WO2023062328A1 - Mélange d'au moins un bactériophage et d'au moins une levure et leur procédé de séchage - Google Patents

Mélange d'au moins un bactériophage et d'au moins une levure et leur procédé de séchage Download PDF

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WO2023062328A1
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bacteriophage
dry
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Mickaël BOYER
Alan Israel
Edith POULAIN
Jean-Bernard SOUICI
Renaud Toussaint
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Lesaffre Et Compagnie
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Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing a dry mixture of at least one bacteriophage and at least one yeast and/or a yeast derivative, a mixture comprising solid entities each of which consists of at least one bacteriophage and at least one yeast and/or yeast derivative and various uses of such a mixture.
  • bacteriophages Both humans and animals or plants can act as hosts for bacteria giving rise to infections of the bacterial type.
  • the use of bacteriophages has been retained to treat diseases or digestive disorders of bacterial origin.
  • document US20190255122 describes a method of treating or preventing gastrointestinal inflammation or pain in a human being comprising the oral administration of a composition comprising one or more bacteriophages chosen from bacteriophages of the family Siphoviridae or family Myoviridae.
  • the bacteriophage(s) are chosen from LH01-Myoviridae, LL5-Siphoviridae, T4D-Myoviridae and LL12-Myoviridae.
  • Bacteriophages would therefore play a prebiotic role in protecting the gastrointestinal microflora.
  • Moye et al. (A Bacteriophage Cocktail Eliminates Salmonella typhimurium from the Human Colonie Microbiome while Preserving Cytokine Signaling and Preventing Attachment to and Invasion of Human Cells by Salmonella In Vitro. J Food Prot. 2019 Aug;82(8):1336-1349) relates to Bacteriophage cocktails administered to human patients to eliminate Salmonella strains from the gut without disrupting the native microbiota. This cocktail also makes it possible to prevent the risk of invasion of the intestinal epithelium by Salmonella.
  • the cocktail of The bacteriophages studied in this article were prepared from three phage preparations marketed by Intralytix, Inc.: ListShieldTM, EcoShield PXTM and SalmoFreshTM.
  • Dissanayake et al. (Bacteriophages Reduce Pathogenic Escherichia co// Counts in Mice Without Distorting Gut Microbiota. Front Microbiol. 2019 Sep 10;10:1984) uses the same bacteriophage cocktail against Escherichia coli O157/H7 strain. At the end of this study, the researchers concluded that such a cocktail has an antibiotic effect similar to that of ampicillin without showing such a harmful effect on the intestinal microbiota as the latter.
  • yeasts have a beneficial role both in human nutrition and health, and in animal nutrition and health or plant nutrition and health.
  • some strains of Saccharomyces cerevisiae are considered probiotic yeasts to promote gut health.
  • bacteriophages can for their part be used to prevent or treat a bacterial infection in humans, animals or plants. It is therefore appropriate to combine at least one bacteriophage and at least one yeast to prevent or treat bacterial infections while allowing the yeasts to develop and play their nutritional, protective and stimulating role in human, animal or plant health.
  • compositions comprising at least one type of bacteriophage as prebiotic agent and at least one probiotic agent which may be chosen from Saccharomyces boulardii or Saccharomyces cerevisiae.
  • Bacteriophage has a promoter role in the development of beneficial bacteria by decreasing populations of harmful bacteria and releasing nutrients into its environment for use by beneficial bacteria in the digestive system in an individual.
  • the prebiotic and probiotic agents mentioned are added separately within the composition.
  • each bacteriophage has a specificity for a unwanted bacteria. Therefore, as such, bacteriophages do not directly affect any other organisms in the digestive tract or any probiotics. Thus, specific undesirable bacteria would be lysed and their cellular material is available as nutrients for the probiotic or endogenous organism. Further, by depleting the population of specific undesirable bacteria, probiotic organisms can successfully compete and establish colonization producing an environment suitable for them but inhospitable to the undesirable organism.
  • microorganisms in dry form promotes handling, long-term storage stability and the possibility of being used in capsules or in other forms of presentation and dosages adapted for specific applications (animal food, foodstuffs, etc).
  • Bacteriophages are viruses that infect bacteria. They have walls made up solely of proteins, walls that are thinner and more fragile than those of bacteria. Thus, when it comes to drying a suspension of bacteriophages (a family or a mixture of phages), in most cases it is necessary to implement supports to promote the survival and/or the obtaining of a final dry product having the required properties (shape, particle size, dry extract, porosity, property of solubilization or instantaneousness, compressibility etc.). It is indeed impossible to dry as it is because the dry matter content of the suspension (from a culture of lysed bacteria or from a saline solution suitable for the preservation of phages) is generally very low ( ⁇ 5% ). Drying under these conditions would not be advantageous from an economic point of view and above all too deleterious for the phages.
  • drying support is intimately linked to the concept of formulation which amounts to using one or more ingredients or supports or excipients with the microorganism so that drying is possible and easy.
  • the mixture of yeast powders and bacteriophages in a finished industrial product would require overcoming certain difficulties such as guaranteeing the homogeneity of the mixed powder or filling capsules or other forms of presentation and dosage with a limited volume.
  • a mixture of phages with yeasts in the form of yeast cream or pressed yeast it is possible to imagine a mixture of phages with yeasts in the form of yeast cream or pressed yeast.
  • cream yeast and pressed yeast are acidic (pH 5.8) and could be associated with protease activity which could modify both the phage titer and the lytic activity of the phages on the bacterial target.
  • phages are biological entities requiring protection against the stresses generally encountered during storage and according to their use (application on an inert or living support, in a protected atmosphere or in the open air, ingestion by a human or an animal, etc.).
  • fermented foods and drinks based on fresh yeasts can also be subject to contamination by bacteria. As seen above, bacteriophages can then be used to fight against these bacteria.
  • bakery products or fermented beverages such as wine or beer may be cited.
  • Bioethanol is ethanol produced by fermentation of agricultural products containing fermentable sugars.
  • a phage is a virus which infects a bacterium. According to the invention, the terms “phage” and “bacteriophage” are interchangeable.
  • the present invention relates to a method for manufacturing a dry mixture of at least one yeast and / or a yeast derivative and at least one bacteriophage, said mixture is in the form of solid entities, each solid entity consists of at least one yeast and/or at least one yeast derivative and at least one bacteriophage and optionally at least one drying excipient, said method being characterized in that it is carried out by mixing at least one yeast and/or a yeast derivative and at least one bacteriophage in suspension and drying this mixture.
  • the present invention relates to a dry mixture of at least one yeast and / or a yeast derivative and at least one bacteriophage, characterized in that it is in the form of solid entities, each solid entity consisting of at least one yeast and/or at least one yeast derivative and at least one bacteriophage and optionally at least one drying excipient.
  • said mixture is obtained by the method according to the first aspect.
  • the present invention relates to a use of the dry mixture according to the second aspect or of the dry mixture obtained from the process according to the first aspect as a medicament in a composition intended to reduce the acidity of gastric juice.
  • the subject of the present invention is a use of the dry mixture according to the second aspect or of the dry mixture obtained from the method according to the first aspect in a composition for stimulation, protection, biocontrol and/ or plant nutrition.
  • the present invention relates to a use of the dry mixture according to the second aspect or of the dry mixture obtained from the process according to the first aspect in a food composition or in a food supplement.
  • the present invention relates to a use of the dry mixture according to the second aspect or of the dry mixture obtained from the method according to the first aspect in brewing and/or in oenology.
  • the present invention relates to a use of the dry mix according to the second aspect or of the dry mix obtained from the method according to the first aspect in bread making.
  • the present invention relates to a use of the dry mixture according to the second aspect or of the dry mixture obtained from the process according to the first aspect in the production of bioethanol.
  • the present invention relates to a method for manufacturing a dry mixture of at least one yeast and / or a yeast derivative and at least one bacteriophage, said method being characterized in that it is carried out by mixing at least one yeast and/or yeast derivative or a yeast derivative and at least one bacteriophage and drying this mixture.
  • Said mixture is in the form of solid entities, each solid entity is composed of at least one yeast and/or at least one yeast derivative and at least one bacteriophage and optionally at least one drying excipient.
  • the subject of the present invention is a process for the manufacture of a dry mixture of at least one yeast and/or of a yeast derivative and of at least one bacteriophage, the mixture is in the form of solid entities, each solid entity consists of at least one yeast and/or at least one yeast derivative and at least one bacteriophage and optionally at least one drying excipient, said method being characterized in that it is carried out by mixing at least one yeast and/or yeast derivative or a yeast derivative and at least one bacteriophage and drying this mixture.
  • Such a method makes it possible to produce stable formulations containing phages ensuring their optimal protection and their transport to the sites of action, such as the gastrointestinal tract or the phyllosphere of plants (aerial parts). Dry forms are preferred due to their ease of handling and long-term storage stability, such as at ambient temperatures, thus obviating the need for a cold chain for storage.
  • yeasts or yeast derivatives used as probiotics in animal, human and plant health have been characterized for their tolerance and resistance to several stress factors associated with both manufacturing procedures (downstream processes, for example drying , storage) and stressful conditions of the intestinal tract (gastric pH, bile and digestive enzymes).
  • the combination of yeast and/or yeast derivative and phage constitutes an alternative for protecting the phages by the yeast or its derivatives and conveying them to the target site.
  • yeasts (or its derivatives) have a dual role: on the one hand they play the role of probiotics and, on the other hand, they serve as a support during the drying step, as shown by the examples below. -below. This solution makes it possible to maximize the beneficial effects of each of the components of the combination.
  • the mixture obtained by the method of co-drying phage with yeast and/or yeast derivatives makes it possible to improve the protection phages against environmental conditions and UV effects (in vitro conditions), while maintaining the activity and beneficial properties of the yeast.
  • Such a mixture makes it possible to reduce the costs associated with the use of compositions comprising both yeasts or yeast derivatives and bacteriophages by optimizing the management of stocks and their supply. It is therefore ready to use, reduces the risk of losses and does not generate additional costs associated with mixing dry yeast or yeast derivatives with bacteriophages, while avoiding the risk of handling errors in the management of microorganisms , such as dosing errors. Indeed, these errors can occur especially during the preparation of yeast powder mixtures when the user must add the ferments in specific mass proportions.
  • the use of this mixture facilitates the preparation of compositions involving the use of yeasts or yeast derivatives.
  • the method according to the invention can be implemented using active yeasts and/or yeast derivatives.
  • active yeast which is synonymous with “live yeast” or “fresh yeast”, refers to a population of yeast cells which are metabolically active. When so-called “fresh” yeasts are used, activity refers to their viability.
  • a yeast derivative according to the invention is defined as a fraction obtained during the degradation of the yeast by physical or chemical action, for example by plasmolysis, hydrolysis or autolysis of the yeast.
  • Yeast-derived products are all products that can be obtained from whole or fractionated yeast cells, by physical or chemical action. They include in particular yeast extracts obtained by autolysis or autolysates, yeast hulls, mannoproteins, inactivated yeasts. They most often come in the form of a more or less fine powder after grinding or in suspension in a rehydration medium, in the form of yeast cream or pressed yeast. Most advantageously, the yeast derivative is yeast cell wall or yeast extract. Even more advantageously, the yeast derivative is yeast hull.
  • the yeast cell walls can be obtained or prepared according to techniques known to those skilled in the art, in particular by enzymatic lysis or by mechanical lysis (separation, concentration, etc.).
  • the peels are produced by enzymatic lysis (autolysis by their own proteolytic enzymes or heterolysis) of yeast cells followed by separation of the soluble and insoluble parts, for example by physical means, such as centrifugation, and recovery of the insoluble part.
  • the insoluble part is thus typically recovered by eliminating the soluble part by centrifugation.
  • the insoluble part corresponds to the yeast cell walls.
  • the soluble part resulting from this process, of light color and low turbidity, is called yeast extract.
  • the process for manufacturing a dry mixture of at least one yeast and/or one yeast derivative and at least one bacteriophage is characterized in that it comprises:
  • the bacteriophages are in suspension in an aqueous solution, preferably saline.
  • an aqueous solution preferably saline.
  • the drying step is carried out by lyophilization or atomization or on a fluidized air bed.
  • the dry matter content of yeast and/or yeast derivative within the mixture before the step of drying at least one yeast or one yeast derivative and at least one bacteriophage is between 20 and 60% relative to the total amount of dry matter in the mixture to be dried.
  • the drying step can be preceded by a dehydration step making it possible to increase the dry matter content.
  • This dehydration step is then followed by an actual drying step to obtain the final dry mixture to be recovered.
  • the drying step would be carried out in two stages.
  • the drying step can be followed by a step in which the dry mixture is further divided, for example by grinding it.
  • Lyophilization drying makes it possible to obtain a lyophilisate which can be ground in the form of flakes or a fine powder, whereas spray drying makes it possible to obtain a finely divided dry product.
  • the principle of drying by atomization is to dehydrate liquid droplets in a current of hot gas (air for example) which circulates in a drying tower.
  • the liquid to be dried (solution or suspension or mixture, with a dry extract adapted so as not to be too viscous) is nebulized in the form of fine droplets using an atomization device (nozzle or turbine) which is generally placed at the top of the tower.
  • nozzle or turbine atomization device
  • the temperature of the outlet air and especially the temperature of the product at the he interior of the tower is lower by several tens of degrees because the particles, which are surrounded by a film of water, cool during the change of state from liquid water to vapour.
  • the temperature of the outlet air and especially the temperature of the product at the he interior of the tower is lower by several tens of degrees because the particles, which are surrounded by a film of water, cool during the change of state from liquid water to vapour.
  • yeasts and/or yeast derivatives are used, and optionally secondary ingredients or excipients having a particular effect (protective for example).
  • the liquid must not exceed a certain viscosity in order to be pumped and transformed into fine droplets by the atomization device.
  • the preparation of the mixture is done until the ingredients or carriers are completely dissolved or dispersed and it will be dried in an atomization tower as quickly as possible to avoid any degradation of the product or microbial proliferation. Preferably the mixture will be maintained at low temperature throughout the drying period. A person skilled in the art will know how to choose the necessary temperature.
  • the drying parameters are adapted according to the configuration of the tower and the atomization device but also the characteristics of the mixture (viscosity, dry extract), the aim being to obtain a fine powder with a maximum final humidity. 10%, preferably maximum 8%, more preferably 6%.
  • additional drying media such as maltodextrin, native starch, trehalose, L-leucine.
  • lyophilization in English - freeze drying is a drying technique allowing the vacuum desiccation of liquid or semi-pasty products which have been frozen beforehand. This technique is often used for fragile products which do not support direct drying. It thus makes it possible to ensure the stability of perishable products, to stop the metabolism of biological products and to obtain easily rehydratable powder products.
  • a freeze-dried product has a very high affinity for the solvent it contains (generally water). From a practical point of view, this operation comprises 3 important phases and one thus speaks of a freeze-drying cycle.
  • the first phase is an operation of freezing the product which makes it possible to solidify the matrix and especially to crystallize the water which it contains in the form of ice. For this it is necessary to lower the temperature of the product sufficiently below its total solidification temperature. A person skilled in the art will know how to choose the necessary temperature.
  • the second phase is a primary desiccation or sublimation step. During this phase it is necessary to lower the pressure in the freeze-drying chamber and therefore to create a high vacuum. Thus the pressure must be lower than the vapor pressure of the ice, at the temperature considered. Furthermore, the temperature of the product must remain below the starting melting temperature.
  • the third phase is a secondary desiccation stage which makes it possible to complete the dehydration by eliminating the last traces of water by desorption. It is characterized by the lowest possible pressure in the chamber and by a high product temperature which will remain below its denaturation temperature.
  • the preparation of the product to be lyophilized which generally consists in combining it with a mixture of excipients or carriers with a protective and cryoprotective effect;
  • the phage suspension is formulated with adjuvants or excipients which will have a supporting and/or cryoprotective agent role. He is necessary to increase the dry extract (for example around 25-30%) to concentrate the suspension of phages and thus reduce the quantity of water to be eliminated. According to the invention, this increase in dry matter is made possible by mixing with yeasts and/or yeast derivatives. A person skilled in the art will know how to choose a “bacteriophage/yeast and/or yeast derivative” ratio in order to obtain the best viability of the phages after drying.
  • the mixture is prepared until the excipients or the yeast and/or the yeast derivative are completely dissolved or dispersed.
  • drying media such as maltodextrin, native starch, trehalose, L-leucine.
  • the mixture will be completely cooled (for example ⁇ 8° C.) and distributed in trays or bottles, respecting a certain layer height (for example 15 mm), before undergoing the freezing phase at at least -20°C in a freezer or deep freezer.
  • a certain layer height for example 15 mm
  • the containers or flasks are placed on the shelves of the lyophilizer cooled beforehand by starting up the cold trap (for example ⁇ 55° C.).
  • the lyophilizate generally has the appearance of a porous meringue.
  • this meringue is reduced to a fine powder by gentle grinding and preferably this operation will be carried out in a chamber with controlled hygrometry (to prevent it from taking up water), before rapid packaging under vacuum or in an inert atmosphere.
  • the method according to the invention further comprises a step of extruding the dehydrated mixture so as to form an extruded mixture, the drying step being carried out in a fluidized bed on the extruded mixture so as to form a dry mix.
  • Fluidized bed drying makes it possible to obtain a dry granular product or in the form of vermicelli.
  • the principle of fluidized bed drying is to dehydrate wet solid particles in a current of hot air. These solid wet particles are obtained in this case after a granulation step which makes it possible to obtain a form and a density of solid suitable for fluidization in the air.
  • the particles also called granules
  • the dry granules are characterized by a residual humidity of less than 10%, preferably 8%, more preferably 5%, which ensures good stability over time of the products (conservation).
  • the advantage of this technique is to be able to carry out gentle drying at low temperature, which makes it a method of choice for drying living microorganisms or fragile biological products.
  • the size of the particles to be dried, after the granulation step, is important and the smaller it is, the faster the product will dry.
  • the time of exposure to heat of the product will also be reduced which will promote a better rate of viability after drying.
  • this technique is commonly used for drying baker's yeast and in this case instant dry yeast is obtained in the form of porous granules which are capable of rehydrating very quickly in water or in a powder mixture (flour) to which water is added.
  • Granulation also called extrusion, is the step preceding fluidized bed drying and can only be done on pasty or semi-pasty products having a dry extract compatible with this operation of passing through a die. .
  • filtration of a yeast cream gives pressed yeast which has this property.
  • the mass to be dried is shaped in a granulator (also called extruder) which produces continuous fine filaments, which are then fragmented into short vermicelli to obtain the granules. If the mass to be extruded is a little too wet, the filaments tend to stick together after extrusion and it will no longer be possible to dry them in individualized form: at the end of drying, large aggregates will be obtained which will retain a certain humidity.
  • a granulator also called extruder
  • a means of countering this difficulty is the addition of a drying excipient.
  • the drying excipient is chosen from maltodextrin, trehalose, native starch or L-leucine.
  • the drying step is carried out in the presence of a drying excipient, preferably maltodextrin.
  • the yeast may be derived from a strain chosen from the species Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces boulardii, preferably the yeast is derived from a strain chosen from the strain Saccharomyces cerevisiae filed on October 17, 2007 under the number CNCM I-3856 , the Saccharomyces cerevisiae strain registered on March 22, 2018 under number CNCM I-5298, the Saccharomyces boulardii strain registered on August 21, 2007 under number CNCM I-3799, the Saccharomyces cerevisiae strain registered on August 31, 2016 under number CNCM 1 -5129, the Saccharomyces cerevisiae strain deposited on August 31, 2016 under the number CNCM 1-5130 or the Saccharomyces cerevisiae strain deposited on February 9, 2011 under the number CNCM I-4444.
  • the yeast comes from a strain chosen from the species Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces boulardii, preferably the yeast comes from a strain chosen from the strain Saccharomyces cerevisiae filed on October 17, 2007 under the number CNCM I -3856, the Saccharomyces cerevisiae strain deposited on March 22, 2018 under number CNCM I-5298 and the Saccharomyces boulardii strain deposited on August 21, 2007 under number CNCM I-3799.
  • the bacteriophage(s) are chosen from those having antibacterial activity against strains of bacteria chosen from Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens or strains of the genus Salmonella, bacteria lactic.
  • the lactic acid bacteria can be chosen from: Lactobacillus fermentum (new taxonomy: Limosilactobacillus fermentum), Lb. delbrueckii, Lb. Reuter! (Limosilactobacillus reuteri), Lb. Casei (Lacticaseibacillus casei), Lb. Brevis (Levilactobacillus brevis), Lb. Perolens (Schleiferilactobacillus perolen), L. amylovorus.
  • Antibacterial activity means a lytic activity on the part of the bacteriophage on the bacterium following the infection of the bacterium by the latter.
  • lactic acid bacteria means Gram-positive bacteria, anaerobes that are partially oxygen-tolerant and capable of fermenting sugars into lactic acid.
  • Known bacteriophages capable of being used are chosen from T4 marketed by DSMZ under the reference DSM 4505 and belonging to the Myoviridae family, T5 marketed by DSMZ under the reference DSM 16353 and belonging to the Siphoviridae family or T7 marketed by DSMZ under the reference DSM 4623 and belonging to the Podoviridae family, or a mixture thereof or among the mixtures of SalmoFreshTM or FOPTM phages marketed by Intralytix Inc. Bacteriophages T4, T5 and T7 exhibit antibacterial activity against Escherichia coli.
  • the cocktail of 6 bacteriophages belonging to the Myoviridae family marketed under the reference SalmoFreshTM has antibacterial activity against pathogenic strains of the Salmonella genus, for example Salmonella enterica or Salmonella typhimurium, Salmonella Heidelberg, Salmonella Newport, Salmonella Kentucky, Salmonella infantis.
  • FOPTM is a unique and proprietary blend of fifteen individual lytic phages that provide broad protection against pathogenic strains of Salmonella enterica, Escherichia coli and Listeria monocytogenes.
  • the invention relates to a dry mixture of at least one yeast and/or of a yeast derivative and of at least one bacteriophage, characterized in that it is in the form of solid entities, each solid entity being composed of at least one yeast and/or at least one yeast derivative and at least one bacteriophage and optionally at least one drying excipient.
  • the invention relates to a dry mixture of at least one yeast and/or of a yeast derivative and of at least one bacteriophage, characterized in that it is in the form of solid entities, each solid entity consisting of at least one yeast and/or at least one yeast derivative and at least one bacteriophage and optionally at least one drying excipient.
  • the mixture is obtained according to a process described according to the first aspect.
  • the yeast derivatives are yeast hulls.
  • the dry mixture is divided into a powder form which comprises solid entities and, optionally, a drying excipient.
  • the solid entities are in the form of flakes, grains, vermicelli or granules.
  • the drying excipient is chosen from maltodextrin, trehalose, native starch or L-leucine.
  • yeasts and bacteriophages are chosen from those described above.
  • the subject of the present invention is a use of the dry mixture according to the second aspect or of the dry mixture obtained from the process according to the first aspect as a medicament in a composition intended to reduce the acidity of gastric juice.
  • the subject of the present invention is a use of the dry mixture according to the second aspect or of the dry mixture obtained from the method according to the first aspect in a composition for stimulation, protection, biocontrol and/ or plant nutrition.
  • the subject of the present invention is a use of the dry mixture according to the second aspect or of the dry mixture obtained from the process according to the first aspect in a food composition or in a food supplement.
  • the subject of the present invention is a use of the dry mixture according to the second aspect or of the dry mixture obtained from the method according to the first aspect in brewing and/or in oenology.
  • the subject of the present invention is a use of the dry mix according to the second aspect or of the dry mix obtained from the process according to the first aspect in bread making.
  • the subject of the present invention is a use of the dry mixture according to the second aspect or of the dry mixture obtained from the method according to the first aspect in the production of bioethanol.
  • Bacteriophage T5 or Phage T5 belonging to the family Siphoviridae which have a long non-contractile tail are Bacteriophage T5 or Phage T5 belonging to the family Siphoviridae which have a long non-contractile tail
  • These 3 phages are lytic phages which infect Escherichia coli.
  • SalmoFreshTM is a unique and exclusive mixture of six individual lytic phages which offer broad protection against pathogenic strains of the Salmonella genus, for example Salmonella enterica or else Salmonella typhimurium, Salmonella Heidelberg, Salmonella Newport, Salmonella Kentucky, Salmonella infantis.
  • FOPTM is a unique and proprietary blend of fifteen individual lytic phages that provide broad protection against pathogenic strains of Salmonella enterica, Escherichia coli and Listeria monocytogenes. The list of microorganisms used is given in Table 1 below.
  • phages in solution 9.9 ml of SGF are poured into a 60 ml pot in which 10 Opl of phage solution are added, which corresponds to a 1 E-02 dilution, the phage solution is diluted to obtain a phage concentration closest to that of the co-dried sample.
  • the jars are then incubated at 37° C. with shaking (100 rpm) to mimic passage through the stomach.
  • shaking 100 rpm
  • 15, 30, 60, 120 min of counting of phages by spots according to the method described below are carried out without forgetting to shake the pot before taking the aliquot for dilution .
  • Yeast counts are also carried out in gastric fluid at pH 2.5 at the beginning (T0) and at the end (T120) of the experiment according to the method described.
  • Simulated intestinal fluid is prepared according to the work of Ma et al.2008, Colom et al.2015 and Vinner et al.2018 (for 100ml):
  • Yeast counts are also carried out at the beginning (T0) and at the end (T120) of the experiment according to the method described.
  • the pH is remeasured at the end of the experiment.
  • the counts of the phages co-dried with the yeast are made after a step of rehydrating the powder in the Stomacher homogenizer and are carried out according to a method adapted from an internal procedure: Enumeration of bacteriophages by PFU.
  • TSA+YE agar Trypto casein Soy Agar (TSA) + yeast extract (YE) at 6 g/L of agar + cycloheximide (0.5%) and keep it supercooled;
  • TSB+YE broth Trpto casein Soy broth (TSB) + Yeast extract (YE);
  • the counting of the yeasts is carried out in parallel.
  • the dishes are then incubated for 3 days at 25°C.
  • Theoretical PFU/g DM titer (before drying) - this titer is calculated from the phage assayed titer of the phage suspension and the actual composition of the formulation produced in the laboratory which takes into account all the added ingredients ( yeast, fraction, protectors, additives etc.). To avoid biases, this title is reduced to the dry matter of the mixture (before drying).
  • each sample was brought into contact with 50ml of simulated gastric fluid at pH 2.5. After homogenization, the pH of each preparation was measured with a pH meter after homogenization.
  • UV resistance tests were carried out on the co-drying samples rehydrated for 3 min with a Stomacher homogenizer (1 g in 9 ml of sterile distilled water) and on the phages in solution in the UV chamber BS-03 + UV -MA with UV-C bulbs.
  • the measured irradiation is 12 mW/cm 2 .
  • three identical aliquots are made to be exposed for 3 different times (5, 15, 30 min). These tests are adapted from the tests carried out by the team of Ramirez et al. 2018. Phage and yeast survival is measured by the count method.
  • the counting at T0 is identical for the co-drying sample and for its rehydrated form, it is done according to the spot method described above, the counting of the phage in solution is done according to an internal procedure.
  • the counting of the yeasts is done at T0 and at T30 according to the method described.
  • Counts of phages according to the depth counting technique are carried out at different points in time: 0, 15, 30, 60, 90 days.
  • the a w (water activity) is measured at 25° C. at times T0, 30 and 90 d using an AquaLab Series 4TEV dew point hygrometer.
  • Water activity is an important parameter linked to the quality of dry products.
  • the values of a w are an indicator of the possibility of growth of microorganisms and production of toxins.
  • the value of the water activity varies between 0 (dry product to the point that all the water is bound to the product, and therefore without reactive quality) and 1 (pure water and without solute).
  • the aw indicates the share of free water in a product, that is to say available for example for the growth of microorganisms.
  • Example 1 General Process for Obtaining a Dry Yeast-Bacteriophage Mixture by Drying in a Fluidized Air Bed
  • the filaments obtained are collected in a 5L beaker and manually fragmented by strong shaking.
  • the drying is carried out on a Fluid Bed Dryer Tornado M501 (Sherwood) equipped with a multi-chamber support. 2 x 80 g of wet granules are placed in 2 glass drying chambers (diameter 60 mm and length 400 mm) equipped at their base with a 250 mesh stainless steel sieve (fluidizing air inlet).
  • the drying program is started and consists of two stages, each carried out at a temperature between 40 and 60°C.
  • the fluidizing and heating air is dehydrated by an air dehumidifier (Munters ComDry M190Y).
  • the drying is finished when the dry extract of the granules reaches at least 94%.
  • the packaging of the granules is done under vacuum to ensure the best stability of the product over time.
  • Example 2 General Process for Obtaining a Dry Yeast-Bacteriophage Mixture by Spray-Drying
  • a suspension of yeast hulls is partially reconstituted by dispersing 75.3 g of dry Safmannan® hulls in 336 g of demineralised water (preparation 1).
  • the pH of the yeast cell wall suspension is optionally adjusted to 7.0 with 10% sodium hydroxide.
  • Preparation 1 is cooled to a temperature between 2 and 10°C.
  • Preparation 2 42 g of trehalose dihydrate and 2.7 g of L-leucine are dissolved hot in 112 g of demineralised water (preparation 2). After cooling of preparation 2, 39 g of a suspension of SalmoFreshTM phages (2.5% dry extract) are added and mixed with vigorous stirring. Then this mixture is added to Preparation 1 with vigorous stirring to obtain the mixture to be dried comprising the phages, yeasts or yeast derivatives and the various supports or ingredients. This mixture is maintained under agitation at low temperature throughout the duration of the process.
  • the drying is carried out on a Mini Spray Dryer B-290 tower (Bûchi) equipped with a bi-fluid compressed air nozzle, a peristaltic pump, a cyclone for separating dry particles from the air wet and a polyester outlet filter.
  • the equipment is completed by an air dehumidifier (Munters ComDry M190Y) which treats the air entering the atomization tower.
  • the operating parameters are adjusted to dry the phages under gentle conditions by exposing them to moderate temperatures, thus the outlet temperature is controlled not to exceed 60°C.
  • Drying is complete when the humidity of the powder is less than 6%.
  • the atomized powder is vacuum packed.
  • Example 3 General Process for Obtaining a Dry Yeast-Bacteriophage Mixture by Drying by Freeze-Drying
  • a protective solution comprising the carriers or excipients is prepared: 18.9 g of trehalose dihydrate, 18.9 g of maltodextrin and 0.63 g of L-leucine are dissolved hot in 51.1 g of demineralised water. 7.9 g of a suspension of T5 phages (2.3% of dry extract) are added to this protective solution, after it has cooled. The mixture is kept under stirring and cooled. This mixture is added to 113 g of the preceding yeast cream, still stirring and cooling. It contains about 27.4% dry extract.
  • the liquid yeast/phage/protective mixture is distributed in trays or glass bottles in such a way that the layer height in the container does not exceed 15 mm. All containers are cooled and frozen quickly in the freezer at a temperature ⁇ -20°C.
  • the containers After freezing for a few hours, the containers are introduced into a laboratory freeze-dryer (Lyovapor L-200 Büchi), the shelves and the freeze-drying chamber of which will have been cooled beforehand.
  • a laboratory freeze-dryer Liscovapor L-200 Büchi
  • the counts were carried out with the in-depth phage technique.
  • the counts were carried out with the spot technique and with a starting sample which constitutes the dilution 1 E -02, the detection limit of this method is therefore 4 Log (hereinafter called ND ).
  • the T5 bacteriophages or the cocktail of SalmoFreshTM bacteriophages retain an activity that is entirely satisfactory for industrial use. Similar results were obtained with T4 and T7 bacteriophages and the FOP cocktail.
  • Example 4 Gastro-resistance test in gastric liquid with a mixture resulting from the co-drying by spraying of a yeast S. cerevisiae CNCM 1-3856 or yeast cell walls with bacteriophage T5 or with the cocktail of bacteriophages SalmoFreshTM
  • the phage alone in solution is inactivated below pH4 while it is possible to count the phages co-dried with yeast from pH 3.
  • the T5 phages co-dried with the CNCM 1-3856 yeast remain active for at least 30 min before falling below the detection threshold.
  • the T5 phages co-dried with the CNCM I-3856 yeast are in a more stable environment.
  • concentration in PFU/g of the samples can increase between times T0 and T30. This is most certainly due to the fact that the powder (in particular the atomized powder) can form agglomerates which do not always dissolve very quickly.
  • the yeasts of the samples placed in contact with gastric liquid at pH 2.5 were counted at the start (T0) then at the end (T120) of the experiment. The results are similar on all the tests, after 2 hours in an acid environment, the concentration of yeast is very slightly reduced.
  • Example 5 Gastro-resistance test in gastric liquid with a mixture resulting from the co-drying by atomization of a yeast with the cocktail of bacteriophages SalmoFreshTM
  • Example 6 Gastro-resistance test in gastric liquid with a mixture resulting from the co-drying of yeast cell walls either with bacteriophage T5 or with the cocktail of bacteriophages SalmoFreshTM. These samples were produced by co-drying by atomization. The survival of the phages seems identical for pH 3.0, 3.5, and 4.0 despite a weaker acidity neutralized by the samples compared to the other atomized tests using the yeast CNCM 1-3856.
  • Example 7 Resistance test in intestinal fluid with a mixture resulting from the co-drying of yeasts either with bacteriophage T5 or with the cocktail of bacteriophages SalmoFreshTM
  • the intestinal resistance tests are based on the same principle as the gastric tests, with the difference that only a pH is tested (pH 6.8). It appears that there is no impact on the survival of phages or yeasts in the intestinal fluid.
  • Example 8 Potential alkalinization test [0250] To determine which ingredients of the formulations had this alkalinization effect which makes it possible to protect the phages in an acid medium, five samples were carried out, all composed of 1% of SalmoFreshTM phages in MS (dry matter)/MST(total dry matter) and 99% of a single excipient used. 0.5g of these samples was brought into contact with 50ml of gastric fluid at pH 2.5. After dissolving the powders, the pH was measured.
  • Example 9 Test resistance to UV rays
  • the phages in solution and the co-spray-dried phages with yeast were exposed to UV-C for 30 min with points at 0, 5, 15, 30 minutes to count the phages.
  • the counts are carried out by spot as for the gastroresistance tests and with the same samples.
  • There first dilution available being dilution 1 E-01 (coming from rehydration with a Stomacher) the detection limit of the technique is 3 Log.

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Abstract

La présente demande concerne un procédé de fabrication d'un mélange sec d'au moins une levure et/ou d'un dérivé de levure et d'au moins un bactériophage, ledit mélange se présentant sous forme d'entités solides, chaque entité solide consistant en au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levure et au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il est effectué par le mélange d'au moins une levure et/ou d'un dérivé de levure et d'au moins un bactériophage en suspension et le séchage de ce mélange. Elle concerne également un mélange sec d'au moins une levure et/ou d'un dérivé de levure et d'au moins un bactériophage, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'entités solides, chaque entité solide consistant en au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levure et au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage et ses utilisations.

Description

Description
Titre : Mélange d’au moins un bactériophage et d’au moins une levure et leur procédé de séchage
Domaine technique
[0001] La présente invention concerne un procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins un bactériophage et d’au moins une levure et/ou un dérivé de levure, un mélange comprenant des entités solides dont chacune consiste enau moins un bactériophage et au moins une levure et/ou dérivé de levure et différentes utilisations d’un tel mélange.
Technique antérieure
[0002] Tant l’humain que les animaux ou les plantes peuvent jouer le rôle d’hôte pour des bactéries donnant lieu à des infections du type bactérien. L’emploi des bactériophages a été retenu pour traiter des maladies ou des troubles digestifs d’origine bactérienne. Par exemple, le document US20190255122 décrit une méthode de traitement ou de prévention d'une inflammation ou d'une douleur gastro-intestinale chez un être humain comprenant l'administration orale d'une composition comprenant un ou plusieurs bactériophages choisis parmi des bactériophages de la famille des Siphoviridae ou la famille des Myoviridae. En particulier, le ou les bactériophages sont choisis parmi LH01 - Myoviridae, LL5- Siphoviridae, T4D- Myoviridae et LL12- Myoviridae. Les bactériophages joueraient donc un rôle de prébiotiques permettant de protéger la microflore gastrointestinale.
[0003] Moye et al. (A Bacteriophage Cocktail Eliminates Salmonella typhimurium from the Human Colonie Microbiome while Preserving Cytokine Signaling and Preventing Attachment to and Invasion of Human Cells by Salmonella In Vitro. J Food Prot. 2019 Aug;82(8):1336-1349) a trait à des cocktails de bactériophages administrés aux patients humains afin d’éliminer les souches de Salmonella de l’intestin sans perturber le microbiote indigène. Ce cocktail permet aussi de prévenir le risque d’invasion de l’épithélium intestinal par les Salmonella. Le cocktail de bactériophages étudié dans cet article a été préparé à partir de trois préparations de phages commercialisées par Intralytix, Inc. : ListShield™, EcoShield PX™ et SalmoFresh™.
[0004] Dissanayake et al. (Bacteriophages Reduce Pathogenic Escherichia co// Counts in Mice Without Distorting Gut Microbiota. Front Microbiol. 2019 Sep 10;10:1984) utilise le même cocktail de bactériophages contre la souche d’ Escherichia coli O157/H7. A l’issue de cette étude, les chercheurs ont conclu qu’un tel cocktail a un effet antibiotique similaire à celui de l’ampicilline sans montrer un effet aussi néfaste sur le microbiote intestinal que cette dernière.
[0005] Par ailleurs, il est connu que les levures ont un rôle bénéfique tant dans la nutrition et la santé humaine, que dans la nutrition et la santé des animaux ou la nutrition et la santé des plantes. Par exemple, certaines souches de Saccharomyces cerevisiae sont considérées comme des levures probiotiques favorisant la santé intestinale. Comme vu plus haut, les bactériophages peuvent quant à eux être utilisés pour prévenir ou traiter une infection bactérienne chez l'homme, l'animal ou la plante. Il convient donc d’associer au moins un bactériophage et au moins une levure pour prévenir ou traiter les infections bactériennes tout en permettant aux levures de se développer et jouer leur rôle nutritionnel, protecteur et stimulant dans la santé humaine, animale ou des plantes.
[0006] Un concept d'innovation attractif consiste à associer levure probiotique et phages dans un même produit pour combiner leurs effets respectifs lors de l'application (effet antibactérien des phages et protection offerte par les levures). Par exemple, le document US20180161382 a trait à des compositions comprenant au moins un type de bactériophage en tant qu’agent prébiotique et au moins un agent probiotique pouvant être choisi parmi Saccharomyces boulardii ou Saccharomyces cerevisiae. Le bactériophage a un rôle de promoteur dans le développement des bactéries bénéfiques en diminuant les populations des bactéries néfastes et en libérant des nutriments dans son environnement destinés à être utilisés par les bactéries bénéfiques du système digestif chez un individu. Les agents prébiotiques et probiotiques cités sont rajoutés séparément au sein de la composition. Selon ce document, chaque bactériophage a une spécificité pour une bactérie indésirable. Par conséquent, en tant que tels, les bactériophages n'affectent directement aucun autre organisme dans le tube digestif ni aucun probiotique. Ainsi, des bactéries indésirables spécifiques seraient lysées et leur matériel cellulaire est disponible en tant que nutriments pour l'organisme probiotique ou endogène. En outre, en affaiblissant la population des bactéries indésirables spécifiques, les organismes probiotiques peuvent entrer en compétition avec succès et établir une colonisation produisant un environnement qui leur convient mais inhospitalier pour l'organisme indésirable.
[0007] La présentation de microorganismes sous forme sèche favorise la manipulation, la stabilité au stockage à long terme et la possibilité à être utilisée en gélules ou dans d'autres formes de présentation et de dosages adaptées pour des applications spécifiques (aliments pour animaux, denrées alimentaires, etc.).
[0008] A l’heure actuelle, différents procédés peuvent être utilisés pour le séchage de micro-organismes vivants mais tous ne permettent pas d’obtenir un taux de viabilité final satisfaisant. Parmi les procédés existants, il y a, par exemple la lyophilisation, le séchage par atomisation (spray drying) et le séchage en lit d’air fluidisé.
[0009] La demanderesse possède une grande connaissance des procédés d’obtention de levures sous forme sèche : levure à humidité intermédiaire surgelée, levure sèche active (ADY pour active dry yeast), levure instantanée active (IDY pour instant dry yeast).
[0010] Un exemple de procédé de séchage de micro-organismes vivants est donné dans le document FR 2708621 dans lequel des bactéries sont co-séchées avec des levures. Les bactéries ont des parois complexes peu sensibles à la dégradation par les protéases de levure, ce qui permet ce co-séchage.
[0011] Les bactériophages sont des virus qui infectent des bactéries. Ils présentent des parois constituées uniquement de protéines, parois qui sont plus fines et plus fragiles que celles des bactéries. Ainsi, lorsqu’il s’agit du séchage d’une suspension de bactériophages (une famille ou un mélange de phages), dans la plupart des cas il est nécessaire de mettre en oeuvre des supports pour favoriser la survie et/ou l’obtention d’un produit sec final ayant les propriétés requises (forme, granulométrie, extrait sec, porosité, propriété de solubilisation ou d’instantanéité, compressibilité etc.). Il est en effet impossible de sécher en l’état car le taux de matière sèche de la suspension (issue d’une culture de bactéries lysées ou d’une solution saline adaptée à la conservation des phages) est généralement très faible (< 5%). Le séchage dans ces conditions ne serait pas intéressant d’un point de vue économique et surtout trop délétère pour les phages.
[0012] Ainsi le support de séchage est intimement lié à la notion de formulation qui revient à mettre en oeuvre un ou plusieurs ingrédients ou supports ou excipients avec le micro-organisme pour que le séchage soit possible et facile.
[0013] De plus, et à condition de disposer de bactériophages sous forme de poudre, le mélange de poudres de levures et de bactériophages dans un produit industriel fini nécessiterait de surmonter certaines difficultés telles que garantir l'homogénéité de la poudre mélangée ou remplir des gélules ou d’autres formes de présentation et de dosage avec un volume limité. Pour éviter les problèmes liés à une forme poudre, il est possible d’imaginer un mélange de phages avec des levures sous forme de crème de levure ou de levure pressée. Cependant, la crème de levure et la levure pressée sont acides (pH 5,8) et pourraient être associées à une activité protéase qui pourrait modifier à la fois le titre phagique et l’activité lytique des phages sur la cible bactérienne.
[0014] Enfin, les phages sont des entités biologiques nécessitant une protection contre les stress généralement rencontrés pendant le stockage et selon leur utilisation (application sur un support inerte ou vivant, en atmosphère protégée ou à l’air libre, ingestion par un humain ou un animal, etc).
[0015] Ainsi, la prévention des infections bactériennes à l’aide de bactériophages peut être compliquée par les conditions difficiles rencontrées dans l'estomac animal ou humain (pH ~ 2-3), ainsi que par l'exposition à la bile et aux enzymes digestives dans le tractus gastro-intestinal, qui rendent les phages inactifs. De la même manière, la persistance transitoire des phages dans différents environnements végétaux reste une préoccupation majeure dans la lutte biologique mettant en oeuvre les phages dirigés contre des agents pathogènes des plantes. En effet, l'irradiation UV de la lumière du soleil peut inactiver le phage pendant le stockage et entraver son application potentielle en tant qu'agent de lutte biologique.
[0016] Il est également connu que les aliments et les boissons fermentés à base de levures fraiches peuvent aussi être sujets à des contaminations par des bactéries. Comme vu plus haut, des bactériophages peuvent alors être employés pour lutter contre ces bactéries. Parmi ces aliments et boissons, les produits de panification ou les boissons fermentées type vin ou bière peuvent être cités.
[0017] De même, lors de la production du bioéthanol, plus particulièrement de bioéthanol de première génération, il est nécessaire de contrôler la flore naturelle de bactéries lactiques dont la prolifération est susceptible d’affecter négativement le rendement de production. Ainsi, l’emploi des bactériophages peut servir à contrôler la flore de bactéries lactiques. Le bioéthanol correspond à de l’éthanol produit par fermentation de produits agricoles contenant des sucres fermentescibles.
[0018] Il y a donc un besoin de mélanges de levures et de bactériophages ayant une résistance aux variations de pH et aux rayons UV tout en assurant l’activité des levures ou des dérivés de levures et l’activité lytique des bactériophages.
[0019] Un phage est un virus qui infecte une bactérie. Selon l’invention, les termes « phage » et « bactériophage » sont interchangeables.
Résumé de l’invention
[0020] L’invention vient améliorer la situation.
[0021] Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, ledit mélange se présente sous forme d’entités solides, chaque entité solide consiste en au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levure et au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage, ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il est effectué par le mélange d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage en suspension et le séchage de ce mélange.
[0022] Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, caractérisé en ce qu’il se présente sous forme d’entités solides, chaque entité solide consistant en au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levures et au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage.
[0023] De préférence, ledit mélange est obtenu par le procédé selon le premier aspect.
[0024] Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en tant que médicament dans une composition destinée à diminuer l’acidité du jus gastrique.
[0025] Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect dans une composition pour la stimulation, la protection, le biocontrôle et/ou la nutrition des plantes.
[0026] Selon un cinquième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect dans une composition alimentaire ou dans un complément alimentaire.
[0027] Selon un sixième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en brasserie et/ou en oenologie.
[0028] Selon un septième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en panification.
[0029] Selon un huitième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect dans la production de bioéthanol.
Exposé de l’invention [0030] Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il est effectué par le mélange d’au moins une levure et/ou dérivé de levure ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage et le séchage de ce mélange.
[0031] Ledit mélange se présente sous forme d’entités solides, chaque entité solide est composée d’au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage.
[0032] Le terme « composé de » se lit comme « consistant en ».
[0033] Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, le mélange se présente sous forme d’entités solides, chaque entité solide consiste en au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levure et au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage, ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il est effectué par le mélange d’au moins une levure et/ou dérivé de levure ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage et le séchage de ce mélange.
[0034] Un tel procédé permet de produire des formulations stables contenant des phages assurant leur protection optimale et leur acheminement vers les sites d'action, tels que le tractus gastro-intestinal ou la phyllosphère des plantes (parties aériennes). Les formes sèches sont privilégiées en raison de leur facilité de manipulation et de leur stabilité de stockage à long terme, par exemple à des températures ambiantes, évitant ainsi la nécessité d'une chaîne de froid pour le stockage.
[0035] Les levures ou dérivés de levure, utilisées comme probiotiques en santé animale, humaine et végétale ont été caractérisées pour leur tolérance et leur résistance à plusieurs facteurs de stress associés à la fois aux procédures de fabrication (processus en aval, par exemple séchage, stockage) et aux conditions stressantes du tractus intestinal (pH gastrique, bile et enzymes digestives). [0036] La combinaison de levure et/ou dérivé de levure et de phage constitue une alternative pour protéger les phages par la levure ou ses dérives et les véhiculer jusqu'au site cible. Ainsi, les levures (ou ses dérivés) ont un double rôle : d’un côté elles jouent le rôle de probiotiques et, d’un autre côté, elles servent de support lors de l’étape de séchage, comme montré par les exemples ci-dessous. Cette solution permet de maximiser les effets bénéfiques de chacun des composants de la combinaison.
[0037] Par ailleurs, et notamment dans le cas d’une utilisation pour la protection des végétaux, le mélange obtenu par le procédé de co-séchage de phage avec de la levure et/ou des dérivés de levure permet d’améliorer la protection des phages vis-à-vis des conditions environnementales et des effets UV (conditions in vitro), tout en conservant l’activité et les propriétés bénéfiques de la levure.
[0038] Un tel mélange permet de réduire les coûts associés à l’emploi des compositions comprenant à la fois des levures ou dérivés de levure et des bactériophages en optimisant la gestion des stocks et leur approvisionnement. Il est donc prêt à l’emploi, réduit les risques de pertes et n’engendre pas de surcoûts liés au mélange de levures sèches ou dérivés de levure avec des bactériophages, tout en évitant les risques d’erreurs de manipulation dans la gestion des microorganismes, comme par exemple les erreurs de dosage. En effet, ces erreurs peuvent survenir notamment lors de la préparation des mélanges de poudres de levures lorsque l’utilisateur doit rajouter les ferments dans des proportions massiques spécifiques. L’emploi de ce mélange facilite la préparation des compositions impliquant l’utilisation des levures ou dérivés de levure.
[0039] Un autre avantage notable de ce procédé par rapport à un mélange sec/sec classique entre au moins une levure et un bactériophage réside dans l’homogénéité du mélange obtenu. Ainsi, le risque de perte d’homogénéité est fortement minimisé. Ceci est dû au fait que chaque entité solide composant le mélange sec obtenu grâce au procédé selon l’invention comprend simultanément des levures ou dérivés de levure et des bactériophages. Ce mélange sec permet également de limiter la manipulation de produits pulvérulents et donc de limiter les risques sanitaires. Autrement dit, un mélange sec unique est utilisé. [0040] Ainsi, cette nouvelle approche de mélanger les levures avec des bactériophages avant leur séchage permet l’amélioration de performances, l’élimination des risques d’erreur de manipulation liés à l’emploi de plusieurs poudres ou micro-organismes sur un même site, la praticité et la simplification, la réduction des coûts, la limitation très forte des pertes suite aux changements de commandes et aléas du marché.
[0041] Le procédé selon l’invention peut être mis en oeuvre en utilisant des levures actives et/ou des dérivés de levure.
[0042] Le terme “levure active”, qui est synonyme de “levure vivante” ou « levure fraîche », désigne une population de cellules de levure qui sont métaboliquement actives. Lorsque des levures dites « fraîches » sont employées, l’activité désigne la viabilité de celles-ci.
[0043] Un dérivé de levure selon l’invention est défini comme une fraction obtenue lors de la dégradation de la levure par action physique ou chimique, par exemple par plasmolyse, hydrolyse ou autolyse de la levure. Les produits dérivés de levure sont tous les produits susceptibles d'être obtenus à partir de cellules de levure entières ou fractionnées, par action physique ou chimique. Ils comprennent en particulier des extraits de levure obtenus par autolyse ou autolysats, des écorces de levure, des mannoprotéines, des levures inactivées. Ils se présentent le plus souvent sous forme de poudre plus ou moins fine après broyage ou en suspension dans un milieu de réhydratation, sous forme de crème de levure ou de levure pressée. De façon tout à fait avantageuse, le dérivé de levure est de l’écorce de levure ou de l’extrait de levure. De façon encore plus avantageuse, le dérivé de levure est de l’écorce de levure.
[0044] Les écorces de levure peuvent être obtenues ou préparées selon des techniques connues de l'homme du métier, notamment par lyse enzymatique ou par lyse mécanique (séparation, concentration, etc.).
[0045] Dans un mode de réalisation, les écorces sont produites par lyse enzymatique (autolyse par leurs propres enzymes protéolytiques ou hétérolyse) de cellules de levures suivie d'une séparation des parties solubles et insolubles, par exemple par des moyens physiques, comme la centrifugation, et récupération de la partie insoluble. La partie insoluble est ainsi typiquement récupérée par élimination de la partie soluble par centrifugation. La partie insoluble correspond aux écorces de levures. La partie soluble résultant de ce procède, de couleur claire et de faible turbidité, est appelée extrait de levure.
[0046] De préférence, le procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage est caractérisé en ce qu’il comprend :
- fournir au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure, de préférence sous forme de crème, et au moins un bactériophage en suspension ;
- mélanger ladite levure et/ou dérivé de levure avec ledit au moins un bactériophage de manière à former un mélange;
- effectuer une étape de séchage du mélange de manière à former un mélange sec ;
- récupérer le mélange sec.
[0047] De préférence, les bactériophages sont en suspension dans une solution aqueuse, de préférence saline. L’homme du métier saura adapter une telle solution selon ses besoins, par exemple en choisissant une solution saline tamponnée.
[0048] Selon certains modes de réalisations, l’étape de séchage s’effectue par lyophilisation ou atomisation ou sur lit d’air fluidisé.
[0049] De préférence, le taux de matière sèche de levure et/ou de dérivé de levures au sein du mélange avant l’étape de séchage d’au moins une levure ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage est situé entre 20 à 60% par rapport à la quantité totale de matière sèche dans le mélange à sécher.
[0050] De préférence, l’étape de séchage peut être précédée d’une étape de déshydratation permettant d’augmenter le taux de matière sèche. Cette étape de déshydratation est ensuite suivie d’une étape de séchage proprement dit permettant d’obtenir le mélange sec final à récupérer. Autrement dit, l’étape de séchage s’effectuerait en deux temps.
[0051] De préférence, l’étape de séchage peut être suivie d’une étape selon laquelle le mélange sec est encore divisé, par exemple, en le broyant. [0052] Le séchage par lyophilisation permet d’obtenir un lyophilisât qui peut être broyé sous forme de paillettes ou d’une poudre fine alors que le séchage par atomisation permet d’obtenir un produit sec finement divisé.
[0053] Le principe du séchage par atomisation (en anglais - spray drying) est de déshydrater des gouttelettes de liquide dans un courant de gaz chaud (air par exemple) qui circule dans une tour de séchage. Le liquide à sécher (solution ou suspension ou mélange, avec un extrait sec adapté pour ne pas être trop visqueux) est nébulisé sous forme de fines gouttelettes à l’aide d’un dispositif d’atomisation (buse ou turbine) qui est placé généralement en haut de la tour. Il s’agit d’un séchage par entraînement, les gouttelettes se transforment presque instantanément en particules solides qui sont séparées de l’air en fin de séchage pour obtenir une poudre fine ou une poudre micro-granulée, selon la configuration du séchoir (simple, double ou multiple effet).
[0054] Si les températures d’entrée d’air sont généralement élevées, par exemple comprises entre 100 et 300°C, préférentiellement entre 120 et 250°C, la température de l’air de sortie et surtout la température du produit à l’intérieur de la tour est plus basse de plusieurs dizaines de degrés car les particules, qui sont entourées d’un film d’eau, se refroidissent lors du changement d’état de l’eau liquide en vapeur. L’homme du métier saura adapter ces températures en fonction de ses besoins.
[0055] Néanmoins même si la température du produit est plus basse, cette technique peut être destructrice pour la déshydratation de produits vivants comme les micro-organismes. Il est cependant possible de préserver partiellement la viabilité en mettant en oeuvre des conditions opératoires (notamment ajout d’un support ou d’additifs de séchage dans la formulation du mélange initial et choix du barème de température) adaptées et plus ménageantes. Par ailleurs le temps de séjour des particules dans la tour de séchage peut aussi impacter la viabilité, il sera donc nécessaire de le minimiser mais en prenant soin de viser une humidité finale de la poudre qui soit compatible avec la durée de vie souhaitée du produit (conservation). [0056] Le séchage par atomisation de la suspension de phages seule telle qu’elle est obtenue (lysat bactérien) n’est pas possible car l’extrait sec est trop faible et l’opération ne serait pas intéressante d’un point de vue économique mais pourrait être aussi délétère pour les micro-organismes (mise en oeuvre de températures d’air élevées). Afin d’augmenter l’extrait sec, selon l’invention on utilise les levures et/ou dérivés de levure, et éventuellement des ingrédients ou excipients secondaires ayant un effet particulier (protecteur par exemple).
[0057] Une attention particulière sera apportée à l’extrait sec visé de la préparation à sécher : il faut en effet que le liquide ne dépasse pas une certaine viscosité pour pouvoir être pompé et transformé en fines gouttelettes par le dispositif d’atomisation.
[0058] La préparation du mélange se fait jusqu’à dissolution ou dispersion complète des ingrédients ou supports et celui-ci sera séché en tour d’atomisation le plus rapidement possible pour éviter toute dégradation du produit ou prolifération microbienne. De préférence le mélange sera maintenu à basse température pendant toute la durée du séchage. L’homme du métier saura choisir la température nécessaire.
[0059] Les paramètres de séchage sont adaptés en fonction de la configuration de la tour et du dispositif d’atomisation mais aussi des caractéristiques du mélange (viscosité, extrait sec), le but étant d’obtenir une poudre fine avec une humidité finale maximum de 10%, de préférence maximum 8%, de préférence encore 6%.
[0060] En plus des levures et/ou dérivés de levures, des supports complémentaires de séchage peuvent être cités : tels que la maltodextrine, l’amidon natif, le tréhalose, la L-leucine.
[0061] D’une manière générale, la lyophilisation (en anglais - freeze drying) est une technique de séchage permettant la dessiccation sous vide de produits liquides ou semi pâteux qui ont été préalablement congelés. Cette technique est souvent utilisée pour des produits fragiles qui ne supportent pas un séchage direct, elle permet ainsi d’assurer la stabilité de produits périssables, de stopper le métabolisme des produits biologiques et d’obtenir des produits pulvérulents facilement réhydratables. Ainsi un produit lyophilisé possède une très grande affinité pour le solvant qu’il contient (généralement de l’eau). [0062] D’un point de vue pratique, cette opération comporte 3 phases importantes et on parle ainsi de cycle de lyophilisation.
[0063] La première phase est une opération de congélation du produit qui permet de solidifier la matrice et surtout de cristalliser l’eau qu’il contient sous forme de glace. Pour cela il est nécessaire d’abaisser suffisamment la température du produit en dessous de sa température de solidification totale. L’homme du métier saura choisir la température nécessaire.
[0064] La deuxième phase est une étape de dessiccation primaire ou sublimation. Pendant cette phase il est nécessaire d’abaisser la pression dans la chambre de lyophilisation donc de réaliser un vide poussé. Ainsi la pression devra être inférieure à la tension de vapeur de la glace, à la température considérée. Par ailleurs la température du produit devra rester inférieure à la température de fusion commençante.
[0065] La troisième phase est une étape de dessiccation secondaire qui permet de terminer la déshydratation en éliminant les dernières traces d’eau par désorption. Elle se caractérise par une pression dans la chambre la plus basse possible et par une température de produit élevée mais qui restera en dessous de sa température de dénaturation.
[0066] Ainsi avec cette dernière phase il sera possible d’obtenir des produits secs présentant une humidité résiduelle très basse (par exemple < 1 %).
[0067] Enfin les opérations annexes du cycle de lyophilisation sont :
[0068] - la préparation du produit à lyophiliser qui consiste généralement à l’associer à un mélange d’excipients ou de supports à effet protecteur et cryoprotecteur ;
[0069] - la protection du produit lyophilisé final qui est souvent instable et peut reprendre rapidement le solvant qu’il contenait (hygroscopicité si produit aqueux) du fait de sa structure fortement poreuse. Dans ce cas il s’agit d’isoler le lyophilisât de l’environnement extérieur en le conditionnant de façon adaptée.
[0070] - la suspension de phages est formulée avec des adjuvants ou des excipients qui auront un rôle de support et/ou d’agent cryoprotecteur. Il est nécessaire d’augmenter l’extrait sec (par exemple autour de 25-30 %) pour concentrer la suspension de phages et réduire ainsi la quantité d’eau à éliminer. Selon l’invention, cette augmentation de la matière sèche est rendue possible par le mélange avec les levures et/ou dérivés de levures. L’homme du métier saura choisir un ratio « bactériophage/levure et/ou dérivé de levure » afin d’obtenir la meilleure viabilité des phages après séchage.
[0071] - la préparation du mélange se fait jusqu’à dissolution ou dispersion complète des excipients ou de la levure et/ou du dérivé de levure.
[0072] En plus des levures et dérivés de levures, d’autres supports de séchage peuvent être cités : tels que la maltodextrine, l’amidon natif, le tréhalose, la L-leucine.
[0073] Lors de cette étape le mélange sera complètement refroidi (par exemple < 8°C) et réparti dans des plateaux ou des flacons en respectant une certaine hauteur de couche (par exemple 15 mm), avant de subir la phase de congélation à au moins -20°C dans un congélateur ou un surgélateur.
[0074] Après contrôle de la solidification du mélange qui doit être totale (eau complètement cristallisée), les récipients ou flacons sont placés sur les étagères du lyophilisateur préalablement refroidies par la mise en route du piège frigorifique (par exemple - 55°C).
[0075] L’homme de métier saura choisir comment mettre en oeuvre les étapes de dessication et adapter les températures en conséquence.
[0076] A la fin du cycle de lyophilisation, le lyophilisât a généralement l’aspect d’une meringue poreuse. Selon les cas cette meringue est réduite en poudre fine par broyage doux et de préférence cette opération sera menée dans une enceinte à hygrométrie contrôlée (pour éviter sa reprise en eau), avant le conditionnement rapide sous vide ou sous atmosphère inerte.
[0077] De préférence, le procédé selon l’invention comprend en outre une étape d’extrusion du mélange déshydraté de manière à former un mélange extrudé, l’étape de séchage s’effectuant en lit fluidisé sur le mélange extrudé de manière à former un mélange sec. [0078] Le séchage en lit fluidisé permet d’obtenir un produit sec granulaire ou sous forme de vermicelles.
[0079] De manière générale, le principe du séchage en lit fluidisé est de déshydrater des particules solides humides dans un courant d’air chaud. Ces particules humides solides sont obtenues dans ce cas après une étape de granulation qui permet d’obtenir une forme et une densité de solide appropriées pour la mise en fluidisation dans l’air. Les particules (appelées encore granules) se retrouvent ainsi en suspension dans l’air chaud sans se toucher et c’est toute leur surface de contact avec l’air qui peut être séchée de façon uniforme. Les granules secs se caractérisent par une humidité résiduelle inférieure à 10%, de préférence à 8%, de préférence encore à 5%, ce qui assure une bonne stabilité dans le temps des produits (conservation).
[0080] L’avantage de cette technique est de pouvoir réaliser des séchages ménageants à basse température ce qui en fait une méthode de choix pour le séchage des micro-organismes vivants ou des produits biologiques fragiles. La taille des particules à sécher, après l’étape de granulation, est importante et plus celle-ci sera petite, plus le produit séchera vite. Le temps d’exposition à la chaleur du produit sera également réduit ce qui favorisera un meilleur taux de viabilité après séchage.
[0081] D’un point de vue applicatif cette technique est couramment utilisée pour le séchage de levure de boulangerie et on obtient dans ce cas de la levure sèche instantanée sous forme de granules poreux qui sont capables de se réhydrater très rapidement dans de l’eau ou dans un mélange pulvérulent (farine) auquel de l’eau est ajoutée.
[0082] La granulation, appelée aussi l’extrusion, est l’étape précédant le séchage en lit fluidisé et ne peut se faire que sur des produits pâteux ou semi-pâteux ayant un extrait sec compatible avec cette opération de passage à travers une filière. Par exemple la filtration d’une crème de levure donne de la levure pressée qui a cette propriété.
[0083] En effet la masse à sécher est mise en forme dans un granulateur (appelé aussi extrudeur) qui produit des filaments fins continus, qui sont ensuite fragmentés en courts vermicelles pour obtenir les granules. Si la masse à extruder est un peu trop humide, les filaments ont tendance à se coller entre eux après l’extrusion et il ne sera plus possible de les sécher sous forme individualisée : on obtiendra en fin de séchage de gros agrégats qui conserveront une certaine humidité.
[0084] L’homme du métier saura adapter l’humidité de la masse à extruder selon ses besoins.
[0085] Par exemple, un moyen de contrer à cette difficulté est l’ajout d’un excipient de séchage. De préférence, l’excipient de séchage est choisi parmi la maltodextrine, le tréhalose, l’amidon natif ou la L-leucine.
[0086] De préférence, l’étape de séchage s’effectue en présence d’un excipient de séchage, de préférence la maltodextrine.
[0087] La levure peut être issue d’une souche choisie parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae et Saccharomyces boulardii, de préférence la levure est issue d’une souche choisie parmi la souche Saccharomyces cerevisiae déposée le 17 octobre 2007 sous le numéro CNCM I-3856, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée le 22 mars 2018 sous le numéro CNCM I-5298, la souche de Saccharomyces boulardii déposée le 21 août 2007 sous le numéro CNCM I-3799, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée le 31 août 2016 sous le numéro CNCM 1-5129, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée le 31 août 2016 sous le numéro CNCM 1-5130 ou la souche Saccharomyces cerevisiae déposée le 9 février 2011 sous le numéro CNCM I-4444.
[0088] De préférence, la levure est issue d’une souche choisie parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae et Saccharomyces boulardii, de préférence la levure est issue d’une souche choisie parmi la souche Saccharomyces cerevisiae déposée le 17 octobre 2007 sous le numéro CNCM I-3856, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée le 22 mars 2018 sous le numéro CNCM I-5298 et la souche de Saccharomyces boulardii déposée le 21 août 2007 sous le numéro CNCM I-3799.
[0089] De préférence, le ou les bactériophages sont choisis parmi ceux ayant une activité antibactérienne contre des souches de bactéries choisies parmi Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens ou des souches du genre Salmonella, les bactéries lactiques. Les bactéries lactiques peuvent être choisies parmi : Lactobacillus fermentum (nouvelle taxonomie : Limosilactobacillus fermentum), Lb. delbrueckii, Lb. Reuter! (Limosilactobacillus reuteri), Lb. Casei (Lacticaseibacillus casei), Lb. Brevis (Levilactobacillus brevis), Lb. Perolens (Schleiferilactobacillus perolen), L. amylovorus. Par activité antibactérienne, on comprend une activité lytique de la part du bactériophage sur la bactérie suite à l’infection de la bactérie par celui-ci.
[0090] Par « bactéries lactiques » on entend des bactéries à Gram positif, anaérobies partiellement tolérantes à l'oxygène capables de fermenter les sucres en acide lactique.
[0091 ] Des bactériophages connus et susceptibles d’être utilisés sont choisis parmi T4 commercialisé par DSMZ sous la référence DSM 4505 et appartenant à la famille des Myoviridae, T5 commercialisé par DSMZ sous la référence DSM 16353 et appartenant à la famille des Siphoviridae ou T7 commercialisé par DSMZ sous la référence DSM 4623 et appartenant à la famille des Podoviridae, ou un mélange de ceux-ci ou parmi les mélanges de phages SalmoFresh™ ou FOP™ commercialisés par Intralytix Inc. Les bactériophages T4, T5 et T7 présentent une activité antibactérienne contre I’ Escherichia coli. Le cocktail de 6 bactériophages appartenant à la famille des Myoviridae commercialisé sous la référence SalmoFresh™ présente une activité antibactérienne contre des souches pathogènes du genre Salmonella, par exemple Salmonella enterica ou bien Salmonella typhimurium, Salmonella Heidelberg, Salmonella Newport, Salmonella Kentucky, Salmonella infantis. FOP™ est un mélange unique et exclusif de quinze phages lytiques individuels qui offrent une large protection contre les souches pathogènes de Salmonella enterica, Escherichia coli et Listeria monocytogenes.
[0092] Selon un deuxième aspect, l’invention concerne un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, caractérisé en ce qu’il se présente sous forme d’entités solides, chaque entité solide étant composée d’au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levures et d’au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage.
[0093] Le terme « composé de » se lit comme « consistant en ». [0094] Ainsi, selon un deuxième aspect, l’invention concerne un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, caractérisé en ce qu’il se présente sous forme d’entités solides, chaque entité solide consistant en au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levures et au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage.
[0095] De préférence, le mélange est obtenu selon un procédé décrit selon le premier aspect.
[0096] De préférence, les dérivés de levures sont des écorces de levure.
[0097] De préférence, le mélange sec est divisé sous forme pulvérulente qui comprend des entités solides et, éventuellement un excipient de séchage.
[0098] De préférence, les entités solides se présentent sous forme de paillettes, de grains, de vermicelles ou de granules.
[0099] De préférence, l’excipient de séchage est choisi parmi la maltodextrine, le tréhalose, l’amidon natif ou la L-leucine.
[0100] De préférence, les levures et bactériophages sont choisis parmi ceux décrits précédemment.
[0101] Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en tant que médicament dans une composition destinée à diminuer l’acidité du jus gastrique.
[0102] Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect dans une composition pour la stimulation, la protection, le biocontrôle et/ou la nutrition des plantes.
[0103] Plus particulièrement, celle-ci est pour le traitement ou la protection des plantes contre les maladies produites ou provoquées par des agents pathogènes, notamment fongiques, bactériens ou viraux, pour l'induction ou la stimulation chez une plante de défenses naturelles contre des agents pathogènes. [0104] Selon un cinquième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect dans une composition alimentaire ou dans un complément alimentaire.
[0105] Selon un sixième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en brasserie et/ou en oenologie.
[0106] Selon un septième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect en panification.
[0107] Selon un huitième aspect, la présente invention a pour objet une utilisation du mélange sec selon le deuxième aspect ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon le premier aspect dans la production de bioéthanol.
Matériel et méthodes
[0108] Bactériophage T4 ou Phage T4 appartenant à la famille des Myoviridae qui ont une longue queue contractile
[0109] Bactériophage T5 ou Phage T5 appartenant à la famille des Siphoviridae qui ont une longue queue non contractile
[0110] Bactériophage T7 ou Phage T7 appartenant à la famille des Podoviridae qui ont une petite queue non contractile
[0111] Ces 3 phages sont des phages lytiques qui infectent Escherichia coli.
[0112] SalmoFresh™ est un mélange unique et exclusif de six phages lytiques individuels qui offrent une large protection contre des souches pathogènes du genre Salmonella, par exemple Salmonella enterica ou bien Salmonella typhimurium, Salmonella Heidelberg, Salmonella Newport, Salmonella Kentucky, Salmonella infantis.
[0113] FOP™ est un mélange unique et exclusif de quinze phages lytiques individuels qui offrent une large protection contre les souches pathogènes de Salmonella enterica, Escherichia coli et Listeria monocytogenes. [0114] La liste des microorganismes utilisés est donnée dans le Tableau 1 ci- dessous.
[0115] [Tableau 1]
Figure imgf000021_0001
[0116] La liste des réactifs utilisés est donnée dans le Tableau 2 ci-dessous.
[0117] [Tableau 2]
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000022_0001
[0118] Liquide Gastrique Simulé (SGF)
[0119] Du liquide gastrique simulé est préparé selon les travaux de Ma et al. (2008), Colom et al. (2015) et Vinner et al. (2018) (pour 100ml) :
[0120] - 0,2g NaCI
[0121] - 0,4g pepsine (500 U/mg)
[0122] - Eau distillée QSP 100 ml
[0123] - pH ajusté avec HCl ou NaOH gamme de pH réalisée : 2,5, 3,0, 3,5, 4,0
[0124] Les activités enzymatiques (U/ml) ont été reproduites selon les travaux de Adouard et al.2019. Une fois préparé le liquide est préchauffé à 37°C.
[0125] Pour les échantillons de co-séchage 50ml de SGF sont versés dans un pot de 180ml et 0,5g de l’échantillon est ajouté, ce qui correspond à une dilution 1 E- 02.
[0126] Pour les phages en solution (contrôles) 9,9 ml de SGF sont versés dans un pot de 60ml dans lequel 10Opl de solution de phage sont ajoutés, ce qui correspond à une dilution 1 E-02, la solution de phages est diluée pour obtenir une concentration de phages la plus proche de celle de l’échantillon co-séché.
[0127] Les pots sont ensuite mis à incuber à 37°C avec agitation (100rpm) pour mimer le passage dans l’estomac. Aux temps 0 (juste après ajout de l’échantillon), 15, 30, 60, 120 min des dénombrements de phages par spots selon la méthode décrite plus bas sont réalisés sans oublier d’agiter le pot avant prélèvement de l’aliquote pour dilution.
[0128] Des dénombrements levures sont aussi réalisés dans le liquide gastrique à pH 2,5 au début (T0) et en fin (T120) d’expérience selon la méthode décrite.
[0129] Le pH est remesuré à la fin de l’expérience. [0130] Liquide intestinal simulé (SI F)
[0131] Du liquide intestinal simulé est préparé selon les travaux de Ma et al.2008, Colom et al.2015 et Vinner et al.2018 (pour 100ml) :
[0132] - 0,68g KH2PO4
[0133] - 1 g de bile porcine
[0134] - 2,16g de pancréatine
[0135] - Eau distillée QSP 100 ml
[0136] - pH ajusté à 6,8 avec NaOH
[0137] Les activités enzymatiques ont été reproduites selon les travaux de Adouard et al.2019. Une fois préparé le liquide est préchauffé à 37°C.
[0138] Pour les échantillons de co-séchage 50ml de SI F sont versés dans un pot de 180ml dans lequel 0,5g de l’échantillon est ajouté, ce qui correspond à une dilution 1 E-02.
[0139] Pour les phages en solution (contrôles) 9,9 ml de SI F sont versés dans un pot de 60ml dans lequel 10Opl de solution de phage sont ajoutés, ce qui correspond à une dilution 1 E-02, la solution de phages est diluée pour obtenir une concentration de phages la plus proche possible de la concentration de l’échantillon co-séché. Les pots sont ensuite mis à incuber à 37°C avec agitation (100rpm) pour mimer le passage dans l’intestin. Aux temps 0 (juste après ajout de l’échantillon), 30, 60, 120 min (Minekus et al. 2014) des dénombrements de phages par spots selon la méthode décrite plus bas ci-après au paragraphe 141 sont réalisés sans oublier d’agiter le pot avant prélèvement de l’aliquote pour dilution.
[0140] Des dénombrements de levures sont aussi réalisés au début (T0) et en fin (T120) d’expérience selon la méthode décrite.
[0141] Le pH est remesuré à la fin de l’expérience.
[0142] Dénombrement des phages et levures co-sechées
[0143] Les dénombrements des phages co-séchés avec la levure se font après une étape de réhydratation de la poudre dans l’homogénéisateur Stomacher et sont réalisés selon une méthode adaptée d’une procédure interne : Dénombrement de bactériophages par PFU.
[0144] Réhydratation des échantillons de co-séchage
[0145] - peser 1 g d’échantillon de co-séchage phage-levure à l’aide d’une balance de précision et le placer dans un sac de Stomacher ;
[0146] - ajouter 9ml d’eau distillée stérile à 37°C dans le sac puis le passer 3 min dans l’homogénéisateur Stomacher à vitesse moyenne.
[0147] Technique de dénombrement des phages en profondeur
[0148] - faire fondre la gélose TSA+YE (Trypto caseine Soja Agar (TSA) + Extrait de levure (YE) à 6g/L d’agar + cycloheximide (0,5%) et la maintenir en surfusion ;
[0149] - préparer des boîtes de Pétri 90 mm avec environ 15 ml du milieu TSA+YE + cycloheximide (0,5%), les mettre sécher sous hotte pendant 30min ;
[0150] - à partir d’une colonie provenant d’une culture fraiche, ensemencer 20ml de bouillon TSB+YE (Trypto caseine Soja bouillon (TSB) + Extrait de levure (YE);
[0151] - incuber sous agitation jusqu’à obtenir une culture en début de phase exponentielle de croissance (exemple : arrêter la culture à une DO comprise entre 0,2 et 0,7 pour E. coli, Salmonella et Listeria) ;
[0152] - relever la valeur de DO.
[0153] Préparer des dilutions décimales de l’échantillon de co-séchage réhydraté dans des tubes Eppendorf contenant 900pL de solution SM
[0154] Dans un tube 13ml contenant 1 OOpl de solution de bactérie hôte (DO comprise entre 0,2 et 0,7), ajouter 1 OOpl de la dilution de phage voulue et laisser en contact 10 min
[0155] Ajouter 3ml de milieu TSA+YE 6g/l d’agar + cycloheximide et couler sur une boite de gélose précédemment coulée et séchée. Laisser solidifier.
[0156] Incuber à la température de croissance de la bactérie hôte pendant 24h.
[0157] Technique de dénombrement des phages par spots
[0158] Préparation des boites gélosées [0159] - faire fondre la gélose à 6g/L d’agar puis ajouter 0.5% d’cycloheximide, la maintenir en surfusion.
[0160] - à partir d’une colonie provenant d’une culture fraiche, ensemencer 20ml de bouillon TSB+YE. Incuber sous agitation jusqu’à obtenir une culture en début de phase exponentielle de croissance (exemple : arrêter la culture à une DO comprise entre 0,2 et 0,7 pour E. coli, Salmonella et Listeria). Préparer les boites de Petri carrées avec 25 ml du milieu TSA+YE + cycloheximide (0.5%), les mettre à sécher sous hotte pendant 30 min.
[0161] - relever la valeur de DO.
[0162] - dans un tube 13ml contenant 300pl de solution de bactérie hôte (DO comprise entre 0,2 et 0,7), ajouter 9ml de milieu TSA+YE 6g/l d’agar + cycloheximide et couler sur une boite de gélose précédemment coulée et séchée ;
[0163] - laisser solidifier.
[0164] Préparation des dilutions décimales de la solution de phages
[0165] - remplir des colonnes de puits de microplaques 96 puits avec 180 pi de tampon SM en commençant à la colonne 3 et en sautant 1 colonne sur 2 afin de permettre l’ensemencement par spot.
[0166] - ajouter dans les puits de la première colonne 10Opl de solution provenant de la réhydratation de l’échantillon qui constituent ici la première dilution au 10e (1 E- 01 ).
[0167] - à l’aide d’une pipette multicanaux, prélever 20pl dans la première colonne et transférer dans les puits de la colonne de dilutions suivantes et ainsi de suite jusqu’à la dernière dilution.
[0168] Dépôt sur boite
[0169] Il est nécessaire de prélever 10pl sur une ligne de microplaque (96 puits) avec une pipette multicanaux adaptée.
[0170] Ensuite, diviser la boite de Petri carrée préalablement ensemencée avec la bactérie hôte en 4 colonnes et déposer les spots de 10pl des dilutions de phages/levures, laisser sécher et incuber à la température de croissance de la bactérie hôte pendant 24h.
[0171] Le dénombrement des levures est réalisé en parallèle.
[0172] Une fois l’échantillon réhydraté, 10Opil sont prélevés pour réaliser des dilutions décimales dans des tubes Eppendorf remplis avec 900pl d’eau distillée stérile.
[0173] 1 OOpl de la dilution d’intérêt sont prélevés, déposés sur boite de gélose YM et étalés.
[0174] Les boites sont ensuite mises à incuber 3 jours à 25°C.
[0175] Indépendamment de la technique, les résultats sont exprimés comme suit :
[0176] Titre théorique PFU/g MS (avant séchage) - ce titre est calculé à partir du titre dosé en phage de la suspension de phages et de la composition réelle de la formulation réalisée au laboratoire qui tient compte de tous les ingrédients ajoutés (levure, fraction, protecteurs, additifs etc.). Pour éviter les biais, ce titre est ramené à la matière sèche du mélange (avant séchage).
[0177] Titre dosé PFU/g MS (après séchage) - c’est le titre réel tel qu’il est dosé sur le produit fini sec et ramené à l’extrait réel du produit fini sec.
[0178] Pertes en phages (Log10 PFU/g) sont égales à la différence entre :
[0179] Log10 (titre théorique PFU/g MS avant séchage) - Log10 (titre dosé PFU/g MS après séchage) et exprimées en Log10 PFU/g.
[0180] Tests de gastro résistance
[0181] Des tests de résistance gastro-intestinal in vitro simplifiés ont été réalisés sur les échantillons de co-séchage. Ces tests ont pour but d’analyser la survie des phages et des levures par dénombrements à différents points au cours du temps dans des liquides gastro-intestinaux simulés. Ces tests reprennent la méthode de dénombrement décrite plus haut sans la phase de réhydratation avec l’homogénéisateur Stomacher qui ici se fait directement dans le liquide simulé.
[0182] 0.5g d’échantillon sont mis dans 50ml de liquide. Une gamme de pH a été réalisée pour le test gastrique allant de 2,5 à 4,0. [0183] Potentiel d’alcalinisation
[0184] Dans le but de définir quel excipient est responsable de la remontée du pH gastrique, des échantillons de co-séchage ont été produits par lyophilisation de la solution SalmoFresh™ avec chaque excipient individuellement dans les mêmes proportions (99%MS excipient versus 1 %MS phage). Les échantillons ont été réalisés au laboratoire.
[0185] 0.5g de chaque échantillon a été mis en contact avec 50ml de liquide gastrique simulé à pH 2,5. Après homogénéisation, le pH de chaque préparation a été mesuré au pHmètre après homogénéisation.
[0186] Tests de résistance aux UV
[0187] Des tests de résistance aux UV ont été réalisés sur les échantillons de coséchage réhydratés 3 min avec un homogénéisateur Stomacher (1 g dans 9ml d’eau distillée stérile) et sur les phages en solution dans la chambre UV BS-03 +UV-MA avec des ampoules UV-C. L’irradiation mesurée est de 12mW/cm2. Pour chaque forme d’échantillon, trois aliquotes identiques sont réalisées pour être exposées pendant 3 temps différents (5, 15, 30 min). Ces tests sont adaptés d’après les tests réalisés par l’équipe de Ramirez et al. 2018. La survie des phages et des levures est mesurée par la méthode de dénombrement.
[0188] Le dénombrement à T0 est identique pour l’échantillon de co-séchage et pour sa forme réhydratée, il se fait selon la méthode des spots décrite plus haut, le dénombrement du phage en solution se fait selon une procédure interne.
[0189] Pour les échantillons de co-séchage, environ 1 ,5g sont pesés et étalés dans une boite de Petri ouverte au centre de la chambre. Après exposition aux UV, 1 g est pesé à la balance de précision puis réhydraté 3 min dans un homogénéisateur Stomacher pour que les phages soient dénombrés selon la méthode des spots décrite plus haut.
[0190] Pour les échantillons de co-séchage réhydratés, 1 ml sont déposés dans une boite de Petri ouverte au centre de la chambre. Après exposition aux UV, 10Opl sont prélevés pour dénombrer les phages selon la méthode des spots décrite plus haut. [0191] Pour les phages en solution, 1 ml sont déposés dans une boite de Pétri ouverte au centre de la chambre. La concentration de phage de la solution est le plus possible approchée de la concentration de phage dans l’échantillon de coséchage par dilutions. Après exposition aux UV, 10Opil sont prélevés pour dénombrer les phages selon une procédure interne.
[0192] Le dénombrement des levures se fait à T0 et à T30 selon la méthode décrite.
[0193] T ests de stabi I ité
[0194] La stabilité des produits de co-séchage phages-levures stockés dans des sachets ou des piluliers sous vides a été étudiée sur 3 mois dans 3 conditions de température et d’humidité :
[0195] - 25°C/60%HR
[0196] - 30°C/65%HR
[0197] - 40°C/75%HR
[0198] Des dénombrements de phages selon la technique de dénombrement en profondeur sont réalisés à différents points dans le temps : 0, 15, 30, 60, 90 jours. L’aw (activité de l’eau) est mesurée à 25°C aux temps T0, 30 et 90j à l’aide d’un hygromètre à point de rosée AquaLab Série 4TEV.
[0199] L'activité de l'eau est un paramètre important lié à la qualité des produits secs. Les valeurs de aw sont un indicateur de la possibilité de croissance de microorganismes et de production de toxines. La valeur de l'activité de l'eau varie entre 0 (produit sec au point que toute l'eau est liée au produit, et donc sans qualité réactive) et 1 (eau pure et sans soluté).
[0200] En effet, l’aw indique la part de l’eau libre dans un produit, c’est à dire disponible par exemple pour la croissance de micro-organismes. Plus l’aw est élevée, plus il y a d’eau disponible pour le développement de ces micro-organismes. Des valeurs d'activité de l'eau supérieures à 0,6 pourraient favoriser la croissance des microorganismes.
Exemples Exemple 1 : procédé général d’obtention d’un mélange sec levure-bactériophage en séchant en lit d’air fluidisé
[0201] Les étapes du procédé :
[0202] - contrôle du pH de la crème de levure ou des dérivés de levure et éventuellement ajustement du pH à 7,0 avec de la soude à 10 % ;
[0203] - filtration de la crème de levure sur un filtre à plaques sous pression : obtention de levure pressée (LP)
[0204] - malaxage de la LP avec la suspension de phages et les agents dessiccant ou protecteurs (aussi appelé excipients de séchage)
[0205] - granulation et mise en forme par extrusion
[0206] - séchage des granules dans un séchoir à lit d’air fluidisé
[0207] - contrôle de l’humidité finale des granules secs et conditionnement sous vide ou sous atmosphère inerte
[0208] Ainsi, 16,5 g d’une suspension de phages SalmoFresh™ (0,6 % matière sèche), 2 g de tréhalose dihydraté, 2 g de maltodextrine et 0,065 g de L-Leucine sont ajoutés à 200 g de levure pressée (30 % extrait sec). Après avoir malaxé pendant 1 min dans un batteur mélangeur Alphamix Matter 5 L équipé d’une palette comme mobile de mélange, 60 g d’amidon (fécule de pomme de terre) sont ajoutés et le mélange est malaxé pendant 1 min. La masse malaxée contenant environ 40 % d’extrait sec est ensuite extrudée sur extrudeuse DRC i10 équipée d’une grille d’extrusion avec des orifices de 1 mm. Les filaments obtenus sont recueillis dans un bêcher de 5L et fragmentés manuellement par de fortes secousses. Le séchage est réalisé sur un Fluid Bed Dryer Tornado M501 (Sherwood) équipé d’un support multichambre. 2 x 80 g de granules humides sont placés dans 2 chambres de séchage en verre (de diamètre 60 mm et longueur 400 mm) équipées à leur base d’un tamis inox 250 mesh (entrée air fluidisation). Le programme de séchage est lancé et comprend deux étapes, chacune menée à une température entre 40 et 60°C. L’air de fluidisation et de chauffage est déshydraté par un déshumidificateur d’air (Munters ComDry M190Y). [0209] Le séchage est terminé quand l’extrait sec des granules atteint au moins 94 %. Le conditionnement des granules se fait sous vide pour assurer la meilleure stabilité du produit dans le temps.
Exemple 2 : procédé général d’obtention d’un mélange sec levure-bactériophage en séchant par atomisation
[0210] Les étapes du procédé :
[0211] - préparation du mélange par ajout de la levure ou des dérivés de levures et, éventuellement, des ingrédients de séchage dans la suspension de phages
[0212] - mélange vigoureux jusqu’à dissolution ou dispersion complète de tous les ingrédients
[0213] - contrôle du pH du mélange et éventuellement ajustement à 7,0 avec de la soude à 10 %
[0214] - séchage du mélange dans une tour d’atomisation
[0215] - contrôle de l’humidité finale et conditionnement sous vide ou sous atmosphère inerte de la poudre fine
[0216] Ainsi, une suspension d’écorces de levure est partiellement reconstituée en dispersant 75,3 g d’écorces sèches Safmannan® dans 336 g d’eau déminéralisée (préparation 1 ). Le pH de la suspension d’écorces de levure est éventuellement ajusté à 7,0 par de la soude à 10 %. La préparation 1 est refroidie à une température comprise entre 2 et 10 °C.
[0217] Ensuite, 42 g de tréhalose dihydraté et 2,7 g de L-leucine sont dissous à chaud dans 1 12 g d’eau déminéralisée (préparation 2). Après refroidissement de la préparation 2, 39 g d’une suspension de phages SalmoFresh™ (2,5 % extrait sec) sont ajoutés et mélangés sous forte agitation. Puis ce mélange est ajouté à la préparation 1 sous une forte agitation pour obtenir le mélange à sécher comprenant les phages, les levures ou les dérivés de levures et les différents supports ou ingrédients. Ce mélange est maintenu sous agitation à basse température pendant toute la durée du process. [0218] Le séchage est réalisé sur une tour Mini Spray Dryer B-290 (Bûchi) équipée d’une buse bi-fluide à air comprimé, d’une pompe péristaltique, d’un cyclone de séparation des particules sèches de l’air humide et d’un filtre de sortie en polyester. L’équipement est complété par un déshumidificateur d’air (Munters ComDry M190Y) qui traite l’air en entrée de la tour d’atomisation.
[0219] Les paramètres opératoires (température et débit d’air, taux d’alimentation de la solution à sécher...) sont ajustés pour sécher les phages dans des conditions ménageantes en les exposant à des températures modérées, ainsi la température de sortie est contrôlée pour ne pas dépasser 60°C.
[0220] Le séchage est terminé quand l’humidité de la poudre est inférieure à 6%. La poudre atomisée est conditionnée sous vide.
Exemple 3 : procédé général d’obtention d’un mélange sec levure-bactériophage en séchant par lyophilisation
[0221] Les étapes du procédé :
[0222] - préparation du mélange par ajout de levures ou dérivés de levure et, éventuellement, d’autres ingrédients dans la suspension de phages
[0223] - mélange vigoureux jusqu’à dissolution ou dispersion complète de tous les ingrédients
[0224] - contrôle du pH du mélange et éventuellement ajustement à 7,0 avec de la soude à 10 %
[0225] - refroidissement et congélation rapide à au moins -20°C
[0226] - séchage du mélange congelé dans un lyophilisateur sous pression réduite
[0227] - broyage du lyophilisât et contrôle de l’humidité finale
[0228] - conditionnement sous vide ou sous atmosphère inerte du produit sec finement divisé.
[0229] Ainsi, le pH d’une crème de levure fraîchement récoltée (extrait sec de 21 ,3%) est ajusté à 7,0 par de la soude à 10 %. Une solution protectrice comprenant les supports ou excipients est préparée : 18,9 g de tréhalose dihydraté, 18,9 g de maltodextrine et 0,63 g de L-leucine sont dissous à chaud dans 51 ,1 g d’eau déminéralisée. 7,9 g d’une suspension de phages T5 (2,3 % d’extrait sec) sont ajoutés à cette solution protectrice, après son refroidissement. Le mélange est maintenu sous agitation et refroidi. Ce mélange est ajouté à 1 13 g de la crème de levure précédente, toujours sous agitation et refroidi. Il contient environ 27,4 % d’extrait sec.
[0230] Le mélange liquide levure/phages/protecteurs est réparti dans des plateaux ou des flacons en verre de telle façon que la hauteur de couche dans le récipient ne dépasse pas 15 mm. Tous les récipients sont refroidis et congelés rapidement au congélateur à une température < -20°C.
[0231] Après congélation de quelques heures, les récipients sont introduits dans un lyophilisateur de laboratoire (Lyovapor L-200 Büchi) dont les étagères et la chambre de lyophilisation auront été préalablement refroidies.
[0232] Comme évoqué précédemment, une dessiccation primaire suivie d’une dessiccation secondaire sont mises en route et le process de lyophilisation est arrêté au bout de 80 à 96 h. Les lyophilisats sont finement réduits en poudre de façon douce à l’aide d’un broyeur à mortier et éventuellement passés au tamis à maille 500 pm. L’humidité finale est contrôlée et doit être < 3 %. Un conditionnement sous vide est réalisé rapidement pour éviter l’altération du produit au cours du temps.
[0233] Les mélanges utilisés dans les tests décrits ci-après ont été séchés selon l’un des trois procédés décrits en Exemples 1 -3.
[0234] Dans le cadre des tests de stabilité, les dénombrements ont été réalisés avec la technique des phages en profondeur. Dans le cadre des autres tests, les dénombrements ont été réalisés avec la technique des spots et avec un échantillon de départ qui constitue la dilution 1 E-02, la limite de détection de cette méthode est donc de 4 Log (nommé ci-après ND).
[0235] Confrontés à des conditions acides, les phages semblent s’inactiver brutalement sous un certain seuil qui se situerait aux alentours de pH 3,5 (Ma ét al. 2008, Davis et al. 1985). Une gamme de quatre pH (2.5, 3,0, 3.5, 4,0) a donc été testée pour encadrer ce seuil et analyser l’ensemble du spectre que l’on peut retrouver dans l’estomac à jeûn ou après absorption d’un bol alimentaire (test gastro-résistance en liquide gastrique).
[0236] Quel que soit le mode de séchage employé, les bactériophages T5 ou le cocktail de bactériophages SalmoFresh™ conservent une activité tout à fait satisfaisante pour un usage industriel. Des résultats analogues ont été obtenus avec les bactériophages T4 et T7 et le cocktail FOP.
Exemple 4. Test gastro résistance en liquide gastrique avec un mélange issu du co-séchage par atomisation d’une levure S. cerevisiae CNCM 1-3856 ou écorces de levures avec le bactériophage T5 ou avec le cocktail de bactériophages SalmoFresh™
Figure imgf000033_0001
[0237] Le phage seul en solution est inactivé sous pH4 tandis qu’il est possible de dénombrer les phages co-séchés avec de la levure à partir de pH 3.
[0238] A pH 2.5, aucune des formes de phage testées n’est restée active.
[0239] A pH 3, les phages T5 co-séchés avec la levure CNCM 1-3856 restent actifs pendant au moins 30 min avant de passer sous le seuil de détection.
[0240] A pH 3.5, après 2h, une perte en phages T5 co-séchés avec la levure CNCM 1-3856 est observée en Log PFU/g plus importante.
[0241] A pH 4, les phages T5 co-séchés avec la levure CNCM I-3856 sont dans un environnement plus stable. A noter que la concentration en PFU/g des échantillons peut augmenter entre les temps T0 et T30. Cela est très certainement dû au fait que la poudre (notamment la poudre atomisée) peut former des agglomérats qui ne se dissolvent pas toujours très rapidement. [0242] Les levures des échantillons mis en contact avec le liquide gastrique à pH 2.5 ont été dénombrées au début (T0) puis à la fin (T120) de l’expérience. Les résultats sont similaires sur tous les essais, après 2h dans un environnement acide, la concentration de levure est très faiblement diminuée.
Figure imgf000034_0001
Exemple 5. Test gastro résistance en liquide gastrique avec un mélange issu du co-séchage par atomisation d’une levure avec le cocktail de bactériophages SalmoFresh™
Figure imgf000034_0002
[0243] En comparant les résistances gastrique des solutions de phages seuls (T5 et SalmoFresh™) entre elles, une meilleure survie est observée des phages présents dans la solution SalmoFresh™. Il est également à noter que la solution de SalmoFresh™ contient un cocktail de phages et que la sensibilité au pH de chacun des phages le composant peut être différente.
[0244] Il est à noter que le co-séchage avec des levures par atomisation permet aux phages de rester actifs pendant 30 min même à pH 2,5 avant de passer sous le seuil de détéction.
[0245] A pH 3,0, 3,5 et 4,0, les échantillons restent actifs pendant les 2h de l’expérience.
[0246] De même, les levures des échantillons mis en contact avec le liquide gastrique à pH 2,5 ont été dénombrées au début (T0) puis à la fin (T120) de l’expérience. Les résultats sont similaires sur tous les essais, après 2h dans un environnement acide, la concentration de levure est très faiblement diminuée.
Figure imgf000035_0001
Exemple 6. Test gastro résistance en liquide gastrique avec un mélange issu du co-séchage d’écorces de levure soit avec le bactériophage T5 soit avec le cocktail de bactériophages SalmoFresh™.
Figure imgf000035_0002
[0247] Ces échantillons ont été réalisés par co-séchage par atomisation. La survie des phages semble identique pour les pH 3,0, 3.5, et 4,0 malgré une acidité plus faiblement neutralisée par les échantillons comparée aux autres essais atomisés utilisant la levure CNCM 1-3856.
[0248] Il a été observé à pH3 que les phages T5 survivent 60 min et les phages de la solution SalmoFresh™ survivent durant les 120 min de l’expérience. L’hypothèse probable est que la poudre obtenue avec ces essais étant encore moins soluble que la poudre atomisée obtenues avec des levures vivantes, la diffusion des phages se ferait plus tardivement, ce qui pourrait participer à leur protection. Cette hypothèse pourrait aussi expliquer pourquoi plus de phages sont dénombrés après 30 min d’exposition comparé aux dénombrements réalisés à T0 min.
Exemple 7. Test de résistance en liquide intestinal avec un mélange issu du co-séchage de levures soit avec le bactériophage T5 soit avec le cocktail de bactériophages SalmoFresh™
Figure imgf000036_0001
[0249] Les tests de résistance intestinale reposent sur le même principe que les tests gastriques, à la différence que seul un pH est testé (pH 6,8). Il en ressort qu’il n’y a pas d’incidence sur la survie des phages ou des levures du liquide intestinal.
Figure imgf000036_0002
Exemple 8. Test potentiel d’alcalinisation [0250] Pour déterminer quels ingrédients des formulations avaient cet effet d’alcalinisation qui permet de protéger les phages dans un mileu acide, cinq échantillons ont été réalisés tous composés de 1 % de phages de SalmoFreshTM en MS(matière sèche)/MST(matière sèche totale) et 99% d’un seul excipient utilisé. 0,5g de ces échantillons a été mis en contact avec 50ml de liquide gastrique à pH 2,5. Après dissolution des poudres, le pH a été mesuré.
[0251] Les échantillons séchés avec la levure et la L-leucine ont provoqué des variations de pH significatives. Avec un pH mesuré à 3,59, l’échantillon avec de la levure a même permis de dépasser le seuil d’inactivation de 3,5. Il est possible d’observer que c’est la levure qui constitue le support de séchage le plus efficace et donc qui est présente en quantité significative dans les différentes formulations contrairement à la L-leucine.
Figure imgf000037_0001
Exemple 9. Test résistance aux rayons UV
Figure imgf000037_0002
[0252] Les phages en solution et les phages co-séchés par atomisation avec de la levure ont été exposés aux UV-C pendant 30 min avec des points à 0, 5, 15, 30 minutes pour dénombrer les phages. Les dénombrements sont réalisés par spot comme pour les tests de gastrorésistance et avec les mêmes échantillons. La première dilution disponible étant la dilution 1 E-01 (venant de la réhydratation au Stomacher) la limite de détection de la technique est de 3 Log.
[0253] Il est possible d’observer que les phages en solution (T5 et phages de SalmoFresh™) sont très sensibles aux UV-C. Les phages de la solution SalmoFresh™ne sont plus actifs dès 5 min d’exposition et les phages T5 ne résistent que 5 min. A l’inverse, les phages co-séchés avec de la levure ne sont que très légèrement affectés par les UV-C.
[0254] Le dénombrement des levures avant et après 30 min d’exposition a permis de démontrer que pour toutes les configurations testées, l’exposition aux UV-C n’avait aucune incidence sur leur survie
Exemple 10. Test stabilité dans le temps
[0255] Des tests de stabilité sur 3 mois ont été réalisés à 25°C/60%HR , 30°C/65%HR et 40°C/75%HR sur les échantillons co-séchés par atomisation. L’aw (activité de l’eau) et la perte de phages ont été mesurés en début (T0 jour) au milieu (T30 jours) et en fin (T90 jours) d’expérience.
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000038_0002
[0256] Les valeurs très faibles d’aw indiquent que la part de l’eau libre dans le produit obtenu est très faible, suffisamment pour empêcher la croissance des microorganismes et donc pour assurer la stabilité du produit dans le temps.

Claims

39 Revendications
[Revendication 1] Procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, ledit mélange se présentant sous forme d’entités solides, chaque entité solide consistant en au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levure et au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage, ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il est effectué par le mélange d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage en suspension et le séchage de ce mélange.
[Revendication 2] Procédé de fabrication d’un mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il comprend :
- fournir au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure, de préférence sous forme de crème et au moins un bactériophage en suspension ;
- mélanger ladite au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure avec ledit au moins un bactériophage de manière à former un mélange;
- effectuer une étape de séchage du mélange de manière à former un mélange sec ;
- récupérer le mélange sec.
[Revendication 3] Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l’étape de séchage s’effectue par lyophilisation ou atomisation ou sur lit d’air fluidisé.
[Revendication 4] Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’étape de séchage s’effectue en présence d’un excipient de séchage, de préférence la maltodextrine.
[Revendication 5] Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la levure est issue d’une souche choisie parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae et Saccharomyces boulardii, de préférence la levure est issue d’une souche choisie parmi la souche Saccharomyces cerevisiae déposée le 17 octobre 2007 sous le numéro CNCM I-3856, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée 40 le 22 mars 2018 sous le numéro CNCM I-5298 et la souche de Saccharomyces boulardii déposée le 21 août 2007 sous le numéro CNCM I-3799.
[Revendication 6] Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le ou les bactériophages sont choisis parmi ceux ayant une activité antibactérienne contre des souches de bactéries choisies parmi Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens ou des souches du genre Salmonella, les bactéries lactiques.
[Revendication 7] Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les dérivés de levure sont des écorces de levure.
[Revendication 8] Mélange sec d’au moins une levure et/ou d’un dérivé de levure et d’au moins un bactériophage, caractérisé en ce qu’il se présente sous forme d’entités solides, chaque entité solide consistant e au moins une levure et/ou au moins un dérivé de levure et au moins un bactériophage et éventuellement au moins un excipient de séchage.
[Revendication 9] Mélange sec selon la revendication 8, caractérisé en ce que les entités solides se présentent sous forme de paillettes, de grains, de vermicelles ou de granules.
[Revendication 10] Mélange sec selon l’une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que la levure est issue d’une souche choisie parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae et Saccharomyces boulardii, de préférence la levure est issue d’une souche choisie parmi la souche Saccharomyces cerevisiae déposée le 17 octobre 2007 sous le numéro CNCM I-3856, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée le 22 mars 2018 sous le numéro CNCM I-5298 et la souche de Saccharomyces boulardii déposée le 21 août 2007 sous le numéro CNCM I-3799.
[Revendication 11] Mélange sec selon l’une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que le ou les bactériophages sont choisis parmi ceux ayant une activité antibactérienne contre des souches de bactéries choisies parmi Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens ou des souches du genre Salmonella, les bactéries lactiques. 41
[Revendication 12] Mélange sec selon l’une des revendications 8 à 11 , caractérisé en ce que les dérivés de levure sont des écorces de levure.
[Revendication 13] Mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 pour utilisation comme médicament.
[Revendication 14] Mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 pour utilisation dans le traitement de l’acidité du jus gastrique.
[Revendication 15] Mélange sec selon l'une des revendications 8 à 12 ou mélange sec obtenu à partir du procédé selon l'une des revendications 1 à 7 pour utilisation dans une composition pour le traitement de l'acidité du jus gastrique..
[Revendication 16] Utilisation du mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon l’une des revendications 1 à 7 dans une composition pour la stimulation, la protection, le biocontrôle et/ou la nutrition des plantes.
[Revendication 17] Utilisation du mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon l’une des revendications 1 à 7 dans une composition alimentaire ou dans un complément alimentaire.
[Revendication 18] Utilisation du mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon l’une des revendications 1 à 7 en brasserie et/ou en oenologie.
[Revendication 19] Utilisation du mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon l’une des revendications 1 à 7 en panification.
[Revendication 20] Utilisation du mélange sec selon l’une des revendications 8 à 12 ou du mélange sec obtenu à partir du procédé selon l’une des revendications 1 à 7 dans la production de bioéthanol.
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