WO2023054951A1 - N-아실화된 글리콜 키토산을 포함하는 고실내 약물 제어 방출형 제형 - Google Patents

N-아실화된 글리콜 키토산을 포함하는 고실내 약물 제어 방출형 제형 Download PDF

Info

Publication number
WO2023054951A1
WO2023054951A1 PCT/KR2022/013938 KR2022013938W WO2023054951A1 WO 2023054951 A1 WO2023054951 A1 WO 2023054951A1 KR 2022013938 W KR2022013938 W KR 2022013938W WO 2023054951 A1 WO2023054951 A1 WO 2023054951A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
drug
hgc
dex
pharmaceutical composition
inner ear
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/013938
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
허강무
김다해
박용호
박지현
Original Assignee
충남대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 충남대학교산학협력단 filed Critical 충남대학교산학협력단
Priority to CN202280063205.7A priority Critical patent/CN117956981A/zh
Publication of WO2023054951A1 publication Critical patent/WO2023054951A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0046—Ear
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals

Definitions

  • the present invention claims priority based on Korean Patent Application No. 10-2021-0131088 filed on October 1, 2021.
  • the present invention relates to an intratympanic drug controlled release formulation comprising N-acylated glycol chitosan.
  • Intratympanic administration is a widely used local administration method to the inner ear, in which a drug is injected and administered into a space called a middle ear cavity or tympanic cavity inside the eardrum. Intratympanic administration delivers the drug to the inner ear more efficiently than systemic administration and has fewer side effects.
  • Drugs administered in the tympanic chamber are delivered by diffusion into the inner ear through the Round Window Membrane (RWM). Therefore, in order to efficiently deliver a drug to the inner ear, the drug must be in contact with the round window membrane at a high concentration for a long time.
  • RWM Round Window Membrane
  • the drug located in the middle ear cavity by intratympanic administration is easily discharged to the outside through the Eustachian tube, it is difficult to contact the round window membrane at a high concentration for a long time. Therefore, prolonging drug retention in the middle ear cavity is considered an approach to improve drug delivery to the inner ear.
  • thermogel exhibiting thermo-reversible sol-gel transition properties is suitable for intratympanic drug delivery because it can be injected in a sol state and gels in the body.
  • the thermogel can carry the drug by mixing with the drug in a sol state.
  • a thermogel mixed with a drug is injected, it is solidified into a gel by body temperature.
  • Poloxamer a representative thermogel, has been used for drug delivery to the inner ear.
  • poloxamer requires a high concentration (more than 20 wt%) for effective thermogelation, has insufficient biodegradability and physical safety, and side effects have been reported.
  • Glycol chitosan is a water-soluble derivative of quinic acid and has promising properties as a biomaterial such as biocompatibility, biodegradability, and water solubility at neutral pH (Korean Publication No. 10-2012-0020386 (2012.03.08). )).
  • GC Glycol chitosan
  • a pharmaceutical composition for treating inner ear diseases for intratympanic administration containing N-acylated glycol chitosan is provided.
  • a formulation for intratympanic administration comprising N-acylated glycol chitosan is provided.
  • R 1 is H or an acyl group having 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, or 1 to 6 carbon atoms
  • n is 10 to 10000, 10 to 9500, or 10 to 9000 , 10-8500, 10-8000, 10-7500, 10-7000, 10-6500, 10-6000, 10-5500, 10-5000, 10-4500, 10-4000, 10-3500, 10-3000, 10 to 2500, 10 to 2000, 10 to 1500, 10 to 1000, 10 to 900, 10 to 800, 10 to 700, 10 to 600, or 10 to 500.
  • the polymer is in a sol state that can be administered by injection at room temperature, and may be a thermogel that undergoes phase transition to a gel by body temperature when administered in the tympanic chamber.
  • the polymer is a drug carrier capable of carrying a drug, and when a mixture of the polymer and the drug is administered into the tympanic cavity, the phase is changed into a gel containing the drug.
  • the gelled pharmaceutical composition increases the residence time in the middle ear cavity, thereby increasing the contact time between the drug and the round window membrane, and can continuously deliver the drug to the inner ear.
  • side effects such as inflammatory reaction and loss of auditory hair cells do not appear, and it has been confirmed that safety is high, and such safety has not been previously known.
  • the polymer since the polymer includes a hydrophilic glycol chitosan backbone and a hydrophobic acyl group (for example, a hexanoyl group), it can carry both a hydrophilic drug and a hydrophobic drug.
  • a hydrophilic glycol chitosan backbone and a hydrophobic acyl group for example, a hexanoyl group
  • R 1 may be H, an acetyl group, or a hexanoyl group.
  • the polymer may have a degree of polymerization (DP) of 150 to 400, 150 to 350, 150 to 300, 150 to 250, 200 to 400, 200 to 350, 200 to 300, or 200 to 250.
  • DP degree of polymerization
  • the temperature at which the sol-gel phase transition occurs is 30 to 34 ° C, 30 to 33 ° C, 30 to 32 ° C, 31 to 34 ° C, 31 to 33 ° C, 31 to 32 ° C, 32 to 34 ° C, or 32 to 33 °C.
  • the polymer may include 8 to 10% of N-acetylated glycol chitosan units, 30 to 40% of N-hexanoylated glycol chitosan units, and the balance of glycol chitosan units polymerized.
  • the polymer may be a compound composed of a unit represented by Formula 2 below.
  • R 2 is H or an acetyl group (-CO-CH 3 )
  • R 3 is a hexanoyl group (-CO-CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 )
  • y is 10 to 10000, 10 to 9500, 10 to 9000, 10 to 8500, 10 to 8000, 10 to 7500, 10 to 7000, 10 to 6500, 10 to 6000, 10 to 5500, 10 to 5000, 10 to 4500, 10 to 4000, 10 to 3500 , 10 to 3000, 10 to 2500, 10 to 2000, 10 to 1500, 10 to 1000, 10 to 900, 10 to 800, 10 to 700, 10 to 600, or 10 to 500.
  • the drug for treating the inner ear disease may be a corticosteroid-based drug.
  • the corticosteroid drugs are, for example, clobetasol, halometasone, dexamethasone, diflorasone, fluocinonide, halobetasol, cancer Amcinonide, Halcinonide, Hydrocortisone, Fluticasone, Mometasone, Fluocinolone, Desonide, Prednisone , Methylprednisolone, Prednisolone, hydrates or solvates thereof, or combinations thereof, and according to one embodiment, it may be dexamethasone, dexamethasone phosphate, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the drug for treating the inner ear disease may be dispersed in the polymer.
  • the drug for treating inner ear disease may be the drug itself, a form dispersed in microspheres, or a combination thereof.
  • the composition may be obtained by mixing and dispersing the drug-dispersed microspheres with a polymer or by mixing and dispersing the drug-dispersed microspheres, the drug itself, and the polymer.
  • the microspheres are microparticles made of biocompatible and biodegradable polymers, and are well known in the art of drug delivery systems.
  • the material constituting the microspheres is not particularly limited as long as it is a polymer having excellent biocompatibility and biodegradability.
  • the biocompatible polymer may be PLGA, PEG, PLA, PGA, PHA, a copolymer thereof, or a combination thereof.
  • the microspheres may be made of a biodegradable polymer having a molecular weight of 5000 to 200,000.
  • the microspheres may have a diameter of 10 to 100 ⁇ m.
  • the pharmaceutical composition may include 0.5 to 4%, 0.6 to 4%, 0.7 to 4%, 0.8 to 4%, 0.9 to 4%, or 1 to 4% by weight of the polymer.
  • the pharmaceutical composition is maintained in the tympanic chamber for 30 minutes or more, 90 minutes or more, 3 hours or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, 8 days or more. longer than 9 days, longer than 10 days, longer than 11 days, or longer than 12 days.
  • the pharmaceutical composition may release a hydrophilic drug in an immediate release and a hydrophobic drug in a sustained release in the tympanic cavity.
  • the immediate release refers to a property in which the drug is released immediately after administration so that the initial effect appears quickly
  • the sustained release refers to a property in which the drug is slowly and continuously released to maintain an effective therapeutic amount or effective concentration for a long time.
  • the effective therapeutic amount means an amount effective to improve or reduce hearing loss in a subject to be treated, and may vary depending on the severity of the subject, the administered drug, and the administration method.
  • the mixing ratio of the polymer and the drug is 4:0.5 to 4:4, 4:1 to 4:4, 4:1.5 to 4:4, 4:2 to 4:4, 4:2.5 to 4: 4, 4:3 to 4:4, 4:3.5 to 4:4, 4:0.5 to 4:3.5, 4:1 to 4:3.5, 4:1.5 to 4:3.5, 4:2 to 4:3.5, 4:2.5 to 4:3.5, 4:3 to 4:3.5, 4:0.5 to 4:3, 4:1 to 4:3, 4:1.5 to 4:3, 4:2 to 4:3, 4: 2.5 to 4:3, 4:0.5 to 4:2.5, 4:1 to 4:2.5, 4:1.5 to 4:2.5, 4:2 to 4:2.5, 4:0.5 to 4:2, 4:1 to 4:2, 4:1.5 to 4:2, 4:0.5 to 4:1.5, 4:1 to 4:1.5, or 4:0.5 to 4:1.
  • the drug content is 0.5 to 4% by weight, 1 to 4% by weight, 1.5 to 4% by weight, 2 to 4% by weight, 2.5 to 4% by weight, 3 to 4% by weight, 3.5 to 4% by weight, 0.5 to 3.5% by weight. 1 to 3.5% by weight, 1.5 to 3.5% by weight, 2 to 3.5% by weight, 2.5 to 3.5% by weight, 3 to 3.5% by weight, 0.5 to 3% by weight, 1 to 3% by weight, 1.5 to 3% by weight , 2 to 3% by weight, 2.5 to 3% by weight, 0.5 to 2.5% by weight, 1 to 2.5% by weight, 1.5 to 2.5% by weight, 2 to 2.5% by weight, 0.5 to 2% by weight, 1 to 2% by weight, 1.5 to 2%, 0.5 to 1.5%, 1 to 1.5%, or 0.5 to 1%.
  • the pharmaceutical composition administers the drug for 30 minutes or more, 90 minutes or more, 3 hours or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, 8 days or more. or more, 9 days or more, 10 days or more, 11 days or more, or 12 days or more.
  • the pharmaceutical composition may release the drug in an immediate or sustained release according to the concentration of the loaded drug.
  • the pharmaceutical composition has a concentration of the loaded drug of 1.5 to 4% by weight, 1.6 to 4% by weight, 1.7 to 4% by weight, 1.8 to 4% by weight, 1.9 to 4% by weight, or 2 to 4% by weight.
  • the drug can be released in a sustained release if it is, and the drug can be released in an immediate release at a concentration less than that.
  • the pharmaceutical composition containing 0.5% by weight or 1% by weight of the drug released the drug in vitro, and the drug was released at 2% by weight or 4% by weight.
  • the pharmaceutical composition loaded with was released in a sustained release form for up to 14 days in vitro.
  • the pharmaceutical composition loaded with a higher concentration of the drug is expected to have a sustained release in the tympanic cavity, resulting in an extended release period.
  • Said inner ear diseases include, for example, Meniere's disease; sensorineural hearing loss; ototoxic hearing loss caused by drugs such as antipyretics, anticancer drugs, and antibiotics; noise-induced hearing loss; senile deafness; tinnitus; vestibular neuritis; acoustic nerve tumor; otosclerosis; Traumatic deafness caused by perilymph fistula, labyrinth, and temporal bone fracture; It may be an autoimmune inner ear disease, which is caused by ankylosing spondylitis, systemic lupus erythematosus (SLE), Sjogren's syndrome, cogan disease, ulcerative colitis, Wegener's granulomatosis, rheumatoid arthritis, scleroderma, or Behçet's disease. may be an autoimmune inner ear disease, which is caused by ankylosing spondylitis, systemic lupus erythematosus (S
  • the intratympanic administration may also be referred to as intratympanic administration, and is a method of injecting into the middle or inner ear behind the eardrum.
  • the intratympanic administration may be administration of the composition to the middle ear so that it can contact the round window membrane. It can be administered using a syringe, pump, microinjection device, sponge material, and the like.
  • the dosage of the composition may vary depending on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the type of drug, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition is a Na / K ATPase modulator, chemotherapeutic agent, collagen, gamma-globulin, interferon, antibacterial agent, antibiotic, local acting anesthetic, platelet activating factor antagonist, ear protector, nitric oxide synthase inhibitor, vertigo inhibitor, vasopressin Antagonists, antiviral agents, antiemetics, anti-TNF agents, vasopressin receptor modulators, methotrexate, cyclophosphamide, immunosuppressants, macrolides, latanoprost, TNF converting enzyme inhibitors, IKK inhibitors, glutamate receptor modulators, anti- Apoptosis agent, neuroprotective agent, thalidomide, c-jun inhibitor compound, hyaluronidase, antioxidant, IL-1 beta modulator, ERR-beta antagonist, IGF-modulator, Toll-like receptor, KCNQ channel modulator, neuro It may further include a tropine modulator, an ATOH
  • the pharmaceutical composition may further include carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceuticals.
  • the pharmaceutical composition may be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories and sterile injection solutions.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, It may be methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, but is not particularly limited.
  • Another aspect is a polymer in which a unit represented by Formula 1 is polymerized; and a drug for treatment of inner ear diseases dispersed therein, wherein the drug-release controlled formulation in the tympanic chamber undergoes a sol-gel phase transition after intratympanic injection.
  • R 1 is H or an acyl group having 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, or 1 to 6 carbon atoms
  • n is 10 to 10000, 10 to 9500, or 10 to 9000 , 10-8500, 10-8000, 10-7500, 10-7000, 10-6500, 10-6000, 10-5500, 10-5000, 10-4500, 10-4000, 10-3500, 10-3000, 10 to 2500, 10 to 2000, 10 to 1500, 10 to 1000, 10 to 900, 10 to 800, 10 to 700, 10 to 600, or 10 to 500.
  • Controlling the drug release means controlling the release rate and delivery rate of the drug in the tympanic chamber.
  • R 1 may be H, an acetyl group, or a hexanoyl group.
  • the polymer may have a degree of polymerization (DP) of 150 to 400, 150 to 350, 150 to 300, 150 to 250, 200 to 400, 200 to 350, 200 to 300, or 200 to 250.
  • DP degree of polymerization
  • the temperature at which the sol-gel phase transition occurs is 30 to 34 ° C, 30 to 33 ° C, 30 to 32 ° C, 31 to 34 ° C, 31 to 33 ° C, 31 to 32 ° C, 32 to 34 ° C, or 32 to 33 °C.
  • the polymer may include 8 to 10% of N-acetylated glycol chitosan units, 30 to 40% of N-hexanoylated glycol chitosan units, and the balance of glycol chitosan units polymerized.
  • the polymer may be a compound composed of a unit represented by Formula 2 below.
  • R 2 is H or an acetyl group (-CO-CH 3 )
  • R 3 is a hexanoyl group (-CO-CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 )
  • y is 10 to 10000, 10 to 9500, 10 to 9000, 10 to 8500, 10 to 8000, 10 to 7500, 10 to 7000, 10 to 6500, 10 to 6000, 10 to 5500, 10 to 5000, 10 to 4500, 10 to 4000, 10 to 3500 , 10 to 3000, 10 to 2500, 10 to 2000, 10 to 1500, 10 to 1000, 10 to 900, 10 to 800, 10 to 700, 10 to 600, or 10 to 500.
  • the drug for treating the inner ear disease may be a corticosteroid-based drug.
  • the formulation may be an injectable formulation.
  • Information about the other formulations may be understood by referring to the information about the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition for treating inner ear diseases can effectively deliver the drug to the inner ear without side effects.
  • the controlled-release drug formulation according to one embodiment can deliver a drug in a sustained-release or immediate-release form without side effects when administered in the tympanic cavity.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for synthesizing HGC thermogel, the principle of thermal gelation of HGC, and intratympanic administration of a mixture of HGC and dexamethasone for inner ear delivery of dexamethasone.
  • Figure 2 shows GC and HGC 1 H-NMR (2a), ATR-FTIR spectra (2b), and solubility of dexamethasone according to HGC concentration (2c).
  • Figure 3 is a result of confirming the sol-gel transition of GC, HGC, HGC-DSP, and HGC-DEX at 20 °C and 37 °C (3a), FE-SEM of lyophilized HGC, HGC-DSP, HGC-DEX samples It shows image 3b.
  • Figure 4 shows (4a) GC (4b) HGC; (4c) HGC-DSP0.5; (4d) HGC-DEX0.5; (4e) HGC-DSP1; (4f) It shows the temperature-dependent rheological behavior of HGC-DEX1.
  • FIG. 7 shows the results of histopathological analysis by H&E staining (7a) and whole mount staining (7b) of the adverse effects of intratympanic administration of HGC.
  • (7a) normal histopathologic findings of the middle ear mucosa were normal on the left, 21 days after saline injection in the middle, and 21 days after HGC injection on the right.
  • the upper scale bar is 1000 ⁇ m and the lower scale bar is 50 ⁇ m.
  • (7b) Whole-mount of auditory epithelium 21 days after HGC injection. Tissues were stained with myosin-VIIa (red) and rhodamine phalloidin (green) to visualize auditory hair cells and actin, and then merged.
  • OHC is an outer hair cell
  • IHC is an inner hair cell
  • the scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIG. 8a is the result of confirming the concentration of DEX (DSP) in the perlymph fluid of the groups injected with DSP, HGC-DSP, and HGC-DEX in the tympanic chamber
  • FIG. 8b is the result of confirming the concentration of DSP, HGC-DSP, and HGC-DEX
  • FIG. 10 is an in vitro drug release test result of HGC in which microspheres carrying dexamethasone are dispersed.
  • FIG. 10A is an experimental result using 023 microspheres and
  • FIG. 10B is an experimental result using 061 and 062 microspheres.
  • 11 is a hydrolysis test result of drug-loaded microspheres (M-DEX). 11 shows SEM images of M-DEX over time (0, 7, 14, 21 and 28 days later).
  • HGC 12 is a SEM image of the surface and cross section of HGC, HGC/DEX, HGC/M-DEX and HGC/DEX/M-DEX.
  • 13 is a graph showing the retention of HGC over time as residual weight. 13 is a graph comparing the case where HGC was stored in PBS and the case where lysozyme was used as a degradation enzyme.
  • HGC glycol chitosan
  • GC glycol chitosan
  • hexanoic acid anhydride 1.106 mL
  • the reaction solution was poured into an excess of cold acetone to precipitate the polymerized product, HGC.
  • the product was dialyzed with distilled water for 2 days using a dialysis membrane (molecular weight cut-off: 12-14 kDa) to purify HGC and freeze-dried.
  • HGC The chemical composition of HGC was analyzed by 1 H-NMR spectroscopy at 600 MHz using an AVANCE III 600 spectrometer (Bruker, Germany). HGC polymer samples were dissolved in D 2 O at 0.5 wt %. The D 2 O peak at 4.85 ppm was set as the reference peak. The chemical composition of HGC was confirmed by ATR-FTIR characterization using Nicolet iS 5 (Thermo Scientific, USA). ATR-FTIR spectra of GC and HGC were recorded in a circumstance of 32 scans at a resolution of 4 cm ⁇ 1 in the frequency range of 4000 to 750 cm ⁇ 1 .
  • Drug-loaded HGC thermogels were prepared by simply physically mixing HGC aqueous solution (PBS, 4 wt%) with DSP (hydrophilic form of DEX) or DEX (hydrophobic form of DEX). First, 40 mg of HGC was dissolved in 1 mL of PBS (pH 7.4) and stored in a refrigerator at 4°C. DSP or DEX (5 or 10 mg) was added to the HGC solution and mixed by vortexing to obtain DSP loaded HGC (HGC-DSP) and DEX loaded HGC (HGC-DEX) samples with a drug concentration of 0.5 or 1.0% by weight. got
  • the sol-gel transition behavior of the HGC thermogel formulation was observed using a tilting tube method at a heating rate of 1 °C/min.
  • the sol-gel transition temperature was determined to exhibit a non-flowing gel state within 1 minute after tilting the vial. The experiment was performed three times.
  • thermogel formulation The in vitro drug release profile of the thermogel formulation was tested in PBS (pH 7.4) using a dialysis membrane.
  • the prepared thermogel formulations HGC-DSP and HGC-DEX
  • MWCO 12-14 kDa, width: 10 mm.
  • the dialysis bag was immersed in 50 mL of PBS and incubated in a shaking water bath (SI-600R, Jeio Tech, Seoul, Korea) under conditions of 37 °C and 100 rpm or less.
  • CT micro-computed tomography
  • MRI magnetic resonance imaging
  • mice were anesthetized by intramuscular injection of alfaxan (15 mg/mL, Careside) and Rumpun (23 mg/mL, Careside).
  • 0.5 ml of 1% lidocaine was subcutaneously injected into the postauricular area for local anesthesia.
  • Anesthetized animals were placed in supine position on a temperature controlled heating pad. After incising the retro auricular, the temporal bone was exposed, and the round window membrane was visualized with a surgical microscope (Carl Zeiss OPMI f 170 Surgical Tilting Head connected to a Hitachi KP-D50 color digital microscope camera). .
  • dental cement DurelonTM Carboxylate Luting Cement, 3M
  • CT computed tomography
  • MRI T2-weighted magnetic resonance imaging
  • CT images were acquired on a Quantum GX2 micro-CT Imaging System (PerkinElmer, Waltham, MA, US).
  • MR images a 4.7 T BioSpec, 47/40 USR (Bruker Biospin, Germany) was used.
  • cochlear was obtained from animals 21 days old after intratympanic injection of saline or HGC thermogel, and middle ear mucosal tissue (middle ear). Ear mucosa tissue) was evaluated for inflammation. Cochlear samples were placed in 4% paraformaldehyde in PBS for 2 hours, decalcified in EDTA for 3 weeks, paraffin embedded, serially sectioned at 4 ⁇ m thickness and stained with hemotoxylin and eosin. Stained tissue sections were examined and representative fields were photographed using an optical microscope (Olympus BX51).
  • Tissues were then stained with rabbit anti-DEX primary antibody (Abcam, Cambridge, MA) at a concentration of 1:200 in blocking solution overnight at 4°C. After rinsing in PBS for 1 hour, tissues were incubated with the corresponding Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit secondary antibody (Molecular Probes, Eugene, OR) at a 1:200 dilution. After incubation at room temperature for 2 hours, tissues were rinsed in PBS for 30 minutes and stained with 1:200 diluted Hoestch 33342 (Invitrogen) for 5 minutes. After incubation at room temperature, tissues were rinsed in PBS for 30 min and mounted on glass slides using Crystal Mount (Biomeda). Drug uptake in the cochlear tissue was observed under a fluorescence microscope (BX53F2, Olympus, Tokyo, Japan).
  • tissues were stained with 1:200 dilution of AlexaFluor 594 goat anti-mouse secondary antibody and AlexaFluor 488 Phalloidin antibody by incubation for 2 hours at room temperature. Tissues were rinsed in PBS for 15 minutes. After rinsing, tissues were mounted on glass slides using Crystal Mount. Tissues were observed using a fluorescence microscope (BX53F2, Olympus, Tokyo, Japan).
  • perilymph sampling was performed at each time point (30 minutes, 90 minutes, 3 hours, 1 day, 3 days, and 7 days) after intratympanic injection of DEX-supported HGC thermogel. Under anesthesia, the temporal bone was removed, and the tympanic bulla was washed with 10 ml saline. Small apical cochleostomy was performed with a sharp pick, and perilymphs were collected into hang-held graduated glass capillary tubes (IntraMAPK micropipettes) marked with a volume of 4 ⁇ l. Cochlear fluid and DEX standard samples were diluted 1:11 with artificial perilymph, and each mixture was diluted again 1:3 with 50% MeOH.
  • thermogels based on N-acyl glycol chitosan are superior to thermogels based on block copolymers such as PEG-PPG and PEG-PLGA in terms of physical safety, biocompatibility, biodegradability, thermogelation, and other biological functions. It has been proven that it has better properties for injection.
  • N-hexanoyl glycol chitosan causes sol-gel transition in response to body temperature and changes the degree of hexanoylation (DH) to achieve physicochemical properties and thermal gelation
  • DH degree of hexanoylation
  • HGC N-hexanoyl glycol chitosan
  • Figure 2b is the result of confirming the chemical structure of HGC by ATF-FTIR analysis.
  • a broad peak corresponding to the stretching vibration of the hydroxyl group appeared at 3400 cm -1 , which overlapped with the NH stretching vibration in the same region.
  • a characteristic peak of HGC appeared at 2890 cm -1 , which is due to the methyl of hexanoyl group and the CH stretching vibration of methylene group.
  • the absorption peak due to the amino bending vibration of GC was observed at 1596 cm -1 , whereas the HGC was observed at 1655 cm -1 and 1555 cm -1 corresponding to the carbonyl stretching vibration and amide II bending vibration, respectively .
  • An absorption peak was observed at 1 , indicating that the N-hexanoylation reaction of GC was successfully performed.
  • the HGC polymer is composed of a hydrophilic GC backbone and a hydrophobic hexanoyl group and exhibits amphiphilic properties, it is expected to be able to support both hydrophilic and hydrophobic drugs.
  • Figure 2c shows the solubility of dexamethasone in PBS as a function of HGC concentration (0-4 wt%).
  • concentration of HGC was 0 wt%
  • aqueous solubility of dexamethasone was 64 ⁇ g/ml.
  • the solubility of dexamethasone increased as the concentration of HGC increased, and when the HGC was 4 wt%, the solubility of dexamethasone increased to 221 ⁇ g/ml (about 4 times). Therefore, it is shown that HGC thermogel improves the water solubility of dexamethasone (DEX).
  • Table 1 below shows the chemical composition of the drug-loading thermogel.
  • thermogels were prepared by simple mixing of HGC aqueous solution (4 wt%) and DSP or DEX (0.5 wt% and 1.0 wt%).
  • DSP is the hydrophilic form of DEX and is highly soluble in aqueous solvents. DSP was well mixed with HGC to prepare a transparent HGC-DSP mixture. (See Fig. 3a)
  • the HGC-DEX mixture was not transparent because DEX had low solubility.
  • the FE-SEM images of the surface and cross section of the gelled HGC-DEX lyophilized sample it was observed that the micronized DEX particles were uniformly dispersed in the thermogel matrix.
  • HGC-DEX thermogels were shown to keep the drug suspension stable without aggregation or precipitation. Therefore, since HGC has amphiphilicity and effectively disperses hydrophobic drugs, it can be used as an injectable formulation of hydrophobic drugs.
  • thermally sensitive sol-gel phase transition behaviors of HGC, HGC-DSP, and HGC-DEX were analyzed using the tube tilting method and rheological analysis.
  • Figure 3a shows images of aqueous solutions (4wt%, PBS) of GC, HGC, HGC-DSP and HGC DEX at 20 °C and 37 °C. No phase transition was observed in GC.
  • the HGC solution exhibited a distinct phase transition from a fluid sol state to a non-flowable gel state as the temperature increased to 37 °C.
  • HGC was observed to exhibit thermogelation at about 32°C.
  • HGC-DSP and HGC-DEX were observed to ascertain whether the presence of hydrophilic DSP or hydrophobic DEX could affect the thermogelation behavior of HGC.
  • Both HGC-DSP and HGC-DEX showed a slightly lower gelation temperature than HGC, and the gelation temperature decreased as the drug concentration increased. This may be because the mixing of DSP (sodium phosphate form of DEX) or hydrophobic DEX promoted hydrophobic interactions between hexanoyl groups.
  • the viscoelastic properties, elasticity (G', elstic) and loss moduli (G'', loss moduli) of GC, HGC, HGC-DSP and HGC-DEX were determined by rheological experiments in the temperature range of 10 to 45 °C. Observed. The crossover temperature of G' and G'' was defined as the gelation point for determining the sol-gel phase transition.
  • the G' value of the GC solution was consistently lower than the G'' value over the entire temperature range without showing any crossover points, indicating that no heat-sensitive sol-gel transition occurred in the GC solution.
  • the G' values of HGC, HGC-DSP, and HGC-DEX were lower than G'' at the initial temperature, but rapidly increased as the temperature increased, and the G' value became higher than the G'' value.
  • the values of G' and G" cross at a lower temperature than HGC, which is consistent with the results of previous tube tilting methods.
  • DSP and HGC-DSP formulations released all drugs within 10 hours regardless of drug concentration (0.5 or 1.0 wt%).
  • HGC-DSP thermogel showed slightly delayed release than DSP, but was not effective in delaying the release rate because DSP is a highly water-soluble small molecule drug.
  • the HGC-DEX formulation showed various drug release profiles in the range of 4 to 14 days depending on the drug concentration (0.5, 1.0, 2.0, 4.0 wt%).
  • the release rates of HGC-DEX 0.5 and HGC-DEX 1.0 were faster than those of the free DEX form under the same concentration conditions due to the solubilization effect of HGC thermogel, which can accelerate the release behavior.
  • HGC-DEX 2 and HGC-DEX 4 with higher drug concentrations showed more sustained-release behavior than HGC-DEX 0.5 and HGC-DEX 1.0 with lower drug concentrations. This may be because it requires more time to solubilize and release.
  • the HGC thermogel formulation can be optimized to release the hydrophobic drug at an appropriate rate and dose as needed.
  • HGC thermogels can enhance drug absorption in the inner ear by improving the residual stability of DEX in the middle ear cavity. This is because thermal gelation can prevent early leakage of the drug through the Eustachian tube and prolong the residence time.
  • thermogel In an in vivo experiment, we first evaluated the residual stability of HGC thermogel in the middle ear cavity by CT and T2-weighted MRI. According to FIG. 6, the HGC thermogel injected into the tympanic cavity remained in the middle ear cavity of guinea pigs for more than 21 days (3 weeks). According to the experimental results, it can be seen that the HGC-based thermogel has the advantage of a long residence time in vivo, and the contact time of the drug loaded on it with the round window membrane increases, thereby enabling continuous delivery of the drug to the inner ear.
  • H&E staining results of FIG. 7a no evidence of mucosal inflammatory response including edema and fibrosis of the middle ear was observed in the group after 21 days of intratympanic injection of HGC thermogel.
  • HGC thermogel has no side effects on the middle or inner ear. In fact, no inflammatory response was observed in the mucosa of the middle ear and loss of auditory hair cells in the inner ear of guinea pigs. The next day after intratympanic injection of HGC thermogel, all guinea pigs behaved normally without showing pathological vestibular behavior such as rolling. Therefore, HGC thermogel is expected to have no side effects such as acute inflammation, progression of middle ear fibrosis, and hearing loss even after intratympanic injection, and can be a safe means for local drug delivery to the inner ear.
  • Example 7 Evaluation of inner ear drug delivery efficacy using HGC thermogel
  • HGC thermogel formulation The effect of the HGC thermogel formulation was evaluated by intratympanic administration of HGC-DEX and observation of changes in DEX concentration in intracochlear perilymph and DEX distribution in cochlear tissue.
  • Dexamethasone was chosen as a model drug because it has anti-inflammatory and hair cell-protective effects and is one of the most used drugs for the treatment of inner ear diseases.
  • thermogel formulation can stay in the gel state in the inner ear cavity for a longer time and can be in contact with the round window membrane (RWM) for a longer time, thereby increasing the efficiency of drug delivery to the inner ear.
  • RWM round window membrane
  • the animal test results measure the absorption of the drug, and since the amount of absorption varies depending on the characteristics of the released drug and the absorption time, the rate of drug release and the amount of absorption do not necessarily match. That is, the absorption amount suggests that sustained release of the drug in the tympanic cavity is possible, but does not directly indicate the rate of sustained release.
  • HGC-DEX thermogel drug release rate was dependent on the drug concentration, and the higher the loaded drug concentration, the slower the release rate. Therefore, using an HGC thermogel formulation with a higher drug concentration will maintain the effective drug concentration for a longer period of time.
  • HGC thermogel formulations can be an effective and useful means for topical drug delivery to the inner ear.
  • the HGC-based thermogel is an intratympanic injection capable of carrying both a hydrophobic drug (eg dexamethasone) and a hydrophilic drug (eg dexamethasone phosphate disodium salt, DSP).
  • a hydrophobic drug eg dexamethasone
  • a hydrophilic drug eg dexamethasone phosphate disodium salt, DSP.
  • HGC-based thermogel can carry drugs by a simple method of physically mixing with drugs in a sol state, and in particular, hydrophobic drugs (DEX) were effectively dispersed and solubilized.
  • DEX hydrophobic drugs
  • the gel formulation showed various release kinetics depending on the drug type and concentration According to the in vitro drug release experiment, HGC thermogel released the drug immediately when the drug was loaded at 0.5% or 1.0% by weight. , When the drug was loaded at 2% or 4% by weight, the drug could be continuously released for 2 weeks, and the HGC thermogel loaded with 0.5% by weight of the drug released the drug for 1 day as a result of the intratympanic administration test.
  • HGC thermogel confirmed that immediate-release or sustained-release occurs depending on the concentration of the drug in in vitro drug release experiments, sustained release in the tympanic cavity is expected to be possible depending on the concentration of the drug. Therefore, it was confirmed that HGC thermogel has great potential as an effective and safe inner ear drug delivery platform.
  • Example 8-1 HGC thermogel containing drug loaded microspheres
  • Drug-loading microspheres made of polymers with excellent biocompatibility and biodegradability can be used for sustained release of drugs.
  • microspheres can easily move to other sites even when injected into the tympanic chamber, it is difficult to continuously deliver the drug while remaining in the tympanic chamber.
  • an HGC thermogel in which microspheres carrying dexamethasone were dispersed was prepared, and its in vitro drug release rate was measured.
  • microspheres Four types of microspheres (GB-5313-023, GB-5313-061, GB-5313-062, GB-5313-075) differed in terms of formulation method, drug content, and particle size were prepared. (hereinafter referred to as 023, 061, 062, 075) Their compositions are shown in Tables 2 and 3 below.
  • the particle size (D50) means the average diameter of 50% of the particles.
  • the S / O / W is a Solid-in-Oil-in-Water Emulsion, prepared by adding a solid drug (S) encapsulated with 061 or 062 to a polymer / oil phase (O), and emulsifying by adding water it did
  • the O/W is prepared by adding an unencapsulated solid drug to the polymer/oil phase (O) and emulsifying it by adding water.
  • the 061 is a dosage form expected to release the drug quickly due to its high drug content compared to 023.
  • the 062 is a formulation expected to release slowly because it uses a 503H polymer having a higher molecular weight than that of 023.
  • 075 is a formulation prepared under the same conditions as 023, and is different in that the particle size is smaller. The fabricated microspheres are shown in FIG. 9 .
  • 023 microspheres loaded with dexamethasone were mixed with 4wt% of HGC hydrogel.
  • an in vitro drug release test was performed in a PBS (pH 7.4, 50ml) environment. Sampling was performed at 0, 0.5, 1, 2, 4, 7, 14, 21, 28, and 30 day intervals. The thickness of the dialysis membrane was 10 mm, and the MWCO was 12 to 14 kDa.
  • In vitro drug release test conditions such as 023 microspheres are shown in Table 4 below.
  • 061 or 062 microspheres loaded with dexamethasone were mixed with 4wt% of HGC hydrogel, and an in vitro drug release experiment was performed in the same manner as the 023 experiment.
  • In vitro drug release test conditions such as 061 microspheres are shown in Table 5 below.
  • 023+HGC HGC dispersed with 023 microspheres (DEX-supported)
  • 023+HGC+DEX HGC with DEX-supported 023 and DEX itself dispersed
  • immediate release occurred until the first 2 days, and the release rate slowed from the 3rd day, resulting in continuous release for more than 20 days.
  • the DEX contained in 023 is based on the result of sustained release with sustained release.
  • HGC (061+HGC) in which 061 microspheres (supported with DEX) were dispersed showed a sustained release
  • 061+HGC+DEX also showed an immediate release until the 2nd day, followed by a release rate from the 3rd day. was slowed down and was continuously released for more than 20 days, as also described above.
  • the release of DEX supported on HGC can be accelerated due to the solubilization effect of HGC, and DEX can be continuously released by being supported on microspheres made of biocompatible polymers.
  • high release occurs initially and sustained release for a long period of time may also occur.
  • desired drug release characteristics can be obtained by appropriately selecting and mixing HGC with a drug, a drug loaded in microspheres, or a combination thereof. can be achieved
  • Example 8-2 Analysis of physical properties of HGC thermogel containing drug-loaded microspheres
  • microspheres carrying the drug and the HGC thermogel containing the microspheres were confirmed.
  • Dexamethasone was used as the drug, and PLGA was used as the microsphere.
  • a dispersed phase After dissolving LA (Lactide) and GA (Glycolide) in dichloromethane, dexamethasone was suspended to prepare a dispersed phase.
  • An emulsion was prepared by injecting the dispersed phase into a PVA aqueous solution (0.5% w/w) of the continuous phase using a membrane emulsifier (LDC-1, Micropore technologies). The organic solvent was removed from the emulsion to obtain solidified microspheres, which were washed with distilled water to obtain drug-loaded microspheres (M-DEX).
  • LDC-1 membrane emulsifier
  • the drug content was calculated as a percentage of the amount of dexamethasone contained in the microspheres relative to the amount of the microspheres, and the drug content was about 33.3%.
  • the encapsulation efficiency of the drug was calculated as a percentage of the amount of dexamethasone contained in the microspheres with respect to the initial amount of dexamethasone, and the encapsulation efficiency was found to be about 83.3%.
  • FIG. 11 shows the results of the hydrolysis experiment of the microspheres over time. Morphological characteristics of the drug-loaded microspheres (M-DEX) were confirmed through SEM observation. According to FIG. 11, the microspheres showed a uniform and distinct spherical particle shape immediately after preparation (0 day), and the supported drug particles appeared to exist on the surface of the microspheres as well. After 7 days, the exposed drug particles disappeared and wrinkles appeared on the surface of the microspheres, and it was confirmed that the microspheres were biodegradable after 21 to 28 days.
  • M-DEX Morphological characteristics of the drug-loaded microspheres
  • HGC thermogel HGC
  • HGC / DEX dexamethasone-supported HGC thermogel
  • HGC thermogel and dexamethasone-supported microspheres formulation HGC / M-DEX
  • HGC/DEX/M-DEX a formulation including HGC thermogel supported with dexamethasone and microspheres supported with dexamethasone was prepared as shown in Table 6 below, and morphological characteristics and physical properties were confirmed.
  • T gel * is the tube tilting method
  • T gel ** is the transition temperature determined by rheological measurement.
  • a sol-gel phase transition was observed at approximately 28 °C for HGC without drug loading, and a sol-gel phase transition was observed at 24 to 26 °C for formulations loaded with drug. This is because the hydrophobic interaction was enhanced by the introduction of hydrophobic drugs or microspheres, resulting in gelation at a lower temperature.
  • FIG. 12 is a SEM image of the surface and cross section of HGC, HGC/DEX, HGC/M-DEX and HGC/DEX/M-DEX. According to FIG. 12, a porous structure unique to the hydrogel is observed in HGC, and drug particles are uniformly dispersed on the surface of the porous structure in HGC/DEX. In HGC/M-DEX and HGC/DEX/M-DEX, the presence of microspheres trapped in the porous network structure was confirmed.
  • FIG. 13 is a graph showing the preservation of HGC.
  • HGC was stored in PBS and observed over time, the weight of HGC initially increased due to swelling and then gradually decreased, but the residual weight was maintained at about 70% or more even after 15 days. This is a result compared to the dissolution of thermogels based on synthetic polymers such as conventional poloxamers within several hours.
  • lysozyme which is a degrading enzyme, it is shown to have biodegradability that is degraded within a day, confirming that HGC thermogel is useful as a material having both stability and biodegradability.
  • HGC/M-DEX and HGC/DEX/M-DEX formulations showed a sustained-release form of about a month at a similar rate to HGC/DEX. Since the formulation containing microspheres can exhibit stable and controllable release behavior, it is easier to control the sustained release than the HGC/DEX formulation, which depends on drug concentration.
  • the release of DEX supported on HGC can be accelerated due to the solubilizing effect of HGC, and the formulation containing microspheres and the formulation in which thermogel and microspheres are mixed can encapsulate the drug according to the introduction of microspheres. It is possible to achieve characteristics such as high efficiency, easy release control, and controllable release rate from several weeks to several months according to biodegradability control.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

N-아실화된 글리콜 키토산은 양친매성을 가지므로 친수성 약물 및 소수성 약물을 모두 담지할 수 있고, 고실내에서 졸-겔 상전이가 일어남으로써 고실내 체류 시간을 증가시킬 수 있고, 부작용이 없으며, 약물의 종류 또는 농도에 따라 속방성 또는 서방성으로 약물을 방출할 수 있으므로 고실내 약물 전달 및 내이 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

N-아실화된 글리콜 키토산을 포함하는 고실내 약물 제어 방출형 제형
본 발명은 2021년 10월 1일에 출원된 한국 특허출원 제10-2021-0131088호에 기초한 우선권을 주장한다.
본 발명은 N-아실화된 글리콜 키토산을 포함하는 고실내 약물 제어 방출형 제형에 관한 것이다.
내이 질환 치료를 위한 약물을 전신투여(systemic administration)하면 혈액-미로 장벽(blood-labyrinthine barrier)에 의해 내이로의 약물 전달이 효율적이지 않다. 또한 내이의 약물 농도를 달성 및 유지하기 위해 고용량으로 전신 투여하면 독성 및 부작용을 수반한다. 따라서 내이로 약물 전달은 국소 투여하는 것이 효율적이다.
고실내 투여(intratympanic administration)는 약물을 고막 안쪽의 중이강(middle ear cavity) 또는 고실(tympanic cavity)로 불리우는 공간에 주사 투여하는 것으로, 널리 사용되는 내이로의 국소투여 방법이다. 고실내 투여는 전신 투여보다 내이로 약물을 더 효율적으로 전달하며 부작용이 더 낮다.
고실내 투여된 약물은 원형창막(Round Window Membrane, RWM)을 통하여 내이로 확산됨으로써 전달된다. 따라서 내이로 약물을 효율적으로 전달하기 위해서는 약물이 원형창막과 높은 농도로 장시간 접촉해야 한다. 그러나 고실내 투여에 의해 중이강(middle ear cavity)에 위치한 약물은 유스타키오관(Eustachian tube)을 통해 외부로 쉽게 배출되기 때문에 원형창막과 높은 농도로 장시간 접촉하기 어렵다. 따라서 중이강에서의 약물 체류(retention)를 연장하는 것이 내이로의 약물 전달을 향상시키기 위한 접근법으로 고려된다.
열 가역적 졸-겔 전이 특성(thermo-reversible sol-gel transition properties)을 나타내는 써모겔(thermogel)은 졸 상태로 주사할 수 있고 체내에서 겔화되므로 고실내 약물 전달에 적합하다. 써모겔은 졸 상태에서 약물과 혼합하여 약물을 담지할 수 있다. 약물과 혼합된 써모겔을 주사하면 체온에 의해 겔로 응고(solidified)된다. 대표적인 써모겔인 폴록사머(Poloxamer)는 내이로의 약물 전달을 위해 이용되었다. 그러나 폴록사머는 효과적인 열 겔화(thermogelation)를 위해 고농도(20 wt% 이상)가 필요하고, 생분해성 및 물리적 안전성이 충분하지 않으며, 부작용이 보고되었다.
글리콜 키토산(Glycol chitosan, GC)은 키노산의 수용성 유도체로서 생체적합성, 생분해성, 및 중성 pH에서의 수용성 등 생체 재료로서 유망한 특성을 갖는다(대한민국 공개공보 제10-2012-0020386호(2012.03.08)). 그러나 N-아실 글리콜 키토산과 약물을 혼합하여 고실내 투여함으로써 내이로의 효율적 약물 전달이 가능한지, 그리고 부작용이 있는지 등은 알려진 바가 없다.
일 구체예에 따르면 N-아실화된 글리콜 키토산을 포함하는 고실내 투여를 위한 내이 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 구체예에 따르면 N-아실화된 글리콜 키토산을 포함하는 고실내 투여를 위한 제형을 제공한다.
일 양상은, 하기 화학식 1로 표시되는 단위체가 중합된 중합체; 및 내이 질환 치료용 약물을 포함하고, 온도에 따라 졸-겔 상전이가 일어나며, 고실내 주사 투여로 내이 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022013938-appb-img-000001
상기 화학식 1에서, R1은 H 또는 탄소수 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 또는 1 내지 6의 아실기이고, 상기 n은 10 내지 10000, 10 내지 9500, 10 내지 9000, 10 내지 8500, 10 내지 8000, 10 내지 7500, 10 내지 7000, 10 내지 6500, 10 내지 6000, 10 내지 5500, 10 내지 5000, 10 내지 4500, 10 내지 4000, 10 내지 3500, 10 내지 3000, 10 내지 2500, 10 내지 2000, 10 내지 1500, 10 내지 1000, 10 내지 900, 10 내지 800, 10 내지 700, 10 내지 600, 또는 10 내지 500이다.
상기 아실기는 (-(C=O)-알킬기)일 수 있으며, 상기 아실기의 알킬기는 탄소수 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 또는 1 내지 6이며 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 중합체는 상온에서 주사 투여가 가능한 졸 상태이며, 고실내 투여하면 체온에 의해 겔로 상전이가 일어나는 써모겔일 수 있다. 상기 중합체는 약물을 담지할 수 있는 약물 전달체이며, 중합체와 약물을 혼합하여 고실내 투여하면 약물을 담지한 겔로 상전이된다. 겔화된 약학적 조성물은 중이강에서의 체류 시간이 증가함으로써 약물과 원형창막과의 접촉 시간이 증가하고, 약물을 내이로 지속적으로 전달할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물을 고실내 투여하면 염증 반응 및 청각 유모 세포 손실 등의 부작용이 나타나지 않아 안전성이 높은 것으로 확인되었으며, 이러한 안전성은 기존에 알려진 바가 없다.
또한 일 실시예에 따르면 상기 중합체는 친수성인 글리콜 키토산 백본과 소수성인 아실기(예를 들면 헥사노일기)가 포함되어 있으므로 친수성 약물 및 소수성 약물을 모두 담지할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 R1은 H, 아세틸기, 또는 헥사노일기일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 중합체는 중합도(DP)가 150 내지 400, 150 내지 350, 150 내지 300, 150 내지 250, 200 내지 400, 200 내지 350, 200 내지 300, 또는 200 내지 250일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 졸-겔 상전이가 일어나는 온도는 30 내지 34℃, 30 내지 33℃, 30 내지 32℃, 31 내지 34℃, 31 내지 33℃, 31 내지 32℃, 32 내지 34℃, 또는 32 내지 33℃일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 중합체는 N-아세틸화 글리콜 키토산 단위체가 8 내지 10%, 및 N-헥사노일화 글리콜 키토산 단위체가 30 내지 40%, 및 잔부는 글리콜 키토산 단위체가 중합된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 중합체는 하기 화학식 2로 표시되는 단위체로 이루어진 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2022013938-appb-img-000002
상기 화학식 2에서 R2는 H또는 아세틸기(-CO-CH3)이고, R3는 헥사노일기(-CO-CH2CH2CH2CH2CH3)이고, 상기 y는 10 내지 10000, 10 내지 9500, 10 내지 9000, 10 내지 8500, 10 내지 8000, 10 내지 7500, 10 내지 7000, 10 내지 6500, 10 내지 6000, 10 내지 5500, 10 내지 5000, 10 내지 4500, 10 내지 4000, 10 내지 3500, 10 내지 3000, 10 내지 2500, 10 내지 2000, 10 내지 1500, 10 내지 1000, 10 내지 900, 10 내지 800, 10 내지 700, 10 내지 600, 또는 10 내지 500 일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 내이 질환 치료용 약물은 코르티코스테로이드 계열 약물일 수 있다.
상기 코르티코스테로이드 계열 약물은 예를 들면 클로베타솔(clobetasol), 할로메타손(halometasone), 덱사메타손(dexamethasone), 디플로라손(Diflorasone), 플루오시노나이드(Fluocinonide), 할로베타솔(halobetasol), 암신노나이드(Amcinonide), 할로시노나이드(Halcinonide), 하이드로코르티손(Hydrocortisone), 플루티카손(Fluticasone), 모메타손(Mometasone), 플루오시놀론(Fluocinolone), 데소나이드(Desonide), 프레드니손(Prednisone), 메틸프레드니솔론(Methylprednisolone), 프레드니솔론(Prednisolone), 이들의 수화물 또는 용매화물, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 일 실시예에 따르면 덱사메타손, 덱사메타손 포스페이트, 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염일 수 있다.
상기 내이 질환 치료용 약물은 상기 중합체에 분산되어 있을 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 내이 질환 치료용 약물은 약물 자체, 마이크로스피어에 분산된 형태, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 조성물은 약물이 분산된 마이크로스피어와 중합체가 혼합되어 분산된 것이거나, 약물이 분산된 마이크로스피어, 약물 자체, 그리고 중합체가 혼합되어 분산된 것일 수 있다. 상기 마이크로스피어는 생체적합성 및 생분해성 고분자로 이루어진 미세입자이며, 약물전달체의 기술분야에서 잘 알려져 있다. 상기 마이크로스피어를 이루는 물질은 생체적합성 및 생분해성이 우수한 고분자라면 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들면 상기 생체적합성 고분자는 PLGA, PEG, PLA, PGA, PHA, 이들의 공중합체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 마이크로스피어는 분자량 5000 내지 200,000의 생분해성 고분자로 이루어진 것일 수 있다. 상기 마이크로스피어의 직경은 10 내지 100 ㎛일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 중합체를 0.5 내지 4 중량%, 0.6 내지 4 중량%, 0.7 내지 4 중량%, 0.8 내지 4 중량%, 0.9 내지 4 중량%, 또는 1 내지 4 중량% 만큼 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 고실내에서 30분 이상, 90분 이상, 3시간 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 또는 12일 이상 잔류할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 고실내에서 친수성 약물을 속방성으로 방출하고, 소수성 약물을 서방성으로 방출하는 것일 수 있다.
상기 속방성은 약물이 투여 후 즉시 방출되어 초기 효과가 빠르게 나타나도록 방출되는 특성을 의미하며, 상기 서방성은 약물이 서서히 지속적으로 방출되어 장시간 동안 유효 치료량 또는 유효농도를 유지할 수 있게 하는 특성을 의미한다. 상기 유효 치료량은 치료 개체에서 난청을 개선 또는 감소시키는데 유효한 양을 의미하며, 대상 개체의 중증도, 투여약물, 투여방법에 따라 달라질 수 있다.
상기 중합체와 상기 약물의 혼합 비율은 중량부 기준 4:0.5 내지 4:4, 4:1 내지 4:4, 4:1.5 내지 4:4, 4:2 내지 4:4, 4:2.5 내지 4:4, 4:3 내지 4:4, 4:3.5 내지 4:4, 4:0.5 내지 4:3.5, 4:1 내지 4:3.5, 4:1.5 내지 4:3.5, 4:2 내지 4:3.5, 4:2.5 내지 4:3.5, 4:3 내지 4: 3.5, 4:0.5 내지 4:3, 4:1 내지 4:3, 4:1.5 내지 4:3, 4:2 내지 4:3, 4:2.5 내지 4:3, 4:0.5 내지 4:2.5, 4:1 내지 4:2.5, 4:1.5 내지 4:2.5, 4:2 내지 4:2.5, 4:0.5 내지 4:2, 4:1 내지 4:2, 4:1.5 내지 4:2, 4:0.5 내지 4:1.5, 4:1 내지 4:1.5, 또는 4:0.5 내지 4:1 일 수 있다.
상기 약물의 함량은 0.5 내지 4 중량%, 1 내지 4 중량%, 1.5 내지 4 중량%, 2 내지 4 중량%, 2.5 내지 4 중량%, 3 내지 4 중량%, 3.5 내지 4 중량%, 0.5 내지 3.5 중량%, 1 내지 3.5 중량%, 1.5 내지 3.5 중량%, 2 내지 3.5 중량%, 2.5 내지 3.5 중량%, 3 내지 3.5 중량%, 0.5 내지 3 중량%, 1 내지 3 중량%, 1.5 내지 3 중량%, 2 내지 3 중량%, 2.5 내지 3 중량%, 0.5 내지 2.5 중량%, 1 내지 2.5 중량%, 1.5 내지 2.5 중량%, 2 내지 2.5 중량%, 0.5 내지 2 중량%, 1 내지 2 중량%, 1.5 내지 2 중량%, 0.5 내지 1.5 중량%, 1 내지 1.5 중량%, 또는 0.5 내지 1 중량% 일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 약물을 30분 이상, 90분 이상, 3시간 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 또는 12일 이상 지속 방출할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 담지된 약물의 농도에 따라 약물을 속방성 또는 서방성으로 방출하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 담지된 약물의 농도가 1.5 내지 4 중량%, 1.6 내지 4 중량%, 1.7 내지 4 중량%, 1.8 내지 4 중량%, 1.9 내지 4 중량%, 또는 2 내지 4 중량%이면 약물을 서방성으로 방출할 수 있고, 그 미만의 농도에서는 약물을 속방성으로 방출할 수 있다.
일 실시예의 시험관내 약물방출 실험결과에 따르면, 상기 약물을 0.5 중량% 또는 1 중량%로 담지한 약학적 조성물은 시험관내에서 약물이 속방성으로 방출되었으며, 상기 약물을 2 중량% 또는 4 중량%로 담지한 약학적 조성물은 시험관내에서 약물이 최대 14일 동안 서방성으로 방출되었다. (도 5 참고) 또한 일 실시예의 동물실험결과에 따르면, 상기 약물을 0.5 중량%로 담지한 약학적 조성물을 고실내 투여하면 1일 동안 지속적으로 약물을 방출하였다. 따라서 약물을 더 높은 농도로 담지한 약학적 조성물은 고실내에서 서방성 방출이 일어나 방출기간이 연장될 것으로 예상된다. (도 8 참고)
상기 내이 질환은 예를 들면 메니에르병; 감각신경성 난청; 해열제, 항암제, 항생제 등 약물에 의해 발생하는 이독성 난청; 소음성 난청; 노인성 난청; 이명; 전정 신경염; 청신경 종양; 이경화증; 외림프누공, 미로진탕, 및 측두골골절 등이 원인인 외상성 난청; 자가면역 내이 질환일 수 있으며, 상기 자가면역 내이 질환은 강직성 척추염, 전신 홍반성 루프스(SLE), 쇼그렌 증후군, 코간병, 궤양성 대장염, 베게너 육아종증, 류마티스성 관절염, 경피증, 또는 베체트병이 원인인 것일 수 있다.
상기 고실내 투여는 고막내 투여로도 지칭할 수 있으며, 고막 뒤의 중이 또는 내이로 주사하는 방법이다. 상기 고실내 투여는 상기 조성물을 중이에 투여하여 원형창막과 접촉할 수 있도록 투여하는 것일 수 있다. 주사기, 펌프, 미세주입 장치, 스폰지재 등을 이용하여 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 Na/K ATPase 조절인자, 화학요법제, 콜라겐, 감마-글로불린, 인터페론, 항균제, 항생제, 국소 작용 마취제, 혈소판 활성화 인자 길항제, 귀 보호제, 산화질소 합성효소 억제제, 현기증 억제제, 바소프레신 길항제, 항바이러스제, 제토제, 항-TNF제, 바소프레신 수용체 조절인자, 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 면역억제제, 마크롤라이드, 라타노프로스트, TNF 전환 효소 억제제, IKK 억제제, 글루타메이트 수용체 조절인자, 항-아폽토시스제, 신경보호제, 탈리도마이드, c-jun 억제제 화합물, 히알루로니다제, 항산화제, IL-1 베타 조절 인자, ERR-베타 길항제, IGF-조절인자, Toll-유사 수용체, KCNQ 채널 조절인자, 뉴로트로핀 조절인자, ATOH 조절인자 또는 이의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 담체, 부형제, 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유일 수 있으나 특별히 한정되는 것은 아니다.
다른 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 단위체가 중합된 중합체; 및 이에 분산된 내이 질환 치료용 약물을 포함하는 고실내 약물 방출 조절형 제제로서, 상기 제제는 고실내 주사 후 졸-겔 상전이가 일어나는 제제를 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022013938-appb-img-000003
상기 화학식 1에서, R1은 H 또는 탄소수 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 또는 1 내지 6의 아실기이고, 상기 n은 10 내지 10000, 10 내지 9500, 10 내지 9000, 10 내지 8500, 10 내지 8000, 10 내지 7500, 10 내지 7000, 10 내지 6500, 10 내지 6000, 10 내지 5500, 10 내지 5000, 10 내지 4500, 10 내지 4000, 10 내지 3500, 10 내지 3000, 10 내지 2500, 10 내지 2000, 10 내지 1500, 10 내지 1000, 10 내지 900, 10 내지 800, 10 내지 700, 10 내지 600, 또는 10 내지 500이다.
상기 아실기는 (-(C=O)-알킬기)일 수 있으며, 상기 아실기의 알킬기는 탄소수 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 또는 1 내지 6이며 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다.
상기 약물 방출 조절은 고실 내에서 약물의 방출 속도 및 전달 속도를 조절하는 것을 의미한다.
일 구체예에 따르면, 상기 R1은 H, 아세틸기, 또는 헥사노일기일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 중합체는 중합도(DP)가 150 내지 400, 150 내지 350, 150 내지 300, 150 내지 250, 200 내지 400, 200 내지 350, 200 내지 300, 또는 200 내지 250일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 졸-겔 상전이가 일어나는 온도는 30 내지 34℃, 30 내지 33℃, 30 내지 32℃, 31 내지 34℃, 31 내지 33℃, 31 내지 32℃, 32 내지 34℃, 또는 32 내지 33℃일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 중합체는 N-아세틸화 글리콜 키토산 단위체가 8 내지 10%, 및 N-헥사노일화 글리콜 키토산 단위체가 30 내지 40%, 및 잔부는 글리콜 키토산 단위체가 중합된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 중합체는 하기 화학식 2로 표시되는 단위체로 이루어진 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2022013938-appb-img-000004
상기 화학식 2에서 R2는 H또는 아세틸기(-CO-CH3)이고, R3는 헥사노일기(-CO-CH2CH2CH2CH2CH3)이고, 상기 y는 10 내지 10000, 10 내지 9500, 10 내지 9000, 10 내지 8500, 10 내지 8000, 10 내지 7500, 10 내지 7000, 10 내지 6500, 10 내지 6000, 10 내지 5500, 10 내지 5000, 10 내지 4500, 10 내지 4000, 10 내지 3500, 10 내지 3000, 10 내지 2500, 10 내지 2000, 10 내지 1500, 10 내지 1000, 10 내지 900, 10 내지 800, 10 내지 700, 10 내지 600, 또는 10 내지 500일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 내이 질환 치료용 약물은 코르티코스테로이드 계열 약물일 수 있다.
상기 제제는 주사용 제형일 수 있다.
그 외 상기 제제에 대한 내용은 상기 약학적 조성물에 대한 내용을 참조하여 이해될 수 있다.
일 구체예에 따른 내이 질환 치료용 약학적 조성물은 고실내 투여시 부작용 없이 약물을 내이로 효과적으로 전달할 수 있다.
일 구체예에 따른 약물 방출 조절형 제제는 고실내 투여시 부작용 없이 서방성 또는 속방성으로 약물을 전달할 수 있다.
도 1은 HGC 써모겔의 합성 방법, HGC의 열겔화 원리, 및 덱사메타손의 내이 전달을 위한 HGC와 덱사메타손 혼합물의 고실내 투여를 나타낸 개략도이다.
도 2는 GC 및 HGC의 1H-NMR (2a), ATR-FTIR 스펙트럼 (2b), HGC 농도에 따른 덱사메타손의 용해도 (2c)를 나타낸 것이다.
도 3은 20℃ 및 37℃에서 GC, HGC, HGC-DSP, 및 HGC-DEX의 졸-겔 전이를 확인한 결과(3a), 동결건조된 HGC, HGC-DSP, HGC-DEX 샘플의 FE-SEM 이미지(3b)를 나타낸 것이다.
도 4는 (4a) GC (4b) HGC; (4c) HGC-DSP0.5; (4d) HGC-DEX0.5; (4e) HGC-DSP1; (4f) HGC-DEX1의 온도 의존적 유변학적 거동을 나타낸 것이다.
도 5는 DSP 농도 증가에 따른 DSP 및 HGC-DSP의 시험관내 약물 방출 프로파일(5a) 및 DEX 농도 증가에 따른 DEX 및 HGC-DEX의 시험관내 약물 방출 프로파일(5b)를 나타낸 것이다.
도 6은 HGC의 고실내 잔류안전성을 CT 및 T2 강조 MRI(T2-weighted MRI)로 분석한 결과이다.
도 7은 HGC의 고실내 투여의 유해효과를 H&E 염색에 의한 조직병리학적 분석(7a) 및 전체 마운트 염색(7b)으로 확인한 결과이다. (7a)에서 좌측은 정상, 가운데는 식염수 주입 21일 후, 우측은 HGC 주입 21일 후 중이 점막의 단면 조직병리학적 소견(histopathologic finding)이다. 상단 스케일 바는 1000 ㎛이고 하단 스케일바는 50 ㎛이다. (7b) HGC 주입 21일 후에 청각 상피의 전체 마운트(whole-mount)이다. 조직을 미오신-VIIa(빨간색), 로다민 팔로이딘(녹색)으로 염색하여 유모 세포(auditory hair cell)와 액틴을 시각화한 다음 병합(merge)했다. OHC는 외부 유모 세포(outer hair cell), IHC는 내부 유모 세포(inner hair cell)이고, 스케일 바는 50 ㎛이다.
도 8a는 DSP, HGC-DSP, 및 HGC-DEX를 고실내 주사한 군들의 외림프액(perilymph fluid)에서의 DEX(DSP) 농도를 확인한 결과이고, 도 8b는 DSP, HGC-DSP, HGC-DEX의 고실내 주사 후 30분 및 90분 경과한 시점에서 달팽이관 조직으로 흡수된 DEX(DSP)의 정량 분석결과이다.
도 9는 덱사메타손을 담지한 마이크로스피어의 SEM 이미지(9a) 및 광학 현미경 촬영 이미지(9b)를 나타낸 것이다.
도 10은 덱사메타손을 담지한 마이크로스피어가 분산된 HGC의 in vitro 약물 방출 실험 결과이다. 도 10a는 023 마이크로스피어, 도 10b는 061, 062 마이크로스피어를 이용한 실험 결과이다.
도 11은 약물이 담지된 마이크로스피어(M-DEX)의 가수 분해 실험 결과이다. 도 11은 시간 경과(0, 7, 14, 21 및 28일 후)에 따른 M-DEX의 SEM 이미지이다.
도 12는 HGC, HGC/DEX, HGC/M-DEX 및 HGC/DEX/M-DEX의 표면과 단면의 SEM 이미지이다.
도 13은 HGC의 시간 경과에 따른 보존성을 잔류 무게로 나타낸 그래프이다. 도 13은 HGC를 PBS에 보관한 경우와, 분해 효소로 리소자임을 사용한 경우를 비교한 그래프이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
1. 물질 준비
글리콜 키토산(GC, DP(Degree of polymerization)≥200, 아세틸화도 = 9.34 ± 2.5%, 1H-NMR 측정)은 Wako(일본)로부터 구입했다. 헥사노익산 무수물(Hexanoic anhydride, 97%)은 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구입했다. 아세톤과 메탄올은 삼천화학(한국)에서 공급받았다. 투석막(MWCO=12~14kDa)은 Spectrum Laboratories(USA)로부터 구입했다. 중수(Deuterium oxide, D2O) 및 Dulbeccos 인산염 완충 식염수(PBS)는 Sigma-Aldrich(미국)로부터 구입했다. 덱사메타손(Dexamethasone, DEX, micronized) 및 DEX 인산이나트륨염(DEX phosphate disodium salt, DSP)은 각각 Farmabios(이탈리아) 및 Steraloids(미국)으로부터 구입했다.
2. N-헥사노일 글리콜 키토산(HGC) 합성 및 특성분석(characterization)
HGC는 글리콜 키토산(GC)의 N-헥사노일화 반응에 의해 합성되었다. GC(3g) 및 헥사노익산 무수물(1.106 mL)을 물과 메탄올(50:50) 혼합용매 700 mL에 용해시키고 실온에서 24시간 자기 교반(magnetic stirring) 하였다. 반응 용액을 과량의 차가운 아세톤에 붓고 중합된 생성물인 HGC를 침전시켰다. 생성물을 투석막(molecular weight cut-off: 12-14 kDa)을 이용하여 2일 동안 증류수로 투석하여 HGC를 정제하고 동결건조하였다.
HGC의 화학적 조성은 AVANCE III 600 분광계(Bruker, Germany)를 사용하여 600MHz에서 1H-NMR 분광법으로 분석하였다. HGC 중합체 샘플을 D2O에 0.5 wt%로 용해시켰다. 4.85ppm의 D2O 피크를 기준 피크로 설정했다. HGC의 화학적 조성은 Nicolet iS 5(Thermo Scientific, USA)를 사용한 ATR-FTIR 특성분석(characterization)으로 확인되었다. GC 및 HGC의 ATR-FTIR 스펙트럼은 4000 내지 750cm-1의 주파수 범위에서 4cm-1의 분해능으로 32회 스캔한 환경(circumstance)에서 기록되었다.
3. 용해도 시험(solubility test)
HGC 농도 변화에 따른 덱사메타손(DEX)의 수용해도 변화를 분석하였다. HGC(PBS, HGC Conc.= 0~4%,w/v) 수용액 3mL에 DEX를 과량 첨가하였다. 그 다음, 샘플을 30분 동안 교반하고 진탕 수조에서 24시간 동안 인큐베이션하였다(100rpm, 37℃). 모든 시료를 시린지 필터(0.8㎛)로 여과하여 침전물을 제거한 후 UV-visible spectrophotometer(V-730, JASCO, Korea)를 이용하여 분석하였다. DEX의 용해도 값은 242nm에서 얻은 다양한 DEX 농도의 표준 곡선을 사용하여 결정되었다. 테스트는 세 번 반복되었다.
4. 약물이 담지된 HGC 써모겔 준비
HGC 수용액(PBS, 4 wt%)을 DSP(친수성 형태의 DEX) 또는 DEX(소수성 형태의 DEX)와 단순히 물리적 혼합하여 약물이 로딩된 HGC 써모젤을 제조했다. 먼저, 40 mg의 HGC를 1mL의 PBS(pH 7.4)에 용해시키고 4℃에서 냉장고에 보관하였다. DSP 또는 DEX(5 또는 10 mg)를 HGC 용액에 첨가하고 볼텍싱으로 혼합하여 0.5 또는 1.0 중량%의 약물 농도를 갖는 DSP 로딩된 HGC(HGC-DSP) 및 DEX 로딩된 HGC(HGC-DEX) 샘플을 얻었다.
5. 온도감응형 졸-겔 상전이 (Thermo-sensitive sol-gel transition)
HGC 써모겔 제형의 졸-겔 전이 거동은 1 ℃/min의 가열 속도로 틸팅 튜브 방법(tilting tube method)을 사용하여 관찰하였다. 졸-겔 전이 온도는 바이알을 기울인 후 1분 이내에 흐르지 않는 겔 상태를 나타내는 것으로 결정되었다. 실험은 세번 수행되었다.
6. 유변학적 분석 (Rheological analysis)
HGC 용액 및 약물이 로딩된 HGC 용액의 유변학적 분석은 MARS-40 레오미터(Thermo Scientific, Germany)를 사용하여 수행했다. GC, HGC, HGC-DSP 및 HGC-DEX 샘플의 수용액을 평행판(직경 60mm 및 갭 1mm) 사이에 놓았다. 주파수는 1Hz이고 10Pa의 일정한 응력(stress)이 측정에 사용되었다. 온도는 0.05℃/s의 가열 속도로 10℃에서 45℃로 증가하였다.
7. In Vitro 약물 방출
써모겔 제형의 시험관 내 약물 방출 프로파일을 투석막을 사용하여 PBS(pH 7.4)에서 시험했다. 약물 농도가 0.5 또는 1 중량%인 제조된 써모겔 제형(HGC-DSP 및 HGC-DEX)을 투석막 백(MWCO= 12~14 kDa, 폭: 10 mm)에 주입하였다. 그런 다음 투석백을 50 mL의 PBS에 담그고 37 ℃ 및 100 rpm 이하 조건의 진탕 수조(SI-600R, Jeio Tech, Seoul, Korea)에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후 10ml의 방출 배지(release medium)를 꺼내고 동일한 양의 새로운 배지를 다시 첨가하였다. 수집된 샘플을 UV-vis 측정으로 분석했다. DEX 방출 프로파일은 242 nm에서 DEX의 UV 흡광도를 측정하여 결정되었다. 실험은 세 번 수행되었으며 데이터는 평균 ± SD로 표시하였다.
8. 실험동물
모든 동물 실험은 충남대학교 동물실험위원회(202006A-CNU-085)의 승인을 받았다. 본 연구에는 체중이 각각 200 내지 250g인 98마리의 수컷 알비노 기니피그가 사용되었다. 20마리는 HGC 써모젤의 중이(middle ear) 주사 후 잔류 안정성을 분석하기 위해 각 주사 시점(1, 3, 7, 14 및 21일)에서 마이크로 컴퓨터 단층촬영(CT) 및 자기공명영상(MRI)을 실시하고 조직병리학적 분석을 실시하는데 이용되었다. 72마리의 동물을 HGC 써모젤의 중이(middle ear) 주사 후 각 시점(30분, 90분, 3시간, 1일, 3일 및 7일)에서 바깥림프(perilymph) 샘플링에 사용했다. 다른 6마리의 동물은 CT 및 T2-체중(N=4)에 대한 정상 대조군으로 사용되었고 조직병리학적 연구를 위해 21일째에(N=2) 식염수를 고실내(intratympanic) 주사 후 사용하였다.
9. 고실내 주사 (Intratympanic injection)
수술 전 동물을 alfaxan(15 mg/mL, Careside사) 및 Rumpun(23 mg/mL, Careside사)을 근육 주사(intramuscular injection)하여 마취시켰다. 또한 국소마취(local anesthesia)를 위해 1% 리도카인(lidocaine) 0.5ml를 후이부(postauricular area)에 피하주사하였다. 마취된 동물을 온도 조절된 가열 패드에 엎드린 자세로 두었다. 귓바퀴뒤(retro auricular)를 절개 후 측두골(temporal bone)을 노출시키고 외과용 현미경(Hitachi KP-D50 컬러 디지털 현미경 카메라에 연결된 Carl Zeiss OPMI f 170 Surgical Tilting Head)으로 원형창(round window) 막을 시각화했다. HGC-DSP 및 HGC-DEX 써모겔 제형(샘플 부피= 100μL, 약물 농도= 5 mg/mL(0.5 중량%에 해당))을 26 게이지 바늘을 사용하여 고막에 투여했다. 주사 후 바늘을 조심스럽게 제거하고 치과용 시멘트(Durelon™ Carboxylate Luting Cement, 3M)를 해당 부위에 도포하고 피부 절개를 봉합하였다. 이 일련의 실험에서 어떤 동물도 희생되지 않았다.
10. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Tomography): CT 및 T2 강조(CT and T2-weighted) MRI 영상
컴퓨터 단층촬영(CT) 및 T2 강조 자기공명영상(MRI)을 사용하여 주사 후 각 시점(1, 3, 7, 14 및 21일)에서 영상 분석을 수행했다. CT 이미지는 Quantum GX2 micro-CT Imaging System(PerkinElmer, Waltham, MA, US)에서 획득했다. MR 이미지는 4.7 T BioSpec, 47/40 USR(Bruker Biospin, Germany)을 사용했다.
11. HGC 써모젤의 고실내 주사 후 조직병리학적 분석(Histopathologic analysis)
고실내 투여된 HGC 써모겔이 중이(middle ear)에 부정적인 영향을 미치는지 조사하기 위해, 식염수 또는 HGC 써모겔을 고실내 주사하고 21일이 지난 동물로부터 달팽이관(cochlear)을 얻고, 중이 점막 조직(middle ear mucosa tissue)의 염증을 평가하였다. 달팽이관 샘플을 PBS 중 4% 파라포름알데히드에 2시간 동안 넣고, EDTA에서 3주 동안 탈회하고(decalcified), 파라핀 포매하고(embedded), 4 ㎛ 두께로 연속 섹션하고 헤모톡실린과 에오신으로 염색했다. 염색된 조직 절편을 검사하고 광학현미경(Olympus BX51)을 사용하여 대표적인 필드를 촬영했다.
달팽이관 조직(cochlear tissue)에서 DEX 흡수를 평가하기 위해, 동물을 수술 후 30분 또는 90분에 희생시켰다. 조직을 PBS에서 30분 동안 헹구고 10% 일반 염소 혈청(normal goat serum)(Vector Laboratories, Inc.) 및 0.3% Triton X-100(Sigma-Aldrich Co.) 용액에서 1시간 인큐베이션하여 비특이적 항체 결합을 차단하였다.
그 다음, 조직을 4℃에서 밤새 차단 용액하에서 1:200 농도의 토끼 항-DEX 1차 항체(Abcam, Cambridge, MA)로 염색하였다. PBS에서 1시간 동안 헹군 후, 조직을 1:200 희석에서 상응하는 Alexa Fluor 594 염소 항-토끼 이차 항체(Molecular Probes, Eugene, OR)와 함께 인큐베이션하였다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 조직을 PBS에서 30분 동안 헹구고 1:200 희석된 Hoestch 33342(Invitrogen)로 5분 동안 염색했다. 실온에서 배양한 후 조직을 PBS에서 30분 동안 헹구고 Crystal Mount(Biomeda)를 사용하여 유리 슬라이드에 장착했다. 달팽이관 조직에서의 약물 흡수는 형광현미경(BX53F2, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
달팽이관 유모 세포(cochlear hair cell)의 생존을 평가하기 위해 HGC 써모젤을 고막내 주사한 후 21일째에 동물을 희생시켰다. 조직을 PBS 중 4% 파라포름알데히드에 4℃에서 30분 동안 고정했다. 달팽이관 골벽(cochlear bony wall)과 측벽(lateral wall) 조직을 제거한 후, 남은 달팽이관 조직을 면역염색하였다. 조직을 PBS에서 30분 동안 헹구고 10% 일반 염소 혈청 및 0.3% Triton X-100이 포함된 PBS 용액에서 1시간 인큐베이션하여 비특이적 항체 결합을 차단하였다. 차단 후, 조직은 4℃에서 밤새 1:200 희석된 모노클로날 항-미오신 VIIa 1차 항체(Proteus BioSciences, Inc.)로 염색되었다. 조직을 PBS에서 60분 동안 헹구었다. 헹군 후 조직을 1:200 희석된 AlexaFluor 594 염소 항-마우스 이차 항체 및 AlexaFluor 488 Phalloidin 항체로 실온에서 2시간 인큐베이션하여 염색했다. 조직을 PBS에서 15분 동안 헹구었다. 헹군 후 Crystal Mount를 사용하여 유리 슬라이드에 조직을 장착했다. 조직은 형광현미경(BX53F2, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다.
12. 달팽이관 외림프(cochlear perilymph)의 약물 농도 측정
달팽이관 외림프 내 DEX의 농도를 평가하기 위해 DEX 담지 HGC 써모겔을 고실내 주입 후 각 시점(30분, 90분, 3시간, 1일, 3일 및 7일)에서 외림프 샘플링을 수행하였다. 마취 하에 측두골(temporal bone)을 제거하고 고실 수포(tympanic bulla)를 10ml 식염수로 세척했다. sharp pick으로 작은 정점 달팽이관 절개술(Small apical cochleostomy)을 수행하고 외림프(perilymph)를 매 4 ㎕ 부피로 표시된 걸이형 눈금 유리 모세관(hang-held graduated glass capillary tubes, IntraMAPK micropipettes)에 수집했다. 달팽이관액(Cochlear fluid)과 DEX 표준시료를 인공외림프액(artificial perilymph)으로 1:11로 희석하고, 각각의 혼합물을 50% MeOH로 1:3으로 다시 희석하였다. 모든 샘플은 외림프의 DEX 농도를 LC-MS/MS로 측정하기 위해 UHPLC/Tandem 질량 분석기(QTRAP 6500 Low Mass BL210251506)가 있는 operator system(QTRAP 6500)을 사용하여 분석되었다. 샘플을 용매 A, 0.1% 포름산/DW, 및 용매 B, MeOH와 함께 C18 컬럼(Atlantis dC18 컬럼)에 주입했다. 유속은 0.3ml/min이었다. 날짜 스캔은 MRM(다중 반응 모니터링)으로 수행되었다.
13. 통계 분석
이미지 대비(contrast), 이미지 중첩(superimposition) 및 흑백 형광 이미지(monochrome fluorescence image)의 채색(colorization)의 조정은 Adobe Photoshop(버전 7.0)을 사용하여 수행했다. 데이터 그래프 및 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 6(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)에서 수행되었다. Two-way ANOVA는 DEX 농도 측정에 사용되었다. 모든 실험은 여러 번 반복되었다. 그룹 차이는 각 경우에 p < 0.05에서 유의미한 것으로 간주되었다.
이하 실시예에 따르면, N-아실 글리콜 키토산 기반 써모겔은 PEG-PPG 및 PEG-PLGA와 같은 블록 공중합체 기반 써모겔보다 물리적 안전성, 생체적합성, 생분해성, 열겔화, 및 기타 생체 기능 측면에서 내이에 주입하기에 더 우수한 특성을 가지고 있음이 입증되었다.
실시예 1: HGC의 합성 및 특성분석(characterization)
N-아실 글리콜 키토산 중에서 N-헥사노일 글리콜 키토산(HGC)는 체온에 반응하여 졸-겔 전이를 일으키고, N-헥사노일화의 정도(degree of hexanoylation, DH)를 변화시켜 물리화학적 특성 및 열겔화 특성을 수정할 수 있으므로 고실내 주사 투여에 적합한 약물 전달 플랫폼이 될 수 있다.
글리콜 키토산(GC)를 N-헥사노일화(N-hexanoylation)시켜 N-헥사노일 글리콜 키토산(HGC)을 합성하고 내이 전달을 위한 주사 가능한 제형으로서 평가하였다. (도 1 참고)
HGC의 합성 결과는 1H-NMR 및 ATR-FTIR 측정으로 특성화하였다.
도 2a는 HGC와 GC에 대한 1H-NMR 결과이다. 4.85 ppm의 D2O 피크를 기준 피크로 설정하여 분석했다. 3.3 내지 4.0 ppm에서 나타나는 피크는 글루코피라노실(glucopyranosyl) 고리의 양성자(H-2 ~ H-8)에 해당하고, 2.7 ppm에서 나타나는 피크는 1차 아민 잔기의 양성자에 기인하며, 이들은 GC 및 HGC의 공통적인 피크이다. HGC의 특징적인 H 피크 중에서 0.8 ppm(-CH3)는 메틸 양성자에 해당하고, 1.3 ppm(-CH2-CH2-CH3), 1.6 ppm(-CO-CH2-CH2-), 2.3 ppm(-CO-CH2-)는 헥사노일기의 메틸렌 양성자에 해당한다. 헥사노일화 정도는 글루코피라노실 고리와 헥사노일기의 양성자 피크의 적분값과 비교하여 약 36%로 계산되었다.
도 2b는 HGC의 화학구조를 ATF-FTIR 분석으로 확인한 결과이다. 히드록시기의 신축 진동(stretching vibration)에 해당되는 넓은 피크가 3400 cm-1에서 나타나며, 이는 동일 영역의 N-H 신축진동과 중첩되었다. HGC의 특징적인 피크는 2890 cm-1에서 나타났는데, 이는 헥사노일 그룹의 메틸 및 메틸렌 그룹의 CH 신축 진동에 기인한다. GC의 아미노 굽힘 진동(bending vibration)에 의한 흡수 피크가 1596 cm-1에서 관찰된 반면, HGC는 각각 카르보닐 신축 진동 및 아마이드 II(amide II) 굽힘 진동에 해당하는 1655 cm-1 및 1555 cm-1에서 흡수 피크가 관찰되었으며, 이는 GC의 N-헥사노일화 반응이 성공적으로 수행되었음을 나타낸다.
HGC 고분자는 친수성(hydrophilic) GC 백본과 소수성(hydrophobic) 헥사노일기로 구성되어 양친매성(amphiphilic)을 나타내므로 친수성 약물 및 소수성 약물 모두 담지할 수 있을 것으로 기대된다.
이하 소수성 덱사메타손(DEX)에 대한 HGC의 가용화 효과를 평가했다.
도 2c는 PBS에서 덱사메타손의 용해도를 HGC 농도(0 내지 4 wt%)의 함수로 나타낸 것이다. HGC의 농도가 0 wt%일 때 덱사메타손의 수용해도는 64 ㎍/ml이었다. HGC의 농도가 증가함에 따라 덱사메타손의 용해도가 증가하여, HGC가 4 wt%일 때 덱사메타손의 용해도는 221 ㎍/ml(약 4배)로 증가하였다. 따라서 HGC 써모겔은 덱사메타손(DEX)의 수용해도를 향상시킴을 나타낸다.
실시예 2: 약물이 담지된 써모겔(drug loaded thermogel) 제조
하기 표 1은 약물 담지 써모겔의 화학 조성을 나타낸 것이다.
Thermogel
samples		 Polymer Conc.
(wt%)		 Drug Conc.
(wt%)		 Sol-Gel transition (℃)
Tgel a Tgel b
HGC 4.0 - 32 30.7
HGC-DSP 0.5 0.5 30 27.3
HGC-DSP 1.0 1.0 25 22.0
HGC-DEX 0.5 0.5 30 29.7
HGC-DEX 1.0 1.0 27 25.6
a:The sol-gel transition temperature determined by tube tilting method
b:The sol-gel transition temperature determined by rheological measurement
표 1에 나열된 바와 같이, 약물이 담지된 써모겔은 HGC 수용액 (4 wt%)과 DSP 또는 DEX (0.5 wt% 및 1.0 wt%)의 단순한 혼합으로 제조하였다.
DSP는 DEX의 친수성 형태이며 수성 용매 하에서 용해도가 높다. DSP는 HGC와 잘 혼합되어 투명한 HGC-DSP 혼합물이 준비되었다. (도 3a 참고)
반면 DEX는 용해도가 낮기 때문에 HGC-DEX 혼합물은 투명하지 않았다. 그러나 겔화된 HGC-DEX의 동결건조 샘플 표면 및 단면의 FE-SEM 이미지에 따르면 마이크로화된 DEX 입자가 써모겔 매트릭스에 균일하게 분산되어 있는 것으로 관찰되었다.
모든 HGC-DEX 써모겔은 약물 현탁액을 응집 또는 침전없이 안정적으로 유지하는 것으로 나타났다. 따라서 HGC는 양친매성을 가지고 소수성 약물을 효과적으로 분산시키므로 소수성 약물의 주사 제형으로서 사용될 수 있다.
실시예 3: 열민감성 졸-겔 상전이(Thermo-sensitive sol-gel transition)
HGC, HGC-DSP, 및 HGC-DEX의 열민감성 졸-겔 상전이 거동을 튜브 틸팅 방법과 유변학적 분석을 통해 분석했다.
도 3a는 20℃ 및 37℃에서 GC, HGC, HGC-DSP 및 HGC DEX의 수용액(4wt%, PBS)의 이미지를 나타낸 것이다. GC에서는 상전이가 관찰되지 않았다. HGC 용액은 온도가 37℃로 증가함에 따라 유동성있는 졸 상태에서 비유동성 겔 상태로 뚜렷한 상전이를 나타냈다. HGC는 약 32℃에서 열겔화(thermogelation)을 나타내는 것으로 관찰되었다.
HGC-DSP 및 HGC-DEX의 졸-겔 전이는 친수성 DSP 또는 소수성 DEX의 존재가 HGC의 열겔화 거동에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하기 위해 관찰되었다. HGC-DSP 및 HGC-DEX 모두 HGC보다 약간 더 낮은 겔화 온도를 보였고 약물의 농도가 증가함에 따라 겔화 온도는 감소하였다. 이는 DSP(DEX의 인산나트륨염 형태) 또는 소수성 DEX의 혼합이 헥사노일기 간의 소수성 상호작용을 촉진했기 때문일 수 있다.
GC, HGC, HGC-DSP 및 HGC-DEX의 점탄성 특성(viscoelastic properties), 탄성(G', elstic) 및 손실 계수(G'', loss moduli)는 10 내지 45℃의 온도 범위에서 유변학적 실험으로 관찰되었다. G'와 G''의 교차 온도(crossover temperature)는 졸-겔 상전이를 결정하기 위한 겔화점(gelation point)으로 정의되었다.
그림 4에 따르면, GC 용액의 G' 값은 전체 온도 범위에 걸쳐 교차점이 나타나지 않고 G'' 값보다 지속적으로 낮았으며, 이는 GC 용액에서 열에 민감한 졸-겔 전이가 발생하지 않았음을 나타낸다. 그러나, HGC, HGC-DSP, HGC-DEX의 G' 값은 초기 온도에서 G''보다 낮았으나 온도가 증가함에 따라 급격히 증가하여 G' 값이 G'' 값보다 높아졌다. HGC-DSP 및 HGC-DEX의 경우 G' 및 G" 값은 HGC보다 낮은 온도에서 교차하며 이는 이전 튜브 틸팅 방법의 결과와 일치한다.
실시예 4: In vitro 방출 역학(release kinetics)
친수성 DSP, 소수성 DEX, 이들이 로딩된 HGC-DSP 및 HGC-DEX에 대해 37°C의 PBS에서 시험관 내 약물 방출 테스트를 수행했다.
도 5a에 따르면, DSP 및 HGC-DSP 제형은 약물 농도(0.5 또는 1.0wt%)에 관계없이 10시간 이내에 약물이 모두 방출되었다. HGC-DSP 써모젤은 DSP 보다 약간 지연된 방출을 보였지만 DSP가 수용성이 높은 저분자 약물이기 때문에 방출 속도를 지연시키는 데 효과적이지 않았다.
한편, HGC-DEX 제형은 약물 농도(0.5, 1.0, 2.0, 4.0 wt%)에 따라 4 일 내지 14 일 범위에서 다양한 약물 방출 프로파일을 나타냈다. HGC-DEX 0.5 및 HGC-DEX 1.0의 방출 속도는 방출 거동을 가속화할 수 있는 HGC 써모젤의 가용화 효과로 인해 유리된 DEX(free DEX) 형태보다 동일 농도 조건에서 더 빠른 방출속도를 나타냈다. 더 높은 약물 농도를 가진 HGC-DEX 2 및 HGC-DEX 4는 더 낮은 약물 농도를 가진 HGC-DEX 0.5 및 HGC-DEX 1.0 보다 서방성 거동을 나타냈는데, 이는 약물이 높은 농도로 담지되면 오히려 약물이 가용화되어 방출되는 데 더 많은 시간이 필요하기 때문일 수 있다. 상기 결과에 따르면, HGC 써모겔 제형은 필요에 따라 소수성 약물을 적절한 속도 및 용량으로 방출되도록 최적화될 수 있다.
실시예 5: 고막내 잔류 안전성(Intratympanic residual stability) 평가
HGC 써모젤은 중이강(middle ear cavity)에서 DEX의 잔류 안정성을 개선하여 내이에서 약물 흡수를 향상시킬 수 있다. 열겔화가 유스타키오관(Eustachian tube)을 통한 약물의 조기 누출(early leakage)을 방지하고 체류 시간(residence time)을 연장할 수 있기 때문이다.
In vivo 실험에서, 먼저 CT 및 T2 강조 MRI(T2-weighted MRI)로 중이강에서 HGC 써모젤의 잔류 안정성을 평가했다. 도 6에 따르면, 고실내 주사한 HGC 써모젤은 기니피그의 중이강에 21일(3주) 이상 남아 있었다. 실험 결과에 따르면 HGC 기반 써모겔은 생체 내 체류 시간이 긴 장점이 있으며, 이에 담지된 약물이 원형창막과 접촉하는 시간이 증가하여 약물을 내이에 지속적으로 전달할 수 있는 장점이 있음을 알 수 있다.
실시예 6: HGC의 안전성 평가
조직 병리학 분석(histopathological analysis) 및 청각 유모 세포(auditory hair cell)의 생존 관찰에 의해 HGC의 고실내 투여가 유해효과(adverse effect)을 미치는지 여부를 확인했다.
HGC의 고실내 투여 후 21일이 경과한 시점에 중이 및 내이의 조직학적 평가를 수행하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 중이 점막(mucosa in the middle ear)의 염증을 검출했다. 도 7a의 H&E 염색 결과에 따르면, HGC 써모겔을 고실내 주입하고 21일이 경과한 군은 중이의 부종 및 섬유화를 포함한 점막의 염증 반응의 증거가 관찰되지 않았다.
도 7b에 따르면, 내부 유모 세포(IHC) 및 외부 유모 세포(OHC)의 전체 마운트 염색(whole mount staining)에서 와우각의 모든 회전(all turns of the cochlea)에서 세포 손실 또는 사멸이 나타내지 않았다.
상기 데이터는 HGC 써모겔이 중이 또는 내이에 대해 부작용이 없음을 시사한다. 실제로도 기니피그의 중이 점막에서 염증 반응 및 내이에서 청각 유모 세포의 손실이 관찰되지 않았다. HGC 써모겔의 고실내 주사 후 다음날 모든 기니피그는 롤링과 같은 병리학적 전정 행동(pathological vestibular behavior)을 나타내지 않고 정상적으로 활동하였다. 그러므로 HGC 써모겔은 고실내 주사하여도 급성 염증, 중이 섬유증 진행, 청력 변화 등 부작용이 없을 것으로 예상되며, 내이에 국소 약물 전달을 위한 안전한 수단이 될 수 있다.
실시예 7: HGC 써모겔을 이용한 내이 약물 전달 효능 평가
HGC-DEX를 고실내 투여하고 와우내 외림프(intracochlear perilymph)의 DEX 농도와 와우(cochlear) 조직의 DEX 분포의 변화를 관찰함으로써 HGC 써모겔 제형의 효과를 평가했다. 덱사메타손은 항염증 및 유모세포 보호 효과가 있고 내이 질환 치료에 가장 많이 사용되는 약물 중 하나이기 때문에 모델 약물로 선택되었다.
DSP 단독, HGC-DSP(DSP 0.5 중량%), 또는 HGC-DEX(DEX 0.5 중량%)를 고실내 주사하고 30분, 90분, 3시간, 1일, 3일 또는 7일이 경과한 후에, 달팽이관에서 외림프를 채취하고 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분광계(LC-MS/MS)를 사용하여 DEX 농도를 측정했다.
도 8a에 따르면, DSP, HGC-DSP, 및 HGC-DEX를 고실내 주사한 군들은 주사 후 30분부터 외림프액(perilymph fluid)에서 유의한 DEX 농도가 검출되었다. DSP가 단독으로 포함된 수성 제형은 투여 후 30분 경과한 시점에 상대적으로 가장 높은 초기 농도를 보였으나, 90분 후에는 농도가 감소하였고, 3시간 후에는 DSP가 검출되지 않았다. 반면 써모젤 제형인 HGC-DSP 및 HGC-DEX는 모두 높은 약물 농도를 더 오랜 기간 동안 유지할 수 있었다. 특히, HGC-DEX 제형 투여군의 DEX 농도는 투여 후 90분에서 최고점에 도달하였으며 DSP 대조군보다 더 높은 것으로 나타났다. 또한 투여 후 1일이 경과한 시점에서도 상당한 DEX 농도가 검출되었다.
도 8b의 면역조직화학 염색(immunohistochemical staining)의 강도분석 결과에 따르면, HGC-DEX 투여군은 DSP 단독 투여군 및 HGC-DSP 투여군에 비해 달팽이관 조직으로의 약물 흡수가 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 소수성 약물을 담지한 HGC 써모겔 제형이 달팽이관 조직으로의 약물 흡수를 크게 향상시킬 수 있음을 나타낸다. DSP 단독 제형은 초기 흡수가 높을 수 있으나 유스타키오관을 통해 신속히 배출되므로 지속시간이 매우 짧다. 대조적으로 써모겔 제형은 더 오랜 시간 내이강에서 겔 상태로 머무를 수 있으며, 원형창막(RWM)과 접촉할 수 있는 시간이 더 길어서 내이로의 약물 전달 효율을 높일 수 있다. 다만 상기 동물실험 결과는 약물의 흡수를 측정한 것으로, 흡수량은 방출된 약물의 특성 및 흡수 시간에 따라 달라지므로 약물 방출 속도와 흡수량이 반드시 일치하는 것은 아니다. 즉 상기 흡수량은 고실내 약물의 서방성 방출이 가능함을 시사하나, 서방성 방출의 속도를 직접적으로 나타내는 것은 아니다.
앞서 In vitro 약물 방출 테스트에 따르면 HGC-DEX 써모겔은 약물 방출 속도가 약물 농도에 의존적이었으며, 담지된 약물 농도가 높을수록 방출속도가 오히려 느려졌다. 따라서 약물 농도가 더 높은 HGC 써모겔 제형을 사용하면 더 오랜 시간 동안 유효 약물 농도를 유지할 수 있을 것이다. 따라서 HGC 써모겔 제형은 내이로의 국소 약물 전달을 위한 효과적이고 유용한 수단이 될 수 있다.
상기 실험결과들에 따르면, HGC 기반 써모겔은 소수성 약물(예를 들면 덱사메타손) 및 친수성 약물(예를 들면 덱사메타손 포스페이트 이나트륨염(Dexamethasone phosphate disodium salt, DSP) 모두를 담지할 수 있는 고실내 주사 가능한 약물 전달 플랫폼임이 확인되었다. HGC 기반 써모겔은 졸 상태에서 약물과 물리적으로 혼합하는 간단한 방법으로 약물을 담지할 수 있으며, 특히 소수성 약물 (DEX)를 효과적으로 분산 및 가용화시켰다. 동물 실험 결과에 따르면, HGC 써모겔은 중이 및 내이강에서 유의한 세포 독성이나 염증없이 최대 21일까지 유지되었으므로, 잔류 안전성이 우수하여 내이에서 약물 농도를 오랜 시간 높은 수준으로 유지하기에 적합함을 확인하였다. 또한 HGC 써모겔 제형은 약물 유형 및 농도에 따라 다양한 방출 역학(versatile release kinetics)을 나타냈다. In vitro 약물 방출 실험에 따르면, HGC 써모겔은 약물을 0.5 중량% 또는 1.0 중량% 담지하면 약물을 속방성으로 방출하였으며, 약물을 2 중량% 또는 4 중량% 담지하면 약물을 2주 동안 지속적으로 방출할 수 있었다. 또한 약물을 0.5 중량% 담지한 HGC 써모겔은 고실내 투여 실험결과 1일간 약물을 방출하였다.
HGC 써모겔은 In vitro 약물 방출 실험에서 약물의 농도에 따라 속방성 또는 서방성 방출이 일어남을 확인하였으므로, 약물의 농도에 따라 고실내 서방성 방출이 가능할 것으로 예상된다. 따라서 HGC 써모겔은 효과적이고 안전한 내이 약물 전달 플랫폼으로써 큰 잠재력을 가지고 있음이 확인되었다.
실시예 8-1: 약물을 담지한 마이크로스피어를 포함하는 HGC 써모겔
생체적합성 및 생분해성이 우수한 고분자로 제작된 약물 담지 마이크로스피어는 약물의 서방성 방출에 이용될 수 있다. 그러나 마이크로스피어는 고실내 주사하여도 다른 부위로 쉽게 이동할 수 있으므로 고실내에서 머무르면서 지속적으로 약물을 전달하기 어려운 단점이 있다.
이를 보완하기 위해 덱사메타손을 담지한 마이크로스피어가 분산된 HGC 써모겔을 제작하고 이의 in vitro 약물 방출 속도를 측정하였다.
제형화 방법, 약물함량, 입자크기 측면에서 차이가 있는 4가지 마이크로스피어(GB-5313-023, GB-5313-061, GB-5313-062, GB-5313-075)를 준비하였다. (이하 023, 061, 062, 075로 지칭한다) 이들의 조성은 하기 표 2 및 표 3과 같다.
GB-5313-023/061/075 GB-5313-062
고분자 RESOMER RG502H RESOMER RG503H
조성(LA:GA) 50:50 50:50
분자량(g/mol) 13,000~15,000 24,000-38,000
Lot No. 제형화 방법 고분자 약물함량 (중량%) 입자크기
(D50, μm)
GB-5313-023 O/W 502H 14.8 27.04
GB-5313-061 S/O/W 502H 24.4 31.78
GB-5313-062 S/O/W 503H 12.5 33.28
GB-5313-075 O/W 502H 16.4 21.88
상기 입자크기(D50)는 입자 50%의 평균 직경을 의미한다.
상기 S/O/W는 Solid-in-Oil-in-Water Emulsion으로써, 각각 061 또는 062로 캡슐화된 고체 약물(S)를 폴리머/오일상(O)에 첨가하고, 물을 가하여 에멀젼화시켜 제조한 것이다. 상기 O/W는 캡슐화되지 않은 고체 약물을 폴리머/오일상(O)에 첨가하고, 물을 가하여 에멀젼화시켜 제조한 것이다.
상기 061은 023 대비 약물 함량이 높아 약물 방출이 빠를 것으로 예상되는 제형이다. 상기 062는 023 대비 높은 분자량을 가지는 503H 고분자를 사용하여 방출이 느릴 것으로 예상되는 제형이다. 상기 075는 023과 동일 조건으로 제조한 제형으로 입자크기가 더 작은 점에서 차이가 있다. 제작된 마이크로스피어는 도 9에 나타내었다.
In vitro 약물 방출 테스트는 다음과 같이 진행하였다.
덱사메타손을 담지한 023 마이크로스피어를 HGC 하이드로겔 4wt%와 혼합하였다. 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 PBS(pH 7.4, 50ml) 환경에서 in vitro 약물 방출 테스트를 수행하였다. 샘플링은 0, 0.5, 1, 2, 4, 7, 14, 21, 28, 30 Day 간격으로 수행했다. 투석막의 두께는 10 mm이고, MWCO는 12 내지 14 kDa이었다. 023 마이크로스피어 등의 in vitro 약물 방출 테스트 조건은 하기 표 4와 같다.
Sample HGC
(mg)		 Drug
(mg)		 Microsphere
(mg) 		Total drug (mg) Sample volume (ml)
Free DEX - 5 - 5 1
HGC + DEX 40 5 -
023 + HGC 40 - 33.78 (약물 5 mg 기준)
023 + DEX + HGC 40 2.5 16.89 (약물 2.5 mg 기준)
023 - - 33.78 (약물 5 mg 기준)
덱사메타손을 담지한 061 또는 062 마이크로스피어를 HGC 하이드로겔 4wt%와 혼합하고, 상기 023 실험과 동일한 방법으로 in vitro 약물방출 실험을 수행하였다. 061 마이크로스피어 등의 in vitro 약물 방출 테스트 조건은 하기 표 5와 같다.
Sample HGC
(mg)		 Drug
(mg)		 Microsphere (mg) Total drug (mg) Sample volume (ml)
061 - - 20.5 (약물 5 mg) 5 1
061 + HGC 40 - 20.5 (약물 5 mg)
061 + DEX + HGC 40 2.5 10.25 (약물 2.5 mg)
062 - - 40 (약물 5 mg)
Free DEX - 5 -
도 10a에 따르면, 023+HGC(023 마이크로스피어(DEX 담지)가 분산된 HGC)는 HGC+DEX 또는 023+HGC+DEX(DEX 담지 023과 DEX자체가 분산된 HGC)보다 방출이 지연되었다. 023+HGC+DEX의 경우 초기 2일까지 속방성 방출이 일어나다가 3일째부터 방출속도가 느려지면서 20일 이상 지속방출되었는데, 이는 HGC에 담지된 DEX는 HGC의 가용화 효과로 속방성 방출이 일어나며, 023에 담지된 DEX는 서방성으로 지속방출된 결과에 따른 것이다. 이러한 약물 방출 특성은 초기 속방성 방출 및 지속 방출의 조합이 필요한 환자에게 유용할 수 있다.
도 10b에 따르면, 061 마이크로스피어(DEX 담지)가 분산된 HGC(061+HGC)는 서방성 방출이 일어났으며, 061+HGC+DEX 또한 2일까지 속방성 방출이 일어나다가 3일째부터 방출속도가 느려지면서 20일 이상 지속방출되었는데, 이 또한 앞서 설명한 바와 같다.
상기 실험결과에 따르면, HGC에 담지된 DEX는 HGC의 가용화 효과로 인해 방출이 촉진될 수 있고, DEX는 생체적합성 고분자로 제작된 마이크로스피어에 담지됨으로써 지속 방출될 수 있으며, HGC에 DEX 및 마이크로스피어에 담지된 DEX가 모두 혼합되면 초기에는 높은 방출이 일어남과 동시에 장기간 지속방출도 일어날 수 있다. 또한 HGC는 고실내 주입시 체온에 의해 겔화됨으로써 약물이 다른 곳으로 이동하는 것을 억제하므로, HGC에 약물, 마이크로스피어에 담지된 약물, 또는 이들의 조합을 적절히 선택하여 혼합함으로써 목적하는 약물방출 특성을 달성할 수 있다.
실시예 8-2: 약물을 담지한 마이크로스피어를 포함하는 HGC 써모겔의 물성 분석
약물을 담지하는 마이크로스피어와 이를 포함하는 HGC 써모겔의 물성을 확인하였다. 약물로는 덱사메타손을 사용하고, 마이크로스피어는 PLGA를 사용하였다.
LA(Lactide)와 GA(Glycolide)를 다이클로로메테인에 용해시킨 후, 덱사메타손을 현탁하여 분산상을 제조하였다. 막유화장치(LDC-1, Micropore technologies)를 이용하여 상기 분산상을 연속상의 PVA 수용액(0.5% w/w)에 주입하여 에멀젼을 제조하였다. 상기 에멀젼으로부터 유기 용매를 제거하여 고형화된 마이크로스피어를 얻었고, 증류수로 세척하여 약물이 담지된 마이크로스피어(M-DEX)를 수득하였다.
먼저, 마이크로스피어에 대한 약물의 함량(loading content) 및 봉입 효율(encapsulation efficiency)을 확인하였다. 10 mg의 덱사메타손을 1 mL DMSO에 녹인 후 50% CAN으로 희석한 것을 표준액으로 하고, 10 mg의 마이크로스피어를 1 mL DMSO에 녹인 후 50% CAN으로 1250배 희석한 것을 검액으로 하여 3회 반복 측정하였다. 이동상으로 50% CAN을 사용하였으며, HPLC(CM5000, Hitachi)를 사용하여 254nm에서 덱사메타손의 흡광도를 측정하여 덱사메타손의 함량 및 봉입 효율을 측정하였다. 약물의 함량은 마이크로스피어의 양에 대해 마이크로스피어에 포함된 덱사메타손의 양의 백분율로 계산하였으며, 약물의 함량은 약 33.3%로 나타났다. 약물의 봉입 효율은 덱사메타손의 초기 양에 대해 마이크로스피어에 포함된 덱사메타손의 양의 백분율로 계산하였으며, 봉입 효율은 약 83.3%로 나타났다.
도 11은 시간에 따른 상기 마이크로스피어의 가수분해 실험을 수행한 결과이다. 약물이 담지된 마이크로스피어(M-DEX)의 SEM 관찰을 통해 상기 마이크로스피어의 형태학적 특성을 확인하였다. 도 11에 따르면, 상기 마이크로스피어는 제조 직후(0 day)에는 균일하고 뚜렷한 구형의 입자 형태를 나타냈으며, 담지된 약물 입자가 마이크로스피어의 표면에도 존재하는 것으로 나타난다. 7일 후에는 노출된 약물 입자가 사라지고 마이크로스피어 표면에 주름이 나타났으며, 21 내지 28일 후에는 마이크로스피어가 생분해되는 것으로 확인되었다.
추가적으로, 앞선 실시예와 동일한 방법으로 HGC 써모젤(HGC), 덱사메타손을 담지한 HGC 써모젤(HGC/DEX), HGC 써모젤과 덱사메타손을 담지한 마이크로스피어를 포함하는 제형(HGC/M-DEX) 및 덱사메타손을 담지한 HGC 써모젤과 덱사메타손을 담지한 마이크로스피어를 포함하는 제형(HGC/DEX/M-DEX)을 하기 표 6과 같이 준비하여 형태학적 특성 및 물성을 확인하였다.
구분 폴리머 농도
(wt%)		 약물 농도
(wt%)		 졸-겔 전이(℃)
Tgel * Tgel **
HGC 3.0 - 28 28.1
HGC/DEX 3.0 2.0 26 26.9
HGC/M-DEX 3.0 2.0 24 26.0
HGC/DEX/M-DEX 3.0 2.0 25 26.9
상기 표 6에서, Tgel *은 튜브 틸팅 방법, Tgel **은 유변학적 측정에 의해 결정된 전이 온도이다. 약물을 담지하지 않은 HGC는 대략 28℃에서 졸-겔 상전이가 관찰되었고, 약물이 담지된 제형들에서는 24 내지 26℃에서 졸-겔 상전이가 관찰되었다. 이는 소수성 약물이나 마이크로스피어의 도입에 따라 소수성 상호작용이 향상되어 더 낮은 온도에서 젤화가 나타난 것이다.
도 12는 HGC, HGC/DEX, HGC/M-DEX 및 HGC/DEX/M-DEX의 표면과 단면의 SEM 이미지이다. 도 12에 따르면, HGC에서는 하이드로겔 고유의 다공성 구조가 관찰되며, HGC/DEX에서는 다공성 구조의 표면에 약물 입자가 균일하게 분산되는 것으로 나타난다. HGC/M-DEX와 HGC/DEX/M-DEX에서는 다공성 망상 구조에 트랩된 마이크로스피어의 존재를 확인할 수 있었다.
도 13은 HGC의 보존성을 나타낸 그래프이다. HGC를 PBS에 보관하여 시간 경과에 따라 관찰하였을 때, 초기에는 팽윤에 의해 HGC의 무게가 증가하였다가 점차 감소하였지만, 15일 경과 후에도 약 70% 이상의 잔류 무게를 유지하였다. 이는 종래 폴록사머와 같은 합성 고분자 기반의 써모젤이 수 시간 내에 용해되는 것과 비교되는 결과이다. 또한, HGC를 분해 효소인 리소자임(lysozyme) 존재 하에 PBS에 보관시에는 하루 이내에 분해되는 생분해성을 갖는 것으로 나타나, HGC 써모젤은 안정성과 생분해성을 동시에 가지는 재료로서 유용함을 확인하였다.
도 14는 약물이 담지된 제형들의 약물 방출 거동을 관찰한 결과이다. 수용성 약물 대조군으로는 DSP의 수용액 제형을 사용하였으며, 상기 대조군은 수 시간 만에 약물 방출이 빠르게 완료된 것으로 나타났다. 반면, 소수성 약물 대조군으로는 덱사메타손(DEX)을 사용하였으며, DSP 대비 서방형 방출 형태를 나타냈지만, 방출 제어보다는 난용성에 기인한 용해도 한계를 나타낸 것으로 판단된다. HGC/DEX는 HGC의 가용화 효과에 따라 소수성 약물 대조군(DEX)보다 효과적인 방출 거동을 나타냈다. HGC/M-DEX와 HGC/DEX/M-DEX 제형은 HGC/DEX 대비 유사한 속도로 한 달 정도의 서방형 방출 형태를 나타냈다. 마이크로스피어를 포함하는 제형은 안정적이면서, 조절이 가능한 방출 거동을 나타낼 수 있다는 점에서, 약물 농도에 의존하는 HGC/DEX 제형보다 서방형 방출의 제어에 용이하다.
상기 실험결과에 따르면, HGC에 담지된 DEX는 HGC의 가용화 효과로 인해 방출이 촉진될 수 있고, 마이크로스피어를 포함하는 제형 및 써모젤과 마이크로스피어가 혼합된 제형은 마이크로스피어의 도입에 따라 약물 봉입 효율이 높고, 방출 제어가 용이하며, 생분해성 조절에 따른 방출 속도를 수 주에서 수 개월까지 조절이 가능한 특성을 달성할 수 있다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 단위체가 중합된 중합체; 및 내이 질환 치료용 약물을 포함하고,
    상기 중합체는 온도에 따라 졸-겔 상전이가 일어나며,
    고실내 주사 투여로 내이 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022013938-appb-img-000005
    상기 화학식 1에서, R1은 H 또는 탄소수 1 내지 10의 아실기이고,
    상기 n은 10 내지 10000이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 H, 아세틸기, 또는 헥사노일기인,
    약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 중합체는 중합도(DP)가 200 내지 400인,
    약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 졸-겔 상전이가 일어나는 온도는 30 내지 34℃인,
    약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 중합체는 N-아세틸화 글리콜 키토산 단위체가 8 내지 10%, 및 N-헥사노일화 글리콜 키토산 단위체가 30 내지 40%, 및 잔부는 글리콜 키토산 단위체가 중합된 것인,
    약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 내이 질환 치료용 조성물은 코르티코스테로이드 계열 약물인,
    약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 상기 중합체를 0.5 내지 4 중량%로 포함하는 것인,
    약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 친수성 약물은 속방성으로 방출하고, 소수성 약물은 서방성으로 방출하는 것인,
    약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 내이 질환 치료용 약물은 약물 자체, 마이크로스피어에 담지된 형태, 또는 이들의 조합인,
    약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 마이크로스피어는 분자량 5000 내지 200,000의 생분해성 고분자를 포함하고, 직경이 10 내지 100㎛인, 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 내이 질환은 메니에르병, 감각신경성 난청, 이독성 난청, 소음성 난청, 노인성 난청, 이명, 전정 신경염, 청신경 종양, 이경화증, 외상성 난청 및 자가면역 내이 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 약학적 조성물.
  12. 하기 화학식 1로 표시되는 단위체가 중합된 중합체; 및 이에 분산된 내이 질환 치료용 약물을 포함하는 약물 방출 조절형 제제로서,
    상기 제제는 고실내 주사 후 졸-겔 상전이가 일어나는 제제:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022013938-appb-img-000006
    상기 화학식 1에서, R1은 H 또는 탄소수 1 내지 10의 아실기이고,
    상기 n은 10 내지 10000이다.
PCT/KR2022/013938 2021-10-01 2022-09-19 N-아실화된 글리콜 키토산을 포함하는 고실내 약물 제어 방출형 제형 WO2023054951A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202280063205.7A CN117956981A (zh) 2021-10-01 2022-09-19 含n-酰化乙二醇壳聚糖的鼓室中药物控制释放型剂型

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0131088 2021-10-01
KR1020210131088A KR102661766B1 (ko) 2021-10-01 2021-10-01 N-아실화된 글리콜 키토산을 포함하는 고실내 약물 제어 방출형 제형

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023054951A1 true WO2023054951A1 (ko) 2023-04-06

Family

ID=85783106

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/013938 WO2023054951A1 (ko) 2021-10-01 2022-09-19 N-아실화된 글리콜 키토산을 포함하는 고실내 약물 제어 방출형 제형

Country Status (3)

Country Link
KR (1) KR102661766B1 (ko)
CN (1) CN117956981A (ko)
WO (1) WO2023054951A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004002329A (ja) * 2002-03-22 2004-01-08 Lion Corp 皮膚賦活外用組成物
US20120277199A1 (en) * 2009-10-21 2012-11-01 Otonomy, Inc. Modulation of Gel Temperature of Poloxamer-Containing Formulations

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101262056B1 (ko) 2010-08-30 2013-05-08 충남대학교산학협력단 글리콜 키토산 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약물 전달체

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004002329A (ja) * 2002-03-22 2004-01-08 Lion Corp 皮膚賦活外用組成物
US20120277199A1 (en) * 2009-10-21 2012-11-01 Otonomy, Inc. Modulation of Gel Temperature of Poloxamer-Containing Formulations

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHO IK SUNG; PARK CHUN GWON; HUH BEOM KANG; CHO MYEONG OK; KHATUN ZEHEDINA; LI ZHENGZHENG; KANG SUN-WOONG; CHOY YOUNG BIN; HUH KAN: "Thermosensitive hexanoyl glycol chitosan-based ocular delivery system for glaucoma therapy", ACTA BIOMATERIALIA, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 39, 6 May 2016 (2016-05-06), AMSTERDAM, NL, pages 124 - 132, XP029596578, ISSN: 1742-7061, DOI: 10.1016/j.actbio.2016.05.011 *
ERNEST PALOMER, BUECHLER JOHANNA, SALINAS PATRICIA C.: "Wnt Signaling Deregulation in the Aging and Alzheimer’s Brain", FRONTIERS IN CELLULAR NEUROSCIENCE, FRONTIERS RESEARCH FOUNDATION, CH, vol. 13, 22 May 2019 (2019-05-22), CH , XP055611339, ISSN: 1662-5102, DOI: 10.3389/fncel.2019.00227 *
SHI HUI; WANG YUAN; BAO ZHISHU; LIN DEQING; LIU HUI; YU AILING; LEI LEI; LI XINGYI; XU XU: "Thermosensitive glycol chitosan-based hydrogel as a topical ocular drug delivery system for enhanced ocular bioavailability", INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, ELSEVIER, NL, vol. 570, 9 September 2019 (2019-09-09), NL , XP085840511, ISSN: 0378-5173, DOI: 10.1016/j.ijpharm.2019.118688 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102661766B1 (ko) 2024-04-26
KR20230047802A (ko) 2023-04-10
CN117956981A (zh) 2024-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6448283B1 (en) Methods for preventing/treating damage to sensory hair cells and cochlear neurons
CN107278151A (zh) 舒尼替尼制剂及其在治疗青光眼中的使用方法
WO2018030612A1 (ko) 연부조직 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어 및 이의 제조방법
Musazzi et al. A new melatonin oral delivery platform based on orodispersible films containing solid lipid microparticles
WO2018147660A1 (ko) 정신질환 또는 중추신경계 질환 치료용 약물전달 제형
Chen et al. Injectable bio-responsive hydrogel for therapy of inflammation related eyelid diseases
WO2021080345A1 (ko) 약물전달시스템으로서의 안구 주입형 마이크로젤 및 이를 포함하는 하이드로젤
WO2023054951A1 (ko) N-아실화된 글리콜 키토산을 포함하는 고실내 약물 제어 방출형 제형
Shao et al. In situ mucoadhesive hydrogel capturing tripeptide KPV: the anti-inflammatory, antibacterial and repairing effect on chemotherapy-induced oral mucositis
Singh et al. TPGS stabilized sublingual films of frovatriptan for the management of menstrual migraine: Formulation, design and antioxidant activity
WO2019059479A1 (ko) 레바미피드를 함유하는 새로운 안구건조증 치료용 점안 조성물 및 이의 가용화 및 안정화 방법
CA3062744A1 (en) Neurotrophins for use in the treatment of hearing loss
KR101464003B1 (ko) 고형 조성물을 이용한 후안부 조직으로의 비침습성 약물전달 시스템
BRPI0604577B1 (pt) formulação farmacêutica para administração intraocular de fármacos e processo de obtenção
WO2019154895A1 (en) Gel formulation for preventing or treating hearing loss
WO2023038202A1 (ko) 생분해성 고분자를 이용한 서방형 미립구 및 이의 제조방법
Le et al. Novel self-degradable prodrug blend thermogel for intratympanic drug delivery to treat inner ear diseases
WO2024096629A1 (ko) Cftr 조절제 화합물을 포함하는 점안용 조성물
WO2023014117A1 (ko) 안구건조증 치료를 위한 레코플라본 함유 점안 조성물 및 이의 제조방법
WO2023224213A1 (ko) 약물전달체, 이를 포함하는 귀 질환 치료용 약학적 조성물 및 약물 방출 조절형 제제
WO2024101859A1 (ko) 덱사메타손 아세테이트를 포함하는 서방형 주사제제 및 그 제조방법
WO2023239200A1 (ko) 폴리(유기포스파젠) 고분자를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
Han et al. Safety and efficacy of intratympanic histamine injection as an adjuvant to dexamethasone in a noise-induced murine model
WO2024049279A2 (ko) 루프롤라이드를 포함하는 서방형 미립구, 이를 포함하는 주사제제 및 이의 제조방법
Jadhav et al. Formulation, Optimization and Evaluation of Ocular Inserts Containing Anti-Fungal Drug.

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22876726

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280063205.7

Country of ref document: CN