WO2023054051A1 - 細胞由来物質の放出を制御可能な細胞封入デバイス - Google Patents

細胞由来物質の放出を制御可能な細胞封入デバイス Download PDF

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WO2023054051A1
WO2023054051A1 PCT/JP2022/034938 JP2022034938W WO2023054051A1 WO 2023054051 A1 WO2023054051 A1 WO 2023054051A1 JP 2022034938 W JP2022034938 W JP 2022034938W WO 2023054051 A1 WO2023054051 A1 WO 2023054051A1
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cell
encapsulation device
cell encapsulation
cells
thin film
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俊宣 藤枝
めぐみ 田熊
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国立大学法人東京工業大学
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Definitions

  • the present invention relates to cell encapsulation devices. More specifically, it relates to a cell encapsulation device comprising a cell aggregate embedded in a scaffold material and coated with a polymer thin film.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Patent Document 1 Attempts have been made to develop encapsulated cells and the like as an example of these transplanted therapeutic devices.
  • the polymer membrane used for these has pores with a pore diameter of 400 nm (Non-Patent Document 2) or a pore diameter of 200 nm (Non-Patent Document 3), and a porous body is used as a cell carrier.
  • Substances derived from the body are secreted through the pores on the surface, and there are problems such as the induction of immunogenicity through the pores, the low adaptability to the implanted site due to the hardness of the device, and the difficulty in controlling the secretion rate. I had a problem.
  • the present invention has improved the problems such as induction of immunogenicity through pores, low bio-followability to the implantation site due to the hardness of the device, and difficulty in controlling the rate of secretion.
  • the object is to provide a cell encapsulation device for treatment.
  • the inventors of the present invention conducted extensive research, wrapped cells in a scaffolding material, hydrogel, and fabricated a flexible device in which the surface was coated with a polymer thin film. We have completed a cell-encapsulated device capable of adjusting the release rate of cell-derived substances and improving bio-followability.
  • the present invention provides a cell-encapsulated device capable of controlling the release rate of cell-derived substances, which is obtained by coating cells embedded in a scaffold material with a single-layer or multiple-layer polymer thin film. .
  • the cells may be cell aggregates, and the cell aggregates may be spheroids.
  • the cell-derived substance may be a physiologically active substance
  • the cells forming the cell aggregate may be cells that secrete the physiologically active substance
  • the physiologically active substance may be vascular endothelial growth factor (VEGF) or insulin.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the cells may be selected from adipose tissue-derived stem cells or stem cell-derived pancreatic islet cells.
  • the scaffold material may be hydrogel.
  • the hydrogel material may be selected from at least one of photocrosslinkable gelatin methacrylate (GelMA), sodium alginate, polyethylene glycol, gelatin, collagen, and hyaluronic acid.
  • GelMA photocrosslinkable gelatin methacrylate
  • sodium alginate sodium alginate
  • polyethylene glycol polyethylene glycol
  • gelatin collagen
  • hyaluronic acid a photocrosslinkable gelatin methacrylate
  • the hardness of the hydrogel formed from the photocrosslinkable gelatin methacrylate (GelMA) may be 2 kPa or more and 90 kPa or less.
  • the polymer thin film may be selected from a pristine membrane or a porous membrane.
  • the material of the polymer thin film is polydimethylsiloxane (PDMS), D,L-polylactic acid (PDLLA), L-polylactic acid (PLLA), D-polylactic acid (PDLA), poly Lactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA), polycaprolactone (PCL), polytetrafluoroethylene (PTFE), styrene-butadiene-styrene block copolymer (SBS), polycarbonate (PC), polystyrene (PS) or polymethyl methacrylate ( PMMA).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PLLA D,L-polylactic acid
  • PLLA L-polylactic acid
  • PDLA D-polylactic acid
  • PLGA poly Lactic acid-glycolic acid copolymer
  • PCL polycaprolactone
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • SBS styrene-butadiene-st
  • the release rate of the cell-derived substance may be controlled by adjusting the film thickness and/or the number of layers of the polymer thin film.
  • the film thickness of the polymer thin film may range from 100 nm to 2.4 ⁇ m.
  • the cell-encapsulated device may be a cell-encapsulated device for preventing or treating skin wounds or diabetes.
  • problems such as induction of immunogenicity through pores, low bio-followability to the implantation site due to the hardness of the device, and difficulty in controlling the secretion rate are improved.
  • a cell encapsulation device that can be used for therapy could be provided.
  • FIG. 4 is a diagram showing the procedure for producing the cell-encapsulated device of the present invention; SEM images of PDMS thin films with thicknesses of 300 nm, 1 ⁇ m, 2.4 ⁇ m and 4.8 ⁇ m.
  • FIG. 10 is a graph showing changes over time in the cumulative amount of insulin permeating a PDLLA thin film or a commercially available polycarbonate porous membrane.
  • a diagram showing the time course of the cumulative release amount of VEGF from the cell encapsulation device (N 3).
  • Fig. 1 shows the evaluation of pancreatic ⁇ -cell culture and insulin release using the cell encapsulation device.
  • the present invention is a cell-encapsulated device capable of controlling the release of cell-derived substances, which is obtained by coating cells embedded in a scaffold material with a single-layer or multiple-layer polymer thin film.
  • the polymer membrane used in the cell-encapsulated device of the present invention differs from the polymer membrane used in conventional encapsulated cell devices in that pores that induce immunogenicity through the pores (Non-Patent Document 2, 3) (example, see FIG. 3).
  • Non-Patent Document 2 3)
  • cell-derived substances such as physiologically active substances are allowed to pass through.
  • the cells may be cells dispersed in the scaffolding material, or aggregates of cells embedded in the scaffolding material.
  • examples of cell aggregates include spheroids, which are three-dimensional cell aggregates, and aggregates of secretory cells that secrete physiologically active substances and cells that support the survival and activity of the cells.
  • examples include somatic bodies and organ-like cell aggregates formed by inducing the differentiation of stem cells into cells that constitute an organ composed of aggregates of multiple types of cells, and spheroids are preferred.
  • the cells are preferably mammalian cells, more preferably human cells.
  • the cell type can be selected from adipose tissue-derived stem cells or stem cell-derived pancreatic islet cells.
  • examples of the physiologically active substance include Vascular Endothelial Growth Factor (hereinafter referred to as "VEGF”) and insulin.
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • insulin insulin
  • ASC Adipose Tissue Derived Stem Cell
  • VEGF secreted by adipose tissue-derived stem cells has been shown to have a wound healing effect by promoting angiogenesis (Li, P. et al., Stem Cell Res. Ther., 9, 302 (2018)).
  • spheroids which are three-dimensional cell aggregates, have been shown to secrete more protein than dispersed cells (Colle, J. et al., J Mater Sci: Mater Med., 31, 36 (2020)). Therefore, a cell-encapsulated device in which ASC spheroids are embedded in a scaffold material and coated with a polymer thin film is thought to exert a wound healing effect.
  • a hydrogel can be mentioned as an example of the scaffold material used for the cell encapsulation device of the present invention.
  • Examples of materials for the hydrogel include at least one of photocrosslinkable gelatin methacrylate (GelMA), sodium alginate, polyethylene glycol, gelatin, collagen, and hyaluronic acid.
  • GelMA photocrosslinkable gelatin methacrylate
  • sodium alginate sodium alginate
  • polyethylene glycol polyethylene glycol
  • gelatin collagen
  • hyaluronic acid hyaluronic acid
  • the hardness of the hydrogel formed from the photocrosslinkable gelatin methacrylate (GelMA) is preferably 2 kPa or more and 90 kPa or less (Yue, K. et al., Biomaterials, 73, 254-271 (2015)). Due to this hardness, the cell-encapsulating device of the present invention can provide bio-followability when implanted into a living body.
  • Examples of materials for the polymer thin film used in the cell encapsulation device of the present invention include polydimethylsiloxane (PDMS), D,L-polylactic acid (PDLLA), L-polylactic acid (PLLA), D-polylactic acid (PDLA), polylactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA), polycaprolactone (PCL), polytetrafluoroethylene (PTFE), styrene-butadiene-styrene block copolymer (SBS), polycarbonate (PC), polystyrene (PS) or It can be selected from at least one of polymethyl methacrylate (PMMA).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PLLA D,L-polylactic acid
  • PLLA L-polylactic acid
  • PDLA D-polylactic acid
  • PLGA polylactic acid-glycolic acid copolymer
  • PCL polycaprolactone
  • PTFE polytetraflu
  • spheroids composed of ASC cells (spherical cell aggregates in which cells are aggregated and aggregated), (2) photocrosslinkable cell scaffolds Gelatin methacrylate (hereinafter referred to as "GelMA”), (3) protein-permeable polydimethylsiloxane (hereinafter referred to as "PDMS”) or D,L-polylactic acid (hereinafter referred to as "PDLLA”) ), which integrates three elements of a thin film and has a VEGF sustained release ability (Fig. 1A, Fig. 1B).
  • GelMA Gelatin methacrylate
  • PDMS protein-permeable polydimethylsiloxane
  • PDLLA D,L-polylactic acid
  • the release rate of the physiologically active substance secreted from the secretory cells that constitute the cell aggregate to the outside of the cell encapsulation device is adjusted within the range of rapid release or sustained release. That is, the release rate of the physiologically active substance from the cell encapsulation device of the present invention can be adjusted by adjusting the film thickness of the polymer thin film and/or by using a monolayer of the polymer thin film coated with the cell-embedded scaffold material. Alternatively, a desired release rate can be controlled by forming multiple layers. That is, the larger the film thickness and/or the larger the number of coating layers, the higher the sustained release properties.
  • Examples of the range of film thickness of the polymer thin film include a single layer or a total of multiple layers, preferably 50 nm to 5 ⁇ m, more preferably 80 nm to 3 ⁇ m, and even more preferably 100 nm to 2.4 ⁇ m.
  • the release rate of cell-derived substances can be controlled by adjusting the number of polymer thin film layers.
  • the number of polymer thin film layers As an example of the range of the number of layers of the polymer thin film, 1 to 5 layers are preferable, and 1 to 3 layers are more preferable.
  • VEGF secreted by ASC has been found to have a wound healing effect by promoting angiogenesis (Li, P. et al., Stem Cell Res. Ther., 9, 302 (2018))
  • a cell-encapsulating device enclosing spheroids containing ASC as constituent cells can be used as a cell-encapsulating device for preventing or treating skin wounds.
  • pancreatic islet cells are composed of multiple types such as ⁇ cells that produce glucagon, ⁇ cells that produce insulin, ⁇ cells that produce somatostatin, PP cells that produce pancreatic peptides, and acinar cells.
  • islet-cell-like cell aggregates can be formed by inducing differentiation from stem cells. By coating a cell aggregate of pancreatic islet cells differentiated from this stem cell with the polymer thin film, it can be used as a cell encapsulation device for prevention or treatment of diabetes.
  • PET was prepared using a gravure coater (manufactured by Yasui Seiki Co., Ltd.)
  • a 10 wt % polyvinyl alcohol (hereinafter referred to as “PVA”) aqueous solution was applied as a sacrificial film onto a (polyethylene terephthalate) substrate.
  • the PDMS solution was applied on the PET substrate having the PVA layer using a bar coater (manufactured by Mitsui Electric Seiki Co., Ltd., desktop coater TC-3 (bar: OSP-10)) and placed in an oven at 120°C for 1.5 hours.
  • a PDMS thin film (thickness: 4.8 ⁇ m).
  • the PDMS thin film was attached to a porous filter (made of polyethylene terephthalate (PET), pore size 8 ⁇ m), and the surface was observed using a scanning electron microscope.
  • PDLLA poly(D,L-lactic acid)
  • solvent ethyl acetate
  • a PDLLA thin film (thickness: 110 nm) was prepared.
  • PS polystyrene
  • a porous PDLLA thin film (thickness: 135 nm) was prepared by immersing this in cyclohexane overnight and treating it with an ultrasonic cleaner for 30 seconds.
  • the transmission coefficient of the PDMS thin film was calculated according to the following formula (1) (Fujie, T. et al., Macromolecules, 46, 395-402 (2012)).
  • N t is the total amount of molecules permeating out of the well at time t (0.5 h)
  • A is the area of the PDMS thin film.
  • porous PDLLA thin films were similarly examined for protein permeability.
  • the porous PDLLA thin film was produced according to the method of Suzuki et al. (Suzuki S. et al., Adv. Mater. Technol., 1(6), 1600064 (2016)).
  • CO 2 incubator 37° C., 5% CO 2
  • PBS was added to each well on days 1 and 3, and the culture was continued for 3 hours to diffuse the proteins inside the hydrogel into PBS. Finally, the supernatant PBS was collected, and the amount of VEGF was quantified by ELISA using a commercially available measurement kit (manufactured by Invitrogen, Catalog No. BMS619-2).
  • a PDMS thin film (thickness: 600 nm) was layered to encapsulate the GelMA containing the spheroids, and the PDMS thin film was melt-cut using a laser processing machine to fabricate a cell-encapsulated device (Fig. 2).
  • the film thickness was measured using a stylus surface profiler (DektakXT, manufactured by Bruker).
  • the spheroids were cultured while the cell encapsulation device was immersed in the medium, and the VEGF concentration was quantified by ELISA on each day up to 5 days after the start of culture. .
  • pancreatic ⁇ -cells using a pancreatic ⁇ -cell encapsulating device and confirmation of viability
  • pancreatic ⁇ cells cultured in the form of spheroids a pancreatic ⁇ cell encapsulating device was produced in the same manner as in Experiment 1.5 above, except that pancreatic ⁇ cell spheroids were used instead of ASC spheroids.
  • the device was immersed in a culture medium, and after 24 hours, calcein AM and ethidium homodimer were used to stain the pancreatic ⁇ -cells enclosed inside the device to evaluate the viability of the pancreatic ⁇ -cells.
  • pancreatic ⁇ -cell-encapsulated device Part of the medium in which the pancreatic ⁇ -cell-encapsulated device was immersed was collected 1 hour and 24 hours after the start of culture. Insulin concentration was measured using an ELISA kit to quantify insulin secretion per spheroid. As a positive control group, the same amount of pancreatic ⁇ -cells as that encapsulated in the device was continuously cultured in a medium by rotation, and the amount of insulin in the medium was measured in the same manner as in the device group.
  • the porous PDLLA membrane with a thickness of 135 nm exhibited rapid permeability, while the smooth PDLLA membrane with a thickness of 110 nm showed a cumulative permeation amount of about 40% in 60 minutes. (Fig. 4).
  • a single-layer porous PDLLA membrane (thickness: 135 nm) showed rapid insulin permeability, and a three-layer porous PDLLA membrane showed about 60% permeation in 60 minutes.
  • smooth PDLLA membranes of 1 layer and 3 layers each showed almost no permeability after 60 minutes (Fig. 6).
  • the porous PDLLA thin film with a thickness of 245 nm showed a slower insulin release rate than the porous PDLLA thin film with a thickness of 135 nm.
  • a single-layer porous PDLLA membrane (thickness: 245 nm) showed a permeability of about 31% in 60 minutes, and a commercially available porous PCTE membrane showed a permeability of about 25% in 60 minutes (Fig. 6).
  • the single-layer porous PDLLA membrane (thickness: 245 nm) and the commercially available porous PCTE membrane showed the same permeability because the porosity of the PDLLA membrane was about 10% and the porosity of the PCTE membrane was about 10%. It is believed that this is because it has a porosity equivalent to 12.8%.
  • the one-layer porous PDLLA film (thickness: 135 nm), which has a smaller film thickness, has a high porosity of about 40%, so it is thought that permeation was rapid.
  • pancreatic ⁇ -cells were stained with a cell viability determination reagent, it was found that the spheroid-specific spherical structure was maintained inside the device, indicating that spheroids Survival of most cells was confirmed (Fig. 10). Therefore, it was shown that the encapsulated pancreatic ⁇ -cells were hardly damaged during the fabrication process of the device, and that they were stably living in the device even after 24 hours.
  • pancreatic ⁇ -cell-encapsulating device Part of the medium in which the pancreatic ⁇ -cell-encapsulating device was immersed was collected 1 hour and 24 hours after the start of culture, and the insulin concentration was measured using an ELISA kit. , and the amount of insulin secretion per spheroid was quantified. In the positive control group, linear insulin secretion was observed from the start of culture until 24 hours later. On the other hand, the pancreatic ⁇ -cell-encapsulated device group showed the same release behavior as the positive control group after 1 hour (Fig. 11). These results indicated that the pancreatic ⁇ -cells encapsulated in the cell-encapsulating device exhibited glucose-responsive insulin secretion behavior.
  • a cell encapsulation device in which aggregates of insulin-secreting islet cells are embedded in hydrogel and coated with a polymer thin film is considered useful for the prevention or treatment of diabetes.

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Abstract

細孔を介した免疫原性の惹起、デバイスの硬さによる移植部位への生体追従性の低さ、並びに、分泌速度の制御が難しいなどの問題を改善した疾病の予防及び/又は治療のための細胞封入デバイスを提供することを目的とする。細胞を足場材料であるヒドロゲルで包み、さらに表面を高分子薄膜被覆した柔軟なデバイスを作製し、高分子薄膜の膜厚を変えることで、生体由来物質の分泌速度の調整と生体追従性を向上させることが可能な細胞封入デバイスを完成した。より具体的には、足場材料に包埋された細胞集合体を単層又は複層の高分子薄膜で被覆してなる、細胞由来物質の放出を制御可能な細胞封入デバイスを提供する。

Description

細胞由来物質の放出を制御可能な細胞封入デバイス
　本発明は、細胞封入デバイスに関する。より具体的には、足場材料に包埋された細胞集合体を高分子薄膜で被覆してなる細胞封入デバイスに関する。
　現在、各種の疾患の治療法の１つとして移植治療が行われている。しかし、現状の移植治療における課題として、移植体の低い生着率や事後的な免疫抑制剤の投与による免疫系への過剰な負荷などが挙げられる。こうした課題に対処するべく、免疫応答を回避しつつ、タンパク質など生体由来物質の分泌等の機能を持続的に発揮する治療用デバイスの研究が進められている（非特許文献１）。
　これらの移植による治療用デバイスの例としてカプセル化細胞等の開発が試みられている（例えば、特許文献１）。
　しかし、従来のデバイスは、これらに用いる高分子膜が、ポア径400 nm（非特許文献２）又はポア径200 nm（非特許文献３）の細孔を有し、細胞担体に多孔体を用い表面の細孔を通して生体由来物質の分泌を行っており、細孔を介した免疫原性の惹起、デバイスの硬さによる移植部位への生体追従性の低さ、分泌速度の制御が難しいなどの問題があった。
ラチュイリエール，オーレリアンら、国際公開パンフレット：WO2014/173441
Farina M., et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 139, 92-115 (2019). Bose S., et al., Nature Biomedical Engineering, 4, 814-826 (2020). Nyitray C.E., et al., ACSNANO, 9, 5675-5682 (2015)
　本発明は、細孔を介した免疫原性の惹起、デバイスの硬さによる移植部位への生体追従性の低さ、並びに、分泌速度の制御が難しいなどの問題を改善した疾病の予防及び/又は治療のための細胞封入デバイスを提供することを課題とする。
　本発明者らは鋭意研究し、細胞を足場材料であるヒドロゲルで包み、さらに表面を高分子薄膜被覆した柔軟なデバイスを作製し、高分子薄膜の膜厚を変えることで前記細胞より分泌された細胞由来物質の放出速度の調整と、生体追従性を向上させることが可能な細胞封入デバイスを完成した。
　より具体的には、本発明は、足場材料に包埋された細胞を単層又は複層の高分子薄膜で被覆してなる、細胞由来物質の放出速度を制御可能な細胞封入デバイスを提供する。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記細胞が細胞集合体であって、前記細胞集合体が、スフェロイドである場合がある。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記細胞由来物質が生理活性物質であって、前記細胞集合体を形成する細胞が生理活性物質を分泌する細胞である場合がある。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記生理活性物質が、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）又はインスリンである場合がある。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記細胞が、脂肪組織由来幹細胞又は幹細胞由来膵島細胞から選択される場合がある。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記足場材料がヒドロゲルである場合がある。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記ヒドロゲルの材質が、光架橋性ゼラチンメタクリレート（GelMA）、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ゼラチン、コラーゲン又はヒアルロン酸の少なくとも１種から選択される場合がある。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記光架橋性ゼラチンメタクリレート（GelMA）で形成されるヒドロゲルの硬さが、2 kPa以上90 kPa以下である場合がある。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記高分子薄膜が、平滑（pristine）膜、又は多孔質（porous）膜から選択される場合がある。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記高分子薄膜の材質が、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、D,L-ポリ乳酸（PDLLA）、L-ポリ乳酸（PLLA）、D-ポリ乳酸（PDLA）、ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、スチレンブタジエンスチレンブロック共重合体（SBS）、ポリカーボネート（PC）、ポリスチレン（PS）又はポリメチルメタクリレート（PMMA）の少なくとも１種から選択される場合がある。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記高分子薄膜の膜厚及び／又は積層数を調整することにより前記細胞由来物質の放出速度を制御する場合がある。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記高分子薄膜の膜厚の範囲が、100 nm～2.4 μmである場合がある。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、前記細胞封入デバイスは、皮膚創傷又は糖尿病の予防又は治療用の細胞封入デバイスである場合がある。
　本発明により、細孔を介した免疫原性の惹起、デバイスの硬さによる移植部位への生体追従性の低さ、並びに、分泌速度の制御が難しいなどの問題が改善された疾病の予防及び／又は治療に使用できる細胞封入デバイスを提供することができた。
本発明の細胞封入デバイスの構成要素を表す概略図。 本発明の細胞封入デバイスの構成要素の役割を表す概略図。 本発明の細胞封入デバイスの作製手順を表す図。 膜厚300 nm、1 μｍ、2.4 μm及び4.8 μmのPDMS薄膜のSEM画像を表す図。 PDMS薄膜及びPDLLA薄膜を透過したBSAの累積量の経時変化を表す図(N=3)。 PDMS薄膜の膜厚と拡散係数の関係を表した図(N=3)。 PDLLA薄膜又は市販のポリカーボネート製多孔質膜を透過したインスリンの累積量の経時変化を表す図。 VEGFの累積分泌量を表した図(N=3、** p<0.01、*** p<0.001)。 細胞封入デバイス内のスフェロイドの蛍光画像(Day 5)を表す図。 細胞封入デバイスからのVEGFの累積放出量の経時変化を表す図(N=3)。 細胞封入デバイスを用いた膵β細胞の培養と生存状態の確認を表す図。左図は位相差像を表し、右図は細胞生死判定試薬で染色した蛍光画像を表す。 細胞封入デバイスを用いた膵β細胞の培養とインスリンの放出を評価した図。
　本発明は、足場材料に包埋された細胞を単層又は複層の高分子薄膜で被覆してなる、細胞由来物質の放出を制御可能な細胞封入デバイスである。
　本発明の細胞封入デバイスで使用する高分子薄膜は、従来からのカプセル化細胞デバイスで使用される高分子膜と異なり、細孔を介した免疫原性の惹起するような細孔（非特許文献２，３）を有さない（実施例、図３参照）。一方、生理活性物質等の細胞由来物質は通過させる。
　本発明において、前記細胞は、前記足場材料中に分散された細胞であってもよく、或いは、前記足場材料に包埋された細胞の集合体であってもよい。
　本発明の細胞封入デバイスにおいて、細胞集合体の例としては、三次元的な細胞凝集体であるスフェロイドや、生理活性物質を分泌する分泌細胞と該細胞の生存や活動をサポートする細胞との集合体や、複数種類の細胞が集合して構成される臓器を構成する細胞を幹細胞から分化誘導して形成される該臓器様の細胞集合体などが挙げられるが、好ましくは、スフェロイドである。
　本明細書において、細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。
　より具体的には、前記細胞の種類は、脂肪組織由来幹細胞又は幹細胞由来膵島細胞から選択することができる。
　本発明において、前記生理活性物質の例として、血管内皮細胞増殖因子（Vascular Endothelial Growth Factor；以下、「VEGF」と記載)、又は、インスリンを挙げることができる。
　脂肪組織由来幹細胞（Adipose Tissue Derived Stem Cell；以下、「ASC」と記載）が分泌するVEGFは血管新生の促進による創傷治癒効果が認められている（Li, P. et al., Stem Cell Res. Ther., 9, 302 (2018)）。また、三次元的な細胞凝集体であるスフェロイドは、分散細胞より多くのタンパク質を分泌することが明らかにされてきた（Colle, J. et al., J Mater Sci: Mater Med., 31, 36 (2020)）。そこで、ASCのスフェロイドを足場材料に包埋し、高分子薄膜で被覆した細胞封入デバイスは、創傷治癒効果を発揮すると考えられる。
　本発明の細胞封入デバイスに用いる足場材料の例としては、ヒドロゲルを挙げることができる。
　前記ヒドロゲルの材質の例としては、光架橋性ゼラチンメタクリレート（GelMA）、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ゼラチン、コラーゲン又はヒアルロン酸の少なくとも１種を挙げることができる。
　前記光架橋性ゼラチンメタクリレート（GelMA）で形成されるヒドロゲルの硬さが、2 kPa以上90 kPa以下が好ましい（Yue, K. et al., Biomaterials, 73, 254-271 (2015)）。この硬さによって、本発明の細胞封入デバイスを生体へ移植した場合の生体追従性をもたらすことができる。
　また、本発明の細胞封入デバイスに用いる高分子薄膜の材質の例としては、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、D,L-ポリ乳酸（PDLLA）、L-ポリ乳酸（PLLA）、D-ポリ乳酸（PDLA）、ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、スチレンブタジエンスチレンブロック共重合体（SBS）、ポリカーボネート（PC）、ポリスチレン（PS）又はポリメチルメタクリレート（PMMA）の少なくとも１種から選択することができる。
　そこで、本発明の１つの実施形態の例として、(1)ASCを構成細胞とするスフェロイド（細胞同士が集合・凝集化した球状の細胞集合体）、(2)細胞足場材となる光架橋性ゼラチンメタクリレート（gelatin methacrylate；以下、「GelMA」と記載)、(3)タンパク質透過性を有するポリジメチルシロキサン（polydimethylsiloxane；以下、「PDMS」と記載)又はD,L-ポリ乳酸（以下、「PDLLA」と記載）を材料とする薄膜の三要素を統合した、VEGF徐放能を有する細胞封入デバイスを挙げることができる(図１Ａ、図１Ｂ)。
　前記高分子薄膜の膜厚によって、細胞集合体を構成する分泌細胞から分泌される生理活性物質の細胞封入デバイス外への放出速度が急速放出ないし徐放の範囲で調節される。すなわち、本発明の細胞封入デバイスからの生理活性物質の放出速度は、高分子薄膜の膜厚を調整することにより、及び/又は、細胞を包埋した足場材料を被覆した高分子薄膜を単層又は複層とすることにより、所望とする放出速度に制御できる。すなわち、膜厚を大きくする程、及び/又は、被覆層の層数を大きくする程、徐放性が高まる。
　高分子薄膜の膜厚の範囲の例としては、単層、又は複層の合計として、好ましくは50 nm～5 μmであり、より好ましくは80 nm～3 μmであり、さらに好ましくは100 nm～2.4 μmである。
　また、本発明の細胞封入デバイスにおいて、高分子薄膜の積層数を調整することにより、細胞由来物質の放出速度を制御することができる。高分子薄膜の層数の範囲の例としては、１～５層が好ましく、１～３層がより好ましい。
　また、上記のとおり、ASCが分泌するVEGFは血管新生の促進による創傷治癒効果が認められているところから（Li, P. et al., Stem Cell Res. Ther., 9, 302 (2018)）、このASCを構成細胞とするスフェロイドを封入した細胞封入デバイスは、皮膚創傷の予防又は治療用の細胞封入デバイスとして使用することができる。
　また、膵臓の膵島細胞（ランゲルハンス島）は、グルカゴンを産生するα細胞、インスリンを産生するβ細胞、ソマトスタチンを産生するδ細胞、膵ペプチドを産生するPP細胞、及び腺房細胞等の複数の種類の細胞の集合体であり、幹細胞から分化誘導することにより、膵島細胞様の細胞集合体を形成することができる。この幹細胞から分化誘導した膵島細胞の細胞集合体を上記高分子薄膜で被覆することにより、糖尿病の予防又は治療用の細胞封入デバイスとして使用できる。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。ここに記述される実施例は本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
1. 実験方法
1.1 高分子薄膜の作製
　既報（Yamagishi, K. et al., Nat. Biomed. Eng., 3, 1, 27-36 (2019)）に従い、グラビアコーター（株式会社康井精機製）を用いてPET（ポリエチレンテレフタレート）製基板上に犠牲膜として10 wt% ポリビニルアルコール（以下、「PVA」と記載）水溶液を塗布した。その後、15 wt%又は50 wt% PDMS溶液(SYLGARD 184、Dow Corning社製; 溶媒: ヘキサン/酢酸エチル混合溶媒(重量比=4:1))を、グラビアコーターを用いて前述のPVA層上に塗布し、80℃のオーブンで12時間加熱してPDMS薄膜(膜厚: 300 nm、600 nm、2.4 μm)を調製した。また、PVA層を有するPET基板上にバーコーター(三井電気精機株式会社製、卓上コーターTC-3型（バー：OSP-10）)を用いてPDMS溶液を塗布し、120℃のオーブンで1.5時間加熱した後、80℃のオーブンで12時間加熱してPDMS薄膜(膜厚: 4.8 μm)を調製した。PDMS薄膜表面の損傷の有無を確認するため、多孔質フィルター(ポリエチレンテレフタレート（PET）製、孔径8 μm)にPDMS薄膜を貼付し、走査型電子顕微鏡を用いて表面を観察した。
　また、グラビアコーターを用いて20 mg/mLのポリ乳酸（poly(D,L-lactic acid)；PDLLA)溶液(溶媒: 酢酸エチル) をPVA層上に塗布し、60℃で加熱して平滑なPDLLA薄膜(膜厚: 110 nm)を調製した。さらに、PDLLAとポリスチレン（polystyrene；以下、「PS」と記載)の混合溶液(各10 mg/mL、溶媒: 酢酸エチル)をPVA層上に塗布し、60℃で加熱した。これをシクロヘキサンに終夜浸漬し、超音波洗浄機を用いて30秒間処理することにより多孔質のPDLLA薄膜(膜厚: 135 nm)を調製した。
1.2 PDMS薄膜のタンパク質透過性の評価
　トランスウェルの底面に異なる膜厚のPDMS薄膜(300 nm、600 nm、1 μm、2.4 μm、4.8 μm)を貼付した。次に、VEGF（分子量：44,500）と同程度の分子量を有する9.4 mg/mLのウシ血清アルブミン（Bovine serum albumin: 以下、「BSA」と記載、分子量：66,500）溶液をウェル内に添加した。その後、ウェル外のリン酸等張緩衝液（phosphate buffered saline: 以下、「PBS」と記載）に拡散したBSAの濃度をブラッドフォード（Bradford）法により経時的に定量した。この結果に基づき、以下の式(１)（Fujie, T. et al., Macromolecules, 46, 395-402 (2012)）に従ってPDMS薄膜の透過係数を算出した。ただし、Ntは時間t (0.5 h)においてウェル外に透過した分子の総量、AはPDMS薄膜の面積をあらわす。
　　[flux(mmol h-1m-2)] = [Nt(mmol)]/[t(h) x A(m2)]　　　　(1)
　比較のため、平滑(pristine)又は多孔質(porous)のPDLLA薄膜も同様にしてタンパク質透過性を調べた。なお、多孔質のPDLLA薄膜は、Suzukiらの方法（Suzuki S. et al., Adv. Mater. Technol., 1(6), 1600064 (2016)）に従い作製した。
1.3 多孔質PDLLA薄膜と市販のポリカーボネート製多孔質膜とのインスリン透過性の比較
　トランスウェルのインサート底面部に対して、1層又は3層の多孔質PDLLA膜（膜厚: 135 nm、245 nm）、1層又は3層の平滑PDLLA膜（膜厚：135 nm、市販の多孔質ポリカーボネート製（PCTE）膜、Advantec社製、K040A025A）をそれぞれ貼付した。
　次に、上記1.2の実験方法において、BSAの代わりに、61.5 ng/mLのインスリン（分子量：5,807）溶液（Fisher scientific社製、Gibco（登録商標） Insulin, human recombinant, zinc solution、Gibco（登録商標） 12585014）を使用してタンパク質の透過性試験を実施した。この時、貼付する膜の種類を変更した点以外は、BSAの透過性試験を検討した方法と同様の方法である。インスリン濃度は、市販の測定キット（Mercodia社製、カタログNo. 10-1113-01）を用いてELISA法により定量した。
1.4 GelMAに混合したASCスフェロイドの生存率評価と分泌タンパク質量の定量
　GelMAからなるヒドロゲルに封入したASCスフェロイドのVEGF分泌挙動を観察するため、PrimeSurface(住友ベークライト社製)を用いて作製したスフェロイド(400個)とGelMA(5 %(w/v)、溶媒：Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12）、150 μL)からなる混合液を48ウェルプレートの各ウェルに播種した。UV照射(λ=365 nm、開始剤：Irgacure 2959、1000 mJ/cm2)にてGelMAを架橋し、CO2インキュベーター内(37℃、5% CO2)で培養した。分泌されたVEGF量を定量するため、1、3日目に各ウェル内にPBSを添加した上で3時間培養を継続し、ヒドロゲル内部のタンパク質をPBSに拡散させた。最後に、上清のPBSを採取し、市販の測定キット（Invitrogen社製、カタログNo. BMS619-2）を用いてELISA法によりVEGF量を定量した。
1.5 ASC封入デバイスの作製とVEGF徐放能評価
　PDMS薄膜(膜厚: 2.4 μm)上において、UV照射(λ=405 nm)にてGelMA(5 %(w/v)、溶媒：PBS)を架橋し(開始剤：Irgacure 819、1173)、GelMA製のドーナツ型フレームを造形した。続いて、ASCのスフェロイド(1000個)を混合したGelMA溶液(5 %(w/v)、溶媒：DMEM/F12、50 μL)をフレーム内に分注して架橋した。最後に、PDMS薄膜(膜厚：600 nm)を重ねてスフェロイドを内包したGelMAを封止して、レーザー加工機にてPDMS薄膜を溶断成型することで細胞封入デバイスを作製した(図２)。なお、膜厚は、触針式表面形状測定器（Bruker社製、DektakXT）を用いて測定した。
　ASC封入デバイスからのVEGF徐放能を評価するため、細胞封入デバイスを培地に浸漬させた状態でスフェロイドを培養し、培養開始後5日目までの各日のVEGF濃度をELISA法にて定量した。
1.6 膵β細胞封入デバイスを用いた膵β細胞の培養と生存状態の確認
　膵β細胞は、東京工業大学生命理工学院粂・白木研究室から提供されたiPS細胞由来の膵β細胞を使用し、スフェロイド状に培養した膵β細胞を用いて、ASCスフェロイドの代わりに膵β細胞スフェロイドを使用した以外上記実験1.5と同様の方法で膵β細胞封入デバイスを作製した。デバイスを培地に浸漬し、24時間後にカルセインAMとエチジウムホモダイマ―を用いて、デバイス内部に封入した膵β細胞を染色することで、膵β細胞の生存状態を評価した。
1.7 膵β細胞封入デバイスからのインスリンの放出の検討
　膵β細胞封入デバイスを浸漬させていた培地の一部を、培養開始から1時間後、及び24時間後に回収した。インスリン濃度をELISAキットを用いて測定し、１スフェロイドあたりのインスリン分泌量を定量した。陽性対照群として、デバイスに封入した量と同量の膵β細胞を培地中で継続して回転培養を行い、培地中のインスリン量をデバイス群と同様の方法にて測定した。
2. 実験結果
2.1 PDMS薄膜のタンパク質透過性の評価
　PDMS薄膜は市販の多孔質フィルターの各細孔を覆っており、表面に貫通孔がないことを確認した(図３)。また、従来技術（非特許文献２，３）で認められた細孔は認められなかった。そして、この時、BSAはPDMS薄膜の膜厚に依存した透過性を示した(図４)。また、既報（Fujie, T. et al., Macromolecules, 46, 395-402 (2012)）をもとに作製した平滑なPDLLA薄膜においても、PDMS薄膜に類似した透過性を示し、多孔質化したPDLLA薄膜ではより速やかな透過性が認められた。そこで、PDMS薄膜について拡散係数を計算したところ、タンパク質透過性はPDMS薄膜の膜厚により制御されることが見出された(図５)。以上の結果より、細胞封入デバイスには、72時間後に60%の透過性を示した膜厚600 nmのPDMS薄膜を使用した。なお、ヒドロゲルの硬度を圧縮試験機（英弘精機株式会社製テクスチャーアナライザー(TA.XT plus 100 C)）を用いて圧縮試験法で測定すると、2.8 kPaであった。
2.2 PDLLA薄膜のタンパク質透過性の評価
　平滑な（pristine）、又は多孔質の（porous）PDLLA薄膜に対するBSA又はインスリンの膜透過性を評価した。
　BSAに対する透過性について、膜厚135 nmの多孔質のPDLLA膜は、速やかな透過性を示したが、膜厚110 nmの平滑なPDLLA膜は、60分間で約40％の累積透過量を示した（図４）。
2.3 多孔質PDLLA薄膜と市販のポリカーボネート製多孔質膜とのインスリン透過性の比較
　インスリンに対する高分子膜透過性について、1層若しくは3層の多孔質PDLLA膜、又は1層若しくは3層の平滑なPDLLA膜及び市販のポリカーボネート製多孔質膜を用いて検討した。
　1層の多孔質PDLLA膜（膜厚: 135 nm）では速やかなインスリンの透過性を示し、3層の多孔質PDLLA膜では60分間で約60%の透過を示した。また、1層及び3層の平滑PDLLA膜では、それぞれ60分間でほとんど透過性を示さなかった（図６）。また、膜厚245 nmの多孔質PDLLA薄膜は、膜厚135 nmの多孔質PDLLA薄膜と比較して、より緩徐なインスリンの放出速度を示した。
　本結果は、細胞封入デバイスからのインスリンの放出速度が、高分子薄膜の積層数に依存して変化し、膜厚及び／又は積層数を調整することによりインスリンの放出速度を制御可能であることを示した。
　また、1層の多孔質PDLLA膜（膜厚: 245 nm）では60分間で約31％、市販の多孔質PCTE膜では60分間で約25%の透過を示した（図６）。1層の多孔質PDLLA膜（膜厚: 245 nm）と市販の多孔質PCTE膜で同等の透過性を示したのは、PDLLA膜の開孔率が約10%、PCTE膜の開孔率が12.8%と同等の開孔率を有するためであると考えられる。一方、より膜厚の小さな1層の多孔質PDLLA膜（膜厚: 135 nm）では、開孔率が約40％と高いために速やかに透過したと考えれる。
2.4 GelMAに混合したASCスフェロイドの生存率評価と分泌タンパク質量の定量
　GelMAに包埋されたASCスフェロイドからのVEGF分泌量は、非スフェロイド化ASCをGelMAに包埋した場合より3.8倍多いことが示された(図７)。この結果より、デバイスに封入するASCはスフェロイド化したものが適することが明らかとなった。
2.5 ASC封入デバイスの作製と徐放能の評価
　以上の結果に基づいてASC封入デバイスを作製した。カルセインAMにてデバイスに充填したASCスフェロイドを染色したところ、5日目においてスフェロイド特有の球状構造を維持し、代謝活性も確認された(図８)。この時、ASC封入デバイスからのVEGFの徐放性能を評価したところ、デバイスから放出されたVEGFの累積量は飽和することなく培養日数に応じて増加し、5日目までのVEGF徐放性能が確認された(図９)。
　以上の結果より、PDMS薄膜の物質透過性が膜厚により制御できることが示された。スフェロイド化したASCはスフェロイド化していない場合の3.8倍のVEGFを分泌した。これらの結果に基づいて作製したASC封入デバイスについて、培養開始後5日目までのVEGF徐放性能が確認された。このASC封入デバイスを生体に適用することにより、皮膚創傷の予防又は治療のために使用できる。
2.6 膵β細胞封入デバイスを用いた膵β細胞の培養と生存状態の確認
　膵β細胞を細胞生死判定試薬を用いて染色したところ、デバイス内部においてスフェロイド特有の球状構造を維持しており、スフェロイドの大部分の細胞の生存が確認された（図１０）。したがって、封入した膵β細胞は、デバイスの作製過程においてほとんど傷害を受けることなく、また、24時間後もデバイス内で安定に生存していることが示された。
2.7 膵β細胞封入デバイスからのインスリンの放出の評価
　膵β細胞封入デバイスを浸漬させていた培地の一部を、培養開始から1時間後、及び24時間後に回収し、インスリン濃度をELISAキットを用いて測定し、１スフェロイドあたりのインスリン分泌量を定量した。
　陽性対照群は培養開始から24時間後まで線形的にインスリンの分泌が認められた。一方、膵β細胞封入デバイス群では、いずれも1時間以降において陽性対照群と同等の放出挙動を示した（図１１）。これらの結果から、細胞封入デバイスに封入した膵β細胞は糖応答性のインスリン分泌挙動を示すことが示された。
　以上の結果より、インスリンを分泌する膵島細胞の集合体をヒドロゲルに包埋し、高分子薄膜で被覆した細胞封入デバイスは、糖尿病の予防又は治療に有用と考えられる。

Claims (13)

  1. 　足場材料に包埋された細胞を単層又は複層の高分子薄膜で被覆してなる、細胞由来物質の放出速度を制御可能な細胞封入デバイス。
  2. 　前記細胞が細胞の集合体であって、前記集合体がスフェロイドであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞封入デバイス。
  3. 　前記細胞由来物質が生理活性物質であって、前記細胞が、生理活性物質を分泌する細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞封入デバイス。
  4. 　前記細胞が、脂肪組織由来幹細胞又は幹細胞由来膵島細胞から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の細胞封入デバイス。
  5. 　前記生理活性物質が、血管内皮増殖因子（VEGF）又はインスリンから選択されることを特徴とする、請求項３に記載の細胞封入デバイス。
  6. 　前記足場材料がヒドロゲルであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞封入デバイス。
  7. 　前記ヒドロゲルの材質が、光架橋性ゼラチンメタクリレート（GelMA）、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ゼラチン、コラーゲン又はヒアルロン酸の少なくとも１種から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の細胞封入デバイス。
  8. 　前記光架橋性ゼラチンメタクリレート（GelMA）で形成されるヒドロゲルの硬さが、2 kPa以上90 kPa以下であることを特徴とする、請求項７に記載の細胞封入デバイス。
  9. 　前記高分子薄膜が、平滑（pristine）膜、又は多孔質（porous）膜から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞封入デバイス。
  10. 　前記高分子薄膜の材質が、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、D,L-ポリ乳酸（PDLLA）、L-ポリ乳酸（PLLA）、D-ポリ乳酸（PDLA）、ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、スチレンブタジエンスチレンブロック共重合体（SBS）、ポリカーボネート（PC）、ポリスチレン（PS）又はポリメチルメタクリレート（PMMA）の少なくとも１種から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞封入デバイス。
  11. 　前記高分子薄膜の膜厚の範囲が、100 nm～2.4 μmであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞封入デバイス。
  12. 　前記高分子薄膜の膜厚及び／又は積層数を調整することにより前記細胞由来物質の放出速度を制御することを特徴とする、請求項１に記載の細胞封入デバイス。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の細胞封入デバイスであって、皮膚創傷又は糖尿病の予防又は治療用の細胞封入デバイス。
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