WO2023027098A1 - 抗ｂ型肝炎ウイルス剤及びその使用 - Google Patents

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WO2023027098A1
WO2023027098A1 PCT/JP2022/031848 JP2022031848W WO2023027098A1 WO 2023027098 A1 WO2023027098 A1 WO 2023027098A1 JP 2022031848 W JP2022031848 W JP 2022031848W WO 2023027098 A1 WO2023027098 A1 WO 2023027098A1
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hepatitis
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剛生 須田
直哉 坂本
恵 木村
美樹 百瀬
勝実 前仲
聡子 乙黒
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国立大学法人北海道大学
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-hepatitis B virus agent containing a substance that suppresses the expression or activity of hypoxia-inducible factor-prolyl hydroxylase (HIF-PH), and uses thereof. .
  • HIF-PH hypoxia-inducible factor-prolyl hydroxylase
  • Hepatitis B virus is an enveloped virus with incomplete double-stranded DNA belonging to the Hepadnaviridae family. also cause. It is said that there are 200 to 400 million infected people in the whole world, and one million people die from HBV-related liver diseases every year.
  • cccDNA covalently closed circular DNA
  • HBV replication is carried out by reverse transcription of the viral DNA polymerase using the pregenome RNA synthesized by the host cell's RNA polymerase as a template. The frequency of treatment-resistant strains is high.
  • nucleic acid analogue preparations such as entecavir and tenofovir, and interferon (IFN) preparations.
  • Nucleic acid analogues inhibit reverse transcription of pregenome RNA to DNA by specifically inhibiting HBV DNA polymerase.
  • HBV DNA polymerase a DNA polymerase that has problems such as limited cccDNA-suppressing effect, long-term administration, lack of appropriate discontinuation criteria, easy emergence of resistant virus, and renal failure.
  • IFN preparations have the advantage of exhibiting a cccDNA suppressive effect, a long-term HBs antigen lowering effect, and a fixed treatment period, but there are few patients who show a remarkable effect of IFN, that is, IFN non-responsiveness. is at issue.
  • HBV protein X HBx
  • P2Ac protein phosphatase 2A suppressor
  • SOCS3 cytokine signaling 3
  • anti-hepatitis B virus agents based on mechanisms of action different from these.
  • the purpose of the present invention is to provide an anti-HBV agent that has new characteristics not found in conventional anti-HBV agents.
  • the present inventors found that a substance that suppresses HIF-PH expression or inhibits activity can improve IFN responsiveness, and completed the following invention.
  • Section 1 An anti-hepatitis B virus agent containing a substance that suppresses the expression or activity of hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase (HIF-PH).
  • Section 2. Item 1, wherein the substance is at least one compound selected from the group consisting of daprodustat, enarodustat, moridustat, roxadustat, vadadustat, and pharmaceutically acceptable salts thereof. The agent described in .
  • Item 3 A pharmaceutical composition for treating or preventing a disease caused by hepatitis B virus infection, containing a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH.
  • Section 4. Item 4.
  • the pharmaceutical composition according to Item 3 wherein the disease caused by hepatitis B virus infection is hepatitis, cirrhosis or liver cancer.
  • Item 5. The pharmaceutical composition according to Item 3 or 4, for use in a subject who has been previously treated with an interferon preparation and has not responded to said treatment.
  • Item 6. Item 6.
  • Item 8 A medicine for treatment or prevention of diseases caused by hepatitis B virus infection, comprising a combination of a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH and an interferon preparation.
  • Item 9. Item 9. The pharmaceutical according to Item 8, wherein the disease caused by hepatitis B virus infection is hepatitis, liver cirrhosis, or liver cancer.
  • Item 10. The medicament according to Item 8 or 9, for use in a subject who has been previously treated with an interferon preparation and has not responded to said treatment.
  • Item 8 wherein the substance is at least one compound selected from the group consisting of daprodustat, enarodustat, moridustat, roxadustat and vadadustat, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the medicament according to any one of -10.
  • Item 12. An agent for improving the responsiveness of hepatitis B virus-infected persons to interferon preparations, containing a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH.
  • Item 13 Item 13.
  • Item 12 wherein said substance is at least one compound selected from the group consisting of daprodustat, enarodustat, moridustat, roxadustat and vadadustat, and pharmaceutically acceptable salts thereof. Or the agent according to 13.
  • Item 15 A method for evaluating the anti-hepatitis B virus activity of a test substance or the responsiveness-improving activity to interferon preparations, using HIF-PH expression-suppressing activity or enzymatic activity-inhibiting activity as an index.
  • new anti-HBV agents and pharmaceutical compositions are provided, which make it possible to treat or prevent diseases caused by HBV infection, especially in IFN-refractory patients.
  • HepG2.2.15.7-ISRE-Luc cells that constitutively express HBV with a luciferase gene integrated downstream of the IFN response element were treated with IFN ⁇ and Daprodustat at a final concentration of 50 ⁇ M (also denoted as Dap in the figure).
  • Enarodustat also represented as Ena in the figure
  • Molidustat also represented as Mol or Moli in the figure
  • Roxadustat also represented as Rox in the figure
  • vadadustat 1 is a graph showing luciferase activity when cultured in a medium supplemented with (Vadadustat, also represented as Vad in the figure).
  • 7-ISRE-Luc cells are graphed to show luciferase activity when cultured in medium supplemented with IFN ⁇ and 1.25 ⁇ M, 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M, 10 ⁇ M or 20 ⁇ M molydustat at final concentrations.
  • HBV-infected primary hepatocytes PXB cells
  • a medium supplemented with daprodustat, enarodustat, moridustat, roxadustat or vadadustat at a final concentration of 2.5 ⁇ M
  • 5 ⁇ M or 10 ⁇ M 1 is a graph showing the amount of HBs antigen in the culture supernatant of , relative to the amount of HBs antigen in a control to which each compound was not added.
  • Culture supernatant of HBV-infected PXB cells cultured in medium containing 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M or 10 ⁇ M final concentration of daprodustat, enarodustat, moridustat, roxadustat or vadadustat is a graph showing the amount of HBV-DNA in each compound expressed relative to the amount of HBV-DNA in a control to which no compound was added.
  • Intracellular HBV when HBV-infected PXB cells were cultured in medium supplemented with daprodustat, enarodustat, moridustat, roxadustat or vadadustat at final concentrations of 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M or 10 ⁇ M 1 is a graph showing the amount of RNA (genotype C) relative to the amount of intracellular HBV-RNA (genotype C) in a control to which no compound was added.
  • HIF-PH HIF-PH is an enzyme that hydroxylates the proline residues of hypoxia-inducible factor (HIF). HIF-PH is responsible for sensing oxygen concentration, and under normal oxygen concentration hydroxylates HIF, leading to ubiquitination and proteasomal degradation. However, under hypoxia, the enzymatic activity of HIF-PH is decreased, resulting in inhibition of HIF degradation and increased abundance of HIF. Since HIF is a protein involved in the production of erythropoietin, an increase in the amount of HIF due to decreased HIF-PH activity under hypoxic conditions induces erythropoietin production and promotes erythrocyte hematopoiesis.
  • HIF hypoxia-inducible factor
  • Human HIF-PH has three isoenzymes: HIF-PH1 (Egl nine homolog (EGLN) 2), HIF-PH2 (EGLN1) and HIF-PH3 (EGLN3).
  • the nucleotide sequence of the human HIF-PH1 gene has been registered as NC_000019.10 in the NCBI Reference Sequence, the nucleotide sequences of the mRNA as NM_017555.1, NM_053046.4 and NM_080732.4, and the amino acid sequences as NP_444274.1 and NP_542770.2.
  • Nucleotide sequence of human HIF-PH2 gene is NCBI Reference Sequence as NC_000001.11
  • mRNA nucleotide sequence is NM_001377260.1, NM_001377261.1 and NM_022051.3
  • amino acid sequence is NP_001364189.1, NP_001364190.1 and NP_071334.1 registered as.
  • the nucleotide sequence of the human HIF-PH3 gene has been registered as NC_000014.9 in the NCBI Reference Sequence, the nucleotide sequences of the mRNA as NM_001308103.2 and NM_022073.4, and the amino acid sequences as NP_001295032.1 and NP_071356.1 (both Retrieved July 12, 2021).
  • the substances that suppress the expression of HIF-PH used in the present invention are any substances that have the ability to suppress the expression of HIF-PH at the gene or protein level.
  • a substance that suppresses HIF-PH expression is a nucleic acid that suppresses HIF-PH expression.
  • the nucleic acid that suppresses the expression of HIF-PH includes a nucleic acid that can suppress transcription of mRNA from the HIF-PH gene (HIF-PH mRNA), a nucleic acid that can degrade HIF-PH mRNA, and a nucleic acid that can degrade HIF-PH mRNA.
  • nucleic acids capable of suppressing protein translation from mRNA examples of which can be designed and produced by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of HIF-PH gene or HIF-PH mRNA.
  • antisense nucleic acids, or nucleic acids that cause RNA interference such as siRNA, shRNA or miRNA.
  • nucleic acids with enhanced stability against degradation by nucleases are also included in the nucleic acids that suppress HIF-PH expression according to the present invention, as nucleic acids that are functionally equivalent to antisense nucleic acids or nucleic acids that cause RNA interference.
  • Modifications for improving stability against nuclease degradation include 2'O-methylation, 2'-F, 4'-thiolation, and the like.
  • chimeric RNAs in which part of the ribonucleotides of the RNA that suppresses HIF-PH expression is replaced with corresponding deoxyribonucleotides or nucleotide analogues are also included in nucleic acids that suppress HIF-PH expression.
  • Nucleotide analogs include, for example, 5-position modified uridine or cytidine, such as 5-(2-amino)propyluridine, 5-bromouridine, etc.; 8-position modified adenosine or guanosine, such as 8-bromoguanosine; deaza nucleotides, Examples include 7-deaza-adenosine and the like; O- or N-alkylated nucleotides such as N6-methyladenosine and the like. There are no particular restrictions on the type or number of modified or substituted bases, as long as they do not lose the ability to suppress the expression of the target molecule.
  • a nucleic acid that suppresses the expression of HIF-PH can be artificially synthesized using genetic recombination technology or chemical synthesis technology. Genetic recombination methods, methods for chemically synthesizing nucleic acids, methods for synthesizing unnatural bases, and methods for synthesizing nucleic acids containing these are well known to those skilled in the art.
  • the substance that inhibits HIF-PH activity used in the present invention is any substance that has the ability to inhibit the enzymatic activity of HIF-PH.
  • a substance that inhibits HIF-PH activity is a specific antibody against HIF-PH or a derivative thereof.
  • a specific antibody to HIF-PH can also be referred to as an antibody that preferentially binds HIF-PH over non-target proteins or an antibody that has a higher binding affinity for HIF-PH.
  • a specific antibody against HIF-PH has an affinity that is at least 5-fold stronger, preferably at least 10-fold stronger, more preferably at least 100-fold stronger, most preferably at least 1000-fold stronger than binding to a non-target protein.
  • -It can be an antibody that binds to PH.
  • a specific antibody against HIF-PH may also be an antibody that binds HIF-PH with a dissociation constant of 10 ⁇ 7 M, preferably 10 ⁇ 8 M, more preferably 10 ⁇ 9 M.
  • a specific antibody against HIF-PH can originate from any species including, for example, mouse, rat, shark, rabbit, pig, hamster, camel, llama, goat or human.
  • the specific antibody can also be of any class (eg IgG, IgE, IgM, IgD or IgA) and subclass of immunoglobulin molecule, but is preferably IgG.
  • the specific antibody against HIF-PH may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • a specific antibody can also be a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • a derivative of a specific antibody against HIF-PH is an antigen-binding fragment defined as a partial fragment of an antibody derived from a specific antibody against HIF-PH that retains the ability to specifically bind to an antigen, such as Fab (fragment of antigen binding), Fab', F(ab')2, single chain antibodies (single chain Fv), disulfide stabilized antibodies (disulfide stabilized Fv) and peptides containing CDRs, etc., but are not limited to these.
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab' fragment of antigen binding
  • F(ab')2 single chain antibodies
  • disulfide stabilized antibodies disulfide stabilized Fv
  • peptides containing CDRs etc.
  • Specific antibodies against HIF-PH and derivatives thereof can be produced using methods known to those skilled in the art. For example, by preparing HIF-PH by a genetic recombination method based on the amino acid sequence of human HIF-PH or the base sequence of the DNA encoding it, and immunizing a suitable animal with this as an antigen, the animal's B They can be produced by fusing the cells with myeloma cells to obtain hybridomas. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164 Please refer to Etc.
  • a specific antibody against HIF-PH or a derivative thereof may be an antibody-drug conjugate further conjugated with another drug.
  • HIF-PH inhibitors are used in the treatment of renal anemia as agents that induce erythropoietin production by inhibiting HIF degradation to increase HIF abundance in the same way as under hypoxic conditions. HIF-PH inhibitors are also called HIF stabilizers.
  • HIF-PH inhibitors that can be used in the present invention may be any substance that can inhibit the hydroxylating activity of HIF on proline residues, and examples thereof include daprodustat, enarodustat, and moridustat. , roxadustat and vadadustat.
  • HIF-PH inhibitors that can be used in the present invention include quinoline-8-carboxamide derivatives described in WO2009/070644, benzimidazole compounds described in WO2009/134750, and WO2010/025087.
  • a HIF-PH inhibitor may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt such as an acid addition salt or a base addition salt, as long as it has the ability to inhibit the enzymatic activity of HIF-PH.
  • Acid addition salts include, for example, inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate and phosphate, citrate, oxalate, acetate, formate, Examples include organic acid salts such as propionate, benzoate, trifluoroacetate, maleate, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate, and paratoluenesulfonate.
  • base addition salts include inorganic base salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts and ammonium salts, and organic base salts such as triethylammonium salts, triethanolammonium salts, pyridinium salts and diisopropylammonium salts.
  • organic base salts such as triethylammonium salts, triethanolammonium salts, pyridinium salts and diisopropylammonium salts.
  • amino acid salts of basic or acidic amino acids such as arginine, aspartic acid, glutamic acid and the like are included.
  • Preferred pharmaceutically acceptable salts include hydrochloride, potassium salt, sodium salt and the like.
  • HIF-PH inhibitors may also be in the form of hydrates or solvates.
  • Anti-HBV agents The substances that inhibit the expression of HIF-PH and the substances that inhibit the activity of HIF-PH described above have the effect of suppressing HBV proliferation (anti-HBV effect), and therefore can be used as anti-HBV agents. can.
  • the present invention provides an anti-HBV agent containing a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH.
  • An anti-HBV agent is a drug that has the effect of suppressing the proliferation of HBV (anti-HBV effect).
  • Anti-HBV activity is achieved by suppressing the production of HBV-RNA and HBV proteins (HBc, HBs, HBx, HBe, etc.) in cells or liver using HBV constitutively expressing cells, HBV-infected cells, or HBV-infected animals, Suppression of extracellular or blood secretion of infectious particles and HBs antigens, reduction of intracellular or intrahepatic cccDNA, development of diseases caused by HBV infection in infected animals, and the like can be used as indicators for confirmation.
  • HBV-RNA and HBV proteins HBc, HBs, HBx, HBe, etc.
  • anti-HBV agents include at least one substance that suppresses the expression or inhibits the activity of HIF-PH.
  • the anti-HBV agent comprises one or more substances that suppress the expression of HIF-PH.
  • the anti-HBV agent comprises one or more substances that inhibit the activity of HIF-PH.
  • the anti-HBV agent comprises one or more substances that suppress HIF-PH expression and one or more substances that inhibit HIF-PH activity.
  • the anti-HBV agent is a pharmaceutical composition containing a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH and a pharmaceutically acceptable component for the treatment or prevention of diseases caused by HBV infection. It can be in the form of an object.
  • An anti-HBV agent in the form of a pharmaceutical composition can also be expressed as an anti-HBV pharmaceutical composition containing a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH and a pharmaceutically acceptable component.
  • Pharmaceutically acceptable components contained in the pharmaceutical composition include drugs other than substances that inhibit the expression or activity of HIF-PH, buffers, antioxidants, preservatives, proteins, hydrophilic polymers, Amino acids, chelating agents, nonionic surfactants, excipients, stabilizers, carriers and the like can be mentioned.
  • Pharmaceutically acceptable ingredients are well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected and used by those skilled in the art within the scope of their ordinary ability.
  • compositions can be in any form, but oral formulations (tablets, capsules, powders, granules, fine granules, pills, suspensions, emulsions, liquids, syrups, etc.) and parenteral formulations (injections , drops, external preparations, etc.) can be mentioned as preferred examples.
  • the pharmaceutical composition is administered to a subject infected with HBV, particularly to a subject who is likely to develop/or has developed a disease caused by HBV infection.
  • Diseases caused by HBV infection include acute hepatitis B, acute liver failure, chronic hepatitis B, cirrhosis of the liver B, and liver cancer that progresses from hepatitis B.
  • the subject is preferably human.
  • a pharmaceutical composition can treat or prevent a disease caused by HBV infection by being administered to a subject who needs treatment or is likely to develop the disease.
  • treatment includes all types of medically acceptable therapeutic interventions aimed at curing or temporarily relieving disease.
  • prevention also includes all types of medically acceptable prophylactic interventions aimed at preventing or suppressing the acquisition or development of disease.
  • the treatment or prevention of diseases caused by HBV infection includes various purposes including delaying or halting progression of diseases caused by HBV infection, regression or disappearance of lesions, prevention of onset or prevention of recurrence, etc. include medically acceptable interventions for
  • a pharmaceutical composition contains a substance that suppresses the expression or inhibits the activity of HIF-PH in an amount that is effective for treating or preventing a disease, which is appropriately determined according to the usage, age of the subject, disease state, and other conditions.
  • the administration method of the pharmaceutical composition is not particularly limited, but in the case of a parenteral preparation, examples thereof include intravascular administration (preferably intravenous administration), intraperitoneal administration, enteral administration, subcutaneous administration, and the like.
  • the pharmaceutical composition is applied to the body by oral administration or intravenous administration.
  • the present invention provides a combination pharmaceutical for treating or preventing a disease caused by HBV infection, comprising a combination of a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH and an IFN preparation; A substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH, and a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH, for use in combination with an IFN preparation in a combination drug for the treatment or prevention of a disease
  • An agent for improving the IFN responsiveness of HBV-infected individuals is provided as yet another aspect. Both the pharmaceutical combination and the agent for improving IFN responsiveness herein can be in the form of pharmaceutical compositions.
  • IFN formulations include IFN ⁇ and IFN ⁇ , which have been applied to HBe antigen-positive chronic active hepatitis B, and PEG (Polyethylene glycol)-modified drugs such as Peg-IFN ⁇ -2a and Peg-IFN ⁇ -2b. PEG-IFN can be mentioned.
  • Medical combination means two or more medicaments intended to be administered together or separately, simultaneously or sequentially to a subject in need thereof, i.e. for whom treatment or prevention of disease caused by HBV infection is desired means a combination of
  • the intended modes of administration include the administration of a formulation in which a substance that inhibits the expression or activity of HIF-PH and an IFN formulation are contained in one formulation, or the administration of separately formulated HIF-PH. Administration of a substance that suppresses expression or inhibits activity and an IFN preparation can be mentioned.
  • their administration order and administration time are not particularly limited, and they may be administered at the same time, or may be administered at different times or on different days.
  • IFN preparations may also be used in combination with substances that suppress the expression or activity of HIF-PH in accordance with the aforementioned guidelines and other policies.
  • the amount of each of the substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH and the IFN preparation that are used in combination may be an amount that allows the combination to treat or prevent a disease caused by HBV infection, Generally the amount is equal to or less than when used alone.
  • a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH and an IFN preparation in an amount equivalent to the amount when used alone, a stronger anti-HBV effect is exhibited, and in a shorter period of time, or Diseases caused by HBV infection can be treated or prevented in subjects for whom no effect could be confirmed even when used alone.
  • a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH in the present invention, and a combination of this and an IFN preparation, are administered to a subject with a disease caused by HBV infection.
  • a disease can be treated or prevented. Therefore, the present invention provides an effective amount of a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH, or an effective amount of a combination of HIF-PH for a subject in need of treatment or prevention of a disease caused by HBV infection. It can also be expressed as a prophylactic or therapeutic method for diseases caused by HBV infection, comprising administering a combination of an effective amount of an IFN preparation and a substance that suppresses the expression or activity of HBV.
  • the effective amount of combination means the amount of each of a substance that suppresses the expression or activity of HIF-PH and an IFN preparation that can treat or prevent diseases caused by HBV infection when combined. means.
  • the present invention further provides a method for evaluating the anti-HBV activity of a test substance or the activity of improving responsiveness to IFN preparations, using activity to suppress expression of HIF-PH or activity to inhibit enzyme activity as an index. do.
  • the evaluation method compares the enzymatic activity of HIF-PH in the presence and absence of the test substance to determine the anti-HBV activity of the test substance or the activity of improving responsiveness to IFN preparations. Including judging. Substances determined to have HIF-PH inhibitory activity in this method can be evaluated as having anti-HBV activity.
  • the comparison of HIF-PH enzymatic activity in the presence and absence of the test substance is carried out using the method employed in the evaluation or screening of the inhibitory action of daprodustat and other known HIF inhibitors. be able to.
  • the evaluation method compares the promoter activity of the HIF-PH gene in the presence and absence of the test substance, thereby improving the anti-HBV activity of the test substance or the responsiveness to IFN preparations. including determining activity.
  • a test substance is added to a cell containing a nucleic acid having a marker gene under the control of a promoter region that controls the expression of the HIF-PH gene, and under conditions in which the expression of the marker gene is induced by the promoter the step of incubating; the step of measuring the intensity of the marker gene-derived signal in the cells; the step of comparing the measured intensity of the marker gene-derived signal with the intensity of the marker gene-derived signal in the absence of the test substance; A step of determining a test substance that reduces the intensity of the derived signal as having anti-HBV activity may be included.
  • the promoter region of the HIF-PH gene for example, a region containing a TATA box located 3.5 kb upstream of the start codon of the PHD2 gene present at human locus 1q42.1 or CpG located 0.5 kb upstream of the start codon Regions containing HIF-binding motifs within the island (Metzen E., et al., Biochem J. 2005 May 1; 387(Pt 3): 711-717) and the like can be used.
  • the marker gene is not particularly limited as long as the expression induction of the gene can be detected, for example, a gene encoding a fluorescent protein such as GFP or a chemiluminescent protein such as luciferase, or a drug resistance gene or auxotrophy of cells Genes that confer a phenotypic change on cells, such as genes that can complement , can be used.
  • a cell containing a nucleic acid having a marker gene under the control of the promoter region of the HIF-PH gene can be obtained, for example, by combining the base sequence of the open reading frame region of HIF-PH in a cell originally having the HIF-PH gene with the marker gene. It can be produced by recombination with the encoding base sequence. Also, based on the human genome nucleotide sequence information, construct an expression vector containing the promoter region of the human HIF-PH gene and a marker gene recombined under its control, and prepare by introducing the expression vector into an appropriate cell. You can also
  • Incubation can be performed by coexisting the cells and the test substance in a medium or buffer solution in an appropriate container. Conditions such as incubation temperature and time may be conditions that allow the cell to express the marker gene. In addition, marker gene-derived signals can be measured by a method suitable for the marker gene used.
  • the evaluation method compares HIF-PH gene expression or HIF-PH protein expression in the presence and absence of the test substance, respectively, to determine the anti-HBV activity of the test substance, or the IFN preparation.
  • determining responsiveness-improving activity to This method comprises, for example, incubating a test substance with cells capable of expressing the HIF-PH gene or protein; measuring the intensity of the HIF-PH gene or protein-derived signal in said cells after incubation; comparing the intensity of the HIF-PH gene or protein-derived signal obtained by the method with the intensity of the HIF-PH gene or protein-derived signal in the absence of the test substance; and reducing the intensity of the HIF-PH gene or protein-derived signal.
  • a step of determining the test substance to have anti-HBV activity may be included.
  • Cells capable of expressing the HIF-PH gene or protein preferably express the human HIF-PH gene or protein, and for example, cultured cell lines incorporating the human HIF-PH gene can be used.
  • Incubation can be performed by coexisting the cells and the test substance in a medium or buffer solution in an appropriate container.
  • Conditions such as incubation temperature and time may be conditions that allow the cells to express the HIF-PH gene or protein.
  • Measurement of HIF-PH gene-derived signal is a general method that can detect and quantify specific gene expression, such as hybridization using base sequence information of HIF-PH gene, quantitative PCR, RNA-Seq, etc. can be done by In addition, measurement of signals derived from HIF-PH proteins can be performed by ELISA using specific antibodies against HIF-PH, immunological detection methods such as Western blotting, and other general methods that can detect and quantify specific protein expression. method.
  • test substance that reduces the intensity of HIF-PH gene- or protein-derived signals in cells incubated with the test substance compared to cells not incubated with the test substance under conditions that induce HIF-PH expression, It can be determined to have anti-HBV activity.
  • siRNA capable of knocking down the expression of HBx protein in these cells was confirmed to increase luciferase activity.
  • Substances that increase luciferase activity in HepG2.2.15.7-ISRE-Luc cells can be obtained by reducing HBV protein production in HBV-infected cells or by IFN refractory-related factors (SOCS3, PP2A, etc.) induced by HBV protein. ) is thought to have the effect of improving IFN responsiveness by reducing the expression or activity of Substances that reduce luciferase activity in these cells are thought to exacerbate IFN responsiveness and have cytotoxic effects.
  • HepG2.2.15.7-ISRE-Luc cells 10% FBS (Sigma), penicillin-streptomycin solution (Wako), 360 ⁇ g/ml G418 sulfate (Wako) and 2.6 ⁇ g/ml puromycin
  • HepG2.2.15.7-ISRE-Luc cells were suspended in DMEM (High Glucose) (Nacalai) medium containing Dihydrochloride, Thermo) at 2.5 ⁇ 10 5 cells/mL.
  • wells containing DMSO at the same concentration (1%) as the culture solution containing the test compound were prepared and used as a control. After culturing for 8 hours, all the culture medium was removed from the wells, and after washing three times with 100 ⁇ L of PBS (gibco), the plate was cryopreserved at -30°C.
  • PXB cells Human primary hepatocytes
  • the purchased PXB cells were cultured for 3 to 4 days after the culture medium was changed immediately after arrival, and then HBV was inoculated according to the supplier's protocol. The day after inoculation, the medium was changed, and the next day, the medium was changed to medium containing the test compound at a final concentration of 2.5, 5.0 or 10.0 ⁇ M. Five days after the addition of the test compound, each culture supernatant was collected, diluted 10-fold and stored at -30°C, and then HBs antigen and HBV DNA in the culture supernatant were measured.
  • HBs antigen in culture supernatant was measured by chemiluminescence immunoassay using Architect HBsAg-QT assay (Abbott Laboratories, lower limit of detection sensitivity 0.05 IU/mL). Measurements were outsourced to SRL.
  • HBV DNA in the culture supernatant was measured using Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HBV test, v2.0 (Roche Diagnostics, detection sensitivity range 20-170,000,000 IU/mL, 2.1-9.0 log10 copies/mL). ) was measured by real-time PCR. Measurements were outsourced to SRL.
  • Genotype C HBV-infected PXB cells were seeded on a collagen-coated 12-well plate (Iwaki) at a density of 2 x 105 cells/well. The next day, the medium was replaced with a medium containing drugs at final concentrations of 2.5, 5.0, and 10.0 ⁇ M, and cultured in a CO 2 incubator for 72 hours. Similarly, wells to which DMSO was added at the same concentration as the culture medium to which the drug was added were prepared and used as a control. Seventy-two hours after drug addition, cells were collected and RNA was extracted using RNeasy (registered trademark) Mini Kit (QIAGEN). The procedure followed the instruction manual attached to the kit.
  • RNeasy registered trademark
  • Mini Kit QIAGEN
  • Example 1 Screening HepG2.2.15.7-ISRE-Luc cells were used to screen 3,200 compounds contained in the compound/drug library held by Hokkaido University, and compounds that increased the luciferase activity of the cells were screened. Furthermore, as a result of conducting an anti-HBV efficacy evaluation test by measuring the amount of HBs antigen in the culture supernatant using HepG2.2.15.7 cells, the HIF-PH inhibitors molydustat, daprodustat, and enarodustat were tested. Stat, roxadustat and vadadustat were selected as anti-HBV agents. Reporter assay results for these compounds are shown in FIGS. An increase in luciferase activity was observed with any of the compounds, and in particular, an increase in luciferase activity was confirmed with moridustat even at a lower concentration.
  • FIG. 3 shows the measurement results of HBs antigen and HBV-DNA in the culture supernatant.
  • moridustat, daprodustat, enarodustat, and roxadustat decreased HBs antigen secretion and HBV-DNA levels in HepG2.2.15.7 cells
  • vadadustat decreased HepG2.2.15. It was confirmed that the amount of HBV-DNA in 7 cells was reduced.
  • SEQ ID NO: 1 base sequence of siRNA (sense strand) targeting HBx gene
  • SEQ ID NO: 2 base sequence of siRNA (antisense strand) targeting HBx gene

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Abstract

本発明は、低酸素誘導因子プロリン水酸化酵素（HIF-PH）の発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含有する抗HBV剤；HBV感染に起因する疾患の治療又は予防のための医薬組成物；前記物質とインターフェロン製剤とを組み合わせてなるHBV感染に起因する疾患の治療又は予防のための医薬；HBV感染者のインターフェロン製剤への応答性を改善するための剤；並びにHIF-PHの発現を抑制する活性又は酵素活性を阻害する活性を指標とした、被験物質の抗HBV活性、又はインターフェロン製剤への応答性改善活性を評価する方法を提供する。

Description

抗Ｂ型肝炎ウイルス剤及びその使用
　本発明は、低酸素誘導因子プロリン水酸化酵素（hypoxia-inducible factor-prolyl hydroxylase、HIF-PH）の発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含有する抗B型肝炎ウイルス剤、及びその使用に関する。
　B型肝炎ウイルス（HBV）は、ヘパドナウイルス（Hepadnaviridae）科に属する不完全2本鎖DNAを有するエンベロープウイルスであり、急性及び慢性の肝炎（B型肝炎）を誘発する他、肝がんの原因ともなる。全世界では、2～4億人の感染者が存在し、年間100万人がHBVと関連した肝疾患により死亡しているとされている。
　HBVが肝細胞内に侵入すると、エンベロープからヌクレオチドキャプシドが放出され、細胞核に移行する。感染肝細胞の核内に移行したHBVゲノムはcccDNA（covalently closed circular DNA）に変換され、その形で長期にわたって存在し続ける。cccDNAは一過性の不顕性感染や既往感染者のウイルス複製源となり、再活性化の原因となる。また、HBVの複製は、宿主細胞のRNA polymeraseを利用して合成されるpregenome RNAを鋳型としたウイルスのDNA polymeraseの逆転写により行われるため、通常のDNAウイルスと比較して変異が生じ易く、治療耐性株の発生頻度が高い。
　現在知られているB型肝炎の治療薬は、エンテカビルやテノホビル等の核酸アナログ製剤と、インターフェロン（IFN）製剤とにほぼ限定されている。核酸アナログ製剤は、HBVのDNA polymeraseを特異的に阻害することによりpregenome RNAからDNAへの逆転写を抑制する。しかしながら、cccDNA抑制効果が限定的である、長期の投与が必要である、適切な中止基準がない、耐性ウイルスが出現し易い、腎障害が発生するといった問題を有する。
　またIFN製剤は、cccDNAの抑制効果及び長期でのHBs抗原の低下作用を示すこと、処置期間が一定であることといった利点があるが、IFNが著効を示す患者が少ないこと、すなわちIFN不応答が問題とされている。IFN不応性の原因について、HBVのProtein X（HBx）がprotein phosphatase 2A suppressor（PP2Ac）及びsuppressor of cytokine signaling 3（SOCS3）の発現上昇を介してIFN不応性に関与することが報告されている（非特許文献１）。また、HBVポリメラーゼやHBVコアタンパク質がIFNのシグナル伝達を阻害することが報告されている（非特許文献２、３）。
　従来の核酸アナログ製剤及びIFN製剤には上記のような問題があることから、これらとは異なる作用機序に基づく抗B型肝炎ウイルス剤（抗HBV剤）が求められている。
Tsunematsu S., et al., 2017, J. Medical. Virol., 89, 267-275 Chen J.et al., 2013, Hepatology, 57, 470-482 Rosmorduc O, et al., 1999, J. Gen. Virol., 80, 1253-1262
　本発明は、従来の抗HBV剤にはない新たな特徴を有する抗HBV剤の提供を目的とする。
　本発明者らは、HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質が、IFN応答性を改善し得ることを見いだし、以下の発明を完成させた。
項１．　低酸素誘導因子プロリン水酸化酵素（HIF-PH）の発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含有する、抗B型肝炎ウイルス剤。
項２．　前記物質が、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタット並びに薬学的に許容されるそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、項１に記載の剤。
項３．　HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含有する、B型肝炎ウイルスの感染に起因する疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
項４．　B型肝炎ウイルスの感染に起因する疾患が、肝炎、肝硬変又は肝臓がんである、項３に記載の医薬組成物。
項５．　インターフェロン製剤での前治療歴があり、当該治療が奏功しなかった対象に対して用いるための、項３又は４に記載の医薬組成物。
項６．　B型肝炎ウイルスの感染に起因する疾患の治療又は予防が、インターフェロン製剤の使用を含むものである、項３～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項７．　前記物質が、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタット並びに薬学的に許容されるそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、項３～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項８．　HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質とインターフェロン製剤とを組み合わせてなる、B型肝炎ウイルスの感染に起因する疾患の治療又は予防のための医薬。
項９．　B型肝炎ウイルスの感染に起因する疾患が、肝炎、肝硬変又は肝臓がんである、項８に記載の医薬。
項１０．　インターフェロン製剤での前治療歴があり、当該治療が奏功しなかった対象に対して用いるための、項８又は９に記載の医薬。
項１１．　前記物質が、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタット並びに薬学的に許容されるそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、項８～１０のいずれか一項に記載の医薬。
項１２．　HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含有する、B型肝炎ウイルス感染者のインターフェロン製剤への応答性を改善するための剤。
項１３．　インターフェロン製剤での前治療歴があり、当該治療が奏功しなかった対象に対して用いるための、項１２に記載の剤。
項１４．　前記物質が、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタット並びに薬学的に許容されるそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、項１２又は１３に記載の剤。
項１５．　HIF-PHの発現を抑制する活性又は酵素活性を阻害する活性を指標とした、被験物質の抗B型肝炎ウイルス活性、又はインターフェロン製剤への応答性改善活性を評価する方法。
　本発明によれば、新たな抗HBV剤及び医薬組成物が提供され、これによって特にIFN不応性の患者においてHBVの感染に起因する疾患を治療又は予防することが可能になる。
IFN応答配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ、HBVを恒常的に高発現するHepG2.2.15.7-ISRE-Luc細胞を、IFNα及び最終濃度50μMのダプロデュスタット（Daprodustat、図中でDapとも表す）、エナロデュスタット（Enarodustat、図中でEnaとも表す）、モリデュスタット（Molidustat、図中でMol又はMoliとも表す）、ロキサデュスタット（Roxadustat、図中でRoxとも表す）又はバダデュスタット（Vadadustat、図中でVadとも表す）を加えた培地で培養したときのルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 HepG2.2.15.7-ISRE-Luc細胞を、IFNα及び最終濃度1.25μM、2.5μM、5μM、10μM又は20μMのモリデュスタットを加えた培地で培養したときのルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 HepG2.2.15.7細胞を最終濃度2.5μM、5μM又は10μMのダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット又はバダデュスタットを加えた培地で培養したときの、培養上清中のB型肝炎ウイルスs抗原（HBs抗原）量及びHBV-DNA量を、各化合物を添加しないコントロール（図中のDMSO）のHBs抗原量及びHBV-DNA量に対する相対値で表したグラフである。ETVは陽性対照とした抗HBV剤のエンテカビルである。 HBVを感染させた初代肝細胞（PXB細胞）を最終濃度2.5μM、5μM又は10μMのダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット又はバダデュスタットを加えた培地で培養したときの培養上清中のHBs抗原量を、各化合物を添加しないコントロールのHBs抗原量に対する相対値で表したグラフである。 HBVを感染させたPXB細胞を最終濃度2.5μM、5μM又は10μMのダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット又はバダデュスタットを加えた培地で培養したときの培養上清中のHBV-DNA量を、各化合物を添加しないコントロールのHBV-DNA量に対する相対値で表した示すグラフである。 HBVを感染させたPXB細胞を最終濃度2.5μM、5μM又は10μMのダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット又はバダデュスタットを加えた培地で培養したときの細胞内HBV-RNA（genotype C）量を、各化合物を添加しないコントロールの細胞内HBV-RNA（genotype C）量に対する相対値で表したグラフである。
　以下に示す本発明の説明は、代表的な実施形態又は具体例に基づくことがあるが、本発明はそのような実施形態又は具体例に限定されるものではない。また、本発明に関連して言及するタンパク質及び遺伝子に関する説明は、特に断らない限り、ヒト由来のタンパク質及び遺伝子を例として行うが、本発明において利用されるタンパク質及び遺伝子はヒト由来のものに限定されず、また本発明の適用対象はヒトに限定されない。
HIF-PH
　HIF-PHは、低酸素誘導因子（hypoxia-inducible factor；HIF）のプロリン残基をヒドロキシ化する酵素である。HIF-PHは酸素濃度を検知する役割を担っており、通常の酸素濃度下ではHIFをヒドロキシル化してユビキチン化とプロテアソームによる分解に至らせる。しかしながら、低酸素濃度下ではHIF-PHの酵素活性は低下し、その結果HIFの分解が抑制されてHIFの存在量は増加する。HIFはエリスロポエチンの産生に関与するタンパク質であることから、低酸素濃度下でのHIF-PH活性低下によるHIF量の増加はエリスロポエチン産生を誘導し、赤血球の造血促進をもたらす。
　ヒトのHIF-PHには、HIF-PH1（Egl nine homolog (EGLN) 2）、HIF-PH2（EGLN1）及びHIF-PH3（EGLN3）の３つのアイソザイムが存在する。ヒトHIF-PH1遺伝子の塩基配列はNCBI Reference SequenceにNC_000019.10として、mRNAの塩基配列はNM_017555.1、NM_053046.4及びNM_080732.4として、アミノ酸配列はNP_444274.1及びNP_542770.2として登録されている。ヒトHIF-PH2遺伝子の塩基配列はNCBI Reference SequenceにNC_000001.11として、mRNAの塩基配列はNM_001377260.1、NM_001377261.1及びNM_022051.3として、アミノ酸配列はNP_001364189.1、NP_001364190.1及びNP_071334.1として登録されている。ヒトHIF-PH3遺伝子の塩基配列はNCBI Reference SequenceにNC_000014.9として、mRNAの塩基配列はNM_001308103.2及びNM_022073.4として、アミノ酸配列はNP_001295032.1及びNP_071356.1として登録されている（いずれも2021年7月12日検索）。
HIF-PHの発現を抑制する物質
　本発明において用いられるHIF-PHの発現を抑制する物質は、HIF-PHの遺伝子又はタンパク質レベルでの発現を抑制する能力を有する任意の物質である。HIF-PHの発現を抑制する物質の１つの例は、HIF-PHの発現を抑制する核酸である。HIF-PHの発現を抑制する核酸は、HIF-PH遺伝子からのmRNA（HIF-PH mRNA）の転写を抑制することができる核酸、HIF-PH mRNAを分解することができる核酸、及びHIF-PH mRNAからのタンパク質翻訳を抑制することができる核酸を包含し、これらの例としては、HIF-PH遺伝子の塩基配列又はHIF-PH mRNAの塩基配列を基にして当業者が設計、作製することができる、アンチセンス核酸、又はRNA干渉を引き起こす核酸、例えばsiRNA、shRNA若しくはmiRNAを挙げることができる。
　また、適当な発現プロモーターの制御下に置かれることでアンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸を転写誘導することのできるDNA、及びアンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸の塩基配列の一部が修飾されてヌクレアーゼによる分解に対する安定性が高められた核酸も、アンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸と機能的に等価な核酸として、本発明にいうHIF-PHの発現を抑制する核酸に包含される。ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させるための修飾としては、2'O-メチル化、2'-F化、4'-チオ化等を挙げることができる。
　さらに、HIF-PHの発現を抑制するRNAのリボヌクレオチドの一部が、対応するデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に置き換えられたキメラRNAもまた、HIF-PHの発現を抑制する核酸に包含される。ヌクレオチド類似体としては、例えば、5位修飾ウリジン又はシチジン、例えば5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-ブロモウリジン等；8位修飾アデノシン又はグアノシン、例えば8-ブロモグアノシン等；デアザヌクレオチド、例えば7-デアザ-アデノシン等；O-又はN-アルキル化ヌクレオチド、例えばN6-メチルアデノシン等を挙げることができる。修飾される又は置換される塩基の種類又は個数は、ターゲット分子の発現を抑制する能力を失わない限り、特に制限はない。
　HIF-PHの発現を抑制する核酸は、遺伝子組み換え技術又は化学合成技術を利用して人工的に合成することができる。遺伝子組み換え方法、核酸の化学合成方法、また非天然型の塩基の合成手法又はこれを含む核酸の合成手法は、当業者に周知である。
HIF-PHの活性を阻害する物質
　本発明において用いられるHIF-PHの活性を阻害する物質は、HIF-PHの酵素活性を阻害する能力を有する任意の物質である。HIF-PHの活性を阻害する物質の１つの例は、HIF-PHに対する特異抗体又はその誘導体である。HIF-PHに対する特異抗体は、非標的タンパク質よりもHIF-PHに優先的に結合する抗体、又はHIF-PHに高い結合親和性を有する抗体と表すこともできる。HIF-PHに対する特異抗体は、非標的タンパク質との結合よりも少なくとも5倍強い、好ましくは少なくとも10倍強い、より好ましくは少なくとも100倍強い、最も好ましくは少なくとも1000倍強い親和性を有してHIF-PHに結合する抗体であり得る。HIF-PHに対する特異抗体はまた、10-7M、好ましくは10-8M、より好ましくは10-9Mの解離定数を有してHIF-PHに結合する抗体であってもよい。
　HIF-PHに対する特異抗体は、例えばマウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを包含する任意の種を起源とすることができる。また特異抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例としてIgG、IgE、IgM、IgD又はIgA）及びサブクラスのものであることができるが、IgGであることが好ましい。
　本発明において、HIF-PHに対する特異抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。また特異抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であり得る。
　HIF-PHに対する特異抗体の誘導体は、HIF-PHに対する特異抗体に由来する、抗原と特異的に結合する能力を保持した抗体の部分断片として定義される抗原結合性断片、例えばFab（fragment of antigen binding）、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体（single chain Fv)、ジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv）及びCDRを含むペプチド等であり得るが、これらには限定されない。
　HIF-PHに対する特異抗体及びその誘導体は、当業者に公知の方法を用いて作製することができる。例えば、ヒトHIF-PHのアミノ酸配列又はこれをコードするDNAの塩基配列に基づいて遺伝子組み換え手法によりHIF-PHを作製し、これを抗原として適当な動物に免疫することで、さらに当該動物のB細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得ることで作製することができる。ハイブリドーマ法については、例えばMeyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Kaithamana et al. (1999) J.Immunol. 163:5157-5164等を参照されたい。HIF-PHに対する特異抗体又はその誘導体は、さらに他の薬物と結合した抗体薬物複合体であってもよい。
　HIFの活性を阻害する物質の別の例は、HIF-PHの酵素活性を阻害する能力を有する物質、すなわちHIF-PHに対する阻害剤である。HIF-PHに対する阻害剤は、HIFの分解抑制を介して低酸素濃度下と同様にHIF存在量を増加させ、エリスロポエチン産生を誘導する薬剤として腎性貧血の治療に用いられている。HIF-PH阻害剤はHIF安定化剤（HIF stabilizer）とも呼ばれている。
　本発明において利用可能なHIF-PH阻害剤は、HIFのプロリン残基に対するヒドロキシ化活性を阻害することができる物質であればよく、その例としては、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタットを挙げることができる。
　また、本発明において利用可能なHIF-PH阻害剤のさらなる例として、WO2009/070644に記載されているキノリン-8-カルボキサミド誘導体、WO2009/134750に記載されているベンゾイミダゾール化合物、WO2010/025087に記載されているピリミジンジオンN-置換グリシン誘導体、WO2011/007856に記載されているトリアゾロピリジン化合物、WO2014/030716に記載されているピラゾロピリミジン化合物、WO2015/180585に記載されている置換アセチドラジド誘導体、WO2016/034108に記載されているキノリノン化合物、WO2016/155357に記載されている5-ヒドロキシ-1，7-ナフチリジン化合物、WO2018/205928に開示されているインドリジン誘導体等を挙げることもできるが、これらには限定されるものではない。
　HIF-PH阻害剤は、HIF-PHの酵素活性を阻害する能力を有するかぎり、酸付加塩又は塩基付加塩といった薬学的に許容される塩の形態であってもよい。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられる。さらに、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の塩基性あるいは酸性アミノ酸といったアミノ酸塩が挙げられる。薬学的に許容される好ましい塩としては、例えば塩酸塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。また、HIF-PH阻害剤は、水和物又は溶媒和物の形態であってもよい。
　本発明において好ましいHIF-PH阻害剤は、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタット、並びに薬学的に許容されるそれらの塩である。好ましいHIF-PH阻害剤の例を以下に示す。
ダプロデュスタット：N -[(1,3-ジシクロヘキシルヘキサヒドロ-2,4,6-トリオキソピリミジン-5-イル)カルボニル]グリシン
エナロデュスタット：N-[7-ヒドロキシ-5-(2-フェニルエチル)[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-8-カルボニル]グリシン
モリデュスタットナトリウム：1-[6-(モルホリン-4-イル)ピリミジン-4-イル]-4-(1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-1H-ピラゾール-5-オラート一ナトリウム
ロキサデュスタット：N-[(4-ヒドロキシ-1-メチル-7-フェノキシイソキノリン-3-イル)カルボニル]グリシン
バダデュスタット：[5-(3-クロロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボキシアミド]酢酸
抗HBV剤
　上述のHIF-PHの発現を抑制する物質及びHIF-PHの活性を阻害する物質はHBVの増殖を抑制する作用（抗HBV作用）を有することから、抗HBV剤として利用することができる。本発明は、HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含有する、抗HBV剤を提供する。
　抗HBV剤は、HBVの増殖を抑制する作用（抗HBV作用）を有する薬剤である。抗HBV作用は、HBV恒常的発現細胞若しくはHBV感染細胞、又はHBV感染動物を用いて、細胞内又は肝臓内でのHBV-RNA及びHBVタンパク質（HBc、HBs、HBx、HBe等）の産生抑制、細胞外又は血中への感染性粒子及びHBs抗原の分泌抑制、細胞内又は肝臓内のcccDNAの減少、感染動物におけるHBV感染に起因する疾患の発症等を指標として確認することができる。
　本発明において、抗HBV剤は、少なくとも1種のHIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含む。１つの実施形態において、抗HBV剤は、1又は複数種のHIF-PHの発現を抑制する物質を含む。別の実施形態において、抗HBV剤は、1又は複数種のHIF-PHの活性を阻害する物質を含む。さらに別の実施形態において、抗HBV剤は、1又は複数種のHIF-PHの発現を抑制する物質及び1又は複数種のHIF-PHの活性を阻害する物質を含む。
医薬組成物
　抗HBV剤は、HBVの感染に起因する疾患の治療又は予防のための、HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質と薬学的に許容される成分とを含む医薬組成物の形態であり得る。医薬組成物形態の抗HBV剤は、HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質と薬学的に許容される成分とを含む抗HBV用医薬組成物と表すこともできる。
　医薬組成物に含まれる薬学的に許容される成分としては、HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質以外の薬物、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、キレート化剤、非イオン性界面活性剤、賦形剤、安定化剤、担体等を挙げることができる。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で適宜選択して使用することができる。
　医薬組成物の形態は任意であるが、経口剤（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤等）及び非経口製剤（注射剤、点滴剤、外用剤等）の形態を好ましい例として挙げることができる。
　医薬組成物は、HBVに感染した対象、特にHBVの感染に起因する疾患を発症するおそれのある／又は発症した対象に投与される。HBVの感染に起因する疾患としては、B型急性肝炎、急性肝不全、B型慢性肝炎、B型肝硬変、B型肝炎から移行する肝臓がん等を挙げることができる。対象は好ましくはヒトである。
　医薬組成物は、HBVの感染に起因する疾患の治療を必要とする又はその発症のおそれのある対象に投与されることで、当該疾患を治療又は予防することが可能である。本明細書において用いられる用語「治療」は、疾患の治癒又は一時的寛解を目的とする医学的に許容される全てのタイプの治療的介入を包含する。また用語「予防」は、疾患の罹患又は発症の防止又は抑制を目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的介入を包含する。すなわち、HBVの感染に起因する疾患の治療又は予防とは、HBVの感染に起因する疾患の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　医薬組成物は、用法、対象の年齢、疾患の状態その他の条件に応じて適宜決定される疾患の治療又は予防に有効な量のHIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含む。医薬組成物の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等を挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、医薬組成物は、経口投与又は静脈内投与により生体に適用される。
IFN製剤との組み合わせ使用
　HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質は、IFN応答性を改善し得ることから、従来のIFN療法において使用されるIFN又はペグインターフェロン（PEG-IFN）といったIFN製剤の薬効を期待することが難しいHBV感染者、例えばIFN製剤での前治療歴があり、当該治療が奏功しなかったHBVに感染した対象に対しても、抗HBV用医薬組成物として利用することができる。
　またHIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質は、IFN応答性を改善し得ることから、IFN製剤と組み合わせて使用することにより、IFN製剤の抗HBV作用を増強することができると期待される。したがって、本発明は、HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質とIFN製剤とを組み合わせてなる、HBV感染に起因する疾患の治療又は予防のための組み合わせ医薬；HBV感染に起因する疾患の治療又は予防のための組み合わせ医薬において、IFN製剤と組み合わせて使用するための、HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質；並びにHIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含有する、HBV感染者のIFN応答性を改善するための剤をさらなる別の態様として提供する。ここで組み合わせ医薬及びIFN応答性を改善するための剤はいずれも医薬組成物の形態であり得る。
　IFN製剤としては、従来からHBe抗原陽性のB型慢性活動性肝炎に対して適用されてきたIFNα及びIFNβや、Peg-IFNα-2aやPeg-IFNα-2b等のPEG（Polyethylene glycol）で修飾されたPEG-IFNを挙げることができる。
　「組み合わせ医薬」とは、その必要がある、すなわちHBV感染に起因する疾患の治療又は予防が望まれる対象に、一緒に又は別々に、同時に又は逐次的に投与することを意図した2以上の医薬の組み合わせを意味する。意図される投与の態様としては、HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質とIFN製剤が一つの製剤中に含まれた製剤の投与や、別々に製剤化されたHIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質とIFN製剤の投与を挙げることができる。また、別々に製剤化され投与される場合、それらの投与順序及び投与時期は特に制限されず、同時に投与されてもよく、時間を置いて異なる時間に又は異なる日に投与されても良い。
　IFN製剤の臨床上の使用に関する方針は、例えば日本肝臓学会が発行するB型肝炎治療ガイドライン第3.1版（2019年3月発行）に詳細に説明されている。本発明におけるHIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質との組み合わせ使用においても、IFN製剤の使用については前述のガイドラインその他の方針に従って行えばよい。
　組み合わせて用いられるHIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質とIFN製剤のそれぞれの量は、組み合わせによってHBVの感染に起因する疾患を治療又は予防することができる量であればよく、一般に、単独で用いられる場合の量と同等であるか、又はこれより少ない。単独で用いられる場合の量と同等の量のHIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質とIFN製剤を用いることで、より強力な抗HBV作用が発揮され、より短期間に、又は単独で用いても効果が確認できなかった対象において、HBVの感染に起因する疾患を治療又は予防することができる。
　本発明におけるHIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質、及びこれとIFN製剤との組み合わせは、HBVの感染に起因する疾患を有する対象に投与することで、HBVの感染に起因する疾患を治療又は予防することができる。したがって本発明は、HBVの感染に起因する疾患の治療又は予防を必要とする対象に前述の有効量のHIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質、又は組み合わせ有効量のHIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質と組み合わせ有効量のIFN製剤との組み合わせを投与することを含む、HBVの感染に起因する疾患の予防又は治療方法として表すこともできる。ここで組み合わせ有効量とは、組み合わされたときにHBVの感染に起因する疾患を治療又は予防することができる、HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質、IFN製剤それぞれの量を意味する。
評価方法
　本発明はさらに、HIF-PHの発現を抑制する活性又は酵素活性を阻害する活性を指標とした、被験物質の抗HBV活性、又はIFN製剤への応答性改善活性を評価する方法を提供する。
　ある実施形態において、評価方法は、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるHIF-PHの酵素活性を比較することで、被験物質の抗HBV活性、又はIFN製剤への応答性改善活性を判定することを含む。この方法においてHIF-PH阻害活性があると判定された物質は、抗HBV活性を有すると評価することができる。被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるHIF-PHの酵素活性の比較は、ダプロデュスタットその他の公知のHIF阻害剤の阻害作用の評価又はスクリーニングにおいて採用されている方法を利用して行うことができる。
　別の実施形態において、評価方法は、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるHIF-PH遺伝子のプロモーター活性を比較することで、被験物質の抗HBV活性、又はIFN製剤への応答性改善活性を判定することを含む。この評価方法は、例えば、被験物質を、HIF-PH遺伝子の発現を制御するプロモーター領域の制御下にマーカー遺伝子を有する核酸を含む細胞と共に、当該プロモーターによるマーカー遺伝子の発現が誘導される条件下でインキュベートするステップ；前記細胞におけるマーカー遺伝子由来シグナルの強度を測定するステップ；測定されたマーカー遺伝子由来シグナルの強度を、被験物質非存在下でのマーカー遺伝子由来シグナルの強度と比較するステップ；及びマーカー遺伝子由来シグナルの強度を減少させた被験物質を、抗HBV活性を有すると判定するステップを含み得る。
　HIF-PH遺伝子のプロモーター領域としては、例えば、ヒトの遺伝子座1q42.1に存在するPHD2遺伝子の開始コドンの3.5kb上流に位置するTATA boxを含む領域又は開始コドンの0.5kb上流に位置するCpGアイランド内のHIF結合モチーフを含む領域（Metzen E., et al.,Biochem J. 2005 May 1; 387(Pt 3): 711-717）等を使用することができる。
　マーカー遺伝子は、当該遺伝子の発現誘導を検出し得るものであれば特に制限はなく、例えばGFP等の蛍光タンパク質やルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質をコードする遺伝子、又は薬剤耐性遺伝子や細胞の栄養要求性を補完することができる遺伝子等の細胞にフェノタイプ変化を与える遺伝子等を利用することができる。
　HIF-PH遺伝子のプロモーター領域の制御下にマーカー遺伝子を有する核酸を含む細胞は、例えば、元来HIF-PH遺伝子を有する細胞中のHIF-PHのオープンリーディングフレーム領域の塩基配列を、マーカー遺伝子をコードする塩基配列に組み換えることで作製することができる。また、ヒトゲノム塩基配列情報を元にして、ヒトHIF-PH遺伝子のプロモーター領域とその制御下に組み換えたマーカー遺伝子とを含む発現ベクターを構築し、適当な細胞に当該発現ベクターを導入することで作製することもできる。
　インキュベーションは、適当な容器内の培地又は緩衝液中で、前記細胞と被験物質とを共存させることにより行うことができる。インキュベーションの温度、時間等の条件は、細胞がマーカー遺伝子を発現することができる条件であればよい。また、マーカー遺伝子由来シグナルの測定は、用いられるマーカー遺伝子に適した方法によって行うことができる。
　さらなる実施形態において、評価方法は、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるHIF-PH遺伝子の発現又はHIF-PHタンパク質の発現を比較することで、被験物質の抗HBV活性、又はIFN製剤への応答性改善活性を判定することを含む。この方法は、例えば、被験物質を、HIF-PH遺伝子又はタンパク質を発現することができる細胞と共にインキュベートするステップ；インキュベート後の前記細胞におけるHIF-PH遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を測定するステップ；測定されたHIF-PH遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を被験物質非存在下でのHIF-PH遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度と比較するステップ；及びHIF-PH遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を低減させた被験物質を、抗HBV活性を有すると判定するステップを含み得る。
　HIF-PH遺伝子又はタンパク質を発現することができる細胞は、ヒトのHIF-PH遺伝子又はタンパク質を発現することが好ましく、例えばヒトHIF-PH遺伝子を組み込んだ培養細胞株を用いることができる。
　インキュベーションは、適当な容器内の培地又は緩衝液中で、前記細胞と被験物質とを共存させることにより行うことができる。インキュベーションの温度、時間等の条件は、細胞がHIF-PH遺伝子又はタンパク質を発現することができる条件であればよい。
　HIF-PH遺伝子由来シグナルの測定は、HIF-PH遺伝子の塩基配列情報を利用したハイブリダイゼーション、定量的PCR、RNA-Seqその他の、特定の遺伝子発現を検出し定量することのできる一般的な方法によって行うことができる。また、HIF-PHタンパク質由来シグナルの測定は、HIF-PHに対する特異抗体を用いたELISA、ウェスタンブロッティング等の免疫学的検出法その他の、特定のタンパク質発現を検出し定量することができる一般的な方法によって行うことができる。
　HIF-PHの発現が誘導される条件下で、被験物質とインキュベートしていない細胞と比べて、被験物質とインキュベートした細胞においてHIF-PH遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を低減させた被験物質は、抗HBV活性を有すると判定することができる。
　以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実験材料及び方法
１）HepG2.2.15.7-ISRE-Luc細胞の作製及び培養
　HBVを恒常的に高発現するHepG2.2.15.7細胞（国立感染症研究所から入手）に、IFN応答配列（IFN-stimulated response element、ISRE、（Platanias LC et al, Nat Rev Immunol. 2005;5(5):375-86.））の下流にルシフェラーゼをコードする遺伝子を組み換えたレンチウイルスベクター（ISRE Cignal Lenti Reporter, Qiagen））を導入して、IFNαによってレポータータンパク質としてルシフェラーゼを発現する組換え細胞HepG2.2.15.7-ISRE-Luc細胞を作製した。この細胞にHBxタンパク質の発現をノックダウンすることができるsiRNA（siRNA against HBx; Hokkaido bio system sense strand, 5’-GGUCUUACAUAAGAGGACUdTdT-3’（配列番号１）; anti-sense strand, 5’-AGUCCUCUUAUGUAAGACCdTdT-3’（配列番号２））を導入すると、ルシフェラーゼ活性が増加することを確認した。HepG2.2.15.7-ISRE-Luc細胞においてルシフェラーゼ活性を増加させる物質は、HBV感染細胞内のHBVタンパク質産生を減少させることにより、又はHBVタンパク質により惹起されるIFN不応性関連因子（SOCS3、PP2A等）の発現若しくは活性を減少させることによりIFN応答性を改善する作用を有するものと考えられる。また、同細胞においてルシフェラーゼ活性を減少させる物質は、IFN応答性を増悪する作用や、細胞毒性作用を有するものと考えられる。
２）HepG2.2.15.7-ISRE-Luc細胞を用いた化合物スクリーニング
　10％FBS（Sigma）、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Wako）、360μg/ml G418硫酸塩（Wako）及び2.6μg/mlピューロマイシン（Puromycin Dihydrochloride, Thermo）を含むDMEM（High Glucose）（ナカライ）培地に、HepG2.2.15.7-ISRE-Luc細胞を2.5×10５細胞/mLとなるように懸濁した。96 wellコラーゲンコートディッシュプレート（イワキ）に1ウェルあたり80μLの細胞懸濁液を分注し、37℃で24時間、CO2インキュベーター内で培養した後、500 IU/mLのIFNα（イントロンA、MSD）及び1.25～50μMの試験化合物を含む培養液（10％FBS及びペニシリン－ストレプトマイシンを添加したDMEM）を1ウェルあたり20μL添加した。また、試験化合物を添加した培養液と同じ濃度（1%）のDMSOを添加したウェルを用意し、コントロールとして用いた。8時間培養した後、ウェルから培養液を全て除去し、100μLのPBS（gibco）を用いて３回洗浄した後、プレートごと-30℃で凍結保存した。
　凍結保存した96ウェルプレートに、1ウェルあたり20μLの5倍希釈細胞溶解液（Luciferase Cell Culture Lysis 5x Reagent, Promega）を分注し、室温で10分静置した。得られた細胞溶解液を測定用プレート（Assay Plate, 96 well White, Flat Bottom, CORNING）に分注し、ルシフェラーゼアッセイキット（Luciferase 1000 Assay System Promega）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。サンプルの調製はアッセイキットのプロトコールに従って行い、GloMax（登録商標）-Multi+Detection System with Instinct Software（Promega）を用いて測定した。
３）HepG2.2.15.7細胞を用いた抗HBV薬効評価試験
　試験化合物を10 mMの濃度になるようにDMSO（Wako）に溶解し、ストック溶液とした。培養液（10％FBS及びペニシリン－ストレプトマイシンを含むDMEM培地）に懸濁したHepG2.2.15.7細胞を、1ウェルあたり2×105細胞となるようにコラーゲンコート12ウェルプレート（イワキ）に播種し、培養した。翌日、培養液を、最終濃度2.5、5.0又は10.0μMの試験化合物を含む培養液に交換し、72時間培養した。試験化合物を添加した培養液と同じ濃度（1%）のDMSOを添加したウェルを用意し、コントロールとして用いた。試験化合物添加から72時間後に培養上清を回収して-30℃で凍結保存した後、培養上清中のHBs抗原を測定した。
４）ヒト初代肝細胞（PXB細胞）を用いた抗HBV薬効評価試験
　PXB細胞は、あらかじめ24ウェルプレートに2.1×105細胞/cm2の密度で播種されたものを、株式会社フェニックスバイオから購入した。また、PXB細胞の培養液及びHBV感染源（Genotype C）も、同様に株式会社フェニックスバイオから購入した。
　購入したPXB細胞は、到着後すみやかに培養液を交換して3～4日培養した後、供給会社のプロトコールに従ってHBVの接種を行った。接種翌日に培養液を交換し、その更に翌日に、最終濃度2.5、5.0又は10.0μMの試験化合物を含む培養液に交換した。試験化合物添加から5日後にそれぞれ培養上清を回収し、10倍に希釈して-30℃で保存した後、培養上清中のHBs抗原及びHBV DNAを測定した。
５）培養上清中HBs抗原の測定
　培養上清中HBs抗原は、Architect HBsAg-QT assay（Abbott Laboratories、検出感度下限0.05IU/mL）を用いた化学発光イムノアッセイで測定した。測定は、SRL社に外注した。
６）培養上清中HBV DNAの測定
　培養上清中HBV DNAは、Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HBV test, v2.0（Roche Diagnostics、検出感度範囲20-170,000,000 IU/mL、2.1-9.0 log10 copies/mL）を用いたリアルタイムPCR法で測定した。測定は、SRL社に外注した。
７）細胞内HBV-RNAの測定
　Genotype C HBV 感染PXB細胞を2×105 細胞/ウェルの濃度でコラーゲンコート12穴プレート（イワキ）に播種した。翌日、最終濃度2.5、5.0、10.0μMの薬剤を含む培養液に交換し、CO2インキュベーターにおいて72時間培養した。同様に、薬剤を添加した培養液と同じ濃度のDMSOを添加したウェルを用意してコントロールとした。薬物添加から72時間後、細胞を回収しRNeasy（登録商標）Mini Kit (QIAGEN)を用いて、RNAを抽出した。手順はキットに添付の取扱説明書に従った。抽出したRNAはPrime Script RT Master Mix (TaKaRa)を用いて逆転写しcDNAを合成した。リアルタイムPCRは、Platinum SYBER Green qPCR SuperMix-UDG with ROX（Thermo）を用い、Nishitsuji,. et al. Cancer Sci 2015 Nov;106(11):1616-24に記載されているgenotype C HBV RNAの増幅用プライマーを用いて行った。
実施例１
１）スクリーニング
　北海道大学が保有する化合物・薬物ライブラリーに含まれる化合物3200個に対してHepG2.2.15.7-ISRE-Luc細胞を用いたスクリーニングを行い、同細胞のルシフェラーゼ活性を増加させた化合物を選抜し、さらにHepG2.2.15.7細胞を用いた培養上清中のHBs抗原量測定による抗HBV薬効評価試験を行った結果、HIF-PH阻害剤であるモリデュスタット、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタットが抗HBV剤として選抜された。これらの化合物のレポーターアッセイの結果を図１及び図２に示す。いずれの化合物を用いた場合もルシフェラーゼ活性の増加が観察され、特にモリデュスタットではより低濃度でもルシフェラーゼ活性の増加が確認された。
２）HepG2.2.15.7細胞を用いた抗HBV薬効評価試験
　１）で選抜されたモリデュスタット、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタットについて、HepG2.2.15.7細胞を用いた抗HBV薬効評価試験を行った。培養上清中のHBs抗原及びHBV-DNAの測定結果を図３に示す。本試験では、モリデュスタット、ダプロデュスタット、エナロデュスタット及びロキサデュスタットはHepG2.2.15.7細胞のHBs抗原分泌及びHBV-DNA量を減少させること、並びにバダデュスタットはHepG2.2.15.7細胞のHBV-DNA量を減少させることが確認された。
３）PXB細胞を用いた抗HBV薬効評価試験
　２）の5種の化合物について、ヒト初代肝細胞（PXB細胞）を用いたHBV増殖抑制試験を行った。試験化合物添加から5日後の培養上清中HBs抗原の測定結果を図４に、培養上清中HBV-DNAの測定結果を図５に、細胞内HBV-RNAの測定結果を図６に、それぞれ示す。5種の化合物はいずれも、PXB細胞のHBs抗原量及びHBV-DNA量を減少させることが確認された。また、添加した化合物の種類及び濃度によってばらつきはあるものの、細胞内HBV-RNA量の減少も確認された。
配列番号１　HBx遺伝子を標的とするsiRNA（センス鎖）の塩基配列
配列番号２　HBx遺伝子を標的とするsiRNA（アンチセンス鎖）の塩基配列

Claims (15)

  1. 　低酸素誘導因子プロリン水酸化酵素（HIF-PH）の発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含有する、抗B型肝炎ウイルス剤。
  2. 　前記物質が、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタット並びに薬学的に許容されるそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、請求項１に記載の剤。
  3. 　HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含有する、B型肝炎ウイルスの感染に起因する疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
  4. 　B型肝炎ウイルスの感染に起因する疾患が、肝炎、肝硬変又は肝臓がんである、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 　インターフェロン製剤での前治療歴があり、当該治療が奏功しなかった対象に対して用いるための、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
  6. 　B型肝炎ウイルスの感染に起因する疾患の治療又は予防が、インターフェロン製剤の使用を含むものである、請求項３～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 　前記物質が、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタット並びに薬学的に許容されるそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、請求項３～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 　HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質とインターフェロン製剤とを組み合わせてなる、B型肝炎ウイルスの感染に起因する疾患の治療又は予防のための医薬。
  9. 　B型肝炎ウイルスの感染に起因する疾患が、肝炎、肝硬変又は肝臓がんである、請求項８に記載の医薬。
  10. 　インターフェロン製剤での前治療歴があり、当該治療が奏功しなかった対象に対して用いるための、請求項８又は９に記載の医薬。
  11. 　前記物質が、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタット並びに薬学的に許容されるそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬。
  12. 　HIF-PHの発現を抑制する又は活性を阻害する物質を含有する、B型肝炎ウイルス感染者のインターフェロン製剤への応答性を改善するための剤。
  13. 　インターフェロン製剤での前治療歴があり、当該治療が奏功しなかった対象に対して用いるための、請求項１２に記載の剤。
  14. 　前記物質が、ダプロデュスタット、エナロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット及びバダデュスタット並びに薬学的に許容されるそれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、請求項１２又は１３に記載の剤。
  15. 　HIF-PHの発現を抑制する活性又は酵素活性を阻害する活性を指標とした、被験物質の抗B型肝炎ウイルス活性、又はインターフェロン製剤への応答性改善活性を評価する方法。

     
PCT/JP2022/031848 2021-08-24 2022-08-24 抗ｂ型肝炎ウイルス剤及びその使用 WO2023027098A1 (ja)

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