peptide) instead of MSP (Non-Patent Document 3). There are reports that the lipid nanodiscs surrounded by the A18 peptide were reconstituted into a lipid membrane on the substrate surface (Non-Patent Documents 4 and 5).
  • MSP membrane scaffold protein
  • the reconstitution rate of membrane proteins within the lipid membrane is low, and problems such as non-specific adsorption and deactivation of membrane proteins remain.
  • the reconstituted membrane protein is immobilized and does not have lateral diffusibility.
  • Membrane proteins diffuse two-dimensionally in biological membranes, interact with specific proteins to form complexes, and accumulate in specific lipid regions to express functions such as signal transduction and energy conversion. there is Therefore, the development of artificial biological membranes containing membrane proteins that maintain lateral diffusibility is desired.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-309464 Patent No. 4150793
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-226920 Patent No. 553222
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2016-125946 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-187975 JP 2017-039673 A
  • the present invention relates to an artificial biological membrane containing a membrane protein, and more specifically, an object of the present invention is to provide an artificial biological membrane containing a membrane protein that retains lateral diffusibility. A further object of the present invention is to provide a method for producing an artificial biological membrane containing membrane proteins.
  • the present inventors formed a polymer lipid membrane by polymerizing a photopolymerized lipid membrane using a photolithographic technique, and obtained a fluidity containing peptide nanodiscs containing membrane proteins.
  • a method for fabricating patterned artificial biomembranes in combination with lipid membranes According to the patterned artificial biomembrane preparation method using peptide nanodiscs containing membrane proteins in the patterned artificial biomembrane, the fluid lipid membrane containing the membrane protein was extended from the edge of the polymer lipid membrane and reconstituted. It was confirmed for the first time that membrane proteins also retain lateral diffusibility, and the present invention was completed.
  • the present invention consists of the following.
  • a polymer lipid film (b) is partially laminated on the surface of the substrate (a), and a nanodisc containing an amphipathic peptide is included on the surface of the substrate (a) where the polymer lipid film (b) is not laminated.
  • An artificial biological membrane comprising a step of laminating a fluid lipid membrane (c) with a membrane protein (d), wherein the membrane protein (d) is reconstituted while maintaining lateral diffusibility. How to make. 2.
  • the step of partially laminating the polymer lipid membrane (b) on the surface of the substrate (a) includes adsorbing the lipid membrane of the polymerizable lipid (monomer) on the surface of the substrate (a) and forming the polymer lipid membrane (b) by photopolymerization.
  • the method for producing the artificial biological membrane according to the preceding item 1, by forming the artificial biological membrane. 3.
  • the method for producing an artificial biological membrane according to 1 or 2 above comprising the following steps (1) to (4): (1) Step of adsorbing a polymerizable lipid (monomer) lipid film onto the substrate (a) surface; (2) Part of the adsorbed lipid membrane is protected from light irradiation, polymerizable lipids (monomers) that are not protected from light irradiation are polymerized by light irradiation, and the polymer lipid membrane (b) is formed into the substrate (a).
  • An artificial biological membrane comprising a lipid membrane laminated on the surface of a substrate (a), wherein the laminated lipid membrane comprises a fluid lipid membrane (c) containing a polymer lipid membrane (b) and a membrane protein (d). 2. An artificial biological membrane, wherein said membrane protein (d) maintains lateral diffusibility. 5.
  • the polymer lipid film (b) is partially laminated on the substrate (a) surface, and the substrate (a) surface on which the polymer lipid film (b) is not laminated contains a membrane protein (d). 5.
  • the artificial biomembrane according to the preceding item 4 characterized in that the lipid membrane (c) is laminated. 6.
  • the polymer lipid film (b) is patterned and laminated on the substrate (a) surface, and the substrate (a) surface on which the polymer lipid film (b) is not laminated contains a membrane protein (d). 7.
  • 10. 10 The artificial biological membrane according to item 9, wherein at least one of the membrane proteins (d) is a protein classified as a G protein-coupled receptor (GPCR). 11. 11.
  • a method for analyzing membrane protein (d) function characterized by using the artificial biological membrane according to any one of 4 to 10 above. 12.
  • a test device for a membrane protein (d) comprising the artificial biological membrane according to any one of 4 to 10 above.
  • the fluid lipid membrane can be divided into compartments by patterning the polymer lipid membrane, and each compartment has a different type of membrane protein. Fluid lipid membranes with varying concentration (density) can be appropriately placed depending on the purpose.
  • an artificial biological membrane containing the membrane protein of the present invention conditions such as the type and concentration (density) of the membrane protein can be adjusted according to the purpose in an in vitro system, and functional analysis of the membrane protein and targeting of the membrane protein can be performed. It is possible to evaluate substances that
  • FIG. 1A shows a photopolymerizable lipid
  • FIG. 1B shows a method for producing a patterned artificial biomembrane by light irradiation.
  • FIG. 1C shows the fabricated patterned artificial biomembrane.
  • FIG. 2 shows a method for producing an artificial biological membrane containing rhodopsin (Rh) as membrane protein (d). The formation process of a fluid lipid membrane (c) (bilayer membrane) and an artificial biomembrane containing membrane proteins (d) are shown.
  • FIG. 3A is a diagram showing the purification process using size exclusion chromatography (SEC) for peptide nanodiscs (Rh-ND) containing rhodopsin (Rh) used for the production of artificial biomembranes.
  • SEC size exclusion chromatography
  • An amphipathic peptide (A18 peptide) and a lipid (POPC) were mixed in a solvent to form a dry film in a glass vial. Nanodiscs were formed by removing the agent.
  • Fractions 7-10 were Rh-containing Nanodiscs (Rh-ND) and fractions 15-16 were lipid-only Nanodiscs (Empty-ND).
  • FIG. 3B is a diagram showing the purification process using SEC for peptide nanodiscs containing only lipids (Lipid-ND).
  • FIG. 2 is a diagram showing the formation of a fluid lipid membrane (c) in an artificial biomembrane. Peptide nanodiscs were introduced into the regions (compartments) surrounded by the lattice-like polymer lipid membrane (b).
  • FIG. 4A shows the results of fluorescence microscope observation of the formation of a fluid lipid membrane (c) from the edge (border) of the polymer lipid membrane (b), and FIG.
  • FIG. 4B shows the results of FIG. 4A up to 120 seconds. The results are quantified by the fluorescence intensity of .
  • FIG. 4C shows the results of measuring the extension rate of the fluid lipid membrane at the boundary (periphery) with the polymer lipid membrane (b) and the center of the compartment without the polymer lipid membrane (b).
  • Example 2 Regarding artificial biological membranes containing membrane proteins (d), flowable lipid membranes (c ) shows the results of confirming the rearrangement of Cy7-NT-Rh.
  • FIG. 6A shows the results of observation with a fluorescence microscope for each, and
  • FIG. 6B shows the results of quantifying the reconstitution of Cy7-NT-Rh.
  • the present invention relates to an artificial biological membrane containing membrane proteins, and more particularly to an artificial biological membrane comprising a lipid membrane laminated on a substrate surface, wherein the laminated lipid membrane comprises a polymer lipid membrane and a fluid membrane protein.
  • the present invention relates to an artificial biological membrane characterized by being a lipid membrane containing a lipid membrane.
  • the polymer lipid film is partially layered on a substrate surface, and a fluid lipid film containing membrane proteins is layered on the substrate surface where the polymer lipid film is not layered.
  • Said polymeric lipid membrane is preferably a photopolymerizable lipid membrane.
  • the term "artificial biomembrane” refers to a biomembrane that is artificially produced while maintaining the basic physical properties of the biomembrane.
  • Biological membranes have a bilayer structure in which lipid molecules are arranged in two layers on the front and back, and maintain basic physical properties (fluidity) in which molecules can diffuse laterally.
  • the artificial biomembrane of the present invention is a lipid bilayer membrane produced on the surface of a substrate, which is a support.
  • An artificial biological membrane on a substrate surface is also called a supported lipid bilayer (SLB).
  • the artificial biological membrane of the present invention is preferably a patterned artificial biological membrane.
  • patterned artificial biomembrane means that a polymer lipid membrane having no fluidity is arranged in a patterned shape on a substrate surface, and a substrate surface on which no polymer lipid membrane is arranged. An artificial biological membrane in which a fluid lipid membrane is placed in The patterning method will be described later.
  • the "substrate” in the present specification is not particularly limited as long as it is a solid that supports the biomembranes and allows the biomembranes to bind through physical interaction or chemical bonding (see FIGS. 1 and 2).
  • Materials for the substrate include, for example, glass, quartz, plastics, ceramics, and metals, and can be selected as appropriate. Glass, quartz, polymer elastomer, silicon oxide and the like are preferable.
  • Polymer elastomer is a general term for industrial materials having rubber-like elasticity, and specific examples include elastomers such as styrene, olefin, vinyl chloride, urethane, and amide. More specifically, silicone elastomers such as polydimethylsiloxane (PDMS) can be used. Further, its shape may be flat or curved.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • lipid membrane may be of natural or synthetic origin, and includes lipid membranes having phospholipids, such as phosphatidylcholine.
  • the lipid membrane may be a bimolecular lipid membrane or a unimolecular lipid membrane, but is particularly preferably a bimolecular lipid membrane (see FIGS. 1 and 2).
  • polymeric lipid membrane refers to a polymeric lipid membrane having a membrane structure equivalent to that of a biological membrane, preferably a photopolymerizable lipid membrane, and may be a pseudo-biological membrane.
  • the photopolymerizable lipid membrane is not particularly limited as long as it is a lipid having at least one photopolymerizable group.
  • Examples of photopolymerizable groups include double bonds, triple bonds, epoxy salts, ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl groups, and the like, preferably double bonds or triple bonds.
  • One to 10, more preferably 2 to 6 photopolymerizable groups are contained per lipid molecule.
  • a lipid membrane having a polymer bimolecular structure shown in Patent Document 1 is suitable.
  • polymerizable lipids include phospholipids, specifically phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, and phosphatidylserine, in which one or two acyl groups contain at least one photopolymerizable group. and is usually a group derived from an aliphatic carboxylic acid of C 6 -C 30 , preferably C 6 -C 24 , more preferably C 12 -C 22 .
  • the lipid is preferably a glycerophospholipid having two acyl groups, but a phospholipid having one acyl group (having a photopolymerizable group) obtained by hydrolysis of one of the acyl groups of the phospholipid can also be used in combination. .
  • Patent Documents 1 and 2 can be referred to for the structures of photopolymerizable groups and lipid monomers.
  • lipid membranes by introducing reactive groups such as primary amines with chemical reactivity into the hydrophilic sites of photopolymerizable lipid molecules, biologically relevant molecules are chemically bonded to the surface of polymer lipid membranes and have biological functions. Artificial biological membranes can be made.
  • Photopolymerizable phospholipid 1,2-bis(10,12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphochorine hereinafter "DiynePC" has a chemically inactive choline group at the hydrophilic portion.
  • the diacetylene group may be at any position on the hydrocarbon chain, for example, at either end.
  • a diacetylene group is incorporated into a fatty acid having 10 to 30 carbon atoms, preferably 14 to 28 carbon atoms, more preferably 18 to 26 carbon atoms, and two of these fatty acids form an ester with a glycerol group to form a photopolymerizable lipid having a diacetylene group. becomes.
  • the temperature of the substrate is adjusted to that of the photopolymerizable lipid with diacetylene groups in order to achieve a crystalline state in which the lipid molecules are regularly oriented. It is preferred that the temperature is at least 5°C lower than the phase transition temperature of the monomer.
  • the temperature of the substrate is preferably 33° C. or lower, more preferably 10° C. or lower. Since the phase transition temperature differs depending on the photopolymerizable lipid having a diacetylene group, a preferred temperature is used according to the lipid.
  • fluid lipid membrane refers to a lipid membrane that has a membrane structure equivalent to that of a biological membrane and has fluidity (molecular lateral diffusibility) similar to that of a cell membrane.
  • lateral diffusivity is used in the sense generally indicated as a property of a membrane, and specifically refers to the property of lipid molecules constituting the membrane to diffuse and move within the membrane. Since the phospholipid molecules are not covalently bonded in the lipid bilayer, various molecular movements are possible. Lateral diffusive motion is the diffusive motion in which lipid molecules exchange their positions and move laterally within the same monolayer.
  • the cell membrane is not a static structure that simply separates the inside and outside of the cell.
  • the cell membrane It is a part of the cell membrane that allows small molecules such as ions to permeate through specific channels and receives signals from outside the cell via receptors. It is responsible for important functions for cells, such as the function of taking up and transporting into the cell.
  • the lipid molecules formed on the hydrophilic substrate also diffuse laterally in the same way as the biological membrane. be able to.
  • Membrane protein in the present invention refers to a protein that adheres to the biomembranes of all cells and intracellular organelles, from microorganisms to animals and plants.
  • Membrane proteins are classified into integral membrane proteins and superficial membrane proteins. Furthermore, membrane proteins are classified into multiple types according to the direction of insertion into the membrane, the presence or absence of a signal peptide, and the position of the transmembrane domain within the protein.
  • the functions of membrane proteins include transportation of substances necessary for life support such as ions and nutrients, and highly sensitive sensors of extracellular information called sensory receptors such as hormones, light, heat, and sound.
  • Membrane proteins are specifically classified into G protein-coupled receptors (GPCRs), ion channels, membrane-bound enzymes, transporters, and the like.
  • GPCRs G protein-coupled receptors
  • GPCRs include receptor groups such as rhodopsin-like receptors (class A), secretin-like receptors (class B), metabotropic glutamate receptors (class C), and Frizzled/Smoothened (class F). They include rhodopsin, adrenergic receptors, histamine H1 receptors, histamine H2 receptors, serotonin receptors, dopamine receptors and the like. Other membrane proteins include cytochrome P450 and ATP synthase.
  • receptor groups such as rhodopsin-like receptors (class A), secretin-like receptors (class B), metabotropic glutamate receptors (class C), and Frizzled/Smoothened (class F). They include rhodopsin, adrenergic receptors, histamine H1 receptors, histamine H2 receptors, serotonin receptors, dopamine receptors and the like. Other membrane proteins include cytochrome P450 and ATP synthase.
  • the artificial biomembrane containing the membrane protein of the present invention is produced by partially laminating a polymer lipid membrane on a substrate surface, and laminating a fluid lipid membrane together with the membrane protein on the substrate surface where the polymer lipid membrane is not laminated. can be made.
  • the arrangement of the polymer lipid membrane and the fluid lipid membrane can be arbitrarily determined using photolithography technology.
  • a photopolymerizable polymer lipid film can be deposited on a substrate according to, for example, the photopolymerization method disclosed in Patent Document 2 (Japanese Patent No. 5532229) to form a lipid film having a bimolecular structure.
  • lipid film consisting of a bimolecular structure
  • a part of the adsorbed polymerizable lipid (monomer) is protected from light irradiation, and polymerization that is not protected from light irradiation is performed.
  • lipids (monomers) can be polymerized by light irradiation to form a polymeric lipid membrane.
  • the portion to be protected from light irradiation can be arbitrarily determined, and the shape of the portion to be irradiated with light can be patterned.
  • the term “patterning” refers to patterning the shape of a portion to be irradiated with light.
  • an artificial biomembrane containing a membrane protein patterned with a polymerized polymer lipid membrane can be produced, for example, by the following method.
  • an artificial biomembrane containing membrane proteins can be produced on a substrate as a hybrid membrane combining a polymer lipid membrane and a fluid lipid membrane (see Fig. 1B).
  • An artificial biological membrane containing the membrane protein of the present invention can be specifically produced by a method including the following steps (1) to (4). A more specific description will be made below based on the symbols shown in FIG. 1B or FIG. (1)
  • the photopolymerizable polymer lipid membrane (b) is prepared, for example, in Patent Document 3 (Patent No. 5532229) or Non-Patent Document 4 (Langmuir 2013 29 (8), 2722- 2730), a lipid membrane consisting of a bimolecular structure can be arbitrarily patterned.
  • the fluid lipid suspension solution containing the membrane protein (d) is laminated on the surface of the substrate (a) together with the membrane protein (d) on the fluid lipid film (c). Achieved by dripping onto the surface.
  • the membrane protein (d) is preferably added dropwise together with the fluid lipid suspension while being contained in Nanodiscs containing amphipathic peptides.
  • a nanodisc containing an amphipathic peptide refers to a disk-shaped nanoparticle containing an amphipathic peptide instead of a membrane scaffold protein (MSP).
  • MSP membrane scaffold protein
  • Nanodiscs Amphipathic peptides available in Nanodiscs can be used to solubilize phospholipid liposomes and form discotic aggregates (Nanodiscs). At molar ratios of 33:1 to 23:1 between phospholipids and amphipathic peptides, the edges of discotic lipid bilayers are covered by the hydrophobic side of the peptides to form metastable nanodiscs. can be done.
  • a membrane protein (d) such as rhodopsin (Rh)
  • Rh rhodopsin
  • the surfactant-solubilized membrane protein, the lipid, and the amphipathic peptide are mixed, and the solution is subjected to surfactant The purpose can be achieved by removing the agent.
  • the amino acid sequence of the amphipathic peptide contained in the Nanodisc of the present invention is exemplified by the amino acid sequence specified by SEQ ID NO: 1 below, but any amphipathic peptide that can be used in the Nanodisc can be used. Amino acid sequences are not particularly limited.
  • FIG. 1 can be referred to for the patterned formation of the artificial biological membrane in the present invention.
  • the artificial biomembranes of the present invention are made by layering fluid lipid membranes (c) with membrane proteins (d) within corrals surrounded by polymeric lipid membranes (b).
  • the type and concentration of membrane protein (d) can be changed as appropriate.
  • Nanodisc containing an amphipathic peptide in the present specification, specifically, the Nanodiscs shown in Non-Patent Documents 3 to 5 shown in the background art section can be used.
  • the membrane protein (d) contained in the nanodisc containing the amphiphilic peptide hereinafter simply referred to as "peptide nanodisc" is attached to the surface of the substrate (a) together with the fluid lipid membrane (c). Laminated.
  • a peptide nanodisc suspension containing membrane protein (d) and a peptide nanodisc suspension not containing membrane protein (d) were mixed at an arbitrary ratio on the substrate (a) surface, and the mixture was applied to the substrate ( a) It can be dropped onto the surface to form a protein-incorporated fluid lipid film (c) and layered.
  • This fluid lipid membrane (c) is formed by extending from the edge of the polymer lipid membrane (b) (see FIGS. 2 and 4). This suggests that the polymer lipid membrane (b) preformed on the surface of the substrate (a) plays an important role in the reconstitution of the fluid lipid membrane (c).
  • the artificial biological membrane containing the membrane protein (d) produced in the present invention can divide the fluid lipid membrane (c) into compartments by patterning the polymer lipid membrane (b).
  • the type and concentration (density) of the membrane protein (d) can be arbitrarily changed and arranged on the fluid lipid membrane (c) divided into compartments.
  • the substance targeting the membrane protein (d) is not particularly limited as long as it is a substance that can interact with the membrane protein (d). markers and the like.
  • the present invention also extends to a method for analyzing membrane protein functions using the artificial biological membrane of the present invention and a method for evaluating substances that target membrane proteins.
  • the present invention also extends to testing devices related to the membrane protein (d) containing the artificial biological membrane.
  • the test device is an artificial biological membrane in which a lipid membrane is laminated on the surface of a substrate (a), wherein the laminated lipid membrane is a fluid lipid membrane containing a polymer lipid membrane (b) and a membrane protein (d).
  • It may be the artificial biological membrane itself, which includes (c) and is characterized in that the membrane protein (d) maintains lateral diffusibility, and the artificial biological membrane is carried or used in a measuring device. It may be placed on a tray or the like as applicable.
  • the term "test for membrane protein (d)” means a test for functional analysis of membrane protein (d) or evaluation of a substance targeting membrane protein (d).
  • the fluid lipid membrane (c) can be separated into compartments by patterning the polymeric lipid membrane (b), as described above.
  • the type and concentration (density) of the membrane protein (d) can be arbitrarily changed and arranged on the fluid lipid membrane (c) divided into compartments.
  • the present invention includes at least a device for testing membrane protein (d), and further includes reagents and/or instruments necessary for testing membrane protein (d), and extends to a testing kit for membrane protein (d).
  • the "reagents necessary for testing the membrane protein (d)” include, for example, water-soluble reagents necessary for the function of the membrane protein such as coenzymes, sample dilution buffer reagents, test marker reagents, etc. All reagents that can be used as a kit are included without being limited to these.
  • equipment necessary for testing membrane protein (d) includes, for example, equipment for introducing specimens and reagents into the testing device and exchanging solutions, equipment for performing measurements, and protecting the testing device. It includes, but is not limited to, any instrument that can be used as a kit.
  • Example 1 Production of patterned artificial biological membrane containing membrane protein (d)
  • a method for producing a patterned artificial biological membrane containing membrane protein (d) will be described.
  • a lipid bilayer membrane was prepared by immobilizing a polymer lipid membrane (b) on the surface of a substrate (a) by the vesicle fusion method.
  • a glass substrate was used as the substrate (a)
  • rhodopsin (Rh) was used as the membrane protein (d).
  • the DiynePC lipid bilayer attached to the surface of the substrate (a) was held in pure water.
  • an aqueous solution purged with an inert gas (argon or nitrogen) was circulated by a pump to remove oxygen from the solution.
  • the substrate (a) on which the DiynePC lipid bilayer membrane was laminated was exposed to ultraviolet light using a deep ultraviolet light exposure lamp (USHIO SP-9, Ushio) that has a strong emission line at wavelengths of 300 nm or less. Irradiated.
  • an interference filter or an interference mirror for a laser was used to selectively irradiate light with a wavelength of around 250 nm, which is most effective for photochemical reactions.
  • the lipid bilayer membrane laminated on the substrate (a) was placed horizontally with the surface facing up, and a mask was placed thereon to block light (Fig. 1B). reference). After the light irradiation, it was bathed in a surfactant solution (Sodium Dodecyl Sulfate: SDS, 100 mM) at 30°C for 30 minutes, and then washed ten times with pure water.
  • a surfactant solution Sodium Dodecyl Sulfate: SDS, 100 mM
  • the lipid bilayer membrane at the site irradiated with light is laminated as the polymer lipid membrane (b) on the surface of the substrate (a), and the site not irradiated with light is washed away, and the polymer lipid membrane (b) is patterned. formed (Fig. 1B, C).
  • Irradiation wavelength Deep UV light exposure lamp (USHIO SP-9, Ushio), 300 nm or less Irradiation light intensity: 160 mW/cm 2 (254 nm) Irradiation time: 100 seconds Irradiation light intensity: Irradiation light intensity 16.0 J/cm 2
  • Cy7-NT-Rh was purified by two-step size exclusion chromatography (SEC) (Superose® 12 3.2 ⁇ 300, Pharmacia; equilibrated with buffer containing 0.1% azolectin and 50 mM octylglucoside).
  • SEC size exclusion chromatography
  • POPC palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine
  • NBD-PE fluorescent lipid
  • Amphipathic peptide A18 peptide: SEQ ID NO: 1
  • lipid nanodiscs (Lipid-ND) required for formation of fluid lipid membrane (c)
  • a lipid nanodisc (Lipid-ND) suspension solution for lamination of fluid lipid membrane (c) was prepared by the following method. prepared. A lipid suspension solution consisting of POPC (1 mg) and fluorescent lipid (NBD-PE) (1 mol%) (POPC (1 mM), NBD-PE (1 mol%)) was dissolved in chloroform and placed in a small brown bottle. , dried the chloroform for 15 min by blowing N2 gas. 0.5 ml of buffer A was added to Rh, and the mixture was allowed to stand overnight at 37°C after simple sonication. This operation forms lipid nanodiscs encapsulating only lipids. The lipid nanodiscs were purified by SEC (Superdex (R) 200 10x300, Pharmacia) for the purpose of removing excess peptides (Fig. 3B).
  • SEC Superdex (R) 200 10x300, Pharmacia
  • Cy7-Rh-ND and Lipid-ND were mixed at a ratio of 60:1 and added to the substrate (a) carrying the patterned polymer lipid membrane (b). After incubation at 25°C for 15 minutes, excess peptide nanodiscs not adsorbed to the substrate (a) surface were removed by exchanging the solution with buffer A. In addition, the solution was added to a pseudophysiological saline solution (potassium gluconate) containing oxygen-removing buffer suitable for microscopy (glucose (4.5 mg/ml), glucose oxidase (216 ⁇ g/ml), and catalase (36 ⁇ g/ml)) to prevent bleaching of the fluorescent dyes.
  • a pseudophysiological saline solution potassium gluconate
  • oxygen-removing buffer suitable for microscopy glucose (4.5 mg/ml), glucose oxidase (216 ⁇ g/ml), and catalase (36 ⁇ g/ml)
  • Example 1 Confirmation of form of fluid lipid membrane formation
  • the form of fluid lipid membrane (c) produced in Example 1 was confirmed.
  • a fluid lipid membrane (c) was formed and extended from the edge of the polymeric lipid membrane (b).
  • the fluorescence intensity was measured at the boundary between the polymer lipid membrane (b) and the polymer lipid membrane (b) and at the center of the compartment.
  • FIG. 4A As a result of confirming the time transition of the fluorescence intensity along the lower right section section of each pattern shown in FIG. 4A, it was confirmed that the film formation was promoted with the lapse of a short time up to 120 seconds (FIG. 4B).
  • a lipid suspension solution for laminating the fluid lipid membrane (c) used in this comparative example was prepared by the following method. Palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine (POPC: 1 mM), fluorescent lipid (NBD-PE: [N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl)-1, 2-dihexadecanoyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt) (1 mol%) (POPC (1 mM), NBD-PE (1 mol%)) dissolved in chloroform, placed in a round-bottomed flask, and blown with N 2 gas. and dried chloroform for 15 minutes.
  • lipid film manufactured laminated lipid bilayers
  • Phosphate buffer solution PBS
  • Cy7-NT-Rh prepared by the same method as in 1-2 of Example 1 was solubilized with OG (50 mM) and added to the aqueous phase above the SLB so that the final concentration was 3 mM or less. The phases were incubated for 10 minutes at 25°C with agitation and rapidly diluted. Cy7-NT-Rh not reconstituted into the SLB was removed by rinsing with buffer A.
  • the patterned artificial biological membrane containing membrane proteins produced by the method of the present invention has a high membrane protein introduction efficiency (membrane protein density is high), has stable lateral diffusibility, and has a polymer lipid membrane surface. It is superior in that the degree of non-specific adsorption of membrane proteins to the membrane is low. Furthermore, the patterned artificial biomembrane containing the membrane protein of the present invention is free from surface activity and the like in the production process, so adverse effects such as defects and deformation of the membrane and aggregation of the membrane protein are reduced. From the above, it was confirmed that the membrane protein-containing patterned artificial biological membrane treated with the Nanodisc of the present invention is superior to the membrane protein-containing patterned artificial biological membrane treated with a surfactant.
  • membrane proteins reconstituted from artificial biological membranes containing membrane proteins of the present invention maintain lateral diffusibility, and artificial biological membranes of the present invention have functions equivalent to biological membranes.
  • the fluid lipid membrane can be divided into compartments by patterning the polymer lipid membrane, and the type and concentration (density) of the membrane protein can be adjusted for each compartment. Fluid lipid membranes with different properties can be appropriately arranged according to the purpose.
  • Membrane proteins play an extremely important role in vivo and are also major target molecules for pharmaceuticals, etc. However, since they have correct structures and functions only when they are incorporated into lipid membranes, sufficient functional analysis is required in vitro systems. It was difficult to By using the artificial biological membrane containing the membrane protein of the present invention, for example, in a test device or kit, conditions can be adjusted according to the purpose in an in vitro system, and functional analysis of the membrane protein and targeting of the membrane protein can be performed. Any substance that may possibly interact with the substance to be used, for example drugs such as pharmaceuticals, foods, membrane proteins, can be evaluated.

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Abstract

側方拡散性を保持した膜タンパク質を含む人工生体膜を提供する。さらには側方拡散性を保持した膜タンパク質を含む人工生体膜の作製方法を提供する。基板(a)表面にポリマー脂質膜(b)を部分的に積層し、前記ポリマー脂質膜(b)が積層されていない基板(a)表面に、ペプチドナノディスクとともに膜タンパク質(d)とともに流動性脂質膜(c)を積層する工程を含む、人工生体膜の作製方法による。作製された人工生体膜には膜タンパク質(d)が高確率で再構成され、側方拡散性も保持する。

Description

膜タンパク質を含む人工生体膜
　本発明は、膜タンパク質を含む人工生体膜に関し、より詳しくは側方拡散性を保持した膜タンパク質含む人工生体膜に関する。さらに本発明は膜タンパク質を含む人工生体膜の作製方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2021-173293号優先権を請求する。
　生体膜と同等の機能や生体適合性を得るために、生体膜と同等な構造を持つ脂質膜を光又は熱で重合して安定化する研究は数多く行われている。本発明者らのグループは、光重合脂質膜を光リソグラフィー技術で重合して天然脂質と組み合わせるパターン化人工生体膜を開発した（非特許文献１、特許文献１、２）。
　パターン化人工生体膜の技術を利用したナノギャップ構造型基板を含むナノ流体デバイスについても開示がある（特許文献３）。ここでは脂質膜と固相の間に厚さが5～200nmで制御されたナノ空間（ナノギャップ構造）を含む基板が示されており、生体分子を高感度計測可能なバイオセンサー、バイオチップなどに利用可能であることが示されている。しかしながら膜タンパク質を含む膜については記載がない。
　膜タンパク質は生体内で非常に重要な役割を果たし、医薬品等の主要標的分子でもあるが、脂質膜に組み込まれた状態でのみ正しい構造、機能を持つ。これまで、生体膜を模倣した人工生体膜を支持体である基板表面に作製して膜タンパク質の物性や機能を計測することが試みられてきた。しかしながら、人工生体膜における膜タンパク質を生体膜と同様に膜内拡散性、機能などを保持して再構成することは困難であった。
　パターン化人工生体膜の技術を利用し、流動性脂質膜部分に膜結合型チトクロームP450（P450）を含む膜画分を固定化した基板について開示がある（特許文献４）。膜結合型P450の膜への固定化は、該タンパク質含有膜画分を２０％グリセロール及び2-mercaptoethanol（2-ME）を含んだ緩衝液で適当な濃度に希釈し、パターン化疑似生体膜に添加することで行われた。ここではP450の膜への固定化が示されているものの、流動性や側方拡散性については何ら示されていない。
　界面活性剤に可溶化した膜タンパク質（ロドプシン）を、水溶液中で急速に希釈することでパターン化人工生体膜に導入する技術の開示がある（非特許文献２）。しかし、（１）導入効率が低い（膜タンパク質密度が低い）、（２）固定化した（側方拡散性を有しない）膜タンパク質の割合が高い、（３）界面活性剤の作用により、膜に欠損や変形が生じる可能性がある、（４）ポリマー脂質膜表面に膜タンパク質が非特異的に吸着する、（５）界面活性剤を希釈する際に、膜タンパク質が凝集して活性を失う可能性がある、などの問題点があった。
　ナノディスクは両親媒性タンパク質（membrane scaffold protein：MSP）が脂質二分子膜をベルト状に取り囲んだ円盤状のナノ粒子であり、一般的には血中の高密度リポプロテイン（HDL）粒子を人工的に再構成したディスク状のナノ粒子が知られている。界面活性剤を使用することなくナノディスクを簡便かつ短時間で調製可能とする界面活性ペプチドについて開示がある（特許文献５）。また、MSPの代わりに両親媒性ペプチド（A18ペプチド）で囲まれた脂質ナノディスクについても報告がある（非特許文献３）。前記A18ペプチドで囲まれた脂質ナノディスクを基板表面上の脂質膜に再構成させたことの報告がある（非特許文献４、５）。しかしながら、両親媒性ペプチドで囲まれた脂質ナノディスクを用いても、脂質膜内での膜タンパク質の再構成率は低く、さらに膜タンパク質の非特異敵吸着や失活等の課題が残されている。また再構成された膜タンパク質は固定化されており、側方拡散性は有さない。膜タンパク質は、生体膜内を2次元に拡散することで、特定タンパク質と相互作用して複合体を形成したり、特定脂質領域に集積することを通じてシグナル伝達、エネルギー変換などの機能を発現している。そのため、側方拡散性を保持した膜タンパク質を含む人工生体膜の開発が望まれている。
特開2004-309464号公報（特許第4150793号公報） 特開2011-226920号公報（特許第5532229号公報） 特開2016-125946号公報 特開2008-187975号公報 特開2017-039673号公報
Okazaki et al., Langmuir, 2009 Jan 6;25(1):345-51 Tanimoto et al., Biophys. J. 2015, 109, 2307-2316 Midtgaard et al., Soft Matter, 2014, 10, 738-752 Luchini et al., Anal. Chem. 2020, 92, 1081-1088 Luchini et al., Journal of Colloid and Interface Science 585 (2021) 376-385
　本発明は、膜タンパク質を含む人工生体膜に関し、より詳しくは側方拡散性を保持した膜タンパク質を含む人工生体膜を提供することを課題とする。さらに本発明は膜タンパク質を含む人工生体膜の作製方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、光重合脂質膜を光リソグラフィー技術で重合してポリマー脂質膜を形成させ、膜タンパク質を含むペプチドナノディスクを含む流動性脂質膜と組み合わせてパターン化人工生体膜を作製する手法を見出した。パターン化人工生体膜に膜タンパク質を含むペプチドナノディスクを用いるパターン化人工生体膜の作製方法によれば、ポリマー脂質膜辺縁部より膜タンパク質を含む流動性脂質膜が伸展し、再構成された膜タンパク質も側方拡散性を保持することを初めて確認し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、以下よりなる。
１．基板(a)表面にポリマー脂質膜(b)を部分的に積層し、前記ポリマー脂質膜(b)が積層されていない基板(a)表面に、両親媒性ペプチドを含むナノディスクに含まれた膜タンパク質(d)とともに流動性脂質膜(c)を積層する工程を含み、前記膜タンパク質(d)が側方拡散性を保持した状態で再構成されていることを特徴とする人工生体膜の作製方法。
２．基板(a)表面にポリマー脂質膜(b)を部分的に積層する工程が、基板(a)表面に重合性脂質（モノマー）の脂質膜を吸着し、光重合によりポリマー脂質膜(b)を形成させることによる、前項１に記載の人工生体膜の作製方法。
３．以下の（1）～（4）の工程を含む、前項１又は２に記載の人工生体膜の作製方法：
（1）基板(a)表面に重合性脂質（モノマー）の脂質膜を吸着させる工程；
（2）前記吸着した脂質膜の一部を光照射から保護し、光照射から保護されていない重合性脂質（モノマー）を光照射して重合させ、ポリマー脂質膜(b)を基板(a)表面にパターン化形成させる工程；
（3）前記（2）の工程で、光重合反応から保護された脂質膜を界面活性剤又は有機溶媒によって基板(a)表面から除去する工程；
（4）前記（3）の工程で、基板(a)表面から脂質膜が除去された部位に膜タンパク質(d)とともに流動性脂質膜(c)を積層する工程。
４．基板(a)表面に脂質膜が積層されてなる人工生体膜であって、前記積層される脂質膜がポリマー脂質膜(b)と膜タンパク質(d)を含む流動性脂質膜(c)を含み、前記膜タンパク質(d)が側方拡散性を保持した状態であることを特徴とする人工生体膜。
５．前記ポリマー脂質膜(b)が、基板(a)表面に部分的に積層されており、前記ポリマー脂質膜(b)が積層されていない基板(a)表面に、膜タンパク質(d)を含む流動性脂質膜(c)が積層されていることを特徴とする、前項４に記載の人工生体膜。
６．前記ポリマー脂質膜(b)が、光重合性脂質膜である前項４又は５に記載の人工生体膜。
７．前記ポリマー脂質膜(b)がパターン化形成されて基板(a)表面に積層されており、前記ポリマー脂質膜(b)が積層されていない基板(a)表面に、膜タンパク質(d)を含む流動性脂質膜(c)が積層されていることを特徴とする前項４～６のいずれかに記載の人工生体膜。
８．前項１～３のいずれかに記載の作製方法で作製されており、膜タンパク質(d)が側方拡散性を保持した状態で再構成されていることを特徴とする基板(a)表面に脂質膜が積層されてなる人工生体膜。
９．膜タンパク質(d)が、１種又は２種以上の膜タンパク質である前項４～８のいずれかに記載の人工生体膜。
１０．膜タンパク質(d)の少なくとも１種が、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）に分類されるタンパク質である前項９に記載の人工生体膜。
１１．前項４～１０のいずれかに記載の人工生体膜を用いることを特徴とする、膜タンパク質(d)機能の解析方法。
１２．前項４～１０のいずれかに記載の人工生体膜を用いることを特徴とする、膜タンパク質(d)を標的とする物質の評価方法。
１３．前項４～１０のいずれかに記載の人工生体膜を含む膜タンパク質(d)に係る検査用デバイス。
１４．前項１３に記載の検査用デバイス及び膜タンパク質(d)の検査に必要な試薬を含む、膜タンパク質(d)に係る検査用キット。
　従来は、人工生体膜では膜タンパク質は側方拡散性や安定性が保持されておらず、人工生体膜内で十分に膜タンパク質が再構成されているとはいえなかった。一方、本発明の膜タンパク質を含む人工生体膜は、再構成された膜タンパク質は側方拡散性を保持し、生体膜と同等の機能を有することが確認された。さらに本発明の膜タンパク質を含む人工生体膜の作製方法によれば、ポリマー脂質膜がパターン化形成されていることにより流動性脂質膜を区画に分別することができ、区画ごとに膜タンパク質の種類や濃度（密度）を変えた流動性脂質膜を目的に応じて適宜配置することができる。
　本発明の膜タンパク質を含む人工生体膜を用いることで、in vitroの系で、目的に応じて膜タンパク質の種類や濃度（密度）等の条件を整え、膜タンパク質の機能解析や膜タンパク質を標的とする物質の評価を行うことができる。
本発明の人工生体膜の作製方法及びパターン化形成の概念を示す図である。図１Ａは光重合性脂質を示し、図１Ｂは光照射によるパターン化人工生体膜の作製方法を示す。図１Ｃは作製されたパターン化人工生体膜を示す。（実施例１） 膜タンパク質(d)としてロドプシン（Rh）を含む人工生体膜の作製方法を示す図である。流動性脂質膜(c)（二分子膜）の形成過程と膜タンパク質(d)を含む人工生体膜を示す。（実施例１） ペプチドナノディスクの精製過程を示す図である。図３Ａは人工生体膜の作製に使用するロドプシン（Rh）を含んだペプチドナノディスク（Rh-ND）について、サイズ排除クロマトグラフィー（Size exclusion chromatography：SEC）を用いた精製過程を示す図である。両親媒性を持つペプチド（A18ペプチド）と脂質（POPC）を溶媒中で混合して、ガラスバイアル中で乾燥フィルムを形成させ、可溶化されたRhを含む水溶液を添加した後、SECによって界面活性剤を除去することでナノディスクを形成した。分画7-10はRh含有ナノディスク（Rh-ND）であり、分画15-16は脂質のみのナノディスク（Empty-ND）であった。このEmpty-NDは副次的に得られるもので、微量のRhを含むなどするため支持脂質二分子膜（Supported Lipid Bilayer：SLB）形成時には使用しない。図３Ｂは脂質のみを含むペプチドナノディスク（Lipid-ND）についてSECを用いた精製過程を示す図である。（実施例１） 人工生体膜において、流動性脂質膜(c)の形成態様を示す図である。格子状のポリマー脂質膜(b)に囲まれた領域（区画）にペプチドナノディスクを導入した。図４Ａはポリマー脂質膜(b)辺縁部（境界部）から流動性脂質膜(c)が形成される様子を蛍光顕微鏡で観察した結果を示し、図４Ｂは図４Ａの結果を120秒までの蛍光度で数値化した結果を示す。図４Ｃはポリマー脂質膜(b)との境界部（辺縁部）及びポリマー脂質膜(b)のない区画の中心部について、流動性脂質膜の伸展速度を測定した結果を示す。（実験例１） 区画内に再構成されたCy7標識ロドプシン（Cy7-NT-Rh）分子について、1分子蛍光追跡によって各分子の2次元拡散速度を測定した結果を示す図である。N ＝ 116での中央値は0.24 μm2s-1であった。（実験例２） 膜タンパク質(d)を含む人工生体膜に関し、Cy7-NT-Rh含有ペプチドナノディスク（Rh-ND）又は界面活性剤で処理したCy7-NT-Rhを用いた場合での流動性脂質膜(c)におけるCy7-NT-Rhの再構成を確認した結果を示す図である。図６Ａは、各々について蛍光顕微鏡で観察した結果を示し、図６ＢはCy7-NT-Rhの再構成を数値化した結果を示す。（比較例１）
　本発明は、膜タンパク質を含む人工生体膜に関し、より詳しくは基板表面に脂質膜が積層されてなる人工生体膜であって、前記積層される脂質膜がポリマー脂質膜と膜タンパク質を含む流動性脂質膜を含む脂質膜であることを特徴とする人工生体膜に関する。前記ポリマー脂質膜は、基板表面に部分的に積層されており、前記ポリマー脂質膜が積層されていない基板表面に、膜タンパク質を含む流動性脂質膜が積層されている。前記ポリマー脂質膜は、好ましくは光重合性脂質膜である。
　本明細書において「人工生体膜」とは、前記生体膜の基本物性を保持しつつ人工的に作製された生体膜をいう。生体膜は、脂質分子が表裏二層に並んだ二分子膜構造を有し、分子が側方拡散できるという基本物性（流動性）を保持する。本発明の人工生体膜は、支持体である基板表面上に作製された脂質二分子膜である。基板表面上の人工生体膜を支持脂質二分子膜（Supported Lipid Bilayer：SLB）ともいう。
　本発明の人工生体膜は、パターン化人工生体膜であるのが好適である。本明細書において、「パターン化人工生体膜」とは、流動性を有しないポリマー脂質膜が基板表面上にパターン化された形状で配置されており、ポリマー脂質膜が配置されていない基板表面上に流動性脂質膜が配置されている人工生体膜をいう。パターン化形成の方法については後述する。
　本明細書における「基板」は、生体膜が支持され、生体膜が物理的相互作用又は化学的結合で結合可能な固体であればよく、特に限定されない（図１、図２参照）。基板の材料としては例えばガラス、石英、プラスチック、セラミック、金属等が挙げられ、適宜選択することができる。好適には、ガラス、石英、高分子エラストマー、酸化シリコン等が挙げられる。高分子エラストマーとはゴム状の弾力性を有する工業用材料の総称をいい、具体的にはスチレン系、オレフィン系、塩ビ系、ウレタン系、アミド系等のエラストマーが挙げられる。より具体的には、例えばポリジメチルシロキサン（Polydimethylsiloxane: PDMS）のようなシリコンエラストマーが挙げられる。またその形状は平板であっても曲線状であってもよい。
　本明細書において「脂質膜」は、天然又は合成の起源に由来してよく、リン脂質、例えばホスファチジルコリンを有する脂質膜が挙げられる。前記脂質膜は二分子脂質膜であってもよいし、単分子脂質膜であってもよいが、特に好適には二分子脂質膜である（図１、図２参照）。
　本明細書において「ポリマー脂質膜」とは、生体膜と同等の膜構造を有するポリマー脂質膜であって、光重合性脂質膜であるのが好ましく、疑似生体膜であってもよい。光重合性脂質膜としては、光重合性基を少なくとも一つ有する脂質であればよく、特に限定されない。光重合性基としては、二重結合、三重結合、エポキシ塩、α、β-不飽和カルボニル基などが例示され、好ましくは二重結合又は三重結合である。光重合性基は、１つの脂質分子あたり1～10個、より好ましくは2～6個含まれる。具体的には、特許文献１に示すポリマー二分子構造からなる脂質膜が好適である。重合可能な脂質としては、リン脂質が例示され、具体的にはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンの１又は２のアシル基が光重合性基を少なくとも１個含む直鎖又は分岐状で、通常C6～C30好ましくはC6～C24、より好ましくはC12～C22の脂肪族のカルボン酸に由来する基であるのが好ましい。脂質は２つのアシル基を有するグリセロリン脂質が好ましいが、リン脂質のアシル基の１つが加水分解された、アシル基（光重合性基を有する） が１つのリン脂質を併用することも可能である。
　光重合性基と脂質モノマーの構造は特許文献１又は２を参照することができる。脂質膜に関し、光重合性脂質分子の親水性部位に化学反応性を持つ１級アミンなどの反応性基を導入することで、ポリマー脂質膜表面に生体関連分子を化学結合して生体機能を有する人工生体膜を作製することができる。光重合性リン脂質1,2-bis(10,12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphochorine（以下「DiynePC」）は、親水部が化学的に不活性なコリン基である。
　DiynePCにおいて、ジアセチレン基は炭化水素鎖のいずれの位置にあってもよく、例えばいずれかの末端側に存在していてもよい。ジアセチレン基は炭素数10～30、好ましくは14～28、より好ましくは18～26の脂肪酸に組み込まれ、この脂肪酸が２個グリセロール基とエステルを形成してジアセチレン基を持つ光重合性脂質となる。
　ジアセチレン基を持つ光重合性脂質のモノマーからなる脂質膜を基板表面に形成する場合、脂質分子が規則正しく配向した結晶状態を実現するため、基板の温度はジアセチレン基を持つ光重合性脂質のモノマーの相転移温度より5℃以上低くするのが好適である。例えば光重合性リン脂質DiynePCの脂質膜の相転移温度は38℃であるので、基板の温度は33℃以下が好適であり、10℃以下とするのがより好適である。相転移温度はジアセチレン基を持つ光重合性脂質により異なるため、脂質に応じて好ましい温度で用いられる。
　本明細書において「流動性脂質膜」とは、生体膜と同等の膜構造を有し、細胞膜と同様に流動性（分子側方拡散性）を有する脂質膜をいう。本明細書において「側方拡散性」とは、膜の性質として一般的に示される意味で用いられ、具体的には膜を構成する脂質分子が膜内を拡散運動する性質をいう。脂質二分子膜の中でリン脂質分子は共有結合をしていないため、さまざまな分子運動が可能である。脂質分子がその位置を入れかえる運動（diffusive motion）で、同一単分子層内を横方向に移動する運動を側方拡散運動という。細胞膜は細胞内外を単に隔てている静的な構造体ではなく、特異的なチャネルによってイオンなどの低分子を透過させたり、受容体を介して細胞外からのシグナルを受け取る機能、細胞膜の一部を取り込んで細胞内に輸送する機能など、細胞にとって重要な機能を担っている。また、親水性基板では物理的相互作用によって吸着した脂質膜と基板との間には水和層が存在するため、親水性基板上に形成される脂質分子も生体膜と同様に側方拡散することができる．
　本発明における「膜タンパク質」は、微生物から動物、植物に至るすべての細胞や細胞内小器官の生体膜に付着するタンパク質をいう。膜タンパク質は、内在性膜タンパク質と表在性膜タンパク質に分類される。さらに膜タンパク質は、膜に挿入される方向やシグナルペプチドの有無、タンパク質内の膜貫通ドメインの位置によって複数のタイプに分類される。膜タンパク質の機能としてイオン、栄養素など生命維持に必要な物質の運搬、ホルモン、光、熱、音などの感覚受容器といわれる細胞外情報の高感度センサーなどが挙げられる。膜タンパク質は具体的には、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）、イオンチャネル、膜結合型酵素、トランスポーターなどに分類される。GPCRの例として、ロドプシン様受容体（クラスA）、セクレチン様受容体（クラスB）、代謝型グルタミン酸受容体（クラスC）やFrizzled/Smoothened（クラスF）などの受容体群があり、具体的には、ロドプシン、アドレナリン受容体、ヒスタミンH1受容体、ヒスタミンH2受容体、セロトニン受容体、ドーパミン受容体等が挙げられる。その他の膜タンパク質としてシトクロムP450やATP合成酵素等が挙げられる。
　本発明の膜タンパク質を含む人工生体膜は、基板表面にポリマー脂質膜を部分的に積層し、前記ポリマー脂質膜が積層されていない基板表面に、膜タンパク質とともに流動性脂質膜を積層することで作製することができる。
　本発明の人工生体膜の作製において、ポリマー脂質膜と流動性脂質膜との配置は、光リソグラフィー技術を用いて任意に決定することができる。光重合性のポリマー脂質膜を、例えば特許文献２（特許第5532229号公報）に示す光重合法に従って基板上に付着させ、二分子構造からなる脂質膜を形成させることができる。光重合法に従って基板上に付着させ、二分子構造からなる脂質膜を形成させる場合において、前記吸着した重合性脂質（モノマー）の一部を光照射から保護し、光照射から保護されていない重合性脂質（モノマー）を光照射して重合させ、ポリマー脂質膜を形成させることができる。この場合に、光照射から保護する部位は任意に決定することができ、光照射する部位の形状をパターン化することができる。本明細書において「パターン化形成」とは、光照射する部位の形状をパターン化させることをいう。具体的には、例えば図１Ｂに示す格子状のパターンが挙げられるが、このような形状に限定されず目的に応じて任意に形状を決定することができる。重合されたポリマー脂質膜がパターン化形成されている膜タンパク質を含む人工生体膜は、例えば以下の方法により作製することができる。これにより、ポリマー脂質膜と流動性脂質膜を組み合わせたハイブリッド膜に、膜タンパク質を含む人工生体膜を基板上に作製することができる（図１Ｂ参照） 。
　本発明の膜タンパク質を含む人工生体膜は、具体的には以下の（1）～（4）の工程を含む方法により作製することができる。以下は図１Ｂ又は図２に示す記号に基づいてより具体的に説明する。
（1）基板(a)表面に重合性脂質（モノマー）の脂質膜を吸着させる工程。
（2）前記吸着した脂質膜の一部を光照射から保護し、光照射から保護されていない重合性脂質（モノマー）を光照射して重合させ、ポリマー脂質膜(b)を基板(a)表面にパターン化形成させる工程。
（3）前記（2）の工程で、光重合反応から保護された脂質膜を界面活性剤又は有機溶媒によって基板(a)表面から除去する工程。
（4）前記（3）の工程で、基板(a)表面から脂質膜が除去された部位に膜タンパク質(d)とともに流動性脂質膜(c)を積層する工程。
　上記（2）及び（3）の工程で、光重合性のポリマー脂質膜(b)を、例えば特許文献３（特許第5532229号公報）又は非特許文献４（Langmuir 2013 29 (8), 2722-2730）に示す光重合法に従って基板上に付着させ、二分子構造からなる脂質膜を任意にパターン化形成することができる。
　上記（4）の工程で、基板(a)表面に膜タンパク質(d)とともに流動性脂質膜(c)への積層は、膜タンパク質(d)を含む流動性脂質懸濁溶液を基板(a)表面に滴下することで達成される。この場合において、膜タンパク質(d)は、両親媒性ペプチドを含むナノディスクに含まれた状態で、流動性脂質懸濁溶液とともに滴下するのが好適である。
　本明細書における「両親媒性ペプチドを含むナノディスク」とは、両親媒性タンパク質（membrane scaffold protein：MSP）の代わりに両親媒性ペプチドを含む円盤状のナノ粒子をいう。両親媒性ペプチドを含むナノディスクとともに膜タンパク質(d)を取り扱うことで生体膜から分離した膜タンパク質(d)を安定的に使用可能である。しかしながら、前記両親媒性ペプチド囲まれた脂質ナノディスクを基板(a)表面上の脂質膜に再構成させた場合であっても、従来では膜タンパク質(d)は固定化されており、側方拡散性を有するものではなかったことは背景技術の欄にも示す通りである（非特許文献３～５）。
　ナノディスクに利用可能な両親媒性ペプチドを用いて、リン脂質リポソームを可溶化し、円盤状の集合体（ナノディスク）を形成することができる。リン脂質と両親媒性ペプチドのモル比が33：1 ～ 23：1の場合において、円盤状脂質二分子膜の縁がペプチドの疎水性側面によって被覆され、準安定状態のナノディスクを形成することができる。このようなナノディスクにロドプシン（Rh）等の膜タンパク質(d)を含めさせる場合は、界面活性剤で可溶化した膜タンパク質と、脂質、そして両親媒性ペプチドを混和し、その溶液から界面活性剤を除去することによって目的を達成することができる。本発明のナノディスクに含まれる両親媒性ペプチドのアミノ酸配列は、例えば以下の配列番号１で特定するアミノ酸配列が例示されるが、ナノディスクに利用可能な両親媒性ペプチドであればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されない。
A18ペプチド：DWLKAFYDKVAEKLKEAF（配列番号１）
　本発明における人工生体膜のパターン化形成の態様は図１を参照することができる。本発明の人工生体膜は、ポリマー脂質膜(b)により囲まれた区画（corrals）内に膜タンパク質(d)とともに流動性脂質膜(c)を積層することで作製される。膜タンパク質(d)の種類及び濃度は適宜変更することができる。
　本明細書における「両親媒性ペプチドを含むナノディスク」は、具体的には背景技術の欄で示す非特許文献３－５に示すナノディスクを使用することができる。本明細書において、前記両親媒性ペプチドを含むナノディスク（以下単に「ペプチドナノディスク」という。）に含まれた膜タンパク質(d)は、流動性脂質膜(c)とともに基板(a)表面に積層される。基板(a)表面へは、膜タンパク質(d)を含むペプチドナノディスク懸濁液と、膜タンパク質(d)を含まないペプチドナノディスク懸濁液を任意の比率で混合し、混合液を基板(a)表面へ滴下し、タンパク質組込流動性脂質膜(c)を形成させて積層することができる。この流動性脂質膜(c)はポリマー脂質膜(b)の辺縁部から伸展して形成される（図２、４参照）。これは基板(a)表面に予め形成されたポリマー脂質膜(b)が、流動性脂質膜(c)の再構成に重要な役割を果たしていることを示唆している。
　すなわち、基板(a)表面にポリマー脂質膜(b)がない場合には、ポリマー脂質膜(b)がある状態と比較して流動性脂質膜(c)の形成に時間を要し、その結果膜タンパク質(d)を含むナノディスクが基板(a)に固定化され、流動性が失われる。ポリマー脂質膜(b)の辺縁部から流動性脂質膜(c)が伸展して形成されることで、膜タンパク質(d)の流動性が保持され、側方拡散性も保持される。
　本発明において作製された膜タンパク質(d)を含む人工生体膜は、ポリマー脂質膜(b)のパターン化形成により流動性脂質膜(c)を区画に分別することができる。区画ごとに分別された流動性脂質膜(c)に任意に膜タンパク質(d)の種類や濃度（密度）を変えて配置することができる。さらに膜タンパク質(d)の種類を複数種組み合わせて導入することもできる。前記導入した膜タンパク質(d)を標的とする物質について相互作用を計測することもできる。かかる人工生体膜を用いることで膜タンパク質(d)の機能を解析したり、膜タンパク質(d)を標的とする物質の評価を行うことができる。膜タンパク質(d)を標的とする物質としては、前記膜タンパク質(d)と相互作用しうる物質であればよく特に限定されないが、例えば医薬品等の薬剤、食品に含まれる成分、生体内のバイオマーカー等が挙げられる。従来は、人工生体膜に含まれる膜タンパク質は側方拡散性が保持されていなかったため、当該膜タンパク質の機能が人工生体膜上で十分に反映されているとはいえなかったが、本発明の膜タンパク質を含む人工生体膜を用いることで、in vitroの系で、膜タンパク質の機能解析や膜タンパク質を標的とする物質の評価を行うことができる。本発明は本発明の人工生体膜を用いることによる膜タンパク質機能の解析方法や、膜タンパク質を標的とする物質の評価方法にも及ぶ。
　本発明は、前記人工生体膜を含む膜タンパク質(d)に係る検査用デバイスにも及ぶ。検査用デバイスは、基板(a)表面に脂質膜が積層されてなる人工生体膜であって、前記積層される脂質膜がポリマー脂質膜(b)と膜タンパク質(d)を含む流動性脂質膜(c)を含み、前記膜タンパク質(d)が側方拡散性を保持した状態であることを特徴とする人工生体膜そのものであってもよいし、さらに前記人工生体膜を持ち運びや測定機器に適用可能なようにトレーなどに設置したものであってもよい。ここにおいて、「膜タンパク質(d)に係る検査」とは、膜タンパク質(d)の機能解析や膜タンパク質(d)を標的とする物質の評価に係る検査を意味する。膜タンパク質(d)に係る検査用デバイスには、前記の如く、ポリマー脂質膜(b)のパターン化形成により流動性脂質膜(c)を区画に分別することができる。区画ごとに分別された流動性脂質膜(c)に任意に膜タンパク質(d)の種類や濃度（密度）を変えて配置することができる。さらに膜タンパク質(d)の種類を複数種組み合わせて導入することもできる。これにより検査の目的に応じて、パターンの形状、膜タンパク質の種類、膜タンパク質の濃度等を適宜カスタマイズした検査用デバイスを提供することができる。
　本発明は、膜タンパク質(d)に係る検査用デバイスを少なくとも含み、さらに膜タンパク質(d)の検査に必要な試薬及び／又は器具を含む、膜タンパク質(d)に係る検査用キットにも及ぶ。ここにおいて、「膜タンパク質(d)の検査に必要な試薬」とは、例えば補酵素など膜タンパク質の機能に必要な水溶性試薬、検体希釈用バッファー試薬、検査用マーカー試薬等が挙げられるが、これらに限定されずキットとして使用可能なあらゆる試薬が挙げられる。また、「膜タンパク質(d)の検査に必要な器具」とは、例えば検査用デバイスに検体や試薬などを導入し溶液交換を行うための器具、測定を行うための器具、検査用デバイスを保護するための器具等が挙げられるが、これらに限定されずキットとして使用可能なあらゆる器具が挙げられる。
　本発明の理解を深めるために、図面に記載の内容を参照しつつ、実施例、実験例及び比較例を示して本発明の内容をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。
（実施例１）膜タンパク質(d)を含むパターン化人工生体膜の作製
　本実施例では、膜タンパク質(d)を含むパターン化人工生体膜の作製方法を説明する。脂質二分子膜は、ポリマー脂質膜(b)をベシクル融合法により基板(a)表面に固定化して調製した。本実施例では、基板(a)としてガラス基板を用い、膜タンパク質(d)としてロドプシン（Rh）を用いた。
１－１．ポリマー脂質膜(b)の調製
　光重合性脂質（DiynePC）10 mgに最終濃度が3 mMになるように超純水を加え、さらにベシクルの融合を促進させるために界面活性剤（DHPC-C6）溶液（0.15 mM）を添加して混合し、DiynePC懸濁液を調製した。前記DiynePC懸濁液を液体窒素で凍結し、60℃で融解し、これを5回繰り返した。凍結融解後、超音波ホモジナイザー（Branson Sonifier(R) 150, Emerson）を用いて、60℃、出力設定3 W、30秒ずつ2回ホモジナイズした。氷上で洗浄した基板(a)上に、前記作製したDiynePC懸濁液を堆積させ、単量体二分子膜を直ちに冷却した。
　前記基板(a)表面に付着したDiynePC脂質二分子膜を純水中に保持した。脂質二分子膜の光重合を行うにあたり、溶液中の酸素を除くために不活性ガス（アルゴン又は窒素）をパージした水溶液をポンプにより循環した。充分に脱気した後に、DiynePC脂質二分子膜が積層した基板(a)を、波長300 nm以下の波長に強い輝線を持つ深紫外光露光ランプ（USHIO SP-9, Ushio）を用いて紫外光照射を行った。その際、干渉フィルター又はレーザー用干渉ミラーを用いて光化学反応に最も有効である波長250 nm付近の光を選択的に照射した。また、特定のパターンを転写するためには、基板(a)に積層した脂質二分子膜の面が上面になるようにして水平に置き、その上に遮光するためのマスクをのせた（図１Ｂ参照）。光照射後、界面活性剤溶液（Sodium Dodecyl Sulfate：SDS、100 mM）にて30分30℃湯浴を行い、その後純水で10回洗浄した。これにより、光照射された部位の脂質二分子膜は、基板(a)表面にポリマー脂質膜(b)として積層され、光照射されなかった部位では洗浄除去され、ポリマー脂質膜(b)についてパターン化形成された（図１Ｂ、Ｃ参照）。
光重合に好適な条件の例
温度 ： 0℃～4℃（氷浴）
照射波長：深紫外光露光ランプ（USHIO SP-9, Ushio）、300 nm以下
照射光強度： 160 mW/cm2（254 nm）
照射時間： 100 秒
照射光量： 照射光量 16.0 J/cm2
１－２．ロドプシン（Rh）を含むペプチドナノディスク（Cy7-Rh-ND）の調製
　ロドプシン（以下、単に「Rh」ともいう）を含む流動性脂質膜(c)の形成に必要な脂質ナノディスク（Cy7-Rh-ND）を以下の方法で調製した。Rhは、ウシガエル視細胞より取得した。視細胞外節膜（タンパク質の90%以上はRh）を低張処理してRh以外のタンパク質を除き、10 mM過ヨウ素酸処理によってRhのN末糖鎖を酸化した。酸化糖鎖にCy7-hydrazideを反応させ、Rhを蛍光標識した。蛍光標識Rh（Cy7-NT-Rh）を含む外節膜を0.1 %アゾレクチン共存下50 mM オクチルグルコシドで可溶化した。Cy7-NT-Rhは２段階のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）（Superose(R) 12 3.2×300, Pharmacia; 0.1 %アゾレクチンと50 mMオクチルグルコシドを含むバッファーで平衡化）で精製した。パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（POPC：1mM）70μg、蛍光脂質（NBD-PE）0.3μg、及び両親媒性ペプチド（A18ペプチド：配列番号１）0.1 mg をメタノール中で混合し、小型褐色瓶内でアルゴン及び真空により乾燥してペプチド脂質フィルムを作製した。ペプチド脂質フィルムに50 mMオクチルグルコシドと0.1% アゾレクチンを含むバッファー A（100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl pH7.5）を100μl添加し、アルゴン環境下においてボルテックスと超音波処理を施して溶解した。この溶液に50μgの可溶化Cy7-NT-Rh（50μl）を加え、室温で30分インキュベーション後、0.22μmのフィルターにより凝集体を除去し、SEC（Superdex(R) 200 2/300, Pharmacia）によりCy7-NT-Rhナノディスク（Cy7-Rh-ND）とRhを含まないペプチドナノディスク（Empty-ND）を分離精製した（図３Ａ）。
１－３．流動性脂質膜(c)の形成に必要な脂質ナノディスク（Lipid-ND）の調製
　流動性脂質膜(c)を積層するための脂質ナノディスク（Lipid-ND）懸濁溶液を次の方法で調製した。POPC（1 mg）、蛍光脂質（NBD-PE）(1 mol%)からなる脂質懸濁溶液（POPC (1 mM), NBD-PE (1 mol%)）をクロロホルムに溶かし、小型褐色瓶に入れ、N2ガスを吹き付けて15分間クロロホルムを乾燥させた。Rhにバッファー Aを0.5 ml加え、簡単な超音波処理後37℃で一晩静置した。この操作で脂質のみを内包する脂質ナノディスクが形成される。過剰なペプチドを除く目的でSEC（Superdex(R) 200 10×300, Pharmacia）による脂質ナノディスクの精製を行った（図３Ｂ）。
１－４．Rhを含むパターン化人工生体膜の調製
　前記１－２で調製したCy7-Rh-NDと１－３で調製したLipid-NDの混合物を、前記１－１で作製したパターン化ポリマー脂質膜(b)で囲まれた区画（corrals）内の基板(a)表面に滴下してSLB（流動性脂質膜(c)）を自発形成させた（図１Ｂ、図２参照）。滴下後120秒で流動性脂質膜(c)が形成された（図４Ａ）。
　Cy7-Rh-NDと、Lipid-NDを60：1の比率で混合し、パターン化ポリマー脂質膜(b)を搭載した基板(a)に添加した。15分間、25℃でインキュベーションした後、バッファー Aで溶液交換して基板(a)表面に吸着しなかった余剰のペプチドナノディスクを除去した。さらに、溶液を蛍光色素の褪色防止に適した顕微鏡観察用酸素除去バッファー（グルコース(4.5 mg/ml)、グルコースオキシダーゼ (216μg/ml)、カタラーゼ (36μg/ml)を含む擬似生理食塩水（ポタシウムグルコネート (98.7 mM)、KCl (2.5 mM)、塩化マグネシウム (1 mM)、HEPES (10 mM)）に交換し、倒立蛍光顕微鏡（Olympus IX73, Olympus）でパターン化人工生体膜中のCy7-NT-Rhを蛍光一分子観察した。ポリマー脂質膜(b)と、流動性脂質膜(c)及びCy7-NT-Rをそれぞれ異なる波長で励起して蛍光を観察した（図４、５参照）。流動性脂質膜(c)は、NBD-PEを励起波長470-495 nm、蛍光波長510-550 nmで観察した。Cy7-NT-Rhは、励起波長750 nm、蛍光波長780-840 nmで観察した。
（実験例１）流動性脂質膜の形成態様の確認
　実施例１で作製した流動性脂質膜(c)の形成態様を確認した。流動性脂質膜(c)はポリマー脂質膜(b)辺縁部から形成され伸長した。ポリマー脂質膜(b)とポリマー脂質膜(b)との境界部及び区画内の中心部の蛍光度を測定した。図４Ａに示す各パターンの右下区画断面に沿った蛍光強度の時間推移を確認した結果、120秒までの短い時間の経過とともに膜形成が促進していることが確認された（図４Ｂ）。各境界部及び中心部について膜形成速度を比較した結果、境界部での膜形成速度が速いことが確認された（図４Ｃ）。これらの結果からも、基板(a)表面に形成されたポリマー脂質膜(b)が、流動性脂質膜(c)内の膜タンパク質(d)の再構成に重要な役割を果たしていることを示唆している。
（実験例２）再構成されたCy7-NT-Rh分子の側方拡散性
　区画内に再構成されたCy7-NT-Rh分子は、ほぼすべてが側方拡散していることが観察された。1分子蛍光追跡によって各分子の2次元拡散速度を決定すると、図５に示される分布となり中央値は0.24 μm2s-1となった（N ＝ 116）。この拡散速度は、非特許文献２に示す急速希釈法により作製した界面活性剤で処理したRh含有パターン化人工生体膜とほぼ同等であった。
（比較例１）ペプチドナノディスクによる膜タンパク質組込と界面活性剤の急速希釈による膜タンパク質組込の比較
　実施例１と同手法で作製したCy7-NT-Rh含有ペプチドナノディスク（Rh-ND）又は界面活性剤（オクチルグルコシド：OG）で処理したCy7-NT-Rhを含む流動性脂質膜(c)におけるRhの再構成について確認した。また、再構成されたRhの側方拡散性についても確認した。
　本比較例で使用する流動性脂質膜(c)を積層するための脂質懸濁溶液を次の方法で調製した。パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（POPC：1mM)、蛍光脂質（NBD-PE： [N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl)-1, 2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt）(1 mol%)からなる脂質懸濁溶液（POPC (1 mM), NBD-PE (1 mol%)）をクロロホルムに溶かし、丸底フラスコに入れ、N2ガスを吹き付けて、15分間クロロホルムを乾燥させた。さらに真空乾燥を4時間行い、丸底フラスコの底に脂質フィルム（脂質二分子膜が多数積層したもの）を調製した。前記脂質フィルムを含む丸底フラスコにリン酸緩衝液（PBS）を入れ、一晩静置することで脂質フィルムを膨潤させ脂質膜懸濁液を作製した。
・界面活性剤（OG）で処理したRh含有パターン化人工生体膜の調製
　急速希釈法により、Cy7-NT-Rh含有パターン化人工生体膜を調製した。上記調製した脂質懸濁溶液（POPC (1mM), NBD-PE (1 mol%)）を、超音波ホモジナイザー（Branson Sonifier(R) 150, Emerson）を用いて、60℃、出力設定3 W、30秒ずつ3回ホモジナイズした。前記実施例１の１－１で作製したパターン化ポリマー脂質膜(b)のうち、光照射されずにポリマー脂質が除去された部位に、前記作製した脂質懸濁溶液を滴下してSLBを自発形成させた（図１Ｂ、図２参照）。前記実施例１の１－２と同手法で作製したCy7-NT-Rhについて OG（50 mM）で可溶化し、最終濃度 3 mM以下になるように前記SLB上部の水相に添加し、水相を攪拌しながら25℃で10分間インキュベーションし、急速希釈した。前記SLBに再構成されなかったCy7-NT-Rhは、バッファー Aでリンスして除去した。
（比較実験結果）
　実施例１で調製したナノディスクで処理したRhを含むパターン化人工生体膜（Nanodisc）と、界面活性剤（OG）で処理したRh含有パターン化人工生体膜（OG）について蛍光顕微鏡画像により比較した。Nanodiscの方が界面活性剤（OG）を用いた場合よりも、区画内（corrals）に多くのCy7-NT-Rh分子の再構成を確認した（図６Ａ） 。区画内（corrals）とポリマー脂質膜(b)部位（Polymer）の蛍光強度を比較した結果、Nanodiscの方が界面活性剤（OG）を用いた場合よりも区画内へのCy7-NT-Rh分子の導入量は約35倍に増加し、ポリマー脂質膜への非特異的吸着量は、約0.6倍に減少したことが確認された（図６Ｂ）。
　界面活性剤を用いて可溶化した膜タンパク質を人工生体膜に導入する場合、（１）導入効率が低い（膜タンパク質密度が低い）、（２）固定化した（側方拡散性を有しない）膜タンパク質の割合が高い、（３）界面活性剤の作用により、膜に欠損や変形が生じる可能性がある、（４）ポリマー脂質膜表面に膜タンパク質が非特異的に吸着する（図６Ｂ）、（５）界面活性剤を希釈する際に、膜タンパク質が凝集して活性を失う可能性がある等の問題がある。
　一方、本発明の方法で作製した膜タンパク質を含むパターン化人工生体膜は、膜タンパク質の導入効率が高く（膜タンパク質密度が高い）、安定的に側方拡散性を有し、ポリマー脂質膜表面への膜タンパク質が非特異的吸着の程度が低い点で優れている。さらに本発明の膜タンパク質を含むパターン化人工生体膜は、製造工程で界面活性等を除去するため、膜への欠損や変形、膜タンパク質の凝集等の悪影響も軽減化される。上記により、本発明のナノディスクで処理した膜タンパク質含有パターン化人工生体膜は界面活性剤で処理した膜タンパク質含有パターン化人工生体膜に比べて優れていることが確認された。
　以上詳述したように、本発明の膜タンパク質を含む人工生体膜で再構成された膜タンパク質は側方拡散性を保持し、本発明の人工生体膜は生体膜と同等の機能を有する。さらに本発明の膜タンパク質を含む人工生体膜の作製方法によれば、ポリマー脂質膜のパターン化により流動性脂質膜を区画に分別することができ、区画ごとに膜タンパク質の種類や濃度（密度）を変えた流動性脂質膜を目的に応じて適宜配置することができる。
　膜タンパク質は生体内で非常に重要な役割を果たし、医薬品等の主要標的分子でもあるが、脂質膜に組み込まれた状態でのみ正しい構造、機能を持つため、in vitroの系で十分な機能解析を行うことは困難であった。本発明の膜タンパク質を含む人工生体膜を、例えば検査用デバイスやキットに利用して用いることで、in vitroの系で、目的に応じて条件を整え、膜タンパク質の機能解析や膜タンパク質を標的とする物質、例えば医薬品等の薬剤、食品、膜タンパク質と相互作用しうる可能性のあるあらゆる物質について評価を行うことができる。これにより、従来はin vivoの系でしか評価できず、またヒト以外の動物を用いなければ評価が困難であったのに対し、ヒトの系で、条件を変えて簡便に評価することが可能となり、経済的にも十分に産業上の利用可能性が期待できる。

Claims (14)

  1. 基板(a)表面にポリマー脂質膜(b)を部分的に積層し、前記ポリマー脂質膜(b)が積層されていない基板(a)表面に、両親媒性ペプチドを含むナノディスクに含まれた膜タンパク質(d)とともに流動性脂質膜(c)を積層する工程を含み、前記膜タンパク質(d)が側方拡散性を保持した状態で再構成されていることを特徴とする人工生体膜の作製方法。
  2. 基板(a)表面にポリマー脂質膜(b)を部分的に積層する工程が、基板(a)表面に重合性脂質（モノマー）の脂質膜を吸着し、光重合によりポリマー脂質膜(b)を形成させることによる、請求項１に記載の人工生体膜の作製方法。
  3. 以下の（1）～（4）の工程を含む、請求項１又は２に記載の人工生体膜の作製方法：
    （1）基板(a)表面に重合性脂質（モノマー）の脂質膜を吸着させる工程；
    （2）前記吸着した脂質膜の一部を光照射から保護し、光照射から保護されていない重合性脂質（モノマー）を光照射して重合させ、ポリマー脂質膜(b)を基板(a)表面にパターン化形成させる工程；
    （3）前記（2）の工程で、光重合反応から保護された脂質膜を界面活性剤又は有機溶媒によって基板(a)表面から除去する工程；
    （4）前記（3）の工程で、基板(a)表面から脂質膜が除去された部位に膜タンパク質(d)とともに流動性脂質膜(c)を積層する工程。
  4. 基板(a)表面に脂質膜が積層されてなる人工生体膜であって、前記積層される脂質膜がポリマー脂質膜(b)と膜タンパク質(d)を含む流動性脂質膜(c)を含み、前記膜タンパク質(d)が側方拡散性を保持した状態であることを特徴とする人工生体膜。
  5. 前記ポリマー脂質膜(b)が、基板(a)表面に部分的に積層されており、前記ポリマー脂質膜(b)が積層されていない基板(a)表面に、膜タンパク質(d)を含む流動性脂質膜(c)が積層されていることを特徴とする、請求項４に記載の人工生体膜。
  6. 前記ポリマー脂質膜(b)が、光重合性脂質膜である請求項４又は５に記載の人工生体膜。
  7. 前記ポリマー脂質膜(b)がパターン化形成されて基板(a)表面に積層されており、前記ポリマー脂質膜(b)が積層されていない基板(a)表面に、膜タンパク質(d)を含む流動性脂質膜(c)が積層されていることを特徴とする請求項４～６のいずれかに記載の人工生体膜。
  8. 請求項１～３のいずれかに記載の作製方法で作製されており、膜タンパク質(d)が側方拡散性を保持した状態で再構成されていることを特徴とする基板(a)表面に脂質膜が積層されてなる人工生体膜。
  9. 膜タンパク質(d)が、１種又は２種以上の膜タンパク質である請求項４～８のいずれかに記載の人工生体膜。
  10. 膜タンパク質(d)の少なくとも１種が、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）に分類されるタンパク質である請求項９に記載の人工生体膜。
  11. 請求項４～１０のいずれかに記載の人工生体膜を用いることを特徴とする、膜タンパク質(d)機能の解析方法。
  12. 請求項４～１０のいずれかに記載の人工生体膜を用いることを特徴とする、膜タンパク質(d)を標的とする物質の評価方法。
  13. 請求項４～１０のいずれかに記載の人工生体膜を含む膜タンパク質(d)に係る検査用デバイス。
  14. 請求項１３に記載の検査用デバイスを少なくとも含み、さらに膜タンパク質(d)の検査に必要な試薬及び／又は器具を含む、膜タンパク質(d)に係る検査用キット。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005099889A1 (ja) * 2004-04-07 2005-10-27 Keio University リポソームを鋳型とする中空ナノ粒子の作製方法
JP2006506642A (ja) * 2002-11-20 2006-02-23 コーニング インコーポレイテッド 生体膜アレイのための安定した表面化学性質を有する基体およびその製造方法
JP4150793B2 (ja) * 2003-03-27 2008-09-17 独立行政法人産業技術総合研究所 光重合性脂質膜による膜内分子の水平拡散制御
EP2732814A1 (en) * 2012-11-16 2014-05-21 Paul Scherrer Institut Integrating reconstituted membrane proteins into free-standing planar lipid bilayers
JP5532229B2 (ja) * 2010-04-20 2014-06-25 独立行政法人産業技術総合研究所 ポリマー脂質二分子膜を用いた機能性基板
JP2016125946A (ja) * 2015-01-06 2016-07-11 国立大学法人神戸大学 ナノギャップ構造型基板
JP2017037029A (ja) * 2015-08-12 2017-02-16 日本電信電話株式会社 生体分子移動度制御方法および電気泳動槽
JP2018059786A (ja) * 2016-10-04 2018-04-12 住友化学株式会社 嗅覚受容体複合体を用いた標的物質の検出装置及び検出方法並びに該検出装置の製造方法
JP2019216660A (ja) * 2018-06-20 2019-12-26 日本電信電話株式会社 脂質二重膜基板におけるリンカー層の制御方法、並びに、脂質二重膜基板及びその製造方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006506642A (ja) * 2002-11-20 2006-02-23 コーニング インコーポレイテッド 生体膜アレイのための安定した表面化学性質を有する基体およびその製造方法
JP4150793B2 (ja) * 2003-03-27 2008-09-17 独立行政法人産業技術総合研究所 光重合性脂質膜による膜内分子の水平拡散制御
WO2005099889A1 (ja) * 2004-04-07 2005-10-27 Keio University リポソームを鋳型とする中空ナノ粒子の作製方法
JP5532229B2 (ja) * 2010-04-20 2014-06-25 独立行政法人産業技術総合研究所 ポリマー脂質二分子膜を用いた機能性基板
EP2732814A1 (en) * 2012-11-16 2014-05-21 Paul Scherrer Institut Integrating reconstituted membrane proteins into free-standing planar lipid bilayers
JP2016125946A (ja) * 2015-01-06 2016-07-11 国立大学法人神戸大学 ナノギャップ構造型基板
JP2017037029A (ja) * 2015-08-12 2017-02-16 日本電信電話株式会社 生体分子移動度制御方法および電気泳動槽
JP2018059786A (ja) * 2016-10-04 2018-04-12 住友化学株式会社 嗅覚受容体複合体を用いた標的物質の検出装置及び検出方法並びに該検出装置の製造方法
JP2019216660A (ja) * 2018-06-20 2019-12-26 日本電信電話株式会社 脂質二重膜基板におけるリンカー層の制御方法、並びに、脂質二重膜基板及びその製造方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
(NAGAI, RURIKA: "パターン化人工膜への膜タンパク質の再構成. Reconstitution of Membrane Proteins into a Model Biological Membrane. Technical Meeting on Optical and Quantum Devices", TECHNICAL MEETING ON OPTICAL AND QUANTUM DEVICES, no. OQD-20-001-008, 8 January 2020 (2020-01-08), pages 29 - 31 *
LUCHINI ALESSANDRA, TIDEMAND FREDERIK GRØNBÆK, JOHANSEN NICOLAI TIDEMAND, CAMPANA MARIO, SOTRES JAVIER, PLOUG MICHAEL, CÁRDENAS MA: "Peptide Disc Mediated Control of Membrane Protein Orientation in Supported Lipid Bilayers for Surface-Sensitive Investigations", ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 92, no. 1, 7 January 2020 (2020-01-07), US , pages 1081 - 1088, XP093057747, ISSN: 0003-2700, DOI: 10.1021/acs.analchem.9b04125 *
LUCHINI ALESSANDRA; SEBASTIANI FEDERICA; TIDEMAND FREDERIK GRøNBæK; BATCHU KRISHNA CHAITHANYA; CAMPANA MARIO; FRAGNETO G: "Peptide discs as precursors of biologically relevant supported lipid bilayers", JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE, ACADEMIC PRESS,INC., US, vol. 585, 26 November 2020 (2020-11-26), US , pages 376 - 385, XP086421329, ISSN: 0021-9797, DOI: 10.1016/j.jcis.2020.11.086 *
MIDTGAARD SØREN ROI, PEDERSEN MARTIN CRAMER, KIRKENSGAARD JACOB JUDAS KAIN, SØRENSEN KASPER KILDEGAARD, MORTENSEN KELL, JENSEN KNU: "Self-assembling peptides form nanodiscs that stabilize membrane proteins", SOFT MATTER, ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY, GB, vol. 10, no. 5, 1 January 2014 (2014-01-01), GB , pages 738 - 752, XP055891132, ISSN: 1744-683X, DOI: 10.1039/C3SM51727F *
MORIGAKI KENICHI: "パターン化人工膜を用いた生体膜機能の解析. Patterned Model Membrane for the Functional Studies of the Biological Membrane", SEIBUTSU BUTSURI, BIOPHYSICAL SOCIETY OF JAPAN, TOKYO, JP, vol. 59, no. 4, 8 February 2019 (2019-02-08), JP , pages 188 - 191, XP093057721, ISSN: 0582-4052, DOI: 10.2142/biophys.59.188 *
OKAZAKI TAKASHI, INABA TAKEHIKO, TATSU YOSHIRO, TERO RYUGO, URISU TSUNEO, MORIGAKI KENICHI: "Polymerized Lipid Bilayers on a Solid Substrate: Morphologies and Obstruction of Lateral Diffusion", LANGMUIR, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 25, no. 1, 6 January 2009 (2009-01-06), US , pages 345 - 351, XP093057751, ISSN: 0743-7463, DOI: 10.1021/la802670t *
RESEARCH INSTITUTE FOR CELL ENGINEERING: "集積化された人工生体膜チップの作製方法 生体膜機能の高精度•高効率解析を目指して. Manufacturing method of integrated artificial biofilm chip, Aiming at the high-precision and high-efficiency analysis of biofilm function", TODAY / セルエンジニアリング研究部門, vol. 9, no. 3, 2 March 2009 (2009-03-02), pages 20, XP093057726 *
TANIMOTO YASUSHI; OKADA KEISUKE; HAYASHI FUMIO; MORIGAKI KENICHI: "Evaluating the Raftophilicity of Rhodopsin Photoreceptor in a Patterned Model Membrane", BIOPHYSICAL JOURNAL, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 109, no. 11, 1 December 2015 (2015-12-01), AMSTERDAM, NL, pages 2307 - 2316, XP029326896, ISSN: 0006-3495, DOI: 10.1016/j.bpj.2015.10.015 *

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