WO2023020664A1 - Aβ-BINDENDE SUBSTANZEN - Google Patents

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WO2023020664A1
WO2023020664A1 PCT/DE2022/100613 DE2022100613W WO2023020664A1 WO 2023020664 A1 WO2023020664 A1 WO 2023020664A1 DE 2022100613 W DE2022100613 W DE 2022100613W WO 2023020664 A1 WO2023020664 A1 WO 2023020664A1
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amyloid
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PCT/DE2022/100613
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Dieter Willbold
Sarah Schemmert
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Priavoid Gmbh
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein

Definitions

  • the invention relates to a peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7, homologues, fragments and parts thereof, such a peptide for use in the treatment of Alzheimer's disease and the use of such a peptide for the identification, quantitative and/or qualitative determination of amyloid-ß fibrils, amyloid-ß - Oligomers and/or amyloid ß-aggregates.
  • AD Alzheimer's dementia
  • Morbus Alzheimer is an estimated proportion of almost two thirds - which corresponds to about 27 million people - the most common neurodegenerative disease worldwide. It is assigned to a heterogeneous group, which is symptomatically characterized by progressive dementia.
  • amyloid ß protein (Aß) aggregation initiates AD pathology and leads to the characteristic amyloid plaques, tau aggregates and loss of neurons in the brain.
  • a ⁇ monomers are continuously formed in normal metabolism by proteolytic cleavage of the amyloid precursor protein (APP) and are not toxic per se. Only through the formation of a ß-sheet structure and the associated aggregation do the Aß proteins develop into toxic species and finally into fibrils and the characteristic Aß plaques. It is postulated that Aß oligomers are the toxic species responsible for the development and progression of AD. Based on these considerations, the goal of causal treatment should be to prevent the formation of toxic Aß oligomers or to completely eliminate Aß oligomers that are already present.
  • Alzheimer's dementia Alzheimer's dementia
  • Medicines used are at best, they are able to temporarily relieve some symptoms, but cannot slow, let alone halt, the progression of the disease.
  • AD Alzheimer's disease
  • D-enantiomeric peptides have been developed in the past for a possible causal therapy of AD. These include D3 (rprtrlhthrnr), RD2 (ptlhthnrrrrr) and various other peptides.
  • amyloid ⁇ fibrils, amyloid ⁇ oligomers and/or amyloid ß-aggregates can be used, especially if these only occur in small concentrations.
  • a peptide according to claim 1 in particular by a peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 and homologues, fragments and parts thereof.
  • these include the following seven D-enantiomeric peptides
  • the peptides according to SEQ ID NO: 1 to 7 can be used as a possible drug against Alzheimer's dementia due to the specific binding to the amyloid ß-peptide.
  • the object according to the invention is also achieved by a peptide containing homologues, fragments and parts of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 to 7.
  • Amyloid ß-peptide or amyloid ß-protein is preferably understood here to mean the human amyloid ß-peptide, in particular amino acids 1-42, or the amyloid ß-protein, in particular amino acids 1-42.
  • Homologous sequences or “homologs” means in the context of the invention that an amino acid sequence has an identity with one of the above amino acid sequences of the monomers of at least 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%. Preference is given to 80% and 90%. Instead of the term “identity”, the terms “homologous” or “homology” are used interchangeably in the present description.
  • the identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is determined by comparison using the BESTFIT program based on the Algorithm of Smith, TF and Waterman, M.S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) calculated using the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2, and the following parameters for nucleic acids: gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3.
  • Preference is given to the identity between z wei nucleic acid sequences or polypeptide sequences are defined by the identity of the nucleic acid sequence/polypeptide sequence over the entire sequence length in each case, as determined by comparison using the program GAP based on the algorithm of Needleman, SB and Wunsch, CD (J. Mol. Biol. 48: 443-453) by setting the following parameters for amino acids: Gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; and the following parameters for nucleic acids gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3.
  • Two amino acid sequences are identical for the purposes of the present invention if they have the same amino acid sequence.
  • homologues are to be understood as meaning the peptide sequences according to the invention which differ from the specified sequences by up to two or three amino acids.
  • the homology or identity is independent of whether the amino acids are D- or L-amino acids.
  • the homology or identity relates here only to the amino acid sequence.
  • sequences which contain the above-mentioned sequences can also be used as peptides.
  • the peptides according to the invention are also preferably characterized in that an acid amide group (CONH 2 group) or a COH group, COCl group, COBr group, CONH-alkyl radical or a CONH- alkyl-amine residue is present or the peptide is present in cyclized form.
  • the problem of providing a peptide without a negative charge at the C-terminus is additionally achieved in a particularly advantageous manner.
  • This has the advantageous effect that it can bind to the target molecule with higher affinity than a peptide which has a carboxyl group at the free C-terminus.
  • peptides with a free, unmodified carboxyl group have a negative charge at this end.
  • the peptides according to the invention are in the physiological state, in particular at pH 6-8, in particular 6.5-7.5, in particular at pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3 , pH 6.4, pH 6.5 pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9 or pH 8.0 modified in such a way that the C-terminus does not carry a negative charge, but instead is neutral or has one or more positive charges.
  • the peptide is characterized in that an acid amide group is present at the free C-terminus instead of the carboxyl group. Instead of the carboxyl group (-COOH group), an acid amide group (-CONH 2 group) is arranged at the C-terminus.
  • the peptide is particularly advantageously amidated at the free C-terminus and not modified at the free N-terminus.
  • the further object is achieved in a particularly advantageous manner, namely that a peptide is present without excess negative charge, which can bind to the target molecule with greater affinity and is easily obtainable.
  • the following additional groups are present instead of the carboxyl group: COH, COCl, COBr, CONH-alkyl radical, CONH-alkyl-amine radical (positive net charge), etc., without being limited to this, if the technical teaching of the main claim is followed.
  • the affinity of the binding of the peptides modified according to the invention without a negative charge at the C-terminus is therefore higher by 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, especially 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
  • the Ko value as a measure of the binding affinity of a modified peptide to amyloid ß-monomer, is reduced by 1%, 2, 3, 4, 5, compared to a linear binding peptide with a negative charge at the free C-terminus. 6, 7, 8, 9, especially 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,
  • the peptide according to the invention is further preferably characterized in that it contains 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more copies of the sequences with the SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and/or SEQ ID NO: 7.
  • the peptides according to the invention are further preferably characterized in that they consist essentially of D-amino acids.
  • the term "essentially composed of D-enantiomeric amino acids" means that the peptides to be used according to the invention contain at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, preferably 75%, 80%, particularly preferably 85%, 90%, 95%, in particular 96%, 97%, 98%, 99%, 100% are made up of D-enantiomeric amino acids.
  • the peptide according to the invention is further preferably characterized in that it consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7.
  • the peptide according to the invention is also preferably characterized in that the peptide is linked to another substance.
  • the link is a chemical bond as defined in Rompp Chemie Lexikon, 9th edition, volume 1, page 650 et seq., Georg Thieme Verlag Stuttgart, preferably a main valence bond, in particular a covalent bond.
  • the substances are drugs or active ingredients, defined in accordance with the Drugs Act ⁇ 2 or. ⁇ 4 (19), as of September 2012.
  • active substances are therapeutically active substances that are used as medicinally active substances. Anti-inflammatory drugs are preferred.
  • the substances are compounds that enhance the effect of the peptides.
  • Another alternative involves compounds that improve the solubility of the peptides and/or the passage of the blood-brain barrier.
  • the peptides according to the invention have any combination of at least two or more features of the variants, embodiments and/or alternatives described above.
  • the peptide according to the invention is further preferably characterized in that a plurality of peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 are linked to one another covalently or non-covalently.
  • a covalent connection or linkage of the peptide units is present within the meaning of the invention if the peptides are linearly linked head-to-head, tail-to-tail or head-to-tail, with or without linkers or linker groups inserted in between.
  • the peptide according to the invention is further preferably characterized in that a plurality of peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 without a linker, ie linked directly to one another, or are linked to one another with a linker group.
  • a non-covalent linkage within the meaning of the invention is present if the peptides are linked to one another, for example via biotin and streptavidin, in particular streptavidin tetramer.
  • the peptide according to the invention is also preferably characterized in that several peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 are linked to one another in a linear or branched manner.
  • the peptides can be linked to one another in a linear manner, in particular as described above.
  • the peptides are linked to one another in a branched manner to form the peptide according to the invention.
  • a branched peptide can be a dendrimer in which the monomers are linked to one another covalently or non-covalently.
  • the peptides can also be linked to a platform molecule (such as PEG or sugar) to form a branched peptide.
  • a platform molecule such as PEG or sugar
  • the affinity of the binding of the peptides is defined via the dissociation constant (Ko value).
  • the dissociation constant (Ko value) of a peptide according to the invention is advantageously reduced in an advantageous embodiment of the invention. Associated with this are improved properties of the peptides according to the invention, such as higher binding affinity and higher effectiveness of the degradation and/or prevention of the formation of toxic amyloid-ß fibrils, amyloid-ß-oligomers and/or amyloid-ß-aggregates.
  • such peptides are used which are particularly preferably attached to an amyloid ⁇ -monomer with a dissociation constant (Ko value) of at most 500 pM, preferably 250, 100, 50 pM, particularly preferably 25, 10, 1 pM with a dissociation constant (Ko value) of at most 500 nM, 250, 100, 50, particularly preferably 25, 10, 1 nM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 , 5, 4, 3, 2, 1 pM to sub-pM, with any intermediate value.
  • Ko value dissociation constant of at most 500 pM, preferably 250, 100, 50 pM, particularly preferably 25, 10, 1 nM with a dissociation constant (Ko value) of at most 500 nM, 250, 100, 50, particularly preferably 25, 10, 1 nM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 , 5, 4, 3, 2, 1 pM to sub-pM, with any intermediate value.
  • the peptides according to the invention are also preferably characterized in that they can bind to the amyloid ⁇ -peptide with a KD of less than a two-digit pM range ( ⁇ 10 pM), preferably in the nM range ( ⁇ 1 pM).
  • the peptides can be produced, for example, via chemical synthesis or peptide synthesis.
  • Another variant is a peptide according to the invention for inhibiting or preventing the formation of amyloid ⁇ fibrils, amyloid ⁇ oligomers and/or amyloid ⁇ aggregates.
  • Another variant is a peptide according to the invention for the detoxification of amyloid ⁇ fibrils, amyloid ⁇ oligomers and/or amyloid ⁇ aggregates.
  • the peptides of the invention detoxify the amyloid-ß-fibrils, amyloid-ß-oligomers and / or amyloid-ß-aggregates or polymers formed therefrom preferably by not binding to it but binding to amyloid-ß-monomer and by shifting the equilibrium to reduce the Lead amyloid-ß-oligomers or fibrils and thus convert them into non-toxic compounds. Accordingly, the subject matter of the present invention is also a method for detoxification of the amyloid-ß-oligomers, aggregates or fibrils formed therefrom.
  • amyloid ß-oligomers amyloid ß-fibrils and/or amyloid ß-aggregates
  • detoxification of the amyloid ß-oligomers, amyloid ß-fibrils and/or amyloid Beta aggregates can take place in vitro or in vivo.
  • the present invention also relates to a peptide according to any one of the preceding claims for use in the treatment of Alzheimer's dementia (Alzheimer's disease).
  • Another object of the present invention is the use of the peptide according to the invention as a probe for the identification, quantitative and/or qualitative determination of amyloid ⁇ fibrils, amyloid ⁇ oligomers and/or amyloid ⁇ aggregates.
  • Such molecular probes preferably contain the peptide according to the invention and optionally dyes, fluorescent dyes, radioactive isotopes (PET etc.), gadolinium (MRI), as well as alternative substances suitable for imaging the probes and can e.g. B. injected intravenously.
  • the probes can bind to amyloid-ß fibrils, amyloid-ß oligomers and/or amyloid-ß aggregates or plaques.
  • the amyloid ß fibrils, amyloid ß oligomers and/or amyloid ß aggregates or plaques marked in this way can be made visible using imaging methods such as SPECT, PET, CT, MRT, proton MR spectroscopy, etc .
  • the SaS peptides significantly reduce toxic A ⁇ (1-42) oligomers. All SaS peptides significantly eliminate toxic A ⁇ oligomers and convert them to higher molecular weight, non-amyloidogenic precipitates when used at substoichiometric concentrations. Shown are the means ⁇ standard deviation from three independent experiments.
  • the dissociation constants (KD) of the binding of the SaS peptides to A ⁇ (1-42) were determined by means of SPR spectroscopy with a Biacore T200 device.
  • a ⁇ (1-42) was immobilized on a Series S CM-5 sensor chip by amine coupling.
  • the flow cells were activated with 50 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) and 16.1 mM N-ethyl-NL(dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) for 7 min.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • EDC N-ethyl-NL(dimethylaminopropyl)carbodiimide
  • a ⁇ (1-42) was dissolved in 10 mM sodium acetate pH 5 to a final concentration of 50 g/mL and injected via one of the activated flow cells to a final signal of 1700 RU.
  • the ligand and reference flow cells were quenched by injecting 1 M ethanolamine pH 8.5 for 7 min.
  • the peptides were diluted to various concentrations in the running buffer. All samples were injected via the flow cells for 180 s, followed by one Dissociation step of 600 s with running buffer. Regeneration of the sensor chip was achieved by a 45 s injection of 2 M guanidinium hydrochloride (AppliChem, Darmstadt, Germany).
  • the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)-based cell viability assay was performed to determine the cytotoxicity of A ⁇ (1-42) in the presence of the SaS peptides on PC- 12 cells to examine.
  • PC-12 cells (DSMZ, Germany) were cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum, 1% antibiotics (penicillin/streptomycin) and 5% horse serum on collagen A-coated tissue culture flasks. Cells were passaged every three to four days depending on confluency.
  • the MTT test was carried out according to the manufacturer's protocol (CellProliferation Kit I; Roche, Switzerland).
  • PC-12 cells were seeded in transparent, collagen-coated 96-well flat-bottom microtiter plates at a density of 1 ⁇ 10 4 cells in a volume of 100 ⁇ l per well and incubated for 24 h.
  • the peptides were assayed in triplicate in three independent experiments. 51 pM A ⁇ (1-42) was incubated for 4.5 h at 37°C with shaking at 600 rpm.
  • ThT thioflavin T test
  • ThT a benzothiazole dye
  • a ⁇ (1-42) 80 pM was preincubated for 2 h to enrich for A ⁇ oligomers. Then 20 pM of the respective SaS peptide were added to the pre-incubated solution and incubated for a further 30 min. The samples were then placed on a density gradient (5-50% (w/v) iodixanol), followed by an ultracentrifugation step (3 h at 4 C and 259000 g).
  • Fraction 15 contains the dissolved pellet in 6 M guanidine hydrochloride solution.
  • Fractions 1-2 contain A ⁇ monomers
  • fractions 4-6 contain the A ⁇ oligomers of particular interest
  • fractions 11-14 contain high molecular weight (co)precipitates or aggregated A ⁇ (1-42).
  • the A ⁇ (1-42) concentrations of each fraction were determined by analytical RP-HPLC and UV absorbance detection at 214 nm.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7, Homologe, Fragmente und Teile davon, ein solches Peptid zur Verwendung in der Behandlung von Morbus Alzheimer und die Verwendung eines solchen Peptids zur Identifizierung, quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Amyloid-ß-Fibrillen, Amyloid-β-Oligomeren und/oder Amyloid-β-Aggregaten.

Description

Aß-BINDENDE SUBSTANZEN
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7, Homologe, Fragmente und Teile davon, ein solches Peptid zur Verwendung in der Behandlung von Morbus Alzheimer und die Verwendung eines solchen Peptids zur Identifizierung, quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Amyloid-ß-Fibri llen, Amyloid-ß- Oligomeren und/oder Amyloid-ß-Aggregaten.
Die Alzheimer'sche Demenz (AD) bzw. Morbus Alzheimer ist einem geschätzten Anteil von knapp zwei Dritteln - was ca. 27 Millionen Menschen entspricht - die häufigste neurodegenerative Erkrankung weltweit. Sie wird einer heterogenen Gruppe zugeordnet, welche symptomatisch durch eine fortschreitende Demenz gekennzeichnet sind.
Nach aktuellem Kenntnisstand wird vermutet, dass die Aggregation des Amyloid-ß- Proteins (Aß) die AD-Pathologie initiiert und zu den charakteristischen amyloiden Plaques, Tau-Aggregaten und dem Verlust von Neuronen im Gehirn führt. Aß- Monomere werden im normalen Stoffwechsel kontinuierlich durch proteolytische Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP) gebildet und sind per se nicht toxisch. Erst durch die Ausbildung einer ß-Faltblatt-Struktur und einer damit verbundenen Aggregation entwickeln sich die Aß-Proteine zu toxischen Spezies und schließlich zu Fibrillen und den charakteristischen Aß-Plaques. Dabei wird postuliert, dass Aß-Oligomere die toxische Spezies sind, welche für die Entstehung und Progression der AD verantwortlich gemacht wird. Aufgrund dieser Überlegungen sollte es das Ziel einer ursächlichen Behandlung sein, die Bildung toxischer Aß- Oligomere zu verhindern bzw. bereits vorhandene Aß-Oligomere vollständig zu eliminieren.
Zum jetzigen Zeitpunkt existiert kein kausal wirkendes Medikament zur Behandlung der Alzheimer'schen Demenz (Morbus Alzheimer). Eingesetzte Medikamente sind bestenfalls in der Lage, einige Symptome kurzzeitig zu mildern, können aber die Progression der Erkrankung nicht verlangsamen, geschweige denn aufhalten.
Es existieren eine Reihe von Substanzen, von denen postuliert wird, dass diese kausal wirksam sind. Dieser Nachweis konnte bis zum jetzigen Zeitpunkt jedoch nicht oder nur in Teilen (im Tiermodell) erbracht werden. Die meisten klinischen Kandidaten (u.a. viele Antikörper) scheitern in der letzten Phase der klinischen Entwicklung an mangelnder Wirksamkeit. Dies könnte daran liegen, dass die meisten dieser klinischen Kandidaten nicht die korrekte Struktur (Aß-Oligomere) als Ziel haben. Das Ziel einer kausal wirksamen Therapie muss es sein, die höchst toxischen Aß-Oligomere direkt zu eliminieren.
Ein weiteres großes Problem besteht darin, dass es keine adäquate Möglichkeit gibt, die AD vor Ausbruch der Symptomatik zu diagnostizieren. Es ist jedoch bekannt, dass Aß-Oligomere und zeitlich darauffolgend Plaques bis zu 20 Jahre vor dem Auftreten der Symptome im Gehirn der Patienten entstehen und irreversibel Schaden anrichten. Molekulare Sonden, die dem Patienten intravenös injiziert werden und die nach der Passage über die Blut-Hirn-Schranke an Aß-Oligomere und Plaques binden, können mittels bildgebender Methoden sichtbar gemacht werden und somit eine frühere Diagnose der AD ermöglichen.
In der Vergangenheit wurde verschiedene D-enantiomere Peptide für eine mögliche kausale Therapie der AD entwickelt. Zu diesen zählen u.a. D3 (rprtrlhthrnr), RD2 (ptlhthnrrrrr) und verschiedene weitere Peptide.
Es besteht jedoch weiterhin ein Bedarf an neuen Verbindungen (Wirkstoffen), die sehr spezifisch und mit hoher Affinität an Aß -Oligomere binden, und so deren Vermehrung verhindern und diese direkt Zerstörern. Diese Verbindungen sollten keine unerwünschten Nebenwirkungen zeigen, insbesondere keine Immunreaktion hervorrufen. Die Verbindungen sollen außerdem toxische Aß-Oligomere und damit auch die kleinen frei diffundierbaren Oligomere auch in kleinen Konzentrationen erkennen, vollständig vernichten und/oder deren (Prionen-ähnliche) Vermehrung verhindern.
Des Weiteren besteht auch ein Bedarf an neuen Verbindungen, die als Sonden für die Erkennung und Markierung von Amyloid-ß-Fibrillen, Amyloid-ß-Oligomeren und/oder Amyloid-ß-Aggregaten einsetzbar sind, insbesondere, wenn diese erst in kleinen Konzentrationen auftreten.
Diese Aufgabe wurde durch ein Peptid gemäß Anspruch 1, insbesondere durch ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon, umfasst, gelöst.
Diese umfassen insbesondere die folgenden sieben D-enantiomere Peptide
SEQ ID NO 1:
SaSl rkrirlhrhrrr
SEQ ID NO 2:
SaS2 rkrirll rirrr
SEQ ID NO 3:
SaS3 rkrhrhhrhrrr
SEQ ID NO 4:
SaS4 rktirlhrhtrr
SEQ ID NO 5:
SaS5 rkrirlhrhrrr
SEQ ID NO 6:
SaS6 rkrhrlhrhrrr SEQ ID NO 7:
SaS7 rktlrlhrhtrr
Die Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1 bis 7 können durch die spezifische Bindung an das Amyloid-ß-Peptid, als mögliches Medikament gegen die Alzheimer'sche Demenz genutzt werden.
Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe auch durch ein Peptid enthaltend Homologe, Fragmente und Teile der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 1 bis 7.
Unter Amyloid-ß-Peptid bzw. Amyloid-ß-Protein wird hier bevorzugt das humane Amyloid-ß-Peptid, insbesondere die Aminosäuren 1-42, bzw. das Amyloid-ß-Protein, insbesondere die Aminosäuren 1-42, verstanden.
Homologe Sequenzen" oder "Homologe" bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz eine Identität mit einer der oben genannten Aminosäuresequenz der Monomere von mindestens 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% aufweist. Bevorzugt sind hierbei 80% und 90%. Anstelle des Begriffs "Identität" werden in der vorliegenden Beschreibung die Begriffe "homolog" oder "Homologie" gleichbedeutend verwendet. Die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch Vergleich mit Hilfe des Programms BESTFIT basierend auf dem Algorithmus von Smith, T. F. und Waterman, M. S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981) ) berechnet unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und folgender Parameter für Nukleinsäuren: Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen durch die Identität der Nukleinsäuresequenz/Polypeptidequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, wie sie durch Vergleich mit Hilfe des Programms GAP basierend auf dem Algorithmus von Needleman, S. B. und Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren berechnet wird: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3.
Zwei Aminosäuresequenzen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung identisch, wenn sie dieselbe Aminosäuresequenz besitzen.
Unter Homologe sind in einer Variante die erfindungsgemäßen Peptidsequenzen zu verstehen, die sich von den angegebenen Sequenzen um bis zu zwei oder drei Aminosäuren unterscheiden.
In einer Ausführungsform ist die Homologie bzw. die Identität unabhängig davon, ob es sich um D- oder L-Aminosäuren handelt. Die Homologie bzw. die Identität bezieht sich hier nur auf die Aminosäuresequenz.
Ferner können als Peptide auch Sequenzen eingesetzt werden, die die oben genannten Sequenzen enthalten.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass am freien C-terminus an Stelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe (CONH2-Gruppe) oder eine COH-Gruppe, COCI-Gruppe, COBr-Gruppe, CONH-alkyl- Rest oder ein CONH-alkyl-Amin-Rest vorliegt oder aber das Peptid zyklisiert vorliegt.
Damit wird besonders vorteilhaft zusätzlich die Aufgabe gelöst, dass ein Peptid ohne negative Ladung am C-terminus, bereitgestellt wird. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass dieses mit höherer Affinität an das Zielmolekül binden kann, als ein Peptid, welches eine Carboxylgruppe am freien C-terminus aufweist. Peptide mit freier, nicht-modifizierter Carboxylgruppe weisen im physiologischen Zustand eine negative Ladung an diesem Ende auf.
In einer Ausgestaltung der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide im physiologischen Zustand, insbesondere bei pH 6-8, insbesondere 6, 5-7, 5, insbesondere bei pH 6,0, pH 6,1, pH 6,2, pH 6,3, pH 6,4, pH 6,5 pH 6,6, pH 6,7, pH 6,8, pH 6,9, pH 7,0, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3, pH 7,4, pH 7,5, pH 7,6, pH 7,7, pH 7,8, pH 7,9 bzw. pH 8,0 derart modifiziert, dass der C-terminus keine negative Ladung trägt, sondern stattdessen neutral ist oder eine oder mehrere positive Ladungen aufweist. In einer Ausführungsform ist das Peptid dadurch gekennzeichnet, dass am freien C- terminus an Stelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe vorliegt. Statt der Carboxylgruppe (-COOH-Gruppe) ist also eine Säureamidgruppe (-CONH2-Gruppe) am C-terminus angeordnet.
Das Peptid ist demnach besonders vorteilhaft am freien C-Terminus amidiert und am freien N-Terminus nicht modifiziert.
Dadurch wird besonders vorteilhaft die weitere Aufgabe gelöst, dass ein Peptid ohne negativen Ladungsüberschuss vorliegt, welches affiner an das Zielmolekül binden kann und auf einfache Weise erhältlich ist.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung liegen folgende weitere Gruppen an Stelle der Carboxylgruppe vor: COH, COCI, COBr, CONH-alkyl-Rest, CONH-alkyl- Amin-Rest (positive Netto-Ladung) etc., wobei man hierauf nicht beschränkt, sofern der technischen Lehre des Hauptanspruchs gefolgt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist daher die Affinität der Bindung der erfindungsgemäß modifizierten Peptide ohne negative Ladung am C-terminus im Vergleich zu linearen Peptiden mit negativer Ladung am C-terminus aber im Übrigen gleicher Aminosäuresequenz, um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,
49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,
93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere 100%, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,
124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139,
140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155,
156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,
172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187,
188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, insbesondere 200%,
201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216,
217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232,
233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264,
265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280,
281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296,
297, 298, 299, insbesondere 300%, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325,
326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341,
342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357,
358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373,
374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389,
390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, insbesondere 400%, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418,
419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434,
435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450,
451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466,
467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482,
483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498,
499, vorteilhaft sogar 500%, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527,
528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543,
544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559,
560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575,
576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591,
592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, besonders vorteilhaft 600%, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619,
620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635,
636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651,
652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667,
668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683,
684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, besonders vorteilhaft 700%, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727,
728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743,
744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759,
760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775,
776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791,
792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, ebenfalls besonders vorteilhaft 800%, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817,
818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833,
834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849,
850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865,
866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881,
882, 883, 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897,
898, 899, ebenfalls besonders vorteilhaft 900%, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923,
924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939,
940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954, 955,
956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971,
972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981, 982, 983, 984, 985, 986, 987,
988, 989, 990, 991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, oder sogar um 1000%, oder sogar um 10000% oder sogar um bis zu 100000% oder 1000000% erhöht, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.
Dies wird durch einen entsprechend erniedrigten Ko-Wert angezeigt. Der Ko-Wert als Maß für die Affinität der Bindung eines modifizierten Peptids an Amyloid-ß-Monomer ist im Vergleich zu einem linearen, bindenden Peptid mit negativer Ladung am freien C-terminus, um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,
39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,
61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,
83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere
99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5%, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 bis zu 99,99 oder sogar 99,999% erniedrigt, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Kopien der Sequenzen mit der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 und/oder SEQ ID NO: 7 enthält.
Es sind auch Varianten denkbar, wobei das Peptid 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
20 oder mehr Peptide mit der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 und/oder SEQ ID NO: 7 enthält. Insbesondere bevorzugt sind Dimere der Sequenzen mit der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 und/oder SEQ ID NO: 7, wobei es sich bei den beiden Monomeren des Dimers um Peptide mit der gleichen SEQ ID oder mit einer verschiedenen SEQ ID handelt.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie im Wesentlichen aus D-Aminosäuren bestehen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „im Wesentlichen aus D- enantiomeren Aminosäuren", dass die erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70% bevorzugt 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, 95%, insbesondere 96%, 97%, 98%, 99%, 100% aus D-enantiomeren Aminosäuren aufgebaut sind.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 besteht.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid mit einer weiteren Substanz verknüpft ist.
Bei der Verknüpfung handelt es sich im Sinne der Erfindung um eine chemische Bindung wie sie in Römpp Chemie Lexikon, 9. Auflage, Band 1, Seite 650 ff, Georg Thieme Verlag Stuttgart definiert ist, bevorzugt um eine Hauptvalenz Bindung, insbesondere eine kovalente Bindung.
Bei den Substanzen handelt es sich in einer Variante um Arzneimittel oder Wirkstoffe, definiert gemäß Arzneimittelgesetz §2 beziehungsweise. §4 (19), Stand September 2012. In einer Alternative sind Wirkstoffe therapeutisch aktive Stoffe die als arzneilich wirksame Stoffe verwendet werden. Bevorzugt werden Entzündungshemmer eingesetzt.
Bei den Substanzen handelt es sich in einer weiteren Variante um Verbindungen, die die Wirkung der Peptide verstärken. In einer weiteren Alternative handelt es sich um Verbindungen, die die Löslichkeit der Peptide und/oder die Passage der Blut-Hirn-Schranke verbessern.
In einer Alternative haben die Peptide erfindungsgemäß jede beliebige Kombination von mindestens zwei oder mehr Merkmalen der oben beschriebenen Varianten, Ausführungen und/oder Alternativen.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.
Eine kovalente Verbindung bzw. Verknüpfung der Peptid-Einheiten liegt im Sinne der Erfindung vor, falls die Peptide Kopf an Kopf, Schwanz an Schwanz oder Kopf an Schwanz linear miteinander verknüpft werden, mit oder ohne dazwischen eingefügten Linker oder Linker-Gruppen.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 ohne Linker, also unmittelbar miteinander verknüpft, oder mit einer Linker-Gruppe miteinander verknüpft sind.
Eine nicht kovalente Verknüpfung im Sinne der Erfindung liegt vor, falls die Peptide beispielsweise über Biotin und Streptavidin, insbesondere Streptavidin-Tetramer, miteinander verknüpft sind.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 linear oder verzweigt miteinander verknüpft sind.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung können die Peptide linear miteinander verknüpft sein, insbesondere wie oben beschrieben. In einer anderen Variante sind die Peptide verzweigt miteinander zu dem erfindungsgemäßen Peptid verknüpft. Bei einem verzweigten Peptid kann es sich erfindungsgemäß um ein Dendrimer handeln, bei dem die Monomere kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.
Alternativ können die Peptide auch mit einem Plattform-Molekül (wie z. B. PEG oder Zucker) verknüpft sein und so ein verzweigtes Peptid bilden.
Alternativ sind auch Kombinationen dieser Optionen möglich
In einer Ausgestaltung der Erfindung ist die Affinität der Bindung der Peptide über die Dissoziationskonstante (Ko-Wert) definiert.
Die Dissoziationskonstante (Ko-Wert) eines erfindungsgemäßen Peptids ist dabei in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung vorteilhaft erniedrigt. Damit verbunden sind verbesserte Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide, wie höhere Affinität der Bindung und höhere Effektivität des Abbaus und/oder der Verhinderung der Bildung toxischer Amyloid-ß-Fibri llen, Amyloid-ß-Oligomere und/oder Amyloid-ß-Aggregate.
In einer Variante der Erfindung werden solche Peptide eingesetzt, die an ein Amyloid-ß-Monomer mit einer Dissoziationskonstante (Ko-Wert) von höchstens 500 pM, bevorzugt 250, 100, 50 pM, besonders bevorzugt 25, 10, 1 pM, besonders bevorzugt mit einer Dissoziationskonstante (Ko-Wert) von höchstens 500 nM, 250, 100, 50, besonders bevorzugt 25, 10, 1 nM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 pM bis sub-pM bindet, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer KD von kleiner als ein zweistelliger pM Bereich (< 10 pM), vorzugsweise nM Bereich (< 1 pM) an das Amyloid-ß-Peptid, binden kann.
Die Peptide können beispielsweise über chemische Synthese bzw. Peptidsynthese hergestellt werden. In einer weiteren Variante handelt es sich um ein erfindungsgemäßes Peptid zur Hemmung bzw. zur Verhinderung der Bildung von Amyloid-ß-Fi brillen, Amyloid-ß- Oligomere und/oder Amyloid-ß-Aggregaten.
In einer weiteren Variante handelt es sich um ein erfindungsgemäßes Peptid zur Enttoxifizierung von Amyloid-ß-Fi brillen, Amyloid-ß-Oligomere und/oder Amyloid-ß- Aggregaten.
Die erfindungsgemäßen Peptide enttoxifizieren die Amyloid-ß-Fibrillen, Amyloid-ß- Oligomere und/oder Amyloid-ß-Aggregaten oder daraus gebildete Polymere vorzugsweise indem sie nicht daran binden sondern an Amyloid-ß-Monomer binden und durch Verschiebung des Gleichgewichts zur Reduktion der Amyloid-ß-Oligomere bzw. Fibrillen führen und diese somit in nicht toxische Verbindungen überführen. Demgemäß ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Enttoxifizierung der Amyloid-ß-Oligomeren, daraus gebildeten Aggregaten oder Fibrillen.
Die Hemmung bzw. zur Verhinderung der Bildung von Amyloid-ß-Oligomeren, Amyloid-ß-Fibrillen und/oder Amyloid-ß-Aggregaten, bzw. die Enttoxifizierung der Amyloid-ß-Oligomeren, Amyloid-ß-Fibrillen und/oder Amyloid-Beta -Aggregaten kann dabei in vitro oder in vivo erfolgen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Behandlung der Alzheimer'schen Demenz (Morbus Alzheimer).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids als Sonde zur Identifizierung, quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Amyloid-ß-Fibrillen, Amyloid-ß-Oligomeren und/oder Amyloid-ß-Aggregaten.
Alle vorstehenden aufgeführten Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen der der erfindungsgemäßen Peptide gelten dabei analog für die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids als Sonde. Solche Sonden sind von großer Bedeutung, da damit eine frühe Diagnose der AD möglich wird. Mit der Frühdiagnose kann der Krankheit schon in einem sehr frühen Stadium entgegengewirkt werden.
Solche molekularen Sonden enthalten vorzugsweise das erfindungsgemäße Peptid und gegebenenfalls Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, radioaktive Isotope, (PET etc.), Gadolinium (MRI), sowie alternative Stoffe geeignet für die Bildgebung der Sonden und können den Patienten z. B. intravenös injiziert werden. Nach Passage über die Bluthirnschranke können die Sonden an Amyloid-ß-Fibril len, Amyloid-ß- Oligomeren und/oder Amyloid-ß-Aggregaten bzw. Plaques binden. Die so markierten Amyloid-ß-Fibri llen, Amyloid-ß-Oligomeren und/oder Amyloid-ß-Aggregaten bzw. Plaques können mittels bildgebender Verfahren wie z.B. SPECT, PET, CT, MRT, Protonen-MR-Spektroskopie usw. sichtbar gemacht werden.
Beschreibung der Figuren
Figur 1:
Einfluss der SaS-Peptide auf die Aß-induzierte Zelltoxizität.
Alle SaS-Peptide reduzieren die Aß-induzierte Zelltoxizität. Dieser Effekt ist, mit Ausnahme des SaS3-Peptides, signifikant bei Einsatz äquimolarer Konzentrationen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.
(One-way ANOVA mit Bonferroni post hoc Analyse, * p < 0.05, *** p < 0.001.)
Figur 2:
Einfluss der SaS-Peptide auf die Aß-Fi bri llenbildung . Alle SaS-Peptide reduzieren die Aß-Fibrillenbildung bei Einsatz äquimolarer Konzentrationen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.
Figur 3:
Die SaS-Peptide reduzieren signifikant toxische Aß(l-42)-Oligomere. Alle SaS- Peptide eliminieren signifikant toxische Aß-Oligomere und wandeln diese in höhermolekulare, nicht-amyloidogene Präzipitate bei Einsatz substöchiometrischer Konzentrationen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.
Die Erfindung wird nachfolgend in nicht beschränkenden Beispielen näher erläutert. Beispiele
Im Folgenden werden experimentelle Daten der erfindungsgemäßen SaS-Peptide dargestellt, die darlegen, dass diese eine Bindungsaffinität sowie ein Spezifität an Aß(l-42) (Tabelle 1) zeigen, die Aß-induzierte Zelltoxizität (Abbildung 1) und Aß- Fibrillenbildung inhibieren (Abbildung 2) und spezifisch Aß-Oligomere eliminieren (Abbildung 3).
Bindunqsstudien (SPR-Messunqen)
Durchführung:
Die Dissoziationskonstanten (KD) der Bindung der SaS-Peptide an Aß(l-42) wurden mittels SPR-Spektroskopie mit einem Biacore T200 Gerät bestimmt.
Dafür wurde Aß(l-42) auf einem Serie S CM-5 Sensorchip durch eine Aminkopplung immobilisiert.
Zunächst wurden die Durchflusszellen mit 50 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 16,1 mM N-Ethyl-NL(dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) für 7 min aktiviert.
Aß(l-42) wurde in 10 mM Natriumacetat pH 5 zu einer Endkonzentration von 50 g/mL gelöst und über eine der aktivierten Durchflusszellen bis zu einem Endsignal von 1700 RU injiziert.
Nach der Immobilisierung wurden die Liganden- und Referenzdurchflusszellen durch Injektion von 1 M Ethanolamin pH 8,5 für 7 min gequencht.
Für die Bestimmung der KD wurden multizyklische kinetische Experimente durchgeführt mit 10 mM HEPES + 50 mM NaCI, pH 7,4 als Laufpuffer bei 25 C und einer Flussrate von 30 L/min durchgeführt.
Die Peptide wurden in dem Laufpuffer auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Alle Proben wurden für 180 s über die Durchflusszellen injiziert, gefolgt von einem Dissoziationsschritt von 600 s mit Laufpuffer. Die Regeneration des Sensorchips wurde durch eine 45 s lange Injektion von 2 M Guanidiniumhydrochlorid (AppliChem, Darmstadt, Deutschland) erreicht.
Die Referenz-Durchflusszelle und Pufferinjektionen (c = 0 nM) wurden zur doppelten Referenzierung der Sensorgramme verwendet.
Zur Datenauswertung wurden die Sensorgramme mit dem in der Biacore T200 Evaluation Software 3.2 implementierten Steady-State-Affinitätsmodell gefittet.
Tabelle 1:
Figure imgf000018_0001
Zelltoxizitätsassav
Durchführung:
Der MTT (3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid)-basierte Zellviabil itätsassay wurden durchgeführt, um die Zytotoxizität von Aß(l-42) in Gegenwart der SaS Pepdite auf PC-12 Zellen zu untersuchen.
PC-12-Zellen (DSMZ, Deutschland) wurden in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum, 1 % Antibiotika (Penicillin/Streptomycin) und 5 % Pferdeserum auf mit Kollagen A beschichteten Gewebekulturflaschen kultiviert. Die Zellen wurden alle drei bis vier Tage, abhängig von der Konfluenz, passagiert.
Der MTT-Test wurde nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt (CellProliferation Kit I; Roche, Schweiz).
PC-12-Zellen wurden in durchsichtigen, kollagenbeschichteten 96-Well-Flachboden- Mikrotiterplatten in einer Dichte von 1 x 104 Zellen in einem Volumen von 100 pl pro well ausgesät und für 24 h inkubiert.
Die Peptide wurden als Fünffachbestimmung in drei unabhängigen Experimenten untersucht. 51 pM Aß(l-42) wurde für 4,5 h bei 37 °C unter Schütteln bei 600 U/min inkubiert.
Danach wurde je 51 pM SaS-Peptid zugegeben und für weitere 40 min inkubiert. Während des gesamten Tests wurden die Zellen mit 1 pM Aß mit oder ohne 1 pM der SaS-Peptide inkubiert.
Es wurde das arithmetische Mittel aller Messungen pro Ansatz berechnet. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der MTT-Reduktion dargestellt, unter der Annahme, dass die Extinktion der Kontrollzellen 100 % betrug.
Die Ergebnisse sind in Figur 1 zusammengefasst. ThT-Assav
Durchführung:
Um auf eine Störung der Fibrillenbildung zu testen, wurde ein Thioflavin-T-Test (ThT) durchgeführt.
Das Fluoreszenzsignal von ThT, einem Benzothiazol-Farbstoff, erhöht sich bei Bindung an Amyloidfibrillen. Unter Verwendung des ThT-Assays wurde die Wirksamkeit der SaS-Peptide zu Inhibierung der Fibrillenbildung von Aß(l-42) analysiert.
Dafür wurden äquimolare Konzentrationen Aß(l-42) und der SaS-Peptide mit 5 pM ThT inkubiert. Die ThT-Fluoreszenz wurde über 48 h bei ex = 440 nm und em = 490 nm in einem Platereader bei RT gemessen.
Die Ergebnisse sind in Figur 2 zusammengefasst.
QIAD-Assav
Durchführung:
Nach Brener et al., wurde ein QIAD-Assay durchgeführt, um die Aß(l-42) Eliminierungseffizienzen der SaS-Peptide zu untersuchen.
80 pM Aß(l-42) wurde für 2 h vorinkubiert, um Aß-Oligomere anzureichern. Anschließend wurden 20 pM des jeweiligen SaS-Petides zu der vorinkubierten Lösung gegeben und für weitere 30 min inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf einen Dichtegradienten (5-50% (w/v) lodixanol) gegeben, gefolgt von einem Ultrazentrifugationsschritt (3 h bei 4 C und 259000 g).
Nach der Ultrazentrifugation wurden 14 Fraktionen (je 140 pl) (von oben nach unten) abpipettiert. Fraktion 15 enthält das gelöste Pellet in 6 M Guanidinhydrochloridlösung.
Die Fraktionen 1 bis 2 enthalten Aß-Monomere, die Fraktionen 4 bis 6 enthalten die Aß-Oligomere, die von besonderem Interesse sind, und die Fraktionen 11 bis 14 enthalten hochmolekulare (Co-)Präzipitate oder aggregiertes Aß(l-42).
Die Aß(l-42) Konzentrationen jeder Fraktion wurden mittels analytischer RP-HPLC und UV-Absorptionsdetektion bei 214 nm bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Figur 3 zusammengefasst.

Claims

Ansprüche
1. Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7, sowie Homologe, Fragmente und Teile davon.
2. Peptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 oder Homologen mit einer Identität von mindestens 80% davon umfasst.
3. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass am freien C-terminus an Stelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe (CONH2-Gruppe) oder eine COH-Gruppe, COCI-Gruppe, COBr- Gruppe, CONH-Alkyl-Rest oder ein CONH-Alkyl-Amin-Rest vorliegt oder aber das Peptid zyklisiert vorliegt.
4. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Kopien der Sequenzen mit der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 enthält.
5. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid im Wesentlichen aus D-Aminosäuren besteht.
6. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 besteht.
7. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid mit einer weiteren Substanz verknüpft ist.
8. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.
9. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 ohne Linker, also unmittelbar miteinander verknüpft, oder mit einer Linker-Gruppe miteinander verknüpft sind.
10. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 linear oder verzweigt miteinander verknüpft sind.
11. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Dendrimer handelt, wobei Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 mit einem Plattform-Molekül verknüpft sind.
12. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einer KD von kleiner als ein zweistelliger pM Bereich (< 10 pM), vorzugsweise nM Bereich (< 1 pM) an das Amyloid-ß-Peptid binden kann.
13. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 12 zur Verhinderung der Bildung und/oder zur Enttoxifizierung von Amyloid-ß-Fibrillen, Amyloid-ß-Oligomeren und/oder Amyloid-ß-Aggregaten.
14. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 12 zur Verwendung in der Behandlung von Morbus Alzheimer.
15. Verwendung eines Peptids gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 12 als Sonde zur Identifizierung, quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Amyloid-ß-Fibrillen, Amyloid-ß-Oligomeren und/oder Amyloid-ß- Aggregaten.
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