WO2023063021A1 - 患者の分類方法、キットおよびバイオマーカーの使用 - Google Patents

患者の分類方法、キットおよびバイオマーカーの使用 Download PDF

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WO2023063021A1
WO2023063021A1 PCT/JP2022/034683 JP2022034683W WO2023063021A1 WO 2023063021 A1 WO2023063021 A1 WO 2023063021A1 JP 2022034683 W JP2022034683 W JP 2022034683W WO 2023063021 A1 WO2023063021 A1 WO 2023063021A1
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WO
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protein
patients
gdf15
proteins
group
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PCT/JP2022/034683
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English (en)
French (fr)
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寿健 松本
健 蛯原
裕司 小倉
庸博 松原
由貴 戸上
順 織田
茂人 瀬尾
伸也 大西
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国立大学法人大阪大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to patient classification methods, kits and uses of biomarkers.
  • COVID-19 a type of coronavirus infection, has spread worldwide and was declared a pandemic by the World Health Organization (WHO) on January 30, 2020. In Japan, the number of cases has skyrocketed since cases were reported in January 2020.
  • WHO World Health Organization
  • COVID-19 is considered a viral sepsis, and when the patient's inflammation becomes excessive, it causes multi-organ failure from systemic inflammatory syndrome.
  • As a treatment for COVID-19 it is considered effective to use an anti-inflammatory drug that suppresses excessive inflammation together with an antiviral drug such as bipiravir.
  • Non-Patent Document 1 it has been reported that serum ferritin, procalcitonin, IL-6, etc. can be used as biomarkers for COVID-19.
  • One aspect of the present invention aims to realize a classification method, kit, biomarker, etc. that can be used to classify patients with coronavirus infection.
  • Another object of the present invention is to realize a classification method, a kit, a biomarker, etc. that can be used to classify systemic inflammatory response syndrome patients.
  • a method of classifying patients with coronavirus infection comprising the step of detecting one or more proteins selected from the group consisting of GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, and KRT19 protein in a sample collected from a subject.
  • AGR2 protein AREG protein, CA3 protein, CALCA protein, CCL7 protein, FGF23 protein, GPR37 protein, HSPB6 protein, IL1RL1 protein, IL6 protein, LTBP2 protein, MB protein, MMP8 protein in a sample collected from a subject
  • the classification method according to ⁇ 1> further comprising detecting one or more selected from the group consisting of NOS1 protein, PLA2G2A protein, STC1 protein, TMSB10 protein, TNFRSF10B protein, TNNI3 protein, and VSIG4 protein.
  • a kit comprising an article for detecting one or more selected from the group consisting of GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, and KRT19 protein.
  • AGR2 protein AREG protein, CA3 protein, CALCA protein, CCL7 protein, FGF23 protein, GPR37 protein, HSPB6 protein, IL1RL1 protein, IL6 protein, LTBP2 protein, MB protein, MMP8 protein, NOS1 protein, PLA2G2A protein, STC1 protein , TMSB10 protein, TNFRSF10B protein, TNNI3 protein, and VSIG4 protein.
  • ⁇ 5> Use of a biomarker containing one or more selected from the group consisting of GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, and KRT19 protein for classifying patients with coronavirus infection.
  • AGR2 protein AREG protein, CA3 protein, CALCA protein, CCL7 protein, FGF23 protein, GPR37 protein, HSPB6 protein, IL1RL1 protein, IL6 protein, LTBP2 protein, MB protein, MMP8 protein, NOS1 protein, PLA2G2A protein, STC1 protein , TMSB10 protein, TNFRSF10B protein, TNNI3 protein, and VSIG4 protein.
  • a method of classifying a patient with systemic inflammatory response syndrome comprising the step of detecting GDF15 protein in a sample collected from a subject.
  • a kit for classifying systemic inflammatory response syndrome patients comprising an article for detecting GDF15 protein.
  • a classification method, a kit, a biomarker, etc. that can be used to classify patients with coronavirus infection.
  • a classification method, a kit, a biomarker, etc. that can be used to classify systemic inflammatory response syndrome patients.
  • FIG. 11 is a volcano plot showing proteins with differential expression between the severe group and the non-severe group in the first analysis population.
  • FIG. Boxplots showing the results of evaluating 24 candidate proteins in the first analysis population in the second analysis population. Boxplots showing the results of assessing the expression levels of 24 candidate proteins in the first analysis population between healthy controls and COVID-19 patients in the second analysis population.
  • FIG. 10 depicts the relationship between 24 candidate proteins in the first analysis population and time to IMV withdrawal in the second analysis population. Heat map of dendrogram and clinical features of critically ill patients in Phase 1 of the second analysis population. 4 is a graph of Scale independence and Mean connectivity output by R; FIG.
  • FIG. 10 is a heatmap plot, dendrogram and modules showing the results of protein co-expression network analysis of critically ill patients in Phase 1 of the second analysis population.
  • FIG. 8 is an excerpt of the dendrogram and modules of FIG. 7;
  • FIG. FIG. 8 is a heat map showing correlations between the modules of FIG. 7 and clinical features;
  • FIG. 10 is a network diagram of the co-expression modules of 24 candidate proteins in the first analysis population reconstructed using Cytoscape and visualized.
  • FIG. 8 depicts the results of gene ontology (GO) enrichment analysis of proteins that showed differential expression in the turquoise and blue modules of FIG. 7.
  • FIG. Boxplots showing the results of assessing differences in expression levels of five candidate proteins in the second analysis population between controls and COVID-19 patients in the validation population.
  • FIG. 10 depicts ROC curves obtained using day 1 expression levels of four major proteins in the validation population.
  • FIG. 4 depicts ROC curves obtained using composite scores, CRP and D-dimer, respectively.
  • FIG. 4 is a diagram showing the ratio of survivors and non-survivors after 28 days and the ratio of early recovery group, delayed recovery group, and in-hospital death group included in each composite score.
  • FIG. 4 shows BIC scores for various numbers of classes;
  • FIG. 10 is a visualization of four phenotypes using t-distributed stochastic neighborhood embedding (t-SNE). Heat map showing relationships between four major proteins and four phenotypes.
  • FIG. 3 depicts Kaplan-Meier curves for survival after 28 days stratifying phenotypes obtained from latent class analysis.
  • FIG. 10 is a diagram representing the ROC curve obtained using the expression level of GDF15 on day 1 of hospitalization.
  • FIG. 10 is a diagram showing the classification results of systemic inflammatory response syndrome patients based on the estimated initial value and amount of change of GDF15;
  • FIG. 4 is a diagram showing Kaplan-Meier curves for four classes classified based on GDF15.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of classifying systemic inflammatory response syndrome patients based on the estimated initial value and amount of change in CRP;
  • FIG. 4 is a diagram showing Kaplan-Meier curves for four classes classified based on CRP.
  • a method for classifying patients with coronavirus infection detects one or more selected from the group consisting of GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, and KRT19 protein in a sample collected from a subject. Including process.
  • the method of classifying patients with coronavirus infection is intended only as a method of classifying patients, and is different from the method of diagnosing patients performed by a doctor.
  • the above classification method can be applied to diagnosis of patients with coronavirus infection, and doctors can make a diagnosis based on the results obtained from the classification method. Therefore, the above classification method can be said to be an auxiliary method for diagnosing patients with coronavirus infection.
  • the above-described classification method includes the step of detecting one or more selected from the group consisting of GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, and KRT19 protein in a sample collected from a subject Diagnosis of patients with coronavirus infection.
  • it is a data acquisition method for Detection of the protein can be performed in vitro.
  • Samples for detecting protein include blood, sputum, bronchoalveolar lavage fluid, saliva, cerebrospinal fluid, urine, stool, etc. collected from a subject, with blood being preferred.
  • the blood may be whole blood, plasma or serum, preferably plasma.
  • blood draws are typically performed daily. Therefore, it is easy to obtain blood, and it is easy to measure protein.
  • the above classification methods also utilize proteins as biomarkers. Proteins are highly stable, and the reproducibility of measured values is also high. Proteins have a simple evaluation process and rapid evaluation times. Such protein-based biomarkers can also be used in the ICU and are clinically useful. Based on these findings, it is believed that the above four proteins can be clinically applied as biomarkers in the future for the selection of treatment indicators and optimal therapeutic drugs for severely ill patients with COVID-19.
  • the subject may be a human or a non-human mammal. Also, the subject can be a patient with a coronavirus infection.
  • a coronavirus infection is an infectious disease caused by a coronavirus.
  • a patient with coronavirus infection may be a patient who tests positive by a PCR test to detect coronavirus.
  • a patient with coronavirus infection may also be a patient diagnosed with pneumonia by CT scan or the like.
  • a patient with coronavirus infection may be a patient diagnosed as requiring hospitalization or a patient diagnosed as not requiring hospitalization.
  • a patient with coronavirus infection may be a patient diagnosed as requiring oxygen administration or a patient diagnosed as not requiring oxygen administration.
  • the coronavirus infection patient may be a severe coronavirus infection patient or a non-severe coronavirus infection patient.
  • a critically ill patient with coronavirus infection may be a patient diagnosed as requiring mechanical ventilation.
  • a non-critically ill patient with coronavirus infection may be a patient diagnosed as not requiring ventilator management.
  • a coronavirus patient may also be a COVID-19 patient. COVID-19 is an infectious disease caused by a coronavirus (SARS-CoV-2).
  • Patients with coronavirus infection may have comorbidities.
  • Comorbidities include, but are not limited to, heart disease, lung disease, renal disease, immunocompromise, hypertension, diabetes, and the like.
  • Heart disease includes coronary artery disease, congestive heart failure, and valvular disease.
  • Pulmonary diseases include asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), conditions requiring oxygen at home, and other chronic lung ailments.
  • Kidney disease includes chronic kidney disease, a condition with baseline creatinine >1.5.
  • Immunocompromised states include active cancer, chemotherapy, transplantation, immunosuppressive drugs, and no spleen.
  • the sample may be collected at any timing, and may be collected multiple times.
  • the sample can be a sample taken on days 1-10 of hospitalization.
  • the sample may be a sample taken on days 1-2 of hospitalization, days 3-5 of hospitalization, and/or days 6-10 of hospitalization.
  • samples taken on days 1-2 of hospitalization may be used to early classify patients who may develop severe disease. Samples may be stored frozen between collection and use for protein detection.
  • GDF15 protein (Growth/differentiation factor 15, growth differentiation factor 15, GDF-15) is a member of the transforming growth factor (TGF)- ⁇ molecular superfamily and is used in macrophages, airway epithelial cells and It is known to be expressed at high levels in vascular endothelial cells (Bootcov, M. R. et al. Proc Natl Acad Sci USA 94, 11514-11519 (1997); Verhamme, F. M. et al. Am J Respir Cell Mol Biol 60, 621-628 (2019)).
  • GDF15 protein has been reported as an independent prognostic factor in cardiovascular disease, pulmonary disease, and sepsis (Myhre, P. L. et al. Circulation 142, 2128-2137 (2020); Husebo, G. R. et al. Eur Respir J 49, (2017); Buendgens, L. et al. Dis Markers 2017, 5271203 (2017)).
  • WFDC2 protein (WAP four-disulfide core domain protein 2, also known as Human epididymis protein 4 (HE4)). WFDC2 protein is known to be expressed at high levels in ovarian cancer, interstitial lung disease associated with systemic sclerosis and lung adenocarcinoma (Dochez, V. et al. Journal of Ovarian Research 12, 28 (2019); Zhang, M. et al. Therapeutic Advances in Chronic Disease 11, 2040622320956420 (2020); Bingle, L. et al. Respir Res 7, 61 (2006)).
  • HE4 Human epididymis protein 4
  • the WFDC2 protein is expressed in several epithelial cells of the upper respiratory tract, mucosal cells, and submucosal gland ducts and is thought to be involved in innate immunity of the oral mucosa and nasopharynx (Bingle, L. et al. Respir Res 7, 61 (2006)).
  • the CHI3L1 protein (also known as Chitinase-3-like protein 1, YKL-40) is a member of the glycoside hydrolase family 18 and includes macrophages, neutrophils, synovial cells, smooth muscle proteins, and tumor cells. Synthesized and secreted by many cells (Zhao, T. et al. Sig Transduct Target Ther 5, 1-20 (2020)). CHI3L1 protein has been reported to promote cancer growth, inflammatory cytokine production, and microglial activity (Yeo, I. J. et al. Pharmacology & Therapeutics 203, 107394 (2019)).
  • CHI3L1 protein has also been reported to have a strong association with diseases such as asthma, arthritis, sepsis, diabetes, liver fibrosis, and coronary artery disease (Zhao, T. et al. Sig Transduct Target Ther 5, 1-20 (2020)).
  • KRT19 protein (Keratin, type I cytoskeletal 19) is one of the most important cytokeratins expressed in epithelial and mesothelial tissues. Also, overexpression of KRT19 protein has been reported in more than 30 malignancies, including lung and breast cancer (Hamesch, K. et al. BMC Medicine 18, 336 (2020)). Cyfra21-1 protein, which is a fragment of KRT19 protein, has been reported to be useful as a marker for non-small cell lung cancer (squamous cell carcinoma) among lung cancers (Reinmuth, N. et al. Lung Cancer 36, 265-270 (2002)).
  • the classification method may comprise detecting two or more, three or more, or all four of the four proteins.
  • a step of detecting one or more selected from the group consisting of proteins, NOS1 protein, PLA2G2A protein, STC1 protein, TMSB10 protein, TNFRSF10B protein, TNNI3 protein, and VSIG4 protein may be included. As shown in the Examples, these proteins also have elevated expression levels in critically ill patients with COVID-19 compared to non-severely ill patients. Therefore, these proteins can also be used as biomarkers together with the four proteins described above.
  • accession numbers in the database UniprotKB are GDF15 protein: Q99988, WFDC2 protein (HE4): Q14508, CHI3L1 protein: P36222, KRT19 protein: P08727, AGR2 protein (Anterior gradient protein 2 homolog ): O95994, AREG protein (Amphiregulin): P15514, CA3 protein (Carbonic anhydrase 3): P07451, CALCA protein (Calcitonin gene-related peptide 1): P06881, CCL7 protein (C-C motif chemokine 7): P80098, FGF23 protein (Fibroblast growth factor 23): Q9GZV9, GPR37 protein (Prosaposin receptor GPR37): O15354, HSPB6 protein (Heat shock protein beta-6): O14558, IL1RL1 protein (Interleukin-1 receptor-like 1): Q01638, IL6 protein (Interleukin-6
  • the protein detection method is not particularly limited, and may be an immunoassay method or a mass spectrometry method.
  • Immunoassays include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), western blotting, radioimmunoassay, immunochromatography, immunoprecipitation, biotin-avidin, electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA). , chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA), and the like.
  • the above classification method may include a step of determining the presence or absence of a protein, and may include a step of quantifying the protein expression level.
  • the classification method may also comprise comparing the expression level measured in patients with coronavirus infection to a preset reference value.
  • the reference value may be set based on expression levels measured in healthy subjects without coronavirus infection, and may be based on expression levels measured in non-severe patients with coronavirus infection. may be set based on The reference value may be a cut-off value obtained from an ROC curve as in Examples described later.
  • the above classification method may include a step of classifying coronavirus infection patients into severe coronavirus infection patients and non-severe coronavirus infection patients.
  • the classification method may also include the step of classifying severely ill patients with coronavirus infection or non-severely ill patients with coronavirus infection into further phenotypes. These classifications can be based on the presence or absence or expression level of the proteins mentioned above.
  • the number of phenotypes may be 2-10, 2-6, or 2-4.
  • severe patients with coronavirus infection may be classified into four phenotypes ( ⁇ -phenotype, ⁇ -phenotype, ⁇ -phenotype, ⁇ -phenotype) shown in the examples.
  • the four phenotypes may, for example, be characterized by increasing expression levels of the four proteins in the order ⁇ -phenotype ⁇ -phenotype ⁇ -phenotype ⁇ -phenotype.
  • the four phenotypes may, for example, be characterized by descending survival rates after 28 days in the order ⁇ -phenotype> ⁇ -phenotype> ⁇ -phenotype> ⁇ -phenotype.
  • kits comprises an article for detecting one or more selected from the group consisting of GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, and KRT19 protein.
  • the kit can be a kit for use in the aforementioned classification method.
  • the kit may include articles for detecting two or more, three or more, or all four of the four proteins. If multiple types of the above four types of proteins are combined and used as biomarkers, it is possible to further improve the accuracy of classification of patients with coronavirus infection.
  • the kit contains AGR2 protein, AREG protein, CA3 protein, CALCA protein, CCL7 protein, FGF23 protein, GPR37 protein, HSPB6 protein, IL1RL1 protein, IL6 protein, LTBP2 protein, MB protein, MMP8 protein, NOS1 protein, PLA2G2A protein, STC1 It may further comprise an article for detecting one or more selected from the group consisting of protein, TMSB10 protein, TNFRSF10B protein, TNNI3 protein, and VSIG4 protein.
  • the protein detection method is as described above.
  • Articles for detecting proteins include, but are not particularly limited to, antibodies.
  • the kit may include articles for determining the presence or absence of the protein, and may include articles for quantifying the expression level of the protein.
  • kit may include drugs, instruments, containers, instructions, etc. required for use of the kit.
  • the kit may comprise, for example, the items necessary to carry out the detection method described above.
  • An embodiment of the present invention also includes the use of biomarkers comprising one or more selected from the group consisting of GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, KRT19 protein for classifying patients with coronavirus infection.
  • biomarkers comprising one or more selected from the group consisting of GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, KRT19 protein for classifying patients with coronavirus infection.
  • a biomarker containing one or more selected from the group consisting of protein, STC1 protein, TMSB10 protein, TNFRSF10B protein, TNNI3 protein, and VSIG4 protein may be used in combination.
  • one embodiment of the present invention can be applied to the selection of therapeutic agents for coronavirus infections. That is, it is possible to support research and development of therapeutic agents for infectious diseases. This will contribute to achieving Goal 3 of the Sustainable Development Goals (SDGs), "Good Health and Well-Being for All.”
  • SDGs Sustainable Development Goals
  • a method for classifying systemic inflammatory response syndrome patients comprises the step of detecting GDF15 protein in a sample taken from a subject.
  • the method of classifying patients with systemic inflammatory response syndrome is intended only as a method of classifying patients, and is different from a method of diagnosing patients performed by a doctor.
  • the above classification method can be applied to diagnosis of systemic inflammatory response syndrome patients, and doctors can make a diagnosis based on the results obtained from the classification method. Therefore, the above classification method can be said to be an auxiliary method for diagnosing systemic inflammatory response syndrome patients.
  • the above classification method can also be rephrased as a data acquisition method for diagnosing systemic inflammatory response syndrome patients, including the step of detecting GDF15 protein in a sample collected from a subject. Detection of the protein can be performed in vitro.
  • the GDF15 protein is associated with the prognosis of systemic inflammatory response syndrome patients, including COVID-19 patients, as shown in Examples.
  • the 28-day mortality rate can be predicted with high sensitivity based on the protein.
  • systemic inflammatory response syndrome patients are classified into four phenotypes. I was able to That is, the GDF15 protein reflects not only COVID-19 but also the molecular pathology of the systemic inflammatory response syndrome, and can be used for predicting prognosis, predicting severity, and selecting the optimal therapeutic method and administration strategy.
  • Systemic inflammatory response syndromes include coronavirus infections (eg, COVID-19), burns, sepsis, trauma, post-resuscitation, post-cardiac arrest syndrome, stroke, acute pancreatitis, and heat stroke.
  • Samples for detecting proteins, subjects, comorbidities that subjects may have, sample collection timings, protein detection methods, and classification methods may include steps described in [1. Classification method] can be used.
  • the subject may be a patient diagnosed as requiring hospitalization or a patient diagnosed as not requiring hospitalization.
  • the subject may be a critically ill patient or a non-critically ill patient.
  • the above classification method may include a step of comparing the expression level measured in systemic inflammatory response syndrome patients with a preset reference value.
  • the reference value may be set based on expression levels measured in healthy subjects not suffering from systemic inflammatory response syndrome, expression levels measured in non-severe patients suffering from systemic inflammatory response syndrome It may be set based on the level.
  • the reference value may be a cut-off value obtained from an ROC curve as in Examples described later.
  • the above classification method may include a step of classifying systemic inflammatory response syndrome patients into severe patients and non-severe patients.
  • the classification method may also include classifying systemic inflammatory response syndrome patients, such as severe and/or non-severe patients, into multiple phenotypes. These classifications can be performed based on the presence or absence of the above-mentioned proteins, the expression level, and the amount of change in the expression level over time.
  • the above classification method includes the step of classifying systemic inflammatory response syndrome patients based on the expression level of GDF15 protein obtained on the first day of hospitalization and the amount of change in the expression level of GDF15 protein thereafter. good too.
  • the amount of change in the expression level of the GDF15 protein may be obtained from the expression level of the GDF15 protein obtained multiple times up to the 3rd day, the 5th day, the 8th day, or the 10th day of hospitalization.
  • the number of phenotypes may be 2-10, 2-6, or 2-4.
  • systemic inflammatory response syndrome patients may be classified into four phenotypes (class 1, class 2, class 3, class 4) shown in the examples.
  • the four phenotypes are, for example, class 1 has an expression level on the first day of hospitalization lower than the cutoff value and the amount of change is less than 0, class 2 has an expression level on the first day of hospitalization higher than the cutoff value, The amount of change is less than 0.
  • Class 3 is the expression level on the first day of hospitalization that is lower than the cutoff value, and the amount of change is 0 or more.
  • Class 4 is the expression level on the first day of hospitalization that is higher than the cutoff value.
  • patients with systemic inflammatory response syndrome are classified into a group with a low risk of aggravation and current treatment is effective (e.g., Class 1), a group with a high aggravation risk but with current treatment that is effective (e.g., class 2), a group with a low risk of severe disease but current treatment is not effective (e.g. class 3), and a group with a high risk of severe disease and current treatment is not effective (e.g. class 4).
  • An embodiment of the present invention also includes a kit for classifying systemic inflammatory response syndrome patients comprising an article for detecting GDF15 protein. Items that can be included in the kit are described in [2. kit]. Also included in one embodiment of the invention is the use of biomarkers comprising GDF15 protein for the classification of systemic inflammatory response syndrome patients.
  • Proteins that can be used as biomarkers that reflect molecular pathology were selected through evaluation in the first analysis group, the second analysis group, and the verification group.
  • Acuity max The severity of each COVID-19 patient was classified based on the maximum Acuity score (Acuity max).
  • Acuity score is based on the World Health Organization's ordinal outcomes scale (COVID-19 Therapeutic Trial Synopsis. See "https://www.who.int/publications-detail-redirect/covid-19-therapeutic-trial-synopsis").
  • A1 death
  • A2 ventilator management
  • A3 hospitalization with oxygen administration
  • A4 hospitalization without oxygen administration
  • A5 no hospitalization. It can be said that the Acuity score increases in the order of A1>A2>A3>A4>A5.
  • Patients with an observed Acuity max of A1 or A2 were defined as 'severe' and those with A3-A5 as 'non-severe'.
  • phase 1 hyperacute phase (days 1 to 2 of hospitalization)
  • phase 2 acute phase (days 3 to 5 of hospitalization)
  • phase 3 subacute phase. (Days 6 to 10 of hospitalization).
  • Heart disease includes coronary artery disease, congestive heart failure, and valvular disease.
  • Pulmonary diseases include asthma, COPD, conditions requiring oxygen at home, and other chronic pulmonary ailments.
  • Kidney disease includes chronic kidney disease, a condition with baseline creatinine >1.5.
  • Immunocompromised states include active cancer, chemotherapy, transplantation, immunosuppressive drugs, and no spleen.
  • Fig. 1 is a volcano plot showing proteins whose expression was different between the severe group and the non-severe group in the first analysis population. Proteins that showed statistically significant changes in expression are shown in darker colors in the volcano plots for each phase. Proteins that reached significance from Phase 1 to Phase 3 were extracted as candidate proteins in the first analysis population. As a result, 24 kinds of proteins (GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, KRT19 protein, AGR2 protein, AREG protein, CA3 protein, CALCA protein, CCL7 protein, FGF23 protein, GPR37 protein were found as candidate proteins in the first analysis population.
  • proteins GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, KRT19 protein, AGR2 protein, AREG protein, CA3 protein, CALCA protein, CCL7 protein, FGF23 protein, GPR37 protein were found as candidate proteins in the first analysis population.
  • HSPB6 protein IL1RL1 protein, IL6 protein, LTBP2 protein, MB protein, MMP8 protein, NOS1 protein, PLA2G2A protein, STC1 protein, TMSB10 protein, TNFRSF10B protein, TNNI3 protein, VSIG4 protein
  • HSPB6 protein IL1RL1 protein, IL6 protein, LTBP2 protein, MB protein, MMP8 protein, NOS1 protein, PLA2G2A protein, STC1 protein, TMSB10 protein, TNFRSF10B protein, TNNI3 protein, VSIG4 protein
  • Patients with IMV treatment for 12 days or less were defined as the early ventilator withdrawal group (early recovery group), and patients with more than 12 days were defined as the delayed ventilator withdrawal group (delayed recovery group).
  • the second analysis group was classified into an early recovery group or no ventilator management group and a delayed recovery group or death group and analyzed.
  • the second analysis population includes 53 COVID-19 patients and 20 healthy controls. Of the COVID-19 patients, 49 were severely ill and 4 were treated in the ICU without intubation. The numbers of blood samples for Phases 1 and 3 were 53 and 34, respectively. Twenty-one patients were classified into the early recovery group and 28 into the delayed recovery or death group. Details of the characteristics of COVID-19 patients in the second analysis population are shown in Table 2 below. The definitions of numerical values and terms in Table 2 are the same as in Table 1.
  • Expression levels of the 24 candidate proteins in the first analysis population were assessed daily between early recovery and delayed recovery or death groups in the second analysis population.
  • proteins whose expression levels were significantly elevated in the delayed recovery group or the death group compared to the early recovery group were extracted as candidate proteins in the second analysis population.
  • FIG. 2 is a boxplot showing the results of evaluating 24 candidate proteins in the first analysis population in the second analysis population.
  • the y-axis of FIG. 2 represents NPX.
  • the boxes in FIG. 2 represent the median, 1st quartile and 3rd quartile. Whiskers represent the 5th to 95th percentiles. Differences between the two groups were assessed by the Wilcoxon rank sum test (*p ⁇ 0.05; **p ⁇ 0.01).
  • the expression levels of GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, KRT19 protein and TNFRSF10B protein in the delayed recovery or death group were significantly higher in both phases 1 and 3 compared to the early recovery group.
  • FIG. 3 is a boxplot showing the results of evaluating the expression levels of 24 candidate proteins in the first analysis population between healthy controls and COVID-19 patients in the second analysis population.
  • the y-axis of FIG. 3 represents NPX.
  • the boxes in FIG. 3 represent the median, first quartile and third quartile. Whiskers represent the 5th to 95th percentiles. Differences between the two groups were assessed by Dunnett's test (*p ⁇ 0.05; **p ⁇ 0.01). Expression levels of 19 out of 24 candidate proteins (including GDF15 protein, WFDC2 protein, CHI3L1 protein, KRT19 protein and TNFRSF10B protein) in the first analysis population were higher than in the control group at all measurement points. rice field.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the 24 candidate proteins in the first analysis population and the time to IMV withdrawal in the second analysis population.
  • the day of IMV weaning was defined as the day the patient was extubated without a tracheostomy or the day the patient was off the ventilator with a tracheostomy.
  • Expression levels of 24 candidate proteins were analyzed as time-dependent covariates.
  • NPX was converted to Z-scores so that the strength of association could be compared among the 24 candidate proteins.
  • the data in FIG. 4 show hazard ratios (HR) with 95% confidence intervals (CI).
  • Fourteen of the 24 candidate proteins in the first analysis population including GDF15, WFDC2, CHI3L1, KRT19 and TNFRSF10B proteins) showed significant association with the timing of IMV withdrawal.
  • Protein co-expression network analysis was performed with the R package 'WGCNA' using data from patients with Acuity scores 1 and 2 on hospital day 1 of the second analysis population (Langfelder, P. & Horvath, S. BMC Bioinformatics 9, 559 (2008)).
  • a signed network was created by computing the component-wise minimum for the topology overlap (TO). Proteins were hierarchically clustered using 1-TO as the distance criterion to generate cluster dendrograms. Protein modules with similar co-expression relationships were determined using a dynamic tree-cutting algorithm (see Langfelder, P. et al. Bioinformatics 24, 719-720 (2008)).
  • a module-specific protein was defined as the first principal component of the module.
  • the principal component of k is the weighted summary of protein expression in the module and represents the maximum variability of all proteins in the module.
  • Module membership quantifies how close a protein is to a given module and can be measured by calculating the correlation between individual proteins and module membership. Relationships between modules and clinical features were determined by calculating biweight intermediate correlations and corresponding p-values between each module's eigenprotein and clinical features using the WGCNA package. .
  • the module network was illustrated using Cytoscape® software (www.cytoscape.org) version 3.8.0 (see Shannon, P. et al. Genome research 13, 2498-2504 (2003)). The biological function of each module protein was investigated by performing GO pathway analysis (see Frohlich, H. et al. BMC Bioinformatics 8, 166 (2007)).
  • FIG. 5 is a heatmap of the dendrogram and clinical features of critically ill patients in Phase 1 of the second analysis population. All samples from patients with Acuity scores 1 and 2 in Phase 1 of the second analysis population were included in the cluster.
  • FIG. 7 is a heatmap plot, dendrogram and module showing the results of protein co-expression network analysis of critically ill patients in phase 1 of the second analysis population.
  • the heatmap represents topological overlap, with lighter colored areas having less overlap and darker colored areas having greater overlap.
  • FIG. 8 is a diagram of an excerpt of the dendrogram and modules of FIG.
  • the dendrogram represents a hierarchical clustering tree of all proteins based on topological overlap.
  • a module corresponds to a branch of the tree. Branches and modules are color-coded. In this specification and drawings, modules are distinguished by color names for convenience. "Gray" represents proteins that have strayed from the appropriate module.
  • FIG. 9 is a heat map showing the correlation between the modules in FIG. 7 and clinical features. Correlations and p-values are listed for each cell in the heatmap.
  • MEyellow corresponds to yellow modules, MEgreen to green modules, MEred to red modules, MEturquoise to turquoise modules, MEblue to blue modules, MEblown to brown modules, MEgrey to gray modules. Blue-green modules had the highest positive correlation with recovery delay. This module was selected as a clinically important module for further analysis.
  • FIG. 10 is a network diagram reconstructing and visualizing co-expression modules of 24 candidate proteins in the first analysis population using Cytoscape. Nodes represent proteins, and edges (lines) represent connections between nodes. The edge width and color correspond to the node connection weight. Nodes enclosed in bold are candidate proteins in the second analysis population.
  • WGCNA Weighted Gene Expression Network Analysis
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of gene ontology (GO) enrichment analysis of proteins that showed different expression in blue-green modules and blue modules in FIG.
  • GO gene ontology
  • FIG. 11 the top 10 significant GO terms are shown with FDR-corrected p-values calculated by the Benjamin-Hochberg method. Blue-green modules were highly associated with cell adhesion and biological adhesion, and blue modules were mainly associated with immune system processes. This analysis revealed that the five candidate proteins in the second analysis population are related to each other and have cell adhesion functions.
  • Protein expression levels were measured by ELISA.
  • ELISA assay kits from R&D Systems (Minneapolis, Minn., USA) were used to measure the expression levels of WFDC2 protein, GDF15 protein and CHI3L1 protein.
  • the expression levels of KRT19 protein and TNFRSF10B protein were measured using ELISA assay kits from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Frozen plasma samples were thawed and measured according to protocol. Absorbance was analyzed using a microplate reader (SH-9000Lab; Corona Denki, Japan).
  • the minimum detectable levels were ⁇ 78.1 pg/mL for WFDC2 protein, ⁇ 7.8 pg/mL for GDF15 protein, ⁇ 31.3 pg/mL for CHI3L1 protein, ⁇ 61 pg/mL for KRT19 protein and ⁇ 2 for TNFRSF10B protein. 0.46 pg/mL. Data for C-reactive protein (CRP) and D-dimer were also measured.
  • Phase 1 and Phase 3 proteins whose expression levels were significantly elevated in the delayed recovery group or the death group compared to the early recovery group (p ⁇ 0.05) were extracted as major proteins. For major proteins, 28-day mortality and in-hospital mortality were also evaluated. Major protein levels in Phase 1 and Phase 3 were compared between survivors and non-survivors, or between survivors and non-survivors in the hospital after 28 days.
  • FIG. 12 is a boxplot showing the results of evaluating the difference in expression levels of five candidate proteins in the second analysis population between controls and COVID-19 patients in the validation population.
  • the y-axis of FIG. 12 represents candidate protein expression levels transformed to common logarithms to normalize the distribution of the data.
  • the boxes in FIG. 12 represent the median, first quartile and third quartile. Whiskers represent the 5th to 95th percentiles. Differences between the two groups were assessed by Dunnett's test (*p ⁇ 0.05; **p ⁇ 0.01). In both phases 1 and 3, the expression levels of WFDC2 protein, GDF15 protein, CHI3L1 protein, and KRT19 protein were significantly higher in COVID-19 patients than in controls.
  • FIG. 13 is a boxplot showing the results of evaluating the difference in expression levels of five candidate proteins in the second analysis population between the early recovery group and the delayed recovery or death group in the validation population.
  • the y-axis of Figure 13 represents the expression levels of candidate proteins transformed to common logarithms to normalize the distribution of the data.
  • the boxes in FIG. 13 represent the median, first quartile and third quartile. Whiskers represent the 5th to 95th percentiles. Differences between the two groups were assessed by the Wilcoxon rank sum test (*p ⁇ 0.05; **p ⁇ 0.01). In both phases 1 and 3, the expression levels of WFDC2 protein, GDF15 protein, CHI3L1 protein and KRT19 protein were significantly higher in the delayed recovery or death group compared to the early recovery group.
  • Figure 14 shows the expression levels of WFDC2, GDF15, CHI3L1, KRT19 proteins between survivors and non-survivors and in-hospital survivors and non-survivors after 28 days in the validation population. is a boxplot showing the results of evaluating the difference in .
  • the y-axis of Figure 14 represents the expression levels of the candidate proteins transformed to common logarithms to normalize the distribution of the data.
  • the boxes in FIG. 14 represent the median, first quartile and third quartile. Whiskers represent the 5th to 95th percentiles. Differences between the two groups were assessed by the Wilcoxon rank sum test (*p ⁇ 0.05; **p ⁇ 0.01).
  • WFDC2 protein, GDF15 protein, CHI3L1 protein and KRT19 protein are the four major proteins associated with COVID-19 severity.
  • ROC analysis A Receiver Operating Characteristic (ROC) analysis was performed on the day 1 expression levels of the four major proteins in the validation population to predict 28-day mortality. From the points on the ROC curve, the distance to the upper left corner was calculated and the point with the smallest distance was chosen as the cutoff point (see Cho, S. et al. BMC Anesthesiology 21, 29 (2021)). When the ROC curve is drawn in the first quadrant where x ⁇ 0 and y ⁇ 0, the side on which the x-axis exists is the lower side, and the side on which the y-axis exists is the left side. We then defined the composite score as follows: Patients were divided into two groups based on cut-off points for each major protein.
  • FIG. 15 is a diagram representing the ROC curve obtained using the expression levels of the four major proteins on the first day of hospitalization in the validation population.
  • the numbers attached to the ROC curves represent the “optimal cutoff point (sensitivity, specificity)”. All of the major proteins had AUCs above 0.5, indicating a certain degree of precision. Among them, the maximum AUC value was 0.75 for WFDC2 protein.
  • FIG. 16 depicts the ROC curves obtained using the composite score, CRP and D-dimer, respectively.
  • the AUC of the composite score was 0.852 (95% CI (confidence interval): 0.777-0.926) with high sensitivity, which was higher than that of CRP or D-dimer.
  • FIG. 17 is a diagram showing the percentage of survivors and non-survivors after 28 days and the percentages of the early recovery group, delayed recovery group, and in-hospital death group included in each composite score. The slope is proportional to the number of patients within the category. Asterisks indicate a statistically significant difference between the clinical outcome and the composite score in the ⁇ 2 test. Figure 17 shows that 28-day mortality and clinical outcome are statistically associated with the composite score.
  • a latent class analysis was performed to derive new clinical phenotypes using key protein combinations.
  • the optimal number of phenotypes was identified by evaluating the Bayesian Information Criterion (BIC), the appropriate size of each phenotype, and the misclassification rate of each phenotype (NAGIN, D. S. Group-Based Modeling of Development. Harvard University Press, 2005); Nylund, K. L. et al. Structural Equation Modeling: A Multidisciplinary Journal 14, 535-569 (2007)).
  • BIC Bayesian Information Criterion
  • the optimal number of phenotypes was selected based on maximum BIC, considering misclassification rate and interpretability.
  • FIG. 18 is a diagram showing BIC scores for various numbers of classes. BIC scores were highest in models with 4 classes and then decreased proportionally with additional classes. That is, it was suggested that the added classes do not add significant information to the model.
  • FIG. 19 is a visualization of four phenotypes using t-distributed stochastic neighborhood embedding (t-SNE).
  • FIG. 20 is a heatmap showing the relationship between the four major proteins and the four phenotypes. Cytokine levels were transformed to Z-scale. White indicates low cytokine levels and darker areas indicate high cytokine levels. The delta-phenotype showed high cytokine levels in four major proteins.
  • FIG. 21 depicts Kaplan-Meier curves for survival after 28 days, stratifying phenotypes obtained from latent class analysis. A log-rank test showed significant differences between the four phenotypes (p ⁇ 0.0001).
  • COVID-19 patient was admitted to Osaka University Hospital or Osaka Prefectural Nakagochi Emergency and Critical Care Center from July 2020 to February 2021 and April 2021. All patients were diagnosed with COVID-19 by SARS-CoV-2 RT-PCR and chest CT examination. Patients who were directly hospitalized for acute respiratory failure or were transferred from other hospitals as indicated by a clinician for ventilator treatment were included.
  • the ELISA method (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) was used to measure the blood concentration of GDF15. Frozen plasma samples were thawed and subsequent measurement steps were performed according to the manufacturer's protocol. Absorbance was analyzed using a microplate reader (SH-9000Lab; Corona Denki, Japan). The lowest detectable value was 7.8 pg/mL for GDF15. Laboratory data of patient blood samples were measured in the central laboratory of each hospital.
  • ROC analysis of GDF15 and other biomarkers A ROC analysis was performed using admission GDF15 values in 54 burn patients, 176 COVID-19 patients, and 32 sepsis patients. Table 6 below shows the relationships between the diseases of the ROC analysis target patients and the clinical data. In Table 6, p-values were obtained by Kruskal-Wallis rank sum test or Pearson's ⁇ 2 test.
  • One aspect of the present invention can be used to classify COVID-19 patients.
  • Another aspect of the present invention can be used to classify patients with systemic inflammatory response syndrome.

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Abstract

コロナウイルス感染症患者等を分類するために利用できる、分類方法、キットおよびバイオマーカー等を提供する。本発明の一実施形態に係るコロナウイルス感染症患者の分類方法は、被験体から採取された試料においてＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出する工程を含む。別の実施形態に係る全身性炎症反応症候群患者の分類方法は、被験体から採取された試料においてＧＤＦ１５タンパク質を検出する工程を含む。

Description

患者の分類方法、キットおよびバイオマーカーの使用
　本発明は、患者の分類方法、キットおよびバイオマーカーの使用に関する。
　コロナウイルス感染症の一種であるＣＯＶＩＤ－１９は世界に拡大し、２０２０年１月３０日に世界保健機関（ＷＨＯ）によりパンデミックと宣言された。日本では２０２０年１月に患者が報告されてから患者数は急増している。
　ＣＯＶＩＤ－１９はウイルス性敗血症と考えられており、患者の炎症が過剰になると全身性炎症症候群から多臓器障害をきたす。ＣＯＶＩＤ－１９の治療として、ビピラビルなどの抗ウイルス薬とともに、過剰な炎症を抑える抗炎症治療薬を併用することが有効と考えられている。
　ところで、非特許文献１に示されるように、ＣＯＶＩＤ－１９のバイオマーカーとして、血清フェリチン、プロカルシトニン、ＩＬ－６等が利用できることが報告されている。
Velavan TP, Meyer CG. Mild versus severe COVID-19: Laboratory markers. Int J Infect Dis. 2020;95:304-307
　ＣＯＶＩＤ－１９に対して様々な抗炎症治療薬の使用を含めた臨床試験が行われてきたが、確立した治療法に至っていない。問題点として、抗炎症治療薬の有効活用、ＣＯＶＩＤ－１９の重症度および予後の予測等に応用できるような、ＣＯＶＩＤ－１９患者を分類するための適切なバイオマーカーが確立されていないことが挙げられる。上述の非特許文献１に挙げられたようなバイオマーカーのみの利用では、ＣＯＶＩＤ－１９等のコロナウイルス感染症の患者を適切に分類するためには不十分であった。また、上記バイオマーカーのみの利用では、コロナウイルス感染症患者を含む全身性炎症反応症候群患者を適切に分類するためにも不十分であった。
　本発明の一態様は、コロナウイルス感染症患者を分類するために利用できる、分類方法、キットおよびバイオマーカー等を実現することを目的とする。また、本発明の別の目的は、全身性炎症反応症候群患者を分類するために利用できる、分類方法、キットおよびバイオマーカー等を実現することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、４種の特定のタンパク質が分子病態を反映しており、高精度のバイオマーカーとして利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の一態様は、以下の構成を含む。
＜１＞被験体から採取された試料においてＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出する工程を含む、コロナウイルス感染症患者の分類方法。
＜２＞被験体から採取された試料においてＡＧＲ２タンパク質、ＡＲＥＧタンパク質、ＣＡ３タンパク質、ＣＡＬＣＡタンパク質、ＣＣＬ７タンパク質、ＦＧＦ２３タンパク質、ＧＰＲ３７タンパク質、ＨＳＰＢ６タンパク質、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質、ＩＬ６タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＢタンパク質、ＭＭＰ８タンパク質、ＮＯＳ１タンパク質、ＰＬＡ２Ｇ２Ａタンパク質、ＳＴＣ１タンパク質、ＴＭＳＢ１０タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質、ＴＮＮＩ３タンパク質、ＶＳＩＧ４タンパク質からなる群より選択される１種以上をさらに検出する工程を含む、＜１＞に記載の分類方法。
＜３＞ＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出するための物品を備える、キット。
＜４＞ＡＧＲ２タンパク質、ＡＲＥＧタンパク質、ＣＡ３タンパク質、ＣＡＬＣＡタンパク質、ＣＣＬ７タンパク質、ＦＧＦ２３タンパク質、ＧＰＲ３７タンパク質、ＨＳＰＢ６タンパク質、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質、ＩＬ６タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＢタンパク質、ＭＭＰ８タンパク質、ＮＯＳ１タンパク質、ＰＬＡ２Ｇ２Ａタンパク質、ＳＴＣ１タンパク質、ＴＭＳＢ１０タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質、ＴＮＮＩ３タンパク質、ＶＳＩＧ４タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出するための物品をさらに備える、＜３＞に記載のキット。
＜５＞ＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質からなる群より選択される１種以上を含むバイオマーカーの、コロナウイルス感染症患者の分類のための使用。
＜６＞ＡＧＲ２タンパク質、ＡＲＥＧタンパク質、ＣＡ３タンパク質、ＣＡＬＣＡタンパク質、ＣＣＬ７タンパク質、ＦＧＦ２３タンパク質、ＧＰＲ３７タンパク質、ＨＳＰＢ６タンパク質、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質、ＩＬ６タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＢタンパク質、ＭＭＰ８タンパク質、ＮＯＳ１タンパク質、ＰＬＡ２Ｇ２Ａタンパク質、ＳＴＣ１タンパク質、ＴＭＳＢ１０タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質、ＴＮＮＩ３タンパク質、ＶＳＩＧ４タンパク質からなる群より選択される１種以上を含むバイオマーカーを併用する、＜５＞に記載の使用。
＜７＞被験体から採取された試料においてＧＤＦ１５タンパク質を検出する工程を含む、全身性炎症反応症候群患者の分類方法。
＜８＞ＧＤＦ１５タンパク質を検出するための物品を備える、全身性炎症反応症候群患者の分類のためのキット。
＜９＞ＧＤＦ１５タンパク質を含むバイオマーカーの、全身性炎症反応症候群患者の分類のための使用。
　本発明の一態様によれば、コロナウイルス感染症患者を分類するために利用できる、分類方法、キットおよびバイオマーカー等を提供することができる。本発明の別の一態様によれば、全身性炎症反応症候群患者を分類するために利用できる、分類方法、キットおよびバイオマーカー等を提供することができる。
第１解析集団において、重症群と非重症群との間で発現に差が見られたタンパク質を表すｖｏｌｃａｎｏプロットである。 第１解析集団における２４種の候補タンパク質を、第２解析集団において評価した結果を示すボックスプロットである。 第１解析集団における２４種の候補タンパク質の発現レベルを第２解析集団における健康な対照群とＣＯＶＩＤ－１９患者との間で評価した結果を示すボックスプロットである。 第１解析集団における２４種の候補タンパク質と第２解析集団におけるＩＭＶ離脱までの時間との関係を表す図である。 第２解析集団のフェイズ１における重症患者のデンドログラムおよび臨床的特徴のヒートマップである。 Ｒによって出力されたScale independenceおよびMean connectivityのグラフである。 第２解析集団のフェイズ１における重症患者のタンパク質共発現ネットワーク解析の結果を示す、ヒートマッププロット、デンドログラムおよびモジュールである。 図７のデンドログラムおよびモジュールを抜粋した図である。 図７のモジュールと臨床的特徴との相関を示すヒートマップである。 第１解析集団における２４種の候補タンパク質の共発現モジュールを、Cytoscapeを使用して再構築し、可視化したネットワーク図である。 図７の青緑色のモジュールおよび青色のモジュールで異なる発現を示したタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析の結果を表す図である。 検証集団における対照群とＣＯＶＩＤ－１９患者との間の、第２解析集団における５種の候補タンパク質の発現レベルの差を評価した結果を示すボックスプロットである。 検証集団における早期回復群と、回復遅延群または死亡群との間の、第２解析集団における５種の候補タンパク質の発現レベルの差を評価した結果を示すボックスプロットである。 検証集団における２８日後の生存者と非生存者との間、および、病院内の生存者と非生存者との間の、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＧＤＦ１５タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質の発現レベルの差を評価した結果を示すボックスプロットである。 検証集団における４種の主要タンパク質の入院１日目の発現レベルを用いて得られたＲＯＣ曲線を表す図である。 複合スコア、ＣＲＰおよびＤ－ダイマーのそれぞれを使用して得られたＲＯＣ曲線を表す図である。 各複合スコアに含まれる２８日後の生存者と非生存者との割合および早期回復群と回復遅延群および院内死亡群との割合を示す図である。 種々のクラス数に対するＢＩＣスコアを示す図である。 ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ）を用いて４つのフェノタイプを可視化した図である。 ４種の主要タンパク質と４つのフェノタイプとの関係性を表したヒートマップである。 潜在クラス分析から得られたフェノタイプを階層化した、２８日後の生存率についてのKaplan-Meier曲線を表す図である。 ＧＤＦ１５の入院１日目の発現レベルを用いて得られたＲＯＣ曲線を表す図である。 ＧＤＦ１５の推定初期値および変化量に基づく全身性炎症反応症候群患者の分類結果を示す図である。 ＧＤＦ１５に基づいて分類した４つのクラスに関するKaplan-Meier曲線を表す図である。 ＣＲＰの推定初期値および変化量に基づく全身性炎症反応症候群患者の分類結果を示す図である。 ＣＲＰに基づいて分類した４つのクラスに関するKaplan-Meier曲線を表す図である。
　本発明の一実施形態について、以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。また、本明細書において「ＸＸＸタンパク質」は「ＸＸＸ遺伝子」によってコードされるタンパク質を意味し、図面等においては単に「ＸＸＸ」と記号のみで表すこともある。
　［第１の実施形態］
　〔１．患者の分類方法〕
　本発明の一実施形態に係るコロナウイルス感染症患者の分類方法は、被験体から採取された試料においてＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出する工程を含む。本明細書において、コロナウイルス感染症患者の分類方法は、あくまで患者の分類方法のみを意図し、医師が行う患者の診断方法とは異なる。上記分類方法をコロナウイルス感染症患者の診断に適用することは可能であり、当該分類方法から得られた結果をもとに、医師が診断を行うことができる。このため、上記分類方法はコロナウイルス感染症患者の診断のための補助的方法であるともいえる。また、上記分類方法は、被験体から採取された試料においてＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出する工程を含む、コロナウイルス感染症患者の診断のためのデータの取得方法であると換言することもできる。上記タンパク質の検出は、インビトロで行われ得る。
　上述のように、これまでＣＯＶＩＤ－１９等のコロナウイルス感染症の患者を分類するための適切なバイオマーカーが確立されていなかった。本発明者らは、実施例に示すようにＣＯＶＩＤ－１９重症患者における１４６３種のタンパク質を評価し、４種のタンパク質（ＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質およびＫＲＴ１９タンパク質）がＣＯＶＩＤ－１９の予後と関連することを見出した。また、これらのタンパク質に基づく複合スコアによって高い感度にて２８日死亡率（２８日後の死亡率）を予測できること、上記複合スコアは臨床転帰と関連していることが分かった。さらに、これらのタンパク質に基づくフェノタイプは、２８日死亡率と関連していた。すなわち、これらの４種のタンパク質は、分子病態を反映しており、既存のバイオマーカーに比べて高精度のバイオマーカーとして利用することができる。これにより、ＣＯＶＩＤ－１９等のコロナウイルス感染症の患者を分類することができ、予後の予測、重症化の予測、最適な治療法および投薬方針の選択などにも利用できる。なお、これらの４種のタンパク質は、実施例に示すように、国および人種の異なる２つのコホート（第１解析集団、第２解析集団）で共通して有意に発現レベルが上昇していたため、汎用性が高いと考えられる。
　タンパク質を検出するための試料としては、被験体から採取された血液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、唾液、髄液、尿、便等が挙げられ、中でも血液が好ましい。上記血液は、全血であってもよく、血漿または血清であってもよいが、好ましくは血漿である。ＩＣＵにおけるＣＯＶＩＤ－１９重症患者の治療において、通常、採血は連日行われる。そのため、血液の入手は容易であり、タンパク質の測定も容易である。また、上記分類方法は、タンパク質をバイオマーカーとして利用する。タンパク質は安定性が高く、測定値の再現性も高い。タンパク質は、評価プロセスが簡単であり、評価時間が迅速である。このようなタンパク質に基づくバイオマーカーは、ＩＣＵでも使用することができ、臨床的に有用である。これらのことから、上記４種のタンパク質は、バイオマーカーとして今後、ＣＯＶＩＤ－１９重症患者の治療指標および至適治療薬の選択に臨床応用することが可能であると考えられる。
　上記被験体は、ヒトであってもよく、非ヒトである哺乳動物であってもよい。また、被験体は、コロナウイルス感染症患者であり得る。コロナウイルス感染症は、コロナウイルスによって引き起こされる感染症である。コロナウイルス感染症患者は、コロナウイルスを検出するためのＰＣＲ検査によって陽性と判定された患者であり得る。また、コロナウイルス感染症患者は、ＣＴスキャン等によって肺炎と診断された患者であり得る。コロナウイルス感染症患者は、入院が必要であると診断された患者であってもよく、入院が不要であると診断された患者であってもよい。コロナウイルス感染症患者は、酸素投与が必要と診断された患者であってもよく、酸素投与が不要と診断された患者であってもよい。コロナウイルス感染症患者は、コロナウイルス感染症重症患者であってもよく、コロナウイルス感染症非重症患者であってもよい。コロナウイルス感染症重症患者は、人工呼吸器による管理が必要であると診断された患者であり得る。コロナウイルス感染症非重症患者は、人工呼吸器による管理が不要であると診断された患者であり得る。また、コロナウイルス感染症患者は、ＣＯＶＩＤ－１９患者であり得る。ＣＯＶＩＤ－１９は、コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる感染症である。
　コロナウイルス感染症患者は、併存疾患を有していてもよい。併存疾患としては特に限定されないが、心臓疾患、肺疾患、腎臓疾患、免疫無防備状態、高血圧、糖尿病等が挙げられる。心臓疾患としては、冠動脈疾患、うっ血性心不全、弁膜症が挙げられる。肺疾患としては、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、自宅での酸素吸入が必要な状態、その他の慢性の肺の病気が挙げられる。腎臓疾患としては、慢性腎臓病、ベースラインクレアチニン＞１．５の状態が挙げられる。免疫無防備状態としては、活性のがん、化学療法を受けている状態、移植を受けた状態、免疫抑制剤を投与されている状態、脾臓がない状態が挙げられる。
　試料は、いずれのタイミングで採取されてもよく、複数回採取されてもよい。例えば試料は、入院１～１０日目に採取された試料であり得る。試料は、入院１～２日目、入院３～５日目および／または入院６～１０日目に採取された試料であってもよい。例えば、入院１～２日目に採取された試料を用いれば、重症化し得る患者を初期の段階で分類できる可能性がある。試料は、採取からタンパク質の検出に用いられるまでの間、冷凍保存されてもよい。
　ＧＤＦ１５タンパク質（Growth/differentiation factor 15、成長分化因子１５、ＧＤＦ－１５とも表記される場合がある）は、形質転換成長因子（ＴＧＦ）－β分子スーパーファミリーのメンバーであり、マクロファージ、気道上皮細胞および血管内皮細胞において高いレベルで発現することが知られている（Bootcov, M. R. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 11514-11519 (1997); Verhamme, F. M. et al. Am J Respir Cell Mol Biol 60, 621-628 (2019)）。ＧＤＦ１５タンパク質は、心臓血管疾患、肺疾患、および敗血症における独立性の予後因子として報告されてきた（Myhre, P. L. et al. Circulation 142, 2128-2137 (2020); Husebo, G. R. et al. Eur Respir J 49, (2017); Buendgens, L. et al. Dis Markers 2017, 5271203 (2017)）。
　ＷＦＤＣ２タンパク質（WAP four-disulfide core domain protein 2、Human epididymis protein 4（ＨＥ４）としても知られる）である。ＷＦＤＣ２タンパク質は、卵巣癌、全身性強皮症に関連する間質性肺疾患および肺腺癌において高いレベルで発現することが知られている（Dochez, V. et al. Journal of Ovarian Research 12, 28 (2019); Zhang, M. et al. Therapeutic Advances in Chronic Disease 11, 2040622320956420 (2020); Bingle, L. et al. Respir Res 7, 61 (2006)）。ＷＦＤＣ２タンパク質は、上気道のいくつかの上皮細胞、粘膜細胞、および粘膜下腺の導管において発現し、口腔粘膜および鼻咽頭の先天性免疫に関与すると考えられている（Bingle, L. et al. Respir Res 7, 61 (2006)）。
　ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質（Chitinase-3-like protein 1、ＹＫＬ－４０としても知られる）は、グリコシドヒドロラーゼファミリー１８のメンバーであり、マクロファージ、好中球、滑膜細胞、平滑筋タンパク質、および腫瘍細胞、を含む多くの細胞によって合成され、分泌される（Zhao, T. et al. Sig Transduct Target Ther 5, 1-20 (2020)）。ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質は、癌の成長、炎症性サイトカインの産生、およびミクログリア活性を促進させることが報告されてきた（Yeo, I. J. et al. Pharmacology & Therapeutics 203, 107394 (2019)）。また、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質は、喘息、関節炎、敗血症、糖尿病、肝線維症、および冠動脈疾患などの疾患と強い関連性を有することが報告されてきた（Zhao, T. et al. Sig Transduct Target Ther 5, 1-20 (2020)）。
　ＫＲＴ１９タンパク質（Keratin, type I cytoskeletal 19）は、上皮組織および中皮組織において発現する最も重要なサイトケラチンの１つである。また、ＫＲＴ１９タンパク質の過剰発現が、肺癌および乳癌を含む３０以上の悪性腫瘍において報告されてきた（Hamesch, K. et al. BMC Medicine 18, 336 (2020)）。ＫＲＴ１９タンパク質のフラグメントであるＣｙｆｒａ２１－１タンパク質は、肺癌の中でも非小細胞肺癌（扁平上皮癌）のマーカーとして有用であると報告されてきた（Reinmuth, N. et al. Lung Cancer 36, 265-270 (2002)）。
　これらの４種のタンパク質をＣＯＶＩＤ－１９等のコロナウイルス感染症の患者の分類に利用できることはこれまで示唆されていなかった。従って、これらの４種のタンパク質をコロナウイルス感染症患者の分類に利用できることは驚くべきことである。実施例に示すように、４種のタンパク質は免疫応答よりも細胞接着経路に関連するクラスターに主に関与することが示唆された。このことは、ＣＯＶＩＤ－１９重症患者における細胞接着経路において、４種のタンパク質がそれぞれ相互作用することにより重要な役割を果たすことを示唆している。重症化し得る患者を特定することは、ＣＯＶＩＤ－１９患者を集中治療することにおいて特に重要である。高い感度で予測できるバイオマーカーを実現できれば、重症化し得る患者を臨床医が治療経過の初期の段階で特定することが可能になると考えられる。これにより、治療方針の決定および資源（特にＩＣＵのベッド）の消費をより賢明に行うことが可能になると考えられる。
　上記の４種のタンパク質のうちの複数種を複合してバイオマーカーとして利用すれば、コロナウイルス感染症患者の分類の精度をより高めることができる。従って、上記分類方法は、上記の４種のタンパク質のうちの２種以上、３種以上、または４種全てを検出する工程を備えていてもよい。
　上記分類方法は、被験体から採取された試料においてＡＧＲ２タンパク質、ＡＲＥＧタンパク質、ＣＡ３タンパク質、ＣＡＬＣＡタンパク質、ＣＣＬ７タンパク質、ＦＧＦ２３タンパク質、ＧＰＲ３７タンパク質、ＨＳＰＢ６タンパク質、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質、ＩＬ６タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＢタンパク質、ＭＭＰ８タンパク質、ＮＯＳ１タンパク質、ＰＬＡ２Ｇ２Ａタンパク質、ＳＴＣ１タンパク質、ＴＭＳＢ１０タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質、ＴＮＮＩ３タンパク質、ＶＳＩＧ４タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出する工程を含んでいてもよい。実施例に示すように、これらのタンパク質もＣＯＶＩＤ－１９の非重症患者に比べて重症患者において発現レベルが上昇する。従って、これらのタンパク質も上述の４種のタンパク質とともにバイオマーカーとして利用することができる。
　データベースUniprotKB（https://www.uniprot.org）におけるアクセッション番号は、ＧＤＦ１５タンパク質：Ｑ９９９８８、ＷＦＤＣ２タンパク質（ＨＥ４）：Ｑ１４５０８、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質：Ｐ３６２２２、ＫＲＴ１９タンパク質：Ｐ０８７２７、ＡＧＲ２タンパク質（Anterior gradient protein 2 homolog）：Ｏ９５９９４、ＡＲＥＧタンパク質（Amphiregulin）：Ｐ１５５１４、ＣＡ３タンパク質（Carbonic anhydrase 3）：Ｐ０７４５１、ＣＡＬＣＡタンパク質（Calcitonin gene-related peptide 1）：Ｐ０６８８１、ＣＣＬ７タンパク質（C-C motif chemokine 7）：Ｐ８００９８、ＦＧＦ２３タンパク質（Fibroblast growth factor 23）：Ｑ９ＧＺＶ９、ＧＰＲ３７タンパク質（Prosaposin receptor GPR37）：Ｏ１５３５４、ＨＳＰＢ６タンパク質（Heat shock protein beta-6）：Ｏ１４５５８、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質（Interleukin-1 receptor-like 1）：Ｑ０１６３８、ＩＬ６タンパク質（Interleukin-6）：Ｐ０５２３１、ＬＴＢＰ２タンパク質（Latent transforming growth factor beta binding protein 2）：Ｈ２ＮＬＳ６、ＭＢタンパク質（Myoglobin）：Ａ０Ａ０２４Ｒ１Ｇ３、ＭＭＰ８タンパク質（Neutrophil collagenase）：Ｅ９ＰＬ８７、ＮＯＳ１タンパク質：Ｃ９Ｊ５Ｐ６（Nitric oxide synthase）、ＰＬＡ２Ｇ２Ａタンパク質（Phospholipase A2）：Ａ０Ａ０２４ＲＡ９６、ＳＴＣ１タンパク質（Stanniocalcin-1）：Ｐ５２８２３、ＴＭＳＢ１０タンパク質（Thymosin beta-10）：Ｐ６３３１３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質（TNFRSF10B protein）：Ｑ６ＦＨ５８、ＴＮＮＩ３タンパク質（Troponin I, cardiac muscle）：Ｐ１９４２９、ＶＳＩＧ４タンパク質（V-set and immunoglobulin domain-containing protein 4）：Ｈ７Ｃ０６２である。
　タンパク質の検出方法は特に限定されず、免疫測定法であってもよく、質量分析法であってもよい。免疫測定法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ法、イムノクロマトグラフィー法、免疫沈降法、ビオチン－アビジン法、電気化学発光免疫測定法（ECLIA；Electro chemiluminescence immunoassay）、化学発光酵素免疫測定法（CLEIA;chemiluminecent enzyme immunoassay）等が挙げられる。
　上記分類方法は、タンパク質の有無を判定する工程を含んでいてもよく、タンパク質の発現レベルを定量する工程を含んでいてもよい。また、上記分類方法は、コロナウイルス感染症患者において測定された発現レベルを、予め設定された基準値と比較する工程を含んでいてもよい。当該基準値は、コロナウイルス感染症に罹患していない健康な被験体において測定された発現レベルに基づいて設定されてもよく、コロナウイルス感染症に罹患した非重症患者において測定された発現レベルに基づいて設定されてもよい。上記基準値は後述の実施例のようにＲＯＣ曲線から求められたカットオフ値であってもよい。
　上記分類方法は、コロナウイルス感染症患者をコロナウイルス感染症重症患者とコロナウイルス感染症非重症患者とに分類する工程を含んでいてもよい。また、上記分類方法は、コロナウイルス感染症重症患者またはコロナウイルス感染症非重症患者をさらなるフェノタイプに分類する工程を含んでいてもよい。これらの分類は、上述のタンパク質の有無または発現レベルに基づいて行われ得る。
　上記フェノタイプの数は、２～１０であってもよく、２～６であってもよく、２～４であってもよい。例えば、コロナウイルス感染症重症患者は、実施例に示す４つのフェノタイプ（α－フェノタイプ、β－フェノタイプ、γ－フェノタイプ、δ－フェノタイプ）に分類されてもよい。４つのフェノタイプは例えば、上記４種のタンパク質の発現レベルがα－フェノタイプ＜β－フェノタイプ＜γ－フェノタイプ＜δ－フェノタイプの順に高くなることにより特徴づけられてもよい。４つのフェノタイプは例えば、２８日後の生存率がα－フェノタイプ＞β－フェノタイプ＞γ－フェノタイプ＞δ－フェノタイプの順に低くなることにより特徴づけられてもよい。
　後述の実施例では、入院１日目における４種のタンパク質のデータを用いて、ＣＯＶＩＤ－１９重症患者を４つのフェノタイプ（α、β、γ、δ）に分けた。δ－フェノタイプおよびγ－フェノタイプは、残り２つのフェノタイプと比較して、より低い生存率を示した。これは、δ－フェノタイプおよびγ－フェノタイプが優先的に介入すべき治療標的になり得ることを示している。
　〔２．キット〕
　本発明の一実施形態に係るキットは、ＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出するための物品を備える。当該キットは、前述の分類方法に使用するためのキットであり得る。
　上記キットは、上記の４種のタンパク質のうちの２種以上、３種以上、または４種全てを検出するための物品を備えていてもよい。上記の４種のタンパク質のうちの複数種を複合してバイオマーカーとして利用すれば、コロナウイルス感染症患者の分類の精度をより高めることができる。
　上記キットは、ＡＧＲ２タンパク質、ＡＲＥＧタンパク質、ＣＡ３タンパク質、ＣＡＬＣＡタンパク質、ＣＣＬ７タンパク質、ＦＧＦ２３タンパク質、ＧＰＲ３７タンパク質、ＨＳＰＢ６タンパク質、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質、ＩＬ６タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＢタンパク質、ＭＭＰ８タンパク質、ＮＯＳ１タンパク質、ＰＬＡ２Ｇ２Ａタンパク質、ＳＴＣ１タンパク質、ＴＭＳＢ１０タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質、ＴＮＮＩ３タンパク質、ＶＳＩＧ４タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出するための物品をさらに備えていてもよい。
　タンパク質の検出方法は、上述した通りである。タンパク質を検出するための物品としては、特に限定されないが、例えば抗体が挙げられる。上記キットは、タンパク質の有無を判定するための物品を備えていてもよく、タンパク質の発現レベルを定量するための物品を備えていてもよい。
　また、上記キットは、キットの使用に必要となる薬剤、器具、容器、説明書などを備えていてもよい。上記キットは、例えば上述の検出方法を実施するために必要となる物品を備えていてもよい。
　本発明の一実施形態には、ＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質からなる群より選択される１種以上を含むバイオマーカーの、コロナウイルス感染症患者の分類のための使用も含まれる。また、この使用においては、ＡＧＲ２タンパク質、ＡＲＥＧタンパク質、ＣＡ３タンパク質、ＣＡＬＣＡタンパク質、ＣＣＬ７タンパク質、ＦＧＦ２３タンパク質、ＧＰＲ３７タンパク質、ＨＳＰＢ６タンパク質、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質、ＩＬ６タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＢタンパク質、ＭＭＰ８タンパク質、ＮＯＳ１タンパク質、ＰＬＡ２Ｇ２Ａタンパク質、ＳＴＣ１タンパク質、ＴＭＳＢ１０タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質、ＴＮＮＩ３タンパク質、ＶＳＩＧ４タンパク質からなる群より選択される１種以上を含むバイオマーカーを併用してもよい。
　なお本発明の一実施形態は、コロナウイルス感染症の治療薬の選択に応用することができる。すなわち、感染性疾患の治療薬の研究開発を支援することができる。これにより、持続可能な開発目標（ＳＤＧｓ）の目標３「すべての人に健康と福祉を」の達成に貢献できる。
　［第２の実施形態］
　本発明の一実施形態に係る全身性炎症反応症候群患者の分類方法は、被験体から採取された試料においてＧＤＦ１５タンパク質を検出する工程を含む。本明細書において、全身性炎症反応症候群患者の分類方法は、あくまで患者の分類方法のみを意図し、医師が行う患者の診断方法とは異なる。上記分類方法を全身性炎症反応症候群患者の診断に適用することは可能であり、当該分類方法から得られた結果をもとに、医師が診断を行うことができる。このため、上記分類方法は全身性炎症反応症候群患者の診断のための補助的方法であるともいえる。また、上記分類方法は、被験体から採取された試料においてＧＤＦ１５タンパク質を検出する工程を含む、全身性炎症反応症候群患者の診断のためのデータの取得方法であると換言することもできる。上記タンパク質の検出は、インビトロで行われ得る。
　本発明者らは、実施例に示すようにＧＤＦ１５タンパク質がＣＯＶＩＤ－１９患者を含む全身性炎症反応症候群患者の予後と関連することを見出した。また、当該タンパク質に基づき高い感度にて２８日死亡率を予測できることが分かった。さらに、当該タンパク質の発現レベルについてＲＯＣ解析から得られたカットオフ値と、経時データを用いた線形モデルから得られた変化量とに基づき、全身性炎症反応症候群患者を４つのフェノタイプに分類することができた。すなわち、ＧＤＦ１５タンパク質は、ＣＯＶＩＤ－１９に限らず全身性炎症反応症候群の分子病態も反映しており、予後の予測、重症化の予測、最適な治療法および投薬方針の選択などに利用できる。
　全身性炎症反応症候群としては、コロナウイルス感染症（例えばＣＯＶＩＤ－１９）、熱傷、敗血症、外傷、蘇生後、心停止後症候群、脳卒中、急性膵炎、熱中症等が挙げられる。タンパク質を検出するための試料、被験体、被験体が有し得る併存疾患、試料の採取タイミング、タンパク質の検出方法、分類方法が含み得る工程については、第１の実施形態の〔１．分類方法〕における説明を援用することができる。また、被験体は、入院が必要であると診断された患者であってもよく、入院が不要であると診断された患者であってもよい。被験体は重症患者であってもよく、非重症患者であってもよい。
　上記分類方法は、全身性炎症反応症候群患者において測定された発現レベルを、予め設定された基準値と比較する工程を含んでいてもよい。当該基準値は、全身性炎症反応症候群に罹患していない健康な被験体において測定された発現レベルに基づいて設定されてもよく、全身性炎症反応症候群に罹患した非重症患者において測定された発現レベルに基づいて設定されてもよい。上記基準値は後述の実施例のようにＲＯＣ曲線から求められたカットオフ値であってもよい。
　上記分類方法は、全身性炎症反応症候群患者を重症患者と非重症患者とに分類する工程を含んでいてもよい。また、上記分類方法は、全身性炎症反応症候群患者、例えば重症患者および／または非重症患者を複数のフェノタイプに分類する工程を含んでいてもよい。これらの分類は、上述のタンパク質の有無、発現レベル、発現レベルの経時的な変化量に基づいて行われ得る。例えば、上記分類方法は、入院１日目に取得されたＧＤＦ１５タンパク質の発現レベルと、その後のＧＤＦ１５タンパク質の発現レベルの変化量とに基づいて全身性炎症反応症候群患者を分類する工程を含んでいてもよい。ＧＤＦ１５タンパク質の発現レベルの変化量は、入院３日目まで、５日目まで、８日目まで、または１０日目までに複数回取得されたＧＤＦ１５タンパク質の発現レベルから求められてもよい。
　上記フェノタイプの数は、２～１０であってもよく、２～６であってもよく、２～４であってもよい。例えば、全身性炎症反応症候群患者は、実施例に示す４つのフェノタイプ（クラス１、クラス２、クラス３、クラス４）に分類されてもよい。４つのフェノタイプは例えば、クラス１は入院１日目の発現レベルがカットオフ値より低く、変化量が０未満であるもの、クラス２は入院１日目の発現レベルがカットオフ値より高く、変化量が０未満であるもの、クラス３は入院１日目の発現レベルがカットオフ値より低く、変化量が０以上であるもの、クラス４は入院１日目の発現レベルがカットオフ値より高く、変化量が０以上であるものとして特徴づけられてもよい。これらのフェノタイプに基づけば、全身性炎症反応症候群患者を、重症化リスクが低く現在の治療が有効である群（例えばクラス１）、重症化リスクが高いが現在の治療が有効である群（例えばクラス２）、重症化リスクが低いが現在の治療が有効でない群（例えばクラス３）、重症化リスクが高く現在の治療が有効でない群（例えばクラス４）に分類することもできる。
　本発明の一実施形態には、ＧＤＦ１５タンパク質を検出するための物品を備える、全身性炎症反応症候群患者を分類するためのキットも包含される。キットに含まれ得る物品は、第１の実施形態の〔２．キット〕で挙げた物品と同様である。また、本発明の一実施形態には、ＧＤＦ１５タンパク質を含むバイオマーカーの、全身性炎症反応症候群患者の分類のための使用も包含される。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　本発明の一実施例について以下に説明する。下記実施例の〔１．バイオマーカーの選定〕～〔３．フェノタイプによる分類〕では、全ての統計学的解析において、R environment for statistical computing, version 4.0.2（R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）を用いた。
　〔１．バイオマーカーの選定〕
　第１解析集団、第２解析集団、検証集団における評価を経て、分子病態を反映したバイオマーカーとして使用可能なタンパク質を選定した。
　＜１－１．第１解析集団における評価＞
　第１解析集団として、Olink Proteomics社から公開されている米国のマサチューセッツ総合病院救急部（Massachusetts General Hospital (MGH) Emergency Department）のＣＯＶＩＤ－１９患者のデータを用いた（「https://www.olink.com/mgh-covid-study/」参照）。当該データは、米国ボストンにおいて２０２０年３月～４月に収集された、３０６人のＣＯＶＩＤ－１９患者のデータである。当該データは、患者の容体の変化、血液採取のタイミング、タンパク質の発現レベル等の情報を含む。
　各ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症度を、最大Acuityスコア（Acuity max）に基づいて分類した。Acuityスコアは、世界保健機関のordinal outcomes scale（COVID-19 Therapeutic Trial Synopsis. 「https://www.who.int/publications-detail-redirect/covid-19-therapeutic-trial-synopsis」参照）に基づき、Ａ１：死亡、Ａ２：人工呼吸器管理、Ａ３：酸素投与を伴う入院、Ａ４：酸素投与を伴わない入院、Ａ５：入院なしに分類される。Ａ１＞Ａ２＞Ａ３＞Ａ４＞Ａ５の順にAcuityスコアが大きいと言える。観察されたAcuity maxがＡ１またはＡ２の患者を「重症」、Ａ３～Ａ５の患者を「非重症」と定義した。
　また、各ＣＯＶＩＤ－１９患者から血液を採取したタイミングを、フェイズ１：超急性期（入院１～２日目）、フェイズ２：急性期（入院３～５日目）、フェイズ３：亜急性期（入院６～１０日目）の３つに分類した。
　上記データにおける１４６３種のタンパク質の発現レベルをOlink（登録商標）Explore 1536によって評価した（Olink Explore 1536/384. 「https://www.olink.com/products/olink-explore/」参照）。タンパク質の発現レベルは、正規化タンパク質発現値（normalized protein expression value（ＮＰＸ））としてｌｏｇ２スケールで表した。
　第１解析集団において、３０６人のＣＯＶＩＤ－１９患者のうち１人は外れ値とされ、３０５人分のフェイズ１サンプル、２１５人分のフェイズ２サンプル、１３９人分のフェイズ３サンプルが残った。外れ値の１人を除くと、重症患者数は１０９人で、非重症患者数は１９６人であった。第１解析集団のＣＯＶＩＤ－１９患者の特性の詳細を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１中の数値は、数（括弧内は％）または中央値（括弧内は四分位範囲（ＩＱＲ））を表す。心臓疾患としては、冠動脈疾患、うっ血性心不全、弁膜症が挙げられる。肺疾患としては、喘息、ＣＯＰＤ、自宅での酸素吸入が必要な状態、その他の慢性の肺の病気が挙げられる。腎臓疾患としては、慢性腎臓病、ベースラインクレアチニン＞１．５の状態が挙げられる。免疫無防備状態としては、活性のがん、化学療法を受けている状態、移植を受けた状態、免疫抑制剤を投与されている状態、脾臓がない状態が挙げられる。
　第１解析集団において、重症群と非重症群との間における、１４６３種のタンパク質の発現の差を評価した。具体的には、ウェルチの２群間ｔ検定を用いて発現差異解析（Differential expression analysis）を実施した（信頼水準０．９５）。ＦＤＲ（False discovery rate）は、Benjamin-Hochberg法によって算出した（Benjamini, Y. & Hochberg, Y. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological) 57, 289-300 (1995)参照）。ＦＤＲが０．０１未満且つＮＰＸの差の絶対値が１以上であるタンパク質は、有意に発現していると判断した。
　図１は、第１解析集団において、重症群と非重症群との間で発現に差が見られたタンパク質を表すｖｏｌｃａｎｏプロットである。統計的に有意な発現の変化を示したタンパク質は、各フェイズのｖｏｌｃａｎｏプロットにおいて濃い色で示している。フェイズ１からフェイズ３まで有意に達したタンパク質を、第１解析集団における候補タンパク質として抽出した。その結果、第１解析集団における候補タンパク質としては、２４種のタンパク質（ＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質、ＡＧＲ２タンパク質、ＡＲＥＧタンパク質、ＣＡ３タンパク質、ＣＡＬＣＡタンパク質、ＣＣＬ７タンパク質、ＦＧＦ２３タンパク質、ＧＰＲ３７タンパク質、ＨＳＰＢ６タンパク質、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質、ＩＬ６タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＢタンパク質、ＭＭＰ８タンパク質、ＮＯＳ１タンパク質、ＰＬＡ２Ｇ２Ａタンパク質、ＳＴＣ１タンパク質、ＴＭＳＢ１０タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質、ＴＮＮＩ３タンパク質、ＶＳＩＧ４タンパク質）が抽出された。
　＜１－２．第２解析集団における評価＞
　第２解析集団として、大阪大学医学部附属病院へ２０２０年７月～２０２１年２月に入院したＣＯＶＩＤ－１９患者のデータを用いた。全ての患者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＲＴ－ＰＣＲ検査および胸部ＣＴスキャンによりＣＯＶＩＤ－１９と診断された。患者は、急性呼吸不全により直接入院したか、または臨床医により人工呼吸器による処置（侵襲的人工呼吸管理（invasive mechanical ventilation, ＩＭＶ））が必要であると判断され別の病院に移送された。年齢、性別、ボディマスインデックス（ＢＭＩ）、Sequential Organ Failure Assessment（ＳＯＦＡ）スコア、併存疾患の状況および臨床変数（ＩＭＶの中止の日数および退院の状態）を含む臨床データを電子医療記録から抽出した。対照群は、公募の外来患者からなる。血液サンプルは、ＣＯＶＩＤ－１９患者の入院１～２日目、３～５日目、６～８日目に採取した。健康な対照群からは、血液サンプルは１回採取した。血漿プロテオミクスは、第１解析集団と同様にOlink（登録商標）Explore 1536を用いて実施した。
　ＩＭＶ処置が１２日以下であった患者を人工呼吸器早期離脱群（早期回復群）、１２日超であった患者を人工呼吸器離脱遅延群（回復遅延群）と定義した。第２解析集団は、早期回復群または人工呼吸器管理なし群と、回復遅延群または死亡群とに分類して、解析した。
　第２解析集団は、５３人のＣＯＶＩＤ－１９患者と２０人の健康な対照群とを含む。ＣＯＶＩＤ－１９患者のうち、４９人が重症で、４人が挿管無しでＩＣＵにて治療を受けた。フェイズ１および３の血液サンプル数は、それぞれ５３および３４だった。２１人の患者を早期回復群に、２８人の患者を回復遅延群または死亡群に分類した。第２解析集団のＣＯＶＩＤ－１９患者の特性の詳細を下記表２に示す。表２中の数値および用語の定義は、表１と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　第１解析集団における２４種の候補タンパク質の発現レベルを、第２解析集団における早期回復群と、回復遅延群または死亡群との間で１日ごとに評価した。フェイズ１およびフェイズ３の両方において、早期回復群に比べて回復遅延群または死亡群で有意に発現レベルが上昇していたタンパク質を、第２解析集団における候補タンパク質として抽出した。
　図２は、第１解析集団における２４種の候補タンパク質を、第２解析集団において評価した結果を示すボックスプロットである。図２のｙ軸は、ＮＰＸを表す。図２中のボックスは、中央値、第１四分位点および第３四分位点を表す。ひげは、５～９５パーセンタイルを表す。２群間の差は、ウィルコクソンの順位和検定によって評価した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。回復遅延群または死亡群のＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質およびＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質の発現レベルは、フェイズ１および３の両方で早期回復群と比較して有意に高かった。
　また、図３は、第１解析集団における２４種の候補タンパク質の発現レベルを第２解析集団における健康な対照群とＣＯＶＩＤ－１９患者との間で評価した結果を示すボックスプロットである。図３のｙ軸は、ＮＰＸを表す。図３中のボックスは、中央値、第１四分位点および第３四分位点を表す。ひげは、５～９５パーセンタイルを表す。２群間の差は、ダネット検定によって評価した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。第１解析集団における２４個の候補タンパク質のうち１９種（ＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質およびＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質を含む）の発現レベルが、全ての測定ポイントにおいて、対照群と比較して高かった。
　さらに、第１解析集団における２４種の候補タンパク質と第２解析集団におけるＩＭＶ離脱までの時間との関係を評価するために、時間依存性共変量を伴うＣｏｘ比例ハザードモデルを適用した。ハザード比は、タンパク質間の関係性の強さを比較できるＺスコアとして示した。
　図４は、第１解析集団における２４種の候補タンパク質と第２解析集団におけるＩＭＶ離脱までの時間との関係を表す図である。ＩＭＶ離脱の日は、患者が気管切開なしに抜管された日または患者が気管切開を伴い人工呼吸器を取り外された日と定義した。２４種の候補タンパク質の発現レベルは、時間依存性共変量として解析した。ＮＰＸは、２４種の候補タンパク質間で関連性の強さを比較できるようにＺスコアに変換した。図４のデータは、９５％信頼区間（ＣＩ）とともにハザード比（ＨＲ）を示している。第１解析集団における２４種の候補タンパク質のうち１４種（ＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質およびＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質を含む）において、ＩＭＶの離脱のタイミングと有意な関連が示された。
　以上のことから、特に５種のタンパク質（ＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質およびＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質）の発現レベルが、対照群と比較してＣＯＶＩＤ－１９患者で高いことが分かった。そして、これらの５種のタンパク質は、臨床転帰およびＩＭＶの離脱のタイミングと関連していた。したがって、これら５種のタンパク質を第２解析集団における候補タンパク質として抽出した。
　タンパク質間のどのようなネットワークがＣＯＶＩＤ－１９の発症機序に関与しているのかを明らかにするために、タンパク質共発現ネットワーク解析を実施した。タンパク質共発現ネットワーク解析は、第２解析集団の入院１日目のAcuityスコア１および２の患者のデータを用いて、Ｒパッケージ「ＷＧＣＮＡ」によって行った（Langfelder, P. & Horvath, S. BMC Bioinformatics 9, 559 (2008)参照）。符号付きネットワーク（signed network）は、トポロジーオーバーラップ（ＴＯ）に対する成分ごとの最小値を算出することによって作成した。クラスターデンドログラムを作成するための距離の基準として１－ＴＯを用いて、タンパク質を階層クラスタリングした。類似の共発現の関係性を有するタンパク質のモジュールは、dynamic tree-cutting algorithmを用いて決定した（Langfelder, P. et al. Bioinformatics 24, 719-720 (2008)参照）。各モジュールにおいて、モジュール特異的なタンパク質をモジュールの第１主成分として定義した。ｋの主成分は、モジュールにおけるタンパク質発現の加重サマリー（weighted summary）であり、モジュールにおける全てのタンパク質のばらつきの最大値を表す。モジュールメンバーシップ（ｋＭＥ）は、所定のモジュールに対してタンパク質がどれくらい近いかを定量化しており、個々のタンパク質とモジュールメンバーシップとの間の相関を計算することにより測定できる。モジュールと臨床的特徴との間の関係性は、ＷＧＣＮＡパッケージを用いて、各モジュールの固有タンパク質（eigenprotein）と臨床的特徴との間のbiweight intermediate correlationおよび対応するｐ値を算出することにより決定した。モジュールネットワークは、Cytoscape（登録商標）ソフトウェア（www.cytoscape.org）バージョン３．８．０を用いて図示した（Shannon, P. et al. Genome research 13, 2498-2504 (2003)参照）。各モジュールのタンパク質の生物学的機能は、GO pathway解析を行うことにより調査した（Frohlich, H. et al. BMC Bioinformatics 8, 166 (2007)参照）。
　図５は、第２解析集団のフェイズ１における重症患者のデンドログラムおよび臨床的特徴のヒートマップである。第２解析集団のフェイズ１におけるAcuityスコア１および２の患者の全てのサンプルがクラスターに含まれた。図６は、Ｒによって出力されたScale independenceおよびMean connectivityのグラフである。Scale independenceのグラフは、種々のsoft-threshold powerに対するネットワークトポロジーの分析を表している。Mean connectivityのグラフは、soft-threshold powerの関数としてのMean connectivityの分析を表している。これらに基づき、soft-threshold powerを、スケールフリーなＲ２フィットが０．９である最小閾値として選択されたβ＝５に設定した。
　図７は、第２解析集団のフェイズ１における重症患者のタンパク質共発現ネットワーク解析の結果を示す、ヒートマッププロット、デンドログラムおよびモジュールである。ヒートマップは、トポロジーオーバーラップを表しており、明るい色の領域はオーバーラップが小さく、暗い色の領域はオーバーラップが大きい。また、図８は、図７のデンドログラムおよびモジュールを抜粋した図である。デンドログラムは、トポロジーオーバーラップに基づく、全てのタンパク質の階層クラスタリングツリーを表している。モジュールは、ツリーの枝に対応する。枝およびモジュールは色分けされている。本明細書および図面ではモジュールを便宜的に色の名称で区別する。「灰色」は適切なモジュールから外れたタンパク質を表す。６個のモジュール（赤色、黄色、青色、茶色、緑色、青緑色）が、平均階層クラスタリング、およびダイナミックツリー（最小モジュールサイズ＝２０、モジュール検出感度deepSplit＝４、およびmerge cut height＝０．５で切り取られた）に基づいて同定された。第１解析集団における２４種の候補タンパク質のうち２２種が、青緑色のモジュールに含まれ、第２解析集団における５種の候補タンパク質もまた青緑色のモジュールに含まれた。
　図９は、図７のモジュールと臨床的特徴との相関を示すヒートマップである。ヒートマップ中の各セルには、相関およびｐ値が記載されている。MEyellowは黄色のモジュール、MEgreenは緑色のモジュール、MEredは赤色のモジュール、MEturquoiseは青緑色のモジュール、MEblueは青色のモジュール、MEblownは茶色のモジュール、MEgreyは灰色のモジュールに対応する。回復遅延と最も正の相関が高かったのは青緑色のモジュールであった。このモジュールは、さらなる分析にとって臨床的に重要なモジュールとして選択された。
　青緑色のモジュールのモジュール内相関を、重み付き遺伝子発現ネットワーク解析（ＷＧＣＮＡ）アルゴリズムを用いて計算した（Langfelder, P. & Horvath, S. BMC Bioinformatics 9, 559 (2008)参照）。図１０は、第１解析集団における２４種の候補タンパク質の共発現モジュールを、Cytoscapeを使用して再構築し、可視化したネットワーク図である。ノードはタンパク質を表し、エッジ（線）はノード間の繋がりを表す。エッジの幅および色は、ノードの繋がりの重みに対応している。太線で囲まれたノードは第２解析集団における候補タンパク質である。
　図１１は、図７の青緑色のモジュールおよび青色のモジュールで異なる発現を示したタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析の結果を表す図である。図１１では、有意なＧＯタームのうち上位１０個を、Benjamin-Hochberg法によって算出したＦＤＲで補正したｐ値とともに示す。青緑色のモジュールは細胞接着および生物学的接着と高い関連性を有し、青色のモジュールは主に免疫システムプロセスと関連していた。この解析によって、第２解析集団の５種の候補タンパク質は互いに関連しており、細胞接着の機能を有することが分かった。
　＜１－３．検証集団における評価＞
　検証集団として、大阪大学医学部附属病院または大阪府立中河内救命救急センターへ２０２０年１２月～２０２１年１月および２０２１年４月に入院したＣＯＶＩＤ－１９患者のデータを用いた。これらの患者は、ＩＭＶによって処置され、入院１日目に血液サンプルを採取された。全てのＣＯＶＩＤ－１９患者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＲＴ－ＰＣＲ検査を用いて診断され、ＣＴスキャンにより肺炎と診断された。対照群は、公募の外来患者からなる。人口統計的変数（年齢、性別、ＳＯＦＡスコア、併存疾患の状況および臨床変数（ＩＭＶの中止の日数および退院の状態））を収集した。血液サンプルは、退院または死亡するまでの間に、入院１日目および入院６～８日目に患者から採取した（患者１人あたり最大２回）。健康な対照群からは、血液サンプルは、１回採取した。血液サンプルは、解析まで－３０℃で保存した。
　１１３人のＣＯＶＩＤ－１９重症患者を含む検証集団において、第２解析集団における５種の候補タンパク質を評価した。フェイズ１および３の血液サンプル数は、それぞれ１１３および１１０だった。検証集団のＣＯＶＩＤ－１９患者の特性の詳細を下記表３に示す。表３中の数値および用語の定義は、表２と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　タンパク質の発現レベルはＥＬＩＳＡによって測定した。ＷＦＤＣ２タンパク質、ＧＤＦ１５タンパク質およびＣＨＩ３Ｌ１タンパク質の発現レベルの測定には、R&D Systems社（Minneapolis, MN, USA）のＥＬＩＳＡアッセイキットを用いた。ＫＲＴ１９タンパク質およびＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質の発現レベルの測定は、Thermo Fisher Scientific社（Waltham, MA, USA）のＥＬＩＳＡアッセイキットを用いた。冷凍した血漿サンプルを解凍し、プロトコルに従って測定を行った。吸光度は、マイクロプレートリーダー（SH-9000Lab; コロナ電気社、日本）を用いて解析した。検出可能な最小レベルは、ＷＦＤＣ２タンパク質で＜７８．１ｐｇ／ｍＬ、ＧＤＦ１５タンパク質で＜７．８ｐｇ／ｍＬ、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質で＜３１．３ｐｇ／ｍＬ、ＫＲＴ１９タンパク質で＜６１ｐｇ／ｍＬ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質で＜２．４６ｐｇ／ｍＬであった。なお、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）およびＤ－ダイマーのデータも測定した。
　まず、健康な対照群とＣＯＶＩＤ－１９患者との間の、候補タンパク質の発現レベルの差を１日ごとに評価した。さらに、ＣＯＶＩＤ－１９患者のうち、早期回復群と、回復遅延群または死亡群との間の、第２解析集団における候補タンパク質の発現レベルの差を１日ごとに評価した。フェイズ１およびフェイズ３の両方において、早期回復群に比べて回復遅延群または死亡群で有意に発現レベルが上昇していたタンパク質（ｐ＜０．０５）を、主要タンパク質として抽出した。主要タンパク質については、２８日死亡率および院内死亡率も評価した。フェイズ１およびフェイズ３における主要タンパク質のレベルを、２８日後の生存者と非生存者との間、または病院内の生存者と非生存者との間で比較した。
　図１２は、検証集団における対照群とＣＯＶＩＤ－１９患者との間の、第２解析集団における５種の候補タンパク質の発現レベルの差を評価した結果を示すボックスプロットである。図１２のｙ軸は、データの分布を正規化するために常用対数値に変換した候補タンパク質の発現レベルを表す。図１２中のボックスは、中央値、第１四分位点および第３四分位点を表す。ひげは、５～９５パーセンタイルを表す。２群間の差は、ダネット検定によって評価した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。フェイズ１および３のいずれにおいても、ＣＯＶＩＤ－１９患者のＷＦＤＣ２タンパク質、ＧＤＦ１５タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質の発現レベルが対照群と比較して有意に高かった。
　図１３は、検証集団における早期回復群と、回復遅延群または死亡群との間の、第２解析集団における５種の候補タンパク質の発現レベルの差を評価した結果を示すボックスプロットである。図１３のｙ軸は、データの分布を正規化するために常用対数値に変換した候補タンパク質の発現レベルを表す。図１３中のボックスは、中央値、第１四分位点および第３四分位点を表す。ひげは、５～９５パーセンタイルを表す。２群間の差は、ウィルコクソンの順位和検定によって評価した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。フェイズ１および３のいずれにおいても、回復遅延群または死亡群のＷＦＤＣ２タンパク質、ＧＤＦ１５タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質およびＫＲＴ１９タンパク質の発現レベルが、早期回復群と比較して有意に高かった。
　図１４は、検証集団における２８日後の生存者と非生存者との間、および、病院内の生存者と非生存者との間の、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＧＤＦ１５タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質の発現レベルの差を評価した結果を示すボックスプロットである。図１４のｙ軸は、データの分布を正規化するために常用対数値に変換した候補タンパク質の発現レベルを表す。図１４中のボックスは、中央値、第１四分位点および第３四分位点を表す。ひげは、５～９５パーセンタイルを表す。２群間の差は、ウィルコクソンの順位和検定によって評価した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。フェイズ１および３のいずれにおいても、２８日死亡率および院内死亡率は、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＧＤＦ１５タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質およびＫＲＴ１９タンパク質の血漿レベルに関連していた。以上のことから、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＧＤＦ１５タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質およびＫＲＴ１９タンパク質が、ＣＯＶＩＤ－１９重症度と関連する４種の主要タンパク質であると結論付けた。
　〔２．ＲＯＣ解析〕
　検証集団における４種の主要タンパク質の入院１日目の発現レベルについて受信者操作特性（Receiver Operating Characteristic, ＲＯＣ）解析を実施し、２８日死亡率を予測した。ＲＯＣ曲線上の点から、左上隅までの距離を算出し、最小の距離を有する点をカットオフポイントとして選択した（Cho, S. et al. BMC Anesthesiology 21, 29 (2021)参照）。なお、ｘ≧０、ｙ≧０の第１象限にＲＯＣ曲線を描いた場合に、ｘ軸の存在する側を下側、ｙ軸の存在する側を左側とする。その後、以下のように複合スコアを定義した。各主要タンパク質に対してカットオフポイントに基づいて患者を２つの群に分けた。主要タンパク質の発現レベルがカットオフ値以上である患者を１、主要タンパク質の発現レベルがカットオフ値未満である患者を０と定義した。各主要タンパク質の値を合計し、複合スコアを算出した。すなわち複合スコアの最小値は０、最大値は４である。複合スコア、並びに入院１日目のＤ－ダイマーおよびＣＲＰが２８日死亡率の予測に有用なバイオマーカーであるか否かを調べるために、ＲＯＣ曲線、ＡＵＣ（Area Under the Curve、曲線下面積）、感度および特異度を決定した。χ２検定を用いて、２８日後の転帰および臨床転帰（院内での死亡、回復遅延、早期回復）の複合スコアを比較した。
　図１５は、検証集団における４種の主要タンパク質の入院１日目の発現レベルを用いて得られたＲＯＣ曲線を表す図である。ＲＯＣ曲線に付された数値は、「最適なカットオフポイント（感度、特異度）」を表す。主要タンパク質のＡＵＣはいずれも０．５を超えており、ある程度の精度が得られた。このうち、ＡＵＣの最大値はＷＦＤＣ２タンパク質の０．７５であった。
　図１６は、複合スコア、ＣＲＰおよびＤ－ダイマーのそれぞれを使用して得られたＲＯＣ曲線を表す図である。複合スコアのＡＵＣは、高い感度を伴う０．８５２（９５％ＣＩ（信頼区間）：０．７７７～０．９２６）であり、ＣＲＰまたはＤ－ダイマーのＡＵＣと比較して高かった。図１７は、各複合スコアに含まれる２８日後の生存者と非生存者との割合および早期回復群と回復遅延群および院内死亡群との割合を示す図である。傾きは、カテゴリー内の患者の数に比例する。アスタリスクは、χ２検定において臨床転帰と複合スコアとの間に統計的に有意差があることを示す。図１７より、２８日死亡率および臨床転帰は、統計的に複合スコアと関連していることが分かる。
　〔３．フェノタイプによる分類〕
　主要タンパク質の組み合わせを用いて新たな臨床フェノタイプを導き出すために、潜在クラス分析（ＬＣＡ）を実施した。ベイズ情報量基準（ＢＩＣ）、各フェノタイプの適切なサイズ、各フェノタイプの誤分類率を評価することにより、フェノタイプの最適な数を特定した（NAGIN, D. S. Group-Based Modeling of Development. (Harvard University Press, 2005); Nylund, K. L. et al. Structural Equation Modeling: A Multidisciplinary Journal 14, 535-569 (2007)参照）。フェノタイプの最適な数は、誤分類率および解釈性を考慮し、最大のＢＩＣに基づいて選択した。ＬＣＡの計算は、最大のＢＩＣが最適であると解釈されるＲのVarSelLCMパッケージを用いて実施した。新たな臨床フェノタイプを臨床データと比較した。χ２検定を用いて、フェノタイプと、２８日死亡率および院内死亡率とを比較した。Kaplan-Meier曲線を用いて累積死亡率を図示し、フェノタイプをログランク検定によって比較した。
　図１８は、種々のクラス数に対するＢＩＣスコアを示す図である。ＢＩＣスコアはクラス数が４個であるモデルにおいて最も高く、その後、クラスの数を追加すると比例的に減少した。すなわち、追加されたクラスがモデルに対して重要な情報を加えないことが示唆された。
　４つのフェノタイプをα－フェノタイプ、β－フェノタイプ、γ－フェノタイプおよびδ－フェノタイプと命名した。図１９は、ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ）を用いて４つのフェノタイプを可視化した図である。図２０は、４種の主要タンパク質と４つのフェノタイプとの関係性を表したヒートマップである。サイトカインレベルをＺスケールに変換した。白はサイトカインレベルが低いことを示し、色の濃い領域はサイトカインレベルが高いことを示す。δ－フェノタイプは、４種の主要タンパク質で高いサイトカインレベルを示した。図２１は、潜在クラス分析から得られたフェノタイプを階層化した、２８日後の生存率についてのKaplan-Meier曲線を表す図である。ログランク検定により、４つのフェノタイプの間に有意差があることが示された（ｐ＜０．０００１）。
　フェノタイプと臨床データとの関連性を下記表４に示す。表４中の数値および用語の定義は、表２と同様である。「ＷＢＣ」は白血球数、「ＰＬＴ」は血小板数を意味する。「ＥＣＭＯ」は、体外式膜型人工肺（extracorporeal membrane oxygenation）を意味する。表４中、アスタリスクは、ウィルコクソンの順位和検定またはχ２検定において統計的に有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。δ－フェノタイプは、高い発現レベルのクレアチニンおよびＤ－ダイマーで特徴づけられ、２８日死亡率および院内死亡率と関連していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　〔４．ＧＤＦ１５タンパク質を用いた全身性炎症反応症候群患者の分類〕
　＜４－１．対象＞
　熱傷患者８３人、ＣＯＶＩＤ－１９患者１９３人、敗血症（細菌性）患者３８人を、この後方視的研究の対象とした。
　上記熱傷患者は２０１４年１０月から２０１９年１２月までに、名古屋市の地域医療機能推進機構、中京病院熱傷センターに入院した。対象に含める基準は、年齢が１６歳以上、熱傷面積の割合（％ＴＢＳＡ（Total Body Surface Area））が２０％以上であることとした。
　上記ＣＯＶＩＤ－１９患者は、２０２０年７月から２０２１年２月、２０２１年４月に大阪大学医学部附属病院または大阪府立中河内救急救命センターに入院した。全患者をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＲＴ－ＰＣＲ検査と胸部ＣＴ検査によりＣＯＶＩＤ－１９と診断した。急性呼吸不全により直接入院した患者、または臨床医により人工呼吸器による治療の適応と判断され、他院から転院してきた患者を対象とした。
　上記敗血症患者は２０１４年２月から２０１５年７月までに大阪大学大学院医学部附属病院高度救命救急センターに入院した。上記敗血症患者はすべて１８歳以上であり、Ｓｅｐｓｉｓ－３基準（Singer M et. al., The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA 2016;315:801-810）を満たした。
　病院到着時に心肺停止状態であった患者および同意が得られない患者は対象から除外した。
　＜４－２．データ収集＞
　患者の年齢、性別、ＢＭＩ、検査データおよび予後を電子カルテから抽出した。患者の血液サンプルを１日目（ＩＣＵ入室日）から８日目まで複数回採取した。血液サンプルは使用するまで－３０℃で保存した。
　ＧＤＦ１５の血中濃度を測定するためにＥＬＩＳＡ法（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を用いた。凍結血漿試料を解凍し、その後の測定工程は、製造業者のプロトコルに従って実施された。吸光度は、マイクロプレートリーダー（SH-9000Lab;コロナ電気社製、日本）を用いて分析した。最小検出値はＧＤＦ１５で７．８ｐｇ／ｍＬであった。患者の血液サンプルの検査データは、各病院の中央検査室で測定された。
　＜４－３．統計解析＞
　以下の解析は、入院時のＧＤＦ１５値が利用可能な症例についてのみ行った。全ての統計学的解析において、R environment for statistical computing, version 4.2.1（R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）を用いた。入院時のＧＤＦ１５値と他の検査データ（ＦＤＰ（フィブリン・フィブリノゲン分解産物）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、クレアチニン、ＰＴ（ＩＮＲ）（プロトロンビン時間（国際標準比））、ＰＬＴ（血小板数）、ＣＲＰ、ビリルビン、ＷＢＣ（白血球数））が２８日死亡率の予測に有用かどうかを調べるために、ＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＣを測定した。ＲＯＣ曲線からＧＤＦ１５のカットオフ値を決定するためにＹｏｕｄｅｎの指数を使用した。
　次に、ＧＤＦ１５値を複数回測定した症例についてのみ、以下の解析を行った。ＧＤＦ１５値の経時的な増減を評価するために、線形モデルを使用した。病日を独立変数、ＧＤＦ１５の測定値を従属変数とし、Ｒのｌｍパッケージを使用して係数と切片を算出した。このモデルに基づいて、入院時（第１病日）の推定ＧＤＦ１５値が得られ、これを推定初期値とした。また係数は変化量とした。
　患者を、推定初期値が上記のカットオフ値以上か未満か、また、変化量が０以上か未満かによって、４つに分類した。Kaplan-Meier曲線を用いて累積死亡率を図示し、フェノタイプをログランク検定によって比較した。両側ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。以下の表における数値は、数（括弧内は％）または中央値（括弧内は四分位範囲（ＩＱＲ））を表す。
　＜４－４．結果＞
　対象患者の臨床データの詳細を下記表５に示す。「ＡＰＴＴ」は活性化部分トロンボプラスチン時間を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　（ＧＤＦ１５および他のバイオマーカーのＲＯＣ解析）
　５４人の熱傷患者、１７６人のＣＯＶＩＤ－１９患者、３２人の敗血症患者の入院時のＧＤＦ１５値を用いてＲＯＣ解析を行った。ＲＯＣ解析対象患者の疾患と臨床データとの関連性を下記表６に示す。表６中、ｐ値は、クラスカル・ウォリスの順位和検定またはピアソンのχ２検定によって得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　２８日死亡率または院内死亡率は、熱傷患者、ＣＯＶＩＤ－１９患者、敗血症患者の間で統計的な差はなかった。第１病日のデータを用いた２８日死亡率を予測するＲＯＣ解析の結果およびＡＵＣを図２２に示す。最も高いＡＵＣは、ＧＤＦ１５でみられ、０．７８であった。ＧＤＦ１５のカットオフ値は、Ｙｏｕｄｅｎの指数を用いて３２８５ｐｇ／ｍＬとなり、感度は０．８２、特異度は０．７０であった。
　（ＧＤＦ１５の経時的測定値を用いた４分類）
　７３人の熱傷患者、１７３人のＣＯＶＩＤ－１９患者、３０人の敗血症患者において症例毎に線形モデルを作成し、係数と第１病日のＧＤＦ１５の推定値とを用いて４つに分類した。その結果を図２３に示す。３つの疾患の特徴および検査データの詳細を下記表７に示す。表７中、ｐ値は、クラスカル・ウォリスの順位和検定またはピアソンのχ２検定によって得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　係数と第１病日のＧＤＦ１５の推定値は３疾患間で有意差を示した。２８日死亡率、院内死亡率については疾患の間で有意差はなかった。図２３に示す４つのフェノタイプはクラス１、クラス２、クラス３、クラス４と名付けられた。クラス１は推定初期値がカットオフ値より低く、変化量が０未満であるもの、クラス２は推定初期値がカットオフ値より高く、変化量が０未満であるもの、クラス３は推定初期値がカットオフ値より低く、変化量が０以上であるもの、クラス４は推定初期値がカットオフ値より高く、変化量が０以上であるものとした。４つのフェノタイプと臨床データとの関連性を下記表８に示す。表８中、ｐ値は、クラスカル・ウォリスの順位和検定またはピアソンのχ２検定によって得られた。ログランク検定は、フェノタイプ間の生存曲線の有意差を示した（図２４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　＜４－５．ＣＲＰを用いた分類＞
　比較のために、ＣＲＰを用いた場合にＧＤＦ１５と同様の分類が可能か検証した。＜４－２．データ収集＞に記載のデータを用いて、入院時のＣＲＰ値が利用可能な症例についてのみ解析を行った。＜４－３．統計解析＞と同様の方法によって、ＣＲＰの推定初期値および変化量に基づき、患者の分類を試みた。その結果を図２５に示す。また、フェノタイプ間の生存曲線を図２６に示す。ログランク検定によると、フェノタイプ間の生存曲線の有意差はなかった。
　本発明の一態様は、ＣＯＶＩＤ－１９患者の分類に利用することができる。本発明の別の一態様は、全身性炎症反応症候群患者の分類に利用することができる。

Claims (9)

  1. 　被験体から採取された試料においてＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出する工程を含む、コロナウイルス感染症患者の分類方法。
  2. 　被験体から採取された試料においてＡＧＲ２タンパク質、ＡＲＥＧタンパク質、ＣＡ３タンパク質、ＣＡＬＣＡタンパク質、ＣＣＬ７タンパク質、ＦＧＦ２３タンパク質、ＧＰＲ３７タンパク質、ＨＳＰＢ６タンパク質、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質、ＩＬ６タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＢタンパク質、ＭＭＰ８タンパク質、ＮＯＳ１タンパク質、ＰＬＡ２Ｇ２Ａタンパク質、ＳＴＣ１タンパク質、ＴＭＳＢ１０タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質、ＴＮＮＩ３タンパク質、ＶＳＩＧ４タンパク質からなる群より選択される１種以上をさらに検出する工程を含む、請求項１に記載の分類方法。
  3. 　ＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出するための物品を備える、キット。
  4. 　ＡＧＲ２タンパク質、ＡＲＥＧタンパク質、ＣＡ３タンパク質、ＣＡＬＣＡタンパク質、ＣＣＬ７タンパク質、ＦＧＦ２３タンパク質、ＧＰＲ３７タンパク質、ＨＳＰＢ６タンパク質、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質、ＩＬ６タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＢタンパク質、ＭＭＰ８タンパク質、ＮＯＳ１タンパク質、ＰＬＡ２Ｇ２Ａタンパク質、ＳＴＣ１タンパク質、ＴＭＳＢ１０タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質、ＴＮＮＩ３タンパク質、ＶＳＩＧ４タンパク質からなる群より選択される１種以上を検出するための物品をさらに備える、請求項３に記載のキット。
  5. 　ＧＤＦ１５タンパク質、ＷＦＤＣ２タンパク質、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質、ＫＲＴ１９タンパク質からなる群より選択される１種以上を含むバイオマーカーの、コロナウイルス感染症患者の分類のための使用。
  6. 　ＡＧＲ２タンパク質、ＡＲＥＧタンパク質、ＣＡ３タンパク質、ＣＡＬＣＡタンパク質、ＣＣＬ７タンパク質、ＦＧＦ２３タンパク質、ＧＰＲ３７タンパク質、ＨＳＰＢ６タンパク質、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質、ＩＬ６タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＢタンパク質、ＭＭＰ８タンパク質、ＮＯＳ１タンパク質、ＰＬＡ２Ｇ２Ａタンパク質、ＳＴＣ１タンパク質、ＴＭＳＢ１０タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂタンパク質、ＴＮＮＩ３タンパク質、ＶＳＩＧ４タンパク質からなる群より選択される１種以上を含むバイオマーカーを併用する、請求項５に記載の使用。
  7. 　被験体から採取された試料においてＧＤＦ１５タンパク質を検出する工程を含む、全身性炎症反応症候群患者の分類方法。
  8. 　ＧＤＦ１５タンパク質を検出するための物品を備える、全身性炎症反応症候群患者の分類のためのキット。
  9. 　ＧＤＦ１５タンパク質を含むバイオマーカーの、全身性炎症反応症候群患者の分類のための使用。
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