WO2023008402A1 - 肺線維症治療剤 - Google Patents

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pulmonary fibrosis
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典子 反町
俊彦 小林
ティエン ダット グェン
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Definitions

  • the present invention relates to a pulmonary fibrosis therapeutic agent containing macrophages in which the function of the SLC15A3 gene is suppressed.
  • Idiopathic pulmonary fibrosis is an incurable chronic disease with an estimated 3 million patients worldwide and a median survival time of 2-3 years without post-diagnosis treatment.
  • pneumonia caused by COVID-19 develops atypical pneumonia, which then develops acute lung injury and acute respiratory distress syndrome (ARDS) and progresses to fibrosis.
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • the elderly and critically ill patients often have aftereffects associated with pulmonary fibrosis, leading to a serious deterioration in QOL.
  • the indolinone derivative nintedanib (trade name: Ofev) is the only drug that has been approved as a drug.
  • this drug suppresses the progression of fibrosis by suppressing the proliferation of fibroblasts, and does not restore fibrotic tissue to normal tissue.
  • Non-Patent Document 1 The present inventor reported that bleomycin-induced pulmonary fibrosis was improved in SLC15A3 (Solute carrier family 15 member 3) gene-deficient mice (Non-Patent Document 1). did not disclose the role of macrophages in ameliorating pulmonary fibrosis.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and its object is to provide a pulmonary fibrosis therapeutic agent, particularly a cell therapeutic agent, capable of restoring fibrotic lung tissue to normal tissue. It is in.
  • the present inventors conducted intensive studies to solve the above problems, and found that macrophages lacking the SLC15A3 gene showed an excellent effect of restoring pulmonary fibrosis in an animal model of pulmonary fibrosis. As a result, the inventors have found that the macrophage is an excellent therapeutic agent for the treatment of pulmonary fibrosis, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for pulmonary fibrosis containing macrophages in which the function of the SLC15A3 gene is suppressed, and a method for treating pulmonary fibrosis comprising administering the therapeutic agent to a subject.
  • the therapeutic agent for pulmonary fibrosis of the present invention it is possible to improve pulmonary fibrosis in a subject.
  • the pulmonary fibrosis therapeutic agent of the present invention reduces the amount of collagen in the lung, which causes pulmonary fibrosis, and restores the deteriorated respiratory function, which is one of the main symptoms of pulmonary fibrosis. According to this, it is possible to stop the progression of pulmonary fibrosis and perform fundamental treatment.
  • FIG. 2 shows the effect of administration of SLC15A3-deficient macrophages on improving silica microparticle-induced pulmonary fibrosis.
  • the present invention provides a pulmonary fibrosis therapeutic agent containing macrophages in which the function of the SLC15A3 gene is suppressed, and a pulmonary fibrosis therapeutic method comprising administering the therapeutic agent to a subject.
  • Interstitial pneumonia is caused by idiopathic interstitial pulmonary fibrosis whose cause is unknown, autoimmune interstitial lung disease caused by autoimmune diseases, pneumoconiosis caused by occupational environmental factors, etc. These diseases include interstitial lung disease, radiation- and drug-induced interstitial lung disease, and interstitial lung disease as a sequela of respiratory infections.
  • SLC15A3 in the present invention is a proton-coupled transporter and has the function of transporting amino acids, dipeptides, oligopeptides, etc. (Wang, Y. et al. J Pharm Sci 2019 Oct;108(10):3416- 3424), pathogen recognition mediated by NOD1 and NOD2 (Nakamura, N. et al. Nature 2014 May 8; 509 (7499): 240-244), inflammatory response mediated by Toll-like receptor 4 (Song, F. et al. al. Cell Death Dis. 2018 Jul 10; 9(7): 770), immune response to herpes virus (He, L. et al. J. Immunol. Res.
  • the mechanism of "suppression of the function of the SLC15A3 gene" in the present invention may be suppression of the activity of the translation product (protein) of the gene or suppression of the expression of the gene.
  • Suppression of the activity of a translation product (protein) of a gene can be performed, for example, by introducing mutation (deletion, substitution, insertion, etc.) into the gene.
  • Whether or not the activity of SLC15A3 is suppressed can be evaluated, for example, using the transporter activity of SLC15A3 (Wang, Y. et al. J Pharm Sci 2019 Oct; 108(10): 3416-3424) as an index.
  • the expression intensity of molecules regulated by SLC15A3 can be used as an index for evaluation.
  • Genome editing systems include, for example, CRISPR-Cas targeting the SLC15A3 gene (eg, CRISPR-Cas9), TALENs, site-specific artificial nucleases such as ZFNs, and the like.
  • a gene is cleaved at a target site by the action of the genome editing system, and mutation (deletion, insertion, etc. of a base) is introduced into the gene via the DNA repair mechanism of the cell.
  • mutation deletion, insertion, etc. of a base
  • the deletion may be a deletion of the entire gene or a partial deletion.
  • CRISPR-Cas as a component of modified Cas added with deaminase (e.g., cytidine deaminase or adenosine deaminase) after eliminating some or all of the nuclease activity of Cas, or, such as TALENs and ZFNs
  • deaminase e.g., cytidine deaminase or adenosine deaminase
  • TALENs and ZFNs By using a deaminase in place of the nuclease domain, it is also possible to efficiently replace specific bases of a gene.
  • a desired mutation can be introduced into a gene through homologous recombination by using a genome editing system using nuclease activity in combination with a donor vector in which a desired mutated sequence has been introduced between homology arms.
  • “Suppression of the function of the SLC15A3 gene” in the present invention can also be performed by suppressing the expression of the gene.
  • Suppression of SLC15A3 gene expression may be suppression of gene translation or transcription.
  • Translation of the SLC15A3 gene can be suppressed using, for example, double-stranded RNA (dsRNA) that binds to the transcript of the SLC15A3 gene.
  • double-stranded RNA include siRNA, shRNA (short haipin RNA), miRNA and the like.
  • Suppression of transcription of the SLC15A3 gene can be performed, for example, by introducing a mutation into the expression control region of the SLC15A3 gene.
  • the above-described genome editing system targeting the expression control region can be used to introduce the mutation.
  • Whether or not the expression of the SLC15A3 gene is suppressed can be determined at the translation level, for example, by an immunoassay using an antibody that binds to the translation product, and at the transcription level, for example, RT-PCR or Northern Each can be evaluated by a blotting method.
  • These molecules for suppressing the function of the SLC15A3 gene may be introduced into macrophages themselves, and DNA encoding the molecules (typically, A vector into which the DNA is inserted) may be introduced into macrophages.
  • Methods for introducing these molecules into macrophages are not particularly limited. methods, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, and the like.
  • Macrophages for suppressing the function of the SLC15A3 gene can be prepared, for example, by isolating monocytes from human peripheral blood and culturing them in a macrophage culture medium.
  • a commercially available macrophage culture medium may be used for macrophage culture.
  • macrophages are preferably prepared from the patient's peripheral blood (ie, autologous peripheral blood).
  • Monocytes and macrophages can also be prepared by induction from pluripotent stem cells such as iPS cells.
  • the macrophages in which the function of the SLC15A3 gene thus prepared is suppressed can treat pulmonary fibrosis by administering them to subjects (patients).
  • Administration to a subject is preferably direct administration to the lungs via the respiratory tract.
  • a fiberoptic bronchoscope can be used for transairway administration.
  • the dose and administration frequency of macrophages to the subject are appropriately adjusted in consideration of the symptoms of the subject.
  • the therapeutic agent for pulmonary fibrosis of the present invention may be administered to a subject alone, or may be administered to a subject in combination with other drugs effective in treating pulmonary fibrosis.
  • Example 1 Effect of SLC15A3-deficient macrophages to improve pathological conditions in pulmonary fibrosis animal model
  • a mononuclear cell fraction was separated from the bone marrow of SLC15A3-deficient and wild - type mice, and red blood cells were removed by hemolysis.
  • the cells were seeded on a plastic culture dish and cultured for 7 days in the presence of recombinant M-CSF in RPMI1640 complete medium containing 10% fetal bovine serum.
  • the obtained macrophages (4 ⁇ 10 6 ) were transplanted through the airway into the lungs 15 days after administration of the silica microparticles.
  • Pathological conditions of pulmonary fibrosis were analyzed by microCT every other week.
  • mice were euthanized 25 days after transplantation (35 days after administration of silica), and microCT, vital capacity, and collagen content were evaluated.
  • pulmonary fibrosis can be effectively treated. Therefore, the present invention greatly contributes to the medical field.

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Abstract

ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子を欠損させたマクロファージが優れた肺線維症治療効果を有することを見出した。

Description

肺線維症治療剤
　本発明は、ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の機能が抑制されたマクロファージを含む、肺線維症治療剤に関する。
　特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、全世界で３００万人の患者が推定されており、診断後治療なしでは生存期間の中央値が２～３年となる治癒困難な慢性疾患である。また、ＣＯＶＩＤ－１９による肺炎は、非定型肺炎を発症し、その後、急性肺障害および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を発症して線維化へと進展する。特に、高齢者や重症患者においては、肺線維化を伴う後遺症を残すケースが存在し、深刻なＱＯＬの低下を招いている。
　そこで、これら疾患に対する治療薬が求められているが、現状は支持療法が主流であり、インドリノン誘導体であるニンテダニブ（商品名：オフェブ）が、唯一、医薬品として承認されている。しかしながら、この医薬品は線維芽細胞の増殖を抑制することにより線維化の進行を抑制するものであり、線維化した組織を正常組織に回復させるものではない。
　なお、本発明者は、ＳＬＣ１５Ａ３（Ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　１５　ｍｅｍｂｅｒ　３）遺伝子を欠損させたマウスでは、ブレオマイシンにより誘導した肺線維症が改善することを報告しているが（非特許文献１）、この報告では、肺線維症の改善におけるマクロファージの役割については開示されていない。
Ｋｅｙｓｔｏｎｅ　Ｓｙｍｐｏｉｕｍ　－　Ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｒｅｐａｉｒ：　Ｆｒｏｍ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ　ｔｏ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．　Ｆｅｂｒｕａｒｙ　１９－２３，　２０２０　　Ｆａｉｒｍｏｎｔ　Ｅｍｐｒｅｓｓ　Ｖｉｃｔｏｒｉａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ｃｅｎｔｒｅ　７２１　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｓｔｒｅｅｔ　Ｖｉｃｔｏｒｉａ，　ＢＣ，　Ｖ８Ｗ　１Ｗ５　Ｃａｎａｄａ　　Ｐｏｓｔｅｒ　ａｂｓｔｒａｃｔ，　ｐａｇｅ　８１
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、線維化した肺組織を正常組織に回復させることが可能な肺線維症治療剤、特に細胞治療剤を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子を欠損させたマクロファージが、肺線維症の動物モデルにおいて、肺の線維化を回復させる優れた効果を示したことから、当該マクロファージが肺線維症治療のための優れた治療剤となることを見出し、本発明を完成するに至った。
　従って、本発明は、ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の機能が抑制されたマクロファージを含む、肺線維症治療剤、および当該治療剤を対象に投与することを含む、肺線維症の治療方法に関する。
　本発明の肺線維症治療剤によれば、対象における肺の繊維化を改善することが可能となる。また、肺の繊維化の原因となる肺中コラーゲンの量を低減させるとともに、肺線維症の主な症状の一つである悪化した呼吸機能を回復させることから、本発明の肺線維症治療剤によれば、肺線維症の進行を停止させ、根本的な治療を行うことが可能となる。
ＳＬＣ１５Ａ３欠損マクロファージの投与による、シリカ微粒子誘導肺線維症の改善効果を示す図である。
　本発明は、ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の機能が抑制されたマクロファージを含む、肺線維症治療剤、および当該治療剤を対象に投与することを含む、肺線維症の治療方法を提供する。
　本発明における「肺線維症」は、様々な原因により肺に炎症が生じ、その結果、肺胞壁、肺小葉、胸膜などに進行性の瘢痕化およびコラーゲンなどのマトリクスの沈着をきたすことにより、肺機能喪失をもたらす疾患であり、間質性肺炎として総称されている。間質性肺炎は、原因が不明とされる特発性間質性肺線維症、自己免疫疾患が原因となる自己免疫性の間質性肺疾患、職業環境性因子が原因となるじん肺などの間質性肺疾患、放射線や薬剤が原因となる医元性の間質性肺疾患、および呼吸器感染症の後遺症としての間質性肺炎を含む疾患である。
　本発明における「ＳＬＣ１５Ａ３」は、プロトン共役型トランスポーターであり、アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチドなどの輸送機能を有するとともに（Ｗａｎｇ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｓｃｉ　２０１９　Ｏｃｔ；１０８（１０）：３４１６－３４２４）、ＮＯＤ１やＮＯＤ２を介した病原体認識（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　２０１４　Ｍａｙ　８；５０９（７４９９）：２４０－２４４），Ｔｏｌｌ様受容体４が媒介する炎症応答（Ｓｏｎｇ，　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｉｓ．　２０１８　Ｊｕｌ　１０；９（７）：７７０）、ヘルペスウイルスに対する免疫応答（Ｈｅ，　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｒｅｓ．　２０１８　Ｊｕｌ　５；２０１８：５２１４１８７）、リソソーム酸性化（Ｚｈａｎｇ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　２０２０　Ｎｏｖ　２４；１１７（４７）：２９８６２－２９８７１）を媒介することも知られている。典型的なヒト由来のＳＬＣ１５Ａ３タンパク質のアミノ酸配列および当該アミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（アクセション番号ＢＣ０３７９７４）や文献（Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ，Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　２００２　９９（２６）：１６８９９－１６９０３）に開示されている。
　本発明における「ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の機能の抑制」は、その機序が、遺伝子の翻訳産物（タンパク質）の活性の抑制であっても、遺伝子の発現の抑制であってもよい。遺伝子の翻訳産物（タンパク質）の活性の抑制は、例えば、当該遺伝子への変異（欠失、置換、挿入など）の導入により行うことができる。ＳＬＣ１５Ａ３の活性が抑制されたか否かは、例えば、ＳＬＣ１５Ａ３のトランスポーター活性（Ｗａｎｇ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｓｃｉ　２０１９　Ｏｃｔ；１０８（１０）：３４１６－３４２４）を指標に評価することができる。また、ＳＬＣ１５Ａ３によって制御される分子の発現強度を指標に評価することもできる。
　ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子への変異の導入は、例えば、ゲノム編集系を利用して行うことができる。ゲノム編集系としては、例えば、ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）、ＴＡＬＥＮｓ、ＺＦＮｓなどの部位特異的人工ヌクレアーゼなどが挙げられる。ゲノム編集系の作用により標的部位で遺伝子が切断され、細胞のＤＮＡ修復機構を介して、遺伝子に変異（塩基の欠失、挿入など）が導入される。変異の導入により遺伝子を欠損させる場合、欠損は、遺伝子全体の欠損であっても、部分的な欠損であってもよい。Ｃａｓのヌクレアーゼ活性の一部または全部を消失させた上でデアミナーゼ（例えば、シチジンデアミナーゼやアデノシンデアミナーゼ）を付加した改変Ｃａｓを構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを用いることにより、あるいは、ＴＡＬＥＮｓやＺＦＮｓなどのヌクレアーゼドメインに代えてデアミナーゼを用いることにより、遺伝子の特定の塩基を効率的に置換することもできる。ヌクレアーゼ活性を利用したゲノム編集系に、ホモロジーアームの間に所望の変異配列が導入されたドナーベクターを組み合わせて利用することにより、相同組換えを通じて遺伝子に所望の変異を導入することもできる。
　本発明における「ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の機能の抑制」は、また、当該遺伝子の発現の抑制によって行うこともできる。ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の発現の抑制は、遺伝子の翻訳の抑制であっても、転写の抑制であってもよい。ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の翻訳の抑制は、例えば、ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の転写産物に結合する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を利用して行うことができる。二重鎖ＲＮＡとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｐｉｎ　ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の転写の抑制は、例えば、ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の発現制御領域への変異の導入によって行うことができる。変異の導入には、当該発現制御領域を標的化する上記のゲノム編集系を利用することができる。ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の発現が抑制されたか否かは、翻訳レベルであれば、例えば、翻訳産物に結合する抗体を利用した免疫学的測定法により、転写レベルであれば、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法やノーザンブロッティング法により、それぞれ評価することができる。
　これらＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の機能を抑制するための分子は、当該分子自体をマクロファージに導入してもよく、また、当該分子をマクロファージ内で発現させるために、当該分子をコードするＤＮＡ（典型的には、当該ＤＮＡが挿入されたベクター）をマクロファージに導入してもよい。これら分子のマクロファージへの導入の方法としては、特に制限はなく、例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染、マイクロインジェクション法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。
　ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の機能を抑制するためのマクロファージは、例えば、ヒト末梢血より単球を分離し、マクロファージ培養液にて培養することにより調製することができる。マクロファージ培養においては、市販のマクロファージ培養液を使用してもよい。患者への適合性の観点から、マクロファージは、患者の末梢血（すなわち、自家の末梢血）から調製することが好ましい。また、単球やマクロファージは、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から誘導して調製することもできる。
　こうして調製されたＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の機能が抑制されたマクロファージは、対象（患者）に投与することにより、肺線維症を治療することができる。対象への投与は、経気道的な肺への直接投与が好ましい。経気道的投与においては、例えば、気管支ファイバースコープを用いることができる。対象へのマクロファージの投与量および投与頻度は、対象の症状などを考慮して適宜調整される。
　本発明の肺線維症治療剤は、対象に対して単独で投与してもよく、また、肺線維症の治療に有効な他の薬剤と組み合わせて対象に投与してもよい。
　［実施例１］　ＳＬＣ１５Ａ３欠損マクロファージの肺線維症動物モデルにおける病態改善効果
　ＳＬＣ１５Ａ３欠損および野生型マウス骨髄より単核球画分を分離し、溶血により赤血球を除去した後、１０７個の細胞を１０ｃｍプラスチック培養皿に播種し、１０％　ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０完全培地にて組み換えＭ－ＣＳＦ存在下で７日間培養した。得られたマクロファージ４×１０６個を、シリカ微粒子投与後１５日目の肺に経気道的に移植した。肺線維症の病態は、１週間おきにマイクロＣＴによる解析を行った。また、移植後２５日目（シリカ投与後３５日目）にマウスを安楽死させ、マイクロＣＴ、肺活量、およびコラーゲン量を評価した。
　その結果、ＳＬＣ１５Ａ３欠損マウスにおいては、肺の線維化が改善するだけでなく、呼吸機能も回復し、線維化肺中のコラーゲン量が有意に減少することが判明した（図１）。
　本発明によれば肺線維症を効果的に治療することができる。従って、本発明は、医療分野において大きく貢献するものである。

Claims (2)

  1. 　ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の機能が抑制されたマクロファージを含む、肺線維症治療剤。
  2. 　請求項１に記載の治療剤を対象に投与することを含む、肺線維症の治療方法。
PCT/JP2022/028695 2021-07-26 2022-07-26 肺線維症治療剤 Ceased WO2023008402A1 (ja)

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Non-Patent Citations (4)

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