WO2023063400A1 - プロテアソーム機能減弱トランスジェニック非ヒト動物 - Google Patents

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WO2023063400A1
WO2023063400A1 PCT/JP2022/038287 JP2022038287W WO2023063400A1 WO 2023063400 A1 WO2023063400 A1 WO 2023063400A1 JP 2022038287 W JP2022038287 W JP 2022038287W WO 2023063400 A1 WO2023063400 A1 WO 2023063400A1
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proteostasis
transgenic non
protein
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泰 佐伯
光 土屋
さや香 安田
愛 相馬
浩志 設楽
啓二 田中
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to transgenic non-human animals, etc., in which proteasome functions are attenuated.
  • proteasome plays an essential role not only in maintaining intracellular protein homeostasis but also in regulating various cellular functions such as gene expression, stress response, and signal transduction. play. Therefore, proteasome dysfunction is thought to cause various pathological conditions such as cancer, neurodegenerative diseases, and autoimmune diseases.
  • proteasome is essential for the survival of all cells, conventional analysis methods such as conditional knockout mice are not very useful, and proteasome research at the individual level lags far behind. Therefore, many unclear points remain regarding the molecular mechanism by which the decline in proteasome function causes diseases.
  • the development of inhibitors targeting the ubiquitin-proteasome pathway is being actively pursued, but there is a problem that there is no model for evaluating drug efficacy at the individual level.
  • proteasome-related disease (proteasomopathy) model animals and proteasome activator efficacy evaluation model animals transgenic non-human animals that can analyze the evaluation of proteasome function and activity at the individual level, and furthermore, Development of transgenic non-human animals that can contribute to drug development targeting the ubiquitin-proteasome system has been desired.
  • the present invention has been made in view of the above situation, and for example, the following screening methods for transgenic non-human animals, proteostasis abnormalities, and therapeutic or preventive agents for diseases, symptoms, or conditions caused by such abnormalities: , and pharmaceutical compositions for the treatment or prevention thereof.
  • a transgenic non-human animal with attenuated proteasome function (2) The transgenic non-human animal according to (1) above, wherein the attenuation of the function is attenuation of systemic proteasome function.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 6 or 8 and having attenuated proteasome function.
  • the model animal is a model animal for a disease, symptom or condition caused by abnormal proteostasis.
  • the disease, symptom or condition caused by proteostasis abnormality is at least one selected from the group consisting of growth retardation, renal dysfunction, liver dysfunction, diaphragmatic hernia and cerebellar abnormality, according to (12) above.
  • a transgenic non-human animal as described.
  • Treatment of abnormal proteostasis comprising the steps of administering a candidate substance to the transgenic non-human animal according to (11) above, and evaluating abnormal proteostasis in the non-human animal after administration of the candidate substance. Or screening methods for prophylactic drugs.
  • a screening method for a therapeutic or prophylactic agent for a disease, symptom or condition caused by abnormal proteostasis including (16) The disease, symptom or condition caused by proteostasis abnormality is at least one selected from the group consisting of growth retardation, renal dysfunction, liver dysfunction, diaphragmatic hernia and cerebellar abnormality, according to (15) above. Screening method described.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing abnormal proteostasis containing a therapeutic or preventive drug obtained by the screening method described in (14) above.
  • a method for treating or preventing proteostasis abnormality which comprises administering the pharmaceutical composition according to (17) above to a patient who has or is likely to have proteostasis abnormality.
  • FIG. 1 A diagram showing the three-dimensional structure of the proteasome.
  • the 26S proteasome is composed of a catalytic subunit (CP: core particle: 20S proteasome) and a catalytic subunit (RP: regulatory particle: 19S complex). RPs are subdivided into lids and bases. The assembly of two 19S complexes is called 30S proteasome.
  • FIG. 2 A diagram showing the analysis results of the produced proteasome-mutant mice.
  • (A) Targeting Psmd12 last exon (exon11), gRNA and Cas9 protein were injected into fertilized eggs, and the cells obtained from the tail of the resulting F0 mouse were primary cultured, and the expression of the mutant PSMD12 protein was expressed by Western blot.
  • FIG. 1 shows the genome sequence of a Psmd12 heterozygous mutant mouse. It is the result of analyzing the genome sequence near the mutation of the wild-type (WT) mouse and three strains of Psmd12 mutant mice (#17, #53, #36) that were successfully established.
  • C shows the amino acid sequence of a Psmd12 heterozygous mutant mouse. Amino acid sequences near the mutations of WT mice and three strains of Psmd12 mutant mice (#17, #53, #36) that were successfully established are shown. WT amino acids and their homologous amino acids are highlighted in blue.
  • FIG. 1 shows the genome sequence of a Psmd12 heterozygous mutant mouse. It is the result of analyzing the genome sequence near the mutation of the wild-type (WT) mouse and three strains of Psmd12 mutant mice (#17, #53, #36) that were successfully established.
  • FIG. 3 shows the results of measuring proteasome activity in proteasome-mutant mice.
  • A Cell extracts were prepared from MEFs (Mouse Embryonic Fibroblast) derived from wild-type (WT) or Psmd12 heterozygous mutant mice, and after separation by Native-PAGE, proteasome peptidic fluorescent substrates were used. One Suc-LLVY-AMC was used to assess the chymotrypsin-like activity of 20S, 26S, 30S proteasomes in gels.
  • B Brain and liver extracts from WT mice and #17 Psmd12 mutant mice were extracted, and proteasome activity was evaluated in the same manner as in (A) above.
  • FIG. 4 A diagram showing the measurement results of examining the growth of proteasome-mutant mice.
  • A Growth curves from 1 to 12 weeks of age. Wild-type (WT) mice and 3 strains of Psmd12 mutant mice (#17, #53, #36) that were successfully lined were weighed from 1 week to 12 weeks after birth (mean ⁇ SD, test Methods: Welch's t-test, * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01).
  • FIG. 5 A diagram showing the results of histological analysis of proteasome-mutant mice.
  • FIG. 6 A diagram showing the results of comprehensive analysis of the phenotypes of proteasome-mutant mice. Specifically, among the visual inspections (56 items), the analysis results regarding head morphology abnormalities and movement delay are shown in FIG. As a blood biochemical test, the analysis results regarding liver function deterioration (analysis results using LDH and AST as indicators) are shown in FIG. FIG.
  • FIG. 7 shows the results of comprehensive analysis of the phenotypes of proteasome-mutant mice. Specifically, as a blood biochemical test, the analysis results on renal function deterioration (analysis results with creatinine and urea as indicators) are shown in FIG. 7(B) shows the analysis result of . In addition, FIG. 7(C) shows the details of the tested individuals/groups.
  • the ubiquitin-proteasome system is a major intracellular proteolytic system that selectively degrades ubiquitinated proteins.
  • Proteasome is a proteolytic enzyme complex composed of 33 different subunits, 20S proteasome (CP: core particle) having protease activity and 19S complex (RP: regulatory particle), one or two It has an associated structure (see Figure 1).
  • the proteasome is responsible for about 70% of intracellular protein degradation, and regulates all cellular functions such as cell cycle progression, transcriptional regulation, signal transduction, immune response, and maintenance of protein homeostasis through degradation of ubiquitinated substrates.
  • proteasome function is disrupted due to aging or stress, normal protein degradation does not occur, causing accumulation of abnormal proteins and disruption of signal transduction, leading to various diseases such as neurodegenerative diseases, autoimmune diseases, and cancer. It is believed that. Therefore, accurate understanding of the UPS control mechanism is expected to lead to understanding of disease development caused by UPS dysfunction.
  • the proteasome is essential for cell survival, analysis of knockout mice is not very effective. With regard to this, pathophysiological analysis at the individual level lags far behind.
  • mutations in the proteasome gene missense mutations in the ⁇ 5i (PSMB8) gene, one of the subunits constituting the immune-type proteasome, which is a subtype of the 20S proteasome, is a hereditary autoimmune disease peculiar to Japan, Nakajo-Nishimura. It has been reported to cause a syndrome (designated intractable disease 268) (see Non-Patent Documents 2 and 3 cited above).
  • the present inventor developed a transgenic non-human animal with attenuated proteasome function, etc., which allows the evaluation of proteasome function and activity to be analyzed at the individual level.
  • transgenic non-human animal of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "non-human animal of the present invention") is, as described above, a non-human animal in which proteasome function is attenuated. It is a non-human animal with attenuated sexual proteasome function.
  • Systemic proteasomes refer to proteasomes that are present throughout the non-human animal, and can also be said to refer to substantially all proteasomes expressed in the body of the non-human animal.
  • the function-attenuated proteasome is not particularly limited as long as its activity is reduced compared to the wild-type proteasome. % reduction is preferred, and the activity is reduced by 20 to 50%, reduced by 30 to 50%, reduced by 40 to 50%, reduced by 10 to 40%, A decrease of 10 to 30% or a decrease of 10 to 20% may be used. Decreased proteasome activity can be confirmed in proteasomes expressed in organs or tissues such as brain (preferably cerebellum, cerebral cortex, hippocampus), liver, kidney, testis, spleen, cardiac muscle, skeletal muscle, etc. .
  • the proteasome activity preferably includes, for example, proteasome peptidase activity measured using the fluorescent peptide substrate suc-LLVY-AMC. Activity measured such as histological analysis of ubiquitin-positive aggregate formation is preferably mentioned.
  • the function-attenuated proteasome is not limited, but is, for example, one in which mutations are introduced into any one or more subunit proteins that constitute the standard 26S proteasome. mentioned.
  • the mutation is not limited, but is preferably, for example, a substitution, deletion and/or addition of an amino acid residue in the amino acid sequence of the subunit.
  • the number of amino acid residues to be substituted, deleted and/or added is not limited, but may be, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, or 1 to 5. can.
  • the function-attenuated proteasome includes, but is not limited to, a catalytic subunit (CP: core particle; "20S proteasome”) and a regulatory subunit (CP) that constitute a standard 26S proteasome.
  • CP catalytic subunit
  • CP regulatory subunit
  • RP regulatory particle; "19S complex”
  • the subunits constituting the 19S complex are mutated, more specifically, for example, the lid portion of the 19S complex
  • a mutation is introduced into the PSDM12 protein (Rpn5 protein), which is one of the constituent subunits of.
  • the PSDM12 protein is a conserved subunit of the proteasome and is believed to be required for correct assembly and activity of the proteasome.
  • the mutation in the PSDM12 protein is not limited, for example, it is preferably a mutation in which an amino acid residue is substituted, deleted and/or added in the C-terminal region of the amino acid sequence of the PSDM12 protein.
  • the substitutions, deletions and/or additions are not limited, but are, for example, up to 20 amino acid residues counted from the C-terminus of the amino acid sequence of the wild-type PSDM12 protein. is preferred, and it may be performed on up to the 30th, up to the 40th, up to the 50th, or up to the 60th amino acid residue.
  • the number of amino acid residues to be substituted, deleted and/or added is not limited, but is, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, or 1 to 5. be able to.
  • mutated PSDM12 protein In the non-human animal of the present invention, specific preferred examples of the mutated PSDM12 protein include the proteins (a) to (c) below.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 6 or 8;
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 6 or 8, and having an attenuated proteasome function.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 6 or 8 and having attenuated proteasome function.
  • the amino acid sequence of the wild-type PSDM12 protein is shown in SEQ ID NO:2.
  • the amino acid sequence (456 amino acids) of SEQ ID NO: 2 can be found on the GenBank website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) of the NCBI (National Center for Biotechnology Information). registered by number.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 6, and 8 can be expressed in clone #17 mice, clone #53 mice, and clone #36 mice, respectively, shown in the examples below. Amino acid sequence of mutant PSDM12 protein.
  • the above clone #17 mouse is not limited, but can be created from, for example, a fertilized egg of a mouse with accession number NITE ABP-03543.
  • the fertilized egg whose receipt number is NITE ABP-03543 is called "PSMD12p.Leu438Gly" and is dated October 7, 2021. 0818 Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture).
  • the above clone #53 mouse is not limited, but can be created, for example, from a fertilized egg of a mouse with accession number NITE ABP-03545.
  • the fertilized egg whose receipt number is NITE ABP-03545 is called "PSMD12p.Ser437Phefs3" and is dated October 7, 2021. 0818 Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture).
  • the clone #36 mouse is not limited, but can be created from, for example, a fertilized egg of a mouse with the accession number of NITE ABP-03544.
  • the fertilized egg whose receipt number is NITE ABP-03544 is called "PSMD12p.Ser437Leufs9" and is dated October 7, 2021. 0818 Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture).
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (438 amino acids) has 18 amino acids on the C-terminal side deleted from the amino acid sequence of the wild-type PSDM12 protein, and the 438th amino acid is from the wild-type amino acid. It is mutating.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (439 amino acids) has 17 amino acids on the C-terminal side deleted from the amino acid sequence of the wild-type PSDM12 protein, and the 437th to 439th amino acids are wild are mutated from the amino acids of the type
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (445 amino acids) has 11 amino acids on the C-terminal side deleted from the amino acid sequence of the wild-type PSDM12 protein, and 437th to 440th and 442nd amino acids. ⁇ 445th amino acid is mutated from the wild-type amino acid.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is, for example, about 1 to 10, preferably 1 to several, 1
  • An amino acid sequence in which ⁇ 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 amino acid is deleted, substituted or added is preferred.
  • Mutations such as deletions, substitutions, or additions can be introduced using mutagenesis kits using site-directed mutagenesis, such as GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen) and TakaRa Site-Directed Mutagenesis System.
  • the “identity" of the protein (c) above is more preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the non-human animal of the present invention is a non-human animal in which proteasome function is attenuated. More specifically, gene mutation is introduced so as to express proteasome with attenuated function It is preferable that the Specifically, the gene mutation includes, but is not limited to, mutation introduced into a gene encoding a protein of any one or more subunits constituting a standard 26S proteasome.
  • the gene mutation is a catalytic subunit (CP: core particle; "20S proteasome”) and a regulatory subunit (RP: regulatory particle; "19S complex”) that constitute the standard 26S proteasome. ”), it is preferably a mutation introduced into a gene encoding a protein of a subunit that constitutes the 19S complex, more specifically, for example, a subunit that constitutes the lid portion of the 19S complex Mutations introduced into a gene encoding one PSDM12 protein (Rpn5 protein) are preferred.
  • the method for introducing the above-described gene mutation is not limited, and known gene recombination techniques, gene mutation introduction techniques, and the like can be employed.
  • DNA used as a mutant gene is described in, for example, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), and the like.
  • it can be prepared using a mutagenesis kit that utilizes site-directed mutagenesis by a known technique such as the Kunkel method or the gapped duplex method.
  • PCR primers designed to introduce, for example, missense mutations are used to obtain DNA encoding the desired mutant protein, and DNA containing a nucleotide sequence encoding the wild-type protein is used as a template. PCR can also be carried out under suitable conditions. Alternatively, CRISPR/Cas9 methods can be used to generate non-human animals with desired genetic mutations.
  • specific examples of the gene encoding the PSDM12 protein into which the mutation has been introduced preferably include, for example, genes containing the following DNAs (a) to (c).
  • the gene encoding the wild-type PSDM12 protein is a gene containing DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is registered with the accession number "NM_025894" on the NCBI (National Center for Biotechnology Information) GenBank website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). ing.
  • nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3, 5, and 7 can be expressed in clone #17 mice, clone #53 mice, and clone #36 mice, respectively, shown in the examples below.
  • mice are, for example, but not limited to, from fertilized eggs of mice with receipt numbers NITE ABP-03543, NITE ABP-03545, and NITE ABP-03544, respectively. can be produced. All of these fertilized eggs were deposited internationally as described above.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 3 encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. More specifically, two bases in the base sequence encoding the wild-type PSDM12 protein (specifically , two bases (ct) at positions 1361 and 1362 in the numbering of the base sequence of SEQ ID NO: 1 are deleted.
  • the termination codon sequence (taa) in the base sequence of SEQ ID NO:3 corresponds to the 1366th to 1368th bases in the numbering of the base sequence of SEQ ID NO:1.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 5 (1320 bases) encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. More specifically, the base sequence encoding the wild-type PSDM12 protein (specifically, the sequence One base (t) is added between the 1358th base and the 1359th base in the numbering of the base sequence of number 1).
  • the termination codon sequence (taa) in the base sequence of SEQ ID NO:5 corresponds to the 1366th to 1368th bases in the numbering of the base sequence of SEQ ID NO:1.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 7 (1338 bases) encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. More specifically, one base in the base sequence encoding the wild-type PSDM12 protein (specifically , the 1358th base (t) in the numbering of the base sequence of SEQ ID NO: 1) is deleted.
  • the sequence (tag) corresponding to the termination codon in the base sequence of SEQ ID NO:7 corresponds to the 1386th to 1388th bases in the numbering of the base sequence of SEQ ID NO:1.
  • the DNA of (b) above is the DNA of (a) above, a DNA consisting of a base sequence complementary thereto, or a fragment thereof, and is used as a probe for colony hybridization, plaque hybridization, and Southern hybridization. It can be obtained from a cDNA library or a genomic library by performing known hybridization methods such as blotting.
  • the library may be prepared by a known method, or may be a commercially available cDNA library or genomic library, and is not limited.
  • “Stringent conditions” in the practice of the hybridization method are conditions for washing after hybridization, which include a buffer salt concentration of 15 to 330 mM, a temperature of 25 to 65°C, preferably a salt concentration of 15 to 330 mM. 150 mM and a temperature of 45 to 55°C. Specifically, conditions such as 80 mM and 50° C. can be mentioned. Furthermore, in addition to the conditions such as salt concentration and temperature, various conditions such as probe concentration, probe length, and reaction time should be taken into account to appropriately set the conditions for obtaining the DNA of (b) above. can be done.
  • the "identity" of the DNA in (c) above is 85% or higher, 90% or higher, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, or 99% or higher.
  • "having an attenuated proteasome function” means that the activity of the proteasome is reduced compared to the wild-type proteasome, as described above. The above description can also be applied to specific examples of the activity.
  • Non-human animals that can be used in the present invention include, but are not limited to, non-human mammals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, pigs, weasels, dogs, cats, monkeys, sheep, cows, and horses.
  • rodents rodentia
  • mice, rats and guinea pigs are preferred, and mice are more preferred.
  • the non-human animal of the present invention exhibits an aspect in which proteasome function is attenuated. Accordingly, the non-human animal of the present invention can be used, for example, as a model animal having proteostasis abnormality, and more specifically, as a model animal for diseases, symptoms, or pathological conditions caused by proteostasis abnormality. can be done.
  • proteostasis abnormality is generally preferably exemplified by the accumulation of abnormal proteins due to disruption of protein homeostasis.
  • Diseases, symptoms, or conditions caused by abnormal proteostasis include, but are not limited to, growth retardation (e.g., abnormal head morphology, delayed movement), renal dysfunction, liver dysfunction, diaphragmatic hernia, and cerebellar abnormalities.
  • growth retardation e.g., abnormal head morphology, delayed movement
  • renal dysfunction e.g., liver dysfunction, diaphragmatic hernia, and cerebellar abnormalities.
  • neurodegenerative diseases e.g., analgesia (e.g., upper central nervous system analgesia), intractable cancer, chronic inflammatory diseases, arteriosclerosis, diabetes (e.g., glucose metabolism disorder), and aging.
  • analgesia e.g., upper central nervous system analgesia
  • intractable cancer chronic inflammatory diseases
  • arteriosclerosis e.g.
  • the non-human animal of the present invention can be used as a model animal having proteostasis abnormality, more specifically, as a model animal for a disease, symptom or condition caused by proteostasis abnormality. It is useful in the development of therapeutic agents for abnormalities, diseases, symptoms, or pathological conditions. Accordingly, the present invention provides a method for screening a drug for treatment or prevention of abnormal proteostasis or a disease, symptom, or condition caused by abnormal proteostasis using the above animal model, and abnormal proteostasis or proteostasis obtained by the method. A therapeutic or prophylactic agent for a disease, symptom or condition caused by the abnormality can be provided.
  • proteostasis abnormalities and diseases, symptoms, or pathological conditions caused by proteostasis abnormalities the above explanations can be applied.
  • the method of screening for proteostasis abnormality or a therapeutic or preventive agent for a disease, symptom or condition caused by proteostasis abnormality includes the following steps (a) and (b).
  • the candidate substance to be administered to the model animal as the test animal and the control animal used as necessary is not limited, but various peptides and proteins (including enzymes and antibodies) synthesized naturally or artificially. ), nucleic acids (polynucleotides (DNA, RNA), oligonucleotides (siRNA, etc.), peptide nucleic acids (PNA), etc.), low-molecular-weight, medium-molecular-weight, or high-molecular-weight organic compounds.
  • Candidate substances can be administered orally or parenterally, and are not limited, and in either case, known administration methods, administration conditions, etc. can be adopted.
  • the dosage can also be appropriately set in consideration of the type and condition of the test animal, the type of candidate substance, and the like.
  • evaluation abnormal proteostasis or "evaluating a disease, symptom or condition caused by abnormal proteostasis” means proteostasis of a non-human animal after administration of a candidate substance.
  • evaluating abnormal proteostasis or "evaluating a disease, symptom or condition caused by abnormal proteostasis” means proteostasis of a non-human animal after administration of a candidate substance.
  • analyzing phenotypes associated with abnormalities, or phenotypes associated with diseases, symptoms, or conditions caused by abnormal proteostasis and comparing the above phenotypes of non-human animals before and after administration of candidate substances.
  • a comparative examination of the above phenotypes between test animals administered with the candidate substance and control animals not administered with the candidate substance.
  • the candidate substance significantly improves abnormal proteostasis or a disease, symptom or pathological condition resulting therefrom, or prevents the occurrence or progression of abnormal proteostasis or a disease, symptom or pathological condition resulting therefrom. If the candidate substance can be evaluated as being significantly inhibited, the candidate substance can be selected as a therapeutic or prophylactic agent for proteostasis abnormality or a disease, symptom or condition caused by it.
  • a "control animal” is not limited as long as it is suitable for use as a control for comparison with the test animal, and may be a littermate non-transgenic non-human animal or a non-transgenic wild-type animal. There may be.
  • a transgenic non-human animal to which no candidate substance is administered can also be used as a control animal.
  • a wild-type non-human animal of the same species or litter with the non-human animal of the present invention is preferable as a control animal in that an accurate comparative experiment can be performed.
  • animals of the same sex and age are preferably used as test animals and control animals, and it is also preferable that the breeding conditions are the same. It should be noted that the screening method of the present invention may include some other steps, if necessary.
  • compositions for treating or preventing proteostasis abnormalities, and pharmaceutical compositions for treating or preventing diseases, symptoms, or conditions caused by proteostasis abnormalities.
  • the pharmaceutical composition preferably contains a therapeutic or prophylactic agent obtained by the screening method of the present invention described above. Specific examples of proteostasis abnormalities and diseases, symptoms, or conditions caused by such abnormalities are as described above.
  • the substance as a therapeutic or prophylactic agent obtained by the screening method of the present invention which is the active ingredient of the pharmaceutical composition, is not limited to the substance itself, and for example, a derivative of the substance may be substituted or used in combination. be able to.
  • the derivative is not particularly limited as long as it has a chemical structure derived from the original protein, compound, etc., and is considered to be the derivative based on the common technical knowledge of those skilled in the art.
  • Such derivatives include, for example, those that undergo metabolism such as oxidation, reduction, hydrolysis, or conjugation in vivo, and those that undergo metabolism such as oxidation, reduction, or hydrolysis in vivo and are produced as active ingredients. drugs (so-called prodrugs) are also included.
  • pharmacologically Any acceptable salt can be used as the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • pharmacologically acceptable salts include, but are not limited to, hydrohalides (e.g., hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, etc.), inorganic acid salts (e.g., sulfates, nitrates, perchlorates, phosphates, carbonates, and bicarbonates), organic carboxylates (e.g.
  • organic sulfonates e.g., methanesulfonate, trifluoromethanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, camphorsulfonate, etc.
  • amino acid salts e.g., aspartate, glutamate, etc.
  • quaternary amine salts alkali metal salts (e.g., sodium salts, potassium salts, etc.), alkaline earth metal salts (e.g., magnesium salts, calcium salts, etc.), etc. are preferably mentioned.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention includes all isomers that can occur structurally of the compound (e.g., geometric isomers, optical isomers based on an asymmetric carbon, rotational isomers, stereoisomers, and tautomers). isomers, etc.) and mixtures of two or more of these isomers, and may be S-, R-, or RS-isomers, without limitation.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention may exist in the form of a hydrate or solvate depending on its type. Examples of such solvates include, but are not limited to, solvates with ethanol.
  • the content ratio of the above-mentioned active ingredients is not limited and can be set as appropriate. 0.01 to 30% by weight, 0.05 to 20% by weight, or 0.1 to 10% by weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can exert therapeutic or preventive effects on proteostasis abnormalities and diseases, symptoms, or conditions caused by such abnormalities.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in various ways to target humans or non-human mammals (e.g., mice, rats, guinea pigs, weasels, rabbits, sheep, pigs, cattle, cats, dogs, monkeys, etc.). It can be administered by route, specifically, orally or parenterally (e.g., intravenous injection (intravenous injection), intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, rectal administration, transdermal administration). It can be formulated into an appropriate dosage form using a pharmaceutically acceptable carrier by a commonly used method and used.
  • intravenous injection intravenous injection
  • intramuscular injection intraperitoneal injection
  • subcutaneous injection subcutaneous injection
  • rectal administration transdermal administration
  • transdermal administration transdermal administration
  • oral dosage forms examples include tablets, powders, fine granules, granules, coated tablets, capsules, internal solutions, suspensions, emulsions, syrups, lozenges, and the like.
  • Oral agents include, for example, injections (including infusions), inhalants, ointments, nasal drops, and liposomes.
  • the therapeutic agent and pharmaceutical composition of the present invention can also be used as a supplement (for example, functional food) in some cases.
  • Examples of carriers that can be used for formulating these formulations include commonly used excipients, binders, disintegrants, lubricants, coloring agents, and flavoring agents, and if necessary, stabilizers and emulsifiers. , absorption promoters, surfactants, pH adjusters, preservatives, antioxidants, bulking agents, wetting agents, surfactants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, and soothing agents, etc. It is possible to formulate by a conventional method by blending known ingredients that can be used as raw materials for pharmaceutical formulations.
  • non-toxic substances examples include animal and vegetable oils such as soybean oil, beef tallow, and synthetic glycerides; hydrocarbons such as liquid paraffin, squalane, and solid paraffin; octyldodecyl myristate, and isopropyl myristate.
  • higher alcohols such as cetostearyl alcohol and behenyl alcohol; silicone resin; silicone oil; polyoxyethylene fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, and surfactants such as polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers; water-soluble polymers such as hydroxyethylcellulose, polyacrylic acid, carboxyvinyl polymer, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, and methylcellulose; lower alcohols such as ethanol and isopropanol; Polyhydric alcohols (polyols) such as glycerin, propylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, and polyethylene glycol; Sugars such as glucose and sucrose; Inorganic powders such as anhydrous silicic acid, magnesium aluminum silicate, and aluminum silicate inorganic salts such as sodium chloride and sodium phosphate
  • excipients include lactose, fructose, corn starch, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol, crystalline cellulose, and silicon dioxide.
  • binders include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, methylcellulose, ethylcellulose, gum arabic. , tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polypropyleneglycol-polyoxyethylene-block polymer, and meglumine.
  • disintegrants examples include starch, agar, gelatin powder, crystalline cellulose, Calcium carbonate, sodium bicarbonate, calcium citrate, dextrin, pectin, carboxymethyl cellulose calcium, etc.
  • Lubricants such as magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, hardened vegetable oil, etc.
  • Colorants As a flavoring agent, for example, cocoa powder, mint brain, aromatic powder, peppermint oil, borneol, and cinnamon powder are preferable, and both are A salt thereof or a hydrate thereof may be used.
  • the pH adjuster is used when formulating as an injection.
  • the pH adjuster is not particularly limited as long as it is pharmaceutically, pharmacologically (pharmaceutical) or physiologically acceptable, and specifically includes sodium carbonate, potassium carbonate, sodium ethoxide. , potassium butoxide, sodium hydroxide, alkali metal hydroxides such as potassium hydroxide, alkali metal hydrides such as sodium hydride and potassium hydride, alkali metal or alkaline earth metal carbonates, alkali metal alkoxides, etc. is mentioned.
  • the pH adjusters to be blended may be used singly or in any combination of two or more. When it is formulated as an injection or the like, it can be appropriately adjusted to an appropriate pH using a pH adjuster.
  • the pH is preferably 3 to 6, more preferably 3 to 5, even more preferably 3 to 4.5, and 3.5 to 4.5. Especially preferred.
  • Cyclodextrins are not particularly limited as long as they are pharmaceutically, pharmacologically (pharmaceutical) or physiologically acceptable. Examples of such cyclodextrins include unmodified cyclodextrins, modified cyclodextrins, and the like. Examples of unmodified cyclodextrin include ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin and the like.
  • modified cyclodextrins include alkylated cyclodextrins (e.g., dimethyl- ⁇ -cyclodextrin, dimethyl- ⁇ -cyclodextrin, dimethyl- ⁇ -cyclodextrin, etc.), hydroxyalkylated cyclodextrins (e.g., hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, etc.), sulfoalkyl ether cyclodextrin (e.g.
  • sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin, sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin, sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin), branched cyclodextrins (eg, maltosyl- ⁇ -cyclodextrin, maltosyl- ⁇ -cyclodextrin, maltosyl- ⁇ -cyclodextrin, etc.).
  • branched cyclodextrins eg, maltosyl- ⁇ -cyclodextrin, maltosyl- ⁇ -cyclodextrin, maltosyl- ⁇ -cyclodextrin, etc.
  • Cyclodextrins may be used singly or in any combination of two or more. Cyclodextrins to be blended are preferably hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin or sulfobutylether- ⁇ -cyclodextrin, more preferably sulfobutylether- ⁇ -cyclodextrin.
  • the content of cyclodextrins is not particularly limited, and is appropriately set according to the type, application of the injection, method of use, etc.
  • the content of cyclodextrins is, for example, preferably 5 to 50% by weight, more preferably 10 to 40% by weight, more preferably 10 to 30% by weight, based on the total weight of the injection. More preferred.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is generally determined by taking into account the ratio of the active ingredient in the formulation, and the age and body weight of the subject (patient), the type and progress of the disease, the route of administration, and the administration. Taking into account the number of times (/day), administration period, etc., it is possible to appropriately set a wide range.
  • the use of the pharmaceutical composition of the present invention as a parenteral preparation or an oral preparation will be specifically described below.
  • parenteral drug When used as a parenteral drug, its form is generally not limited, but in the case of various injections, for example, it is in the form of a unit dose ampoule or a multi-dose container, or the form of a lyophilized powder that is redissolved in a dissolution liquid at the time of use. can be provided in In addition to the above-mentioned active ingredients, etc., the parenteral preparation can contain various known excipients and additives according to various forms, as long as the effects of the above active ingredients are not impaired. For example, in the case of various injections, water, glycerol, propylene glycol, and aliphatic polyalcohols such as polyethylene glycol can be used.
  • the dosage (per day) of parenteral agents is not limited, but for various injections, for example, the above-mentioned active ingredients are generally added to 0 per kg body weight of the subject (subject, patient, etc.). 0.01 to 1000 mg, 0.05 to 500 mg, or 0.1 to 50 mg, or 0.5 to 20 mg, or 1 to 10 mg.
  • the oral preparation When used as an oral preparation, its form is generally not limited, and it may be in any of the dosage forms described above, or may be a dry product that is redissolved before use.
  • the oral preparation may contain various known excipients and additives according to various forms, as long as the effects of the above active ingredients are not impaired.
  • binders for example, binders (syrup, gum arabic, gelatin, sorbitol, tragacanth, polyvinylpyrrolidone, etc.), fillers (lactose, sugar, corn starch, potato starch, calcium phosphate, sorbitol, glycine, etc.), lubricants (magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, etc.), disintegrants (various starches, etc.), and wetting agents (sodium lauryl sulfate, etc.).
  • the dosage (per day) of oral preparations is generally 0.05 to 5000 mg, 0.1 to 1000 mg, or 0.05 to 5000 mg per 1 kg body weight of the subject (subject, patient, etc.) of the aforementioned active ingredient.
  • the dosage can be 1 to 100 mg, or 0.5 to 50 mg, or 1 to 10 mg.
  • the mixing ratio of the active ingredient in the oral preparation is not limited, and can be appropriately set in consideration of the number of administrations per day and the like.
  • the present invention provides (i) the use of the pharmaceutical composition of the present invention. or patients suffering from or suspected of suffering from a condition, or such non-human mammals (e.g., mice, rats, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, weasels, cats, dogs, monkeys, etc.) (ii) for the treatment or prevention of proteostasis abnormalities or diseases, symptoms or conditions caused by such abnormalities, including administering to Use of the pharmaceutical composition of the present invention for manufacturing a medicament, and (iii) use of the pharmaceutical composition of the present invention for the treatment or prevention of proteostasis abnormalities or diseases, symptoms or conditions caused by such abnormalities. It is a thing.
  • non-human mammals e.g., mice, rats, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, weasels, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the treatment of proteostasis abnormality and the disease, symptom or pathological condition caused by the abnormality specifically includes, for example, suppression of progress of the treatment of the abnormality or the disease, symptom or condition caused by the abnormality , improvement of prognosis, and/or prevention of recurrence.
  • Kit A kit containing the above-described pharmaceutical composition of the present invention can be used to treat or prevent a proteostasis abnormality or a disease, symptom, or condition caused by the abnormality.
  • the form of the active ingredient in the pharmaceutical composition in the kit is not limited, but in consideration of stability (storage), ease of use, etc., it may be provided in a dissolved state, for example.
  • the kit can optionally contain other components in addition to the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the guide RNA (gRNA) and Cas9 protein targeting the last exon (Exon11) of the Psmd12 gene were injected into fertilized eggs of C57BL/6JJcl mice (CLEA Japan).
  • the gRNA used was appropriately designed using the following nucleotide sequence (SEQ ID NO: 9) in Exon 11 of the Psmd12 gene as a target sequence.
  • MEF Mae Embryonic Fibroblast
  • mouse tissue was measured.
  • MEFs were prepared from day E12.5 embryos using the Primary Mouse Embrionic Fibroblast Isolation Kit (Thermo #88279) according to the attached protocol. 1 ⁇ 10 6 wild-type (WT) or proteasome heterozygous mouse MEFs were washed twice with PBS and harvested using trypsin.
  • the recovered cells were further washed twice with PBS, and added with 50 ⁇ l of Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 4 mM ATP, 1 mM DTT, 10 mM MgCl 2 , 1 ⁇ Protease Inhibitor Cocktail (PIC) EDTA free (Roche)) plus 0.2% NP40 was added to lyse the cells. After standing in ice for 30 minutes, centrifugation was performed at 15,000 rpm and 4° C. for 10 minutes to collect the supernatant.
  • Lysis buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 4 mM ATP, 1 mM DTT, 10 mM MgCl 2 , 1 ⁇ Protease Inhibitor Cocktail (PIC) EDTA free (Roche)
  • PIC Protease Inhibitor Cocktail
  • mice For mouse tissues, the brains and livers of 10-week-old WT and proteasome-mutant mice were collected in 10 ml cryo-fracture tubes (Yasui Kikai), and the tissues were completely frozen in liquid nitrogen. A metal cone for 10 ml crushing tube (Yasui Kikai) was added to the tube, and the tissue was freeze crushed at 2,700 rpm for 10 seconds using a multi-bead shocker (Yasui Kikai).
  • Lysis buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 4 mM ATP, 1 mM DTT, 10 mM MgCl 2 , 1 ⁇ Protease Inhibitor Cocktail (PIC) EDTA free (Roche) for 10 mg tissue weight
  • PIC Protease Inhibitor Cocktail
  • the protein concentration of the resulting tissue extract was calculated using Pierce 660 nm Protein Assay Reagent (Thermo Fisher Scientific) (bovine serum albumin (BSA, Thermo Fisher Scientific) was used as a standard protein).
  • the tissue extract was adjusted to 5 ⁇ g/3 ⁇ l with a lysis buffer, 1 ⁇ l of 4 ⁇ loading dye (0.1 ⁇ g/ ⁇ l Xylene Cyanol, 10% glycerol) was added, and NuPAGE 3-8% Tris acetate gel (Thermo Fisher Scientific ) (150 V, 240 min, 4° C.).
  • TBE buffer (90 mM Tris, 80 mM borate, 0.1 mM EDTA, 0.5 mM ATP, 2 mM MgCl 2 , 0.5 mM DTT) was used as an electrophoresis buffer.
  • Wild-type (WT) and proteasome mutant mice were weighed immediately after birth or weekly from 1 to 12 weeks after birth to monitor growth. In addition, tissues were collected from 4-week-old mice, and the weight of each tissue was measured.
  • paraffin block was sliced into 5 ⁇ m slices using a microtome (Leica Biosystems RM2245), attached to peel-resistant coated glass slides (Matsunami Glass), and dried overnight on a hot plate at 37°C. The dried samples were stored at 4°C. Paraffin sections were deparaffinized with xylene and then rehydrated with 100%, 90%, 70%, 50% Dryzol N series (Kanto Kagaku) and purified water. After rehydration, the cells were stained with Meyer's hematoxylin (Fuji Film Wako) and eosin (Sakura Fine Tech), dehydrated and cleared with 100% drysol N and xylene, and mounted with Mount Quick (Daido Sangyo). .
  • Hot plate test A 17- to 28-week-old male mouse was placed on a plate at 52° C., and the latency to lick its hind limbs was measured. The cutoff time was 60 seconds.
  • Tail flic test A heat stimulus was applied to the tail of 17- to 28-week-old male mice, and the latency to flick the tail was measured. Measurements were performed in triplicate and the median value was used for analysis. A cut-off time was set to 10 seconds.
  • liver function LDH, AST
  • renal function creatinine, urea
  • glucose metabolism glycosylated hemoglobin A1c
  • mice with systemic proteasome dysfunction produced in this example corresponds well to the multifaceted symptoms observed in patients with developmental disorders due to PSMD12 mutations, such as growth retardation and renal impairment. Therefore, the mice with decreased proteasome function produced in this study are considered to be useful as model mice for proteasome-related diseases (proteasomopathy). Furthermore, the mouse with systemic proteasome dysfunction produced in this Example can be used not only as a model mouse for proteasome disease (abnormal proteostasis or a disease, symptom or pathological condition caused by such abnormality), but also for treatment, prevention, etc. of the proteasome disease.
  • a transgenic non-human animal having attenuated proteasome function, preferably attenuated systemic proteasome function, or a proteostasis abnormality using the non-human animal A model animal or a model animal of a disease, symptom or pathological condition caused by said abnormality, a proteostasis abnormality or a disease, symptom or condition caused by said abnormality, a screening method for a drug for treatment or prevention, and a drug for treatment or prevention thereof Compositions and the like can be provided.
  • SEQ ID NO: 3 Recombinant DNA
  • SEQ ID NO: 4 recombinant protein
  • SEQ ID NO: 5 recombinant DNA
  • SEQ ID NO: 6 recombinant protein
  • SEQ ID NO: 7 recombinant DNA
  • SEQ ID NO: 8 recombinant protein

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Abstract

プロテアソームの機能や活性の評価を個体レベルで解析できるトランスジェニック非ヒト動物等を提供する。本発明は、プロテアソームの機能が減弱された卜ランスジェニック非ヒト動物等に係るものである。

Description

プロテアソーム機能減弱トランスジェニック非ヒト動物
　本発明は、プロテアソームの機能が減弱されたトランスジェニック非ヒト動物等に関する。
　プロテアソームは、ユビキチン化されたタンパクを選択的に分解・除去することで、細胞内のタンパク質恒常性の維持のみならず、遺伝子発現、ストレス応答、シグナル伝達など様々な細胞機能の制御に必須の役割を果たしている。従って、プロテアソームの機能破たんは、ガンや神経変性疾患、自己免疫疾患など様々な病態を引き起こすと考えられている。しかしながら、プロテアソームはすべての細胞生存に必須であるため、コンディショナルノックアウトマウスなどの従来の解析法があまり有用ではなく、個体レベルでのプロテアソーム研究は大きく立ち遅れている。そのため、プロテアソーム機能の低下がどのような分子機構で疾患を引き起こすのかについては不明な点が多く残されている。また、ユビキチン・プロテアソーム経路を標的とした阻害剤の開発が積極的に進められているが、個体レベルで薬効を評価するモデルが存在しないことが問題となっている。
Ｇｌｉｃｋｍａｎ，Ｍ．Ｈ．＆　Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．Ｔｈｅ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ：ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓａｋｅ　ｏｆ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｒｅｖ　８２，３７３−４２８（２００２）． Ａｒｉｍａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｄｅｆｅｃｔ　ｄｕｅ　ｔｏ　ａ　ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｂｅｔａ　ｔｙｐｅ　８（ＰＳＭＢ８）ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｃａｕｓｅｓ　ｔｈｅ　ａｕｔｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｄｉｓｏｒｄｅｒ，Ｎａｋａｊｏ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　１０８，１４９１４−１４９１９（２０１１）． Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ＰＳＭＢ８　ｃａｕｓｅｓ　ａｕｔｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｓ．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１２１，４１５０−４１６０（２０１１）．
　このような状況下において、例えば、プロテアソーム関連疾患（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｏｐａｔｈｙ）モデル動物や、プロテアソーム活性化剤薬効評価モデル動物といった、プロテアソームの機能や活性の評価を個体レベルで解析できるトランスジェニック非ヒト動物、ひいては、ユビキチン・プロテアソーム系を標的とした創薬開発などに貢献し得るトランスジェニック非ヒト動物の開発が望まれていた。
　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、例えば、以下に示す、トランスジェニック非ヒト動物、並びにプロテオスタシス異常あるいは該異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防薬のスクリーニング方法、及びその治療又は予防用医薬組成物などを提供するものである。
（１）プロテアソームの機能が減弱された、トランスジェニック非ヒト動物。
（２）前記機能の減弱が、全身性プロテアソーム機能の減弱である、上記（１）に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（３）前記機能が減弱されたプロテアソームは、プロテアソーム活性が１０~５０％低下したものである、上記（１）又は（２）に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（４）前記機能が減弱されたプロテアソームは、２６ＳプロテアソームのサブユニットであるＰＳＤＭ１２タンパク質に変異が導入されたものである、上記（１）~（３）のいずれか１つに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（５）前記変異は、ＰＳＤＭ１２タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端側の領域において、アミノ酸残基の置換、欠失及び／又は付加がされたものである、上記（４）に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（６）前記変異が導入されたＰＳＤＭ１２タンパク質が、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質である、上記（４）又は（５）に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
　（ａ）配列番号４、６又は８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
　（ｂ）配列番号４、６又は８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、減弱されたプロテアソームの機能を有する、タンパク質。
　（ｃ）配列番号４、６又は８に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、減弱されたプロテアソームの機能を有する、タンパク質。
（７）前記機能が減弱されたプロテアソームを発現するように、遺伝子変異が導入されたものである、上記（１）~（６）のいずれか１つに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（８）前記遺伝子変異は、２６ＳプロテアソームのサブユニットであるＰＳＤＭ１２タンパク質をコードする遺伝子に導入された変異である、上記（７）に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（９）非ヒト動物が齧歯類動物である、上記（１）~（８）のいずれか１つに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（１０）齧歯類動物がマウスである、上記（９）に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（１１）プロテオスタシス異常を有するモデル動物である、上記（１）~（１０）のいずれか１つに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（１２）前記モデル動物が、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態のモデル動物である、上記（１１）に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（１３）プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態が、成長遅延、腎機能障害、肝機能低下、横隔膜ヘルニア及び小脳異常からなる群から選択される少なくとも１種である、上記（１２）に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（１４）上記（１１）に記載のトランスジェニック非ヒト動物に候補物質を投与する工程、及び該候補物質投与後の前記非ヒト動物のプロテオスタシス異常を評価する工程を含む、プロテオスタシス異常の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
（１５）上記（１２）に記載のトランスジェニック非ヒト動物に候補物質を投与する工程、及び該候補物質投与後の前記非ヒト動物のプロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態を評価する工程を含む、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
（１６）プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態が、成長遅延、腎機能障害、肝機能低下、横隔膜ヘルニア及び小脳異常からなる群から選択される少なくとも１種である、上記（１５）に記載のスクリーニング方法。
（１７）上記（１４）に記載のスクリーニング方法により得られた治療又は予防薬を含む、プロテオスタシス異常の治療又は予防用医薬組成物。
（１８）上記（１５）又は（１６）に記載のスクリーニング方法により得られた治療又は予防薬を含む、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防用医薬組成物。
（１９）上記（１７）に記載の医薬組成物を、プロテオスタシス異常を有している又は有している恐れがある患者に投与することを含む、プロテオスタシス異常の治療又は予防方法。
（２０）上記（１８）に記載の医薬組成物を、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態を患っている又は患っている恐れがある患者に投与することを含む、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防方法。
　発明の効果
　本発明によれば、プロテアソームの機能が減弱された、好ましくは全身性プロテアソーム機能が減弱された、トランスジェニック非ヒト動物や、当該非ヒト動物を用いたプロテオスタシス異常を有するモデル動物又は該異常に起因する疾患、症状又は病態のモデル動物、さらには、プロテオスタシス異常又は該異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防薬のスクリーニング方法、及びその治療又は予防用医薬組成物などを提供することができる。
　図１：プロテアソームの立体構造を示す図である。
　２６Ｓプロテアソームは、触媒サブユニット（ＣＰ：ｃｏｒｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ：２０Ｓプロテアソーム）と触媒サブユニット（ＲＰ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐａｒｔｉｃｌｅ：１９Ｓ複合体）から構成される。ＲＰは、蓋部（ｌｉｄ）と基底部（ｂａｓｅ）とに更に分類される。１９Ｓ複合体が２つ会合したものを３０Ｓプロテアソームと呼ぶ。
　図２：作出したプロテアソーム変異マウスについての解析結果を示す図である。
　（Ａ）Ｐｓｍｄ１２ラストエクソン（ｅｘｏｎ１１）を標的としてｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを受精卵にインジェクションし、得られたＦ０マウスの尾から採取した細胞を初代培養し、変異型ＰＳＭＤ１２タンパク質の発現をＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにて解析した結果である。黒矢印は、正常型ＰＳＭＤ１２タンパク質を、赤矢印は、変異型ＰＳＭＤ１２タンパク質を示す。
　（Ｂ）Ｐｓｍｄ１２ヘテロ変異マウスのゲノム配列を示す。野生型（ＷＴ）マウス及びライン化に成功した３系統のＰｓｍｄ１２変異マウス（＃１７，＃５３，＃３６）の変異付近のゲノム配列を解析した結果である。
　（Ｃ）Ｐｓｍｄ１２ヘテロ変異マウスのアミノ酸配列を示す。ＷＴマウス及びライン化に成功した３系統のＰｓｍｄ１２変異マウス（＃１７，＃５３，＃３６）の変異付近のアミノ酸配列を示す。ＷＴのアミノ酸及びそれと相同なアミノ酸に、青色ハイライトを付した。
　図３：プロテアソーム変異マウスにおけるプロテアソーム活性測定の結果を示す図である。
　（Ａ）野生型（ＷＴ）又はＰｓｍｄ１２ヘテロ変異マウス由来のＭＥＦ（Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：マウス胎児線維芽細胞）から細胞抽出液を調製し、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにて分離後、プロテアソームのペプチド性蛍光基質であるＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣを用いて、ゲル中の２０Ｓ、２６Ｓ、３０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を評価した。
　（Ｂ）ＷＴマウス及び＃１７のＰｓｍｄ１２変異マウスの脳及び肝臓抽出液を抽出し、上記（Ａ）と同様にプロテアソーム活性を評価した。
　図４：プロテアソーム変異マウスの生育状況を検討した測定した結果を示す図である。
　（Ａ）生後１週目から１２週目までの成長曲線である。生後１週目から１２週目まで、野生型（ＷＴ）マウス及びライン化に成功した３系統のＰｓｍｄ１２変異マウス（＃１７，＃５３，＃３６）の体重測定を行った（ｍｅａｎ±ＳＤ、検定方法：Ｗｅｌｃｈ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
　（Ｂ）４週目における、ＷＴマウス及び＃１７のＰｓｍｄ１２変異マウスの、各組織の写真である。
　図５：プロテアソーム変異マウスの組織学的解析の結果を示す図である。
　野生型（ＷＴ）マウス及び＃１７のＰｓｍｄ１２変異マウスの小脳片をＨＥ染色にて染色し形態を観察した。スケールバーは、４倍（ｘ４）時には３００μｍ、４０倍（ｘ４０）時には５０μｍを表す。矢印で示すように、＃１７のＰｓｍｄ１２変異マウスでは、プルキンエ細胞の脱落が観察された。
　図６：プロテアソーム変異マウスの表現型の網羅的解析の結果を示す図である。
　具体的には、可視的検査（５６項目）のうち、頭部形態異常と動き出し遅延に関する解析結果を、図６（Ａ）図に示し、
　血液生化学検査として、肝機能低下に関する解析結果（ＬＤＨとＡＳＴを指標とする解析結果）を、図６（Ｂ）図に示し、
　痛覚検査として、上位中枢性の痛覚異常に関する解析結果（Ｈｏｔ−ｐｌａｔｅ　ｔｅｓｔとＴａｉｌ−ｆｌｉｃｋ　ｔｅｓｔによる解析結果）を、図６（Ｃ）図に示した。
　図７：プロテアソーム変異マウスの表現型の網羅的解析の結果を示す図である。
　具体的には、血液生化学検査として、腎機能低下に関する解析結果（ＣｒｅａｔｉｎｉｎｅとＵｒｅａを指標とする解析結果）を、図７（Ａ）図に示し、糖代謝に関する解析結果（Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ａ１ｃを指標とする解析結果）を、図７（Ｂ）図に示した。なお、図７（Ｃ）図は、検査を実施した個体・群の詳細を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０２１−１６６８９１号明細書（２０２１年１０月１１日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
　ユビキチン・プロテアソーム系（ＵＰＳ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ）は、ユビキチン化修飾を受けたタンパク質を選択的に分解する細胞内の主要なタンパク質分解システムある。プロテアソームは３３種類の異なるサブユニットから構成されるタンパク質分解酵素複合体であり、プロテアーゼ活性を有する２０Ｓプロテアソーム（ＣＰ：ｃｏｒｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ）と１９Ｓ複合体（ＲＰ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐａｒｔｉｃｌｅ）とが、１つあるいは２つ会合した構造をもつ（図１参照）。
　プロテアソームは、細胞内のタンパク質分解の約７０％を担っており、ユビキチン化基質の分解を介して細胞周期の進行や転写制御、シグナル伝達、免疫応答、タンパク質恒常性の維持などあらゆる細胞機能の制御に必須の役割を果たしている（前掲の非特許文献１参照）。加齢やストレスによりプロテアソーム機能が破たんすると、正常なタンパク質分解が行われなくなり、異常タンパク質の蓄積やシグナル伝達の攪乱が引き起こされ、神経変性疾患や自己免疫疾患、がんなどの様々な疾患につながると考えられている。よって、ＵＰＳ制御機構の正確な理解は、ＵＰＳ機能破たんにより引き起こされる疾患発症の理解につながることが期待される。しかしながら、プロテアソームは細胞生存に必須であるため、ノックアウトマウスなどの解析はあまり有効ではなく、プロテアソーム機能がどのように制御されているのかということや、プロテアソームの機能低下がどのように疾患を引き起こすのかということに関して、個体レベルでの病態生理学的解析が大きく立ち遅れている。
　ところで、プロテアソーム遺伝子の変異については、２０Ｓプロテアソームのサブタイプである免疫型プロテアソーム構成サブユニットの一つβ５ｉ（ＰＳＭＢ８）遺伝子のミスセンス変異が、日本に特有の遺伝性自己免疫疾患である中条−西村症候群（指定難病２６８）を引き起こすことが報告されている（前掲の非特許文献２、３参照）。
　また、近年、ＵＰＳを標的とした創薬の開発が製薬企業を中心に積極的に進められている。特に、がん細胞では増強したプロテアソーム活性が細胞増殖、細胞生存を助けていることが分かっており、ＵＰＳ制御分子は抗がん剤開発のターゲットとなっている。しかしながら、これまでに、これらＵＰＳ制御分子の薬効を評価するプロテアソーム機能減弱モデル動物などが存在せず、プロテアソーム機能や活性の評価を個体レベルで解析するためのモデル動物の開発が待たれていた。
　このような状況下において、本発明者は、プロテアソームの機能や活性の評価を個体レベルで解析できる、プロテアソームの機能が減弱されたトランスジェニック非ヒト動物等を開発した。
２．トランスジェニック非ヒト動物
　本発明のトランスジェニック非ヒト動物（以下、「本発明の非ヒト動物」ということがある）は、前述のとおり、プロテアソームの機能が減弱された非ヒト動物、好ましくは、全身性プロテアソーム機能が減弱された非ヒト動物である。全身性プロテアソームとは、当該非ヒト動物の全身において存在するプロテアソームのことであり、当該非ヒト動物の体内において発現される実質的にすべてのプロテアソームのことである、ということもできる。
　本発明の非ヒト動物において、機能が減弱されたプロテアソームは、野生型のプロテアソームに比べてその活性が低下しているものであればよく、特に限定はされないが、例えば、プロテアソーム活性が１０~５０％低下したものが好ましく挙げられ、また該活性は、２０~５０％低下したものや、３０~５０％低下したものや、４０~５０％低下したものや、１０~４０％低下したものや、１０~３０％低下したものや、１０~２０％低下したものであってもよい。プロテアソーム活性の低下は、例えば、脳（好ましくは、小脳、大脳皮質、海馬）、肝臓、腎臓、精巣、脾臓、心筋、骨格筋などの臓器又は組織において発現しているプロテアソームにおいて確認することができる。
　プロテアソーム活性は、例えば、プロテアソームのペプチダーゼ活性を蛍光ペプチド基質ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣを用いて測定される活性が好ましく挙げられ、その他にも、ポリユビキチン化タンパク質の分解を指標として測定される活性や、ユビキチン陽性凝集体形成の組織学的解析のようにして測定される活性が好ましく挙げられる。
　本発明の非ヒト動物において、機能が減弱されたプロテアソームは、限定はされないが、例えば、標準型の２６Ｓプロテアソームを構成するいずれか１つ又は複数のサブユニットのタンパク質に変異が導入されたものが挙げられる。当該変異は、限定はされないが、例えば、上記サブユニットのアミノ酸配列における、アミノ酸残基の置換、欠失及び／又は付加がされた変異であることが好ましい。当該置換、欠失及び／又は付加がされるアミノ酸残基の数は、限定はされないが、例えば、１~２０個、１~１５個、１~１０個、又は１~５個とすることができる。
　また、具体的な態様としては、前記機能が減弱されたプロテアソームは、限定はされないが、標準型の２６Ｓプロテアソームを構成する触媒サブユニット（ＣＰ：ｃｏｒｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ；「２０Ｓプロテアソーム」）と制御サブユニット（ＲＰ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐａｒｔｉｃｌｅ；「１９Ｓ複合体」）のうちの、１９Ｓ複合体を構成するサブユニットに変異が導入されたものであることが好ましく、より具体的には、例えば、１９Ｓ複合体のｌｉｄ部分の構成サブユニットの１つであるＰＳＤＭ１２タンパク質（Ｒｐｎ５タンパク質）に変異が導入されたものであることが好ましい。ＰＳＤＭ１２タンパク質は、プロテアソームの保存されたサブユニットであり、プロテアソームの正確な集合と活性のために必要とされると考えられている。また、ＰＳＤＭ１２タンパク質やその遺伝子の変異は致死とはならないものであることから、本発明者は、ＰＳＤＭ１２タンパク質の変異は、プロテアソームの軽度な機能低下を引き起こす、つまり、機能が減弱されたプロテアソームを生じさせ得ることに着目した。
　ＰＳＤＭ１２タンパク質における前記変異は、限定はされないが、例えば、ＰＳＤＭ１２タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端側の領域において、アミノ酸残基の置換、欠失及び／又は付加がされた変異であることが好ましい。当該置換、欠失及び／又は付加は、限定はされないが、例えば、野生型のＰＳＤＭ１２タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端から数えて、２０個目までのアミノ酸残基に対してなされたものであることが好ましく、また、３０個目までや、４０個目までや、５０個目までや、６０個目までのアミノ酸残基に対してなされたものであってもよい。また、当該置換、欠失及び／又は付加がされるアミノ酸残基の数は、限定はされないが、例えば、１~２０個、１~１５個、１~１０個、又は１~５個とすることができる。
　本発明の非ヒト動物において、前記変異が導入されたＰＳＤＭ１２タンパク質としては、具体的には、例えば、下記（ａ）~（ｃ）のタンパク質が好ましく挙げられる。
　（ａ）配列番号４、６又は８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
　（ｂ）配列番号４、６又は８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、減弱されたプロテアソームの機能を有する、タンパク質。
　（ｃ）配列番号４、６又は８に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、減弱されたプロテアソームの機能を有する、タンパク質。
　なお、野生型のＰＳＤＭ１２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示されるものである。配列番号２のアミノ酸配列（４５６アミノ酸）は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）において、「ＮＰ＿０８０１７０」のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒで登録されている。
　上記配列番号４、６、及び８に示されるアミノ酸配列は、それぞれ順に、後述する実施例において示されているクローン＃１７のマウス、クローン＃５３のマウス、及びクローン＃３６のマウスにおいて発現し得る変異型ＰＳＤＭ１２タンパク質のアミノ酸配列である。
　上記クローン＃１７のマウスは、限定はされないが、例えば、受領番号がＮＩＴＥ　ＡＢＰ−０３５４３であるマウスの受精卵から作出することができる。受領番号がＮＩＴＥ　ＡＢＰ−０３５４３である受精卵は、「ＰＳＭＤ１２ｐ．Ｌｅｕ４３８Ｇｌｙ」と称し２０２１年１０月７日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８　１２２号室）に国際寄託されたものである。
　上記クローン＃５３のマウスは、限定はされないが、例えば、受領番号がＮＩＴＥ　ＡＢＰ−０３５４５であるマウスの受精卵から作出することができる。受領番号がＮＩＴＥ　ＡＢＰ−０３５４５である受精卵は、「ＰＳＭＤ１２ｐ．Ｓｅｒ４３７Ｐｈｅｆｓ３」と称し２０２１年１０月７日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８　１２２号室）に国際寄託されたものである。
　上記クローン＃３６のマウスは、限定はされないが、例えば、受領番号がＮＩＴＥ　ＡＢＰ−０３５４４であるマウスの受精卵から作出することができる。受領番号がＮＩＴＥ　ＡＢＰ−０３５４４である受精卵は、「ＰＳＭＤ１２ｐ．Ｓｅｒ４３７Ｌｅｕｆｓ９」と称し２０２１年１０月７日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８　１２２号室）に国際寄託されたものである。
　配列番号４のアミノ酸配列（４３８アミノ酸）は、野生型のＰＳＤＭ１２タンパク質のアミノ酸配列に比べてＣ末端側の１８アミノ酸が欠失したものであり、かつ、第４３８番目のアミノ酸が野生型のアミノ酸から変異しているものである。
　配列番号６のアミノ酸配列（４３９アミノ酸）は、野生型のＰＳＤＭ１２タンパク質のアミノ酸配列に比べてＣ末端側の１７アミノ酸が欠失したものであり、かつ、第４３７番目~第４３９番目のアミノ酸が野生型のアミノ酸から変異しているものである。
　配列番号８のアミノ酸配列（４４５アミノ酸）は、野生型のＰＳＤＭ１２タンパク質のアミノ酸配列に比べてＣ末端側の１１アミノ酸が欠失したものであり、かつ、第４３７番目~第４４０番目及び第４４２番目~第４４５番目のアミノ酸が野生型のアミノ酸から変異しているものである。
　ここで、上記（ｂ）のタンパク質において、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、１個~１０個程度、好ましくは１~数個、１~５個、１~４個、１~３個、１~２個、又は１個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であることが好ましい。当該欠失、置換又は付加等の変異の導入は、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、及びＴａＫａＲａ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　ｋｉｔ、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、上記欠失、置換又は付加の変異が導入されているかどうかは、各種アミノ酸配列決定法、並びにＸ線及びＮＭＲ等による構造解析法などを用いて確認することができる。
　上記（ｃ）のタンパク質における「同一性」は、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることがより好ましい。
　上記（ｂ）及び（ｃ）のタンパク質において、「減弱されたプロテアソームの機能を有する」とは、前述したように、野生型のプロテアソームに比べてその活性が低下しているものであればよく、当該活性の具体的な例示についても前述の説明が適用できる。
　本発明の非ヒト動物は、前述のとおり、プロテアソームの機能が減弱された非ヒト動物であるが、より具体的には、前記機能が減弱されたプロテアソームを発現するように、遺伝子変異が導入されたものであることが好ましい。詳しくは、当該遺伝子変異は、限定はされないが、例えば、標準型の２６Ｓプロテアソームを構成するいずれか１つ又は複数のサブユニットのタンパク質をコードする遺伝子に導入された変異が挙げられる。
　また、具体的な態様としては、当該遺伝子変異は、標準型の２６Ｓプロテアソームを構成する触媒サブユニット（ＣＰ：ｃｏｒｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ；「２０Ｓプロテアソーム」）と制御サブユニット（ＲＰ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐａｒｔｉｃｌｅ；「１９Ｓ複合体」）のうちの、１９Ｓ複合体を構成するサブユニットのタンパク質をコードする遺伝子に導入された変異であることが好ましく、より具体的には、例えば、１９Ｓ複合体のｌｉｄ部分の構成サブユニットの１つであるＰＳＤＭ１２タンパク質（Ｒｐｎ５タンパク質）をコードする遺伝子に導入された変異であることが好ましい。
　本発明の非ヒト動物において、上述のような遺伝子変異の導入の方法としては、限定はされず、公知の遺伝子組換え技術や、遺伝子変異導入技術等を採用することができる。例えば、変異型遺伝子として用いるＤＮＡは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　４ｔｈ　ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調製することができる。具体的には、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。また、所望の変異型タンパク質をコードするＤＮＡが得られるように例えばミスセンス変異が導入されるように設計したＰＣＲプライマー等を用い、野生型タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ等をテンプレートとして、適当な条件下でＰＣＲを行うこともできる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いて、所望の遺伝子変異を有する非ヒト動物を作出することもできる。
　本発明の非ヒト動物において、前記変異が導入されたＰＳＤＭ１２タンパク質をコードする遺伝子としては、具体的には、例えば、下記（ａ）~（ｃ）のＤＮＡを含む遺伝子が好ましく挙げられる。
　（ａ）配列番号３、５又は７に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
　（ｂ）配列番号３、５又は７に示される塩基配列からなるＤＮＡ（すなわち上記（ａ）のＤＮＡ）に対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ減弱されたプロテアソームの機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　（ｃ）配列番号３、５又は７に示される塩基配列からなるＤＮＡ（すなわち上記（ａ）のＤＮＡ）と８０％以上の同一性を有するＤＮＡであり、かつ減弱されたプロテアソームの機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　なお、野生型のＰＳＤＭ１２タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子である。配列番号１の塩基配列は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）において、「ＮＭ＿０２５８９４」のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒで登録されている。
　上記配列番号３、５、及び７に示される塩基配列は、それぞれ順に、後述する実施例において示されているクローン＃１７のマウス、クローン＃５３のマウス、及びクローン＃３６のマウスにおいて発現し得る変異型ＰＳＤＭ１２タンパク質をコードする塩基配列である。
　上記クローン＃１７、＃５３、及び＃３６のマウスは、限定はされないが、例えば、それぞれ順に、受領番号がＮＩＴＥ　ＡＢＰ−０３５４３、ＮＩＴＥ　ＡＢＰ−０３５４５、及びＮＩＴＥ　ＡＢＰ−０３５４４であるマウスの受精卵から作出することができる。またこれらの受精卵はいずれも前述のとおり国際寄託されたものである。
　配列番号３の塩基配列（１３１７塩基）は、前述した配列番号４のアミノ酸配列をコードするものであり、より詳しくは、野生型のＰＳＤＭ１２タンパク質をコードする塩基配列中の２塩基（具体的には、配列番号１の塩基配列の番号付けでいうところの第１３６１番目及び第１３６２番目の２塩基（ｃｔ））が欠失したものである。なお、配列番号３の塩基配列における終始コドンにあたる配列（ｔａａ）は、配列番号１の塩基配列の番号付けでいうところの第１３６６番目~第１３６８番目の塩基に対応するものである。
　配列番号５の塩基配列（１３２０塩基）は、前述した配列番号６のアミノ酸配列をコードするものであり、より詳しくは、野生型のＰＳＤＭ１２タンパク質をコードする塩基配列中に（具体的には、配列番号１の塩基配列の番号付けでいうところの第１３５８番目の塩基と第１３５９番目の塩基の間に）１塩基（ｔ）が付加されたものである。なお、配列番号５の塩基配列における終始コドンにあたる配列（ｔａａ）は、配列番号１の塩基配列の番号付けでいうところの第１３６６番目~第１３６８番目の塩基に対応するものである。
　配列番号７の塩基配列（１３３８塩基）は、前述した配列番号８のアミノ酸配列をコードするものであり、より詳しくは、野生型のＰＳＤＭ１２タンパク質をコードする塩基配列中の１塩基（具体的には、配列番号１の塩基配列の番号付けでいうところの第１３５８番目の塩基（ｔ））が欠失したものである。なお、配列番号７の塩基配列における終始コドンにあたる配列（ｔａｇ）は、配列番号１の塩基配列の番号付けでいうところの第１３８６番目~第１３８８番目の塩基に対応するものである。
　ここで、上記（ｂ）のＤＮＡは、上記（ａ）のＤＮＡ若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、及びサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、ｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。
　ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　４ｔｈ　ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等を適宜参照することができる。
　ハイブリダイゼーション法の実施における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩濃度が１５~３３０ｍＭ、温度が２５~６５℃、好ましくは塩濃度が１５~１５０ｍＭ、温度が４５~５５℃の条件を意味する。具体的には、例えば８０ｍＭで５０℃等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件も考慮し、上記（ｂ）のＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
　上記（ｃ）のＤＮＡにおける「同一性」は、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることがより好ましい。
　上記（ｂ）及び（ｃ）のＤＮＡにおいて、「減弱されたプロテアソームの機能を有する」とは、前述したように、野生型のプロテアソームに比べてその活性が低下しているものであればよく、当該活性の具体的な例示についても前述の説明が適用できる。
　本発明に用い得る非ヒト動物としては、限定はされないが、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、イタチ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ及びウマ等のヒトを除く哺乳類動物が挙げられ、なかでも、マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類（ネズミ目）動物が好ましく、より好ましくはマウスである。
　本発明の非ヒト動物は、プロテアソームの機能が減弱されているという態様を示すものである。このことから、本発明の非ヒト動物は、例えば、プロテオスタシス異常を有するモデル動物として用いることができ、より具体的には、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態のモデル動物として用いることができる。
　ここで、プロテオスタシス異常とは、一般的に、タンパク質恒常性の破綻に伴い異常タンパク質が蓄積している状態などが好ましく例示できる。また、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態とは、限定はされないが、例えば、成長遅延（例えば、頭部形態異常、動き出し遅延）、腎機能障害、肝機能異常、横隔膜ヘルニア、小脳異常、神経変性疾患、痛覚異常（例えば、上位中枢系の痛覚異常）、難治性がん、慢性炎症疾患、動脈硬化、糖尿病（例えば、糖代謝異常）、及び老化などが好ましく挙げられる。
３．スクリーニング方法
　前述のとおり、本発明の非ヒト動物は、プロテオスタシス異常を有するモデル動物、より具体的には、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態のモデル動物として用いることができるため、当該異常や当該疾患、症状又は病態の治療薬等の開発において有用なものである。そこで本発明は、上記モデル動物を用いた、プロテオスタシス異常、あるいはプロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防薬のスクリーニング方法、並びに当該方法により得られるプロテオスタシス異常、あるいはプロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防薬を提供することができる。ここで、プロテオスタシス異常や、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態の具体例としては、前述した説明が適用できる。
　本発明において、プロテオスタシス異常、あるいはプロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防薬をスクリーニングする方法は、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む。
　（ａ）本発明の非ヒト動物（モデル動物）に候補物質を投与する工程（投与工程）
　（ｂ）候補物質投与後の前記非ヒト動物（モデル動物）のプロテオスタシス異常を評価する、あるいはプロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態を評価する工程（評価工程）
　上記投与工程において、被験動物としての上記モデル動物や、必要により用いる対照動物に投与する候補物質としては、限定はされないが、天然又は人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質（酵素や抗体を含む）、核酸（ポリヌクレオチド（ＤＮＡ，ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ等）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）、低分子、中分子又は高分子有機化合物等の様々な物質を例示することができる。
　候補物質の投与は、経口的又は非経口的に行うことができ、限定はされず、いずれの場合も公知の投与方法及び投与条件等を採用することができる。投与量についても、被験動物の種類及び状態、並びに候補物質の種類等を考慮して、適宜設定可能である。
　上記評価工程において、「プロテオスタシス異常を評価する」とは、又は、「プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態を評価する」とは、候補物質を投与した後における非ヒト動物のプロテオスタシス異常に関連する表現型、又は、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態に関連する表現型を解析することを意味し、候補物質の投与前後の非ヒト動物の上記表現型を比較検討すること、あるいは、候補物質を投与した被験動物と投与しない対照動物との上記表現型の比較検討を行うことのいずれをも意味するものである。
　上記表現型の解析においては、候補物質の投与により、プロテオスタシス異常あるいはそれに起因する疾患、症状又は病態が有意に改善されたり、プロテオスタシス異常あるいはそれに起因する疾患、症状又は病態の発生や進行が有意に抑制されていると評価できる場合は、当該候補物質を、プロテオスタシス異常あるいはそれに起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防薬として選択することができる。
　「対照動物」は、被験動物との比較対照に使用されるに適している限り限定されるものではなく、同腹の非トランスジェニックの非ヒト動物であっても、トランスジェニック動物でない野生型動物であってもよい。また、候補物質を投与しないトランスジェニック非ヒト動物を対照動物として用いることもできる。本発明の非ヒト動物と同腹又は同種の野生型非ヒト動物は、正確な比較実験を行うことができる点で対照動物として好ましい。また、被験動物及び対照動物は、同性及び同齢の動物を用いることが好ましく、飼育条件は同様であることも好ましい。
　なお、本発明のスクリーニング方法においては、必要に応じ、他の何らかの工程を含んでいてもよい。
４．医薬組成物
　本発明においては、プロテオスタシス異常の治療又は予防用医薬組成物や、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防用医薬組成物を提供することもできる。当該医薬組成物は、上述した本発明のスクリーニング方法により得られた治療又は予防薬を含むことが好ましい。プロテオスタシス異常や、当該異常に起因する疾患、症状又は病態の具体例としては、前述した説明が適用できる。
　上記医薬組成物の有効成分となる、本発明のスクリーニング方法により得られた治療又は予防薬としての物質としては、当該物質そのものに限定はされず、例えば、当該物質の誘導体も、代用又は併用することができる。当該誘導体としては、元のタンパク質や化合物等に由来の化学構造を有するなど、当業者の技術常識に基づいて当該誘導体と考えられるものであればよく、特に限定はされない。当該誘導体としては、例えば、生体内で酸化、還元、加水分解、又は抱合などの代謝を受けるものも包含するほか、生体内で酸化、還元、又は加水分解などの代謝を受けて有効成分として生成されるもの（いわゆるプロドラッグ）も含まれる。
　本発明の医薬組成物の有効成分としては、本発明のスクリーニング方法により得られた上記物質、上記誘導体もしくは上記プロドラッグと共に、又は当該物質、誘導体もしくはプロドラッグに代えて、それらの薬理学的に許容し得る塩を用いることもできる。薬理学的に許容し得る塩としては、限定はされないが、例えば、ハロゲン化水素酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、及びヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、及び重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、及びクエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、及びカンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えば、アスパラギン酸塩、及びグルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、及びカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、及びカルシウム塩など）などが好ましく挙げられる。
　本発明の医薬組成物の有効成分としては、化合物の構造上生じ得るすべての異性体（例えば、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、及び互変異性体等）及びこれら異性体の２種以上の混合物をも包含することができ、また、Ｓ−体、Ｒ−体又はＲＳ−体のいずれであってもよく、限定はされない。さらに、本発明の医薬組成物の有効成分は、その種類により水和物や溶媒和物の形で存在する場合も含むものとする。当該溶媒和物としては、限定はされないが、例えば、エタノールとの溶媒和物などが挙げられる。
　本発明の医薬組成物において、上述した有効成分の含有割合は、限定はされず、適宜設定することができるが、例えば、医薬組成物全体に対して、０．０１~９９重量％や、０．０１~３０重量％や、０．０５~２０重量％や、０．１~１０重量％の範囲内とすることができる。有効成分の含有割合が上記範囲内であることにより、本発明の医薬組成物は、プロテオスタシス異常や当該異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防効果を発揮することができる。
　本発明の医薬組成物は、対象とするヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、イタチ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、種々の投与経路、具体的には、経口、又は非経口（例えば静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、直腸投与、経皮投与）で投与することができ、投与経路に応じて慣用される方法により薬学的に許容し得る担体を用いて適当な剤形に製剤化して用いることができる。
　剤形としては、経口剤では、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、及びトローチ剤等が挙げられ、非経口剤では、例えば、注射剤（点滴剤を含む）、吸入剤、軟膏剤、点鼻剤、及びリポソーム剤等が挙げられる。なお、上述した各種経口剤とする場合、本発明の治療剤及び医薬組成物は、場合によりサプリメント剤（例えば機能性食品に該当する）として利用することもできる。
　これら製剤の製剤化に用い得る担体としては、例えば、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、及び矯味矯臭剤のほか、必要に応じ、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、及び無痛化剤等が挙げられ、医薬品製剤の原料として用いることができる公知の成分を配合して常法により製剤化することが可能である。
　当該成分として使用可能な無毒性のものとしては、例えば、大豆油、牛脂、及び合成グリセライド等の動植物油；流動パラフィン、スクワラン、及び固形パラフィン等の炭化水素；ミリスチン酸オクチルドデシル、及びミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；セトステアリルアルコール、及びベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、及びポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、及びメチルセルロース等の水溶性高分子；エタノール、及びイソプロパノール等の低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、及びポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；グルコース、及びショ糖等の糖；無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、及びケイ酸アルミニウム等の無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等の無機塩；精製水等が挙げられ、いずれもその塩またはその水和物であってもよい。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、及び二酸化ケイ素等が、結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、及びメグルミン等が、崩壊剤としては、例えば、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、及びカルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、及び硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、例えば、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、及び桂皮末等が、それぞれ好ましく挙げられ、いずれもその塩又はそれらの水和物であってもよい。
　また、ｐＨ調整剤は、注射剤として製剤化する場合等に使用される。ｐＨ調整剤としては、例えば、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容されるものであれば、特に制限されず、具体的には、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムエトキシド、カリウムブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物、水素化ナトリウム、水素化カリウムのようなアルカリ金属水素化物、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の炭酸塩、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。配合されるｐＨ調整剤は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。注射剤等として製剤化する場合は、ｐＨ調整剤を用いて適当なｐＨに適宜調整することができる。本発明においては、ｐＨは、３~６であることが好ましく、３~５であることがより好ましく、３~４．５であることがさらに好ましく、３．５~４．５であることが特に好ましい。
　なお、注射剤として製剤化する場合は、シクロデキストリン類を含有していてもよい。シクロデキストリン類は、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容されるものであれば、特に限定はされない。このようなシクロデキストリン類として、例えば、未修飾シクロデキストリン、修飾シクロデキストリン等が挙げられる。未修飾シクロデキストリンとして、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン等が挙げられる。また修飾シクロデキストリンとして、例えば、アルキル化シクロデキストリン（例えば、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン等）、ヒドロキシアルキル化シクロデキストリン（例えば、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン等）、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン（例えば、スルホブチルエーテル−α−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−γ−シクロデキストリン）、分岐シクロデキストリン（例えば、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン等）等が挙げられる。
　シクロデキストリン類は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。配合されるシクロデキストリン類は、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、又は、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンが好ましく、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンがより好ましい。
　シクロデキストリン類の含有量は特に限定されず、その種類、注射剤の用途、使用方法等に応じて適宜設定される。シクロデキストリン類の含有量として、例えば、注射剤の総量を基準に、５~５０重量％であることが好ましく、１０~４０重量％であることがより好ましく、１０~３０重量％であることがさらに好ましい。
　本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、製剤中の有効成分の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数（／１日）、投与期間等を勘案し、適宜、広範囲に設定することができる。
　本発明の医薬組成物を、非経口剤又は経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
　非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されないが、各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した有効成分等のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。
　非経口剤の投与量（１日あたり）は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した有効成分等を、適用対象（被験者、患者等）の体重１ｋｇあたり、０．０１~１０００ｍｇ、０．０５~５００ｍｇ、又は０．１~５０ｍｇ服用できる量とすることができ、あるいは０．５~２０ｍｇ服用できる量や１~１０ｍｇ服用できる量とすることもできる。
　経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、前述した剤形のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。当該経口剤には、前述した有効成分等のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン等）、充填材（乳糖、糖、コーンスターチ、馬鈴薯でんぷん、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（各種でんぷん等）、および湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）等が挙げられる。
　経口剤の投与量（１日あたり）は、一般には、前述した有効成分等を、適用対象（被験者、患者等）の体重１ｋｇあたり、０．０５~５０００ｍｇ、０．１~１０００ｍｇ、又は０．１~１００ｍｇ服用できる量とすることができ、あるいは０．５~５０ｍｇ服用できる量や１~１０ｍｇ服用できる量とすることもできる。また、経口剤中の有効成分の配合割合は、限定はされず、１日あたりの投与回数等を考慮して、適宜設定することができる。
　なお、本発明は、（ｉ）本発明の医薬組成物を用いること、具体的には例えば、本発明の医薬組成物の有効量を被験対象（プロテオスタシス異常や当該異常に起因する疾患、症状又は病態を患っている又は患っている恐れがある患者、あるいはそのような非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イタチ、ネコ、イヌ、サルなど））に投与することを含む、プロテオスタシス異常あるいは当該異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防方法、（ｉｉ）プロテオスタシス異常あるいは当該異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防用の薬剤を製造するための本発明の医薬組成物の使用、並びに、（ｉｉｉ）プロテオスタシス異常あるいは当該異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防用の本発明の医薬組成物の使用も含むものである。
　また、本発明において、プロテオスタシス異常や当該異常に起因する疾患、症状又は病態の治療としては、具体的には、例えば、当該異常や当該異常に起因する疾患、症状又は病態の治療の進行抑制、予後改善、及び／又は再発防止等も含まれる。
５．キット
　プロテオスタシス異常や当該異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防を行うに当たっては、前述した本発明の医薬組成物を含むキットを用いることができる。
　当該キットにおける医薬組成物中の有効成分の形態は、限定はされないが、安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮し、例えば溶解した状態で備えられていてもよい。
　当該キットは、本発明の医薬組成物以外にも、適宜、他の構成要素を含むことができる。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［方法］
Ｐｓｍｄ１２変異マウス（プロテアソーム機能減弱マウス）の作出
　本発明者は、プロテアソーム機能減弱マウスを作出するにあたり、２６Ｓプロテアソームを構成するサブユニットのうち、変異が致死とはならず、プロテアソームの機能を減弱させるのに適したサブユニットを種々検討した。その結果、ＰＳＭＤ１２（Ｒｐｎ５）タンパク質に着目し、ＰＳＭＤ１２の変異型タンパク質を発現するトランスジェニックマウス（Ｐｓｍｄ１２変異マウス）の作出を試みた。具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いて、ＰＳＭＤ１２タンパク質のＣ末端領域欠損マウスの作出を試みることにした。具体的には、Ｐｓｍｄ１２遺伝子のラストエクソン（Ｅｘｏｎ１１）を標的としたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とＣａｓ９タンパク質とを、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（日本クレア）の受精卵にインジェクションした。なお、上記ｇＲＮＡは、Ｐｓｍｄ１２遺伝子のＥｘｏｎ１１中の下記塩基配列（配列番号９）を標的配列として適宜設計したものを用いた。
　ＡＣＴＧＡＡＣＴＣＧＣＴＧＡＴＧＴＣＴＣ（配列番号９）
　次いで、得られたＦ０マウスにおいてＰｓｍｄ１２遺伝子に変異が導入されていることをゲノムｓｅｑｕｅｎｃｅにより確認した。また、変異型ＰＳＭＤ１２タンパク質の発現を確認するため、得られた各種Ｐｓｍｄ１２変異マウス（プロテアソーム変異マウス）のＦ０世代の尾から採取した細胞を初代培養し、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ解析を行った。
プロテアソーム機能減弱マウスのプロテアソーム活性測定
　ＭＥＦ（Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：マウス胎児線維芽細胞）及びマウス組織におけるプロテアソームの活性を測定した。ＭＥＦはＥ１２．５日胚をＰｒｉｍａｒｙ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　＃８８２７９）を用いて付属のプロトコルに従って作製した。１×１０６の野生型（ＷＴ）またはプロテアソームヘテロ変異マウスＭＥＦをＰＢＳで２回洗浄し、トリプシンを用いて回収した。回収した細胞をさらにＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、４ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＰＩＣ）ＥＤＴＡ　ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ））に＋０．２％　ＮＰ４０を加え細胞を溶解した。氷中で３０分静置後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心を行い、上清を回収した。マウス組織については、１０週齢ＷＴおよびプロテアソーム変異マウスの脳および肝臓を、１０ｍｌ凍結破砕用チューブ（安井器械）に回収し、液体窒素にて、組織を完全に凍結した。チューブに１０ｍｌ破砕チューブ用メタルコーン（安井器械）を加え、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて、組織を２，７００ｒｐｍ、１０秒で凍結破砕した。組織重量１０ｍｇに対して、７０μｌのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、４ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＰＩＣ）ＥＤＴＡ　ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ））を加え、懸濁し、超音波破砕処理を行った。超音波破砕処理後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心を行い、上清を回収した。得られた上清を０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過（５，０００ｒｐｍ、４℃、１分間）した。得られた組織抽出液をＰｉｅｒｃｅ　６６０ｎｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質濃度を算出した（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を標準タンパク質とした）。組織抽出液をＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒにて、５μｇ／３μｌに調製し、４×ｌｏａｄｉｎｇ　ｄｙｅ（０．１μｇ／μｌＸｙｌｅｎｅ　Ｃｙａｎｏｌ、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を１μｌ加えた後に、ＮｕＰＡＧＥ　３−８％　Ｔｒｉｓ　ａｃｅｔａｔｅ　ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて泳動した（１５０Ｖ、２４０分間、４℃）。泳動ｂｕｆｆｅｒとしてＴＢＥ　ｂｕｆｆｅｒ（９０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、８０ｍＭ　ｂｏｒａｔｅ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ　ＡＴＰ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ　ＤＴＴ）を使用した。Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ後のゲルを３７℃、３０分間でプレインキュベートを行った。２６Ｓおよび３０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様プロテアーゼ活性を評価するために、１００μＭ　Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−７−Ａｍｉｄｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｉｎ（Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、ペプチド研究所）、１ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴを含んだＢｕｆｆｅｒ　Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ）４ｍｌをゲルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣの加水分解による、ＡＭＣの蛍光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ　３４５ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ＝４４５ｎｍ）をＬＡＳ４０００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて可視化した（設定：ＤＡＰＩモード、標準的なＤＮＡ染色用）。
プロテアソーム機能減弱マウスの生育解析
　野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）およびプロテアソーム変異マウスの体重を、生後直後または生後１週目から１２週目まで１週毎に実施し、成長のモニタリングを行った。また、４週齢マウスの組織を採取し、各組織の重量を測定した。
組織学的解析
　１０週齢のＷＴおよびプロテアソーム変異マウスの組織を採取し、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液（４％ｉｎ０．１Ｍ　ＰＢＳ）に浸し、４℃で数日固定を行った。固定後、０．１Ｍ　ＰＢＳで洗浄し、７０％ドライゾール、８０％ドライゾール、９０％ドライゾール、９５％ドライゾール、１００％ドライゾール系列（関東化学）を用いて、３０分~１時間ずつ脱水処理を行った。脱水処理後、キシレン（ＭＥＲＣＫ）による脱脂を１時間ずつ３回行った。脱脂後のサンプルをパラフィン（富士フィルム和光）浸透し、パラフィンブロックを作製した。得られたパラフィンブロックをミクロトーム（Ｌｅｉｃａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＲＭ２２４５）により、５μｍに薄切し、剥離防止コートスライドガラス（松浪硝子）に貼り付け、３７℃のホットプレート上で、一晩乾燥させた。乾燥後のサンプルは４℃で保存した。パラフィン切片を、キシレンを用いた脱パラフィン後、１００％、９０％、７０％、５０％ドライゾールＮ系列（関東化学）および精製水により再水和を行った。再水和後、マイヤーヘマトキシリン（富士フィルム和光）およびエオジン（サクラファインテック）による染色を行い、１００％ドライゾールＮおよびキシレンにより脱水および透徹を行った後、マウントクイック（大道産業）にて封入した。
プロテアソーム機能減弱マウスの表現型の網羅的解析
　野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）およびプロテアソーム変異マウス（＃１７）の表現型の網羅的解析として、以下の、可視的検査、痛覚検査、血液生化学検査（肝機能、腎機能、糖代謝）を行った。
＜可視的検査＞
　ＲＩＫＥＮ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＳＨＩＲＰＡ法を用いて可視的検査を実施した。なお、ＲＩＫＥＮ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＳＨＩＲＰＡ法のＳｔａｎｄａｒｄ　Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（ＳＯＰｓ）に関しては、下記ＵＲＬのウェブサイトに詳細が記載されている。
　ｈｔｔｐｓ：／／ｊａ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｌａｂ／ｊｍｃ／ｍｏｕｓｅ＿ｃｌｉｎｉｃ／ＳＯＰｓ／Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ＿ｂｙ＿Ｐｌａｔｆｏｒｍ／Ｊａｐａｎ＿Ｍｏｕｓｅ＿Ｃｌｉｎｉｃ＿Ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ／ＲＩＫＥＮＭＰＰ＿００１＿００３＿０２＿ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ＳＨＩＲＰＡ＿ｖ３．ｘｍｌ
＜痛覚検査＞
Ｈｏｔ　ｐｌａｔｅテスト
　１７週~２８週齢の雄マウスを５２℃のプレート上にマウスを置き、後肢をなめるまでの潜時を測定した。カットオフタイムは６０秒とした。
Ｔａｉｌ　ｆｌｉｃテスト
　１７週~２８週齢の雄マウスの尾に熱刺激を与え、尾を振り動かすまでの潜時を測定した。測定を３回行い、中央値を解析に用いた。カットオフタイムは１０秒とした。
＜血液生化学検査＞
　血液生化学実験には、１７週~２８週齢のマウスを用いた。マウスの採血は、吸気麻酔下（イソフルラン吸入麻酔液「ファイザー」／マイラン＝ファイザー）で眼窩より行い、抗凝固剤コートの採血管（マイクロティナ　微量採血管　ＢＤ　マイクロガード　キャップ付き（ヘパリンリチウム）／ベクトン・ディッキンソン）に採取した。血液サンプルは、１回目、５０００ｇ、８℃で１０分間遠心し血漿を分注し、更に５０００ｇ、８℃で５分間遠心し、血漿サンプルと血球サンプルを得た。これらのサンプルを用いて、生化学自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ６０７０（日本電子）により肝機能（ＬＤＨ，ＡＳＴ）、腎機能（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ，Ｕｒｅａ）、糖代謝（Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ａ１ｃ）を測定した。
［結果］
プロテアソーム機能減弱マウスの確立
　Ｐｓｍｄ１２遺伝子のラストエクソン（Ｅｘｏｎ１１）を標的としたｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質をマウス受精卵にインジェクションし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法による変異導入を行ったところ、ｉｎｄｅｌ変異を持つＰｓｍｄ１２変異マウスを複数系統取得した（図２Ａ）。そのうちライン化に成功した３系統（クローン＃１７、＃５３、＃３６）についてゲノムｓｅｑｕｅｎｃｅを実施したところ、クローン＃１７のマウスではｃ．１３１２−１３（ＣＴ）の２塩基欠失、クローン＃５３のマウスではｃ．１３１０への１塩基挿入（Ｔ）、クローン＃３６のマウスではｃ．１３０９（Ｔ）の１塩基欠失という変異が、Ｐｓｍｄ１２遺伝子に導入されていた（図２Ｂ）。このように、変異部位の異なる３ラインのヘテロ接合型Ｐｓｍｄ１２変異マウス（系統名　＃１７：ｐ．Ｌｅｕ４３８Ｇｌｙ＊、＃５３：ｐ．Ｓｅｒ４３７Ｐｈｅｆｓ＊３、＃３６：ｐ．Ｓｅｒ４３７Ｌｅｕｆｓ＊９）の作出に成功した。以下、＃１７ヘテロ接合型変異マウスを「＃１７マウス」、＃５３ヘテロ接合型変異マウスを「＃５３マウス」、＃３６ヘテロ接合型変異マウスを「＃３６マウス」と表記する。
　プロテアソームヘテロ変異マウス同士の掛け合わせを行ったところ、＃１７マウスおよび＃５３マウスの２系統ではホモマウスを得ることが出来なかった。従って、＃１７および＃５３のホモ変異マウスは胎生致死であることが示唆された。一方で、ＰＳＭＤ１２のＣ末端欠損の度合いが最も小さい＃３６マウスではホモ変異マウスが得られた。以上より、ＰＳＭＤ１２のＣ末端欠損の度合いにより、プロテアソーム機能に与える影響が異なることが示唆された。
プロテアソーム活性の検討
　Ｐｓｍｄ１２ヘテロ変異の導入が実際にプロテアソーム活性に影響を及ぼすのか、ＷＴ及びＰｓｍｄ１２変異マウス由来のＭＥＦ（Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：マウス胎児線維芽細胞）を用いてプロテアソームの活性をｉｎ　ｇｅｌペプチダーゼアッセイ法により解析した。その結果、＃１７マウス及び＃５３マウス由来のＭＥＦにおいて２６Ｓプロテアソーム活性、特にＣＰの両端にＲＰが会合した３０Ｓプロテアソームの活性が著しく減弱することが明らかとなった（図３Ａ）。さらに、１０週齢ＷＴおよび＃１７マウスの肝臓と脳について抽出液を用いて上記と同様の方法でプロテアソーム活性を測定したところ、＃１７マウスでは２６Ｓプロテアソームの活性が、ＷＴと比べて脳で約３０％低下し、肝臓で約２０％低下していることが明らかとなった（図３）。以上の結果より、ＰＳＭＤ１２のヘテロ変異はプロテアソームの機能を低下させることが明らかとなった。
Ｐｓｍｄ１２変異が生育に及ぼす影響の検討
　Ｐｓｍｄ１２変異が生育に及ぼす影響を検討するために、生後１週目から１２週目までの体重測定を実施した。その結果、＃１７及び＃５３マウスはＷＴマウスと比較して雌雄ともに成長が遅延していることが明らかとなった（図４Ａ）。特に、ＰＳＭＤ１２のＣ末端欠損の度合いが最も大きい＃１７マウスは、３系統の中でも特に体格が小さく、肝臓、腎臓、精巣などの主要な臓器も小さいことが明らかとなった（図４Ｂ）。他方、＃３０のホモ変異マウスでは、ＷＴマウスと比較して成長遅延や運動障害の傾向があることが確認された。以上の結果から、本実施例で作出したプロテアソーム変異マウスは、発育障害を引き起こしていることが明らかとなった。
プロテアソーム変異マウスの組織学的解析
　プロテアソームの機能低下が各組織に及ぼす影響を詳細に解析するために、組織学的解析を実施した。１０週齢のＷＴ及び＃１７マウスの脳組織のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、顕微鏡にて形態を観察した。この結果、大脳皮質や海馬では目立った異常がないものの、＃１７マウスの小脳プルキンエ細胞の顕著な脱落が確認された（図５）。よって、プロテアソームの機能低下は小脳の機能異常を引き起こすことが示唆された。
プロテアソーム機能減弱マウスの表現型の網羅的解析
＜可視的検査＞
　プロテアソーム変異マウスの形態的・行動的検査特徴を検査するため可視的検査を行った。この結果、野生型と比較して＃１７マウスにおいて頭部形態に異常が見られたほか、床から３０ｃｍ程度の高さから落としてから再度動き出すまでの時間に遅れが見られた。これらの解析結果を、図６（Ａ）に示した。
＜痛覚検査＞
　プロテアソーム変異マウスの痛覚を検査するため、Ｈｏｔ　ｐｌａｔｅテスト及びＴａｉｌ　ｆｌｉｃテストを実施した。この結果、Ｔａｉｌ　ｆｌｉｃテストにおいてはＷＴと比較し差が見られなかったが、Ｈｏｔ　ｐｌａｔｅテストにおいては＃１７マウスの後肢舐め潜時が有意に長く、痛覚が鈍いことが明らかとなった。以上の結果より、脊髄反射には異常がないが。上位中枢を介した痛覚に異常があることが示唆された。これらの解析結果を、図６（Ｃ）に示した。
＜血液生化学検査＞
　ＷＴ及び＃１７マウス血液中のＬＤＨ，ＡＳＴ，Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ，Ｕｒｅａ，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ａ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の値を測定した。この結果、ＷＴと比較し、＃１７マウスでは血漿中のＬＤＨ，ＡＳＴ，Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ，Ｕｒｅａの値が上昇していることが明らかとなった、よって＃１７マウスは肝機能、腎機能が低下していることが示唆された。一方、＃１７マウスにおいてＨｂＡ１ｃの値が優位に減少していることから、糖代謝が亢進していることが示唆された。これらの解析結果を、図６（Ｂ）及び図７（Ａ），（Ｂ）に示した。
［考察］
　プロテアソームは全ての細胞に存在し、個体生存に必須であるため、これまでのコンディショナルノックアウトマウスを用いた従来の解析法では、「プロテアソームの要求性は組織により異なるのか、また、プロテアソーム活性は、どの時期・どの場所で必要なのか」といった、本質的な問いには答えられない状況であった。本実施例では、全身性のプロテアソーム機能減弱マウスの作出を試み、１９Ｓ複合体構成サブユニットの一つＰｓｍｄ１２遺伝子に変異を持つ、３系統のＰｓｍｄ１２変異マウス（Ｐｓｍｄ１２ヘテロ接合型変異マウス）を樹立することに成功した。これらの変異マウスはそれぞれ変異の度合いが異なり、特に、ＰＳＭＤ１２のＣ末端の欠失が最も大きい＃１７マウスで顕著な表現型を示した。このように、ＰＳＭＤ１２の変異の度合いによりプロテアソーム機能に与える影響が異なることが示唆された。また、本実施例で作出したプロテアソーム機能減弱マウスの化学的および組織学的解析の結果から、プロテアソーム機能の低下が個体に及ぼす影響は一様ではなく、プロテアソーム要求性は組織や部位により異なることが示唆された。
　本実施例で作出した全身性プロテアソーム機能減弱マウスの表現型は、成長遅延、腎障害などＰＳＭＤ１２変異発達障害患者に見られる多面的な症状とよく対応している。よって本研究で作出したプロテアソーム機能減弱マウスは、プロテアソーム関連疾患（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｏｐａｔｈｙ）モデルマウスとして有用であると考えられる。さらに、本実施例で作出した全身性プロテアソーム機能減弱マウスは、プロテアソーム病（プロテオスタシス異常や当該異常に起因する疾患、症状又は病態）モデルマウスとしてのみならず、当該プロテアソーム病の治療や予防等のためのプロテアソーム調節剤をｉｎ　ｖｉｖｏで評価することができる、ＵＰＳ創薬に利用し得る優れた動物モデルとなると考えられる。
　産業上の利用可能性
　本発明によれば、プロテアソームの機能が減弱された、好ましくは全身性プロテアソーム機能が減弱された、トランスジェニック非ヒト動物や、当該非ヒト動物を用いたプロテオスタシス異常を有するモデル動物又は該異常に起因する疾患、症状又は病態のモデル動物、さらには、プロテオスタシス異常又は該異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防薬のスクリーニング方法、及びその治療又は予防用医薬組成物などを提供することができる。
配列番号３：組換えＤＮＡ
配列番号４：組換えタンパク質
配列番号５：組換えＤＮＡ
配列番号６：組換えタンパク質
配列番号７：組換えＤＮＡ
配列番号８：組換えタンパク質
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Claims (20)

  1. 　プロテアソームの機能が減弱された、トランスジェニック非ヒト動物。
  2. 　前記機能の減弱が、全身性プロテアソーム機能の減弱である、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  3. 　前記機能が減弱されたプロテアソームは、プロテアソーム活性が１０~５０％低下したものである、請求項１又は２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  4. 　前記機能が減弱されたプロテアソームは、２６ＳプロテアソームのサブユニットであるＰＳＤＭ１２タンパク質に変異が導入されたものである、請求項１~３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  5. 　前記変異は、ＰＳＤＭ１２タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端側の領域において、アミノ酸残基の置換、欠失及び／又は付加がされたものである、請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  6. 　前記変異が導入されたＰＳＤＭ１２タンパク質が、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質である、請求項４又は５に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
    　（ａ）配列番号４、６又は８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
    　（ｂ）配列番号４、６又は８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、減弱されたプロテアソームの機能を有する、タンパク質。
    　（ｃ）配列番号４、６又は８に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、減弱されたプロテアソームの機能を有する、タンパク質。
  7. 　前記機能が減弱されたプロテアソームを発現するように、遺伝子変異が導入されたものである、請求項１~６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  8. 　前記遺伝子変異は、２６ＳプロテアソームのサブユニットであるＰＳＤＭ１２タンパク質をコードする遺伝子に導入された変異である、請求項７に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  9. 　非ヒト動物が齧歯類動物である、請求項１~８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  10. 　齧歯類動物がマウスである、請求項９に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  11. 　プロテオスタシス異常を有するモデル動物である、請求項１~１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  12. 　前記モデル動物が、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態のモデル動物である、請求項１１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  13. 　プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態が、成長遅延、腎機能障害、肝機能低下、横隔膜ヘルニア及び小脳異常からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  14. 　請求項１１に記載のトランスジェニック非ヒト動物に候補物質を投与する工程、及び該候補物質投与後の前記非ヒト動物のプロテオスタシス異常を評価する工程を含む、プロテオスタシス異常の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
  15. 　請求項１２に記載のトランスジェニック非ヒト動物に候補物質を投与する工程、及び該候補物質投与後の前記非ヒト動物のプロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態を評価する工程を含む、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
  16. 　プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態が、成長遅延、腎機能障害、肝機能低下、横隔膜ヘルニア及び小脳異常からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１５に記載のスクリーニング方法。
  17. 　請求項１４に記載のスクリーニング方法により得られた治療又は予防薬を含む、プロテオスタシス異常の治療又は予防用医薬組成物。
  18. 　請求項１５又は１６に記載のスクリーニング方法により得られた治療又は予防薬を含む、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防用医薬組成物。
  19. 　請求項１７に記載の医薬組成物を、プロテオスタシス異常を有している又は有している恐れがある患者に投与することを含む、プロテオスタシス異常の治療又は予防方法。
  20. 　請求項１８に記載の医薬組成物を、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態を患っている又は患っている恐れがある患者に投与することを含む、プロテオスタシス異常に起因する疾患、症状又は病態の治療又は予防方法。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013039065A (ja) * 2011-08-12 2013-02-28 Nagasaki Univ 自己炎症疾患又は自己免疫疾患関連遺伝子及びその利用
JP2015513317A (ja) * 2012-01-25 2015-05-07 プロテオステイシス セラピューティクス，インコーポレイテッド プロテアソーム活性を増強する化合物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013039065A (ja) * 2011-08-12 2013-02-28 Nagasaki Univ 自己炎症疾患又は自己免疫疾患関連遺伝子及びその利用
JP2015513317A (ja) * 2012-01-25 2015-05-07 プロテオステイシス セラピューティクス，インコーポレイテッド プロテアソーム活性を増強する化合物

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAEKI YASUSHI: "Understand the mechanism of the ubiquitin proteasome system and develop treatment strategies for related diseases!", LABORATORIES, DEPARTMENT OF MEDICAL INFORMATICS AND LIFE SCIENCES, GRADUATE SCHOOL OF FRONTIER SCIENCES, UNIV. OF TOKYO, 1 April 2021 (2021-04-01), XP093058973, Retrieved from the Internet <URL:https://www.cbms.k.u-tokyo.ac.jp/lab/rinsho.html#saeki> [retrieved on 20230629] *
SéBASTIEN KüRY, THOMAS BESNARD, FRéDéRIC EBSTEIN, TAHIR N. KHAN, TOMASZ GAMBIN, JESSICA DOUGLAS, CARLOS A. BAC: "De Novo Disruption of the Proteasome Regulatory Subunit PSMD12 Causes a Syndromic Neurodevelopmental Disorder", THE AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, AMERICAN SOCIETY OF HUMAN GENETICS , CHICAGO , IL, US, vol. 100, no. 2, 1 February 2017 (2017-02-01), US , pages 352 - 363, XP055482689, ISSN: 0002-9297, DOI: 10.1016/j.ajhg.2017.01.003 *
TANAKA KEIJI: "Proteasomes: Elucidation of the principle of operation and physiological pathology", 2018 FISCAL YEAR ANNUAL RESEARCH REPORT, 6 July 2021 (2021-07-06), XP093058972, Retrieved from the Internet <URL:https://kaken.nii.ac.jp/en/report/KAKENHI-PROJECT-26000014/260000142018jisseki> [retrieved on 20230629] *
YAMAMOTO, MIYUKI AND 6 OTHERS: "Morphological study of the submandibular gland in mice with reduced proteasome activity", ACTA ANATOMICA NIPPONICA, vol. 85, 2010, pages 142, ISSN: 0022-7722 *

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