WO2022264966A1 - 発達障害および精神疾患の処置および予防 - Google Patents

発達障害および精神疾患の処置および予防 Download PDF

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WO2022264966A1
WO2022264966A1 PCT/JP2022/023638 JP2022023638W WO2022264966A1 WO 2022264966 A1 WO2022264966 A1 WO 2022264966A1 JP 2022023638 W JP2022023638 W JP 2022023638W WO 2022264966 A1 WO2022264966 A1 WO 2022264966A1
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WO
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reverse transcriptase
mecp2
mice
disorders
inhibitor
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PCT/JP2022/023638
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French (fr)
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欽一 中島
秀行 中嶋
レナト ムオトリ，アリソン
Original Assignee
国立大学法人九州大学
ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention provides pharmaceutical compositions for treating and/or preventing developmental disorders or psychiatric disorders, in particular developmental disorders such as Rett's syndrome and autism spectrum disorders, containing reverse transcription inhibitors of retrotransposon L1. or to pharmaceutical compositions for treating and/or preventing mental disorders such as schizophrenia.
  • MIA maternal immune activation
  • MSS mother-child separation stress
  • L1 transposon LINE1 (long interspersed nucleotide elements or L1)
  • the retrotransposon L1 promoter is usually methylated, and the transcription of L1 is repressed by binding the methylated DNA-binding transcription repressor MeCP2 (methyl-CpG binding protein 2).
  • MeCP2 methyl-CpG binding protein 2
  • MeCP2 dissociates and its transcription is activated.
  • L1 cDNA transfer is normally found only in the brain outside the germline, and that the retrotransposon L1 is highly expressed during neural stem cell (NSC) differentiation into neurons.
  • NSC neural stem cell
  • Non-Patent Document 2 the transcription of L1 is further enhanced in MeCP2-deficient NSCs, and when the L1 promoter in NSCs is demethylated by treatment with a DNA demethylating agent, MeCP2 is transferred to it. reveals that they no longer combine.
  • MeCP2 exists on the X chromosome, and its mutation causes Rett syndrome (RTT), a progressive psychiatric and neurological disease (Non-Patent Document 3).
  • RTT Rett syndrome
  • Non-Patent Document 4 A case of Rett syndrome was first reported in 1966 by Andreas Rett, a pediatric neurologist in Vienna (Non-Patent Document 4). After that, many cases were reported in the 1980s, and Rett syndrome came to be recognized worldwide as a neurodevelopmental disorder that mainly affects girls.
  • Patent Document 1 and its family Patent Documents 2 and 3 disclose a method for reducing non-long terminal repeat (LTR) retrotransposons in nerve cells by treating nerve cells with a transposon inhibitor.
  • Retrotransposons are broadly divided into LTR retrotransposons and non-LTR retrotransposons, the latter also called LINE1 or L1.
  • the neuron is a neuron in a certain diseased state due to the retrotransposon L1 in the neuron, diseases with the neuron in the diseased state include Rett's syndrome, and metastasis inhibition.
  • Reverse transcriptase inhibitors are mentioned as substances.
  • the ability of reverse transcriptase inhibitors to modulate retrotransposon L1 and treat Rett's syndrome has not been specifically and explicitly described and has not been substantiated by experimental data.
  • the main treatment methods are “rehabilitation” and “adjustment of the living environment", but depending on the disease, disorder, and symptoms of the target patient, Drug therapy may be required.
  • Drug therapy may be required. For example, if you have epileptic seizures, antiepileptic drugs; sleep disturbances, inattentiveness, hyperactivity, impulsivity, self-harm, agitation, aggression, etc., sleep-inducing drugs , drugs for treating bipolar disorder, drugs for ADHD, antipsychotics, and if there are mental symptoms such as anxiety, depression, and tension, anti-anxiety drugs, antidepressants, etc. are prescribed.
  • any drug therapy is only a symptomatic treatment, and a drug therapy that can fundamentally solve the problem is always desired.
  • psychiatric disorders such as schizophrenia
  • pharmacotherapy focusing on changes in monoamines and glutamate receptors is performed.
  • Symptoms of schizophrenia can be broadly classified into positive symptoms, negative symptoms, and cognitive dysfunction, and treatment is performed according to each symptom.
  • Drugs based mainly on the dopamine hypothesis are prescribed for positive symptoms, but although certain effects are observed, there are cases where no effect is observed, and there is sufficient therapeutic effect for negative symptoms and cognitive impairment. There are no drugs that show
  • the present invention is directed to new pharmaceutical compositions for treating and/or preventing developmental disorders such as Rett Syndrome (RTT) and autism spectrum disorders or psychiatric disorders such as schizophrenia. .
  • developmental disorders such as Rett Syndrome (RTT) and autism spectrum disorders or psychiatric disorders
  • psychiatric disorders such as schizophrenia.
  • Patent Documents 1 to 3 the expression and function of various genes are abnormal due to the insertion of reverse-transcribed L1cDNA into the genome, the onset of L1cDNA occurs once in the genome. Since it occurs by insertion, we assumed that treatment would not be possible without removing the inserted L1 cDNA from the genome. The task of removing specific genes from the genome is complicated and expensive. Therefore, the present inventors regard L1cDNA itself as a functional molecule, and believe that the abnormal cell response induced by the presence of L1cDNA can be alleviated by suppressing the production of L1cDNA with a substance that inhibits reverse transcription of retrotransposon L1. As a result of intensive research, it was found that developmental disorders such as Rett syndrome (RTT) and autism spectrum disorders and mental disorders such as schizophrenia can be treated as well as prevented. completed.
  • RTT Rett syndrome
  • schizophrenia autism spectrum disorders
  • schizophrenia mental disorders
  • the present invention includes the following aspects.
  • ⁇ Pharmaceutical composition> A pharmaceutical composition for treating and/or preventing a developmental disorder or a psychiatric disorder, containing a retrotransposon L1 reverse transcription inhibitor (other than the non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor nevirapine).
  • a retrotransposon L1 reverse transcription inhibitor other than the non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor nevirapine.
  • the pharmaceutical composition of [1] wherein the retrotransposon L1 reverse transcription inhibitor is a reverse transcriptase inhibitor.
  • nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor is lamivudine or stavudine.
  • the developmental disorder is Rett's syndrome.
  • RTT Rett syndrome
  • autism spectrum disorders or psychiatric disorders such as schizophrenia
  • psychiatric disorders such as schizophrenia
  • the present invention enables therapies to treat and/or prevent developmental disorders such as Rett Syndrome (RTT), autism spectrum disorders, or psychiatric disorders such as schizophrenia, for which no curative therapy has yet been found. .
  • Figure 2 is a graph showing the effect of 3TC, d4T and vehicle drinking water administration on survival in MeCP2-KO mice.
  • n number of knockout mice used for analysis. *p ⁇ 0.05, KO vs. KO-3TC. ⁇ p ⁇ 0.01, KO vs. KO-d4T. Log-rank test.
  • FIG. 3A shows CTRL (neurons derived from normal human iPS cells), MECP2-KO (neurons derived from patient-derived iPS cells), MECP2- treated with reverse transcriptase inhibitors 3TC and d4T (RTi). Images of KO and MECP2-KO neurons treated with nevirapine (NVP) (black dots are Soma (cell bodies)). There is a nucleus in the sunspot, and in each condition there is only one sunspot, from which neuron projections extend. Each thus represents a representative morphology of one neuron. Neuron complexity analysis by Soll analysis is shown in FIG. 3A (bottom). FIG.
  • 3B is a graph showing that a reverse transcriptase inhibitor restores abnormal release of the pro-inflammatory cytokine IL6 from MECP2-KO astrocytes. Astrocyte function was confirmed by adding IL1 ⁇ to the medium 48 hours before IL6 expression analysis. The numerical value was expressed by converting the expression level of IL6 in the control (CTRL) (astrocytes induced from normal human iPS cells) to 1.
  • CTRL astrocytes induced from normal human iPS cells
  • FIG. 3C shows control (CTRL), MECP2-KO (KO), reverse transcriptase inhibitor-treated MECP2-KO (KO+RTi), and NVP-treated MECP2-KO (KO+NVP) neurons.
  • Representative immunostaining images of MAP2 grey
  • synapsin 1 SYN1
  • PSD95 postsynaptic hypertrophy protein 95
  • FIG. 3C right
  • Co-localized synaptic puncta analysis is shown in FIG. 3C (right). Co-localized synaptic puncta per 20 ⁇ m in neurons in each condition were quantified. Data are presented as mean ⁇ s.e.m.
  • FIG. 3D is a graph showing restoration of neuronal activity (weighted average firing frequency, Hz) by reverse transcriptase inhibitors measured using a multi-electrode array (MEA) with human iPS cell-derived neurons.
  • FIG. 3E (top) are representative images of cortical organoids from various treatment conditions used to measure organoid diameter. Dot plots show quantification of cortical organoid diameters from each condition.
  • n Number of cortical organoids measured. *p ⁇ 0.05, ***p ⁇ 0.001.
  • FIG. 3E shows the results of measuring the diameter of cortical organoids. Chronic treatment of cells with a reverse transcriptase inhibitor restores the size distribution to that of the control group.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of 3TC administration on sociality in MIA model mice.
  • n number of mice used for analysis. ***p ⁇ 0.001.
  • Figure 5A shows Golgi staining of prefrontal cortical neurons of 8-week-old WT (wild-type), MeCP2-KO (KO), and 3TC-treated MeCP2-KO (KO-3TC) mice. Representative images of cell bodies.
  • FIG. 5B (left) is a representative image of dendritic spines of prefrontal cortical neurons of 8-week-old WT, KO, and KO-3TC mice with Golgi staining.
  • FIG. 5B (right) shows the results of quantifying the spine density of neurons in each mouse.
  • n Number of neurons used for analysis. *p ⁇ 0.05, ***p ⁇ 0.001.
  • FIG. 6A shows control (None-CTRL), overexpressed L1-EGFP vector (L1-EGFP-CTRL), overexpressed L1-EGFP vector and added 3TC (L1-EGFP-3TC), L1 -EGFP vector overexpressed with d4T (L1-EGFP-d4T) and L1-EGFP vector overexpressed with Tenofovir disoproxil fumarate (TDF) (L1-EGFP-TDF) HEK293 A representative immunostaining image of GFP is shown (gray).
  • FIG. 6B is a graph showing the ratio of EGFP-positive cells (EGFP-positive cells/Hoechest (nuclear staining)-positive cells) in each experimental group in FIG. 6A.
  • n Number of experiments for each condition. ***p ⁇ 0.001, one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test.
  • Rett syndrome and developmental disorders such as autism spectrum disorders or psychiatric disorders such as schizophrenia, preferably Rett syndrome.
  • Patent Documents 1 to 3 exemplify methods for reducing non-LTR retrotransposons in nerve cells by treating nerve cells with a transposon-inhibiting substance. not proven in Specifically, it has been described that the amount of retrotransposon L1 DNA is higher in the brains of patients with Rett syndrome than in the brains of healthy individuals.
  • the "reverse transcription inhibitor of retrotransposon L1" in the present invention may be any substance that inhibits the production of the reverse transcription product cDNA of retrotransposon L1 in the cytoplasm of neural cells. Included are substances that inhibit L1 transcription, L1 cDNA production, translocation or function, or substances that inhibit these at the same time.
  • L1 reverse transcriptase inhibitors include antiretroviral agents used to treat HIV infection or AIDS, and can include reverse transcriptase inhibitors, which in some cases also treat hepatitis B. Thus, reverse transcriptase inhibitors inhibit the activity of reverse transcriptase, the viral DNA polymerase required for replication of HIV and other retroviruses.
  • reverse transcriptase inhibitors include nucleoside or nucleotide analog reverse transcriptase inhibitors and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors.
  • Nucleoside or nucleotide analog reverse transcriptase inhibitors are natural deoxynucleotide analogues required to synthesize viral DNA and compete with natural deoxynucleotides for incorporation into the growing viral DNA chain.
  • reverse transcriptase inhibitors unlike natural deoxynucleotide substrates, reverse transcriptase inhibitors lack the 3'-hydroxyl group on the deoxyribose moiety.
  • reverse transcriptase inhibitors having L1 reverse transcriptase inhibitory activity.
  • Nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors are exemplified by: zidovudine (also called AZT, ZDV and azidothymidine), didanosine (also called ddI), zalcitabine (also called ddC and dideoxycytidine), stavudine (also called d4T: Dai et al., BMC Biochemistry 2011, 12:18), lamivudine ( Also known as 3TC, approved to treat both HIV and hepatitis B: Dai et al., BMC Biochemistry 2011, 12:18), abacavir (also known as ABC), emtricitabine (also known as FTC), entecavir (also known as ETV) ), and tenofovir (also called TDF).
  • zidovudine also called AZT, ZDV and azidothymidine
  • didanosine also called ddI
  • zalcitabine also called ddC and dideoxy
  • nucleoside reverse transcriptase inhibitors having L1 reverse transcriptase inhibitory activity. More preferred are stavudine and lamivudine.
  • nucleoside analog reverse transcriptase inhibitors can also be used in the present invention: Epzicom (EPZ) (lamivudine + abacavir [3TC+ABC]) Tolvada (TVD) (tenofovir + emtricitabine [TDF + FTC]) Comvival (CBV) (Zidovudine + Lamivudine [AZT+3TC]) Descobay (DVY) (tenofovir alafenamide + emtricitabine [TAF + FTC]).
  • Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors block reverse transcriptase by directly binding to the enzyme.
  • Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors do not incorporate into viral DNA like nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors, but instead inhibit movement of protein domains of reverse transcriptase that are required to carry out the process of DNA synthesis. .
  • non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors examples include: Efavirenz (also called EFV; Dai et al., BMC Biochemistry 2011, 12:18), Delavirdine (also called DLV; Dai et al., BMC Biochemistry 2011, 12:18), Etravirine (also called ETR), Rilpivirine (RPV (also known as MK-1439), doravirine (also known as MK-1439).
  • Efavirenz also called EFV
  • Delavirdine also called DLV
  • Etravirine also called ETR
  • Rilpivirine Rilpivirine
  • doravirine also known as MK-1439
  • Preferred are non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors having L1 reverse transcriptase inhibitory activity. More preferred are efavirenz and delavirdine having L1 reverse transcriptase inhibitory activity. More preferred is etravirine or
  • NTP Nevirapine
  • NTP is a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor and has HIV reverse transcriptase inhibitory activity, but does not have L1 reverse transcriptase inhibitory activity (Dai et al., BMC Biochemistry 2011, 12:18), which does not fall under the pharmaceutical composition for treating developmental disorders and psychiatric disorders of the present invention.
  • CMP complera
  • the first-generation non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors NVP, EFV, and DLV have different structural formulas, but are similar in their bound state, resembling a butterfly spreading its wings. be done. It can be roughly divided into the following two types according to the connection form.
  • tight-binding inhibitor A drug that does not come off when it binds to RT, and EFV corresponds to this correspondence.
  • Tight-binding inhibitors are being investigated for use as bactericidal agents to prevent HIV infection.
  • rapid equilibrium inhibitor The drug reversibly binds to RT, and because the equilibrium is extremely biased to the side where RT and drug bind, it exhibits an anti-HIV-1 effect, but does not act as a bactericidal agent. drug.
  • NVP and DLV are of this type.
  • the second-generation nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors are diarylpyridine (DAPY) analogs with characteristic flexibility, such as torsional flexibility (wiggling) and jiggling (jiggling). ).
  • DAPY diarylpyridine
  • the reason why it does not exhibit cross-resistance with the first-generation NNRTI is that this flexibility enables binding at multiple sites even at the binding site that has been deformed after the acquisition of resistance mutations, and is thought to inhibit reverse transcriptase activity. .
  • the reverse transcriptase inhibitor includes, in addition to the substances exemplified above, for example, a prodrug with improved oral absorption, a substance that is resistant to degradation by nucleases or esterases, etc., and has a stable blood concentration in vivo for a long period of time.
  • Target diseases to be treated and/or prevented by the pharmaceutical composition of the present invention are developmental disorders such as Rett syndrome and autism spectrum disorders, and psychiatric disorders such as schizophrenia, preferably Rett syndrome.
  • developmental disorders such as Rett syndrome and autism spectrum disorders
  • psychiatric disorders such as schizophrenia, preferably Rett syndrome.
  • the present inventors have confirmed the effect of suppressing L1cDNA production. Therefore, the reverse-transcribed L1cDNA itself in the cytoplasm is regarded as a functional factor, and it is possible to treat diseases by inhibiting the production of L1cDNA. I think it will be As detailed in the Examples, in MeCP2-KO mice (Chen, RZ, Akbarian S, Very M and Jaenisch R.
  • Rett syndrome was first reported in 1966 by Andreas Rett, a pediatric neurologist in Vienna (Non-Patent Document 4). After that, many cases were reported in the 1980s, and Rett syndrome came to be recognized worldwide as a neurodevelopmental disorder that mainly affects girls.
  • the symptoms and severity of the disease vary greatly from patient to patient, and typical patients, who account for more than 80% of the disease, appear normal at first glance until about 6 months after birth, but after that, their bodies become soft, Autistic symptoms such as delay in movement such as crawling and walking, poor reaction to the outside world, and difficulty in making eye contact appear.
  • Autism spectrum disorder is a complex developmental disorder characterized by impaired social and communication skills, repetitive behavior and biased interests. ASD is thought to develop due to a combination of different genetic and environmental factors, and its pathology is extremely complex. A recent study reported that ASD affects 1 in 68 people under the age of 8 in the United States. Despite this high incidence, the pathogenesis of ASD remains largely obscure.
  • Schizophrenia is a mental illness characterized by loss of contact with reality, hallucinations, and delusions. Depending on the course of the disease, it is divided into a prodromal stage, an acute stage, a resting stage, and a recovery stage. In the acute stage, positive symptoms are conspicuous, and negative symptoms such as lethargy and doing nothing are the main symptoms, and it enters the resting stage. In addition, it has been suggested that cognitive impairment worsens in multiple stages. Although the cause is unknown, it is believed that an imbalance of neurotransmitters in the brain is involved, and treatment should be started early. tend to respond better to treatment.
  • treatment means (1) delaying the onset of developmental disorders such as Rett syndrome and autism spectrum disorders or psychiatric disorders such as schizophrenia; (2) Rett syndrome and autism spectrum disorders (3) slowing or halting the progression, exacerbation or deterioration of symptoms of developmental disorders such as Rett syndrome and psychiatric disorders such as schizophrenia; or (4) means a method or process aimed at curing a developmental disorder such as Rett syndrome and autism spectrum disorders or a psychiatric disorder such as schizophrenia. Treatment may be administered prior to the onset of the disease or condition as a prophylactic measure, or treatment may be administered after the onset of the disease.
  • prevention means preventing the onset of developmental disorders such as Rett's syndrome and autism spectrum disorders or mental disorders such as schizophrenia.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by methods known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered both parenterally and orally.
  • the composition can be injectable, nasal, pulmonary, or percutaneous administration.
  • it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • compositions such as tablets, capsules, pills, granules, powders, and syrups can be used.
  • the administration method can be appropriately selected according to the patient's age and symptoms.
  • the dosage and administration method vary depending on the patient's body weight, age, symptoms, etc., but those skilled in the art can consider these conditions and set an appropriate dosage and administration method.
  • a substance for treating and/or preventing developmental disorders such as Rett syndrome and autism spectrum disorders or psychiatric disorders such as schizophrenia is effective for developmental disorders such as Rett syndrome and autism spectrum disorders or schizophrenia. It is a preventive or therapeutic agent for mental disorders such as schizophrenia.
  • Another aspect of the present invention is a method for treating and/or preventing a developmental disorder or psychiatric disorder, comprising administering a retrotransposon L1 reverse transcription inhibitor to a subject in need of such treatment.
  • the retrotransposon L1 reverse transcriptase inhibitor is a reverse transcriptase inhibitor, more preferably the reverse transcriptase inhibitor is a nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor.
  • another aspect of the present invention provides a retrotransposon L1 reverse transcription inhibitor, preferably a reverse transcriptase inhibitor, more preferably a nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor for treating and/or preventing a developmental disorder or psychiatric disorder.
  • a retrotransposon L1 reverse transcription inhibitor preferably a reverse transcriptase inhibitor, more preferably a nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor for treating and/or preventing a developmental disorder or psychiatric disorder.
  • Still another aspect of the present invention is the use of a substance that inhibits reverse transcription of retrotransposon L1, preferably reverse transcription of retrotransposon L1, for the manufacture of a medicament for treating and/or preventing developmental disorders or psychiatric disorders.
  • the inhibitor is a reverse transcriptase inhibitor, more preferably uses wherein the reverse transcriptase inhibitor is a nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor.
  • Example 1 Effect of Reverse Transcription Inhibitor of Retrotransposon L1 on Phenotype of MeCP2-KO Mice Reverse transcription inhibitor treatment was performed as follows. MeCP2-KO mice (C57BL/6 background) were obtained from Mutant Mouse Resource & Research Centers (MMRRC) (Chen, RZ, Akbarian S, Tudor M and Jaenisch R. Nat Genet 27, 327-331 (2001)). . All animal care and procedures were performed in accordance with the guidelines of the Kyushu University Laboratory Animal Care Committee. Mice were housed on a 12 hour light/dark cycle and had free access to food and water.
  • MMRRC Mutant Mouse Resource & Research Centers
  • MeCP2-KO mice were divided into three groups: a 3TC (QA-4615, Combi-Blocks) administration group, a d4T (D3580, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) administration group and a vehicle administration group. Mice were orally dosed with 3TC (2 mg/ml), d4T (2 mg/ml) and vehicle in their drinking water from week 4 onwards. As a control, vehicle-treated MeCP2-KO mice were used. All mice were observed daily.
  • 3TC QA-4615, Combi-Blocks
  • d4T D3580, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • mice were scored as described (Guy J, Gan J, Selfridge J, Cobb S and Bird A. Science 315, 1143-1147 (2007)). Briefly, mice housed as described above were scored blindly for genotype and treatment status for six symptoms: mobility, gait, hindlimb grip, tremor, respiration, and general condition. . Each of the 6 symptoms was scored from 0 to 2. 0 corresponds to no symptoms or the same as wild type, 1 to presence of symptoms and 2 to severe symptoms. In each of the three groups of mice (vehicle 15, 3TC 10, d4T 10), 6 neurological symptom scores were summed and observed and recorded up to 10 weeks. The results are shown in FIG. A significant reduction in Rett's symptoms was observed in the 3TC and d4T administration groups.
  • Example 2 Effect of 3TC and d4T on iPS cell-derived differentiated nervous system cells Using human iPS cell-derived nervous system cells, simultaneous addition of nucleoside reverse transcriptase inhibitors 3TC and d4T was shown to ameliorate cellular dysfunction. Found it.
  • iPS cells and iPS cell-derived iPS cells obtained from Rett syndrome patients are cultured, differentiated into cortical neurons.
  • MECP2-deficient or MECP2-KO differentiated nervous system cells are cultured, differentiated into cortical neurons.
  • neurospheres neural stem cell clusters
  • NPCs neural progenitor cells
  • NG Neuronal culture (DMEM/F12, 1% Glutamax (Life Technologies), 1% N2 Neuroplex (Gemini Bio-products), 2% Gem21 NeuroPlex (Gemini Bio-products) supplemented with cell growth factors, R&D Systems) , 1% penicillin-streptomycin), and shake-cultured in a 6-well plate at 95 rpm at 37°C for 48 hours. After 48 hours, the medium was replaced with NG medium without bFGF, and the neurospheres were cultured for 2 weeks.
  • iPS cell-derived cortical organoids were differentiated as follows (Trujillo et al., Cell Stem Cell 25, 558-569 (2019)).
  • iPS cells were detached from culture dishes using 1:1 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS, Fisher Scientific) and StemPro Accutase solution, transferred to 6-well plates and kept in suspension.
  • Neural induction medium was DMEM/F12, 1% Glutamax, 1% N2 Neuroplex, 1% non-essential amino acids (Gibco), 1% penicillin-streptomycin, 1 ⁇ M Dorsomorphin (R&D Systems), and 10 ⁇ M SB431542 (SB, Stemgent).
  • Cell growth medium consisted of Neurobasal medium (Life Technologies), 2% Gem21 Neuroplex, 1% non-essential amino acids, 1% Glutamax, 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF, Peprotech), and 20 ng/mL bFGF. rice field. For maturation of neurons, cells were kept in the same medium without growth factors. Organoid results were obtained from four separate differentiation batches and combined.
  • the differentiated nervous system cells were maintained for 8 weeks after removing bFGF.
  • the main important features observed in in vitro neurons derived from MECP2-KO cells are the low number of synapses, small cell body size, and altered neuronal morphology (Marchetto et al., Cell 143 , 527-539 (2010)).
  • 3TC and d4T were added to the obtained differentiated nervous system cells.
  • a reverse transcriptase inhibitor for cultured cells was prepared as follows. Lamivudine (3TC, Sigma-Aldrich) was prepared in dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich) and 3TC was added to the medium to a final concentration of 10 ⁇ M. Stavudine (d4T, Sigma-Aldrich) was suspended in water and a final concentration of 1 ⁇ M d4T was used in combination with 3TC.
  • Lamivudine (3TC, Sigma-Aldrich) was prepared in dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich) and 3TC was added to the medium to a final concentration of 10 ⁇ M.
  • Stavudine (d4T, Sigma-Aldrich) was suspended in water and a final concentration of 1 ⁇ M d4T was used in combination with 3TC.
  • NTP Nevirapine
  • CTL Nevirapine control cells
  • MECP2-KO patient-derived iPS cells
  • CRL normal human iPS cells
  • dendrite complexity decreased.
  • MECP2-deficient neurons treated with reverse transcriptase inhibitors showed a statistically significant increase in cell body area and number of branch points, whereas NVP-treated MECP2-deficient neurons did not exhibit this recovery. I was not able to admit. The results that did not recover even after treatment with NVP were as previously reported (Dai et al., BMC Biochem 12, 18 (2011), Jones et al., PLoS One 3, 31547 (2008)).
  • IL6 expression is abnormally increased by nearly 6-fold compared to CTRL (abnormally enhanced IL6 production), whereas in MECP2-KO cells treated with a reverse transcriptase inhibitor, it is Reduced (improved) to the same level as CRTL.
  • NPCs were differentiated into three-dimensional spherical cell clusters (spheroids). NPCs used to generate spheroids were chronically treated with each condition and plated on multi-electrode array (MEA) plates, thereby measuring neural network activity. MEA plates were recorded weekly and spontaneous neural activity was analyzed after 4 weeks. Raster plots displayed spiking timestamps across multiple channels, which indicated that control spheroids exhibited more spiking and spontaneous neural activity when compared to MECP2-deficient spheroids.
  • MEA multi-electrode array
  • the weighted average firing frequency is significantly reduced only in MECP2-deficient and NVP-treated spheroids.
  • Treatment of MECP2-deficient spheroids with a reverse transcriptase inhibitor improved firing frequency to levels comparable to control levels. No difference was observed when control spheroids were treated with reverse transcriptase inhibitors.
  • the data demonstrate that the reduction in spontaneous neural activity seen in MECP2-deficient neurons is reversed with antiretroviral drug treatment (Fig. 3D).
  • RTT is often associated with the microcephaly phenotype, in which the brain does not develop properly and the head is smaller than normal.
  • 3D cortical organoids differentiated from human iPS cells exhibit spontaneous self-organizing structures resembling human neocortex and transcriptional profiles resembling mid-fetal prenatal human brain. After 56 days of the differentiation process, when the organoids matured, MECP2-deficient organoids showed a statistically significant decrease in diameter compared to control organoids, but not NVP, due to the reverse transcriptase inhibitor treatment. In addition, the size of cortical organoids recovered. No significant changes were observed when control cells were treated with reverse transcriptase inhibitors (Fig. 3E).
  • Morphological analysis of iPS cell-derived neurons was performed as follows. Cultured NPCs were lentivirally transduced with a gene containing the synapsin 1 (SYN) promoter upstream of the EGFP reporter (Nageshappa et al., Mol Psychiatry 21, 178-188 (2016)). The transduction efficiency of infection (MOI) was 2. Cells transduced with SYN::GFP lentivirus were differentiated into neurons for 5-6 weeks in culture, fixed and immunostained with GFP and CTIP2 antibodies. Tracing of differentiated neurons used a Zeiss Axio Imager 2 microscope equipped with a 40x oil objective and Neurolucida v.2017 (MBF Bioscience, Williston, VT).
  • SYN synapsin 1
  • Neurolucida Explorer v.11 MEF Bioscience, Williston, VT was used to quantify neuronal morphology and to obtain the total length of all neurites and dendrites per traced neuron.
  • Sholl analysis was performed using Neurolucida Explorer. In this analysis, we designated the center point of the soma and created a grid around it of concentric rings with radii increasing in 10 ⁇ m steps. Neuronal complexity was determined by recording the number of crossovers within each ring.
  • Cortical Organoid Diameter Cortical Organoid were imaged with an Evos FL Imagine System (ThermoFisher) at 4x magnification. Images were uploaded to Image J and the diameter of each organoid was measured by the length measurement function of the program.
  • a multi-electrode array was performed as follows. 12-well MEA plates (Axion Biosystems) were coated with 100 ⁇ g/mL poly-L-ornithine (Sigma-Aldrich) and 5 ⁇ g/mL laminin (Life Technologies). Neurospheres generated from NPCs were placed in the center of the MEA well, completely covering the electrodes. Neurospheres were plated on NG medium supplemented with 1% FBS. One week after plating, the neurospheres were replaced with a 1:1 mixture of Neurobasal medium and NG medium and medium containing 1% FBS. Two weeks after plating, the neurosphere medium was changed to neurobasal alone and remained on this medium for the rest of the recording.
  • Example 3 Effects of reverse transcription inhibitors of retrotransposon L1 on maternal immune activation (MIA)
  • MIA maternal immune activation
  • Example 3-1 Method for producing MIA model mice For 3 days from day 12, PBS or polyI:C (Sigma, P1530) dissolved in PBS was administered intraperitoneally to pregnant mice at 20 mg/kg body weight (once/day) as a control (CTRL). The male mice that were born were used as MIA mice (MIA).
  • the reverse transcriptase inhibitor 3TC was administered by dissolving 3TC in autoclave-sterilized tap water at a concentration of 2 mg/ml, and giving the mice regular drinking after weaning (4 weeks of age).
  • Example 3-2 Behavioral analysis of mice using a 3-chamber test for evaluating sociability A box with 3 chambers separated by 2 partitions was prepared. The two partitions have a doorway so that the mouse can freely come and go between the rooms. Cages large enough to accommodate mice were placed in the rooms on both sides (right and left) of the central room. However, the cage does not have an entrance and exit, and the mouse that is put into the cage cannot enter the cage.
  • Example 4 Quantification of neuronal cell body area and spine density using Golgi staining.
  • the brain was taken out and Golgi staining was performed using FD Rapid GolgiStain TM Kit (FD Neuro Technologies: PK401) according to the attached protocol. Specifically, the removed brain was rinsed in distilled water, the tissue was infiltrated with a mixed solution of solution A and solution B prepared 24 hours earlier, and stored at room temperature in the dark for 2 weeks. The permeate was changed the next day. After 2 weeks, it was transferred to solution C and stored at room temperature in a dark place for 1 week, and the penetrant was also replaced on the next day. Thereafter, the mouse brain was embedded in cryomold No.
  • a Keyence fluorescence microscope BZ-X800 was used to acquire Golgi-stained images of mouse brain specimens. Quantification of soma area of the prefrontal cortex area of each mouse using a 20x objective and spine density of dendrites of prefrontal cortical neurons of each mouse using a 100x objective. was photographed and measured using ImageJ. The results obtained are shown in FIGS. 5A and 5B, respectively. Compared with WT, KO mice had decreased cell body area and spine density, but 3TC treatment improved the phenotype.
  • Example 5 Reverse transcriptase inhibitory effect using reverse transcriptase inhibitors
  • Reverse transcriptase inhibitors 3TC, d4T and tenofovir Teenofovir disoproxil fumarate (TDF), QA-2704, Combi- Blocks
  • TDF Tufofovir disoproxil fumarate
  • QA-2704, Combi- Blocks was added to a final concentration of 20 ⁇ M, and a vector (L1-EGFP, Macia et al. Genome Res 27, 335-348 (2017)) expressing EGFP protein was introduced only into L1-activated cells.
  • immunostaining was performed using an antibody against GFP and Hoechest for staining nuclei, and the cells were photographed using a fluorescence microscope (Leica AF600) with a 10x objective lens. It was found that the ratio of EGFP-positive cells decreased by administration of a reverse transcriptase inhibitor, and it was confirmed that the inhibition of reverse transcriptase inhibits the activity of L

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Abstract

本発明は、根治療法が未だ見出されていないレット症候群（RTT）、自閉症スペクトラム障害または統合失調症を処置および／または予防するための治療を目的とする。　本発明は、レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質を含有する、レット症候群（RTT）、自閉症スペクトラム障害または統合失調症を予防または処置するための医薬組成物に関する。

Description

発達障害および精神疾患の処置および予防
　本特許出願は、日本国特許出願２０２１－０９８５８５号（２０２１年６月１４日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
　本発明は、発達障害または精神疾患を処置および／または予防するための医薬組成物、詳細にはレトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質を含有する、レット症候群および自閉症スペクトラム障害などの発達障害、または統合失調症などの精神疾患を処置および／または予防するための医薬組成物に関する。
　母体免疫活性化（MIA）、母体ストレス、母子分離ストレス（MSS）および粗悪養育行動などの早期ライフステージ（受精～若年成人期）の環境要因変化は、ライフコース中後期（成人以降）に統合失調症、自閉症スペクトラム障害、うつ、および不安障害などを含む精神・神経疾患の発症リスクを高めると言われている。その発症機序の詳細は不明であるが、早期ライフステージでの変化がライフコース中後期に異常として現れることから、エピジェネティック修飾変化の関与が考えられており、エピジェネティック修飾に関連してレトロトランスポゾンLINE1（long interspersed nucleotide elementsまたはL1）の関与が報告されている（非特許文献１）。
　レトロトランスポゾンL1プロモーターは通常、メチル化されており、メチル化DNA結合性転写抑制因子MeCP2（メチル-CpG結合タンパク質2）が結合することによって、L1の転写は抑制されている。しかし、環境要因の変化等により、L1プロモーターが脱メチル化されると、MeCP2が解離してその転写が活性化される。本発明者らは、L1 cDNAの転移は通常、生殖系以外では脳でしか見られないこと、および神経幹細胞（NSC）からニューロンへの分化過程でレトロトランスポゾンL1の発現が高いことを見出している（非特許文献２）。さらに、非特許文献２では、MeCP2欠損NSCではさらにL1の転写が亢進していること、また、DNA脱メチル化剤処理によりNSCの中のL1プロモーターが脱メチル化されると、そこへはMeCP2が結合しなくなることを明らかにしている。
　MeCP2はX染色体上に存在し、その変異は進行性精神・神経疾患であるレット症候群（Rett syndrome：RTT）の原因となる（非特許文献３）。レット症候群は、1966年にウィーンの小児神経科医Andreas Rettにより初めてその症例が報告された（非特許文献４）。その後，1980年代に多くの症例が報告されるようになり、レット症候群は主に女児に発症する神経発達障害として世界的に認知されるようになった。
　特許文献１およびそのファミリーである特許文献２および３には、神経細胞をトランスポゾン阻害物質で処理することによる神経細胞内の非LTRレトロトランスポゾン（Non-long terminal repeat (LTR) retrotransposons）を減少させる方法が記載されている。レトロトランスポゾンは、LTRレトロトランスポゾンおよび非LTRレトロトランスポゾンに大別され、後者はLINE1またはL1とも呼ばれる。これらの特許文献では、当該神経細胞は神経細胞内のレトロトランスポゾンL1によってある種の疾患状態にある神経細胞であり、当該疾患状態にある神経細胞をもつ疾患としてレット症候群が挙げられ、そして転移阻害物質として逆転写酵素阻害物質が挙げられている。しかし、逆転写酵素阻害物質によってレトロトランスポゾンL1が調節できること、そしてレット症候群を処置できることについて、具体的かつ明示的な記載はなく、実験データにより実証されていない。
WO2011-017404A2公報 US 20130315886A1公報 US 20140038896A1公報
Suarez NA, Macia A & Muotri AR. Dev Neurobiol 78, 433-455 (2018) Muotri AR, Marchetto MCN, Coufal NG, Oefner R, Yeo G, Nakashima K, Gage FH. Nature 468, 443-446 (2010). Amir, R.E., Van den Veyver, I.B., Wan, M., Tran, C.Q., Francke, U., & Zoghbi, H.Y. Nat. Genet., 23, 185-188 (1999). Rett, A. Wien. Med. Wochenschr., 116, 723-726 (1966).
　レット症候群（RTT）および自閉症スペクトラム障害などの発達障害を処置する際、主な治療法は「療育」と「生活環境の調整」であるが、対象患者における疾患・障害・症状に応じ、薬物療法が必要な場合がある。例えば、てんかん発作がある場合は、抗てんかん薬、睡眠障害、不注意、多動性、衝動性、自傷行為、興奮、攻撃性などによって生活に支障を来している場合は、睡眠導入薬、双極性障害治療薬、ADHD治療薬、抗精神病薬、また、不安、うつ、緊張などの精神症状がある場合は、抗不安薬、抗うつ薬等が処方される。しかし、いずれの薬物療法も、対症療法に過ぎず、根本的に解決できる薬物療法は常に求められている。
　また、統合失調症などの精神疾患を処置する場合、モノアミンの変化やグルタミン酸受容体の変化などに着目した薬物療法が施される。統合失調症は、その症状は大きく陽性症状、陰性症状、認知機能障害の三つに分けることができ、それぞれの症状に対応した処置が行われる。陽性症状に対しては主としてドパミン仮説に基づいた薬物が処方されるが、一定の効果が認められるものの、効果が認められない場合があり、陰性症状や認知機能障害に対しては十分な治療効果を示す薬物はない。
　この状況に鑑み、本発明は、レット症候群（RTT）および自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患を処置および／または予防するための新たな医薬組成物を目的とする。
　本発明者らは、逆転写されたL1cDNAがゲノムに挿入されることによって種々の遺伝子の発現や機能が異常になるという従来技術（特許文献１－３）では、発症は、L1cDNAがゲノムに一旦挿入されて起こるため、挿入されたL1cDNAをゲノムから取り除かない限り治療はできないと想定した。特定遺伝子をゲノムから取り除く作業は煩雑かつ高価である。そこで、本発明者らは、L1cDNA自身を機能性分子として捉え、L1cDNAの存在によって惹起される細胞の異常応答はレトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質によってL1cDNAの産生を抑制すれば軽減できると考え、鋭意研究を重ねたところ、レット症候群（RTT）および自閉症スペクトラム障害などの発達障害ならびに統合失調症などの精神疾患を、予防のみならず、処置することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
　したがって、本発明は、以下の態様を含む。
＜医薬組成物＞
［１］
　レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質（非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質ネビラピンを除く）を含有する、発達障害または精神疾患を処置および／または予防するための医薬組成物。
［２］
　レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質が、逆転写酵素阻害物質である、［１］記載の医薬組成物。
［３］
　逆転写酵素阻害物質が、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質である、［１］または［２］記載の医薬組成物。
［４］
　ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質が、ラミブジンまたはスタブジンである、［１］から［３］までのいずれか記載の医薬組成物。
［５］
　発達障害が、レット症候群である、［１］から［４］までのいずれか記載の医薬組成物。
［６］
　発達障害が、自閉症スペクトラム障害である、［１］から［４］までのいずれか記載の医薬組成物。
［７］
　精神疾患が、統合失調症である、［１］から［４］までのいずれか記載の医薬組成物。
　レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害を標的とした、レット症候群（RTT）、自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患に対する画期的な医薬組成物を提供することができる。本発明は、根治療法が未だ見出されていないレット症候群（RTT）、自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患を処置および／または予防するための治療を可能とする。
図１は、MeCP2ノックアウト（-KO）マウスにおける神経学的症状に対する3TC、d4Tおよびビークル飲水投与の経時的効果を示すグラフである。データは平均±s.e.m.として示している。KO、n = 15； KO-3TC、n = 10； KO-d4T、n = 10。n：解析に使用したノックアウトマウスの数。** p <0.01、*** p <0.001、KO vs. KO-3TC。† p <0.05、†† p <0.01、††† p <0.001、KO vs. KO-d4T。一元配置分散分析とTukey's 多重比較検定。
図２は、MeCP2-KOマウスにおける生存率に対する3TC、d4Tおよびビークル飲水投与の効果を示すグラフである。KO、n = 20； KO-3TC、n = 13； KO-d4T、n = 13。n：解析に使用したノックアウトマウスの数。* p <0.05、KO vs. KO-3TC。†† p <0.01、KO vs. KO-d4T。ログランク検定。
図３Ａ（上）は、CTRL（正常ヒトiPS細胞から誘導したニューロン）、MECP2-KO（患者由来のiPS細胞から誘導したニューロン）、逆転写酵素阻害物質3TCおよびd4T（RTi）で処理したMECP2-KO、およびネビラピン（NVP）で処理したMECP2-KO のニューロン（黒点はSoma（細胞体））の画像である。黒点の中に核があり、それぞれの条件で黒点は一つしかなく、そこからニューロンの突起が伸びている。よって、それぞれは、一つのニューロンの代表的な形態を示している。Soll解析によるニューロンの複雑性解析を図３Ａ（下）に示す。 図３Ｂは、逆転写酵素阻害物質によりMECP2-KOアストロサイトからの炎症誘発性サイトカインIL6放出異常が回復することを示すグラフである。アストロサイトの機能は、IL6発現解析の48時間前に培地にIL1βを添加することで確認した。数値は対照（CTRL）(正常ヒトiPS細胞から誘導したアストロサイト)におけるIL6の発現量を1と換算し表記した。
図３Ｃ（左）は、対照（CTRL）、MECP2-KO（KO）、逆転写酵素阻害物質で処理したMECP2-KO（KO+RTi）、およびNVPで処理したMECP2-KO（KO+NVP）ニューロンの代表的な免疫染色画像を示す（MAP2 (灰色) 、シナプシン1 (SYN1) (実線矢印)、シナプス後肥厚タンパク質95 (PSD95) (破線矢印）およびSYN1とPSD95が共局在するシナプス（太字実線開いた矢印）)。共局在シナプス斑点解析を図３C（右）に示す。各条件のニューロンにおける20μmあたりの共局在シナプス斑点を定量化した。データは平均±s.e.m.として示している。CTRL、n = 22； MECP2-KO、n = 21； MECP2-KO + 逆転写酵素阻害物質、n = 23； MECP2-KO + NVP、n = 15。n：条件ごとにトレースしたニューロンの数。* p <0.05、一元配置分散分析とTukey's 多重比較検定。 図３Ｄは、ヒトiPS細胞由来ニューロンを用い多電極アレイ (MEA) を使用して測定した、逆転写酵素阻害物質によるニューロン活動の回復 (加重平均発火頻度、Hz) を示すグラフである。 図３Ｅ（上）は、オルガノイドの直径を測定するために使用する様々な処置条件からの皮質オルガノイドの代表的な画像である。点図表プロットは、各条件からの皮質オルガノイドの直径の定量化を示している。エラーバーは、s.e.m.を示す。対照（CTRL）、n = 60； MECP2-KO、n = 60； MECP2-KO + 逆転写酵素阻害物質、n = 55； MECP2-KO + NVP、n = 60。n：測定した皮質オルガノイドの数。* p <0.05、*** p <0.001。一元配置分散分析とTukey’s多重比較検定。図３E（下）は、皮質オルガノイドの直径を測定した結果を示す図である。細胞を逆転写酵素阻害物質で慢性的に処理すると、サイズ分布が対照群のものに回復する。
図４は、MIAモデルマウスにおける社会性に対する3TC投与の効果を示すグラフである。Ctrl、n = 15； MIA、n = 8； MIA-3TC 、n = 3。n：解析に使用したマウスの数。*** p <0.001。t検定。 図５Ａ（左）は、ゴルジ染色を行った8週齢のWT（野生型）マウス、MeCP2-KO(KO)マウス、3TCを投与したMeCP2-KO(KO-3TC)マウスの前頭前皮質ニューロンの細胞体の代表的な画像である。各マウスのニューロンの細胞体の面積を定量化した結果を図５Ａ（右）に示す。WT、n = 76； KO、n = 85； KO-3TC 、n = 88。n：解析に使用したニューロンの数。*** p <0.001。一元配置分散分析とTukey's 多重比較検定。 図５Ｂ（左）は、ゴルジ染色を行った8週齢のWTマウス、KOマウス、KO-3TCマウスの前頭前皮質ニューロンの樹状突起のスパインの代表的な画像である。各マウスのニューロンのスパイン密度を定量化した結果を図５Ｂ（右）に示す。WT、n = 14； KO、n = 14； KO-3TC 、n = 14。n：解析に使用したニューロンの数。* p <0.05、*** p <0.001。一元配置分散分析とTukey's 多重比較検定。
図６Ａは、対照（None-CTRL）、L1-EGFPベクターを過剰発現させた（L1-EGFP-CTRL）、L1-EGFPベクターを過剰発現させ3TC添加をおこなった（L1-EGFP-3TC）、L1-EGFPベクターを過剰発現させd4T添加をおこなった（L1-EGFP-d4T）、およびL1-EGFPベクターを過剰発現させテノホビル（Tenofovir disoproxil fumarate（TDF））添加をおこなった（L1-EGFP-TDF）HEK293の代表的な免疫染色画像を示す（GFP(灰色))。 図６Ｂは、図６Ａにおける各実験群のEGFP陽性細胞の割合（EGFP陽性細胞/Hoechest(核染色)陽性細胞）を示すグラフである。None-CTRL、n = 3； L1-EGFP-CTRL、n = 3； L1-EGFP-3TC、n = 3； L1-EGFP-d4T、n = 3； L1-EGFP-TDF、n = 3。n：各条件の実験回数。*** p <0.001、一元配置分散分析とTukey's 多重比較検定。
　本発明はひとつの実施形態において、レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質、好ましくは逆転写酵素阻害物質、具体的にはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質、好ましくはラミブジンまたはスタブジンを含有する、レット症候群（RTT）および自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患、好ましくはレット症候群を処置および／または予防するための医薬組成物を提供する。
　本発明者らは、神経系細胞におけるレトロトランスポゾンL1cDNAの産生を抑制すれば、レット症候群および自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患を、予防のみならず、処置することが可能であることを見出した。上記の通り、特許文献１－３には、神経細胞をトランスポゾン阻害物質で処理することによる神経細胞内の非LTRレトロトランスポゾンを減少させる方法が例示されているが、具体的な根拠となる実験データで実証されていない。具体的には、レット症候群の患者脳においてレトロトランスポゾンL1 DNA量が健常人脳と比較して多いことが記載されている。しかし、これは、レトロトランスポゾンL1が転移した、すなわちゲノムDNAに組み込まれた状態のL1のcDNA数が多いことを示しており、細胞質におけるL1のcDNA数、すなわち逆転写量自体が多いことを示しているわけではない。この点は、例えばFIG.2において、ここではL1の転移が起こった場合にのみEGFP（蛍光タンパク質）が発現されるように細工されたトランスジェニックマウスでの結果が示され、MeCP2KOマウスにおいて脳の様々な部位でEGFPを発現する細胞が多いことより、多くの転移が起こっている、つまりゲノムに組み込まれたL1の数が多いことが示されていることから、明らかである。
　さらには、特許文献１－３およびこれまでの報告では、レトロトランスポゾンL1cDNAがゲノムの中に挿入され、それが遺伝子機能を破壊することでRTT等の神経系疾患を発症させると考えられている。この機序から、一旦発症してしまった場合、遺伝子は既に機能が壊されているため、特許文献１－３に記載されているトランスポゾン阻害物質などでは、予防はできても、処置することは不可能である。他方、本発明者は、細胞質における逆転写されたL1cDNA自体を機能性因子として捉え、レトロトランスポゾンL1cDNA産生の抑制効果が、L1cDNAの存在によって惹起される細胞の異常応答、すなわちレット症候群（RTT）および自閉症スペクトラム障害などの発達障害ならびに統合失調症などの精神疾患を処置できると考えた。レトロトランスポゾンL1cDNA産生の抑制効果は、レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質によって得ることができる。
　本発明における「レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質」は、上記の通り、神経系細胞の細胞質におけるレトロトランスポゾンL1の逆転写産物cDNAの産生を阻害する物質であれば、何でもよく、例えば、レトロトランスポゾンL1の転写、L1cDNAの産生、転移若しくは機能を阻害する物質、またはこれらを同時に阻害する物質が含まれる。L1逆転写阻害物質には、HIV感染症またはAIDSの治療に使用される抗レトロウイルス薬が含まれ、場合によってはB型肝炎も処置する逆転写酵素阻害物質を挙げることができる。すなわち、逆転写酵素阻害物質は、HIVおよびその他のレトロウイルスの複製に必要なウイルスDNAポリメラーゼである逆転写酵素の活性を阻害するものである。
　本発明において、逆転写酵素阻害物質には、ヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログ逆転写酵素阻害薬、および非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質が包含される。
　ヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログ逆転写酵素阻害物質は、ウイルスDNAを合成するために必要な天然のデオキシヌクレオチドアナログであり、成長中のウイルスDNA鎖への取り込みについて、天然のデオキシヌクレオチドと競合する。しかし、天然のデオキシヌクレオチド基質とは異なり、逆転写酵素阻害物質にはデオキシリボース部分に3'-ヒドロキシル基が無い。結果として、逆転写酵素阻害物質の取り込み後、次のデオキシヌクレオチドはDNA鎖を延長するために必要な次の5'-3'ホスホジエステル結合を形成できない。したがって、逆転写酵素阻害物質が組み込まれると、ウイルスDNA合成が停止する。好ましくは、L1逆転写酵素阻害活性を有する逆転写酵素阻害物質である。
　ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質として、以下が例示される：
ジドブジン（AZT、ZDVおよびアジドチミジンとも呼ばれる）、ジダノシン（ddIとも呼ばれる）、ザルシタビン（ddCおよびジデオキシシチジンとも呼ばれる）、スタブジン（d4Tとも呼ばれる：Dai et al., BMC Biochemistry 2011, 12:18）、ラミブジン（3TCとも呼ばれ、HIVとB型肝炎の両方の治療に承認：Dai et al., BMC Biochemistry 2011, 12:18）、アバカビル（ABCとも呼ばれる）、エムトリシタビン（FTCとも呼ばれる）、エンテカビル（ETVとも呼ばれる）、およびテノホビル（TDFとも呼ばれる）。好ましくは、L1逆転写酵素阻害活性を有するヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質である。より好ましくは、スタブジンおよびラミブジンが挙げられる。また、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質の合剤も、本発明に使用することができる：
エプジコム（EPZ）（ラミブジン+アバカビル [3TC+ABC]）
トルバダ（TVD）（テノホビル+エムトリシタビン [TDF+FTC]）
コンビバル（CBV）（ジドブジン+ラミブジン [AZT+3TC]）
デスコバイ（DVY）（テノホビル アラフェンアミド+エムトリシタビン [TAF+FTC]）。
　非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質は、酵素に直接結合することにより逆転写酵素をブロックする。非ヌクレオシド逆転写酵素阻害物質はヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質のようにウイルスDNAに組み込まれないが、代わりにDNA合成のプロセスを実行するために必要な逆転写酵素のタンパク質ドメインの動きを抑制する。
　非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質として、以下が例示される：
エファビレンツ（EFVとも呼ばれる；Dai et al., BMC Biochemistry 2011, 12:18）、デラビルジン（DLVとも呼ばれる；Dai et al., BMC Biochemistry 2011, 12:18）、エトラビリン（ETRとも呼ばれる）、リルピビリン（RPVとも呼ばれる）、ドラビリン （MK-1439とも呼ばれる）。好ましくは、L1逆転写酵素阻害活性を有する非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質である。より好ましくは、L1逆転写酵素阻害活性を有するエファビレンツおよびデラビルジンが挙げられる。さらに好ましくは、エトラビリンまたはリルピビリンである。ネビラピン（NVP）は非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質でありHIV逆転写酵素阻害活性を有しているが、L1逆転写酵素阻害活性を有していないため（Dai et al., BMC Biochemistry 2011, 12:18）、本発明の発達障害および精神疾患を治療する医薬組成物には当たらない。
　また、以下の合剤も、本発明に使用できる：
complera（CMP）（リルピビリン+テノホビル+エムトリシタビン [RPV+TDF+FTC]）
　第1世代非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質であるNVP、EFVおよびDLVは、互いに化合物の構造式は異なっているが、結合した状態では類似し、蝶がはねを広げたような形にたとえられる。結合形式から大きく次の2つのタイプに分けることが出来る。
tight-binding inhibitor：薬剤がRTに結合すると外れない薬剤であり、EFVがこの対応に該当する。Tight-binding inhibitorは、HIVの感染予防に用いる殺菌剤としての使用が検討されている。
rapid equilibrium inhibitor：薬剤は可逆的にRTに結合しており、RTと薬剤が結合している側に極端に平衡が偏っているために抗HIV-1効果を呈するが、殺菌剤としては作用しない薬剤である。NVPとDLVがこのタイプになる。
　第2世代非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質であるETRおよびRPVは、ジアリールピリジン（DAPY）アナログであり、ねじれによる柔軟性（wiggling）と揺れによる再配置（jiggling）といった特徴的な柔軟性（flexibility）をもつ構造を有する。第1世代NNRTIと交差耐性を示さない理由として、この柔軟性があることで耐性変異獲得後の変形した結合部位にも複数箇所の結合が可能となり、逆転写酵素活性を阻害すると考えられている。
　本発明において、逆転写酵素阻害物質には、上記例示した物質に加え、例えば経口吸収性が改善されているプロドラッグ、ヌクレアーゼまたはエステラーゼ等により分解されにくく、生体内において長時間安定した血中濃度を維持する改変体、耐性株に奏功する新たな化合物等、およびこれらの合剤も、神経系細胞の細胞質におけるレトロトランスポゾンL1の逆転写産物cDNAの産生を阻害する限り、本発明の「レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質」に包含される。
　本発明の医薬組成物が処置および／または予防する対象疾患は、レット症候群および自閉症スペクトラム障害などの発達障害、ならびに統合失調症などの精神疾患、好ましくはレット症候群である。上記の通り、本発明者は、L1cDNA産生の抑制効果を確かめたことから、細胞質における逆転写されたL1cDNA自体を機能性因子と捉え、L1cDNAの産生を阻害することで、疾患の処置が可能となると考えている。実施例において詳述する通り、レット症候群のモデルマウスとして知られているMeCP2-KOマウス(Chen, RZ, Akbarian S, Tudor M and Jaenisch R. Nat Genet 27, 327-331 (2001))において、HIV治療薬として臨床的に利用されている逆転写酵素阻害薬3TCおよびd4Tが、レット症候群の典型的な症状を明らかに軽減し、またそれらの処置マウスにおける生存率が格段に上がることが証明された。MeCP2-KOマウスではL1の転写が亢進しており（非特許文献２）、そのためレット症候群症状を呈するところ、本実施例において、逆転写酵素阻害物質がL1の逆転写を阻害し、それによりレット症候群の典型的な症状を明らかに軽減したと考えることができる。
　自閉症スペクトラム障害（ASD）の患者から採取された末梢血由来の白血球では、L1のメチル化が低下し、その転写量も高いこと（Tangsuwansri C, et al., PLoS One 13, e0201071 (2018)、Shpyleva S, et al. Mol Neurobiol 55, 1740-1749 (2017)）、および発達障害であるASD患者でもL1の発現亢進が認められること（Suarez et al., Dev Neurobiol 434-455（2018））が報告され、これらは、L1がASDの症状と関連していることを示している。また、ASD患者の脳でもL1の転移が多く、おそらくは転写も高いと思われる。これらのことから、レット症候群と同様、本発明にかかるレトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質は、ASDを処置および／または予防することができると考えられる。
　統合失調症患者の死後脳において、L1cDNAの転移が増加していることが報告されている（Bundo M, et al., Neuron 81, 306-313 (2014)）。また、ASDや統合失調症のモデルマウス作製には、polyI:Cを母マウスに投与するところ、この母マウスから生まれた子マウスでもL1の転写亢進がみられるとの報告がある（Bundo M, et al., Neuron 81, 306-313 (2014)）。これらのことから、レット症候群と同様、本発明にかかるレトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質は、統合失調症を処置および／または予防することができると考えられる。
　レット症候群（Rett syndrome：RTT）は、1966年にウィーンの小児神経科医Andreas Rettにより初めて症例が報告された（非特許文献４）。その後、1980年代に多くの症例が報告されるようになり、レット症候群は主に女児に発症する神経発達障害として世界的に認知されるようになった。症状や病気の程度には患者ごとに大きな幅があり、病気の約8割以上を占める典型的な患者は、生後6か月くらいまでは一見正常に見えるが、それ以降に、体が柔らかい、四つ這いや歩行などの運動の遅れ、外界への反応が乏しい、視線が合いにくいなどの自閉症状が出る。必ず出る症状ではないが、頻度の高い症状として、けいれん、呼吸の異常、頭囲の発育の伸びが鈍くなるなどの症状が現れる指定難病（156）である（https://www.mhlw.go.jp/file/05-Shingikai-10601000-Daijinkanboukouseikagakuka-Kouseikagakuka/0000084170.pdf）。
　自閉症スペクトラム障害は、社会性・コミュニケーション能力の障害，繰り返し行動や偏った興味などにより特徴づけられる複雑な発達障害である。ASDは異なる遺伝的・環境的要因の組み合わせで発症すると考えられており、その病態はきわめて複雑である。最新の研究により、アメリカにおけるASDの発症頻度は8歳以下で68人に1人と報告されている。このように高頻度な発症率にも関わらず、依然としてASDの発症病態は大部分が不明瞭である。
　統合失調症は、現実との接触の喪失、幻覚、妄想などによって特徴づけられる精神疾患である。病気の経過によって前駆期、急性期、休息期、回復期に分けられ、急性期には陽性症状が目立ち、無気力で何もしなくなるなどの陰性症状が中心となり休息期に入る。また、複数の段階で認知機能障害が悪化することが示唆されている、原因は不明であるが、脳内で神経伝達物質のバランスが崩れることが関与すると考えられており、早期に治療を開始すれば治療により良く反応する傾向がある。
　本発明において、「処置」とは、 (１) レット症候群および自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患の発症を遅延させる； (２) レット症候群および自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患の症状の進行、増悪または悪化を減速または停止させる； (３) レット症候群および自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患の症状の寛解をもたらす；あるいは (４) レット症候群および自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患を治癒させることを目的とする方法またはプロセスを意味する。処置は、予防的措置として疾患または状態の発症前に施してもよいし、あるいは、処置は、疾患の発症後に施してもよい。
　本発明において、「予防」とは、レット症候群および自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患の発症を事前に防ぐことを意味する。
　本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。本発明の医薬組成物は、非経口投与および経口投与のいずれによっても投与することができる。非経口投与の場合、例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。経口投与の場合、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の組成物とすることができる。
　投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。投与量および投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量および投与方法を設定することが可能である。
　レット症候群および自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患を処置および／または予防するための物質は、効果的なレット症候群および自閉症スペクトラム障害などの発達障害または統合失調症などの精神疾患の予防剤または治療剤となる。
　本発明は別の態様として、発達障害または精神疾患を処置および／または予防するための方法であって、レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質を、そのような処置等を必要としている対象に投与することを含む方法、好ましくは、レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質が逆転写酵素阻害物質である方法、より好ましくは、逆転写酵素阻害物質がヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質である方法に関する。
　さらに、本発明は別の態様として、発達障害または精神疾患を処置および／または予防するためのレトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質、好ましくは逆転写酵素阻害物質、より好ましくはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質に関する。
　本発明はさらなる別の態様として、発達障害または精神疾患を処置および／または予防するための医薬を製造するための、レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質の使用、好ましくは、レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質が逆転写酵素阻害物質である使用、より好ましくは、逆転写酵素阻害物質がヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質である使用に関する。
　以下、本発明を参考例および実施例により、詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでなく、単なる例示であることに留意すべきである。
実施例１
MeCP2-KOマウスの表現型に対するレトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質の効果
　逆転写阻害物質処置は、次のように行った。
　MeCP2-KOマウス(C57BL/6バックグラウンド)は、Mutant Mouse Resource & Research Centers（MMRRC）から入手した(Chen, RZ, Akbarian S, Tudor M and Jaenisch R. Nat Genet 27, 327-331 (2001))。動物の飼育と処置のすべては、九州大学の実験動物管理委員会のガイドラインに従って実施した。
　マウスを12時間の明/暗サイクルで飼育し、餌と水は自由に摂取させた。MeCP2-KOマウスを3TC（QA-4615、Combi-Blocks）投与群、d4T（D3580、Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.）投与群およびビークル投与群の3群に分けた。マウスには、4週間目から飲料水中、3TC（2 mg/ml）、d4T（2 mg/ml）およびビークルをそれぞれ経口的に投与した。対照として、ビークル投与のMeCP2-KOマウスを使用した。すべてのマウスを毎日観察した。
　症状のスコア化は、次のように行った。
　マウスの神経学的症状は、文献に記載されているようにして記録した(Guy J, Gan J, Selfridge J, Cobb S and Bird A. Science 315, 1143-1147 (2007))。簡単には、上記のようにして飼育したマウスに関し、可動性、歩行、後肢の握り、振戦、呼吸、および全身状態の6つの症状について、遺伝子型および治療状態を盲検的にスコア化した。6つの症状のそれぞれについて、0から2まででスコア化した。0は、症状がないか、または野生型と同じであり、1は症状が存在し、2は症状が重度であることに対応する。
　3群それぞれのマウス（ビークル・15匹、3TC・10匹、d4T・10匹）において、6つの神経学的症状のスコアを合計し、それを10週まで観察し、記録した。結果を図１に示す。3TCおよびd4T投与群において、有意なレット症状の軽減が見られた。
　次に、各群のマウス（ビークル・20匹、3TC・13匹、d4T・13匹）の生存率を調べた。結果を図２に示す。3TCおよびd4T投与群において、有意な延命効果が見られた。
実施例２
iPS細胞由来の分化神経系細胞における3TCおよびd4Tの効果
　ヒトiPS細胞由来の神経系細胞を使用し、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質3TCおよびd4Tを同時添加すると、細胞の機能障害を改善することを見出した。
　詳細には、正常ヒトiPS細胞およびレット症候群患者から入手したiPS細胞由来（MECP2遺伝子が不活性化されているため、以下、MECP2欠損あるいはMECP2-KOと称する）の分化神経系細胞を培養し、皮質ニューロンに分化させた。ニューロスフェア (神経幹細胞塊) に分化させるため、StemPro Accutase (Life Technologies) を使用してNPC（神経前駆細胞）をプレートから剥がした後に、300～500万個の細胞を、bFGF (塩基性線維芽細胞成長因子、R＆D Systems) を添加した神経培養（NG）培地（DMEM/F12、1% Glutamax（Life Technologies）、1% N2 Neuroplex（Gemini Bio-products）、2% Gem21 NeuroPlex (Gemini Bio-products) 、1% ペニシリン-ストレプトマイシン）に懸濁し、6ウェルプレート内にて、95rpm、37℃、48時間、振盪培養した。48時間後にbFGFを除いたNG培地に交換し、ニューロスフェアを2週間培養した。iPS細胞由来の皮質オルガノイドは次のように分化させた (Trujillo et al., Cell Stem Cell 25, 558-569 (2019)) 。培養したiPS細胞を、1:1のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS、Fisher Scientific) とStemPro Accutase溶液を使用して培養皿から分離し、6ウェルプレートに移し、懸濁状態を保った。神経誘導培地は、DMEM/F12、1% Glutamax、1% N2 Neuroplex、1% 非必須アミノ酸 (Gibco) 、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、1μMのドルソモルフィン (R＆D Systems) 、および10μM SB431542 (SB、Stemgent) で構成されていた。細胞増殖培地は、Neurobasal培地 (Life Technologies) 、2% Gem21 Neuroplex、1% 非必須アミノ酸、1% Glutamax、20 ng/mL上皮成長因子 (EGF、Peprotech) 、および20 ng/mL bFGFで構成されていた。ニューロンの成熟には、成長因子を除いた同じ培地にて細胞を保持した。オルガノイドの結果は、4つの別々の分化バッチからオルガノイドの結果を入手し、それを組み合わせた。
　分化した神経系細胞を、bFGFを除去後、8週間維持した。MECP2-KO細胞に由来するin vitroニューロンに見られる主な重要な特徴は、シナプスの数が少なく、細胞体のサイズが小さく、ニューロンの形態が変化することである (Marchetto et al., Cell 143, 527-539 (2010))。
　次に、得られた分化神経系細胞に3TCおよびd4Tを添加した。培養細胞用の逆転写酵素阻害物質は次のようにして準備した。ラミブジン (3TC、Sigma-Aldrich) をジメチルスルホキシド (DMSO、Sigma Aldrich) で調製し、培地には、終濃度10μMになるように3TCを添加した。スタブジン (d4T、Sigma-Aldrich) は水に懸濁し、終濃度1μMのd4Tを、3TCと組み合わせて使用した。非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質でありHIV逆転写酵素阻害活性を有しているが、Dai et al., BMC Biochemistry 2011, 12:18においてL1逆転写酵素阻害活性を有していないことが示されていたネビラピン（NVP） (Sigma Aldrich、SML0097) はDMSOに懸濁し、終濃度400 nMのネビラピンを使用した。ネビラピンは対照の細胞（CTRL）には、ビヒクル対照として、10μMのDMSOが含まれていた。得られた結果を図３Ａに示す。
　患者由来のiPS細胞から誘導したニューロン（MECP2-KO）、すなわちMECP2欠損ニューロンは、正常ヒトiPS細胞から誘導したニューロン（CTRL）と比較して樹状突起の長さおよび分岐点の数が減少し、樹状突起の複雑さが減少した。これに対して、逆転写酵素阻害物質で処理したMECP2欠損ニューロンでは、細胞体の面積と分岐点の数が統計的に有意に増加したのに対し、NVPで処理したMECP2欠損ニューロンではこの回復が認められなかった。NVPで処理しても回復しなかった結果は、既報（Dai et al., BMC Biochem 12, 18 (2011)、 Jones et al., PLoS One 3, 31547 (2008）)の通りであった。逆転写酵素阻害物質処理が対照細胞に影響を及ぼしているかどうかを評価するために、それらを慢性的に処理し、形態計測分析を行った。結果、対照細胞を逆転写酵素阻害物質で処理した場合、違いが認められず、これは、これらの抗レトロウイルス薬は対照ニューロンには影響を与えず、RTTの表現型を改善することを示唆している（図３A）。
　Soll解析（ショール解析）により、様々な条件における樹状突起の複雑さの違いを調査した。対照ニューロンは、MECP2欠損ニューロン（MECP2-KO）と比較すると有意に複雑である。MECP2欠損ニューロン（MECP2-KO）を逆転写酵素阻害物質で処理した場合、それにより、樹状突起の長さ、分岐点の数、細胞体の面積、およびニューロンの複雑さが回復した。これは、逆転写酵素阻害物質が、MECP2欠損細胞におけるニューロン形態と複雑さの異常を改善できることを示している。さらに、逆転写酵素阻害物質で処理したMECP2欠損ニューロンは、逆転写酵素阻害物質による処理のない場合と比較して、シナプスが形成されていることを示す共局在シナプス斑点 (co-localized puncta) が有意に増加したが、このことは、NVPで処理したMECP2欠損ニューロンでは見られない。逆転写酵素阻害物質で処理した対照細胞では、共局在斑点の増加は観察されなかった（図３C）。
　次に、炎症誘発性サイトカインIL6が異常放出しているMECP2-KOアストロサイトに対し、逆転写酵素阻害物質がそのIL6産生能に影響を与えるか調べた。正常ヒトiPS細胞から誘導した対照細胞であるCTRL、MECP2欠損ニューロン（MECP2-KO）およびを逆転写酵素阻害物質で処理したMECP2欠損ニューロン（MECP2-KO）に対し、アストロサイトからIL6産生を誘導することが知られているIL1βを添加48時間後に、IL6の発現量を測定し、比較した。結果を図３Ｂに示す。MECP2-KO細胞においては、CTRLに比べて6倍近く異常にIL6の発現が上昇する（IL6産生能の異常亢進）のに比べ、逆転写酵素阻害剤で処置したMECP2-KO細胞では、それがCRTLと同じレベルにまで低下（改善）した。
　形態およびシナプス形成で観察された変化が神経接続の改善につながるかどうかを完全に理解するため、より複雑な細胞モデルを利用して解析を行った。NPCを3次元の球状細胞塊（スフェロイド）に分化させた。スフェロイドを生成するために使用したNPCを、それぞれの条件で慢性的に処理し、多電極アレイ (MEA) 平板にプレートし、それによりニューラルネットワーク活動を測定した。MEA平板を毎週記録し、4週間後に自発的神経活動を分析した。ラスタープロットは、複数のチャネルにわたるスパイクのタイムスタンプを表示し、これは、MECP2欠損スフェロイドと比較した場合、対照スフェロイドがより多くのスパイクと自発的な神経活動を示すことを示した。したがって、加重平均発火頻度は、MECP2欠損スフェロイドおよびNVP処理スフェロイドにおいてのみ有意に減少する。MECP2欠損スフェロイドを逆転写酵素阻害物質で処理すると、対照レベルに匹敵するレベルまで発火頻度を改善した。対照スフェロイドを逆転写酵素阻害物質で処理した場合、違いは観察されなかった。総合すると、このデータは、MECP2欠損ニューロンで見られる自発的な神経活動の減少が、抗レトロウイルス薬処置で回復することを示している（図３D）。
　RTTはしばしば小頭症の表現型と関連しており、その表現型は、脳が適切に発達せず、通常の頭よりも小さくなる。そこで、この3次元モデルで、患者で観察される小頭症の表現型を模倣できるかどうかを調べた。ヒトiPS細胞から分化された3次元皮質オルガノイドは、ヒト新皮質に類似している自発的な自己組織化構造と、胎児中期の出生前のヒト脳に類似した転写プロファイルを示す。分化プロセスの56日後、そのオルガノイドが成熟すると、MECP2欠損オルガノイドは、対照オルガノイドと比較して統計的に有意な直径の減少を示したが、上記逆転写酵素阻害物質処理により、NVPでは見られなかった、皮質オルガノイドのサイズが回復した。対照細胞を逆転写酵素阻害物質で処理した場合、有意な変化は観察されなかった（図３E）。
　iPS細胞由来ニューロンの形態分析は、次のようにして行った。
　培養NPCについて、EGFPレポーターの上流にシナプシン1(SYN)プロモーターを含む遺伝子をレンチウイルスを用いて形質導入した(Nageshappa et al., Mol Psychiatry 21, 178-188 (2016))。形質導入の感染効率 (MOI) は2とした。SYN::GFPレンチウイルスで形質導入した細胞を、5～6週間の培養でニューロンに分化させ、固定し、GFPおよびCTIP2抗体で免疫染色した。分化したニューロンのトレーシングには、40倍のオイル対物レンズを装着したZeiss Axio Imager 2 顕微鏡とNeurolucida v.2017 (MBF Bioscience、Williston、VT) を使用した。この分析は、GFPおよびCTIP2の両方が陽性であるニューロンのみについて行った。Neurolucida Explorer v.11 (MBF Bioscience、Williston、VT) を使用してニューロンの形態を定量化し、トレースされたニューロンごとのすべての神経突起と樹状突起の長さの合計値を得た。Neurolucida Explorerを利用し、ショール解析を行った。この解析では、細胞体の中心点を指定し、半径が10 μm刻みで増加する同心リングのグリッドをその周りに作成した。ニューロンの複雑さは、各リング内の交差の数を記録することによって決定した。
　シナプス斑点の定量化は、次のようにして行った。
　5～6週齢のニューロンを固定し、次のマーカーで染色した: SYN1、シナプス後肥厚タンパク質95 (PSD-95) 、および樹状突起マーカー (MAP2) 。蛍光顕微鏡 (Z1 Axio Observer Apotome Zeiss) を使用し、焦点距離を変えて撮影したZスタック画像をコンパイルすることにより、スライドを画像化した。共局在化したSYN1 (シナプス前) およびPSD-95 (シナプス後) を、コンパイルされたZスタック画像を使用して定量化した。この分析には、MAP2-陽性神経突起の近くにある共局在斑点のみを用いた。
皮質オルガノイド直径の測定
　皮質オルガノイドを、4倍の倍率のEvos FL Imagine System (ThermoFisher) で画像化した。画像は、Image Jにアップロードし、各オルガノイドの直径を、プログラムの長さ測定機能によって測定した。
　多電極アレイ(MEA) は、次のようにして行った。
　12ウェルMEA平板 (Axion Biosystems) を、100 μg/mLのポリ-L-オルニチン (Sigma-Aldrich) と5 μg/mLのラミニン (Life Technologies) でコーティングした。NPCから生成されるニューロスフェアをMEAウェルの中央に配置し、電極を完全に覆った。ニューロスフェアを、1%FBSを添加したNG培地にプレートした。プレートの1週間後、ニューロスフェアをNeurobasal培地とNG培地を1:1で混合し、1% FBSを含む培地に交換した。プレートの2週間後、ニューロスフェア培地をニューロベーサルのみに変更し、残りの記録のため、この培地に保持した。培地は週に2回交換し、記録は、培地を交換した1日後に測定した。記録は、Maestro MEAシステムとAxISソフトウェア (Axion Biosystems) を使用して週に1回行った。10Hzおよび2.5kHzのカットオフ周波数のバンド-パスフィルターを使用し、スパイク検出器の閾値を、標準偏差の5.5倍に設定した。記録ごとに、記録前に平板をMaestroに3分間そのままにしてから記録し、その後、3分間のデータを記録した。分析には、Axion Biosystems Neural MetricsToolを使用した。活性化電極を検出するための基準は、毎分5スパイクに設定し、バースト電極を検出するための基準は、毎分5バーストに設定した。
定量化と統計分析は、次のようにして行った。
　技術的な繰り返しにより、標準誤差を決定した。各図には、Nを表示している。データの整理には、標準のスプレッドシートソフトウェア (Microsoft Excelバージョン15.33) を使用した。図のエラーバーは、GraphPad Prism v6 (Graphpad Software Inc) を用いて計算した平均の標準誤差(S.E.M)である。t検定分析では、α=0.05の両側の対応のない検定（two-tailed unpaired tests）を使用した。多重比較の場合、有意差は、Tukeyの多重比較検定を用いてANOVAにより決定した。α=0.05のGrabb検定で、外れ値の判定を行い、有意な値は、解析から除外した。
実施例３
母体免疫活性化（maternal immune activation：MIA）に対するレトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質の効果
実施例３－１：MIAモデルマウスの作製方法
　妊娠マウス(C57BL/6NCrl)のプラグ確認日を0日とし、12日目から3日間、対照 (CTRL)としてPBSまたはPBSに溶解したpolyI:C (Sigma, P1530)を 20 mg/kg体重（1回/日）となるよう妊娠マウスの腹腔内に注射器で投与し、産まれてきたオスマウスをMIAマウス（MIA）として使用した。逆転写酵素阻害物質3TCの投与は、高圧蒸気滅菌をした水道水に3TCを2mg/mlの濃度で溶解し、離乳後（4週齢）からマウスに常飲させた。
実施例３－２：社会性を評価する3チャンバーテストを用いたマウスの行動解析
　2枚の仕切りで区切られた3部屋の箱を用意した。2枚の仕切りは、マウスが自由に部屋を行き来できるように出入り口が設けられている。中央の部屋の両サイド（右側と左側）の部屋にはマウスを収納できる大きさのケージをそれぞれ置いた。ただし、ケージには出入り口はなく、入れられたマウスはケージの中に入れない。
　まず、第1セッションとして、中央の部屋にテストを行うテストマウスとして、対照（CTRL）マウス、MIAモデルマウスおよび3TCを投与したMIAモデルマウスを置き、それぞれ、5分間自由に移動させ環境に慣らし、その後テストマウスを元の飼育していたケージに戻した。第2セッションとして、箱の右側のケージにテストマウスと同じ月齢のオスマウス（Social target）を入れ、箱の左側のケージは空（Empty）のままにした。5分後、中央の部屋にテストマウスを放し、10分間自由に行動させ、ビデオ解析プログラムにより、それぞれのケージへの接近時間を測定した。通常、マウスは新規のマウスに対して興味を示すため、正常なマウスはテストマウスと同じ月齢のオスマウスを入れた右側のケージへの接近時間が長くなる。得られた結果を図４に示す。MIAモデルマウスでは社会性に異常を示すが、3TCの投与により社会性が改善した。
実施例４
ゴルジ染色を用いたニューロンの細胞体の面積とスパイン密度の定量化
　まず8週齢のWT（野生型）マウス、MeCP2-KO(KO)マウス、3TCを投与したMeCP2-KO(KO-3TC)から脳を取り出しFD Rapid GolgiStainTM Kit (FD Neuro Technologies: PK401)を使用して添付のプロトコールに従って、ゴルジ染色を行なった。
　具体的には、取り出した脳を蒸留水中でリンスし、24時間前に調製した溶液Aと溶液Bの混合溶液に組織を浸潤し、室温・暗所で2週間保存した。翌日に浸透液を交換した。2週間後、溶液Cに移し、室温・暗所で1週間保管し、浸透液も翌日に交換した。その後、マウス脳を、凍結組織切片作製用包埋剤TFM（ファルマ:303-100-1）を用いて、凍結切片作製用包埋皿クリオモルド３号（三商: 83-2254）に包埋し、-80℃にて凍結させた。凍結させた試料はLeica CM 1900 cryostatを用いて-22℃で100 μmの厚さの切片を作製し、溶液Cが滴下されたゼラチンコーティング顕微鏡スライドにマウントした。切片作製後、室温で自然乾燥させた。切片を蒸留水にて各4分ずつ2回リンスし、その後、溶液D：溶液E：蒸留水＝１：１：２の混合液に移し、10分間浸漬した。蒸留水で各4分ずつ２回リンスし、50%、75%及び95%エタノールで4分ずつ、切片を脱水した。その後、無水エタノールで各4分ずつ4回脱水し、キシレンで各4分ずつ3回透徹後、Permount（ファルマ: SP15-100-1）で切片を封入し標本を作製した。
　マウス脳標本のゴルジ染色画像取得には、キーエンス蛍光顕微鏡BZ-X800を使用した。細胞体面積の定量化は20倍の対物レンズを用いて各マウスの前頭前皮質の領域を、スパイン密度の定量化は100倍の対物レンズを用いて各マウスの前頭前皮質ニューロンの樹状突起を撮影し、Image Jを用いて測定した。得られた結果をそれぞれ、図５Ａおよび図５Ｂに示す。WTと比較しKOマウスでは細胞体の面積とスパイン密度の減少が観察されたが、3TCを投与することでその表現型が改善した。
実施例５
逆転写酵素阻害物質を用いた逆転写酵素の阻害効果
　ヒト胎児腎細胞由来の細胞株（HEK293）に逆転写酵素阻害物質3TC、d4Tおよびテノホビル（Tenofovir disoproxil fumarate（TDF）、QA-2704、Combi-Blocks）を終濃度20μMになるように添加し、L1が活性化した細胞だけがEGFPタンパク質を発現するベクター（L1-EGFP, Macia et al. Genome Res 27, 335-348 (2017)）を導入した。4日間培養後、GFPに対する抗体と核を染色するHoechestを用いて免疫染色を行い、蛍光顕微鏡（Leica AF600）を用い10倍の対物レンズを使用して撮影した。逆転写酵素阻害物質の投与によりEGFP陽性細胞の割合が減少することがわかり、逆転写酵素の阻害により、L1の活性が阻害されることが確認できた。

Claims (7)

  1. 　レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質（非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害物質ネビラピンを除く）を含有する、発達障害または精神疾患を処置および／または予防するための医薬組成物。
  2. 　レトロトランスポゾンL1の逆転写阻害物質が、逆転写酵素阻害物質である、請求項１記載の医薬組成物。
  3. 　逆転写酵素阻害物質が、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質である、請求項１または２記載の医薬組成物。
  4. 　ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害物質が、ラミブジンまたはスタブジンである、請求項１から３までのいずれか記載の医薬組成物。
  5. 　発達障害が、レット症候群である、請求項１から４までのいずれか記載の医薬組成物。
  6. 　発達障害が、自閉症スペクトラム障害である、請求項１から４までのいずれか記載の医薬組成物。
  7. 　精神疾患が、統合失調症である、請求項１から４までのいずれか記載の医薬組成物。
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