WO2023042643A1 - リンカー化合物及びそれを含む複合体化合物 - Google Patents

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WO2023042643A1
WO2023042643A1 PCT/JP2022/032220 JP2022032220W WO2023042643A1 WO 2023042643 A1 WO2023042643 A1 WO 2023042643A1 JP 2022032220 W JP2022032220 W JP 2022032220W WO 2023042643 A1 WO2023042643 A1 WO 2023042643A1
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健彦 和田
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国立大学法人東北大学
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    • C07C323/09—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and halogen atoms, or nitro or nitroso groups bound to the same carbon skeleton having sulfur atoms of thio groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
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    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/62—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atom of at least one of the thio groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton

Definitions

  • the present invention relates to a conjugated compound in which a drug compound used for treatment is conjugated with another compound, a linker compound used to form the conjugated compound, and a conjugated compound using the same.
  • Cancer is a disease that ranks high in both morbidity and mortality in Japan and the world, and the establishment of its treatment is one of the most important issues.
  • drugs for cancer relatively high-molecular-weight biopharmaceuticals produced by using gene recombination techniques have been developed from low-molecular-weight drugs in recent years.
  • antibody drugs using the distinguishing property of antibodies have been developed.
  • Antibody drugs have the advantages of high target specificity and fewer side effects than low-molecular-weight drugs. For this reason, antibody drugs are expected to be applied to cancer treatments by specifically acting on cancer cells.
  • Antibody drugs can be developed in a short period of time using existing drugs and antibodies, and are expected to be developed with a drug development strategy that has relatively low development costs and a high probability of success. It is also expected in terms of possibility.
  • antibody drugs generally have many problems such as complicated manufacturing processes, high manufacturing and development costs, high molecular weight drugs, and antigenicity.
  • due to its large molecular weight, etc. its cell membrane permeability is extremely low, and its target is sometimes limited to extracellular proteins such as cell surface layers.
  • an antibody-drug conjugate (antibody-drug conjugate) is created by combining an antibody and a drug with a linker compound, and by giving the linker compound a dissociable function, the drug exerts its function independently of the antibody. Technologies to enable this are also being developed.
  • Patent Document 1 discloses a drug-antibody conjugate compound in which an antibody and a drug are linked via a linker compound.
  • This drug-antibody conjugate compound uses a linker compound having a sulfide group to form a disulfide bond with a cysteine in the Fc portion of the antibody to form a conjugate of the pyrrolobenzodiazepine prodrug monomer (drug), the antibody and the linker compound. It is what we are trying to form.
  • Non-Patent Document 1 discloses an alkane-type disulfide linker as a linker that binds an antibody and a drug. This linker cleaves the disulfide linker in a glutathione concentration-dependent manner, and the cleavage is to be evaluated using FRET.
  • Non-Patent Document 2 discloses a dithiobenzylurethane linker as a linker that binds an antibody and a drug. This linker attempts to cleave the disulfide linker in a glutathione concentration-dependent manner.
  • the disulfide bond of the linker compound binds the antibody and the drug-composing compound, and the antibody and the drug-composing compound are cleaved according to the glutathione concentration, and the drug is treated. function can be exhibited.
  • the concentration of glutathione is said to be 5 to 25 ⁇ M in blood and 0.4 mM to less than 10 mM in normal cells.
  • Patent Document 1 identifies a range of glutathione concentrations greater than three digits (mM order) as the intracellular concentration. When the antibody-drug conjugate is administered into the blood, the glutathione concentration is low ( ⁇ M order), so the conjugated state is maintained.
  • the glutathione concentration becomes high (mM order)
  • the disulfide bond of the linker compound is cleaved
  • the conjugate of the antibody and the compound that constitutes the drug is dissociated, and the drug is released. It can exert its medicinal effect in cells.
  • the linker compound can only dissociate the complex of the antibody and the compound constituting the drug at a certain concentration according to the structure of each compound.
  • the conjugate dissociates when the glutathione concentration reaches the mM order. exert its medicinal effect. Therefore, since the drug dissociates even in normal cells, the drug may act on unwanted cells and cause side effects.
  • cancer cells are known to have a glutathione concentration of 10 to 100 times higher than that of normal cells, averaging about 10 to 200 mM.
  • the present inventors considered whether it would be possible to distinguish between cancer cells and normal cells based on the difference in glutathione concentration between cancer cells and normal cells.
  • the linker compound disclosed in Patent Document 1 can distinguish between ⁇ M-order and mM-order glutathione concentrations due to the structure of the linker compound.
  • the linker using a disulfide bond used in Non-Patent Documents 1 and 2 is an alkane-type linker based on a thiol group such as cysteine.
  • the alkane-type linker can adjust the easiness of dissociation and binding by adjusting the steric hindrance of the S atom, but it is difficult to give a high degree of selectivity according to various glutathione concentrations.
  • glutathione concentration in cancer cells varies depending on the cell type and cancer state.
  • linker compounds that dissociate at a given concentration of glutathione may be insufficient for therapeutic use in a variety of cancer cells and cancer conditions.
  • the present inventors have found that by using a multifunctional linker compound with a higher degree of freedom in designing functions, various cancer cells can be identified, target cells can be accurately selected, and effective It was considered that it can be used for cancer treatment. Specifically, if the glutathione concentration at which disulfide bonds dissociate can be adjusted by molecular design, it is possible to obtain a multifunctional linker compound that can distinguish various cancer cells and cancer states depending on the glutathione concentration. Further research was carried out on linker compounds.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and the concentration of glutathione at which disulfide bonds dissociate can be designed by molecular design, cancer cells can be accurately identified, and the glutathione is stable and targeted outside the target cells.
  • An object of the present invention is to provide a linker compound and a conjugate compound containing the linker compound that can effectively release a drug compound in cells.
  • a linker compound used in a conjugate compound containing a drug compound the linker compound having a structure represented by the following formula (1).
  • R 1 and R 2 are each a compound containing hydrogen, carbon, oxygen, nitrogen, or a halogen element, or a derivative thereof.
  • the linker compound, wherein the conjugate compound is an antibody drug conjugate compound in which the drug compound and the drug compound transit peptide are conjugated via the linker compound.
  • the conjugate compound, which is an antibody-drug conjugate compound in which the drug compound and an antibody are conjugated via the linker compound.
  • the complex compound, wherein the drug compound is an apoptosis fusion peptide.
  • the complex compound, wherein the drug compound is a nucleic acid.
  • the concentration of glutathione at which disulfide bonds dissociate can be designed by molecular design, cancer cells can be accurately identified, and a drug compound can be released stably outside target cells and effective in target cells.
  • a linker compound and a conjugate compound containing the same are obtained.
  • FIG. 2 is a graph showing the NMR spectrum of the compound used in Test Example 1.
  • FIG. FIG. 2 is a graphical representation comparing the NMR spectra of the compounds of FIG. 1 overlaid;
  • 4 is a graph showing the NMR spectrum of the compound used in Comparative Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the NMR spectrum of the compound used in Test Example 2.
  • FIG. 5 is a partially enlarged view of FIG. 4;
  • FIG. FIG. 5 is a graph showing the result of plotting changes in absorption intensity at 242 nm in FIG. 4 with respect to time;
  • 3 is a graph showing NMR spectra of some compounds used in Test Example 3.
  • FIG. 3 is a graph showing NMR spectra of some compounds used in Test Example 3.
  • FIG. 1 is a graph showing NMR spectra of some compounds used in Test Example 3.
  • FIG. 3 is a graph showing NMR spectra of some compounds used in Test Example 3.
  • FIG. 3 is a graph showing NMR spectra of some compounds used in Test Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing the NMR spectrum of the compound used in Test Example 4.
  • FIG. 3 is a graph showing an NMR spectrum of another compound used in Test Example 3.
  • FIG. 13 is a partially enlarged view of FIG. 12;
  • FIG. 13 is another partially enlarged view of FIG. 12;
  • FIG. 10 is a confocal microscopic view of fluorescent coloring of cells used in Test Example 9.
  • the linker compound of this embodiment is a linker compound used for a complex compound containing a drug compound, and has a structure represented by the following formula (1).
  • R 1 and R 2 are each a compound containing hydrogen, carbon, oxygen, or a halogen element, or a derivative thereof.
  • a linker compound is a compound that is used to join other compounds and form a conjugate compound with those other compounds. Primarily through substitution on either the benzene ring of formula (1) or on R 1 , R 2 , it binds to other compounds to form complex compounds.
  • a linker compound is used for a conjugate compound containing a drug compound. That is, at least one of the plurality of compounds directly or indirectly bound to the linker compound to form the complex compound is a drug compound.
  • Pharmaceutical compounds broadly refer to compounds that act as drugs and compounds that exert therapeutic effects.
  • the pharmaceutical compound is used in the treatment of cancer.
  • the complex compound is preferably used against cancer cells.
  • the linker-binding portion dissociates according to the concentration of glutathione. Therefore, when introduced into cancer cells with a high concentration of glutathione, the drug compound separates from the complex compound and is suitable for acting as a drug. ing.
  • R 1 and R 2 are substituents in the aromatic ring in the formula.
  • R 1 and R 2 may be substituted at any position in the aromatic ring.
  • R 1 is substituted on one aromatic ring
  • R 2 is substituted on the other aromatic ring. It may be a group, and may be substituted at multiple positions on the aromatic ring.
  • R 1 , R 2 , and a plurality of substituents that can be contained therein may be the same substituents or different substituents.
  • the substituent may be substituted at any position ortho, meta or para with respect to the position to which S is attached on the aromatic ring.
  • the present inventors found that the conditions under which the S--S bond dissociates, specifically reducing conditions such as glutathione concentration, can be adjusted by adjusting the S atom of the S--S bond.
  • the conditions under which the S--S bond dissociates specifically reducing conditions such as glutathione concentration
  • it might be possible by adjusting the electron density of Mutual thiol-disulfide exchange reactions between S atoms and S—S bonds are controlled by the acidity (pKa) of the thiol, the electronic environment of the S atom, steric hindrance, entropy, and the like. Therefore, to control the reactivity of the disulfide linker with GSH, it is necessary to change the above factors.
  • linker candidate compound As a linker candidate compound, by adjusting the electronic environment in the aromatic ring with the substituent (-R) of the aromatic ring bonded to or adjacent to the S atom, the environment of the S atom is controlled and the reactivity with GSH is controlled. I expected. Therefore, at first, attention was paid to the use of benzylthiol derivatives (Formulas (10) and (11) described later) that can be synthesized based on commercially available isophthalic acid. However, with benzylthiol derivatives, it was not possible to obtain a difference in electron density by proton NMR depending on the presence or absence of substituents, and it was considered difficult to design them as linker compounds.
  • R 1 and R 2 are each preferably a halogen element, a hydrocarbon group, an oxide group, or a nitride group.
  • each of R 1 and R 2 is preferably a halogen element, methyl group, t-butyl group, methoxy group, nitro group, carboxyl group, cyano group or dimethylamino group.
  • R 1 and R 2 are each preferably a nitro group, a fluorine group, or a carboxyl group.
  • R 1 and R 2 are each preferably a nitro group, a fluorine group, or a carboxyl group.
  • substituents or compounds by selecting R 1 and R 2 from these elements, substituents or compounds, the electron density of the S atom in the above formula (1) is designed, and the glutathione concentration in cancer cells is selected. It can be a structure suitable for dissociating effectively. Specifically, by setting R 1 and R 2 to ortho-coordinated carboxyl groups, 80% or more of normal cells do not dissociate one day after administration, and a cancer cell model with a glutathione concentration of 20 mM It can be a structure in which nearly 100% dissociate one day after administration.
  • both R 1 and R 2 are ortho-coordinated carboxyl groups and meta-coordinated fluorine elements
  • 70% or more at 100 minutes after administration to a cancer cell model with a glutathione concentration of 20 mM can be a structure that dissociates.
  • 70% or more at 100 minutes after administration to a cancer cell model with a glutathione concentration of 20 mM can be a structure that dissociates.
  • R 1 and R 2 are meta-coordinated carboxyl groups and para-coordinated nitro group elements, 80% after administration to a cancer cell model with a glutathione concentration of 20 mM at 100 minutes after administration A structure in which the above dissociates can be obtained.
  • the S—S bond is cleaved at a glutathione concentration of 10 to 200 mM.
  • the S—S bond can be cleaved at glutathione concentrations in various cancer cells.
  • the scale (order) of glutathione concentration in tissues is considered to be approximately 10 -6 to 10 -5 M in blood, approximately 1000 to 100000 ⁇ M in normal cells, and approximately 10000 to 100000 ⁇ M in cancer cells in terms of molar concentration. It is In particular, on average, it ranges from 5 to 25 ⁇ M in blood, from 0.4 mM to less than 10 mM in normal cells, and from 10 mM to 200 mM in cancer cells.
  • the linker compound and the linker portion of the conjugate compound containing the linker compound are contained at a glutathione concentration of 10 to 200 mM in cancer cells under specific conditions. can be designed to cleave at a glutathione concentration of 10 to 200 mM.
  • the structure of the compound of formula (1) more specifically, the structure of R 1 and R 2 , and the substitution positions on the aromatic ring can be designed to increase the electron density of the S atom.
  • the linker compounds of the present embodiments can be widely used to form conjugate compounds with drug compounds and other compounds. Specifically, as described later, it can be used for an antibody-drug conjugate compound in which the drug compound and the antibody are conjugated via the linker compound.
  • the complex compound of this embodiment contains the linker compound. That is, the conjugate compound includes the drug compound and the linker compound. In particular, it includes compounds in which drug compounds and other compounds are conjugated via said linker compounds.
  • the conjugate compound is preferably an antibody-drug conjugate compound in which the drug compound and the drug compound transit peptide are conjugated via the linker compound.
  • the drug compound transit peptide broadly refers to a peptide that has the function of complexing with a drug compound and guiding the drug compound to a target.
  • the term "peptide" as used herein refers broadly to a conjugate of a plurality of amino acids, ranging from a few to large polypeptides (so-called proteins).
  • a target refers to, for example, a particular cell or a particular location in a cell.
  • a specific cell is a cell having a specific property such as a cancer cell, and a specific position in a cell refers to the inside of the cell, the surface of the cell, or the like.
  • the drug compound transit peptide is selected from the group consisting of antibodies and cell membrane penetrating peptides.
  • These effects include, for example, antibodies that deliver drug compounds to target cancer cells, and cell membrane-penetrating peptides such as linker peptides that deliver drug compounds into cells. It has the function of leading to a place.
  • the cell membrane penetrating peptide is also preferably a linker peptide (peptide linker) that binds the above linker compound to another compound.
  • a linker peptide for example, an arginine linker having an oligoarginine sequence in which multiple arginines are bound can be used.
  • Peptides having an oligoarginine sequence or arginine-rich peptides facilitate intracellular uptake. Therefore, these peptides can be used as arginine linkers to bind to other compounds, allowing compounds to enter the cytoplasm from the extracellular space. can be taken into.
  • the conjugated compound is also preferably an antibody-drug conjugated compound in which the drug compound and the antibody are conjugated via the linker compound.
  • An antibody-drug conjugate compound can be used as a kind of antibody drug. That is, the antibody-drug conjugate compound has highly selective selectivity due to specific binding of the antibody to the target object (antigen).
  • the linker compound is cleaved according to the intracellular environment, for example, the reducing environment (glutathione concentration), and the drug compound is released from the antibody-drug conjugate compound. Particularly high selectivity can be exhibited.
  • the drug compound is also preferably a so-called drug, an amino acid, an oligopeptide, a protein drug, or a nucleic acid drug.
  • the oligopeptide of the drug compound is also preferably an apoptosis-inducing peptide.
  • Apoptosis-inducing peptides include, for example, PAD/kla(KLAKLAK) 2 and the like.
  • Apoptosis fusion peptides induce apoptosis in cells and can be used to kill and treat cancer cells. Since the linker compound of the present embodiment and the complex compound containing it can specifically target cancer cells and cancer cells under specific conditions, they are used for treatment to kill specific cancer cells. be able to.
  • the drug compound of this embodiment is a nucleic acid.
  • the nucleic acid of the drug compound can be selected from those used as nucleic acid drugs.
  • Nucleic acid medicines are therapeutic drugs that target chromosomal DNA, various functional RNAs, and proteins, and exhibit efficacy through functional control using nucleic acid derivatives.
  • the antisense method which targets functional RNA in particular for target diseases, enables the design of various nucleic acid medicines based on the sequence, expression timing, expression site, etc., and has many potential applications.
  • the linker compound of the present embodiment can be applied as a linker with polyethylene glycol (PEG), which is frequently used as a general-purpose DDS system. It can also be used as a linker compound that binds a molecule and a drug. It can also be used as a prodrug and as a binding linker to a deactivating molecule.
  • PEG polyethylene glycol
  • the linker compound is not limited to the above-mentioned compounds as the drug to be bound/loaded, and can be applied to various drugs.
  • the complex compound of the present embodiment can appropriately select target cells by reducing conditions, particularly glutathione concentration conditions.
  • it is preferably used against cancer cells.
  • Cancer cells have a specific range of glutathione concentration, and the complex compound of this embodiment can specifically select a target.
  • the action of the linker compound of the present embodiment includes the structure represented by formula (1), and the disulfide bond (S—S bond) in the structure of formula (1) is dissociated under reducing conditions. For example, it dissociates when glutathione (GSH) concentration increases.
  • GSH glutathione
  • the reductive conditions for dissociation such as glutathione concentration, vary depending on the structure represented by formula (1).
  • the redox potential of the disulfide bond differs depending on the coordination position and structure of the substituent R on the aromatic ring of formula (1). In other words, the design of the substituent R on the aromatic ring can set the conditions for the dissociation of the disulfide bond.
  • the linker compound of the present embodiment distinguishes between mM glutathione concentrations, specifically glutathione concentrations within the range of 10 to 200 mM, and dissociates when placed under specific concentration conditions. Therefore, the linker compound does not dissociate under specific concentration conditions, for example, when introduced into blood or normal cells with a glutathione concentration in the ⁇ M level. On the other hand, the linker compound can be dissociated when introduced into target disease cells having a glutathione concentration above the specific concentration condition, or having a certain intracellular glutathione concentration.
  • the linker compound of the present embodiment has the above-described actions, it can specifically identify cancer cells. Specifically, according to the difference in glutathione concentration between normal cells and cancer cells, and also according to the difference in glutathione concentration according to the type of cancer cell and the state of cancer, the disulfide bonds are dissociated and the linker Conditions can be set for the compound to dissociate. Therefore, it is possible to accurately identify cancer cells and their types and states, dissociate the linker compound, and release the drug compound in the cells. This results in a linker compound that is stable outside the target cell and capable of effective release of the drug compound in the target cell. That is, it can be applied as a multifunctional linker that has designability and selectivity and exhibits advanced functions.
  • linker compounds that can be dissociated by other glutathione concentrations or reducing conditions, and dissociate under conditions that can be designed in various ways. It can be widely applied as
  • the composite compound of this embodiment has a linker compound having the above-described actions and effects.
  • the conjugated compounds of the present embodiments can be used for drug delivery in a variety of situations where discrimination of reduction states by linker compounds can be applied, such as drug delivery in the treatment of various diseases. It can be widely used as a complex compound that can dissociate and release drug compounds depending on the glutathione concentration, which can be designed in various ways, in various situations, not limited to distinguishing between normal cells and cancer cells, or whether intracellular dissociation exists or not. .
  • a compound with specific selectivity such as an antibody
  • a linker compound to form a complex compound stable and efficient cell transduction other than the target is possible. Effective drug release in the targeted cytoplasm is possible.
  • the complex compound of the present embodiment can be suitably used particularly for cancer treatment.
  • cancer treatment it is possible to selectively release drugs in the vicinity of cancer cells, effectively escape drugs from endosomes, and selectively release drugs in the cell environment characteristic of cancer cells.
  • a selective drug delivery system (DDS) is needed.
  • the conjugated compound of the present embodiment is a conjugated compound obtained by binding a compound having specific selectivity such as an antibody with a linker compound to a drug compound. Since the linker compounds of the embodiments enable cancer cell selection, effective drug escape from endosomes, and selective drug release in cell environments characteristic of cancer cells, they can be widely applied to the DDS.
  • FIG. 1 shows a comparison of spectral results of proton NMR in CDCl3 for the compounds of formulas (2) and (4).
  • FIG. 2 shows a graph in which the spectra in FIG. 1 are superimposed for comparison.
  • THF used was Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product code 207-17765, ultra-dehydrated, stabilizer-free, and a cell of 10 mm ⁇ 10 mm was used.
  • a reduction reaction of the oxidized form (disulfide) of the unsubstituted model compound of formula (2) was carried out in the cell.
  • the reaction was carried out using an excess amount (11 equivalents) of LiBH 4 with respect to the oxidized form of the compound of formula (2) (45 ⁇ Min THF).
  • LiBH 4 was prepared by diluting a commercially available THF 2M solution and used in the reaction.
  • FIG. 4 shows changes in the UV spectrum as the reaction progresses.
  • FIG. 5 shows an enlarged graph of absorption 1.0 to 1.5 on the vertical axis and wavelength 216 to 228 nm on the horizontal axis in FIG.
  • NMR NMR was used to investigate the stability of disulfide bonds in a mixed system under various concentration conditions. From Test Example 2, it is possible to track the reaction by UV, but NMR measurement is used below because NMR can track a complex system more.
  • the compounds of formula (6), formula (7) and formula (8) having the substituent (--COOH) are represented as ArSSrA(H), ArSSrA(F) and ArSSrA(NO 2 ), respectively.
  • a comparison of the NMR spectra in FIGS. 7 and 8 shows that there is a clear difference between GSH and GSSG.
  • a particularly striking difference is the chemical shift of the number 7 proton at the root of the S atom.
  • the proton of number 7 of GSH is located at 2.144 ppm, while the proton of number 7 of GSSG is divided into two peaks of 3.292 and 2.956 ppm.
  • the difference in chemical shift is due to the difference in electron density depending on the state of the S atom being SH or SS. It is thought that it is because it stopped rotating because it was crowded. Since it was found that there was a difference in the peaks of GSH and GSSG, it was thought that the respective compound ratios in the mixed system of GSH and GSSG could be calculated from the integrated values.
  • FIG. 9 shows the NMR spectrum of reduced ArSH (formula (15) in the figure) and
  • FIG. 10 shows the NMR spectrum of oxidized ArSSrA (formula (7)).
  • Equation (16) shows the parallel relationship between ArSSrA(H) and GSH (left side) and between ArSH(H) and GS-SG (right side).
  • An NMR tube was prepared by using a double tube (SHIGEMI model SP-405) and putting a TMS-containing CDCl3 solution (LOCK solvent) on the outside.
  • LOCK solvent TMS-containing CDCl3 solution
  • the abundance ratio of each compound can be derived from the comparison of the initial concentration of the input and the integral value of the obtained spectrum. was found to exist in the system as an intermediate.
  • ArSSrA(F) and ArSSrA(NO2) were tested in the same manner as in Test Example 6 to examine their respective cleavage reactions in normal cell models and cancer cell models.
  • the results of ArSSrA(F)ArSSrA(NO2) are shown in Tables 6 and 7, respectively.
  • Tables 6 and 7 both ArSSrA (F) and ArSSrA (NO2) were cleaved about 90% after 100 minutes, and all were cleaved after 1 day. It was found that it can be expected as a linker that cleaves in response to cancer cell GSH concentration.
  • Arg 8 acts as a cell membrane penetrating peptide (arginine linker) and has the effect of taking the bound compound into the cytoplasm.
  • FAM and Dbs each develop a color by fluorescence, but the compound to which FAM-Dbs binds hardly develops color.
  • FAM and DBS are separated and emit light, so that their intracellular distribution can be detected. Therefore, examining the fluorescence emission of the Arg 8 -Dbs-linker-FAM compound detects whether the compound was taken up into the cytoplasm, cleaved intracellularly, and the intracellular distribution of the cleaved compound. be able to.
  • FIG. 15 shows a diagram of fluorescence development observed with a confocal microscope after incubating various cells with an Arg 8 -Dbs-linker-FAM compound (formula (22)) (25 ⁇ M) for 30 minutes in the F-12(-) state. show.
  • the various cells are HeLa (human cervical epithelial cancer cells), HT-1080 (human fibroblastoma cells), HepG2 (human liver cancer cells), and CHO-K1 (Chinese hamster ovary-derived cells), respectively.
  • strong intracellular fluorescence was observed, indicating that the compound was incorporated into each cell via a cell membrane penetrating peptide (arginine linker).
  • the fact that fluorescence was strong indicates that Dbs and FAM were separated from the compound of formula (22), that is, the disulfide bond of the linker compound was cleaved. From this result, the compound bound by the linker compound of the present embodiment can be introduced into cells by the cell membrane penetrating peptide, and the linker compound can be cleaved only in cancer cells where the glutathione concentration is above a certain level. shown.
  • the glutathione concentration at which the disulfide bond dissociates can be designed by molecular design, cancer cells can be accurately identified, and stable and stable outside the target cell. can provide effective drug compound release. Therefore, it can be widely applied to antibody drugs using antibody-drug conjugates and drugs using other conjugates, and can be used for cancer treatment with few side effects.

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Abstract

分子設計によってジスルフィド結合が解離するグルタチオン濃度を設計でき、がん細胞を的確に識別することができ、標的細胞外では安定かつ標的細胞では効果的な薬剤化合物の放出を行うことができるリンカー化合物及びそれを含む複合体化合物を提供する。薬剤化合物を含む複合体化合物に用いられるリンカー化合物であって、下記式（１）で現される構造を有する、リンカー化合物である。 （式（１）において、Ｒは水素、炭素、酸素若しくはハロゲン元素を含む化合物又はその誘導体である。

Description

リンカー化合物及びそれを含む複合体化合物
　本発明は、治療に用いられる薬剤化合物と他の化合物が複合した複合体化合物について、その複合体化合物を形成するために用いられるリンカー化合物、及びそれを用いた複合体化合物に関する。
　本願は、２０２１年９月１７日に、日本に出願された特願２０２１－１５２０９２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　がんは、日本そして世界において、罹患数・死亡数ともに上位を占める疾患であり、その治療法の確立は最も重要な課題の一つである。がんに対する医薬品としては、近年、医薬品としては低分子医薬から遺伝子組換技術を利用して作成された比較的高分子のバイオ医薬が開発されている。バイオ医薬の代表例として、抗体の識別性を用いた抗体医薬が開発されている。抗体医薬は低分子医薬と比較して標的特異性が高く副作用が少ないという利点がある。このため、抗体医薬は特にがん細胞に特異的に作用させることで、がんの治療法に応用できる点が期待されている。
　抗体医薬は、既存の薬物及び抗体活用による短期間開発が可能であり、比較的廉価な開発コストと成功確率の高い薬剤開発戦略で開発することが見込まれ、創薬における事業、市場の発展の可能性の面においても期待されている。
　一方で、抗体医薬は一般的に、煩雑な製造工程、高い製造・開発コスト、薬剤の高分子量化、抗原性など多くの問題点も有する。さらにその大きな分子量などに起因し、細胞膜透過性が極めて低く、標的が細胞表層などの細胞外部のタンパク質に限定されることもある。
　この問題に対して、抗体と薬物をリンカー化合物によって結合した複合体（抗体薬物複合体）とし、リンカー化合物に解離可能な機能を持たせることで、薬物に抗体とは離れた単体で機能を発揮させるための技術も開発が進められている。
　抗体医薬に応用可能な化合物としては、例えば特許文献１には、抗体と薬剤をリンカー化合物で結合した薬物－抗体コンジュゲート化合物が開示されている。
　この薬物－抗体コンジュゲート化合物は、スルフィド基を有するリンカー化合物を用いて抗体のＦｃ部のシステインとジスルフィド結合を形成させ、ピロロベンゾジアゼピンプロドラッグ単量体（薬物）と抗体とリンカー化合物の複合体を形成しようとするものである。
　非特許文献１には、抗体と薬剤を結合するリンカーとして、アルカン型ジスルフィドリンカーが開示されている。
　このリンカーは、グルタチオン濃度に依存的にジスルフィドリンカーを切断し、また、その切断をＦＲＥＴを利用して評価しようとするものである。
　非特許文献２には、抗体と薬剤を結合するリンカーとして、ジチオベンジルウレタンリンカーが開示されている。
　このリンカーは、グルタチオン濃度に依存的にジスルフィドリンカーを切断しようとするものである。
特表２０１９－５３４２３８号公報
Ｓｃａｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ　３０　（２０１９）　３０４６－３０５６ Ｚｈｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ　１４，　（２０１９）　１１９６－１２０３
　特許文献１及び非特許文献１、２の技術では、リンカー化合物のジスルフィド結合により抗体と薬物を構成する化合物が結合し、グルタチオン濃度に応じて抗体と薬物を構成する化合物が切断され、薬物が治療の機能を発揮することができる。一般にグルタチオンの濃度は血中では５～２５μＭ、正常細胞内では０．４ｍＭ以上、１０ｍＭ未満といわれている。例えば、特許文献１ではグルタチオン濃度が３桁より大きい（ｍＭオーダー）範囲を細胞内の濃度として識別する。抗体薬物複合体が血中に投与された際は、グルタチオン濃度が低い（μＭオーダー）ため複合体が形成された状態を維持している。抗体薬物複合体が細胞中に移行した際に、グルタチオン濃度が高濃度（ｍＭオーダー）となってリンカー化合物のジスルフィド結合が開裂し、抗体と薬物を構成する化合物の複合体が解離し、薬物が細胞内で薬効を発揮することができる。
　しかしながら、特許文献１及び非特許文献１、２の技術では、リンカー化合物は各化合物の構造に応じて、それぞれ一定の濃度で抗体と薬物を構成する化合物の複合体が解離することしかできない。
　例えば、特許文献１の抗体薬物複合体は、グルタチオン濃度がｍＭオーダーとなった際に複合体が解離するので、正常細胞、がん細胞を問わず、細胞中に移行した際に薬物が細胞内で薬効を発揮する。そのため、正常細胞においても薬物が解離するため、望まぬ細胞において薬物が作用し、副作用の原因となる場合がある。
　ここで、がん細胞は正常細胞に比べてグルタチオン濃度が１０～１００倍の、平均しておよそ１０～２００ｍＭであることが知られている。本発明者らは、がん細胞と正常細胞のグルタチオン濃度差によって、がん細胞と正常細胞とを識別することが可能ではないかと考察した。しかしながら、例えば特許文献１に開示されたリンカー化合物では、リンカー化合物の構造上、グルタチオン濃度がμＭオーダーとｍＭオーダーであれば識別することができるが、がん細胞と正常細胞のグルタチオン濃度差のような、さらに精密な濃度差を識別してリンカー化合物を切断することはできない。
　非特許文献１、２で用いられているジスルフィド結合を用いたリンカーは、システインなどのチオール基を元にしたアルカン型のリンカーである。アルカン型のリンカーは、Ｓ原子の立体障害を調節することにより解離、結合のしやすさを調節することはできるが、様々なグルタチオン濃度に応じた高度な選択性を持たせることは難しい。
　さらに、がん細胞におけるグルタチオン濃度は、細胞の種類や、がんの状態によってそれぞれ異なっている。そのため、一定のグルタチオン濃度で解離するリンカー化合物を用いても、様々ながん細胞やがんの状態における治療に利用するには不十分なことがある。
　本発明者は、これらの状況を鑑みて、より設計による機能の自由度の高い多機能性リンカー化合物を用いることで、様々ながん細胞を識別でき、的確に標的の細胞を選択し、有効ながん治療に用いることができると考察した。具体的には、ジスルフィド結合が解離するグルタチオン濃度を分子設計によって調節することができれば、グルタチオン濃度によって様々ながん細胞やがんの状態を識別できる多機能性リンカー化合物を得られると考察し、リンカー化合物についてさらなる研究を進めていった。
　本発明は上記のような事情を鑑みてなされたものであり、分子設計によってジスルフィド結合が解離するグルタチオン濃度を設計でき、がん細胞を的確に識別することができ、標的細胞外では安定かつ標的細胞では効果的な薬剤化合物の放出を行うことができるリンカー化合物及びそれを含む複合体化合物を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明は以下の態様を有する。
［１］薬剤化合物を含む複合体化合物に用いられるリンカー化合物であって、下記式（１）で現される構造を有する、リンカー化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ水素、炭素、酸素、窒素若しくはハロゲン元素を含む化合物又はその誘導体である。）
［２］前記式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれハロゲン元素、炭化水素基、酸化物基又は窒化物基である、前記リンカー化合物。
［３］前記式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれハロゲン元素、メチル基、ｔ－ブチル基、メトキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、シアノ基又はジメチルアミノ基である、前記リンカー化合物。
［４］前記式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれニトロ基、フッ素又はカルボキシル基である、前記リンカー化合物。
［５］前記式（１）において、前記Ｓ－Ｓ結合がグルタチオン濃度１０～２００ｍＭにおいて開裂するよう構成されてなる、前記リンカー化合物。
［６］前記複合体化合物が、前記薬剤化合物と薬剤化合物輸送ペプチドとが前記リンカー化合物を介して複合した抗体薬剤複合体化合物である、前記リンカー化合物。
［７］前記薬剤化合物輸送ペプチドが、抗体、細胞膜透過ペプチドからなる群から選択される、請求項６に記載のリンカー化合物。
［８］前記リンカー化合物を含む複合体化合物。
［９］前記薬剤化合物と抗体とが前記リンカー化合物を介して複合した抗体薬剤複合体化合物である、前記複合体化合物。
［１０］前記薬剤化合物がアポトーシス融合ペプチドである、前記複合体化合物。
［１１］前記薬剤化合物が核酸である、前記複合体化合物。
［１２］がん細胞に対して用いられる、前記複合体化合物。
　本発明によれば、分子設計によってジスルフィド結合が解離するグルタチオン濃度を設計でき、がん細胞を的確に識別することができ、標的細胞外では安定かつ標的細胞では効果的な薬剤化合物の放出を行うことができるリンカー化合物及びそれを含む複合体化合物が得られる。
試験例１で用いた化合物のＮＭＲスペクトルを示すグラフ図である。 図１の化合物のＮＭＲスペクトルを重ねて比較したグラフ図である。 比較例１で用いた化合物のＮＭＲスペクトルを示すグラフ図である。 試験例２で用いた化合物のＮＭＲスペクトルを示すグラフ図である。 図４の一部拡大図である。 図４の２４２ｎｍの吸収強度の変化を時間に対してプロットした結果を示すグラフ図である。 試験例３で用いた一部の化合物のＮＭＲスペクトルを示すグラフ図である。 試験例３で用いた一部の化合物のＮＭＲスペクトルを示すグラフ図である。 試験例３で用いた一部の化合物のＮＭＲスペクトルを示すグラフ図である。 試験例３で用いた一部の化合物のＮＭＲスペクトルを示すグラフ図である。 試験例４で用いた化合物のＮＭＲスペクトルを示すグラフ図である。 試験例３で用いた別の化合物のＮＭＲスペクトルを示すグラフ図である。 図１２の一部拡大図である。 図１２の別の一部拡大図である。 試験例９で用いた細胞の蛍光発色の共焦点顕微鏡図である。
　以下、本発明に係るリンカー化合物及び複合体化合物について、実施形態を示して説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　（リンカー化合物）
　本実施形態のリンカー化合物は、薬剤化合物を含む複合体化合物に用いられるリンカー化合物であって、下記式（１）で現される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ水素、炭素、酸素若しくはハロゲン元素を含む化合物又はその誘導体である。）
　リンカー化合物とは他の複数の化合物を結合し、それらの他の複数の化合物との間で複合体化合物を形成するために用いられる化合物である。主に、式（１）のベンゼン環上又はＲ１，Ｒ２へのいずれか対する置換により、他の化合物と結合し、複合体化合物を形成する。
　リンカー化合物は、薬剤化合物を含む複合体化合物に用いられる。すなわち、リンカー化合物と直接又は間接的に結合し、前記複合体化合物を形成している複数の化合物のうち少なくとも一つが、薬剤化合物である。
　薬剤化合物とは、薬物として働く化合物、治療のための効果を発揮する化合物を広く指す。薬剤化合物は、がんの治療に用いられることが好ましい。このとき、複合体化合物はがん細胞に対して用いられることが好ましい。本実施形態のリンカー化合物は、グルタチオン濃度に応じてリンカー結合部分が解離するので、グルタチオン濃度の高いがん細胞に導入された際に複合体化合物から薬剤化合物が分離し、薬剤として働くことに適している。
　前記式（１）において、Ｒ１及びＲ２は式中の芳香族環中の置換基である。Ｒ１及びＲ２は、芳香族環中のいずれの位を置換していてもよい。式（１）中では、一方の芳香族環に置換しているものをＲ１、他方の芳香族環に置換しているものをＲ２としているが、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ複数の置換基であってもよく、また、芳香族環上の複数の位に置換していてもよい。また、Ｒ１、Ｒ２、それに含まれ得る複数の置換基は、それぞれ同じ置換基であっても、異なっていても良い。置換基は、芳香族環上でＳが結合している位置に対して、オルト位、メタ位又はパラ位のいずれの位に置換されていてもよい。
　本発明者らは、Ｓ－Ｓ結合を有するリンカー化合物について、該Ｓ－Ｓ結合が解離する条件、具体的にはグルタチオン濃度などの還元的条件を調節するには、Ｓ－Ｓ結合のＳ原子の電子密度を調整することで可能ではないかと考察した。
　Ｓ原子とＳ－Ｓ結合の相互のチオール－ジスルフィド交換反応は、チオールの酸性度（ｐＫａ）、Ｓ原子の電子的環境、立体障害、エントロピーなどによって制御される。そのため、ジスルフィドリンカーのＧＳＨとの反応性を制御するには、上記因子を変化させる必要がある。
　リンカー候補化合物として、Ｓ原子に結合又は隣接する芳香環の置換基（－Ｒ）によって芳香環内の電子的環境を調節することによって、Ｓ原子の環境を制御・ＧＳＨとの反応性の制御を期待した。そこで当初は、市販のイソフタル酸をもとに合成可能なベンジルチオール誘導体（後述の式（１０）及び式（１１））を用いることに着目した。しかしながら、ベンジルチオール誘導体では、置換基の有無によってプロトンＮＭＲによる電子密度の差を得ることができず、リンカー化合物としての設計は困難と思われた。
　そこで、ベンジルチオール誘導体よりもＳ原子が芳香環に近く、芳香環及び置換基の電子密度を受けやすい構造、すなわち直接芳香環にＳ原子が結合しているチオフェノール誘導体（式（１））を用いることを検討した。その結果、この化合物では芳香環上の置換基によるＳ原子上の電子密度の制御、ならびにＧＳＨとの反応性の制御が可能であることを見出した。
　前記式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれハロゲン元素、炭化水素基、酸化物基又は窒化物基であることが好ましい。また、式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれハロゲン元素、メチル基、ｔ－ブチル基、メトキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、シアノ基又はジメチルアミノ基であることも好ましい。
　前記式（１）において、Ｒ１、Ｒ２をこれらの元素、置換基又は化合物から選択することで、上記式（１）におけるＳ原子の電子密度を様々に設計することができる。その設計によって、上記式（１）におけるＳ－Ｓの解離する条件を制御することができる。
　また、式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれニトロ基、フッ素、又はカルボキシル基であることも好ましい。
　前記式（１）において、Ｒ１、Ｒ２をこれらの元素、置換基又は化合物から選択することで、上記式（１）におけるＳ原子の電子密度を設計し、がん細胞におけるグルタチオン濃度に選択的に解離するのに適切な構造とすることができる。
　具体的には、Ｒ１、Ｒ２をそれぞれオルト配位されたカルボキシル基とすることにより、正常細胞に投与後１日で８０％以上が解離せず、グルタチオン濃度が２０ｍＭのがん細胞モデルに投与後投与後１日で１００％近くが解離する構造とすることができる。
　また、Ｒ１、Ｒ２のいずれも、オルト配位されたカルボキシル基及びメタ配位されたフッ素元素とした場合、グルタチオン濃度が２０ｍＭのがん細胞モデルに投与後投与後１００分で７０％以上が解離する構造とすることができる。
　また、Ｒ１、Ｒ２のいずれも、オルト配位されたカルボキシル基及びメタ配位されたフッ素元素とした場合、グルタチオン濃度が２０ｍＭのがん細胞モデルに投与後投与後１００分で７０％以上が解離する構造とすることができる。
　また、Ｒ１、Ｒ２のいずれも、メタ配位されたカルボキシル基及びパラ配位されたニトロ基元素とした場合、グルタチオン濃度が２０ｍＭのがん細胞モデルに投与後投与後１００分で８０％以上が解離する構造とすることができる。
　前記式（１）において、前記Ｓ－Ｓ結合がグルタチオン濃度１０～２００ｍＭにおいて開裂するよう構成されてなることも好ましい。この構成により、各種のがん細胞内のグルタチオン濃度において前記Ｓ－Ｓ結合が開裂するようにすることができる。一般に、組織内におけるグルタチオン濃度の規模（オーダー）は、モル濃度で血中において約１０－６～１０－５Ｍ、正常細胞中において約１０００～１０００００μＭ、がん細胞中において約１００００～１０００００μＭと考えられている。特に、平均すると、血中においては５～２５μＭ、正常細胞では０．４ｍＭ以上、１０ｍＭ未満、がん細胞では１０ｍＭ以上、２００ｍＭ以下の範囲のことがある。したがって、Ｓ－Ｓ結合がグルタチオン濃度１０～２００ｍＭにおいて開裂するよう構成することで、リンカー化合物及びそれを含む複合体化合物のリンカー部分が、１０～２００ｍＭに含まれる特定条件のがん細胞のグルタチオン濃度において開裂するよう設計することができる。
　具体的には、前述したように式（１）の化合物の構造、さらに具体的にはＲ１，Ｒ２の構造や、芳香環上の置換位置を設計することで、Ｓ原子の電子密度を設計し、Ｓ－Ｓ結合が開裂するグルタチオン濃度を制御することができる。
　本実施形態のリンカー化合物は、薬剤化合物及び他の化合物との複合体化合物を形成するために広く用いることができる。
　具体的には、後述するように、前記薬剤化合物と抗体とが前記リンカー化合物を介して複合した抗体薬剤複合体化合物に用いることができる。
（複合体化合物）
　本実施形態の複合体化合物は、前記リンカー化合物を含む。すなわち、複合体化合物は、薬剤化合物と、前記リンカー化合物とを含む。特に、薬剤化合物と、その他の化合物が前記リンカー化合物を介して複合した化合物を含む。
　前記複合体化合物は、前記薬剤化合物と薬剤化合物輸送ペプチドとが前記リンカー化合物を介して複合した抗体薬剤複合体化合物であることが好ましい。
　ここで、薬剤化合物輸送ペプチドとは、薬剤化合物と複合し、薬剤化合物を標的に導く機能を有するペプチドを広く指す。また、ここでのペプチドはアミノ酸複数個の結合体で、数個から大型のポリペプチド（いわゆる蛋白質）まで広く指す。標的とは、例えば特定の細胞や、細胞における特定の位置を指す。特定の細胞としてはがん細胞などの特定の性質を有する細胞、細胞における特定の位置とは細胞内部、細胞表面などを指す。
　薬剤化合物輸送ペプチドが、抗体、細胞膜透過ペプチドからなる群から選択されることも好ましい。これらの効果としては、例えば、抗体が薬剤化合物を標的がん細胞に届けるように、またリンカーペプチドのような細胞膜透過ペプチドが薬剤化合物を細胞内に届けるように、効かせたい薬剤を効かせたい場所へ導く機能を有する。
　細胞膜透過ペプチドとしては、前記リンカー化合物とさらに他の化合物とを結合するリンカーペプチド（ペプチドリンカー）であることも好ましい。
　リンカーペプチドである細胞膜透過ペプチドとしては、例えばアルギニンが複数結合したオリゴアルギニンの配列を有する、アルギニンリンカーを用いることができる。オリゴアルギニンの配列を有する、又は、アルギニンに富んだペプチドは、細胞内への取り込みが促進されるので、これらのペプチドをアルギニンリンカーとして用い他の化合物と結合させることで、化合物の細胞外から細胞質へ取り込みませることができる。
　前記複合体化合物は、前記薬剤化合物と抗体とが前記リンカー化合物を介して複合した抗体薬剤複合体化合物であることも好ましい。
　抗体薬剤複合体化合物は、抗体医薬の一種として用いることができる。すなわち、抗体薬剤複合体化合物は、抗体が標的となる対象（抗原）に特異的に結合することで、高度に選択性な選択性を有する。さらに、抗体薬剤複合体化合物は、細胞内環境、例えば還元的環境（グルタチオン濃度）に応じてリンカー化合物が切断され、抗体薬剤複合体化合物から薬剤化合物を放出するので、抗体とリンカー化合物の組み合わせにより特に高い選択性を発揮することができる。
　前記薬剤化合物は、いわゆる薬物、薬効を有するアミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質医薬、又は核酸医薬であることも好ましい。
　前記薬剤化合物のオリゴペプチドとしては、アポトーシス誘導ペプチドであることも好ましい。アポトーシス誘導ペプチドとしては、例えばＰＡＤ／ｋｌａ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２などが挙げられる。アポトーシス融合ペプチドは、細胞のアポトーシスを誘導するので、がん細胞を死滅させ治療に用いることができる。本実施形態のリンカー化合物及びそれを含む複合体化合物は、がん細胞、さらに特定の条件のがん細胞を特異的に標的にすることができるので、特定のがん細胞を死滅させる治療に用いることができる。
　本実施形態の薬剤化合物は、核酸であることも好ましい。薬剤化合物の核酸としては、核酸医薬として用いられているものから選択することができる。
　核酸医薬は、染色体ＤＮＡや各種機能性ＲＮＡ、さらにタンパク質も標的とし、核酸誘導体を用いた機能制御により薬効発現する治療薬である。対象疾患に対し、特に機能性ＲＮＡを標的とするアンチセンス法は、その配列や発現タイミング・発現部位などに基づく多彩な核酸医薬設計が可能であり、潜在的適用疾患も多い。一方、従来の核酸医薬では、的親和性が高い誘導体は、標的と類似配列を有する標的ではないＲＮＡとも複合体を形成し、オフターゲット効果と呼ばれる副作用を惹起することが報告され、深刻な課題となっている。
　本実施形態の薬剤化合物として核酸医薬を用い、本実施形態のリンカー化合物を含服複合体化合物とすることで、リンカー化合物の高い選択性を得ることができ、また複合体化合物を構成する他の化合物に選択性を有するものを選ぶことができるので、特定の対象に対する高い選択性を得ることができ、副作用を防ぐことができる。
　本実施形態の複合体化合物に用いる化合物は、その他の化合物を用いることもできる。例えば、本実施形態のリンカー化合物は、汎用的なＤＤＳ系として多用されているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などとのリンカーとしても適用可能であり、また、ペプチド系ベクター、ＧａｌＮａｃなど糖鎖系ベクターやパイロット分子と薬物を結合するリンカー化合物として用いることもできる。また、プロドラッグとして脱活性化分子との結合リンカーとして用いることができる。リンカー化合物は結合・搭載する薬物は上記化合物に限らず、多様な薬物への展開が可能なので、これらを複合した複合体化合物に用いることができる。
　本実施形態の複合体化合物は、還元的条件、特にグルタチオン濃度の条件によって適宜標的とする細胞を選択することができる。特に、がん細胞に対して用いられることが好ましい。がん細胞は、特定範囲のグルタチオン濃度を有しており、本実施形態の複合体化合物が特異的に標的を選択することができる。
（本実施形態のリンカー化合物及び複合体化合物の作用、効果）
　本実施形態のリンカー化合物の作用としては、式（１）で現される構造を含み、前記式（１）の構造のうちジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）が、還元的条件において解離する。例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が高くなった際に解離する。前記解離する還元的条件、例えばグルタチオン濃度は、式（１）で現される構造によって異なる。例えば、式（１）の芳香環上の置換基Ｒの配位位置及び構造によって、ジスルフィド結合の酸化還元電位が異なる。換言すれば、芳香環上の置換基Ｒの設計によって、ジスルフィド結合が解離する条件を設定することができる。
　この作用により、本実施形態のリンカー化合物は、ｍＭ単位のグルタチオン濃度、具体的には１０～２００ｍＭ内でのグルタチオン濃度を識別し、特定の濃度条件に置かれた際に解離する。このため、特定の濃度条件下、例えば血中や、μＭ単位のグルタチオン濃度の正常細胞に導入された際にもリンカー化合物は解離しない。一方、前記特定濃度条件より上のグルタチオン濃度、細胞内が一定のグルタチオン濃度を有する標的疾患細胞に導入された際に、リンカー化合物が解離するようにすることができる。
　本実施形態のリンカー化合物は、上記のような作用を有するため、特にがん細胞を的確に識別することができる。具体的には、正常細胞とがん細胞のグルタチオン濃度の差異に応じて、また、がん細胞の種類やがんの状態に応じたグルタチオン濃度の差異に応じて、ジスルフィド結合が解離し、リンカー化合物が解離する条件を設定することができる。そのため、がん細胞及びその種類と状態を的確に識別してリンカー化合物が解離し、薬剤化合物の細胞内での放出を行うことができる。これにより、標的細胞外では安定、かつ標的細胞では効果的な薬剤化合物の放出を行うことができるリンカー化合物となる。すなわち、設計性と選択性を有し、高度な機能を発揮する多機能性リンカーとして応用することができる。
　また、がん細胞の識別及び細胞内での複合体の解離の他にも、その他のグルタチオン濃度、又は還元条件によって解離することができ、様々な状況において種々設計可能な条件において解離するリンカー化合物として広く応用することができる。
　本実施形態の複合体化合物は、上述の作用及び効果を持つリンカー化合物を有している。本実施形態の複合体化合物は、リンカー化合物による還元状態の識別が応用できる様々な状況、例えば様々な疾患の治療における薬剤輸送に使用できる。正常細胞とがん細胞の識別、又は細胞内における解離の有無に限らず、様々な状況において、種々設計可能なグルタチオン濃度に応じて解離、薬剤化合物を放出できる複合体化合物として広く用いることができる。
　具体的には、リンカー化合物で抗体等の特異的な選択性を持つ化合物と、薬剤化合物とを結合し複合体化合物とした場合、標的以外での安定性及び効率的な細胞導入が可能で、標的とする細胞質での効果的な薬物放出が可能である。
　本実施形態の複合体化合物は、特にがんの治療に好適に用いることができる。
　がんの治療には、がん細胞近傍での選択的な薬剤放出、エンドソームからの効果的薬物エスケープ、がん細胞特徴的な細胞環境での選択的薬物放出などが可能な、がん細胞に選択的な薬物輸送システム（ＤＤＳ）が求められる。
　本実施形態の複合体化合物は、リンカー化合物で抗体等の特異的な選択性を持つ化合物と、薬剤化合物とを結合し複合体化合物とした場合、細胞膜透過性、体内循環特性に加えて、本実施形態のリンカー化合物によるがん細胞選択制、エンドソームからの効果的薬物エスケープ及びがん細胞特徴的な細胞環境での選択的薬物放出が可能であるため、前記ＤＤＳに広く応用することができる。
　以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず種々の変更を行うことができる。
　以下、実施例および比較例により、本発明の効果をより明らかなものとする。なお、本発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施できるものである。
　（試験例１）
　（チオフェノール誘導体モデル化合物の置換基効果：プロトンＮＭＲ測定）
　チオフェノール誘導体として式（２）～式（９）に示す、化合物群を用いて各種検討を行なった。これらチオフェノール誘導体は市販されているもので、式（２）～式（６）は、様々な電子吸引基、電子供与基を持つモデル化合物として使用した。また、置換基（－ＣＯＯＨ）を持つ式（７）～（９）も各種検討に使用した。置換基（－ＣＯＯＨ）は、後の薬物・輸送部位との縮合に用いることが期待でき、置換基（－ＣＯＯＨ）が、疎水性の高いジスルフィド類の水溶性を高めるという意味でも適切であると判断した。実際にこれら化合物は水に対して、溶解性があり、ＴＨＦなどの有機溶媒にも可溶であるため、各種溶媒における様々な検討が可能である。また式（９）の化合物はエルマン試薬と呼ばれ、チオールの定量試薬として用いられている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　置換基によるＳ原子上の電子密度の影響の確認をＮＭＲ測定により行なった。３３Ｓ　ＮＭＲなども考えられるが、３３Ｓ　ＮＭＲは感度が低く、ピークが広くブロードになるため有益な情報を得ることができないと考え、Ｓ原子の根元であるベンジル位のプロトンの化学シフトを比較した。式（２）、式（４）の化合物について、ＣＤＣｌ３中のプロトンＮＭＲのスペクトル結果の比較を図１に示す。図１のスペクトルを重ねて比較したグラフを図２に示す。
　無置換の式（２）、メトキシ置換の式（４）、のそれぞれのピークの帰属と化学シフトは以下のようになる。
　Ｒ　＝　Ｈ　７．４９３３　ｐｐｍ　４Ｈ　（オルト位）　Ｒ　＝　Ｈ　７．２９２７　ｐｐｍ　４Ｈ　（メタ位）
　Ｒ　＝　Ｈ　７．２１６　ｐｐｍ　２Ｈ　（パラ位）
　Ｒ　＝　ＯＭｅ　７．４９３３　ｐｐｍ　４Ｈ　（オルト位）　Ｒ　＝　ＯＭｅ　６．８３０４　ｐｐｍ４Ｈ　（メタ位）
　重ね合わせたスペクトル結果をみると、無置換のものとメトキシ置換されているもので、化学シフトが大きく変化していることが確認できる。この結果より、チオフェノール誘導体ジスルフィドリンカーは、芳香環上の置換基によるＳ原子上の電子密度の制御、ならびにＧＳＨとの反応性の制御が可能であることが示唆された。
　（比較例１）
　（ベンジルチオール誘導体モデル化合物の置換基効果：プロトンＮＭＲ測定）
　薬剤・輸送モジュールと縮合させたベンジルチオール誘導体は、様々な置換基を有する誘導体が安価で市販されているイソフタル酸から、単純な官能基変換反応によって、合成可能であると考えた。芳香環上の置換基による制御が行えれば、リンカー化合物として有用であると考え、初期的検討を行うこととした。一般に、ベンジル位の置換基の反応において、芳香環上の置換基による電子密度の制御が可能なことは知られていない。そこで、モデル化合物を用いて、ベンジルチオール誘導体の置換基効果を、以下の式（１０）及び式（１１）に示した化合物で比較を行うこととした。式（１０）のベンジルチオール、及び式（１０）の化合物のＲ　＝　Ｈのうち２か所を置換基ＯＭｅで置換した式（１１）の化合物を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　ＮＭＲ測定を試験例１と同様に行った。ＣＤＣｌ３中のプロトンＮＭＲのスペクトル結果の比較を図３に示す。
　図３の結果について、ベンジル位の　２Ｈ　を置換基（Ｒ　＝　Ｈ，　ＯＭｅ）で比較すると、
　Ｒ　＝　Ｈ　３．５９８　ｐｐｍ
　Ｒ　＝　ＯＭｅ　３．５９０　ｐｐｍ
　と有意な差を確認することはできなかった。この結果より、ベンジルチオール誘導体を用いた、芳香環の置換基効果によるＧＳＨとの反応性の制御可能なジスルフィドリンカー化合物の合理的設計は困難であると判断した。そこで、試験例１のように、リンカー候補化合物を、より直接芳香環にＳ原子が結合しているチオフェノール誘導体を選択し、各種検討を行うこととした。
　（試験例２）
　（ＵＶ　スペクトルを用いた還元開裂反応の検討）
　上記ＮＭＲの結果より、置換基によるＳ原子の電子密度の制御が期待できたため、実際にチオフェノール型ジスルフィドリンカーの還元的開裂反応の検討を行なった。まずは、簡便に検討可能なＵＶスペクトルを用いて、モデル反応として、有機溶媒ＴＨＦ中におけるチオフェノール誘導体モデル化合物（式（２）の化合物）の還元剤ＬｉＢＨ４との反応を行ない（式（１２））、擬一次反応速度の検討を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　ＴＨＦは、和光純薬株式会社、製品コード２０７－１７７６５、超脱水、安定剤不含のものを使用し、セルは１０ｍｍ×１０ｍｍのものを使用した。無置換のモデル化合物、式（２）化合物の酸化型（ジスルフィド）の還元反応をセル中で行なった。酸化型の式（２）化合物（４５μＭｉｎ　ＴＨＦ）に対し、過剰量（１１当量）のＬｉＢＨ４を用いて反応を行なった。ＬｉＢＨ４はＴＨＦ　２Ｍ溶液として市販されているものを薄めて調整し、反応に使用した。反応進行に伴うＵＶスペクトル変化を図４に示す。また、図４の縦軸の吸収１．０～１．５、横軸の波長２１６～２２８ｎｍを拡大したグラフを図５に示す。
　上記スペクトル結果は、等吸収点を示すことから、モデル酸化型ジスルフィドが、還元型の開裂体へと二状態変化で反応進行していることが明らかとなった。２４２ｎｍの吸収強度の変化を時間に対してプロットした結果を図６に示す。上記プロットより、擬一次反応速度定数を、ｋ＝１．９７×１０－２と算出することができた。
　この結果より、化合物のＵＶスペクトル変化より擬一次反応速度定数を求めることができ、化合物の構造による還元的開裂反応の影響の検証に役立てることができることが示された。
　（試験例３）
　（ＮＭＲを用いたチオフェノールモデル化合物とＧＳＨの反応の検討）
　ＧＳＨ　とジスルフィドの交換反応は広く研究されている。その交換反応を考える上で重要になるのが平衡定数である。ＧＳＨは、ＧＳＨ自身にも還元型ＧＳＨ・酸化型ＧＳ－ＳＧとの平衡があり、またリンカーとなるジスルフィドにも、その酸化体との平衡反応が存在する。そのため、各種化学種の濃度比を決定し、平衡定数を求めることが、リンカージスルフィドとＧＳＨの反応性を考える指標となる。電気化学的な測定により酸化還元電位を求める手法や、ＮＭＲ測定により各化学種の濃度比を求める手法など、様々な方法で調べられている。
　本研究では、ＮＭＲを用いて各種濃度条件混合系における、ジスルフィド結合の安定性の検討を行なった。試験例２より、ＵＶによって反応の追跡も可能であるが、複雑系についてはＮＭＲの方がより追跡を行えるため、以下はＮＭＲ測定を用いた。
　前記した置換基（－ＣＯＯＨ）を持つ式（６）、式（７）、及び式（８）の化合物を、それぞれ、ＡｒＳＳｒＡ（Ｈ），ＡｒＳＳｒＡ（Ｆ），ＡｒＳＳｒＡ（ＮＯ２）と表記する。
　ＮＭＲによってチオフェノール誘導体のＧＳＨによる還元的開裂反応の追跡を行うには、系内に存在する化合物のピークの区別を行い、系内化合物存在比を明確に導出し、詳細な検討を行う必要がある。そこで、図７に示す還元型ＧＳＨ（図中の式（１３）），図８に示す酸化型ＧＳＳＧ（図中の式（１４））のそれぞれの化合物のＮＭＲスペクトルの測定を行なった。
　それぞれの化合物のＮＭＲスペクトルを図７、図８に示す。なお、図７においてａに示すピークは、アミドの２Ｈで、水消し（事前飽和法：ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）測定により積分値が下がっているものである。
　図７及び図８のＮＭＲスペクトルを比較すると、ＧＳＨ，ＧＳＳＧで明確な違いがあることが分かる。特に顕著な違いはＳ原子の根元の番号７のプロトンの化学シフトである。ＧＳＨの番号７のプロトンは２．１４４ｐｐｍにあるのに対し、ＧＳＳＧの番号７のプロトンは３．２９２，２．９５６ｐｐｍと二つのピークに分かれている。化学シフトの違いは、Ｓ原子がＳＨ，ＳＳの状態による電子密度の差異の違いで、ＧＳＳＧの番号７のピークが分かれているのは、Ｓ原子がジスルフィドになり、Ｓ原子周りが立体的に混み合い回転しなくなったためであると考えている。ＧＳＨ，ＧＳＳＧのピークに違いがあることが分かったため、ＧＳＨ，ＧＳＳＧ混合系においてそれぞれの化合物比を積分値により算出できると考えた。
　次に、図９に還元型ＡｒＳＨ（図中の式（１５））のＮＭＲスペクトル、酸化型　ＡｒＳＳｒＡ（式（７））のＮＭＲスペクトルを図１０に示す。
　図９、１０のそれぞれのスペクトルを比較すると、式（１５）のＡｒＳＨが一部式（７）のＡｒＳＳｒＡに酸化されていることが分かる。そのため、実際に混合系において還元開裂反応を検討する際には、アルゴン置換し、酸素ができるだけ入らないように行うこととした。また図９よりＧＳＨ，ＧＳＳＧの系と同様に、式（１５）のＡｒＳＨ、式（７）のＡｒＳＳｒＡのピークに違いがあることが分かったため、ピークの積分値比較により、混合系におけるそれぞれの化合物比を積分値により算出できると考えた。
　（試験例４）
　（混合系における還元開裂反応の検討）
　ＡｒＳＳｒＡ（Ｈ）とＧＳＨ（左辺）、ＡｒＳＨ（Ｈ）とＧＳ－ＳＧ（右辺）の平行関係を式（１６）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　ＮＭＲスペクトルの測定条件としては、５０　ｍＭ　リン酸緩衝液中で、式（７）のＡｒＳＳｒＡ（Ｈ）に対して、式（１３）のＧＳＨを加え、ＡｒＳＳｒＡ（Ｈ）　／　ＧＳＨ　＝　４．４　ｍＭ　／　４．５　ｍＭ　の溶液を調整し、ＮＭＲによる測定を行なった。二重管（株式会社ＳＨＩＧＥＭＩ　型式ＳＰ－４０５）を使用し、外側にＴＭＳ含有のＣＤＣｌ３　溶液（ＬＯＣＫ溶媒）を入れてＮＭＲチューブを調整した。
　ＮＭＲ　測定においては、Ｃａｓｉ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ．　２０１２，　１６１，　１２１，　４２２－４２８などを参考にし、水消し（事前飽和法：ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）測定で行なった。
　ＮＭＲチューブを調整してから２５分後の全体のＮＭＲスペクトルを図１１に示す。
　次に、先ほど示した２５分後の混合系スペクトルの各化合物の帰属、詳細な解析のため、混合系において先ほど示した反応式より存在すると考えられる以下の化学種、式（１５）のＡｒＳＨ（Ｈ）、式（７）のＡｒＳＳｒＡ（Ｈ）、式（１３）のＧＳＨ、式（１４）のＧＳ－ＳＧのＮＭＲスペクトルとの比較の全体図を図１２、およそ２～４ｐｐｍの一部拡大図を図１３、およそ７．２～８．４ｐｐｍの一部拡大図を図１４に示した。なお、図１２～１４においては、化学式の添えられていない一番下のスペクトルが混合系のスペクトルとなっている。
　投入した初期濃度、得られたスペクトルの積分値の比較より、それぞれの化合物の存在比を導出することができ、下記の式（１７）のヘテロジスルフィド（以下（Ｈ）ＡｒＳ－ＳＧとも表記する）が中間体として系内に存在していることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　得られたスペクトルの積分値の比較により、調整後２５分後、１００分後、１日後の各化合物の存在比率が以下の表１に示すようになっていることが分かった。（初期濃度ＡｒＳＳｒＡ（Ｈ）　／　ＧＳＨ　＝　４．４　ｍＭ／　４．５　ｍＭ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　上の表より、還元型ＧＳＨの量は時間とともに、消費され減少しているのに対し、酸化型ＧＳ－ＳＧの量は大きく変化せず、ヘテロジスルフィド（Ｈ）ＡｒＳ－ＳＧが増加していくことがわかる。また、切断され生じるＡｒＳＨ（Ｈ）の変化は複雑で、１００分後では、２５分後の２倍になっているのに対し、１日後では、（Ｈ）ＡｒＳ－ＳＧ、ＡｒＳ－ＳｒＡ（Ｈ）へと変化していることが分かる。以上の結果より、ＡｒＳ－ＳｒＡ（Ｈ）はＧＳＨにより確実に開裂されていることが分かったため、ＡｒＳＳｒＡ（Ｈ）をリンカーとするＤＤＳにおける、薬物放出が可能であることが示唆された。
　（試験例５）
　（正常細胞モデル条件下での開裂反応の検討）
　現実的な細胞内薬物濃度を想定したＧＳＨ濃度の細胞モデルに対して、式（７）のＡｒＳ－ＳｒＡ（Ｈ）を投与し、リンカー化合物の開裂反応の検討を行った。
　ＡｒＳ－ＳｒＡ（Ｈ）濃度（２２５μＭ）において、正常細胞のＧＳＨ濃度を４５０μＭと近似し、同様の測定を行なった。ＣＤＣｌ３に含まれるＣＨＣｌ３のピークにより、濃度の薄い芳香族領域のピークが重なってしまうのを防ぐために、二重管の外側はＤ２Ｏで測定を行なった。全体的な化合物の濃度が薄く水のピーク割合が多くなり、化合物のピークとベースラインのピークの区別のため、積算回数をあげて測定した。解析結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　上の表より、正常細胞のモデルＧＳＨ濃度条件下において、ＧＳＨは１日経過後に１８％が残留し、８２％が消費されている一方、リンカーモデルジスルフィドＡｒＳ－ＳｒＡ（Ｈ）は１日経過後に８４％が残留し、１６％程度が開裂するにとどまり、ＡｒＳ－ＳｒＡ（Ｈ）は多くが消費されず残っていることが分かった。
　（試験例６）
　（がん細胞モデル条件下での開裂反応の検討）
　現実的な細胞内薬物濃度を想定した式（７）のＡｒＳ－ＳｒＡ（Ｈ）濃度（２２５μＭ）において、がん細胞のＧＳＨ濃度を２０ｍＭと近似し、同様の測定を行なった。
　ＣＤＣｌ３に含まれるＣＨＣｌ３のピークにより、濃度の薄い芳香族領域のピークが重なってしまうのを防ぐために、二重管の外側はＤ２Ｏで測定を行なった。全体的な化合物の濃度が薄く水のピーク割合が多くなり、化合物のピークとベースラインのピークの区別のため、積算回数をあげて測定した。解析結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　上記の結果より、ＡｒＳ－ＳｒＡ（Ｈ）のうち、１００分経過後に１９％が残留し８２％が開裂、１日経過後には０％が残留し１００％が開裂していることが分かった。
　この結果を試験例５の正常細胞ＧＳＨ濃度での結果と上記結果を比較すると、明確な違いがあり、がん細胞を想定したＧＳＨ濃度では、（Ｈ）ＡｒＳ－ＳＧ，ＡｒＳＳｒＡ（Ｈ）はほとんどＧＳＨにより開裂され、ＡｒＳＨ（Ｈ）へと変換されていることが分かる。以上の結果より、現実的な細胞内薬物濃度のＡｒＳ－ＳｒＡ（Ｈ）において、正常細胞ＧＳＨ　濃度・がん細胞ＧＳＨ濃度に対応して開裂するリンカーとして期待できることが分かった。
　（試験例７）
　（Ｆ置換体の還元的開裂反応の検討）
　次に、下記の式（１８）内に示すＡｒＳＳｒＡ（Ｆ）を用い、試験例５と同様の条件において、前記ＡｒＳＳｒＡ（Ｈ）と同様に開裂反応が起こるかを検討した。解析結果を表４に示す。表４のとおり、ＡｒＳＳｒＡ（Ｆ）は１日経過後に４割程度が開裂せずに残っていることが分かった。
もＡｒＳＳｒＡ（Ｈ）と同様に開裂することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　（試験例８）
　（ＮＯ２置換体の還元的開裂反応の検討）
　また、下記の式（１９）内に示すＡｒＳＳｒＡ（ＮＯ２）を用い、試験例５と同様の条件において、前記ＡｒＳＳｒＡ（Ｈ）と同様に開裂反応が起こるかを検討した。解析結果を表５に示す。表５のとおり、ＡｒＳＳｒＡ（ＮＯ２）は１日経過後に３割程度が開裂せずに残っていることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　（試験例９）
　（ＧＳＨによる還元的開裂反応：別のＧＳＨ濃度、置換基による影響）
　ＡｒＳＳｒＡ（Ｆ）、ＡｒＳＳｒＡ（NO2）について、試験例６と同様の試験を行い、正常細胞モデル及びがん細胞モデルにおけるそれぞれの開裂反応を調べた。ＡｒＳＳｒＡ（F）ＡｒＳＳｒＡ（NO2）の結果を表６、表７にそれぞれ示す。表６～表７が示すとおり、ＡｒＳＳｒＡ（Ｆ）、ＡｒＳＳｒＡ（NO2）はいずれも１００分経過後に約９割、１日経過後にはすべてが開裂していることが分かり、正常細胞ＧＳＨ濃度・がん細胞ＧＳＨ濃度に対応して開裂するリンカーとして期待できることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　（試験例１０）
　（がん細胞特徴的細胞質環境での選択的薬物放出）
　本実施形態のリンカー化合物による開裂が、がん細胞の条件において特異的に起こるかを、培養細胞を用いて試験した。
　まず、式（１）のリンカーの２つのＲに、それぞれＦＡＭ（式（２０））と、Ｄｂｓ（式（２１））－Ａｒｇ８を結合させたＡｒｇ８－Ｄｂｓ－リンカー－ＦＡＭ化合物を準備した（式（２２））。
　Ａｒｇ８は細胞膜透過ペプチド（アルギニンリンカー）として働き、結合した化合物を細胞質内に取り込ませる作用を有する。
　ＦＡＭ及びＤｂｓはそれぞれ蛍光によって発色するが、ＦＡＭ－Ｄｂｓが結合した化合物はほとんど発色することがない。これにより、リンカー化合物が開裂した場合、ＦＡＭとＤＢＳが分離して発光するので、細胞内での分布を検出することができる。
　したがって、Ａｒｇ８－Ｄｂｓ－リンカー－ＦＡＭ化合物の蛍光発光を調べることで、該化合物が細胞質内に取り込まれたか、細胞内で開裂したか、及びその開裂した化合物の細胞内での分布を検出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　図１５に、各種細胞をＡｒｇ８－Ｄｂｓ－リンカー－ＦＡＭ化合物（式（２２））（２５μＭ）と共にＦ－１２（－）状態で３０分間インキュベートし、蛍光発色を共焦点顕微鏡で観察した図を示す。各種細胞は、それぞれＨｅＬａ（ヒト子宮頚部上皮癌細胞）、ＨＴ－１０８０（ヒト繊維芽肉腫細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓癌細胞）、ＣＨＯ－Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣由来細胞）である。
　いずれも細胞内での強い蛍光発色が見られ、細胞膜透過ペプチド（アルギニンリンカー）によって該化合物が各細胞内に取り込まれたことを示している。また、蛍光発色が強いことは、式（２２）の化合物からＤｂｓとＦＡＭが分断されている、すなわち、リンカー化合物のジスルフィド結合が切断されていることが確認できた。
　この結果により、本実施形態のリンカー化合物で結合された化合物を、細胞膜透過ペプチドにより細胞内に導入し、かつ、グルタチオン濃度が一定以上のがん細胞内でのみリンカー化合物を切断することができることが示された。
　本発明のリンカー化合物及びそれを含む複合体化合物によれば、分子設計によってジスルフィド結合が解離するグルタチオン濃度を設計でき、がん細胞を的確に識別することができ、標的細胞外では安定かつ標的細胞では効果的な薬剤化合物の放出を行うことができる。そのため、抗体薬物複合体を用いた抗体医薬、その他の複合体を用いた医薬に広く応用し、副作用の少ないがん治療に役立てることができる。

Claims (12)

  1. 　薬剤化合物を含む複合体化合物に用いられるリンカー化合物であって、
    　下記式（１）で現される構造を有する、リンカー化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ水素、炭素、酸素、窒素若しくはハロゲン元素を含む化合物基又はその誘導体である。）
  2. 　前記式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれハロゲン元素、炭化水素基、酸化物基又は窒化物基である、請求項１に記載のリンカー化合物。
  3. 　前記式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれハロゲン元素、メチル基、ｔ－ブチル基、メトキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、シアノ基又はジメチルアミノ基である、請求項１又は２に記載のリンカー化合物。
  4. 　前記式（１）において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれニトロ基、フッ素又はカルボキシル基である、請求項１から３のいずれか１項に記載のリンカー化合物。
  5. 　前記式（１）において、前記Ｓ－Ｓ結合がグルタチオン濃度１０～２００ｍＭにおいて開裂するよう構成されてなる、請求項１から４のいずれか１項に記載のリンカー化合物。
  6. 　前記複合体化合物が、前記薬剤化合物と薬剤化合物輸送ペプチドとが前記リンカー化合物を介して複合した抗体薬剤複合体化合物である、請求項１から５のいずれか１項に記載のリンカー化合物。
  7. 　前記薬剤化合物輸送ペプチドが、抗体、細胞膜透過ペプチドからなる群から選択される、請求項６に記載のリンカー化合物。
  8. 　請求項１から７のいずれか１項のリンカー化合物を含む複合体化合物。
  9. 　前記薬剤化合物と抗体とが前記リンカー化合物を介して複合した抗体薬剤複合体化合物である、請求項８に記載の複合体化合物。
  10. 　前記薬剤化合物がアポトーシス融合ペプチドである、請求項８又は９に記載の複合体化合物。
  11. 　前記薬剤化合物が核酸である、請求項８から１０のいずれか１項に記載の複合体化合物。
  12. 　がん細胞に対して用いられる、請求項８から１１のいずれか１項に記載の複合体化合物。
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