WO2023063337A1 - Method for producing substantially pure d-talitol or allitol - Google Patents

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WO2023063337A1
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allitol
talitol
allulose
microorganism
burkholderia
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PCT/JP2022/037982
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志郎 加藤
健 何森
明秀 吉原
進 望月
和也 秋光
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国立大学法人香川大学
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing substantially pure D-talitol or allitol from a mixture of D-talitol and allitol obtained by hydrogenating D-allulose.
  • D-allulose is the D-form of allulose, which is classified as ketohexose.
  • D-allulose also known as D-psicose, is an epimer of D-fructose and is similar in sweetness to D-fructose, but its sweetness is about 70% that of sugar, giving it a refreshing and sharp sweetness.
  • D-allulose has been proven to be zero kcal (Non-Patent Document 3) in human studies (Non-Patent Document 6) and animal studies (Non-Patent Document 7), respectively.
  • Non-Patent Document 4 Postprandial blood sugar suppressing effect
  • D-glucose which constitutes digestible sugar ingested with food and beverages
  • Patent Document 5 anti-obesity effect
  • D-allulose is available by any means, including those extracted from nature, those synthesized by chemical or biological methods, and the like.
  • D-allulose is a rare sugar and was very difficult to obtain in large quantities, but now it is possible to produce high-purity D-allulose in large quantities through a reaction using epimerase. rice field.
  • D-allulose can be produced more efficiently than D-fructose using D-allulose 3-epimerase (DAE), and can be produced in large quantities with a high performance liquid chromatography (HPLC) purity of almost 100%. It is possible to produce it (Non-Patent Document 1).
  • Ketose 3-epimerase is an enzyme that catalyzes the isomerization (epimerization reaction) of the hydroxyl group at the 3-position of ketohexose.
  • EC 5.1.3.30 is an enzyme that epimerizes D-allulose to D-fructose and D-fructose to D-allulose.
  • DAEs from multiple microorganisms have been found with equilibrium reaction ratios of D-allulose: D-fructose ranging from 27:73 to 33:67.
  • An object of the present invention is to produce pure D-talitol from a mixture of sugar alcohols D-talitol and allitol obtained by hydrogenating D-allulose.
  • D-talitol is intended to be efficiently mass-produced in a pure form as a raw material for D-tagatose, and allitol, which is a by-product of the D-talitol production stage, can also be a raw material for D-allulose.
  • allulose has an anti-obesity effect equal to or greater than that of D-allulose.
  • this separation of allitol by crystallization is a process of reducing the content of allitol.
  • the mixed solution with an increased D-talitol content and a decreased allitol content compared to before separation is passed through a chromatography column to collect a D-talitol fraction containing no allitol. or by treating with a microorganism that acts on allitol but not on D-talitol to degrade allitol to obtain substantially pure D-talitol.
  • the mixture (A) of D-talitol and allitol is reacted with a microorganism capable of producing D-allulose from allitol to produce D-allulose from allitol, which is passed through a chromatography column. , a D-talitol fraction free of D-allulose can be collected. D-talitol and D-allulose can be purified relatively easily because their chromatographic elution positions are farther apart than those of D-talitol and allitol.
  • the gist of the present invention is the method for producing substantially pure D-talitol (B) or allitol (C) of the following (1) to (8).
  • a method for producing substantially pure D-talitol (B) or allitol (C) from a mixture (A) of D-talitol and allitol comprising: (a) Crystals (A-1) with a higher allitol ratio than before crystallization and crystals (A-1) with a higher ratio of allitol than before crystallization, and obtaining a mixed solution (A-2) in which the content of D-talitol is increased and the content of allitol is decreased;
  • the mixed solution (A-2), i) collect an allitol-free D-talitol fraction through a chromatography column, or ii) treat with an allitol-affecting but not D-talitol-affecting microorganism to degrade allitol.
  • the mixture (A) of D-talitol and allitol is prepared by using D-allulose as a raw material and reducing D-allulose with hydrogen under a metal catalyst under high temperature and pressure to obtain a mixture of D-talitol and allitol.
  • the method according to (1) above which is obtained by a hydrogenation step to produce (3)
  • the crystal (A-1) having a higher allitol ratio than before the crystallization is subjected to a repeated crystallization operation, or the crystal having a higher allitol ratio is washed with an allitol solution to obtain a substantially pure crystal.
  • a microorganism (a) ii) that acts on allitol but does not act on D-talitol a microorganism (a) that has the ability to produce D-allulose from allitol and at the same time has DAE is selected.
  • D-allulose converted from allitol by action is converted to D-fructose by the action of DAE and is metabolically decomposed in the bacteria to degrade allitol, or has the ability to produce D-allulose from allitol.
  • a microorganism (b) that does not have DAE is selected, immobilized DAE is allowed to coexist, and D-allulose converted from allitol by the action of allitol is converted to D-fructose outside the cells by the action of DAE.
  • the genus Burkholderia, the genus Enterobacter, the genus Agrobacterium The method according to any one of (1) to (4) above, wherein the microorganism is selected from the group consisting of bacteria belonging to the genus Agrobacterium, the genus Buttiauxella, the genus Lelliottia, and the genus Pantoea. . (6) the microorganism is Burkholderia lata, Burkholderia multivorans, Burkholderia diffusa, Enterobacter hormaechei, Enterobacter solibacter ), Agrobacterium pusense, Buttiauxella brennerae, Butiauxella sp. (5) above, which is selected from the group consisting of the bacterial species Buttiauxella sp., Lelliottia jeotgali, and Pantoea sp.
  • the microorganism having the ability to produce D-allulose from allitol in (a) above and having DAE at the same time is Burkholderia lata, Burkholderia diffusa, Agrobacterium psensus (Agrobacterium pusense), the method according to any one of (4) to (6) above.
  • the microorganism having the ability to produce D-allulose from allitol in (b) and having no DAE is Burkholderia lata, Burkholderia multivorans, Burkholderia multivorans Burkholderia diffusa, Enterobacter hormaechei, Enterobacter soli, Buttiauxella brennerae, Buttiauxella sp. (Buttiauxella sp.), Lelliottia jeotgali, and Pantoea sp.
  • pure D-talitol which is a raw material for D-tagatose, which is one of the rare sugars, and allitol, a by-product of the production of D-talitol, can be easily mass-produced.
  • the by-product allitol can be converted to the starting material D-allulose and reused. Hydrogenation is adopted for mass production using D-allulose as a raw material, so D-allulose becomes allitol and D-talitol, and a mixture of D-talitol and allitol is the starting material.
  • This allitol is treated with a microorganism capable of producing D-allulose from allitol but not capable of converting D-talitol to convert allitol to D-allulose, which is passed through a chromatography column to obtain D-allulose.
  • - Mass production of D-talitol becomes possible by collecting the D-talitol fraction containing no allulose.
  • allitol is a by-product of the D-talitol production stage, but it can also be used as a raw material for D-allulose. There is a technical contribution to efficient mass production in a variety of forms.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the allitol-degrading process of microorganisms that have the ability to convert to DAE at the same time with the Izumofleet formula.
  • an allitol-degrading step using a microorganism that degrades allitol but cannot degrade D-talitol to obtain only pure D-talitol, wherein the microorganism (b) converts allitol to D-allulose It is a microorganism that has the ability to convert to DAE and does not have DAE, and is a drawing explaining the allitol degradation process in the coexistence of immobilized DAE with the Izumofleet formula.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 The basic rules of the Izumofleet formula shown in Non-Patent Documents 1 and 2 are shown. That is, for aldoses, ketoses, and polyols, the Fischer projection formula and the Izmo-fleet structure are compared to show the notation principle of the Izmo-fleet structure, which is a pattern graphic. For example, D-glucose displayed in the Fisher projection formula, when divided into combinations of elements other than carbon to which each carbon is bonded, "CHO”, “HC-OH”, “HO-C- H”, “HC-OH”, “HC-OH” and "CH 2 OH". Details of each corresponding pattern diagram are shown in the lower part of FIG.
  • FIG. 4 shows that the pattern corresponding to each combination with the element other than carbon to which the carbon is bonded is determined in advance, and the combination of each carbon contained in the sugar and the element other than carbon to which the carbon is bonded. , and patterns.
  • the combination of aldehyde groups “CHO” corresponds to a pattern of circles with short vertical bars at the bottom.
  • a combination of ketone groups “C ⁇ O” corresponds to a pattern of circles with short vertical bars above and below.
  • D-talitol which is the raw material for D-tagatose, one of the rare sugars, and allitol, which is a by-product of the D-talitol production stage, are produced in pure form.
  • the mixture of D-talitol and allitol is prepared from D-allulose as a raw material, and D-allulose is subjected to high temperature and high pressure treatment under a metal catalyst.
  • D-allulose has a relationship with a mixture of D-talitol and allitol and raw material D-allulose, and when allitol is removed from the reaction system, a microorganism having the ability to produce D-allulose from allitol is allowed to act. , in relation to the product of allitol in the production of D-allulose.
  • D-allulose contaminating as a by-product of D-tagatose when D-allulose is produced by allowing microorganisms capable of producing D-allulose from allitol to act on allitol, a byproduct of the D-talitol production stage. , obtained as a mixture of D-tagatose and D-allulose.
  • D-allulose can be separated to obtain substantially pure D-tagatose, which can be used as a mixture for food applications.
  • Allitol and D-talitol are polyols (sugar alcohols) and rare sugars. D-talitol is oxidatively converted to D-tagatose by the action of acetic acid bacteria. Therefore, in the production of D-tagatose, D-talitol is a raw material, but allitol is a by-product and is removed from the reaction system. Allitol is a sugar alcohol with 6 carbon atoms produced by reduction of D-allulose, and it is thought that it exists dynamically back and forth through oxidation-reduction with D-allulose in zuina, a deciduous shrub.
  • the present invention adopts the process of hydrogenation for mass production, takes D-allulose as raw material, and obtains a mixture of allitol and D-talitol.
  • raw material D-allulose is reduced with hydrogen under high temperature and high pressure in the presence of a metal catalyst to produce a mixture of D-talitol and allitol (see Patent Document 3).
  • the method of industrially reducing (hydrogenating) the raw material D-allulose at low cost was adopted.
  • the metal catalyst used is a catalyst containing a metal selected from the elements of groups 8 to 10 of the periodic table.
  • Elements of Groups 8 to 10 of the Periodic Table refer to elements of the iron, cobalt, nickel and platinum groups.
  • the platinum group elements refer to the six elements of ruthenium, rhodium, palladium, osmium, iridium, and platinum.
  • metals selected from elements of Groups 8 to 10 of the periodic table metals selected from nickel and platinum group elements are preferably used as catalysts in the present invention.
  • metals selected from nickel, ruthenium, platinum and palladium are preferable in terms of hydrogenation ability. It was confirmed that ruthenium and platinum have a higher hydrogenation ability than palladium, that these reactions can be hydrogenated under low temperature and low pressure conditions, and that they have higher catalytic ability than copper chromium, Raney cobalt, and the like.
  • a so-called Raney nickel catalyst obtained by treating an alloy of nickel and aluminum or the like with caustic alkali or the like is preferable because it increases the reaction rate by increasing the surface area, that is, its catalytic activity is high.
  • the properties of the catalyst used for the reduction reaction are not only determined by the type of metal, but are also affected by the carrier on which the metal is carried.
  • supports for supporting the metal catalyst used include activated carbon, metal oxides such as titanium oxide and alumina, barium sulfate, and diatomaceous earth.
  • the mode of implementation of this step is not particularly limited, but usually, the raw material D-allulose is dissolved in a solvent such as water, and the above-mentioned metal catalyst is added to the solution.
  • the hydrogenation reaction of D-allulose is carried out by pressurizing.
  • Water is usually used as the solvent, but alcohol solvents such as ethanol, methyl acetate, ethyl acetate, mixed solvents thereof, and mixed solvents of these and water can also be used.
  • the concentration of D-allulose in the reaction solution is usually 1 to 60 w/v%, preferably 5 to 50 w/v%.
  • the reaction temperature is usually 10 to 150°C, preferably 10 to 70°C, more preferably 30 to 60°C, so as to make it difficult to produce reaction by-products.
  • the reaction pressure is generally 1 to 200 kg/cm 2 (gauge pressure), preferably 5 to 100 kg/cm 2 .
  • the progress of the reaction in this step can be confirmed by sampling the reaction solution at regular intervals and analyzing D-allulose, the sugar alcohol D-talitol and allitol to be produced.
  • HPLC or the like is preferably used for the analysis of D-allulose and the sugar alcohol D-talitol and allitol to be produced.
  • the catalyst can be easily removed by filtration, decantation, centrifugation, filtration and the like. By removing the catalyst in this manner, a solution containing the desired sugar alcohol is obtained.
  • an optically active substance for inducing diastereoisomerism that is, an asymmetric source
  • the production ratio of sugar alcohols can be changed.
  • chiral sources include boric acid, cinchonidine, cinchonine, ephedrine, quinidine, brucine, etc., alkaloids such as quinine and strychnine, sugars such as D-mannitol and derivatives thereof, menthol, camphor, terpene, and L-tartaric acid.
  • hydroxy acids such as L-lactic acid and L-malic acid
  • amino acids such as L-leucine, L-cystine and L-cysteine.
  • a synthetic asymmetric source molecularly designed for the purpose of diastereoisomeric reduction together with a catalyst containing a metal selected from nickel, ruthenium, platinum and palladium.
  • Such synthetic asymmetric sources include existing asymmetric phosphines such as BINAP.
  • the production ratio of D-talitol and allitol can be changed depending on the type of metal catalyst used. That is, the production ratio of two or more sugar alcohols changes depending on conditions such as the type of catalyst metal and the type of support.
  • D-talitol and allitol when Raney nickel is used, D-talitol:allitol is preferably produced in a ratio of about 50:50 to 40:60, and when platinum is used, D-talitol is preferred. : Allitol is preferable for obtaining a production ratio of about 30:70 to 42:58. In this way, a mixture rich in D-talitol can be easily obtained, making it easier to obtain pure D-talitol if necessary.
  • allitol crystallizes out when the mixture is concentrated, leaving the remaining mixture with less concentrated allitol relative to D-talitol.
  • this separation of allitol by crystallization is a process of reducing the content of allitol.
  • the reaction solution was sampled at regular intervals and subjected to HPLC analysis to obtain the results of obtaining the ratios of allitol and D-talitol in the water of crystallization and the mother liquor.
  • the crystallization operation By repeating the crystallization operation from , it is possible to preferentially crystallize allitol, and it is also possible to obtain pure allitol.
  • High-purity allitol can also be obtained by washing primary crystals obtained from a mixed aqueous solution of allitol and D-talitol with an allitol solution. By repeating this crystallization operation, crystals with a higher proportion of allitol than before crystallization are obtained, and finally 100% allitol crystals are obtained.
  • the obtained allitol can also be used as raw material D-allulose, and in recent years it has been reported to have an anti-obesity effect equal to or greater than that of D-allulose, so it can be used as a functional substance. .
  • the mixed solution with an increased D-talitol content and a decreased allitol content compared to before crystallization was i) passed through a chromatography column to obtain D-talitol containing no allitol.
  • Substantially pure D-talitol can be obtained by collecting the fraction or ii) degrading allitol by treatment with a microorganism that acts on allitol but not on D-talitol. In i) above, it becomes easier to purify and separate D-talitol and allitol from the remaining mixture of allitol and D-talitol by chromatography.
  • a microorganism that decomposes allitol but does not act on D-talitol is used.
  • a microorganism capable of producing D-allulose from allitol and at the same time having DAE is selected.
  • D-allulose converted from allitol within the microorganism is further converted to D-fructose by DAE and metabolically degraded within the microorganism.
  • microorganism (b) As the microorganism (b), a microorganism (b) having the ability to produce D-allulose from allitol and not having DAE is selected. As shown in FIG. 3, when the microorganism of (b) is allowed to act on allitol in the presence of immobilized DAE, D-allulose converted from allitol inside the microorganism is transformed into D- by the action of DAE outside the microorganism. It is converted to fructose, enters the cells and is metabolically decomposed, and allitol is decomposed.
  • Step of producing D-allulose from allitol by allowing a microorganism capable of producing D-allulose from allitol Further, after the hydrogenation step, as (a), a microorganism capable of producing D-allulose from allitol is allowed to act on the aqueous solution of the mixture (A) of D-talitol and allitol to convert D-allulose from allitol. can be manufactured.
  • Microorganisms having the ability to produce D-allulose from allitol include Burkholderia, Enterobacter, Agrobacterium, Butiaucthera, which do not have the ability to convert D-talitol.
  • the microorganism is Burkholderia ratta lata) ⁇ ⁇ (Burkholderia multivorans) ⁇ ⁇ (Burkholderia diffusa) ⁇ ⁇ (Enterobacter hormaechei) ⁇ ⁇ (Enterobacter soli) ⁇ ⁇ (Agrobacterium pusense) ⁇ ⁇ (Buttiauxella brennerae), Buttiauxella sp. (Buttiauxella sp.), Lelliottia jeotgali, and Pantoea sp. (Pantoea sp.).
  • D-talitol and D-allulose exist outside the cells. This is passed through a chromatography column to collect a D-talitol fraction containing no D-allulose. D-Talitol and D-allulose can be purified relatively easily because their chromatographic elution positions are separated.
  • Microorganisms that have the ability to produce D-allulose from allitol and do not have a DAE include Burkholderia spp., Enterobacter spp., A microorganism selected from the group consisting of bacteria belonging to the genera Buttiauxella, Lelliottia, and Pantoea.
  • Microorganisms having the ability to produce D-allulose from allitol and at the same time having a DAE belong to the genus Burkholderia or Agrobacterium, which do not have the ability to convert D-talitol as described above. Examples include Burkholderia lata, Burkholderia diffusa, and Agrobacterium pusense.
  • the present inventors used a soil library to search for microorganisms capable of producing D-allulose from allitol upon contact with an aqueous solution containing allitol.
  • any bacterium belonging to the genus Burkholderia that has been confirmed to have the ability to produce D-allulose from allitol can be used as long as it has the ability.
  • Burkholderia martivorans S332-4 1 strain
  • Burkholderia martivorans Y555-2d 2 strains
  • Burkholderia diffusa Y452-1 3 strains dated April 30, 2021, respectively.
  • strains were subsequently deposited on February 1, 2022 under accession numbers NITE BP-03413, NITE BP-03410, NITE BP-03412, NITE BP-03408, NITE BP-03414, NITE BP-03411.
  • Bacteria of the genus Enterobacter having the ability to produce D-allulose from allitol can be used as long as they are of the genus Enterobacter and have that ability.
  • Bacterial species of the genus Enterobacter having that ability include, for example, Enterobacter hormaechei, Enterobacter soli, and the like.
  • Enterobacter formaekei BCr11-1, Enterobacter formaekei BCr11-2, and Enterobacter sori BDr27-1 which have been confirmed to have the ability to produce D-allulose from allitol, were acquired from Kisarazu, Chiba Prefecture on April 30, 2021.
  • bacteria belonging to the genus Agrobacterium, the genus Buttiauxella, the genus Lelliottia, and the genus Pantoea having the ability to produce D-allulose from allitol are the genus Agrobacterium, the genus Butiauxella , Reliotia, and Pantoea can be used.
  • Bacterial species of the genera Agrobacterium, Butiauxella, and Reliotia that have that ability include, for example, Agrobacterium pusense, Buttiauxella brennerae, Butiauxella sp. (Buttiauxella sp.), Lelliottia jeotgali, and Pantoea sp.
  • Butiauchera brenellae BCr16-1-3 strain, Butiauxera sp. BCr16-1-1 strain, Reliotia geogari NH309-4 strain, Reliotia geogari Ou92-1-1 strain, and Reliotia geogari T33-1 strain were each acquired on April 30, 2021 at 2-Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture.
  • these bacteria are first cultured in a normal nutrient medium, preferably under aerobic conditions such as shaking, aeration and agitation, and allowed to grow. Allitol in the mixture is converted to D-allulose during the culture or using the obtained viable cells. Bacteria used for the oxidation of D-allulose can utilize it in the culture medium. In addition, live cells separated from the culture solution and dried cells can also be used. As a culture method, a nutrient medium, preferably a liquid medium, containing a nutrient source required by these bacteria, such as a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, yeast extract, etc., is added. Bacteria are inoculated and cultured under aerobic conditions at a temperature of 20-40° C. for 1-10 days.
  • a nutrient medium preferably a liquid medium, containing a nutrient source required by these bacteria, such as a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, yeast extract, etc.
  • the viable cells obtained by such a culture method are brought into contact with an aqueous solution containing allitol, preferably under predetermined conditions such as shaking, aeration and stirring, and injecting oxygen to convert allitol to D-allulose.
  • an aqueous solution containing allitol preferably under predetermined conditions such as shaking, aeration and stirring, and injecting oxygen to convert allitol to D-allulose.
  • these bacteria can be used after being immobilized, and highly active immobilized bacteria can be obtained by various immobilization methods such as carrier binding, cross-linking, gel entrapment, and microencapsulation. can be done.
  • HPLC analysis was performed using a GL-C611 column (manufactured by Hitachi Ltd.) and Prominence (manufactured by Shimadzu Corporation) under the conditions of an eluent of 0.1 mM-NaOH, a temperature of 60°C and a flow rate of 1 mL/min.
  • a device manufactured by Shimadzu Corporation, trade name “RID-20A” was used.
  • OD 600 which is an index of cell concentration, was calculated by measuring absorbance at a wavelength of 600 nm using an ultraviolet-visible spectrophotometer UV-1800 (manufactured by Hitachi, Ltd.).
  • Example 1 100 g of a 20% NaOH aqueous solution was added to 10 g of 50% Raney nickel (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After the addition, the mixture was heated at 90°C for 1 hour. After confirming that the generation of bubbles had stopped, the catalyst was washed with distilled water by decantation. Washing was performed until the washing liquid reached pH 9.2.
  • 300 g of an aqueous solution containing 100 g of D-allulose was added with 24 g of Raney nickel obtained by the above method. was adjusted to 600 g. At that time, calcium carbonate was added to adjust the pH of the reaction solution to 7.
  • the temperature was kept at 50° C., the hydrogen pressure was kept at 12 kg/cm 2 (gauge pressure), and the stirring speed was kept at 700 rpm to carry out the reaction.
  • the reaction solution was sampled at regular time intervals and analyzed for D-allulose, D-talitol and allitol to confirm the progress of the reaction. Analysis of D-allulose, D-talitol and allitol was performed using HPLC. Samples subjected to analysis were obtained by appropriately diluting the reaction solution sampled over time, and desalted by adding an anion exchange resin and a cation exchange resin. As a result, D-allulose decreased to 1% after 8 hours of reaction, and D-talitol and allitol were obtained at a production ratio of 55:45.
  • Example 2 2050 g of a mixed aqueous solution of allitol and D-talitol obtained by reducing 270 g of D-allulose to 100% by hydrogenation using Raney nickel as a catalyst was concentrated and crystallized, and separated from the mother liquor by suction filtration under reduced pressure to recover crystals. Let this be the primary crystal. The primary crystals were recrystallized and the same procedure was repeated to obtain secondary and tertiary crystals. 48 g of allitol was obtained by three crystallization operations. The tertiary crystal obtained was found to have an allitol purity of 100% by the same analytical method as that shown in Example 1.
  • DAE D-allulose 3-epimerase
  • Recombinant E. coli cells expressing DAE derived from strain Y586-1 were suspended in 10 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), and the cell suspension was cooled in ice water with an ultrasonic homogenizer. After crushing, the crushed product was centrifuged at 12000 rpm for 30 minutes, and the centrifugal supernatant was used as a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution was heat-treated at 60° C. for 10 minutes to inactivate contaminating proteins and centrifuged to remove them.
  • the partially purified enzyme after the heat treatment was added to a weakly basic anion exchange resin A111S (manufactured by Purolite) ion exchange resin (immobilizing carrier) previously equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) to immobilize the enzyme. turned into The resulting immobilized DAE was used for subsequent tests.
  • Example 4 A 1% polyol mixture was reacted with Reliotia geogari, a microorganism capable of producing D-allulose from allitol.
  • the cells were washed with sodium phosphate buffer (10 mM, pH 7.0).
  • reaction solution was sampled over time, removed by centrifugation, desalted with an ion-exchange resin, and then analyzed for sugar composition using HPLC. The results are shown in FIG. After 18 hours of reaction, the allitol peak disappeared (retention time 19.2 min), and a highly pure D-talitol (retention time 21.8 min) solution was obtained.
  • Example 6 Reaction using 20% polyol mixture
  • BDr27-3-2 strain cells cultured in TSB medium were collected by centrifugation and washed with sodium phosphate buffer (10 mM, pH 7.0).

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Abstract

[Problem] To provide a method for producing substantially pure D-talitol or allitol from a mixture of D-talitol and allitol. [Solution] The present invention pertains to (a) a method that comprises a step for performing a crystallization operation for precipitating, through condensation, crystals from an aqueous solution of a mixture (A) of D-talitol and allitol, to obtain a crystal (A-1) having a higher allitol proportion as compared to prior to crystallization and a mixture liquid (A-2) having a lower allitol content and an increased D-talitol percentage content as compared to prior to crystallization, and that is for obtaining substantially pure D-talitol (B) by causing the mixture liquid (A-2) to i) pass through a chromatography column to collect a D-talitol fraction not containing allitol or to ii) be treated with a microorganism that processes allitol but does not process D-talitol to break down allitol. Alternatively, the present invention pertains to (b) a method for obtaining substantially pure D-talitol (B) by producing D-allulose from allitol through processing of an aqueous solution of a mixture (A) of D-talitol and allitol using a microorganism having the ability to produce D-allulose from allitol, and by passing the solution through a chromatography column to collect a D-talitol fraction not containing D-allulose.

Description

実質上純粋なＤ－タリトールまたはアリトールの製造方法Process for producing substantially pure D-talitol or allitol
　本発明は、D-アルロースを水素化して得られるD-タリトールとアリトールの混合物から、実質上純粋なD-タリトールまたはアリトールを製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing substantially pure D-talitol or allitol from a mixture of D-talitol and allitol obtained by hydrogenating D-allulose.
　D-アルロースは、ケトヘキソースに分類されるアルロースのD体である。D-アルロースはD-プシコースともいい、D-フラクトースのエピマーであり、甘味の質においてD-フラクトースに類似しているが、甘味度は砂糖の7割程度で、清涼感があるキレのいい甘さをしている。D-アルロースは、ゼロキロカロリー（非特許文献３）であることがヒト試験（非特許文献６）および動物試験（非特許文献７）においてそれぞれ証明されている。食後血糖抑制効果（非特許文献４）、食物および飲料により摂取した消化性糖を構成するＤ－グルコースによる急激な血糖値上昇の抑制効果（特許文献１）、抗肥満効果（非特許文献５）など生活習慣病予防素材としての特質を示すことが明らかにされている。 D-allulose is the D-form of allulose, which is classified as ketohexose. D-allulose, also known as D-psicose, is an epimer of D-fructose and is similar in sweetness to D-fructose, but its sweetness is about 70% that of sugar, giving it a refreshing and sharp sweetness. are doing D-allulose has been proven to be zero kcal (Non-Patent Document 3) in human studies (Non-Patent Document 6) and animal studies (Non-Patent Document 7), respectively. Postprandial blood sugar suppressing effect (Non-Patent Document 4), suppression effect of rapid blood sugar level rise by D-glucose, which constitutes digestible sugar ingested with food and beverages (Patent Document 1), anti-obesity effect (Non-Patent Document 5) It has been clarified that it exhibits characteristics as a material for preventing lifestyle-related diseases.
　現在ではD-アルロースは、自然界から抽出されたもの、化学的または生物学的な方法により合成されたもの等を含め、どのような手段によっても入手可能である。D-アルロースは希少糖であり、多量に得ることは非常に困難であったが、現在では、エピメラーゼを用いた反応により、D-アルロースは高純度のものを多量に生産することが可能となった。例えば、D-アルロースは、D-アルロース3-エピメラーゼ（ＤＡＥ）を用い、D-フラクトースより効率的に生産することが可能となり、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）純度がほぼ１００％のものを多量に生産することが可能となっている（非特許文献１）。
　ケトース３-エピメラーゼは、ケトヘキソースの３位の水酸基の異性化（エピ化反応）を触媒する酵素であり、その１種であるD-アルロース3-エピメラーゼ（D-allulose 3-epimerase（DAE），EC 5.1.3.30）は、D-アルロースをD-フラクトースへ、D-フラクトースをD-アルロースへエピ化する酵素である。D-アルロース：D-フラクトースの平衡反応比が、27 : 73～33 : 67の範囲である、複数の微生物由来のＤＡＥが発見されている。 At present, D-allulose is available by any means, including those extracted from nature, those synthesized by chemical or biological methods, and the like. D-allulose is a rare sugar and was very difficult to obtain in large quantities, but now it is possible to produce high-purity D-allulose in large quantities through a reaction using epimerase. rice field. For example, D-allulose can be produced more efficiently than D-fructose using D-allulose 3-epimerase (DAE), and can be produced in large quantities with a high performance liquid chromatography (HPLC) purity of almost 100%. It is possible to produce it (Non-Patent Document 1).
Ketose 3-epimerase is an enzyme that catalyzes the isomerization (epimerization reaction) of the hydroxyl group at the 3-position of ketohexose. EC 5.1.3.30) is an enzyme that epimerizes D-allulose to D-fructose and D-fructose to D-allulose. DAEs from multiple microorganisms have been found with equilibrium reaction ratios of D-allulose: D-fructose ranging from 27:73 to 33:67.
ＷＯ２０２０／１７１１４４号WO2020/171144 ＷＯ２０２０／１９５１０６号WO2020/195106 特許第４３８１６８４号公報Japanese Patent No. 4381684
　本発明は、D-アルロースを水素化して得られる糖アルコールのD-タリトールとアリトールの混合物から、D-タリトールを純粋なものとして生産することを目的とする。
　D-タリトールはD-タガトースの原料として純粋な形態で効率よく大量生産することを目的とし、また、アリトールはD-タリトール生産段階の副生物であるが、D-アルロースの原料にもなり得え、近年、D-アルロースと同等あるいはそれ以上の抗肥満作用があることが見出されており、純粋な形態で効率よく大量生産することを目的とする。 An object of the present invention is to produce pure D-talitol from a mixture of sugar alcohols D-talitol and allitol obtained by hydrogenating D-allulose.
D-talitol is intended to be efficiently mass-produced in a pure form as a raw material for D-tagatose, and allitol, which is a by-product of the D-talitol production stage, can also be a raw material for D-allulose. In recent years, it has been found that allulose has an anti-obesity effect equal to or greater than that of D-allulose.
　D-アルロースを水素添加(hydrogenation)すると、アリトールとD-タリトールの混合物が得られる。微生物反応で不斉還元は可能であるが、D-アルロースからアリトールへの効率よい還元はできないため、工業的に安価に還元（水添）する方法が最適であるが、水添では、ケトースから二つのポリオール、アリトールとD-タリトールが生産され、両者のクロマトグラフィーの溶出位置が近いため、アリトールとD-タリトールは分離が困難なことが問題となる。
　そこで、（ア）として、二つのポリオールの溶解度の差を利用し、アリトールを結晶化して分離する方法を採用すると、アリトールの結晶分離後の糖液にはD-タリトールと微量のアリトールが含まれている。D-タリトールにとっては、この結晶化によるアリトールの分離は、アリトールの含有量を低減させる工程ということになる。
　このように、分離前に比べてD-タリトールの含有率が上昇し、アリトールの含有量が低下している混合液は、クロマトグラフィーカラムに通して、アリトールを含まないD-タリトール画分を採取するか、またはアリトールに作用しD-タリトールに作用しない微生物で処理してアリトールを分解することにより、実質上純粋なD-タリトールを得る。
　また、（イ）として、D-タリトールとアリトールの混合物(A)にアリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物を作用させて、アリトールからD-アルロースを製造し、クロマトグラフィーカラムに通して、D-アルロースを含まないD-タリトール画分を採取することができる。D-タリトールとD-アルロースは、D-タリトールとアリトールに比べてクロマトグラフィーの溶出位置が離れているため、比較的容易に精製できる。 Hydrogenation of D-allulose gives a mixture of allitol and D-talitol. Asymmetric reduction is possible by microbial reaction, but efficient reduction of D-allulose to allitol is not possible. The problem is that two polyols, allitol and D-talitol, are produced and their chromatographic elution positions are close, making it difficult to separate allitol and D-talitol.
Therefore, as (a), by adopting the method of crystallization and separation of allitol by utilizing the difference in solubility of the two polyols, the sugar solution after crystal separation of allitol contains D-talitol and a small amount of allitol. ing. For D-talitol, this separation of allitol by crystallization is a process of reducing the content of allitol.
Thus, the mixed solution with an increased D-talitol content and a decreased allitol content compared to before separation is passed through a chromatography column to collect a D-talitol fraction containing no allitol. or by treating with a microorganism that acts on allitol but not on D-talitol to degrade allitol to obtain substantially pure D-talitol.
Alternatively, as (a), the mixture (A) of D-talitol and allitol is reacted with a microorganism capable of producing D-allulose from allitol to produce D-allulose from allitol, which is passed through a chromatography column. , a D-talitol fraction free of D-allulose can be collected. D-talitol and D-allulose can be purified relatively easily because their chromatographic elution positions are farther apart than those of D-talitol and allitol.
　本発明は、以下の（１）ないし（８）の実質上純粋なD-タリトール(B) またはアリトール(C)を製造する方法を要旨とする。
（１）D-タリトールとアリトールの混合物(A)から実質上純粋なD-タリトール(B)またはアリトール(C)を製造する方法であって、
（ア）D-タリトールとアリトールの混合物(A)の水溶液から濃縮により結晶を析出させる晶析操作により、晶析前よりアリトール比率のより高い結晶(A-1)と、晶析前に比べてD-タリトールの含有率が上昇し、アリトールの含有量が低下している混合液(A-2)とを得る工程、を有し、
　前記混合液(A-2)を、
　ｉ）クロマトグラフィーカラムに通して、アリトールを含まないD-タリトール画分を採取する、または
　ii) アリトールに作用しD-タリトールに作用しない微生物で処理してアリトールを分解する、
ことにより、実質上純粋なD-タリトール（B）を得る、または
（イ）D-タリトールとアリトールの混合物(A) の水溶液にアリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物を作用させて、アリトールからD-アルロースを製造し、クロマトグラフィーカラムに通して、D-アルロースを含まないD-タリトール画分を採取する、
ことにより、実質上純粋なD-タリトール（B）を得る、ことを特徴とする方法。
（２）前記D-タリトールとアリトールの混合物(A)が、D-アルロースを原料とし、D-アルロースを金属触媒の下、高温高圧下で水素を用いて還元してD-タリトールとアリトールの混合物を生成する水添工程により得られる、上記（１）に記載の方法。
（３）前記晶析前よりアリトール比率のより高い結晶 (A-1)を、晶析操作を繰り返すこと、あるいは晶析したアリトールの比率の高い結晶をアリトール溶液で洗浄することにより、実質上純粋なアリトールを得る上記（１）または（２）に記載の方法。 The gist of the present invention is the method for producing substantially pure D-talitol (B) or allitol (C) of the following (1) to (8).
(1) A method for producing substantially pure D-talitol (B) or allitol (C) from a mixture (A) of D-talitol and allitol, comprising:
(a) Crystals (A-1) with a higher allitol ratio than before crystallization and crystals (A-1) with a higher ratio of allitol than before crystallization, and obtaining a mixed solution (A-2) in which the content of D-talitol is increased and the content of allitol is decreased;
The mixed solution (A-2),
i) collect an allitol-free D-talitol fraction through a chromatography column, or ii) treat with an allitol-affecting but not D-talitol-affecting microorganism to degrade allitol.
to obtain substantially pure D-talitol (B), or (a) react an aqueous solution of a mixture of D-talitol and allitol (A) with a microorganism capable of producing D-allulose from allitol, producing D-allulose from allitol and passing it through a chromatography column to collect a D-allulose-free D-talitol fraction;
to obtain substantially pure D-talitol (B).
(2) The mixture (A) of D-talitol and allitol is prepared by using D-allulose as a raw material and reducing D-allulose with hydrogen under a metal catalyst under high temperature and pressure to obtain a mixture of D-talitol and allitol. The method according to (1) above, which is obtained by a hydrogenation step to produce
(3) The crystal (A-1) having a higher allitol ratio than before the crystallization is subjected to a repeated crystallization operation, or the crystal having a higher allitol ratio is washed with an allitol solution to obtain a substantially pure crystal. The method according to the above (1) or (2) for obtaining an allitol.
（４）前記（ア）ii)のアリトールに作用しD-タリトールに作用しない微生物として、アリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、同時にＤＡＥを持つ微生物（ａ）を選択し、アリトールに作用させてアリトールから変換されたD-アルロースが、ＤＡＥの作用によりD-フラクト－スに変換され菌体内で代謝分解されてアリトールを分解する、または、アリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、ＤＡＥを持たない微生物（ｂ）を選択し、固定化DAEを共存させて、アリトールに作用させてアリトールから変換されたD-アルロースが、菌体外でＤＡＥの作用によりD-フラクト－スに変換され菌体内で代謝分解されてアリトールを分解する、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記アリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物が、D-タリトールを変換する能力を有さない、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）、レリオティア属（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ）、およびパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）に属する細菌からなる群より選択される微生物である、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法。　
（６）前記微生物が、バークホルデリア　ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｌａｔａ）、バークホルデリア　マルティボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア　ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｉｆｆｕｓａ）、エンテロバクター　ホルマエケイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）、エンテロバクター　ソリ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｏｌｉ）、アグロバクテリウム　プセンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｕｓｅｎｓｅ）、ブティアウクセラ　ブレネラエ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブティアウクセラ　ｓｐ．（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｓｐ．）、レリオティア　ジェオガリ（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ　ｊｅｏｔｇａｌｉ）、およびパントエア　ｓｐ.（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｐ.）の細菌種からなる群より選択される、上記（５）に記載の方法。 (4) As the microorganism (a) ii) that acts on allitol but does not act on D-talitol, a microorganism (a) that has the ability to produce D-allulose from allitol and at the same time has DAE is selected. D-allulose converted from allitol by action is converted to D-fructose by the action of DAE and is metabolically decomposed in the bacteria to degrade allitol, or has the ability to produce D-allulose from allitol. Then, a microorganism (b) that does not have DAE is selected, immobilized DAE is allowed to coexist, and D-allulose converted from allitol by the action of allitol is converted to D-fructose outside the cells by the action of DAE. The method according to any one of the above (1) to (3), wherein allitol is degraded by metabolic decomposition in the cells.
(5) the genus Burkholderia, the genus Enterobacter, the genus Agrobacterium ( The method according to any one of (1) to (4) above, wherein the microorganism is selected from the group consisting of bacteria belonging to the genus Agrobacterium, the genus Buttiauxella, the genus Lelliottia, and the genus Pantoea. .
(6) the microorganism is Burkholderia lata, Burkholderia multivorans, Burkholderia diffusa, Enterobacter hormaechei, Enterobacter solibacter ), Agrobacterium pusense, Buttiauxella brennerae, Butiauxella sp. (5) above, which is selected from the group consisting of the bacterial species Buttiauxella sp., Lelliottia jeotgali, and Pantoea sp.
（７）前記（a）のアリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、同時にＤＡＥを持つ微生物が、バークホルデリア　ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｌａｔａ）、バークホルデリア　ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｉｆｆｕｓａ）、アグロバクテリウム　プセンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｕｓｅｎｓｅ）の細菌種からなる群より選択される、上記（４）ないし（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記（b）のアリトールをD-アルロースを製造する能力を有し、ＤＡＥを持たない微生物が、バークホルデリア　ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｌａｔａ）、バークホルデリア　マルティボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア　ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｉｆｆｕｓａ）、エンテロバクター　ホルマエケイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）、エンテロバクター　ソリ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｏｌｉ）、ブティアウクセラ　ブレネラエ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブティアウクセラ　ｓｐ．（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｓｐ．）、レリオティア　ジェオガリ（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ　ｊｅｏｔｇａｌｉ）、およびパントエア　ｓｐ.（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｐ）の細菌種からなる群より選択される、上記（４）ないし（６）のいずれかに記載の方法。 (7) The microorganism having the ability to produce D-allulose from allitol in (a) above and having DAE at the same time is Burkholderia lata, Burkholderia diffusa, Agrobacterium psensus (Agrobacterium pusense), the method according to any one of (4) to (6) above.
(8) The microorganism having the ability to produce D-allulose from allitol in (b) and having no DAE is Burkholderia lata, Burkholderia multivorans, Burkholderia multivorans Burkholderia diffusa, Enterobacter hormaechei, Enterobacter soli, Buttiauxella brennerae, Buttiauxella sp. (Buttiauxella sp.), Lelliottia jeotgali, and Pantoea sp.
　本発明により、希少糖のひとつであるD-タガトースの原料のD-タリトールと、D-タリトール生産段階の副生物アリトールを純粋なものとして容易に大量生産することができる。また、副生物のアリトールを出発物質のD-アルロースに変換させて再度利用できる。
　D-アルロースを原料として大量生産のためには水添(hydrogenation)を採用するため、D-アルロースからはアリトールとD-タリトールとなり、D-タリトールとアリトールの混合物が出発原料となる。このアリトールに、アリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、D-タリトールを変換する能力を有さない微生物を作用させて、アリトールをD-アルロースに変換させ、クロマトグラフィーカラムに通してD-アルロースを含まないD-タリトール画分を採取することで、D-タリトールの大量生産が可能になる。
　また、アリトールはD-タリトール生産段階の副生物であるが、D-アルロースの原料にもなりえるし、近年、D-アルロースと同等あるいはそれ以上の抗肥満作用があることが見出され、純粋な形態で効率よく大量生産することには技術的貢献がある。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, pure D-talitol, which is a raw material for D-tagatose, which is one of the rare sugars, and allitol, a by-product of the production of D-talitol, can be easily mass-produced. In addition, the by-product allitol can be converted to the starting material D-allulose and reused.
Hydrogenation is adopted for mass production using D-allulose as a raw material, so D-allulose becomes allitol and D-talitol, and a mixture of D-talitol and allitol is the starting material. This allitol is treated with a microorganism capable of producing D-allulose from allitol but not capable of converting D-talitol to convert allitol to D-allulose, which is passed through a chromatography column to obtain D-allulose. - Mass production of D-talitol becomes possible by collecting the D-talitol fraction containing no allulose.
In addition, allitol is a by-product of the D-talitol production stage, but it can also be used as a raw material for D-allulose. There is a technical contribution to efficient mass production in a variety of forms.
水添工程の後に、D-タリトールとアリトールの混合物からアリトールを結晶化して分離し、分離前に比べてD-タリトールの含有割合が上昇し、アリトールの含有割合が低下している混合液を得る工程と、アリトールを結晶化して分離する工程をイズモフリート構造式（Izumofleet formula）で説明する図面である。After the hydrogenation step, allitol is crystallized and separated from the mixture of D-talitol and allitol to obtain a mixed solution in which the content of D-talitol is increased and the content of allitol is decreased compared to before the separation. It is drawing explaining a process and a process of crystallizing and separating allitol by Izumofleet structural formula (Izumofleet formula). 水添工程の後、アリトールを分解しD-タリトールを分解できない微生物を用いて、純粋なD-タリトールのみを得る微生物によるアリトール分解工程を有し、該微生物（ａ）が、アリトールからD-アルロースへ変換する能力を有し、同時にDAEを持つ微生物であるアリトール分解工程を、イズモフリート構造式（Izumofleet formula）で説明する図面である。After the hydrogenation step, a step of decomposing allitol by a microorganism to obtain only pure D-talitol using a microorganism that decomposes allitol but cannot decompose D-talitol, wherein the microorganism (a) converts allitol to D-allulose FIG. 1 is a diagram illustrating the allitol-degrading process of microorganisms that have the ability to convert to DAE at the same time with the Izumofleet formula. 水添工程の後、アリトールを分解しD-タリトールを分解できない微生物を用いて、純粋なD-タリトールのみを得る微生物によるアリトール分解工程を有し、該微生物（ｂ）が、アリトールをD-アルロースへ変換するする能力を有し、DAEを持たない微生物であり、固定化DAEの共存でのアリトール分解工程を、イズモフリート構造式（Izumofleet formula）で説明する図面である。After the hydrogenation step, an allitol-degrading step using a microorganism that degrades allitol but cannot degrade D-talitol to obtain only pure D-talitol, wherein the microorganism (b) converts allitol to D-allulose It is a microorganism that has the ability to convert to DAE and does not have DAE, and is a drawing explaining the allitol degradation process in the coexistence of immobilized DAE with the Izumofleet formula.
非特許文献１および２に示されたイズモフリート構造式（Izumofleet formula）の基本法則を示す。すなわち、アルドース、ケトース、およびポリオールについて、フィッシャー投影式およびイズモフリート構造式を比較して、パターン図形であるイズモフリート構造式の表記法の原則を示す。　例えば、フィッシャー投影式で表示したD-グルコースは、各炭素と当該炭素が結合する炭素以外の元素との組み合わせに分けた場合、「ＣＨＯ」、「Ｈ－Ｃ－ＯＨ」，「ＨＯ－Ｃ－Ｈ」，「Ｈ－Ｃ－ＯＨ」，「Ｈ－Ｃ－ＯＨ」および「ＣＨ２ＯＨ」の６つの組み合わせに分けることができる。　図４上段に示される単糖に含まれる炭素と当該炭素が結合する炭素以外の元素との組み合わせごとに、対応する各パターン図の詳細を図４下段に示す。図４は、当該炭素が結合する炭素以外の元素との組み合わせごとに、対応するパターンが予め決定されているところ、糖に含まれる各炭素と当該炭素が結合する炭素以外の元素との組み合わせと、パターンとの対応関係を示す図である。（ア）アルデヒド基「ＣＨＯ」の組み合わせは、丸の下部に短い縦棒を付けたパターンに対応している。（イ）ケトン基「Ｃ＝Ｏ」からなる組み合わせは、丸の上下に短い縦棒を付けたパターンに対応している。（ウ）フィッシャー投影式で鎖の中間に位置する「ＨＯ－Ｃ－Ｈ」の組み合わせは、棒が突き出た「Ｔ」の文字を時計まわりに９０°回転させたパターンに対応している。（エ）同じく鎖の中間に位置する「Ｈ－Ｃ－ＯＨ」の組み合わせは、棒が突き出た「Ｔ」の文字を時計まわりに２７０°回転させたパターンに対応している。（オ）さらに、フィッシャー投影式で最下部に置かれる「ＣＨ２ＯＨ」の組み合わせは、「Ｔ」の文字を１８０°回転させたパターンに対応している。（カ）フィッシャー投影式で最上部に置かれる「ＣＨ２ＯＨ」の組み合わせは、「Ｔ」の文字のようなパターンに対応している。The basic rules of the Izumofleet formula shown in Non-Patent Documents 1 and 2 are shown. That is, for aldoses, ketoses, and polyols, the Fischer projection formula and the Izmo-fleet structure are compared to show the notation principle of the Izmo-fleet structure, which is a pattern graphic. For example, D-glucose displayed in the Fisher projection formula, when divided into combinations of elements other than carbon to which each carbon is bonded, "CHO", "HC-OH", "HO-C- H", "HC-OH", "HC-OH" and "CH 2 OH". Details of each corresponding pattern diagram are shown in the lower part of FIG. 4 for each combination of the carbon contained in the monosaccharide shown in the upper part of FIG. 4 and the element other than carbon to which the carbon is bonded. FIG. 4 shows that the pattern corresponding to each combination with the element other than carbon to which the carbon is bonded is determined in advance, and the combination of each carbon contained in the sugar and the element other than carbon to which the carbon is bonded. , and patterns. (a) The combination of aldehyde groups “CHO” corresponds to a pattern of circles with short vertical bars at the bottom. (a) A combination of ketone groups “C═O” corresponds to a pattern of circles with short vertical bars above and below. (c) The combination of "HO-C-H" located in the middle of the chain in the Fisher projection formula corresponds to a pattern in which the letter "T" with the stick sticking out is rotated clockwise by 90°. (d) The "HC-OH" combination, also located in the middle of the chain, corresponds to a pattern in which the letter "T" with a protruding stick is rotated clockwise by 270°. (e) Furthermore, the combination of "CH 2 OH" placed at the bottom in the Fisher projection formula corresponds to a pattern in which the letter "T" is rotated 180°. (f) The combination of "CH 2 OH" placed at the top in the Fisher projection formula corresponds to a pattern like the letter "T".
図３に示されるように、アリトールをD-アルロースへ変換する微生物レリオティア　ジェオガリ（BDr27-3-2菌体）と固定化DAEを共存させ、アリトールを分解する工程を、ポリオール混合液１％（アリトール：D-タリトール＝１：５）を用いて行う実施例４のHPLCの結果（反応液の糖組成％および糖ピーク面積の経時的変化）を示した。As shown in Fig. 3, the step of coexisting the microorganism Reliotia geogari (BDr27-3-2 cells), which converts allitol to D-allulose, and immobilized DAE to decompose allitol, was performed using a 1% polyol mixture (allitol : D-talitol = 1:5), the results of HPLC of Example 4 (% sugar composition of the reaction solution and change in sugar peak area over time) are shown. 図３に示されるように、アリトールをD-アルロースへ変換する微生物レリオティア　ジェオガリ（BDr27-3-2菌体）と固定化DAEを共存させ、アリトールを分解する工程を、ポリオール混合液１０％（アリトール：D-タリトール＝１：５）を用いて行う実施例５のHPLCの結果（反応液の糖組成％および糖ピーク面積の経時的変化）を示した。As shown in Fig. 3, the step of coexisting the microorganism Reliotia geogari (BDr27-3-2 cells), which converts allitol to D-allulose, and immobilized DAE to decompose allitol, was performed using a 10% polyol mixture (allitol : D-talitol = 1:5), the results of HPLC of Example 5 (% sugar composition of the reaction solution and change in sugar peak area over time) are shown. 図３に示されるように、アリトールをD-アルロースへ変換する微生物レリオティア　ジェオガリ（BDr27-3-2菌体）と固定化DAEを共存させ、アリトールを分解する工程を、ポリオール混合液２０％（アリトール：D-タリトール＝１：５）を用いて行う実施例６のHPLCの結果（反応液の糖組成％および糖ピーク面積の経時的変化）を示した。As shown in Fig. 3, the step of coexisting the microorganism Reliotia geogari (BDr27-3-2 cells), which converts allitol to D-allulose, and immobilized DAE to decompose allitol, was performed using a 20% polyol mixture (allitol : D-talitol = 1:5), the results of HPLC of Example 6 (% sugar composition of the reaction solution and change in sugar peak area over time) are shown. 図３に示されるように、アリトールをD-アルロースへ変換する微生物レリオティア　ジェオガリ（BDr27-3-2菌体）と固定化DAEを共存させ、アリトールを分解する工程を、ポリオール混合液２０％（アリトール：D-タリトール＝１：５）を用いて行う実施例７のHPLCの結果（反応液の糖組成％および糖ピーク面積の経時的変化）を示した。As shown in Fig. 3, the step of coexisting the microorganism Reliotia geogari (BDr27-3-2 cells), which converts allitol to D-allulose, and immobilized DAE to decompose allitol, was performed using a 20% polyol mixture (allitol : D-talitol = 1:5), the results of HPLC of Example 7 (% sugar composition of the reaction solution and change in sugar peak area over time) are shown.
図３に示されるように、アリトールをD-アルロースへ変換する微生物レリオティア　ジェオガリ（BDr27-3-2菌体）と固定化DAEを共存させ、アリトールを分解する工程を、アリトール晶析後の、晶析前に比べてD-タリトールの含有割合が上昇し、アリトールの含有割合が低下しているポリオール混合液を用いて行う実施例８のHPLCの結果（反応液の糖組成％および糖ピーク面積の経時的変化）を示した。As shown in Figure 3, the step of coexisting the microorganism Reliotia geogari (BDr27-3-2 cells), which converts allitol to D-allulose, and immobilized DAE to decompose allitol, was carried out after crystallizing allitol. Results of HPLC of Example 8 using a polyol mixture in which the content of D-talitol is increased and the content of allitol is decreased compared to before precipitation (the sugar composition % of the reaction solution and the sugar peak area change over time).
図２に示されるように、アリトールをD-アルロースへ変換し、かつDAEを有する微生物バークホルデリア　ディフュサ（BCa7-2菌体）を用いてアリトールを分解する工程を、ポリオール混合液１０％（アリトール：D-タリトール＝１：５）を用いて行う実施例9のHPLCの結果（反応液の糖組成％および糖ピーク面積の経時的変化）を示した。As shown in FIG. 2, the process of converting allitol to D-allulose and degrading allitol using the microorganism Burkholderia diffusa (BCa7-2 cells) having DAE was carried out in a 10% polyol mixture (allitol : D-talitol = 1:5), the results of HPLC of Example 9 (% sugar composition of the reaction solution and change in sugar peak area over time) are shown.
［実質上純粋なD-タリトールまたはアリトール］
　希少糖のひとつであるD-タガトースの原料のD-タリトール、D-タリトール生産段階の副生物アリトールを純粋なものとして生産する。
　D-タリトールとアリトールの混合物から実質上純粋なD-タリトールまたはアリトールを製造する方法において、D-タリトールとアリトールの混合物は、D-アルロースを原料とし、D-アルロースを金属触媒の下、高温高圧下で水素を用いて還元してD-タリトールとアリトールの混合物を生成する水添工程により得られる。
　また、D-アルロースは、D-タリトールとアリトールの混合物と原料D-アルロースの関係にあり、また、アリトールを反応系から取り除く場合、アリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物を作用させて、D-アルロースを製造するときのアリトールの生産物の関係にある。
　D-タリトール生産段階の副生物アリトールに、アリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物を作用させてD-アルロースを製造する場合、D-タガトースの副生物として混入するD-アルロースに相当し、D-タガトースとD-アルロースの混合物として得られる。クロマト分離により、D-アルロースは分離され実質上純粋のD-タガトースを得ることができるが、食品用途などでは混合物としてそのまま利用することができる。 [Substantially pure D-talitol or allitol]
D-talitol, which is the raw material for D-tagatose, one of the rare sugars, and allitol, which is a by-product of the D-talitol production stage, are produced in pure form.
In the method for producing substantially pure D-talitol or allitol from a mixture of D-talitol and allitol, the mixture of D-talitol and allitol is prepared from D-allulose as a raw material, and D-allulose is subjected to high temperature and high pressure treatment under a metal catalyst. It is obtained by a hydrogenation step in which hydrogen is used to produce a mixture of D-talitol and allitol.
In addition, D-allulose has a relationship with a mixture of D-talitol and allitol and raw material D-allulose, and when allitol is removed from the reaction system, a microorganism having the ability to produce D-allulose from allitol is allowed to act. , in relation to the product of allitol in the production of D-allulose.
This corresponds to D-allulose contaminating as a by-product of D-tagatose when D-allulose is produced by allowing microorganisms capable of producing D-allulose from allitol to act on allitol, a byproduct of the D-talitol production stage. , obtained as a mixture of D-tagatose and D-allulose. By chromatographic separation, D-allulose can be separated to obtain substantially pure D-tagatose, which can be used as a mixture for food applications.
　アリトールおよびD-タリトールは、ポリオール（糖アルコール）であり、希少糖である。D-タリトールに酢酸菌を作用させてD-タガトースに酸化変換されるので、D-タガトースの製造においては、D-タリトールは原料であるが、アリトールは副生物であり、反応系から取り除かれる。
　アリトールは、D-アルロースを還元して作られる炭素数６の糖アルコールであり、落葉低木であるズイナ中ではD-アルロースと酸化還元して動的に行き来しながら存在していると考えられる。アリトールを含有している天然物である植物体そのもの、すなわち自然界では極少量しか産生しない希少糖のD-アルロースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体そのものにおける、体脂肪蓄積抑制機能、および／または、総コレステロール値上昇抑制機能がすでに検証されている（特許文献２）が、アリトールそのものにもD-アルロースと同等あるいはそれ以上の抗肥満作用があることが見出されている(特許文献３)。 Allitol and D-talitol are polyols (sugar alcohols) and rare sugars. D-talitol is oxidatively converted to D-tagatose by the action of acetic acid bacteria. Therefore, in the production of D-tagatose, D-talitol is a raw material, but allitol is a by-product and is removed from the reaction system.
Allitol is a sugar alcohol with 6 carbon atoms produced by reduction of D-allulose, and it is thought that it exists dynamically back and forth through oxidation-reduction with D-allulose in zuina, a deciduous shrub. Suppression of body fat accumulation in the plant body itself, which is a natural product containing allitol, that is, the plant body itself that produces and contains D-allulose and allitol, which are rare sugars that are produced only in extremely small amounts in nature. The function and/or the function of suppressing an increase in total cholesterol level has already been verified (Patent Document 2), but it has been found that allitol itself has an anti-obesity effect equal to or greater than that of D-allulose. (Patent Document 3).
［水添工程］
　本発明は、大量生産のために水添(hydrogenation)の過程を採用しており、D-アルロースを原料とし、アリトールとD-タリトールの混合物が得られる。まず、原料D-アルロースを、金属触媒の下、高温高圧下で水素を用いて還元してD-タリトールとアリトールの混合物を生成する（特許文献３参照）。大量生産には原料D-アルロースを工業的に安価に還元（水添）する方法が最適であるため採用した。 [Hydrogenation step]
The present invention adopts the process of hydrogenation for mass production, takes D-allulose as raw material, and obtains a mixture of allitol and D-talitol. First, raw material D-allulose is reduced with hydrogen under high temperature and high pressure in the presence of a metal catalyst to produce a mixture of D-talitol and allitol (see Patent Document 3). For mass production, the method of industrially reducing (hydrogenating) the raw material D-allulose at low cost was adopted.
　D-アルロースを原料として、金属触媒の下、高温高圧下で水素を用いて還元してD-タリトールとアリトールの混合物を生成する工程について説明する。
　用いられる金属触媒は、周期律表の第８族ないし第１０族の元素から選ばれる金属を含有する触媒である。周期律表の第８族ないし第１０族の元素とは、鉄、コバルト、ニッケル及び白金族の元素をいう。ここで、白金族の元素とは、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、オスミウム、イリジウム、白金の６元素をいう。周期律表の第８族ないし第１０族の元素から選ばれる金属の中でも、ニッケル及び白金族元素から選ばれる金属が本発明において触媒として好ましく用いられる。より好ましくは、ニッケル、ルテニウム、白金およびパラジウムから選ばれる金属である。この中で、水素化能に関しては、ルテニウムや白金が好ましい。ルテニウムや白金の水素化能がパラジウムよりも高く、またこれらの反応は低温低圧条件において水素添加が可能であり、銅クロムやラネーコバルト等よりも触媒能力が高いことが確認された。又、ニッケルとアルミニウム等との合金を苛性アルカリ等で処理して得られるいわゆるラネーニッケル触媒は、表面積の増大により反応速度を増大させる、すなわちその触媒活性が高いので好ましい。
　又、還元反応に使用する触媒の性質は、金属の種類のみにより決まるものでなく、金属が担持される担持物によっても影響される。用いられる金属触媒が担持される担持物としては、活性炭、酸化チタン、アルミナ等の金属酸化物、硫酸バリウム、珪藻土等が挙げられる。 A process of producing a mixture of D-talitol and allitol by reducing D-allulose as a raw material with hydrogen under high temperature and high pressure under a metal catalyst will be described.
The metal catalyst used is a catalyst containing a metal selected from the elements of groups 8 to 10 of the periodic table. Elements of Groups 8 to 10 of the Periodic Table refer to elements of the iron, cobalt, nickel and platinum groups. Here, the platinum group elements refer to the six elements of ruthenium, rhodium, palladium, osmium, iridium, and platinum. Among metals selected from elements of Groups 8 to 10 of the periodic table, metals selected from nickel and platinum group elements are preferably used as catalysts in the present invention. More preferred are metals selected from nickel, ruthenium, platinum and palladium. Among these, ruthenium and platinum are preferable in terms of hydrogenation ability. It was confirmed that ruthenium and platinum have a higher hydrogenation ability than palladium, that these reactions can be hydrogenated under low temperature and low pressure conditions, and that they have higher catalytic ability than copper chromium, Raney cobalt, and the like. A so-called Raney nickel catalyst obtained by treating an alloy of nickel and aluminum or the like with caustic alkali or the like is preferable because it increases the reaction rate by increasing the surface area, that is, its catalytic activity is high.
Moreover, the properties of the catalyst used for the reduction reaction are not only determined by the type of metal, but are also affected by the carrier on which the metal is carried. Examples of supports for supporting the metal catalyst used include activated carbon, metal oxides such as titanium oxide and alumina, barium sulfate, and diatomaceous earth.
　この工程の実施の態様は特に限定されないが、通常、原料D-アルロースを水等の溶媒に溶解し、その中にさらに上述の金属触媒を添加したものを圧力容器等に入れ、そこに水素を圧入することにより、D-アルロースの水素添加反応を行う。
　用いる溶媒として、通常水が用いられるが、他にエタノール等のアルコール溶媒、酢酸メチル、酢酸エチル、これらの混合溶媒及びこれらと水との混合溶媒等も用いることができる。
　反応液中のD-アルロースの濃度は、通常１ないし６０ｗ／ｖ％、好ましくは５ないし５０ｗ／ｖ％である。又、反応温度は、通常１０ないし１５０℃、反応副生成物を生じ難くするために好ましくは１０ないし７０℃であり、さらに好ましくは、３０ないし６０℃である。反応圧力は、通常１ないし２００ｋｇ／ｃｍ２（ゲージ圧）、好ましくは５ないし１００ｋｇ／ｃｍ２の条件で行われる。 The mode of implementation of this step is not particularly limited, but usually, the raw material D-allulose is dissolved in a solvent such as water, and the above-mentioned metal catalyst is added to the solution. The hydrogenation reaction of D-allulose is carried out by pressurizing.
Water is usually used as the solvent, but alcohol solvents such as ethanol, methyl acetate, ethyl acetate, mixed solvents thereof, and mixed solvents of these and water can also be used.
The concentration of D-allulose in the reaction solution is usually 1 to 60 w/v%, preferably 5 to 50 w/v%. The reaction temperature is usually 10 to 150°C, preferably 10 to 70°C, more preferably 30 to 60°C, so as to make it difficult to produce reaction by-products. The reaction pressure is generally 1 to 200 kg/cm 2 (gauge pressure), preferably 5 to 100 kg/cm 2 .
　この工程の反応の進行状況は、一定時間毎に反応液をサンプリングして、D-アルロース、生成する糖アルコールD-タリトールとアリトールの分析を行うことにより確認することができる。D-アルロース、生成する糖アルコールD-タリトールとアリトールの分析には、ＨＰＬＣ等が好ましく用いられる。
　この工程において、反応後、触媒は、ろ過、デカンテーション、遠心分離、フィルトレーション等により容易に除去することができる。このように触媒を除去することにより、目的とする糖アルコールを含んだ溶液が得られる。 The progress of the reaction in this step can be confirmed by sampling the reaction solution at regular intervals and analyzing D-allulose, the sugar alcohol D-talitol and allitol to be produced. HPLC or the like is preferably used for the analysis of D-allulose and the sugar alcohol D-talitol and allitol to be produced.
In this step, after the reaction, the catalyst can be easily removed by filtration, decantation, centrifugation, filtration and the like. By removing the catalyst in this manner, a solution containing the desired sugar alcohol is obtained.
　この工程においては、ジアステレオ異性を誘起するための光学活性体、すなわち不斉源を添加することにより、生成する糖アルコール、例えばD-タリトール及びアリトールの生成比を変えることができる。このような不斉源としては、ホウ酸、シンコニジン、シンコニン、エフェドリン、キニジン、ブルシン等や、キニーネやストリキニーネ等のアルカロイド、D-マンニトール等の糖及びその誘導体、メントール、カンファー、テルペン、Ｌ－酒石酸、Ｌ－乳酸、Ｌ－リンゴ酸等のヒドロキシ酸、Ｌ－ロイシン、Ｌ－シスチン、Ｌ－システイン等のアミノ酸等が挙げられる。又、ジアステレオ異性還元を目的とし分子設計された合成不斉源を、ニッケル、ルテニウム、白金およびパラジウムから選ばれる金属を含有する触媒とともに用いることにより糖アルコールの生成比を変えることも可能である。このような合成不斉源としては、既存のＢＩＮＡＰ等の不斉ホスフィンが挙げられる。 In this step, by adding an optically active substance for inducing diastereoisomerism, that is, an asymmetric source, the production ratio of sugar alcohols, such as D-talitol and allitol, can be changed. Such chiral sources include boric acid, cinchonidine, cinchonine, ephedrine, quinidine, brucine, etc., alkaloids such as quinine and strychnine, sugars such as D-mannitol and derivatives thereof, menthol, camphor, terpene, and L-tartaric acid. , hydroxy acids such as L-lactic acid and L-malic acid, and amino acids such as L-leucine, L-cystine and L-cysteine. It is also possible to change the production ratio of sugar alcohols by using a synthetic asymmetric source molecularly designed for the purpose of diastereoisomeric reduction together with a catalyst containing a metal selected from nickel, ruthenium, platinum and palladium. . Such synthetic asymmetric sources include existing asymmetric phosphines such as BINAP.
　さらに、この工程においては、使用する金属触媒の種類によっても生成するD-タリトールとアリトールの生成比を変えることができる。すなわち、触媒の金属の種類と担持物の種類等の条件により、２種以上の糖アルコールの生成比は変化する。
　D-タリトールとアリトールの製造においては、通常、ラネーニッケルを用いる場合は、D-タリトール：アリトールが５０：５０～４０：６０程度の生成比を得るのに好ましく、白金を用いる場合は、D-タリトール：アリトールが３０：７０～４２：５８程度の生成比を得るのに好ましい。
　このように、D-タリトールが多く含まれている混合物を容易に得ることができるので、必要により純粋な当該D-タリトールを得ることが容易になる。 Furthermore, in this step, the production ratio of D-talitol and allitol can be changed depending on the type of metal catalyst used. That is, the production ratio of two or more sugar alcohols changes depending on conditions such as the type of catalyst metal and the type of support.
In the production of D-talitol and allitol, when Raney nickel is used, D-talitol:allitol is preferably produced in a ratio of about 50:50 to 40:60, and when platinum is used, D-talitol is preferred. : Allitol is preferable for obtaining a production ratio of about 30:70 to 42:58.
In this way, a mixture rich in D-talitol can be easily obtained, making it easier to obtain pure D-talitol if necessary.
［D-タリトールとアリトールの混合物からアリトールを結晶化して分離し、分離前に比べてD-タリトールの含有率が上昇し、アリトールの含有量が低下している混合液を得る、アリトールの含有量を調整する工程］について説明する。
　前記水添工程では二つのポリオールが生産され、アリトールとD-タリトールの分離が困難なことが問題である。それはクロマトの溶出位置が近いためである。
　そのため、（ア）としては、二つのポリオールの溶解度の差を利用し、アリトールを結晶化して分離する方法を採用する。
　アリトールとD-タリトールの溶解度の差により、混合液を濃縮するとアリトールが晶出し、残る混合液には、D-タリトールに対してより濃度が低くなったアリトールが残る。D-タリトールにとっては、この結晶化によるアリトールの分離は、アリトールの含有量を低減させる工程ということになる。
　この晶析操作を繰り返すことにより、晶析前よりD-タリトール比率のより高い混合液が得られ、最終的には、１０％アリトールに対して９０％D-タリトールの混合液が得られる。 [Crystalizing and separating allitol from a mixture of D-talitol and allitol to obtain a mixed solution with a higher D-talitol content and a lower allitol content than before separation, step of adjusting] will be described.
The problem is that two polyols are produced in the hydrogenation process and the separation of allitol and D-talitol is difficult. This is because the chromatographic elution positions are close.
Therefore, as (a), a method of crystallizing and separating allitol by utilizing the difference in solubility of two polyols is adopted.
Due to the difference in solubility between allitol and D-talitol, allitol crystallizes out when the mixture is concentrated, leaving the remaining mixture with less concentrated allitol relative to D-talitol. For D-talitol, this separation of allitol by crystallization is a process of reducing the content of allitol.
By repeating this crystallization operation, a mixture with a higher D-talitol ratio than before crystallization is obtained, and finally a mixture of 10% allitol and 90% D-talitol is obtained.
　この反応の進行状況は、一定時間毎に反応液を採取してＨＰＬＣ分析を行い、結晶水及び母液中のアリトール、Ｄ－タリトールの比率を求めた結果を得て、アリトールとＤ－タリトール混合水溶液から晶析操作を繰り返すことにより、アリトールの優先晶析が可能であり、さらに純粋なアリトールを得ることも可能である。また、アリトールとＤ－タリトール混合水溶液から得られた一次結晶をアリトール溶液で洗浄することにより高純度のアリトールを得ることも可能である。
　この晶析操作を繰り返すことにより、晶析前よりアリトールのより高い比率の結晶が得られ、最後に１００％アリトール結晶が得られる。得られたアリトールは、原料D-アルロースにもなり得、または近年、D-アルロースと同等あるいはそれ以上の抗肥満作用があることが報告されており、機能性物質として利用することが可能である。 As for the progress of this reaction, the reaction solution was sampled at regular intervals and subjected to HPLC analysis to obtain the results of obtaining the ratios of allitol and D-talitol in the water of crystallization and the mother liquor. By repeating the crystallization operation from , it is possible to preferentially crystallize allitol, and it is also possible to obtain pure allitol. High-purity allitol can also be obtained by washing primary crystals obtained from a mixed aqueous solution of allitol and D-talitol with an allitol solution.
By repeating this crystallization operation, crystals with a higher proportion of allitol than before crystallization are obtained, and finally 100% allitol crystals are obtained. The obtained allitol can also be used as raw material D-allulose, and in recent years it has been reported to have an anti-obesity effect equal to or greater than that of D-allulose, so it can be used as a functional substance. .
　一方、晶析前に比べてD-タリトールの含有率が上昇し、アリトールの含有量が低下している混合液に対しては、ｉ）クロマトグラフィーカラムに通して、アリトールを含まないD-タリトール画分を採取するか、またはii) アリトールに作用しD-タリトールに作用しない微生物で処理してアリトールを分解することにより、実質上純粋なD-タリトールを得ることができる。
　上記ｉ）において、残りのアリトールとD-タリトールとの混合液から、クロマトグラフィーにより、D-タリトール、アリトールをそれぞれを精製分離することがさらに容易になる。混合液中のD-タリトールの含有量が多い場合、純粋なD-タリトールの画分の流出量が多くなり、この画分を採取することにより、純粋なD-タリトールを効率的に製造できるからである。
　クロマトグラフィーの条件としては、通常の分離に用いられる場合の条件と同様な条件が採用できる。 On the other hand, the mixed solution with an increased D-talitol content and a decreased allitol content compared to before crystallization was i) passed through a chromatography column to obtain D-talitol containing no allitol. Substantially pure D-talitol can be obtained by collecting the fraction or ii) degrading allitol by treatment with a microorganism that acts on allitol but not on D-talitol.
In i) above, it becomes easier to purify and separate D-talitol and allitol from the remaining mixture of allitol and D-talitol by chromatography. When the content of D-talitol in the mixed liquid is high, the outflow amount of the pure D-talitol fraction increases, and by collecting this fraction, pure D-talitol can be efficiently produced. is.
As conditions for chromatography, the same conditions as those used for ordinary separation can be employed.
　また、上記ii) アリトールに作用しD-タリトールに作用しない微生物で処理してアリトールを分解する工程では、アリトールを分解してD-タリトールには作用しない微生物を用いる。
　例えば、（ａ）の微生物として、アリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、同時にＤＡＥを持つ微生物を選択する。図２に示すように、（ａ）の微生物をアリトールに作用させると、菌体内でアリトールから変換されたD-アルロースが、ＤＡＥによりさらにD-フラクト－スに変換されて菌体内で代謝分解されて、アリトールが分解される。
　また、（ｂ）の微生物として、アリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、ＤＡＥを持たない微生物（ｂ）を選択する。図３に示すように、（ｂ）の微生物を、固定化ＤＡＥの共存下でアリトールに作用させると、菌体内でアリトールから変換されたD-アルロースが、菌体外でＤＡＥの作用によりD-フラクト－スに変換されて、さらに菌体内に入って代謝分解されて、アリトールが分解される。 In the step ii) of degrading allitol by treating with a microorganism that acts on allitol but does not act on D-talitol, a microorganism that decomposes allitol but does not act on D-talitol is used.
For example, as the microorganism (a), a microorganism capable of producing D-allulose from allitol and at the same time having DAE is selected. As shown in FIG. 2, when the microorganism (a) is allowed to act on allitol, D-allulose converted from allitol within the microorganism is further converted to D-fructose by DAE and metabolically degraded within the microorganism. and allitol is degraded.
As the microorganism (b), a microorganism (b) having the ability to produce D-allulose from allitol and not having DAE is selected. As shown in FIG. 3, when the microorganism of (b) is allowed to act on allitol in the presence of immobilized DAE, D-allulose converted from allitol inside the microorganism is transformed into D- by the action of DAE outside the microorganism. It is converted to fructose, enters the cells and is metabolically decomposed, and allitol is decomposed.
[アリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物を作用させて、アリトールからD-アルロースを製造する工程］
　また、水添工程の後、（イ）として、D-タリトールとアリトールの混合物(A) の水溶液に、アリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物を作用させて、アリトールからD-アルロースを製造することができる。
　アリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物は、D-タリトールを変換する能力を有さない、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）、レリオティア属（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ）およびパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）に属する細菌からなる群より選択される微生物である。 [Step of producing D-allulose from allitol by allowing a microorganism capable of producing D-allulose from allitol]
Further, after the hydrogenation step, as (a), a microorganism capable of producing D-allulose from allitol is allowed to act on the aqueous solution of the mixture (A) of D-talitol and allitol to convert D-allulose from allitol. can be manufactured.
Microorganisms having the ability to produce D-allulose from allitol include Burkholderia, Enterobacter, Agrobacterium, Butiaucthera, which do not have the ability to convert D-talitol. A microorganism selected from the group consisting of bacteria belonging to the genera Buttiauxella, Lelliottia and Pantoea.
　前記微生物は、バークホルデリア　ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　
ｌａｔａ）、バークホルデリア　マルティボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア　ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｉｆｆｕｓａ）、エンテロバクター　ホルマエケイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）、エンテロバクター　ソリ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｏｌｉ）、アグロバクテリウム　プセンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｕｓｅｎｓｅ）、ブティアウクセラ　ブレネラエ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブティアウクセラ　ｓｐ．（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｓｐ．）、レリオティア　ジェオガリ（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ　ｊｅｏｔｇａｌｉ）、およびパントエア　ｓｐ．（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｐ．）の細菌種からなる群より選択される。 The microorganism is Burkholderia ratta
ｌａｔａ）、バークホルデリア マルティボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｄｉｆｆｕｓａ）、エンテロバクター ホルマエケイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）、エンテロバクター ソリ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ）、アグロバクテリウム プセンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｕｓｅｎｓｅ）、ブティアウクセラ ブレネラエ(Buttiauxella brennerae), Buttiauxella sp. (Buttiauxella sp.), Lelliottia jeotgali, and Pantoea sp. (Pantoea sp.).
（ｂ）アリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物が、ＤＡＥを持たない場合、D-タリトールとアリトールの混合物の水溶液に微生物を作用させて、アリトールからD-アルロースを製造して、D-タリトールとD-アルロースの混合物とする工程について説明する。
　この工程の概略は、図３に示すとおりであり、（ｂ）のアリトールをD-アルロースへ変換する能力を有しＤＡＥを持たない微生物を、固定化ＤＡＥの共存下でアリトールに作用させると、菌体内に入ったアリトールはD-アルロースに変換され、このD-アルロースは菌体外で固定化ＤＡＥにより、その一部がエピ化され、平衡反応によりD-フラクト－スに変換される。このD-フラクト－スは菌体内に入り代謝分解されるので、菌体外には、D-タリトールとD-アルロースが存在する。
　これを、クロマトグラフィーカラムに通して、D-アルロースを含まないD-タリトール画分を採取する。D-タリトールとD-アルロースは、クロマトグラフィーの溶出位置が離れているため比較的容易に精製できる。 (b) When a microorganism capable of producing D-allulose from allitol does not have DAE, the microorganism is allowed to act on an aqueous solution of a mixture of D-talitol and allitol to produce D-allulose from allitol, producing D - Describe the process of making a mixture of talitol and D-allulose.
The outline of this step is shown in FIG. Allitol that has entered the cells is converted to D-allulose, and a part of this D-allulose is epilated by immobilized DAE outside the cells and converted to D-fructose by an equilibrium reaction. Since this D-fructose enters the cells and is metabolically degraded, D-talitol and D-allulose exist outside the cells.
This is passed through a chromatography column to collect a D-talitol fraction containing no D-allulose. D-Talitol and D-allulose can be purified relatively easily because their chromatographic elution positions are separated.
　アリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、ＤＡＥを持たない微生物は、上記のとおりD-タリトールを変換する能力を有さない、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）、レリオティア属（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ）、およびパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）に属する細菌からなる群より選択される微生物である。 Microorganisms that have the ability to produce D-allulose from allitol and do not have a DAE include Burkholderia spp., Enterobacter spp., A microorganism selected from the group consisting of bacteria belonging to the genera Buttiauxella, Lelliottia, and Pantoea.
　また、バークホルデリア　ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｌａｔａ）、バークホルデリア　マルティボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア　ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｉｆｆｕｓａ）、エンテロバクター　ホルマエケイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）、エンテロバクター　ソリ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｏｌｉ）、ブティアウクセラ　ブレネラエ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブティアウクセラ　ｓｐ．（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｓｐ．）、レリオティア　ジェオガリ（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ　ｊｅｏｔｇａｌｉ）、およびパントエア　ｓｐ.（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｐ．）の細菌種からなる群より選択され、エンテロバクター　ソリ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｏｌｉ）、レリオティア　ジェオガリ（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ　ｊｅｏｔｇａｌｉ）、およびパントエア　ｓｐ.（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｐ．）の細菌種が好ましい。 また、バークホルデリア　ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｌａｔａ）、バークホルデリア　マルティボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア　ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｉｆｆｕｓａ）、エンテロバクター　ホルマエケイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）、エンテロバクター　ソリ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｏｌｉ）、ブティアウクセラ　ブレネラエ（ Buttiauxella brennerae), Buttiauxella sp. (Buttiauxella sp.), Lelliottia jeotgali, and Pantoea sp. (Pantoea sp.), Enterobacter soli, Lelliottia jeotgali, and Pantoea (Pantoea sp.) bacterial species are preferred.
（ａ）アリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物が、同時にＤＡＥを持つ場合、D-タリトールとアリトールの混合物の水溶液に微生物を作用させて、アリトールからD-アルロースを製造して、D-タリトールとD-アルロースの混合物とする工程について説明する。
　この工程の概略は、図２に示すとおりであり、（ａ）のアリトールをD-アルロースへ変換する能力を持ち、同時にＤＡＥを持つ微生物を、アリトールに作用させると、菌体内に入ったアリトールはD-アルロースに変換され、ＤＡＥによりD-フラクト－スに変換され、D-フラクト－スは菌体内で代謝分解されるので、菌体外にはD-タリトールのみが存在することにより、実質的に純粋なD-タリトールを得ることができる。 (a) When a microorganism capable of producing D-allulose from allitol has DAE at the same time, the microorganism is allowed to act on an aqueous solution of a mixture of D-talitol and allitol to produce D-allulose from allitol to produce D - Describe the process of making a mixture of talitol and D-allulose.
The outline of this process is shown in FIG. It is converted to D-allulose, converted to D-fructose by DAE, and D-fructose is metabolically degraded in the cells, so that only D-talitol exists outside the cells, so that can obtain pure D-talitol.
　アリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、同時にＤＡＥを持つ微生物は、上記のとおりD-タリトールを変換する能力を有さない、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）またはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌であり、バークホルデリア　ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｌａｔａ）、バークホルデリア　ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｉｆｆｕｓａ）、アグロバクテリウム　プセンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｕｓｅｎｓｅ）が例示される。 Microorganisms having the ability to produce D-allulose from allitol and at the same time having a DAE belong to the genus Burkholderia or Agrobacterium, which do not have the ability to convert D-talitol as described above. Examples include Burkholderia lata, Burkholderia diffusa, and Agrobacterium pusense.
[規則91に基づく訂正 24.10.2022]　
　本発明者等は、土壌ライブラリーを用いて、アリトールを含有する水溶液に接触させて、アリトールからD-アルロースを生産することができる微生物を探索した。
　その結果、アリトールからのD-アルロース産生能が確認されたバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の細菌は、その能力を有するバークホルデリア属の細菌であれば使用することができる。その能力を有するバークホルデリア属の細菌種には、たとえば、バークホルデリア　ラタ　Ｙ５３４－１＝３株、バークホルデリア　ラタ　Ｕ４５９－１－１＝１株、バークホルデリア　マルティボランス　Ｙ４８８－４＝４株、バークホルデリア　マルティボランス　Ｓ３３２－４＝１株、バークホルデリア　マルティボランス　Ｙ５５５－２ｄ＝２株、およびバークホルデリア　ディフュサ　Ｙ４５２－１＝３株は、それぞれ２０２１年４月３０日付けで千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４１３、ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４１０、ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４１２、ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４０８、ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４１４、ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４１１として寄託された。その後菌株は、２０２２年２月１日付けで、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４１３、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４１０、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４１２、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４０８、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４１４、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４１１として寄託された。[Correction under Rule 91 24.10.2022]
The present inventors used a soil library to search for microorganisms capable of producing D-allulose from allitol upon contact with an aqueous solution containing allitol.
As a result, any bacterium belonging to the genus Burkholderia that has been confirmed to have the ability to produce D-allulose from allitol can be used as long as it has the ability. Bacterial species of the genus Burkholderia having that ability include, for example, strain Burkholderia lata Y534-1=3, strain Burkholderia rata U459-1-1=1, Burkholderia martivorans Y488-4=. 4 strains, Burkholderia martivorans S332-4 = 1 strain, Burkholderia martivorans Y555-2d = 2 strains, and Burkholderia diffusa Y452-1 = 3 strains dated April 30, 2021, respectively. 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary Center, Accession No. NITE P-03413, NITE P-03410, NITE P-03412, NITE P -03408, NITE P-03414, NITE P-03411. The strains were subsequently deposited on February 1, 2022 under accession numbers NITE BP-03413, NITE BP-03410, NITE BP-03412, NITE BP-03408, NITE BP-03414, NITE BP-03411.
[規則91に基づく訂正 24.10.2022]　
　また、バークホルデリア　ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｉｆｆｕｓａ）ＢＣａ７－２株は、２０２１年９月９日に千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託し、受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３５３１として受領された。その後菌株は、２０２１年１１月１日付けで、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５３１として寄託された。[Correction under Rule 91 24.10.2022]
In addition, the Burkholderia diffusa BCa7-2 strain was deposited on September 9, 2021 at the National Institute of Technology and Evaluation, an independent administrative agency located in Room 122, Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture. It was deposited with the Center and was received under Receipt No. NITE ABP-03531. The strain was subsequently deposited on November 1, 2021 under accession number NITE BP-03531.
[規則91に基づく訂正 24.10.2022]　
　また、アリトールからD-アルロース産生能を有するエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の細菌は、その能力を有するエンテロバクター属の細菌であれば使用することができる。その能力を有するエンテロバクター属の細菌種には、たとえば、エンテロバクター　ホルマエケイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）、エンテロバクター　ソリ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｏｌｉ）等がある。
　アリトールからのD-アルロース産生能が確認されたエンテロバクター　ホルマエケイ　ＢＣｒ１１－１株、エンテロバクター　ホルマエケイ　ＢＣｒ１１－２株、およびエンテロバクター　ソリ　ＢＤｒ２７－１株は、それぞれ２０２１年４月３０日付けで千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４００、ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４０１、ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４０５として寄託された。その後菌株は、２０２２年２月１日付けで、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４００、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４０１、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４０５として寄託された。[Correction under Rule 91 24.10.2022]
Bacteria of the genus Enterobacter having the ability to produce D-allulose from allitol can be used as long as they are of the genus Enterobacter and have that ability. Bacterial species of the genus Enterobacter having that ability include, for example, Enterobacter hormaechei, Enterobacter soli, and the like.
Enterobacter formaekei BCr11-1, Enterobacter formaekei BCr11-2, and Enterobacter sori BDr27-1, which have been confirmed to have the ability to produce D-allulose from allitol, were acquired from Kisarazu, Chiba Prefecture on April 30, 2021. They were deposited at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center located at Room 122, 2-5-8 Kamatari, Kazusa, under the accession numbers NITE P-03400, NITE P-03401, and NITE P-03405, respectively. The strains were subsequently deposited on February 1, 2022 under accession numbers NITE BP-03400, NITE BP-03401, NITE BP-03405.
　また、アリトールからD-アルロース産生能を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）、レリオティア属（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ）、およびパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）に属する細菌は、そのアグロバクテリウム属、ブティアウクセラ属、レリオティア属、およびパントエア属の細菌であれば使用することができる。その能力を有するアグロバクテリウム属、ブティアウクセラ属、およびレリオティア属の細菌種には、たとえば、アグロバクテリウム　プセンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｕｓｅｎｓｅ）、ブティアウクセラ　ブレネラエ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブティアウクセラ　ｓｐ．（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｓｐ．）、レリオティア　ジェオガリ（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ　ｊｅｏｔｇａｌｉ）、およびパントエア　ｓｐ.（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｐ.）等がある。 In addition, bacteria belonging to the genus Agrobacterium, the genus Buttiauxella, the genus Lelliottia, and the genus Pantoea having the ability to produce D-allulose from allitol are the genus Agrobacterium, the genus Butiauxella , Reliotia, and Pantoea can be used. Bacterial species of the genera Agrobacterium, Butiauxella, and Reliotia that have that ability include, for example, Agrobacterium pusense, Buttiauxella brennerae, Butiauxella sp. (Buttiauxella sp.), Lelliottia jeotgali, and Pantoea sp.
[規則91に基づく訂正 24.10.2022]　
　アリトールからのD-アルロース産生能が確認されたブティアウクセラ　ブレネラエ　ＢＣｒ１６－１－３株、ブティアウクセラ　ｓｐ．ＢＣｒ１６－１－１株、レリオティア　ジェオガリ　ＮＨ３０９－４株、レリオティア　ジェオガリ　Ｏｕ９２－１－１株、およびレリオティア　ジェオガリ　Ｔ３３－１株は、それぞれ２０２１年４月３０日付けで千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４０４、ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４０３、ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４０６、ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４０７、ＮＩＴＥ　Ｐ－０３４０９として寄託された。その後菌株は、２０２２年２月１日付けで、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４０４、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４０３、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４０６、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４０７、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３４０９として寄託された。[Correction under Rule 91 24.10.2022]
Butiauchera brenellae BCr16-1-3 strain, Butiauxera sp. BCr16-1-1 strain, Reliotia geogari NH309-4 strain, Reliotia geogari Ou92-1-1 strain, and Reliotia geogari T33-1 strain were each acquired on April 30, 2021 at 2-Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture. 5-8 Deposited to the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganism Depositary Center located in Room 122 under the accession numbers NITE P-03404, NITE P-03403, NITE P-03406, NITE P-03407, and NITE P-03409, respectively. was done. The strains were subsequently deposited on February 1, 2022 under accession numbers NITE BP-03404, NITE BP-03403, NITE BP-03406, NITE BP-03407, NITE BP-03409.
[規則91に基づく訂正 24.10.2022]　
　また、レリオティア　ジェオガリ　ＢＤｒ２７－３－２株、パントエア　ｓｐ.　ＣＣｒ７９－１－１株は、２０２１年９月９日に千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託し、受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３５３２、ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３５３３として受領された。その後菌株は、２０２１年１１月１日付けで、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５３２、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５３３として寄託された。[Correction under Rule 91 24.10.2022]
In addition, Reliotia Geogari BDr27-3-2 strain and Pantoair sp. It was deposited at the Patent Microorganisms Depositary, National Institute of Technology, and received as receipt numbers NITE ABP-03532 and NITE ABP-03533. The strains were subsequently deposited on November 1, 2021 under accession numbers NITE BP-03532, NITE BP-03533.
　本発明では、まず、これら細菌を通常栄養培地で培養し、望ましくは、振盪、通気撹拌などの好気的条件下で培養し増殖させる。培養中に、または得られた生菌体を用いて、混合液中のアリトールをD-アルロースに変換させる。D-アルロースの酸化に用いる細菌は、培養液中のそれを利用することができる。　また、培養液から分離された生菌体およびこれを乾燥した菌体を利用することもできる。
　培養方法としては、これらの細菌が必要とする栄養源、例えば、炭素源、窒素源、無機塩、酵母エキスなどを含有する栄養培地、望ましくは液体培地に、アリトールからD-アルロース産生能を有する細菌を植菌し、温度２０～４０℃で、１～１０日間好気的条件下で培養する。 In the present invention, these bacteria are first cultured in a normal nutrient medium, preferably under aerobic conditions such as shaking, aeration and agitation, and allowed to grow. Allitol in the mixture is converted to D-allulose during the culture or using the obtained viable cells. Bacteria used for the oxidation of D-allulose can utilize it in the culture medium. In addition, live cells separated from the culture solution and dried cells can also be used.
As a culture method, a nutrient medium, preferably a liquid medium, containing a nutrient source required by these bacteria, such as a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, yeast extract, etc., is added. Bacteria are inoculated and cultured under aerobic conditions at a temperature of 20-40° C. for 1-10 days.
　このような培養方法によって得られた生菌体を、アリトールを含有する水溶液と接触、望ましくは、振盪、通気撹拌、酸素の圧入などの所定の条件下で接触させ、アリトールをD-アルロースに変換させる。振盪下にて３０℃で反応を行うと、１日後にアリトールの最大１００ｗ／ｗ％がD-アルロースに変換する。
　また、これらの細菌は、固定化しての利用が可能であり、種々の固定化方法、たとえば担体結合法、架橋法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等によって活性の高い固定化細菌を得ることができる。 The viable cells obtained by such a culture method are brought into contact with an aqueous solution containing allitol, preferably under predetermined conditions such as shaking, aeration and stirring, and injecting oxygen to convert allitol to D-allulose. Let Up to 100 w/w % of allitol is converted to D-allulose after 1 day when the reaction is carried out at 30° C. under shaking.
In addition, these bacteria can be used after being immobilized, and highly active immobilized bacteria can be obtained by various immobilization methods such as carrier binding, cross-linking, gel entrapment, and microencapsulation. can be done.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。以下の実施例において、　ＨＰＬＣ分析は、ＧＬ－Ｃ６１１カラム（日立製作所製）及びＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）を用い、溶離液０．１ｍＭ－ＮａＯＨ、温度６０℃、流速１ｍＬ／ｍｉｎの条件下、検出器（島津製作所製、商品名「ＲＩＤ－２０Ａ」）を使用して行った。　また、菌体濃度の指標であるＯＤ６００は、紫外可視分光光度計ＵＶ－１８００（日立製作所製）を使用して、波長６００ｎｍの吸光度を測定することで算出した。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below by way of examples, but the present invention is not limited to these examples. In the following examples, HPLC analysis was performed using a GL-C611 column (manufactured by Hitachi Ltd.) and Prominence (manufactured by Shimadzu Corporation) under the conditions of an eluent of 0.1 mM-NaOH, a temperature of 60°C and a flow rate of 1 mL/min. A device (manufactured by Shimadzu Corporation, trade name “RID-20A”) was used. OD 600 , which is an index of cell concentration, was calculated by measuring absorbance at a wavelength of 600 nm using an ultraviolet-visible spectrophotometer UV-1800 (manufactured by Hitachi, Ltd.).
［実施例１］
　５０％ラネーニッケル（和光純薬工業（株）製）１０ｇに対し、２０％ＮａＯＨ水溶液を１００ｇ添加した。添加後９０℃、１時間の加温を行った。気泡の発生が止まったことを確認した後、デカンテーションにより蒸留水で触媒を洗浄した。洗浄は、洗浄液がｐＨ９．２になるまで行った。
　撹拌器、温度計を備えた１Ｌガラスオートクレーブに、１００ｇのD-アルロースを含む水溶液３００ｇに上記の方法により得られたラネーニッケル２４ｇを加えたものを添加した後、さらに水を加えて全反応液量を６００ｇに調整した。その際、反応液のｐＨを７に調整するため、炭酸カルシウムを添加した。５０℃に温度を、１２ｋｇ／ｃｍ２（ゲージ 圧）に水素圧を、７００ｒｐｍに攪拌速度を保ち反応を行った。一定時間毎に、反応液をサンプリングしD-アルロース、D-タリトール及びアリトールの分析を行い反応の進行状況を確認した。D-アルロース、D-タリトール及びアリトールの分析はＨＰＬＣを用いて行った。分析に供したサンプルは、反応液を経時的にサンプリングしたものを適宜希釈した後、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂を加え脱塩したものとした。その結果、８時間の反応でD-アルロースは１％まで減少し、D-タリトールとアリトールが生成比５５：４５で得られた。 [Example 1]
100 g of a 20% NaOH aqueous solution was added to 10 g of 50% Raney nickel (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After the addition, the mixture was heated at 90°C for 1 hour. After confirming that the generation of bubbles had stopped, the catalyst was washed with distilled water by decantation. Washing was performed until the washing liquid reached pH 9.2.
Into a 1 L glass autoclave equipped with a stirrer and a thermometer, 300 g of an aqueous solution containing 100 g of D-allulose was added with 24 g of Raney nickel obtained by the above method. was adjusted to 600 g. At that time, calcium carbonate was added to adjust the pH of the reaction solution to 7. The temperature was kept at 50° C., the hydrogen pressure was kept at 12 kg/cm 2 (gauge pressure), and the stirring speed was kept at 700 rpm to carry out the reaction. The reaction solution was sampled at regular time intervals and analyzed for D-allulose, D-talitol and allitol to confirm the progress of the reaction. Analysis of D-allulose, D-talitol and allitol was performed using HPLC. Samples subjected to analysis were obtained by appropriately diluting the reaction solution sampled over time, and desalted by adding an anion exchange resin and a cation exchange resin. As a result, D-allulose decreased to 1% after 8 hours of reaction, and D-talitol and allitol were obtained at a production ratio of 55:45.
［実施例２］
　ラネーニッケルを触媒とした水素添加によりD-アルロース２７０ｇから１００％還元して得られたアリトール、D-タリトール混合水溶液２０５０ｇを濃縮結晶化させ、減圧吸引ろ過により母液と分離し、結晶を回収した。これを一次結晶とする。一次結晶は再結晶させ、同様の方法を繰り返すことにより、二次結晶、三次結晶を得た。３回の晶析操作により４８ｇのアリトールを得た。実施例１に示す方法と同様の分析方法により、得られた三次結晶は、アリトール純度１００％であることが分かった。
　一方、上記操作において、結晶と分離し得られた母液を混合した溶液からは、２１７ｇのアリトール、D-タリトール混合糖アルコールが得られた。 ＨＰＬＣ分析を行い、結晶水及び母液中のアリトール、D-タリトールの比率を求めた結果、アリトールとD-タリトールとは、一次結晶では９１％と９％、二次結晶では９７％と３％、三次結晶では１００％と０％、混合母液では３７％と６３％であった。 [Example 2]
2050 g of a mixed aqueous solution of allitol and D-talitol obtained by reducing 270 g of D-allulose to 100% by hydrogenation using Raney nickel as a catalyst was concentrated and crystallized, and separated from the mother liquor by suction filtration under reduced pressure to recover crystals. Let this be the primary crystal. The primary crystals were recrystallized and the same procedure was repeated to obtain secondary and tertiary crystals. 48 g of allitol was obtained by three crystallization operations. The tertiary crystal obtained was found to have an allitol purity of 100% by the same analytical method as that shown in Example 1.
On the other hand, 217 g of allitol-D-talitol mixed sugar alcohol was obtained from the solution obtained by mixing the mother liquor obtained by separating the crystals in the above operation. HPLC analysis was performed to determine the ratios of allitol and D-talitol in the water of crystallization and the mother liquor. 100% and 0% for the tertiary crystals and 37% and 63% for the mixed mother liquor.
［実施例３］
　固定化ＤＡＥを以下のように作成した。
　Ｄ-アルロース3-エピメラーゼ（ＤＡＥ）は、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２８１３として寄託されたアルスロバクター　ヒスチジノロボランス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）Ｙ５８６－１株由来の組換え体粗酵素を使用した。
　Ｙ５８６－１株由来のＤＡＥを発現する組換え大腸菌菌体を５０ｍＭトリス－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌに懸濁した菌体懸濁液を、氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザーで細胞破砕して、破砕物を１２０００ｒｐｍで３０分遠心し、その遠心上清を粗酵素液とした。粗酵素液は、６０℃で１０分間熱処理することで夾雑タンパク質を失活させて、遠心分離することで除去した。熱処理後の部分精製酵素は予め５０ｍＭトリス－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した弱塩基性アニオン交換樹脂Ａ１１１Ｓ（ピュロライト社製）イオン交換樹脂（固定化担体）に添加して酵素を固定化した。得られた固定化ＤＡＥを以降の試験に用いた。 [Example 3]
Immobilized DAE was made as follows.
D-allulose 3-epimerase (DAE) was a crude recombinant enzyme derived from Arthrobacter histidinolovorans Y586-1 strain deposited under Accession No. NITE BP-02813.
Recombinant E. coli cells expressing DAE derived from strain Y586-1 were suspended in 10 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), and the cell suspension was cooled in ice water with an ultrasonic homogenizer. After crushing, the crushed product was centrifuged at 12000 rpm for 30 minutes, and the centrifugal supernatant was used as a crude enzyme solution. The crude enzyme solution was heat-treated at 60° C. for 10 minutes to inactivate contaminating proteins and centrifuged to remove them. The partially purified enzyme after the heat treatment was added to a weakly basic anion exchange resin A111S (manufactured by Purolite) ion exchange resin (immobilizing carrier) previously equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) to immobilize the enzyme. turned into The resulting immobilized DAE was used for subsequent tests.
［実施例４］
　１％ポリオール混合液に、アリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物、レリオティア　ジェオガリを作用させた反応
　ＴＳＢ培地で培養したレリオティア　ジェオガリ ＢＤｒ２７－３－２株菌体を遠心分離により集菌し、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ7.0）を用いて洗菌した。ポリオール１％ (アリトール：D-タリトール＝1:5)、リン酸ナトリウム緩衝液 ５０ｍＭ (pH 7.0)、洗浄菌体 (ＯＤ６００＝２０)から成る反応液 (10 mL)に固定化ＤＡＥ100μLを添加し、30℃にて振盪・撹拌した。経時的に反応液の一部を採取し、遠心分離による菌体除去、イオン交換樹脂による脱塩の後に、ＨＰＬＣを用いて糖組成を分析した。
結果を図５に示す。反応１８時間でアリトールのピーク（retention time １９．２ min）が消失し、高純度のD-タリトール（retention time ２１．８ min）溶液が得られた。 [Example 4]
A 1% polyol mixture was reacted with Reliotia geogari, a microorganism capable of producing D-allulose from allitol. The cells were washed with sodium phosphate buffer (10 mM, pH 7.0). 100 μL of immobilized DAE was added to a reaction solution (10 mL) consisting of 1% polyol (allitol:D-talitol=1:5), 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), and washed cells (OD 600 =20). , and shaken and stirred at 30°C. A portion of the reaction solution was sampled over time, removed by centrifugation, desalted with an ion-exchange resin, and then analyzed for sugar composition using HPLC.
The results are shown in FIG. After 18 hours of reaction, the allitol peak disappeared (retention time 19.2 min), and a highly pure D-talitol (retention time 21.8 min) solution was obtained.
［実施例５］
　１０％ポリオール混合液を用いた反応
　ＴＳＢ培地で培養したBDr27-3-2株菌体を遠心分離により集菌し、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ7.0）を用いて洗菌した。ポリオール１０％ (アリトール：D-タリトール＝1:5)、リン酸ナトリウム緩衝液 ５０ｍＭ  (pH 7.0)、洗浄菌体 (ＯＤ６００＝２０)から成る反応液 (10 mL)に固定化ＤＡＥ100 μLを添加し、30℃にて振盪・撹拌した。経時的に反応液の一部を採取し、遠心分離による菌体除去、イオン交換樹脂による脱塩の後に、ＨＰＬＣを用いて糖組成を分析した。結果を図６に示す。反応の経過に伴いアリトールのピーク（retention time １９．２min）が減少し、反応７２時間でアリトールピークが消失し、高純度のD-タリトール（retention time２１．８ min）溶液が得られた。 [Example 5]
Reaction Using 10% Polyol Mixture BDr27-3-2 strain cells cultured in TSB medium were collected by centrifugation and washed with sodium phosphate buffer (10 mM, pH 7.0). 100 μL of immobilized DAE was added to a reaction solution (10 mL) consisting of 10% polyol (allitol: D-talitol = 1:5), 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), and washed cells (OD 600 = 20). and shaken and stirred at 30°C. A portion of the reaction solution was sampled over time, removed by centrifugation, desalted with an ion-exchange resin, and then analyzed for sugar composition using HPLC. The results are shown in FIG. The allitol peak (retention time: 19.2 min) decreased with the progress of the reaction, and disappeared after 72 hours of reaction, yielding a high-purity D-talitol (retention time: 21.8 min) solution.
［実施例６］
　２０％ポリオール混合液を用いた反応 (１)
　ＴＳＢ培地で培養したBDr27-3-2株菌体を遠心分離により集菌し、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ7.0）を用いて洗菌した。ポリオール２０％ (アリトール：D-タリトール＝1:5)、リン酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭ  (pH 7.0)、洗浄菌体 (ＯＤ６００＝５０)から成る反応液 (10 mL)に固定化ＤＡＥ400 μLを添加し、30℃にて振盪・撹拌しつつ48時間ごとにＯＤ５０相当の菌体を追加した。経時的に反応液の一部を採取し、遠心分離による菌体除去、およびイオン交換樹脂による脱塩をした後に、ＨＰＬＣを用いて糖組成を分析した。結果を図７に示す。反応の経過に伴いアリトールのピーク（retention time １９．２ min）が減少し、反応１４４時間でアリトールピークが消失し、高純度のD-タリトール（retention time２１．８ min）溶液が得られた。 [Example 6]
Reaction using 20% polyol mixture (1)
BDr27-3-2 strain cells cultured in TSB medium were collected by centrifugation and washed with sodium phosphate buffer (10 mM, pH 7.0). 400 μL of immobilized DAE was added to a reaction mixture (10 mL) consisting of polyol 20% (allitol: D-talitol = 1:5), sodium phosphate buffer 50 mM (pH 7.0), and washed cells (OD 600 = 50). Then, while shaking and stirring at 30°C, cells corresponding to OD50 were added every 48 hours. A portion of the reaction solution was sampled over time, subjected to centrifugal separation to remove bacterial cells, and desalted using an ion-exchange resin, followed by analysis of the sugar composition using HPLC. The results are shown in FIG. The allitol peak (retention time 19.2 min) decreased with the progress of the reaction, and the allitol peak disappeared after 144 hours of reaction, yielding a highly pure D-talitol (retention time 21.8 min) solution.
［実施例７］
　２０％ポリオール混合液を用いた反応 (２)
　ＴＳＢ培地で培養したBDr27-3-2株菌体を遠心分離により集菌し、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ7.0）を用いて洗菌した。ポリオール ２０％ (アリトール：D-タリトール＝1:5)、リン酸ナトリウム緩衝液 ５０ｍＭ(pH 7.0)、洗浄菌体 (ＯＤ６００＝５０)から成る反応液 (10 mL)に固定化ＤＡＥ400 μL添加し、30℃にて振盪・撹拌した。反応液中の菌体を48時間、96時間経過後に遠心分離により除去し、新たに培養した菌体を加え反応を再開した。経時的に反応液の一部を採取し、遠心分離による菌体除去、およびイオン交換樹脂による脱塩をした後に、ＨＰＬＣを用いて糖組成を分析した。結果を図８に示す。反応の経過に伴いアリトールのピーク（retention time １９．２min）が減少し、反応１６８時間でアリトールピークが消失し、高純度のD-タリトール（retention time ２１．８ min）溶液が得られた。 [Example 7]
Reaction with 20% polyol mixture (2)
BDr27-3-2 strain cells cultured in TSB medium were collected by centrifugation and washed with sodium phosphate buffer (10 mM, pH 7.0). 400 μL of immobilized DAE was added to a reaction solution (10 mL) consisting of polyol 20% (allitol:D-talitol=1:5), sodium phosphate buffer 50 mM (pH 7.0), and washed cells (OD 600 =50). , and shaken and stirred at 30°C. After 48 hours and 96 hours, the cells in the reaction solution were removed by centrifugation, and newly cultured cells were added to restart the reaction. A portion of the reaction solution was sampled over time, subjected to centrifugal separation to remove bacterial cells, and desalted using an ion-exchange resin, followed by analysis of the sugar composition using HPLC. The results are shown in FIG. The allitol peak (retention time: 19.2 min) decreased with the progress of the reaction, and disappeared after 168 hours of reaction, yielding a highly pure D-talitol (retention time: 21.8 min) solution.
［実施例８］
　アリトール晶析後のD-アルロース水素添加反応液を用いた試験（（ア）ii））
　ＴＳＢ培地で培養したBDr27-3-2株菌体を遠心分離により集菌し、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ7.0）を用いて洗菌した。アリトール晶析後のD-アルロース水素添加反応液 Brix10、リン酸ナトリウム緩衝液 ５０ｍＭ(pH 7.0)、洗浄菌体 (ＯＤ６００＝２０)から成る反応液 (500 mL)に固定化ＤＡＥ5 mLを添加し、ジャーファーメンターを用いて30℃にて通気（0.８L/min）しつつ撹拌した。経時的に採取した反応液を遠心分離して菌体を除去し、脱塩した後にＨＰＬＣを用いて糖組成を分析した。結果を図９に示す。反応の経過に伴いアリトールのピーク（retention time １９．２min）が減少し、反応１２０時間でアリトールピークが消失し、高純度のD-タリトール（retention time ２１．８ min）溶液が得られた。 [Example 8]
Test using D-allulose hydrogenation reaction solution after allitol crystallization ((a) ii))
BDr27-3-2 strain cells cultured in TSB medium were collected by centrifugation and washed with sodium phosphate buffer (10 mM, pH 7.0). 5 mL of immobilized DAE was added to the reaction mixture (500 mL) consisting of D-allulose hydrogenation reaction mixture Brix 10 after allitol crystallization, sodium phosphate buffer 50 mM (pH 7.0), and washed cells (OD 600 = 20). , and stirred at 30° C. with aeration (0.8 L/min) using a jar fermenter. The reaction solution collected over time was centrifuged to remove the cells, desalted, and analyzed for sugar composition using HPLC. The results are shown in FIG. The allitol peak (retention time 19.2 min) decreased with the progress of the reaction, and disappeared after 120 hours of reaction, giving a highly pure D-talitol (retention time 21.8 min) solution.
［実施例９］
　１０％ポリオール混合液を用いた反応
　ＴＳＢ培地で培養したBCa7-2株菌体を遠心分離により集菌し、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ7.0）を用いて洗菌した。ポリオール１０％ (アリトール：D-タリトール＝1:5)、リン酸ナトリウム緩衝液 ５０ｍＭ  (pH 7.0)、洗浄菌体 (ＯＤ６００＝5０)から成る反応液 (10 mL)を30℃にて振盪・撹拌した。経時的に反応液の一部を採取し、遠心分離による菌体除去、イオン交換樹脂による脱塩の後に、ＨＰＬＣを用いて糖組成を分析した。結果を図10に示す。反応の経過に伴いアリトールのピーク（retention time １９．２min）が減少し、高純度のD-タリトール（retention time２１．８ min）溶液が得られた。

  [Example 9]
Reaction Using 10% Polyol Mixture BCa7-2 strain cells cultured in TSB medium were collected by centrifugation and washed with sodium phosphate buffer (10 mM, pH 7.0). A reaction solution (10 mL) consisting of 10% polyol (allitol: D-talitol = 1:5), sodium phosphate buffer 50 mM (pH 7.0), and washed cells (OD 600 = 50) was shaken at 30°C. Stirred. A portion of the reaction solution was sampled over time, removed by centrifugation, desalted with an ion-exchange resin, and then analyzed for sugar composition using HPLC. The results are shown in FIG. The allitol peak (retention time 19.2 min) decreased with the progress of the reaction, and a highly pure D-talitol (retention time 21.8 min) solution was obtained.

Claims (8)

  1. 　D-タリトールとアリトールの混合物(A)から実質上純粋なD-タリトール(B)またはアリトール(C)を製造する方法であって、
    （ア）D-タリトールとアリトールの混合物(A)の水溶液から濃縮により結晶を析出させる晶析操作により、晶析前よりアリトール比率のより高い結晶(A-1)と、晶析前に比べてD-タリトールの含有率が上昇し、アリトールの含有量が低下している混合液(A-2)とを得る工程、を有し、
    　前記混合液(A-2)を、
    　ｉ）クロマトグラフィーカラムに通して、アリトールを含まないD-タリトール画分を採取する、または
    　ii) アリトールに作用しD-タリトールに作用しない微生物で処理してアリトールを分解する、
    ことにより、実質上純粋なD-タリトール（B）を得る、または
    （イ）D-タリトールとアリトールの混合物(A)の水溶液にアリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物を作用させて、アリトールからD-アルロースを製造し、クロマトグラフィーカラムに通して、D-アルロースを含まないD-タリトール画分を採取する、
    ことにより、実質上純粋なD-タリトール（B）を得る、ことを特徴とする方法。     A method for producing substantially pure D-talitol (B) or allitol (C) from a mixture (A) of D-talitol and allitol, comprising:
    (a) Crystals (A-1) with a higher allitol ratio than before crystallization and crystals (A-1) with a higher ratio of allitol than before crystallization, and obtaining a mixed solution (A-2) in which the content of D-talitol is increased and the content of allitol is decreased;
    The mixed solution (A-2),
    i) collect an allitol-free D-talitol fraction through a chromatography column, or ii) treat with an allitol-affecting but not D-talitol-affecting microorganism to degrade allitol.
    to obtain substantially pure D-talitol (B), or (a) reacting an aqueous solution of a mixture of D-talitol and allitol (A) with a microorganism capable of producing D-allulose from allitol, producing D-allulose from allitol and passing it through a chromatography column to collect a D-allulose-free D-talitol fraction;
    to obtain substantially pure D-talitol (B).
  2. 　前記D-タリトールとアリトールの混合物(A)が、D-アルロースを原料とし、D-アルロースを金属触媒の下、高温高圧下で水素を用いて還元してD-タリトールとアリトールの混合物を生成する水添工程により得られる、請求項１に記載の方法。 The mixture (A) of D-talitol and allitol is prepared by using D-allulose as a starting material, and reducing D-allulose with hydrogen under a metal catalyst at high temperature and high pressure to produce a mixture of D-talitol and allitol. 2. A method according to claim 1, obtained by a hydrogenation process.
  3. 　前記（ア）の晶析前よりアリトール比率のより高い結晶(A-1)を、晶析操作を繰り返すこと、あるいは晶析したアリトールの比率の高い結晶をアリトール溶液で洗浄することにより、実質上純粋なアリトールを得る、請求項１または２に記載の方法。 By repeating the crystallization operation of the crystal (A-1) having a higher allitol ratio than before the crystallization of (A), or by washing the crystallized crystal having a high allitol ratio with an allitol solution, 3. A method according to claim 1 or 2, wherein pure allitol is obtained.
  4. 　前記（ア）ii)のアリトールに作用しD-タリトールに作用しない微生物として、アリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、同時にＤＡＥを持つ微生物（ａ）を選択し、アリトールに作用させてアリトールから変換されたD-アルロースが、ＤＡＥの作用によりD-フラクト－スに変換され菌体内で代謝分解されてアリトールを分解する、または、アリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、ＤＡＥを持たない微生物（ｂ）を選択し、固定化DAEを共存させて、アリトールに作用させてアリトールから変換されたD-アルロースが、菌体外でＤＡＥの作用によりD-フラクト－スに変換され菌体内で代謝分解されてアリトールを分解する、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。 As the microorganism (a) ii) that acts on allitol but does not act on D-talitol, a microorganism (a) that has the ability to produce D-allulose from allitol and at the same time has DAE is selected and allowed to act on allitol. D-allulose converted from allitol has the ability to be converted to D-fructose by the action of DAE, which is metabolically degraded in bacteria to degrade allitol, or has the ability to produce D-allulose from allitol, and DAE Microorganisms (b) that do not have the bacterium are selected, coexisted with immobilized DAE, and D-allulose converted from allitol by the action of allitol is converted to D-fructose outside the cells by the action of DAE. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein allitol is degraded through metabolic decomposition in the cells.
  5. 　前記アリトールからD-アルロースを製造する能力を有する微生物が、D-タリトールを変換する能力を有さない、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）、レリオティア属（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ）、およびパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）に属する細菌からなる群より選択される微生物である、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。 the genus Burkholderia, the genus Enterobacter, the genus Agrobacterium, wherein the microorganism capable of producing D-allulose from allitol does not have the ability to convert D-talitol; 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the microorganism is selected from the group consisting of bacteria belonging to the genera Buttiauxella, Lelliottia, and Pantoea.
  6. 　前記微生物が、バークホルデリア　ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｌａｔａ）、バークホルデリア　マルティボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア　ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｉｆｆｕｓａ）、エンテロバクター　ホルマエケイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）、エンテロバクター　ソリ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｏｌｉ）、アグロバクテリウム　プセンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｕｓｅｎｓｅ）、ブティアウクセラ　ブレネラエ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブティアウクセラ　ｓｐ．（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｓｐ．）、レリオティア　ジェオガリ（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ　ｊｅｏｔｇａｌｉ）、およびパントエア　ｓｐ．（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｐ．）の細菌種からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。 The microorganisms include Burkholderia lata, Burkholderia multivorans, Burkholderia diffusa, Enterobacter hormaechei, Enterobacter gloserobacteri (Enterobacter hormaechei) Bacterium pusense, Buttiauxella brennerae, Butiauxella sp. (Buttiauxella sp.), Lelliottia jeotgali, and Pantoea sp. (Pantoea sp.) bacterial species.
  7. 　前記（a）のアリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、同時にＤＡＥを持つ微生物が、バークホルデリア　ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｌａｔａ）、バークホルデリア　ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｉｆｆｕｓａ）、アグロバクテリウム　プセンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｕｓｅｎｓｅ）の細菌種からなる群より選択される、請求項４ないし６のいずれかに記載の方法。 The microorganisms having the ability to produce D-allulose from allitol in (a) above and having DAE at the same time are Burkholderia lata, Burkholderia diffusa, and Agrobacterium pusense. ) bacterial species.
  8. 　前記（b）のアリトールからD-アルロースを製造する能力を有し、ＤＡＥを持たない微生物が、バークホルデリア　ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｌａｔａ）、バークホルデリア　マルティボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア　ディフュサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｉｆｆｕｓａ）、エンテロバクター　ホルマエケイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）、エンテロバクター　ソリ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｏｌｉ）、ブティアウクセラ　ブレネラエ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブティアウクセラ　ｓｐ．（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｓｐ．）、レリオティア　ジェオガリ（Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ　ｊｅｏｔｇａｌｉ）、およびパントエア ｓｐ．（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｐ．）の細菌種からなる群より選択される、請求項４ないし６のいずれかに記載の方法。

          The above (b) microorganisms capable of producing D-allulose from allitol and having no DAE are Burkholderia lata, Burkholderia multivorans, Burkholderia diffusa ( Burkholderia diffusa), Enterobacter hormaechei, Enterobacter soli, Buttiauxella brennerae, Butiauxella sp. (Buttiauxella sp.), Lelliottia jeotgali, and Pantoea sp. 7. The method according to any one of claims 4 to 6, wherein the method is selected from the group consisting of bacterial species of (Pantoea sp.).
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WO (1) WO2023063337A1 (en)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04197192A (en) * 1990-11-29 1992-07-16 Kirin Brewery Co Ltd Production of xylose and reduced xylose
JPH0856659A (en) * 1994-08-20 1996-03-05 Hayashibara Biochem Lab Inc Ribitol dehydrogenase and its production and use
WO2002092545A1 (en) * 2001-05-11 2002-11-21 Fushimi Pharmaceutical Company, Limited Method for producing sugar alcohol
WO2008062570A1 (en) * 2006-11-20 2008-05-29 National University Corporation Kagawa University Microorganism capable of producing deoxy polyol dehydrogenase and utilization of the same
JP2009207462A (en) * 2008-03-06 2009-09-17 Unitika Ltd Method for producing sugar for synthetic raw material
JP2010505441A (en) * 2006-10-13 2010-02-25 株式會社アモーレパシフィック Method for producing kaempferol-3-O-rutinoside and skin external preparation composition containing the same
WO2020096006A1 (en) * 2018-11-08 2020-05-14 国立大学法人香川大学 Method for producing rare sugar-containing composition and rare sugar-containing composition

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04197192A (en) * 1990-11-29 1992-07-16 Kirin Brewery Co Ltd Production of xylose and reduced xylose
JPH0856659A (en) * 1994-08-20 1996-03-05 Hayashibara Biochem Lab Inc Ribitol dehydrogenase and its production and use
WO2002092545A1 (en) * 2001-05-11 2002-11-21 Fushimi Pharmaceutical Company, Limited Method for producing sugar alcohol
JP2010505441A (en) * 2006-10-13 2010-02-25 株式會社アモーレパシフィック Method for producing kaempferol-3-O-rutinoside and skin external preparation composition containing the same
WO2008062570A1 (en) * 2006-11-20 2008-05-29 National University Corporation Kagawa University Microorganism capable of producing deoxy polyol dehydrogenase and utilization of the same
JP2009207462A (en) * 2008-03-06 2009-09-17 Unitika Ltd Method for producing sugar for synthetic raw material
WO2020096006A1 (en) * 2018-11-08 2020-05-14 国立大学法人香川大学 Method for producing rare sugar-containing composition and rare sugar-containing composition

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LU FUZHI; XU WEI; ZHANG WENLI; GUANG CUIE; MU WANMENG: "Polyol dehydrogenases: intermediate role in the bioconversion of rare sugars and alcohols", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER BERLIN HEIDELBERG, BERLIN/HEIDELBERG, vol. 103, no. 16, 2 July 2019 (2019-07-02), Berlin/Heidelberg, pages 6473 - 6481, XP036847529, ISSN: 0175-7598, DOI: 10.1007/s00253-019-09980-z *
POONPERM, W. TAKATA, G. ANDO, Y. SAHACHAISAREE, V. LUMYONG, P. LUMYONG, S. IZUMORI, K.: "Efficient conversion of allitol to d-psicose by Bacillus pallidus Y25", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 103, no. 3, 1 March 2007 (2007-03-01), NL , pages 282 - 285, XP022028175, ISSN: 1389-1723, DOI: 10.1263/jbb.103.282 *
PUSHPAKIRAN GULLAPALLI, TAKATA GORO, POONPERM WAYOON, RAO DEVENDAR, MORIMOTO KENJI, AKIMITSU KAZUYA, TAJIMA SHIGEYUKI, IZUMORI KEN: "Bioproduction of D-Psicose from Allitol with Enterobacter aerogenes IK7: A New Frontier in Rare Ketose Production", BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY, JP, vol. 71, no. 12, 1 January 2007 (2007-01-01), JP , pages 3048 - 3054, XP055354147, ISSN: 0916-8451, DOI: 10.1271/bbb.70450 *

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