WO2022254316A1 - 皮膚外用治療關節退化及骨質疏鬆症的天然提取物與方法 - Google Patents

皮膚外用治療關節退化及骨質疏鬆症的天然提取物與方法 Download PDF

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Definitions

  • Single chemical composition is the main direction of medicine research field, and mechanism of action is definite, and most modern medicines are all single chemical composition medicines, and the medicine of multimaterial and multichemical composition (as composite composition medicine and traditional Chinese medicine) because raw material , molecular weight, molecular structure, boiling point, optical rotation, saponification value, iodine value, disintegration, solubility and volatility and other physical and biochemical indicators are different, and there are chemical complexity and variability that are difficult to grasp. , the more substances and chemical compounds, the more complex the molecular physical and biochemical reactions between them, and the more difficult to predict and grasp the results, which makes the research of compound drugs much more difficult than that of single chemical components.
  • An embodiment of the present invention includes a product for external use on the skin mainly made of natural extracts to treat and improve joint degeneration and osteoporosis, help ribs to restore mobility and eliminate pain.
  • natural extracts applied externally through the skin can improve joint degeneration and osteoporosis, increase bone strength, help ribs regain mobility and relieve pain.
  • the natural extract applied externally through the skin and rubbed on the joints can not only improve the symptoms of degenerative arthritis and osteoporosis of the joints, but also relieve or mediate female menopause Resulting pain and symptoms, return to mobility.
  • the natural extract of the present invention includes active ingredients Gramineae (Gramineae) vetiveria zizanioides and plants of the same family, such as vetiver (chrysopogon zizanioides) or Andropogon zizanioides extract (hereinafter collectively referred to as bluegrass).
  • the natural extract of the present invention includes an active ingredient of Apiaceae carrot (Daucus carota) extract.
  • the natural extract of the present invention includes bluegrass With carrot extract.
  • the external use of skin can be absorbed through the skin to avoid the destruction of digestive juice and the first-pass effect of the liver. It can treat abnormal hormones, make estradiol return to normal, and can treat the abnormal estradiol of osteoporosis. Restore the level before osteoporosis, prevent bone calcium loss and transfer to blood and urine, improve bone strength, prevent fractures and treat osteoporosis. Simple illustration
  • Fig. 1 is a bar graph showing rat body weight before drug treatment in animal experiments.
  • Fig. 2 is a bar graph showing the body weight of rats on day 1 after drug treatment in animal experiments.
  • Fig. 3 is a bar graph showing the body weight of rats in 20 days after drug treatment in animal experiments.
  • Fig. 4 is a bar graph showing the effect of SDTL-E on serum alkaline phosphatase in ovariectomy model rats in animal experiments.
  • Material is made up of different molecule and molecular structure, and each material has different molecular formula, spatial structure and functional effect, and in all material spaces, the space inside and outside of material or molecular intersection space and produced Functional effect is a variable and ratio relationship, and its ratio is changed by other factors involved in the ratio, which will cause different functional changes and results, the type and quantity of compound chemical components in the same environmental space
  • the mutual ratio is a dynamic and static balance relationship of ratio, and the mutual ratio balance has an important influence on the function of the substance and the disappearance of the function, and the strength of the function.
  • bone is one of the main organs and tissues of vertebrate organisms, one of functions is to support, protect the body and make the organism maintain its ability to move through joints and muscles, nerve tissue, and bones have functions such as storing minerals, mainly composed of Composed of bone, bone marrow, and periosteum, articulation is a part that can move and change angles between bones.
  • cartilage, articular cysts, ligaments, and synovial fluid in between. All bone and joint dysfunction diseases will lead to biological Decreased or complete loss of movement and activity (including the human body).
  • Osteoporosis and degenerative arthritis also known as degenerative arthritis
  • degenerative arthritis are one of the most important diseases in orthopedics and motor impairment. There are a large number of patients all over the world.
  • Hip pain increase bone strength and enhance the ability to resist fractures.
  • the embodiment of the present invention can quickly alleviate, eliminate and treat the clinical symptoms caused by bone and joint degeneration and looseness, regardless of age, race and gender, and can be applied to various living things, including but not limited to cats, dogs and other animals, and is easy to operate .
  • the extract of this method can be obtained by various processes, including distillation, pressing and supercritical extraction.
  • the present invention can be extended to be applied in various fields, including daily chemicals, cosmetics, skin care, health care and pharmaceuticals, and can be applied in various forms and dosage forms, including skin external application and emulsion dosage forms.
  • Osteoarthritis and osteoporosis have numerous patients all over the world, and develop towards younger age, the clinical symptoms of inconvenient movement such as arthritic joint abnormal sound, joint weakness, muscle weakness, pain, difficulty in squatting down, unable to go up and down stairs and Osteoporosis such as bone density, pain and other clinical symptoms are ubiquitous, causing serious troubles and heavy burdens to many patients, families and society.
  • Osteoporosis is a metabolic disease. Patients are prone to pain, fractures and complications due to reduced bone density. Calcium supplementation, vitamin D supplementation and exercise are one of the countermeasures, but the effect is limited.
  • Diclofenac The inflammatory drug Diclofenac (Diclofenac) is used for the in vitro treatment of arthritis and osteoporosis, but it is contraindicated in pregnant women and has many side effects.
  • the U.S. Food and Drug Administration (FDA) pregnancy drug system classifies this drug as C moderate risk and D high risk.
  • the side effects include stomach discomfort, nausea and vomiting, heartburn, diarrhea, constipation, flatulence, headache, drowsiness, dizziness, etc., while other drugs have long treatment cycle, many side effects, replacement page (rule 26) Defects that cannot be used continuously.
  • the present invention has small side effects on the human body and animals.
  • the only known adverse reaction is that if it is used when sweating, a small amount of localized red spots will appear on the skin due to the one-way perspiration mechanism of the skin. Stop using it for about two days The red dot will disappear by itself.
  • Natural plants or extracts are one of the sources of natural pharmaceutical raw materials, and single compounds (such as artemisinin, lutein, elemene, etc.) have been widely used in medicine, beauty and related industries or products, and are widely used Applied to the production of anti-aging and natural medicines, a single compound can remove harmful substances such as heavy metals and pesticide residues that are harmful to the human body through modern technology during the extraction process, providing better and higher equivalent concentration of drug raw materials, a single compound The function is simpler and clearer, the effect is clearer, and the action target and pharmacology are easier to understand clearly. Natural plants and organisms have better bioacceptance and compatibility, and the compounds in natural extracts can inhibit different cells, action sites, and dysfunctional enzymes (Enzymes) due to molecular clustering. Elevation and other adjustments.
  • Enzymes enzymes
  • Gramineae Vetiveria zizanioides and plants of the same family such as vetiver (chrysopogon zizanioides) or Andropogon zizanioides extract
  • vetiver chlorrysopogon zizanioides
  • Andropogon zizanioides extract have a pain-relieving effect on knee joint pain (approximately Less than 2 hours), it also improves joint stiffness and mobility.
  • the carrot Daucus carota extract also had an improving effect on joint stiffness and pain.
  • vetiver vetiveria zizanioides and its congeners such as vetiver (chrysopogon zizanioides) or Andropogon zizanioides extract
  • carrot Daucus carota extract or compound with other extracts, in order to seek more Better, faster, more obvious functional effects and therapeutic effects.
  • the present invention is a kind of with natural plant Vetiveria zizanioides and its congener genera (such as vetiver (chrysopogon zizanioides) or Andropogon zizanioides extract external skin treatment and improvement of joint degeneration and bone quality
  • the extract can be mixed with other media or substances, including oil (but not limited to oil, extract, solvent), in one embodiment, the weight of the extract and solvent is 1 ⁇ 9: 9 ⁇ 1 Ratio range, in one embodiment, the weight ratio range is 1 ⁇ 7: 3 ⁇ 9, in one embodiment, the weight ratio range is 1 ⁇ 5:5 ⁇ 9, external use on the skin can relieve joint pain, stiffness and other effects.
  • the present invention is a kind of natural plant Vetiveria zizanioides and its replacement page (rule 26)
  • the formulation of extracts from the same family such as vetiver (chrysopogon zizanioides) or Andropogon zizanioides) combined with carrot Daucus carota extract can treat and improve joint degeneration and osteoporosis with external application on the skin.
  • the formulation is composed of vetiver vetiveria zizanioides and its congeners (such as the extract of vetiver (chrysopogon zizanioides) or Andropogon zizanioides) as the main component, in one embodiment, compounded with carrot Daucus carota extract, in one embodiment, the weight ratio range between the two extracts is 1 ⁇ 9: 2 ⁇ 9; in one embodiment, the ratio range is 1.5 ⁇ 7.5: 2.5 ⁇ 8.5; in one embodiment, the ratio range is 1 ⁇ 5: 4.5 ⁇ 8.
  • the abnormal estrogen and serum alkaline phosphatase content of ovariectomized rat osteoporosis can be restored to the normal level before osteoporosis by skin topical application, and the lack of estrogen causes Osteoporosis has physiological changes, treatment and protection, and can be applied to the treatment of diseases related to bone and joint degeneration and osteoporosis.
  • the external application of the present invention can treat the hip joint pain of human osteoporosis and the abnormal noise of joint degeneration, the inability of the joint to bend, the joint weakness, muscle weakness, difficulty in squatting down, difficulty in going up and down the stairs Intensity reduction, is a way to treat disease.
  • extract can be obtained with various production techniques, including distillation, extraction, supercritical etc.
  • formula can be compounded or melted again with other substances, can be in various forms and dosage forms, such as liquid, emulsion , spray, smear, etc.
  • the present invention can improve the clinical symptoms of human degenerative arthritis and osteoporosis, improve joint mobility, increase joint range of motion and reduce joint pain, improve joint abnormal noise, improve joint
  • the present invention can regulate hormone levels, and can be applied to improve bone and joint degeneration, osteoporosis, and physical discomfort caused by abnormal hormones.
  • Aromatase is called estrogen synthetase (estrogen synthetase) . It can catalyze the aromatization reaction from androgen to estrogen in the process of steroid hormone synthesis, and catalyze the conversion of androstenedione and testosterone to estrogen Ketone and estradiol conversion, aromatase exists in gonad, brain, adipose tissue, blood vessel, skin and bone, and the reaction speed of aromatase can be regulated by coenzyme.
  • the present invention uses these two natural extracts in proportion Mixed within the range, as the composite formula in the present invention, it is tried on human body and animals, and according to animal experiments and human body use statistics, it has been proved that the formula of the present invention and the method of use have strong practicability, obvious efficacy, rapid onset, wide range of effects and
  • the embodiments of the present invention in animals and human bodies are as follows:
  • Hormone deficiency is one of the main causes of causing postmenopausal osteoporosis and joint degeneration, and there are hormone receptors in chondrocytes such as small intestine, osteoblast, osteoclast precursor, bone cell and growth bone plate, Decreased estrogen levels and increased serum alkaline phosphatase levels after menopause are one of the most important causes of joint degeneration and osteoporosis in women, so the mixture formula (hereinafter referred to as SDTL-E) in an embodiment of the method of the present invention is used In the skin of ovariectomized (OVX) osteoporosis model rats, the data changes in rats were observed.
  • OVX ovariectomized
  • this SDTL-E can improve estrogen in biological rats and reduce rat serum alkaline phosphatase content to normal level, and has balance ovariectomized model rat estrogen and serum alkali sex phosphatase containing
  • the selected ovariectomized rat experimental model has rich literature, mature technology, stable and reliable, and is the best model for OVX rat research recommended by the World Health Organization (WHO) and the National Institutes of Health (NIH) .
  • WHO World Health Organization
  • NASH National Institutes of Health
  • the SDTL-E formula is based on the Vetiver extract as the main compound with the red radish Daucus camta extract, in one embodiment, the 2 extracts are separately shaken and stirred > 10 Second, in one embodiment, the weight ratio range between the two extracts is 1 ⁇ 9: 2 ⁇ 9; in one embodiment, the ratio range is 1.5 ⁇ 7.5: 2.5 ⁇ 8.5; in one embodiment, the ratio range 2 ⁇ 5: 4.5 ⁇ 8.
  • the two things are mixed in an environment above > 4°C and can be > 40 revs/sec mixed and stirred > 5 seconds (depending on the actual proportioning total weight and finally determining to increase the stirring time) to stand still, and can be mixed with other solvents such as Fat fusion, in one embodiment, is effective in the weight ratio range of 1 ⁇ 9: 9 ⁇ 1 with fat fusion, in one embodiment, the weight ratio range is 1 ⁇ 7: 3 ⁇ 9, in one embodiment Among them, the weight ratio range is 1 ⁇ 5:5 ⁇ 9, and the skin is applied to experimental animals. The results show that it has a down-regulation effect on the early compensatory increase of alkaline phosphatase Alkaline phosphatase (ALP) in model rats.
  • ALP alkaline phosphatase
  • Estradiol hormone has the effect of increasing, can reduce the hyperabsorption of osteoporotic animals, restore the therapeutic function and balance of estrogen and serum alkaline phosphatase, and protect and treat the pathological changes of osteoporosis caused by estrogen deficiency It can rapidly increase bone strength and increase anti-fracture ability, and can be researched and developed into a drug for treating bone and joint degeneration and osteoporosis. (See Annex 1. Animal Experiments J
  • the extract of natural plant Vetiveria zizanioides and its congeners (such as vetiver (chrysopogon zizanioides) or Andropogon zizanioides) is diluted with solvent
  • the weight ratio range is 1 ⁇ 5:5 ⁇ 9, as a solvent, it has the effect of slowing down and improving joint pain and stiffness.
  • it is used in the knee of human degenerative arthritis 2 times a day for the skin, 0.4m I each time, 8 people tried it out, and counted after 2 hours of use.
  • 4 of them had a tendency to alleviate joint pain and stiffness (the trend rate was 50%) and could maintain About 2 hours, in one embodiment, it shows that the single extract of vetiver can improve the symptoms of joint degeneration, pain and stiffness.
  • the SDTL-E formula composed of vetiver and carrot 2 extracts was used as an external agent for human skin, and it was used on the knee joint skin of patients with joint degeneration (voluntary users), and observed effect and make statistics.
  • the SDTL-E formula is compounded by Vetiver vetiveria zizanioides and its congener genera (such as vetiver (chrysopogon zizanioides) or Andropogon zizanioides and Daucus carota extract, in a
  • the two extracts are separately shaken and stirred for more than 10 seconds before compounding.
  • the weight ratio between the two extracts is 1 ⁇ 9: 2 ⁇ 9; in one embodiment, the ratio is 1.5 ⁇ 7.5: 2.5 ⁇ 8.5; In one embodiment, the ratio range is 2 ⁇ 5: 4.5 ⁇ 8.
  • the two substances are mixed at > 4 ° C and > 40 rpm > 5 second (depending on the actual total weight to finally decide to increase the stirring time) and leave it alone, in one embodiment, then blend with the fat, in one embodiment, blend with the fat in the weight ratio range of 1 ⁇ 9: 9 ⁇ 1 , in one embodiment, the weight ratio range is 1 ⁇ 7: 3 ⁇ 9, in one embodiment, the weight ratio range is 1 ⁇ 5:5 ⁇ 9, in one embodiment, the skin is applied externally to the human body, SDTL-E is tried out with 23 people who suffer from knee joint disorders age 50-96 years old, in one embodiment, use 2 times a day, each time 0.4
  • the invalid ones in the table may be users who are not osteoporosis or other inflammatory patients.
  • vetiver chrysopogon zizanioides
  • Andropogon zizanioides have the effect of improving joint pain and stiffness
  • the SDTL-E compound formula is faster and more effective than a single vetiver extract
  • the hormone has the effect of increasing, and has the effect of reducing the serum alkaline phosphatase content.
  • several cases of skin have shown that a single vetiver vetiveria zizanioides and its congeners (vetiver (chrysopogon zizanioides) or Andropogon zizanioides) have the effect of improving joint pain and stiffness
  • the SDTL-E compound formula is faster and more effective than a single vetiver extract
  • the hormone has the effect of increasing, and has the effect of reducing the serum al
  • the present disclosure provides a solution to the long-standing need described above.
  • aspects of the present invention overcome prior reliance on the use of non-natural or chemically based mixtures to treat and improve joint degeneration and osteoporosis, aid in regaining mobility, and relieve pain.
  • Rats were randomly assigned to sham operation control group (control group), ovariectomized rat osteoporosis model control group (model group, ovariectomized rat osteoporosis model SDTL-E treatment group 8011 ⁇ £ group>, model group and SDTL -E group received ovariectomy, and the control group received surgery without ovariectomy.
  • control group ovariectomized rat osteoporosis model control group
  • model group ovariectomized rat osteoporosis model SDTL-E treatment group
  • SDTL-E treatment group were compared with those of the control group. Ratio, bone density difference is significant, the data show that osteoporosis modeling is successful.
  • the skin of the control group and the model group is externally applied with vegetable oil liquid
  • the skin of SDTL-E group is externally applied with oily liquid SDTL-E, twice a day for 20 days .
  • the experimental results showed that the serum estradiol value in the model group was still significantly lower , the serum alkaline phosphatase (ALP) activity, serum calcium, and urine calcium were still significantly higher, the bone mechanical indexes were still significantly lower, and the number of trabecular bone decreased. , Thinning, sparse and broken.
  • ALP serum alkaline phosphatase
  • estradiol value in the SDTL-E group was significantly restored to the level of the (sham operation) control group, the ALP activity, serum calcium, and urine calcium were significantly reduced to the level of the (sham operation) control group, and the bone mechanical indexes of torsional force, torque and shear The shear modulus was increased, the shear stress was significantly increased to the level of the (sham-operated) control group, and the number of trabeculae was slightly increased.
  • Drug therapy is mainly divided into two categories: oral and injection.
  • One is to reduce the rate of bone resorption, including bisphosphonates (Bisphosphonates), estrogen (Estrogen) and denosumab (Denosumab).
  • bisphosphonates Bisphosphonates
  • Estrogen Estrogen
  • denosumab Denosumab
  • drugs include parathyroid hormone analogs (Parathyroid Hormone Analogs) and the like.
  • 3-month-old Sprague Dawley female rats were purchased from the Guangdong Provincial Medical Experimental Animal Center (Foshan, Guangdong, China). Rats were fed SPF-grade granular mouse feed, and they were free to ingest bottled tap water. The feeding conditions were at a temperature of 20°C The humidity is 80%, and the light and dark are 12 hours each. After feeding for 15 days, the rats are randomly assigned to the following three treatment groups (10-12 rats in each group): (1) sham operation control group (control group); (2) Ovariectomized rat model control group (model group; C3) Ovariectomized rat osteoporosis model SDTL-E treatment group (CSDTL-E group).
  • Ovariectomized rat model and treatment program model group and SDTL-E treatment group were anesthetized with Bacillus (Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd, Shanghai, China) and operated aseptically.
  • the abdominal cavity was opened 4 cm below the xiphoid process, about 1.5 cm, Pull out the fat pad to find the ovaries on both sides and remove them, then return the fat pad to suture the abdominal cavity.
  • the control group underwent the above surgery without ovary removal. Then intramuscular injection of ampicillin ( ⁇ Sinopharm Chemical Reagents) 100,000 units/rat, continuous injection for 3 days.
  • the above-mentioned animals were raised for 3 months, and then the weight was measured and the bone density was detected by dual-energy X-ray.
  • Rats in the above three groups were given 3% pentobarbital sodium (36mg/kg) (Sinopharm Chemical Reagents) intraperitoneal injection for anesthesia, and then smeared depilatory agent (sodium sulfide 3g, soap powder 1g, starch 7g, added water to adjust to Paste) about 5 minutes, the hair removal area is about 3cmx4cm. Dosing started 48 hours after hair removal. 100
  • ALP test kit (Nanjing Jiancheung Bioengineering Institute, Nanjing, Jiangsu, China) will be used to measure serum ALP activity. According to the supplier's instructions, the serum ALP in the sample reacted with the p-Nitrophenylphosphate substrate (p-Nitrophenylphosphate) provided by the kit to generate a yellow product, which was then analyzed using an S22PC spectrophotometer (Shanghai Lengguang Technology Co. Ltd, Shanghai, China). Absorbance was measured at a wavelength of 415 nm to quantify serum ALP activity. Calcium ion determination Calcium ion test kit (Nanjing Jiancheung Bioengineering Institute) was used to determine serum and urine #5 ion levels.
  • the calcium ions in the sample react with the methylthymol blue substrate (Methylthymolblue) provided by the kit to generate a blue product, and then use the S22PC spectrophotometer to measure the absorbance at a wavelength of 610 nm to quantify the serum and urinary calcium levels. Creatinine determination
  • the creatinine test kit (Nanjing Jiancheung Bioengineering Institute) was used to determine the urine creatinine level. According to the supplier's instructions, the urine creatinine in the sample was oxidized by the oxidase provided by the kit to produce a purple-red product, and then the absorbance was measured at a wavelength of 546 nm using a S22PC spectrophotometer to quantify the urine creatinine level. Estradiol determination
  • the AxSYM Estradiol Kit (Abbott, Chicago, Illinois, U.S. A) was used to measure estradiol levels. According to the supplier's instructions, serum estradiol in the sample was bound to the matrix wells in the form of an antibody-estradiol-alkaline phosphatase conjugate, which was then bound to the substrate 4-methylphenidone phosphate (4- methylumbelliferyl phosphate) was reacted to produce radiance, which was then measured using the ARCHITECT i2000SR immunoassay analyzer (Abbott) to quantify serum estradiol levels.
  • Bone Density Test Rats in each group were anesthetized with B, and when the rats were in a stable lethargic state for more than 5 minutes, they were placed under the probe of a Lunar Prodigy dual-energy X-ray absorptiometry (GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA) and scanned The speed is 60.0 mmol/L/sec, the step distance is 1.0x1. Ommol/L, the whole body scan is performed after calibration with the small animal software module, and the bone density value BMD (CV ⁇ 1%) is measured. Bone mechanical testing Right tibia CTibia;) for torsional testing (Torsional Testing). Torsion test: The proximal and distal ends of the tibia were embedded in polymethyl methacrylate and placed on the 858 Mini Bionix II material testing system for the torsion test
  • Histological examination Remove the soft tissue of the proximal 1/2 of the left femur in rats, fix with freshly prepared 10% neutral formalin (Sinopharm Chemical Reagents) for 24 hours, and then use 0.01M phosphate buffered saline (PBS) (Sinopharm Chemical Reagents) Rinse 3 times, and then use 20% formic acid solution (Sinopharm Chemical Reagents) to remove gold calcium for 6 days. The working solution needs to be replaced every day.
  • PBS phosphate buffered saline
  • SDTL-E has the effect of reducing serum ALP activity in OVX-induced osteoporosis rats
  • ALP assay was used to evaluate the effect of SDTL-E on serum ALP activity of bone metabolism markers.
  • the serum ALP activity of the model group was significantly increased to 46.69 ⁇ 13.32 King's unit/100 mL ( ⁇ O.Ol)° SDTL-E group externally applied SDTL -E 20 days later, compared with the model group, the serum ALP activity was significantly reduced by 58.79% to 19.24 ⁇ 6.06 King’s units/100 mL ( ⁇ O.Ol), which was similar to the level of the control group (Appendix 1, Figure 2), showing a significant Regulation and reduction of ALP activity.
  • SDTL-E decreased serum ALP activity in OVX-induced osteoporotic rats.
  • SDTL-E group (n 10) rats were externally applied to the skin SDTL-E ° externally applied to the skin twice a day for 20 consecutive days.
  • ALP assay was used to assess serum ALP activity. Results are expressed as mean ⁇ standard deviation. w/ ⁇ cO.Ol vs model group.
  • SDTL-E can increase the serum estradiol level in rats with OVX-induced osteoporosis, and the determination of estradiol was used to evaluate the effect of SDTL-E on serum estradiol. Serum estradiol levels in the control group
  • SDTL-E increased serum estradiol levels in OVX-induced osteoporosis rats.
  • SDTL-E has the effect of reducing serum and urinary calcium ion levels in OVX-induced osteoporosis rats. Calcium ion determination was used to evaluate the effect of SDTL-E on serum and urinary calcium ion levels of bone metabolism markers. Compared with the serum calcium ion level of 2.28 ⁇ 0.20 mM in the control group, the serum calcium ion level in the model group was significantly increased to 2.70 ⁇ 0.32 mMCPO.Ol;). In the SDTL-E group, SDTL-E was applied externally on the skin.
  • the urinary calcium ion level in the model group was significantly increased to 2.45 ⁇ 0.76 mM (P ⁇ 0.01) Compared with the model group, the urinary calcium ion level was significantly reduced by 28.16% to 1.76 ⁇ 0.80 mM ( P ⁇ 0.01 ) (Appendix 1 Figure 4b ), showing that it can significantly prevent the loss and transfer of calcium ions to the urine.
  • SDTL-E had no significant effect on the urinary calcium/creatinine ratio in OVX-induced osteoporosis rats.
  • Calcium ion determination and creatinine determination were used to measure calcium ion and creatinine to calculate the urinary calcium/creatinine ratio.
  • the urinary calcium/creatinine ratio in the model group increased to 0.49 ⁇ 0.29, but there was no statistical significance.
  • SDTL-E group SDTL-E was applied externally on the skin, and the ratio of urinary calcium/creatinine decreased to 0.36 ⁇ 0.14 after 20 days, which was similar to that of the control group, and there was no statistical significance compared with the model group (Fig. 5 in Annex 1).
  • SDTL-E had no significant effect on the urine creatinine/creatinine ratio in OVX-induced osteoporotic rats.
  • SDTL-E group (n 10) rats were externally applied to the skin SDTL-E ° externally applied to the skin twice a day for 20 consecutive days.
  • Calcium ion determination and creatinine determination are used to measure the amount of calcium ion and creatinine to calculate the urinary calcium/creatinine ratio. Results are presented as mean ⁇ standard deviation.
  • SDTL-E had no significant effect on the bone mineral density of OVX-induced osteoporosis rats. Bone mineral density was detected on the right femur to evaluate the effect of SDTL-E on bone density. Compared with the bone density of the control group (0.22 ⁇ 0.02 g/cm 2 ) , the bone density of the model group was significantly reduced to 0.20 ⁇ 0.01 g/cm 2 CP ⁇ 0.01;).
  • SDTL-E group was externally applied SDTL-E to the skin, and the bone mineral density was 0.20 ⁇ 0.01 g/cm 2 after 20 days, which was not significantly different from that in the model group (Appendix 1 Figure 6: ), showing that the SDTL-E group had It has no significant effect on the bone mineral density of osteoporosis model rats.
  • SDTL-E improves the bone strength and hardness of OVX-induced osteoporosis rats.
  • the model group and the control group apply external vegetable oil to the skin, and the SDTL-E group applies SDTL-E to the skin.
  • the results of the bone torsion experiment after 20 days show that the torsional force, torque and The shear stresses were all significantly lower than those in the control group (F ⁇ 0.05) (Appendix I Fig. 7a-c) - although the shear modulus was also lower than the control group, but not statistically significant (Appendix I Fig. 7d).
  • the shear stress of the SDTL-E group was significantly increased by 39.93% to 249.502 ⁇ 63.445 Mpa (P ⁇ 0.05), which was close to the shear stress of the control group of 235.540 ⁇ 58.097 Mpa (Appendix 1 Figure 7c).
  • the torsional force, torque and shear modulus of the SDTL-E group also increased, but there was no statistical significance.
  • Experimental data show that SDTL-E externally applied SDTL-E to the skin, after 20 days, the torsional force, torque and shear modulus are close to those of the control group (Fig. Rat bone strength and stiffness.
  • SDTL-E increased bone strength and stiffness in OVX-induced osteoporotic rats.
  • SDTL-E group 9
  • SDTL-E was applied externally to rat skin. Topical application to the skin twice daily for 20 consecutive days. Bone torsion tests were used to evaluate (a) torsional force, (b) torque, (c) shear stress, and (d) shear modulus. Results are presented as mean ⁇ standard deviation. * ⁇ 0.05 vs model group.
  • SDTL-E can improve the bone tissue structure of OVX-induced osteoporosis rats. It can be seen from Figure 8a in Annex 1 that the bone tissue structure of rats in the control group is clear, the bone trabeculae are thicker, the coloring is deeper, the arrangement is denser, and the bone marrow has active hematopoietic function. Trabecular spaces are also smaller. As can be seen in Figure 8b of Annex 1, the number of trabeculae in rats in the model group
  • Attachment 1 Figure 8c shows that compared with normal rats in the control group, SDTL-E group rats have thinner bone trabeculae, sparse arrangement, lighter fracture and coloration, widened bone trabecular gaps, decreased blood red bone marrow, and low hematopoietic function , adipose tissue increased, but also showed a slight increase in the number of trabecular bone and a thickening trend compared with model rats, so it is necessary to extend the use of SDTL-E for the next experiment.
  • SDTL-E improves bone tissue structure in OVX-induced osteoporotic rats. Vegetable oil was applied externally to the skin of rats in the model group and the control group. SDTL-E was applied externally to the skin of rats in SDTL-E group. Topical application to the skin twice daily for 20 consecutive days. The left femoral bone tissue was stained with HE, and then observed under a 200X magnified optical microscope. Above are representative staining images of rats in (a) control group (b) model group and (c) SDTL-E group.
  • Bone strength is positively correlated with the bone's ability to resist fracture.
  • bone density a commonly used bone strength marker, was used to study the effect of SDTL-E on the bone strength of OVX rats.
  • the bone density of OVX rats in the model group was significantly lower than that in the control group, and the osteoporosis model was successful.
  • Osteoporosis reduces the number of trabecular bones, trabecular thickness, and degree of connectivity all affect bone strength.
  • SDTL-E externally applied to OVX rats for 20 days restored bone strength, there was no significant change in bone density, indicating that the rapid increase in bone strength was not due to the increase in bone density when SDTL-E was applied externally for 20 days, but may be due to other rapid changes in bone density.
  • Strength mechanism of action The microscopic observation results of this study showed that compared with the control rats, the bones of OVX- rats in the model group and SDTL-E group were smaller.
  • Aromatase known as estrogen synthetase
  • aromatase exists in gonads, brain, adipose tissue, blood vessels, skin and bones, and the reaction speed of aromatase can be regulated by coenzyme.
  • bisphosphonate-related drugs (Alendronate Sodium, Alendronate Sodium) can be administered orally for 6 months ( ⁇ 180 days) before the bone strength can be significantly increased and returned to normal levels. It takes 0 ⁇ rt eO ®> 12 weeks to 84 days) before the bone strength increases significantly and returns to normal level, and the estrogen receptor modulator-related drug raloxifene, Raloxifene;) is administered orally for 4 weeks (: ⁇ 28 days > There is no significant increase in bone strength.
  • This study shows that the SDTL-E external application of plant ingredients quickly restores estradiol levels, ALP activity, and serum calcium levels through endogenous regulation, and increases the number of trabecular bone and bone density.
  • Aromatase is encoded by the gene CYP19A1 in the human body and exists in cytochrome P450 In the enzyme system,
  • estrogen synthetase also known as estrogen synthetase ( estrogen synthetase ) can catalyze the aromatization reaction from androgen to estrogen in the process of steroid hormone synthesis, catalyze the conversion of androstenedione and testosterone to estrone and estradiol, aromatase It exists in gonads, brain, adipose tissue, blood vessels, skin and bones, and the speed of aromatase reaction can be regulated by coenzyme.
  • SDTL-E has a coenzyme-like effect, and its SDTL-E has the function of aromatization acceleration coenzyme cluster [Aromatization Acceleration Coenzyme Cluster (A ACC)], which may be through the activation of aromatase (Aromatase).
  • a ACC aromatization Acceleration Coenzyme Cluster
  • Response Enzyme catalysis regulates hormone levels, such as estradiol and ALP activity, serum calcium, urinary calcium, etc., promotes the activity of osteoblasts and inhibits the activity of osteoclasts.
  • oil-soluble reagents A, B, C, and D were more capable of improving and enhancing the viability of damaged cells than water-soluble reagents E, F, G, and H.
  • A, B, D The higher the concentration of oil-soluble reagents, the more obvious the effect of increasing the vitality of damaged cells, and the most effective peak amount is when the concentration reaches 0.1%-0.9%.
  • reagent A has the highest and most obvious ability to improve and enhance the viability of damaged cells, and the concentration of A at 0.1%-0.9% significantly increases the viability of damaged cells, reaching 259% (p ⁇ 0.05).
  • each reagent group had little effect on the viability of normal cells, and the data had no statistical significance.
  • the oil-soluble reagents in each reagent group were stronger than the water-soluble reagents in improving the viability of damaged cells, and the 0.1%-0.9% concentration of A reagent had the highest and most significant effect on improving and enhancing the viability of damaged cells.
  • the above results are of reference value for the future development of all-natural plant antioxidant extract ingredient products and drugs, ingredient combination, solvent selection and use of measuring tools.
  • This experiment is to study the effects of different doses of the exclusive SDTL-E extract and the combination of various reagent groups on cell viability through cell experiments, in order to select and prove the optimal dosage and the best range of efficacy, and provide the best anti-oxidation for subsequent research and development. It provides references for substances, combinations and dosages, and also provides research references for related animal experiments.
  • PrestoBlueTM HS cell viability reagent (Thermo Fisher Scientific) is used to measure cell viability. The principle is that Resazurin in the reagent will be reduced to red and highly fluorescent resorufin after entering living cells. °
  • Cell viability was determined according to the instructions of the PrestoBlue® HS cell viability reagent supplier. In a 96-well plate (96-well plate), 10,000 cells were first prepared in each well and immersed in 90 medium. 10 PrestoBlue® HS Cell Viability Reagent was then added to the wells and placed in a dark 37°C incubator for 10 minutes. Finally, use a Microplate Reader (Molecular Devices, San Jose, California, U_S_A) to measure the Fluorescence Excitation Wavelength is 560 nm, and then measure the Fluorescence Emission Wavelength 590 nm To quantify cell viability. Evaluation procedure: 0.5 mM hydrogen peroxide (Kam Sing Medicine Co.
  • the first phase of the experiment is to measure the cell viability 15 minutes after using each group of reagents to screen out the reagents with the best effect on cell viability; the second phase of the experiment is to dilute the reagents screened in the first phase to different concentrations to treat the cells for 15 minutes Then determine the cell viability to select the optimal dose of each group of reagents; in the third stage, the best reagents selected in the first and second stages are used to treat the cells at the optimal dose for 15 minutes and then measure the cell viability. capabilities for further comparison.
  • 0.1%-0.9% concentration A significantly increased the viability of damaged cells by 190%
  • 1%-5% concentration A significantly increased the viability of damaged cells by 126% (p ⁇ 0.05).
  • 0.1%- 0.9% concentration B significantly increased the viability of damaged cells by 158%
  • 1%-5% concentration B significantly increased the viability of damaged cells by 99%.
  • 0.1%-0.9% concentration D increased the viability of damaged cells by 79%
  • 1%-5% concentration D increases
  • Attachment 2 Figure 3 After being treated with different concentrations of A, B, and D reagent groups for 15 minutes, the % change in cell viability of cells relative to the normal control group (represented by the red dotted line) Note 1: The red line is the viability level of the normal cell control group. Note 2: All reagents are diluted in cell culture medium. Note 3: * indicates a significant statistical difference (p ⁇ 0.05) compared with the normal cell control group. Attachment 2 Figure 4. After being treated with reagent groups A, B, and D at different concentrations for 15 minutes, the % change of cell viability compared to the damaged cell control group (represented by the red dotted line) Note 1: The red line is the level of the damaged cell viability of the control group.
  • Reagent B at 0.1%-0.9% concentration significantly increased the viability of damaged cells by 198% (p ⁇ 0.05).
  • 0.1%-0.9%% concentration D reagent significantly increased the viability of damaged cells by 198% (p ⁇ 0.05).
  • Reagent C at a concentration of 0.1%-0.9% significantly increased the viability of damaged cells by 176% (p ⁇ 0.05).
  • Table 3, Annex II Figure 6 The above experimental results show that reagent A at a concentration of 0.1%-0.9% is the best in increasing the viability of normal or damaged cells, while reagent C has no obvious effect on increasing the viability of normal cells, but it can significantly increase the viability of damaged cells. .
  • H 2 0 2 Hydrogen peroxide is a kind of active oxygen, which can cause oxidative damage to cells and destroy cell viability, and has been widely used in the past research to establish HUVEC injury cell model [2].
  • hydrogen peroxide significantly reduced the viability of HUVEC cells by more than 70% on average, and successfully established the damaged cell model.
  • the results of the first phase of the experiment showed that each reagent group improved and enhanced the viability of damaged cells as a whole, but did not improve or enhance the viability of normal cells as a whole, indicating that each reagent group only acts on damaged cells.
  • each reagent group has no obvious effect on improving and enhancing the vitality of normal cells, but only has an effect on improving the vitality of damaged cells, and the greater the damage to the cells, the greater the effect of each reagent group on the repair of damaged cells. The stronger the effect on improving vitality.
  • oil-soluble reagents are stronger than water-soluble reagents, and reagent A has the highest and most significant ability to improve and enhance the viability of damaged cells.
  • Reagents A, B, and D had no significant effect on the viability of normal cells in the first phase of the experiment, but significantly increased the viability of normal cells in the third phase of the experiment.
  • the average viability value of the normal cell control group (Appendix Table 3) is much lower than the average viability value of the normal cell control group in the first stage experiment (Appendix Table 1), which may be due to unknown reasons during the third stage of cell culture For example, free radicals produced by environmental chemical pollutants can cause oxidative damage to cells and destroy cell viability [3].
  • the experimental results showed that the biological effects of each group of reagents on normal cells were limited, and the data were not statistically significant. The experimental results also show that each group of reagents has a significant effect on the damaged cells, and when the damage to the cells themselves is greater,
  • Reagent groups A, B, and D have more significant effects on cell repair and improvement of viability.
  • the results show that the special SDTL-E extract and
  • the 0.1%-0.9% concentration of D reagent was the second most effective in improving and enhancing the viability of damaged cells, reaching 198% compared with damaged cells.
  • the 0.1%-0.9% concentration of reagent B can improve and enhance the viability of damaged cells, which is 198% higher than that of damaged cells.
  • the 0.1%-0.9% concentration of C reagent was the second most effective in improving and enhancing the viability of damaged cells, which was 176% compared to the damaged cells.
  • reagents A, B and D could all reduce the level of reactive oxygen species in damaged cells, and reagents A, B and D could rapidly reduce the level of reactive oxygen species in cells after treating the damaged cells for 3 minutes.
  • Each reagent group treated the damaged cells for 3 minutes.
  • the 0.1%-0.9% concentration of A reagent significantly reduced the reactive oxygen species in the damaged cells by 67% (p ⁇ 0.05), and the effect was the most rapid, significantly reducing and Improve the active oxygen in damaged cells most rapidly and most significantly.
  • Each reagent group treated the damaged cells for 15 minutes.
  • the B reagent at a concentration of 0.1%-0.9% significantly reduced the reactive oxygen species in the damaged cells by 75% (p ⁇ 0.05).
  • Active oxygen has the most significant and sustained effect.
  • the experimental results show that each reagent group has a significant effect of reducing active oxygen.
  • the experiment has a direction for the research and development of all-natural plant antioxidant ingredients and the ingredients, combinations, dosage, antioxidant effect, antioxidant onset speed and other subsequent cell research. Inspirational significance and follow-up animal experiment reference value.
  • Reactive Oxygen Species are compounds that are more reactive than molecular oxygen in chemical reactions.
  • Reactive oxygen species include free radicals (Free Radical) and non-free radicals (Nonfree Radical) oxygen-containing molecules, which can lead to increased formation of reactive oxygen species and oxidative stress (Oxidative Stress) and damage redox balance.
  • Hydrogen peroxide is a non-free radical active oxygen. When it accepts an extra electron, it will split into hydroxyl radical (Hydroxyl Radical) (HO ) and hydroxyl anion (OH- )[1, 2].
  • Oxidative Stress can damage osteoblasts and is related to osteoporosis, while antioxidants can protect osteoblasts from oxidative damage and help control osteoporosis [4, 5].
  • the cell culture method is based on the instructions of the cell supplier ATCC, and the vascular cell basal medium (ATCC) added with the endothelial cell growth medium (Endothelial Cell Growth Kit-VEGF) (ATCC) is used to culture the human umbilical vein Endothelial cells were cultured at 37°C and 5% carbon dioxide.
  • ATCC vascular cell basal medium
  • Endothelial Cell Growth Kit-VEGF Endothelial Cell Growth Kit-VEGF
  • Intracellular ROS Assay Fluorometric Intracellular ROS Assay (Sigma Aldrich) was used to measure the content of reactive oxygen species in cells to evaluate the anti-inflammatory effects of reagents A, B, and D on cells. oxidation capacity. The principle is that intracellular
  • the oxygen reacts with the cell-permeable sensor chemical (Cell-permeable Sensor Chemical) to generate light.
  • Cell-permeable Sensor Chemical The stronger the antioxidant capacity of A, B, and D reagents in the cells, the lower the fluorescence brightness value will be.
  • Fluorescent intracellular reactive oxygen species were measured according to the supplier's instructions. In a 96-well plate (96 Well Plate), 10,000 cells were first prepared in each well and immersed in 100 medium, and then 100 sensor reaction mixture (Reaction Master Mix) was added. , and placed at B7°C for 30 minutes. Then a microplate reader (Molecular Devices) was used to quantify intracellular reactive oxygen species with an excitation wavelength of 540 nm and an emission wavelength of 570 nm.
  • the experimental groups are: normal cell control group, normal cells plus water, normal cells plus oil, normal cells plus A reagent, normal cells plus B reagent, normal cells plus D reagent, damaged cell control group, damaged cells plus water, damaged cells plus oil 12 groups including damaged cells plus A reagent, damaged cells plus B reagent and damaged cells plus D reagent.
  • parametric Parametric
  • t-test t-test
  • Mann-Whitney test Mann-Whitneytest
  • Concentration D at 0.1%-0.9% also reduced activity in injured cells Oxygen 19%.(Table 2, Figure 4)
  • Table 2, Figure 4 The above experimental results show that when the 0.1%-0.9% concentration of A and B reagents treat normal and damaged cells for 3 minutes, they can rapidly and significantly reduce the level of reactive oxygen species in damaged cells and cells.
  • H202 Hydrogen peroxide is a kind of reactive oxygen species, which can lead to the increase of intracellular reactive oxygen species such as superoxide anion CSeroxide anions;) [8] - produce and cause oxidative damage to cells, resulting in abnormal cell apoptosis, and have been widely used in previous studies To establish the HUVEC injury cell model[9].
  • hydrogen peroxide significantly increased the reactive oxygen species in HUVEC cells by more than 90%, and the experimental results confirmed that the damaged cell model was successfully established.
  • Phase 1 experiment each reagent group treated the cells for 15 minutes, showing that the A, B, and D reagents all reduced the reactive oxygen species in the damaged cells, which was statistically significant.
  • Oxygen levels are strong. However, when the A and B reagents were used to treat the damaged cells for 15 minutes, the ability of B to reduce the level of reactive oxygen species in the damaged cells was stronger than that of A. Through the analysis and comparison of the two-stage experimental results, it was shown that the antioxidant effect of A on damaged cells was faster than that of B, while the antioxidant effect of B on damaged cells was stronger than that of A, but the effect was slower.
  • the results of the two-stage experiment also showed that: B, D reagents treated normal cells for 3 minutes, can reduce the level of active oxygen in normal cells, but when B, D reagents treated normal cells for 15 minutes, but increased the level of intracellular active oxygen,
  • B D reagents treated normal cells for 3 minutes
  • the first reason is that the raw data of the experiment showed that in the second stage experiment of treating normal cells for 3 minutes, the average value of reactive oxygen species in the control group of normal cells (Appendix Table 2; ) was much higher than that of the second stage experiment of treating normal cells for 15 minutes.
  • the average value of reactive oxygen species in the normal cells of the control group in the stage 1 experiment is an appendix table, which may be due to the oxidative damage to the cells caused by free radicals produced by environmental chemical pollutants during the cell culture process of the second stage experiment ⁇ 10;
  • cell experiment factors may cause reactive oxygen metabolites to fail to be excreted from the body as in the physiological metabolism in the living body, thereby causing the accumulation of reactive oxygen species in cells and leading to an increase in the accumulation of reactive oxygen species in cells. Therefore, the results of cell experiments can only be used as a reference for animal experiments, and cannot fully reflect what actually occurs in animals or humans. Through this study, the experimental results and data analysis show that in this experiment, the higher the level of active oxygen in the cells, the more significant the effect of the reagent groups A, B, and D on reducing the level of active oxygen in the cells, and the more effective they are in reducing the level of active oxygen in the cells.
  • Damaged cells have a strong antioxidant repair effect, but for normal cells, the effectiveness of each reagent group is limited, and the data is not statistically significant, suggesting that the significant antioxidant effect of each reagent group on normal cells and damaged cells comes from the treatment of The scavenging and regulation mechanism of reactive oxygen species in cells.
  • Conclusion The experimental results clearly show that the patented SDTL-E extract and combination A, B, and D reagents have significant antioxidant effects, dose-effect, and time relationships on reactive oxygen species in damaged cells.
  • the experimental results also show that each reagent group, for normal The antioxidant effect of reactive oxygen species in cells is limited, and the data is not statistically significant, but it also suggests the difference and regulation or balance effect of each reagent group on damaged and normal cells.
  • each reagent group has obvious antioxidant effects on damaged cells, and when the cells themselves are more damaged, the antioxidant effects of each reagent group A, B, and D on cells are more significant, showing that each reagent group has a greater effect on cells.
  • Active oxygen in damaged cells has a strong antioxidant effect.
  • Each reagent group treated the damaged cells for 15 minutes, and the 0.1%-0.9% concentration of B reagent had the highest and most significant effect on reducing the reactive oxygen species in the damaged cells, which was significantly reduced by 75% compared with the damaged cells.
  • the 0.1%-0.9% concentration of reagent A was the second most effective in reducing reactive oxygen species in damaged cells, and significantly reduced 68% reactive oxygen species compared with damaged cells.
  • the 0.1%-0.9% concentration of D reagent reduces the effect of reactive oxygen species in damaged cells. Compared with damaged cells, the reactive oxygen species is reduced by 36%.
  • Potassium lon Chaime ⁇ a potassium ion channel, is a pore across the cell membrane, which can selectively allow only potassium ions to pass through the cell membrane.
  • the literature points to a potential role for modulation of potassium channels in osteoporosis and joint degeneration.
  • Previous studies have also shown that potassium ion channels can affect cell proliferation cycle, cell viability, and cell apoptosis.
  • the immortalized human umbilical vein endothelial cell line HUVEC was used as a model cell, and the three reagents of the patented SDTL-E extract A, B and composition D were evaluated through the determination of potassium ion channels.
  • the experimental results showed that A, B, and D reagents treated normal and damaged cells for 15 minutes, compared with the damaged cell control group, had very little effect on the voltage-gated potassium ion channels of normal and damaged cells, without statistical significance.
  • the experimental results show that reagents A, B, and D all have significant effects on down-regulating the activity of non-voltage-gated potassium ion channels in normal and damaged cells, but have no obvious effect on voltage-gated potassium ion channels, indicating that their mechanism of action is through non-voltage-gated potassium ion channels. It is presented by controlling potassium ion channel pathway.
  • the experimental results show that there is a significant difference in the activity of the voltage-gated potassium ion channel between the single extract and the extract composition, and the
  • the cell culture method is based on the instructions of the cell supplier ATCC, and the vascular cell basal medium (ATCC) added with the endothelial cell growth medium (Endothelial Cell Growth Kit-VEGF) (ATCC) is used to culture the human umbilical vein Endothelial cells were cultured at 37°C and 5% carbon dioxide.
  • Counting Cell Numbers A Hemocytometer (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Konigshofen, Germany) was used to count the cell numbers. 10 piL of cells were injected into a hemocytometer, which was then placed under a cell culture microscope (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) to count the number of cells. Potassium Ion Channel Assay
  • FluxORäll green ion channel assay (Thermo Fisher Scientific) was used to measure the activity of ion channels in cells to evaluate the effects of reagents A, B, and D on the activity of potassium ion channels in cells.
  • the principle is to use Thallium Ion, which can enter the cell through the potassium ion channel.
  • the Thallium ion enters the cell and reacts with the FluxORTMll Green Indicator Dye (FluxORTMll Green Indicator Dye) placed in the cell beforehand, it will emit green light.
  • FluxORTMll Green Indicator Dye FluxORTMll Green Indicator Dye
  • Potassium ion channels were determined according to the supplier’s instructions for FluxORäll green potassium ion channel assays. In a 96-well plate (96 Well Plate), 20,000 cells were prepared in each well and immersed in 80 medium, and then 80 FluxORäll green indicators were added. Dye and place at 24°C for 60 minutes.
  • Non-Voltage Gated Potassium Ion Channel (Non-Voltage Gated Potassium Ion Channel)
  • Basal Potassium Stimulus Buffer containing thallium ions Ion channel activity (Voltage-Gated Potassium Ion Channel )
  • High Potassium Stimulus Buffer containing thallium ions 40 piL of High Potassium Stimulus Buffer containing thallium ions.
  • a microplate reader (Molecular Devices) was used to measure the light, the light excitation wavelength was 490 nm, and then the fluorescence emission wavelength was measured at 525 nm to quantify the cellular potassium ion channel activity. Evaluation procedure 0.5 mM hydrogen peroxide (Kam Sing Medicine Co.
  • vascular cell basal medium was added to HUVEC cells for 30 minutes in the normoxic cell control group). Then add the vascular cell basal medium and reagents A, B, and D diluted to 0.1%-0.9% concentration by the vascular cell basal medium into the damaged cell control group and the normal cell control group for 15 minutes, respectively. Then through potassium ion channel measurement, value acquisition, statistics, and analysis of the effects and differences of various reagents on cellular potassium ion channel activity.
  • the experimental groups are: normal cell control group, normal cell plus water, normal cell plus fat, normal cell plus A reagent, normal cell plus B reagent, normal cell plus D reagent, damaged cell control group, damaged cell plus water, damaged cell Add oil, add A reagent to damaged cells, add B reagent to damaged cells, and add D reagent to damaged cells, a total of 12 groups.
  • Statistical Analysis The study was performed in two phases. Experiments at each stage were repeated 3 times, and then different groups of cells, control group and damaged cells were
  • the first phase of the experiment was to measure the activity of non-voltage-gated potassium ion channels in normal and damaged cells 15 minutes after using each group of reagents; the second phase of the experiment was to measure the voltage-gated potassium in normal and damaged cells 15 minutes after using each group of reagents ion channel activity.
  • the experimental results showed that compared with the control group of damaged cells, the concentration of A at 0.1%-0.9% significantly reduced the activity of non-voltage-gated potassium ion channels in damaged cells by 54% (p ⁇ 0.05) and the concentration of B at 0.1%-0.9% significantly reduced the activity of damaged cells
  • the activity of non-voltage-gated potassium ion channels was 65% (p ⁇ 0.05), and the concentration of 0.1%-0.9% D significantly reduced the activity of non-voltage-gated potassium ion channels in damaged cells.
  • composition D at a concentration of 0.1%-0.9% reduces the activity of voltage-gated potassium ion channels in normal cells by a maximum of 44% (p ⁇ 0.05).
  • the red line is the activity level of potassium ion channel in normal cells in the control group.
  • Note 2 All reagents are diluted to 0.1%-0.9% with cell culture medium, and the concentration of water is 1%-5%.
  • Attachment 4 Figure 2 After being treated with each reagent for 15 minutes , the % change of intracellular potassium ion channel activity relative to the damaged cell control group (represented by the red dotted line).
  • the red line is the activity level of potassium ion channel in the damaged cell control group.
  • Note 2 All The reagent is diluted to 0.1%-0.9% with cell culture medium, and the concentration of water is 1%-5%.Note 3: * means there is a significant statistical difference compared with the damaged cell control group (p ⁇ 0.05).
  • 5Kosan potassium ion channels can be divided into different subfamilies (Subfamily) according to their structure and function, such as inward rectifier (Inward rectifier)
  • Rectifiers Four Transmembrane Segments-2 Pores (FourTransmembrane Segments-2 Pores, K2P), Voltage-gated (Voltage-
  • Cilantro Leaf Extract can reduce, Voltage dependence of activation of the voltage-gated ion channel KCNQ2/B [knife. Based on the results of previous experiments on the activity of A, B, and D reagents, this experiment confirmed that A, B, and D reagents all exhibit biological effects through the non-voltage-gated potassium ion channel pathway.
  • Hydrogen peroxide is a kind of reactive oxygen species, which has been widely used to establish HUVEC injury cell models in previous studies [8], and can increase the activity of potassium ion channels [9].
  • hydrogen peroxide significantly increased the activity of non-voltage-gated potassium ion channels in HUVEC cells by 71%, and the experimental results confirmed that the damaged cell model was successfully established.
  • Phase 1 experiment Each reagent group treated the cells for 15 minutes, showing that ⁇ A, B, and D reagents all significantly reduced the activity of the non-voltage-gated potassium ion channel of the damaged cells, with statistical significance.
  • B and D reagents also significantly reduced the activity of non-voltage-gated potassium ion channels in normal cells. Although reagent A also reduced the activity of non-voltage-gated potassium channel in normal cells, it was not statistically significant. The experimental results show that the B reagent has the strongest and most significant effect in reducing the activity of the non-voltage-gated potassium ion channel when the injured cells are treated for 15 minutes.
  • Phase 2 experiment Each reagent group treated the cells for 15 minutes and showed that A and B reagents (extracts had an effect on the activity of voltage-gated potassium ion channels in damaged cells, but there was no statistical significance, only D reagent (extract composition) Compared with the normal cell voltage-gated potassium ion channel activity value, it has statistical significance, showing that the extraction composition D and single extracts A and B have differences in the regulation of normal cell voltage-gated potassium ion channels.
  • Single extracts A, Reagent B showed an increase in the activity of voltage-gated potassium ion channels in damaged cells, while reagent D of the extract composition showed a decrease in the activity of voltage-gated potassium ion channels in damaged cells.
  • Past research literature has shown that hydrogen peroxide can increase the magnitude of calcium-activated potassium currents in HUVEC cells [9], reflecting that hydrogen peroxide increases cellular calcium and activates potassium ion channel activity.
  • Another research literature shows that plant phenolic compounds can inhibit calcium and activate potassium channels [10].
  • calcium-activated potassium channels are traditionally regarded as voltage-gated potassium channels, some literatures have pointed out that some voltage-gated potassium channels can also be regulated by ligand-gated potassium channels by directly combining with plant extracts[ 7].
  • Previous research literature pointed out that among potassium ion channels, voltage-gated potassium ion channels are the main regulatory mechanism of cell viability, cell proliferation and cell death [4, 5].
  • A, B, and D reagents can improve the results of HUVEC cell viability and analyze the results of this experiment.
  • the results of this experiment show that in this experiment, A, B, and D reagents Regardless of whether it is normal or damaged cells, the effect on the activity of non-voltage-gated potassium ion channels is significant, while the effect on the activity of voltage-gated potassium ion channels is limited, and the data are not statistically significant, suggesting that each reagent group is passed through Regulation of non-voltage-gated potassium ion channels to exhibit functional effects on normal cells and damaged cells is to regulate cell viability through non-voltage-gated potassium ion channels.
  • Reagent A at a concentration of 0.1%-0.9% reduces the activity of non-voltage-gated potassium ion channels in damaged cells, which is 54% lower than that of damaged cells.
  • Each reagent group treated the damaged cells for 15 minutes, and the activity of the reagents on the voltage-gated potassium channel of the damaged cells was not statistically significant.
  • 0.1%-0.9% concentration of A increased the activity of voltage-gated potassium ion channels in injured cells by 32%.
  • Concentration B at 0.1%-0.9% increased the activity of voltage-gated potassium ion channels in damaged cells by 12%.
  • D at a concentration of 0.1%-0.9% reduced the activity of voltage-gated potassium ion channels in damaged cells by 28%.
  • composition D shows the difference between composition D and extracts A and B due to the complex action.
  • the comprehensive literature data and the results of this experiment show that SDTL-E exclusive extracts A, B and composition D all regulate cells by affecting non-voltage-gated potassium ion channels.
  • the above experimental results on normal cells and damaged cells are of inspiration and reference value for the further development and development of all-natural plant antioxidant extract products and components, combinations, dosage, and understanding of the mechanism of action on the activity of potassium ion channels.

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Abstract

一种以天然植物提取物皮肤外用促进激素水平，治疗及改善关节退化和骨质疏松症，帮助恢复骨强度，帮助恢复活动能力及消除疼痛的方法，其特点是利用天然植物提取物外用于皮肤，能快速帮助关节退化及骨质疏松患病者消除疼痛，恢复活动能力，恢复骨强度。

Description

皮膚外用治療關節退化及骨質疏鬆症的天然提取物與方法 背景說明:
[0001]單一化學成份是藥物研究領域的主要方向，作用機理明確，絕大多數現代藥 物都是單一的化學成份藥物 ，而多物質及多化學成份的藥物（如複合成份藥物及中藥）因 原料 、分子量、分子結構、沸點、旋光度、皂化值、碘值、崩解度、溶解度與揮發度 等各項物理及生化指標不同 ，存在難以掌握的化學複雜性及多變性，在藥物學研究 中 ，物質與化合及化學物數量越多，其相互間分子物理及生物化學反應越複雜，產生 的結果也越難以預料及掌握 ，使複合藥物的研究困難度遠髙於單一化學成份的藥物， 為尋求生物功能多樣性及有效性以帮助人類健康治療 、抗衰老的功能性產品開發及研 究 ，在已知單一物質功能以外尋求更多的新藥物及治療功能，多種天然物質複合是藥 物研究領域與功能性產品技術努力突破的方向之一 ，多種天然物質及分子複合時因複 合物數量與分子成份交叉多及生物化學反應複雜 ，在複合過程中會產生眾多的不確定 性 ，但是在產生不確定性的同時，產生藥用治療功能作用的機率也隨之増加及提髙， 而一些新產生的功能效果往往是單一化學成份及單一物質所完全不可能產生及存在 的 ，所以利用含多種化學成份的天然物質或以複合方式尋找新的治療疾病功能，在醫 藥研究及功能產品開發方面具有潛力與發展空間 。 摘 要：
[0002；]本發明中的一個實施例包括以天然提取物為主製成的皮膚外用的產品來治療 及改善關節退化和骨質疏鬆症 、幫肋恢復活動能力及消除疼痛。同時，在另一個實施 替换页 （细则第 26条） 例中 ，透過皮膚外用的天然提取物，可改善關節退化和骨質疏鬆症、増加骨强度、幫 肋恢復活動能力及消除疼痛 。在一個實施例中 ，對於包括但不限於女性使用者，透過 皮膚外用的天然提取物在關節部位塗擦 ，不但能改善該關節之退化關節炎和骨質疏鬆 症等症狀 ，也能舒緩或調解女性更年期所產生的疼痛與症狀，恢復活動能力。又在例 一個實施例中 ，本發明之天然提取物包括有效成分是禾本科 ( Gramineae )岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬植物，例如香根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides提取物 (以下統稱蘭草)。在另一個實施例中本發明之天然提取 物包括有效成分是傘形科 (Apiaceae)紅蘿蔔 ( Daucus carota )提取物，除此之外，在一 個實施例中 ，本發明之天然提取物包括蘭草與紅蘿蔔提取物。
[0003]在本發明實施例中的皮膚外用能透皮吸收避免消化液破壞及肝臟首過作用減 效 ，能治療激素異常，使雌二醇恢復正常，能將骨質疏鬆症異常的雌二醇恢復致骨質 疏鬆症前水平 ，阻止骨鈣丟失及向血、尿轉移，提昇骨强度，預防骨折及治療骨質疏 鬆症 。 圖示簡單說明
[0004]具有本領域技術人員可能領會到圖檔中的元素是用來說明簡單明瞭，所以並 非所有的連貫和選擇都表現出來 。例如，在商業上可行的實施例中有用或必要的常見 但廣為人知的要素通常不能加以描述 ，以便對本披露的這些各種實施例的較少阻礙。 可以進一步理解的是 ，而本領域技術人員可能理解，實際上不需要序列方面的這種特 殊性 。也可以理解，本案使用的用語和用語可就其相應的調查和研究領域作出定義， 替换页 (细则第 26条) 除非此處另有規定的具體含義 。
[0005；]圖 1為條形圖顯示動物實驗中藥物處理前大鼠體重。
[0006；]圖 2 為條形圖顯示動物實驗中藥物處理後第 1天大鼠體重。
[0007；]圖 3 為條形圖顯示動物實驗中藥物處理後 20天大鼠體重。
[0008；]圖 4 為條形圖顯示動物實驗中 SDTL-E對去除卵巢模型大鼠血清鹼性磷酸酶 的影響 。
[oooq圖 5 為條形圖顯示動物實驗中 SDTL-E對去除卵巢模型大鼠雌二醇含量的影 塑 。 詳細說明
[0010]物質由不同的分子及分子結構所組成，每一物質都有不同的分子式、空間結 構及功能作用 ，在所有的物質空間中 ，物質的內外所處空間或分子交叉空間與所產生 的功能作用是一個變量及比量關係 ，而其比量因為其它比量的因素參予變量改變，而 會使之產生不同的功能變化及結果 ，在同一環境空間中複合化學成份的種類、數量多 少及相互比例是一種比量的動態與靜態平衡關係 ，而相互的比量平衡對於物質的功能 產生與消失以及功能的效果強弱具有重要的影響 ，在同一所處空間中不同物質及分子 的數量越多其分子交叉點越多 ，集束及變化比量也越多、空間中的比量變化過程也越 複雜 、變化比量也越難以掌握。而物質及分子在同一空間的比量因素越少，其中的分 子交叉點及比量變化也越少 ，物理空間中的過程變量也越少，變化度及其比量結果也 越少 。物質的品種選擇是否適當與相互比例是否適合與何種使用方式（如口服、注射、 替换页 （细则第 26条） 皮膚外用等方式），都會影響其功能作用及效用結果，天然植物能通過複雜成份與未知 生化反應或電子置換反應及不同的使用方式 ，可能產生一些新的藥物治療功能及效 果 ，而這些效果正是研究者所努力或期待的結果，可能會給人們帶來意外的驚喜。
[0011]在自然界中 ，骨骼是脊椎生物主要器官組織之一，功能之一是支撐、保護身 體及通過關節與肌肉 、神經組織使生物體保持運動能力 ，骨骼有儲藏礦物質等功能， 主要由骨質 、骨髓和骨膜構成，骨關節（Articulation） 是骨與骨之間能活動與變換角度 的部位 ，其間有軟骨、關節嚢、韌帶及滑液，所有的骨關節功能障礙疾病都會導至生 物體（包括人體）運動及活動能力下降或完全喪失。骨質疏鬆症及退化性關節炎（又稱退 行性關節炎） 是骨科及運動能力障礙方面最主要疾病之一，全世界患者人數衆多，在 發達先進國家及地區患者比未發達地區普遍 ，多存在於 40以上年齡人群 （絕經期後女 性尤多），並向年輕人群發展趨勢明顯，有資料顯示數年前全球僅退化性關節炎患者就 已超過 8億人，退化性關節炎及骨質疏鬆症疾病嚴重影響人們活動能力及生活自理能 力 。現代醫學治療骨關節退化及骨質疏鬆以手術、注射及口服藥物方式為主，能有效 並迅速治療退化性關節及骨質疏鬆症並改善關節活動能力的藥物極少 ，能有效並迅速 治療退化性關節及骨質疏鬆症的外用藥物更是幾乎沒有 。
[0012]在疾病治療領域，外用藥物均是通過皮膚給藥的方式，藥物起效時間及藥用 治療效果普遍明顯低於口服及注射方式的給藥效果 ，本發明是利用選定天然植物提取 物的分子多樣性及分子集束複合 （混合）而產生功能作用，能以包括不限於皮膚外用 形式應用於骨關節退化及骨質疏鬆疾病的臨床治療及改善症狀 ，具有治療抽筋、 肌肉 替换页 （细则第 26条） 疼痛及青 、中、老年退化性 (退行性) 關節炎的關節異響、關節疲軟、肌肉無力、疼 痛 、下蹲困難、無法上下樓梯等症狀的功能作用，能改善骨質疏鬆症的激素異常與髖 關節疼痛 ，増加骨强度及提昇抗骨折的能力。本發明實施例能快速減輕、消除及治療 骨關節退化及疏鬆產生的臨床症狀 ，適用者不分年齡及人種、性別，可應用於各種生 物 ，包括但不限於貓、狗等動物，容易操作。
[0013；]本方法之提取物可以多種工藝方法取得，包括蒸餾、壓榨及超臨界提取。本 發明可延伸應用於各領域 ，包括日用化工、化妝、護膚、保健及藥品，能以各種形式 及劑型應用 ，包括皮膚外用及乳液劑型。
[0014]退化性關節炎及骨質疏鬆症全世界患者衆多，並向年輕化發展，關節炎的關 節異響 、關節疲軟、肌肉無力、疼痛、下蹲困難、無法上下樓梯等行動不便臨床症狀 及骨質疏鬆症如骨密度 、疼痛等臨床症狀普遍存在，給眾多患者、家庭及社會造成嚴 重困擾及沉重負擔 ，現代治療方法除關節置換手術、關節玻尿酸注射、口服葡萄胺、 口服補鈣及人工化學藥物治療方式外 ，對退化性關節炎及骨質疏鬆症尚無其它具明顯 效果治療改善方法 。骨質疏鬆症是一種新陳代謝的疾病，患者因骨質密度減少極易發 生疼痛 、骨折及併發症死亡現象，補鈣、補充維生素 D及運動雖是應對方法之一，但 效果有限 ，如非甾體抗炎藥雙氯芬酸 (Diclofenac)用於關節炎及骨質疏鬆症的體外治 療 ，但因孕婦禁用及副作用較多，美國食品藥物管理局 (F D A )懷孕用藥制度將此藥品 分級為 C中度風險和 D髙度風險，產生的副作用有胃部不適、噁心嘔吐、胃灼熱、腹 瀉 、便秘、脹氣、頭痛、嗜睡、頭暈等，而其它藥物均存在治療周期長、副作用多、 替换页 (细则第 26条) 不能連續使用的缺陷 。
[0015]本發明有對人體及動物副作用小特點，僅知的不良反應是如果出汗時使用， 因皮膚單向排汗機制使皮膚出現極少量局部性小紅點現像 ，停止使用約两日紅點即自 行消失 。
[0016；]天然植物或提取物是天然藥物原料來源之一，提取單一化合物（如青蒿素、 葉黃素 、欖香烯等）已廣泛應用於醫藥、美容及相關產業或產品，並廣泛應用於抗衰 老及天然藥物的產生 ，單一化合物在提取過程中能通過現代工藝技術將對人體有害的 重金屬 、農藥殘留等有害物質摒除，提供了更好及當量濃度更髙的藥物原料，單一化 合物功能較簡單明確 ，效果較清晰，作用靶點及藥理較易清楚了解。天然植物與生物 之間具有較佳的生物認受性及相容性 ，而天然提取物中化合物因分子集束現象，而能 對不同細胞 、作用位點及功能異常的酶（ Enzyme）產生抑制、提昇等調節作用。
[0017]因全球植物衆多，借鑒一些傳統醫學、醫藥如中醫藥理論及知識，結合各種 物理 、生物化學方法對眾多植物進行充分瞭解、分析、評估及研究後，從眾多植物中 苢 0選了生薑 Zingiber officinale、辣椒 Capsicum annuum、洋蔥 Allium cepa、大宗宗 Allium sativum、胡椒 Piper nigrum、花椒（辛辣類）； 佛手相 Citrus medica var. sarcodactylis擰檬 Citrus limon、桂 Citrus reticulata、青撤欖 Canarium album（果類）； 玫瑰 Rosa rugosa、薰 衣草 Lavandula、岩蘭草 Andropogon zizanioides、當是帚 Angelica sinensis、香茅 Cymbopogon（芳香油類）； 菊花 Cymbopogon、茶花 Camellia japonica '桂花 Osmanthus fragrans（花葉類）； 黑木耳 Auricularia auricula、白木耳 Tremella fuciformis、紅藻 替换页 （细则第 26条） Rhodophyta（含膠質類）； 髙麗蔘 Panax ginseng、西洋蔘 Panax quinquefolius '黨蔘 Codonopsis pilosula、） '少參 Adenophora stricta Codonopsis pilosula（暮材 I頁）； 黃瓜 Cucumis sativus、紅蘿蔔 Daucus carota、南瓜 Cucurbita cv、絲瓜 Luffa aegyptiaca（瓜果 類） 等多類天然植物及提取物作為最佳候選物，再將每一種物質給予膝關節退化及骨 質疏鬆症患者的自願人群皮膚外用 1次，即時與數小時後詢問其状况及感覺。在一個 實施例中 ，從試用者反映中發現禾本科岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬植物， 例如香根草 vetiver（chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides提取物對膝關節 疼痛現象有舒緩疼痛作用（約小於 2小時），亦對關節僵硬及活動能力有改善作用。在 另一個實施例中 ，發現紅蘿蔔 Daucus carota提取物對關節僵硬及疼痛也有改善作用。 爾後 ，選定將岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬（如香根草 vetiver（chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides提取物）與紅蘿蔔 Daucus carota提取物複合，或 再與其它提取物進行複合 ，以尋求更佳、更快、更明顯的功能作用及治療效果。
[0018]在一個實施例中 ，本發明是一種以天然植物岩蘭草 vetiveria zizanioides及其 同科屬（如香根草 vetiver（chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides的提取物 皮膚外用治療及改善關節退化和骨質疏鬆症的方法 ，提取物可與其它介質或物質溶 合 ，包括油脂 （但不限於油脂、 提取物、 溶劑），在一個實施例中 ，提取物與溶劑在 1 ~9 : 9 ~1的重量比例範圍，在一個實施例中 ，重量比例範圍為 1~7 : 3~9，在一個實施 例中 ，重量比例範圍為 1~5 :5~9，皮膚外用有減緩關節疼痛、僵硬等作用。
[0019]在一個實施例中 ，本發明是一種以天然植物岩蘭草 vetiveria zizanioides及其 替换页 （细则第 26条） 同科屬 (如香根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides的提取物 與紅蘿蔔 Daucus carota提取物複合的配方，能以皮膚外用方式治療及改善關節退化和 骨質疏鬆症 ，配方由岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬（如香根草 vetiver （chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides的提取物為主要成份，在 _個實施 例中 ，再與紅蘿蔔 Daucus carota提取物複合而成， 在一個實施例中 ，两提取物相互 間重量比例範圍為 1~9 : 2~9 ;在一個實施例中 ，比例範圍為 1.5~7.5 : 2.5~8.5 ;在一個 實施例中 ，比例範圍為 1~5 : 4.5~8。
[0020；]在一個實施例中 ，本發明中皮膚外用能將去卵巢大鼠骨質疏鬆症的異常雌激 素及血清鹼性磷酸酶含量恢復至骨質疏鬆症前的正常水準 ，對雌激素缺少引起的骨質 疏鬆有生理性的改變 、治療與保護作用，能應用於與骨關節退化及骨質疏鬆相關的疾 病治療 。
[0021]在一個實施例中 ，本發明皮膚外用能治療人體骨質疏鬆症的髖關節疼痛及關 節退化的關節異響 、關節無法彎曲、關節疲軟、肌肉無力、下蹲困難、上下樓梯困難 皮骨强度降低 ，是一種治療疾病的方法。
[0022]在本發明中 ，提取物可以用各種生產工藝方法取得，包括蒸餾、萃取、超臨 界等 ，配方能與其它物質再次複合或溶合，能以各種不同形式及劑型，例如液體、乳 液 、噴霧、塗抹等。
[0023]在一個實施例中 ，本發明能改善人體退化性關節炎及骨質疏鬆症臨床症狀， 改善關節活動能力 ，増加關節活動幅度及減輕關節疼痛，有改善關節異響、改善關節
8 替换页 （细则第 26条） 無法彎曲 、改善關節疲軟、改善肌肉無力、改善下蹲困難、改善上下樓梯困難等臨床 症狀的效果 ，並具有改善骨質疏鬆症髖關節疼痛的功能作用。
[0024]在一個實施例中 ，本發明能調節激素水平，能應用於改善骨關節退化與骨質 疏鬆症 ，及激素異常引致的身體不適現象。
[0025]芳香酶 ( Aromatase )被稱為雌激素合成酶 ( estrogen synthetase ) •能催化與 甾體激素合成過程中從雄激素到雌激素的芳香化反應 ，催化雄烯二酮、睾酮向雌酮及 雌二醇转化 ，芳香酶在生殖腺、腦、脂肪組織、血管、皮膚和骨骼中均有存在，芳香 酶反應速度可由辅酶 ( coenzyme )調節。 SDTL-E的骨質疏鬆症大鼠實驗結果提示， SDTL-E具有芳香化加速輔酶 ( Aromatization Acceleration Coenzyme )作用，其提取物複 合所產生的芳香化加速辅酶集束 [ Aromatization Acceleration Coenzyme Cluster (AACC) ] 對芳香酶 ( Aromatase )有調節作用，其機制可能是通過激活芳香酶 ( Aromatase )酶 促反應 ( Enzyme catalysis )使異常的激素水平，包括雌二醇恢復正常及使異常多 ALP 活性 、血清鈣、尿鈣等恢復正常，促使了破骨細胞與成骨細胞對身體的作用，而呈現 出將異常激素恢復致正常水平及促進骨强度恢復的藥物治療效果 。
[0026]實施例：
[0027]在以岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬 (如香根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides提取物複合其它提取物的組合中發現，岩蘭草與 紅蘿蔔提取物複合後有更明顯止痛増效作用外 ，還増加了改善關節僵硬、關節異響、 關節彎曲及關節活動能力的功能效果 ，所以選擇將天然植物岩蘭草 vetiveria zizanioides 替换页 (细则第 26条) 及其同科屬 (如香根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides提取 物與紅蘿蔔 Daucus carota提取物共同組成複合配方（以下簡稱為 SDTL-E）。本發明將此 2天然提取物在比例範圍內混合 ，作為本發明中的複合配方，試用於人體及動物，並 根據動物實驗及人體使用統計 ，証實了本發明配方及使用方法具有實用性強、功效明 顯 、起效快速、作用廣泛及使用方便的獨特優點，並可與其它提取物及包括不限於化 合物 、化學物、油脂、溶劑、水、乳液等物質再次複合或相溶合，能以包括不限於滴 液 、噴霧、塗抹、敷塗等方式使用於皮膚，能使用於包括不限於人體，本發明在動物 及人體的實施例如下：
[0028]實施例 _ :
[0029]激素缺乏是造成絕經後骨質疏鬆及關節退化的主要成因之一，而在小腸、成 骨細胞 、破骨細胞前體、骨細胞和生長骨板等軟骨細胞中均有激素受體，絕經後雌激 素水準下降及血清鹼性磷酸酶含量増加是女性發生關節退化及骨質疏鬆的最主要原因 之一 ，遂以本發明方法中一個實施例中之混合物配方 （以下簡稱 SDTL-E） 使用在去卵 巢（ovariectomized, 0VX） 骨質疏鬆模型大鼠皮膚，觀察大鼠體內數據變化。最終實驗顯 示皮膚外用治療大鼠後 ，去卵巢模型大鼠血清鹼性磷酸酶含量降低恢復到接近正常水 準 （ P<0.01），去卵巢模型大鼠雌激素上昇恢復到接近正常水準 （ P<0.01）。（見附件 1. 動物實驗 J
[0030；]在一個實施例中 ，顯示本 SDTL-E可以提髙生物大鼠體內雌激素及降低大鼠血 清鹼性磷酸酶含量至正常水準 ，具有平衡去卵巢模型大鼠雌激素及血清鹼性磷酸酶含
10 替换页 （细则第 26条） 量的作用 ，具治療關節退化及骨質疏鬆症的潛在研究與實際應用價值。在一個實施例 中 ，選用的去卵巢大鼠實驗模型文献資料豐富，技術成熟且穩定可靠，是世界衛生組 織 WHO 及美國國家衛生研究院 (NIH)均推薦使用的 OVX大鼠研究的最佳模型。
[0031]在一個實施例中 ， SDTL-E配方是以岩蘭草提取物為主要與紅羅蔔 Daucus camta提取物共同進行複合，在一個實施例中 ， 2提取物複合前單獨震盪並攪拌＞10 秒 ，在一個實施例中 ， 2提取物相互間重量比例範圍為 1〜 9 : 2〜 9 ;在一個實施例 中 ，比例範圍為 1.5〜 7.5 : 2.5〜 8.5 ;在一個實施例中 ，比例範圍為 2〜 5 : 4.5〜 8。在 一個實施例中 ，兩物混合約在＞4°C以上環境可以＞40轉 /秒混合攪拌＞5秒後 (視實際配 比總重量最終決定増加攪拌時間)靜置，可以與其它溶劑如油脂溶合，在一個實施例 中 ，與油脂溶合在 1 ~9 : 9 ~1的重量比例範圍有效，在一個實施例中 ，重量比例範圍 為 1~7 : 3~9，在一個實施例中 ，重量比例範圍為 1~5 :5~9，外抹皮膚使用於實驗動 物 ，結果顯示對模型大鼠早期的鹼性磷酸酶 Alkaline phosphatase (ALP)代償性升髙具有 下調作用 ，對大鼠雌二醇激素有増加作用，能減輕骨質疏鬆動物骨吸收亢進，有恢復 雌激素及血清鹼性磷酸酶的治療功能及平衡作用 ，對雌激素缺少引起的骨質疏鬆的病 理性改變具有保護與治療作用 ，能迅速増加骨强度，増加抗骨折能力 ，可以研究發展 成為治療骨關節退化及骨質疏鬆症的藥物 。 (見附件 1. 動物實驗 J
[0032]實施例二：
[0033]在一個實施例中 ，先以天然植物岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬 (如香 根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides的提取物以溶劑稀釋
11 替换页 (细则第 26条) （酒精、油脂等） ，使用於人體退化性關節炎膝部位皮膚 ， 在一個實施例中 ，提取物與 溶劑在 1 ~9 : 9 ~1的重量比例範圍有效， 在一個實施例中 ，重量比例範圍為 1~7 :
3~9 在一個實施例中 ，重量比例範圍為 1~5 :5~9，做為溶劑有減緩及改善關節疼痛、 僵硬的作用 ， 在一個實施例中 ，使用於人體退化性關節炎膝部位皮膚時每日 2次，每 次 0. 4m I ， 8人試用 ，於使用 2小時後統計 ， 在一個實施例中 ，其中 4人關節疼痛僵 硬症狀有減緩趨勢（趨勢率為 50%）能保持約 2小時左右 ， 在一個實施例中 ，顯示出岩蘭 草單一提取物對關節退化疼痛 、僵硬症狀都有改善作用。在一個實施例中 ，經多方面 分析考慮後 ，將岩蘭草、紅蘿蔔 2物提取物組成 SDTL-E配方作為人體皮膚外用試劑 ， 使用於關節退化患者（自願使用者）膝關節皮膚處 ，觀察效果並作統計。
[0034]在一個實施例中 ， SDTL-E配方由岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科屬（如香 根草 vetiver（chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides與紅蘿葡 Daucus carota 提取物複合而成 ， 在一個實施例中 ， 2提取物複合前單獨震盪並攪拌＞10秒 ， 在一個實 施例中 ， 2提取物相互間重量比例範圍為 1〜 9 : 2〜 9 ; 在一個實施例中 ， 比例範圍為 1.5〜 7.5 : 2.5〜 8.5 ; 在一個實施例中 ， 比例範圍為 2〜 5 : 4.5〜 8。在一個實施例中 ， 2 物混合在＞4°C以上環境以＞40轉 /秒混合攪拌＞5秒（視實際總重量最終决定増加攪拌時 間）後靜置， 在一個實施例中 ，再與油脂溶合 ， 在一個實施例中 ，與油脂溶合在 1 ~9 : 9 ~1的重量比例範圍 ， 在一個實施例中 ，重量比例範圍為 1~7 : 3~9 ， 在一個實施例中 ， 重量比例範圍為 1~5 :5~9， 在一個實施例中 ， 外抹皮膚使用於人體 ， SDTL-E以 23名 患有膝關節障礙年齡 50 -96歲人士試用 ， 在一個實施例中 ，每日使用 2次 ，每次 0. 4
12 替换页 （细则第 26条） m l 48小時統計 23人中 21人症狀得到明顯改善（2人無效） ， 在一個實施例中 ，有效 率為 92.93 %（見表 1）， 在一個實施例中 ， SDTL-E 配方及皮膚外用方法顯示出明顯的 減輕人體退化性關節炎臨床症狀 、増加關節活動幅度、改善關節活動能力及行走運動 能力的功能治療作用（見表 1）。
[0035]再另以 17名患有骨質疏鬆症髖關節疼痛的 55-81歲人士試用 ，每日 1次 ，每 次 0.4 m I ， 20分鐘及 48小時調查， 17人中 16人症狀明顯改善（1人無效） ，統計有效 率為 94.118 %。（見表 2）
[0036]表 1 :
[0037]實施例二
[0038]退化性關節炎皮膚外用 SDTL-E每日 2次 ，每次 0. 4 m I。
[0039]效果統計表 ，統計人數 23人 （男性 11人、女性 12人、年齡 50 -96歲）
Figure imgf000014_0001
13 替换页 （细则第 26条）
Figure imgf000015_0001
[0040]退化性關節炎每日皮膚外用 SDTL-E每日 2次 ，每次 0. 4 m I。
[0041]約 20分鐘、 4 8小時調查表，調查人數 23人 （男性 11人、女性 12人、年齡 -96歲）
Figure imgf000015_0002
14 替换页 （细则第 26条）
Figure imgf000016_0001
15 替换页 （细则第 26条）
Figure imgf000017_0001
16 替换页 （细则第 26条）
Figure imgf000018_0001
注： 表中無效者可能是使用者不是退化性關節炎或是其它炎症患者
[0042]表 2 :
[0043]骨質疏鬆髖關節疼痛每日 1次，每次 0. 4 m I SDTL-E皮膚外用
[0044] 48小時效果統計表，統計總數 17人（男性 4人、女性 13人、年齡 55-81歲）
Figure imgf000018_0002
[0045]骨質疏鬆髖關節疼痛每日 2次，每次 0.4 m I， SDTL-E皮膚外用。
[0046] 48小時效果調查表，統計人數 17人（男性 4人、女性 13人、 55-81歲 ）
Figure imgf000018_0003
17 替换页 （细则第 26条）
Figure imgf000019_0001
注： 表中無效者可能是使用者不是骨質疏鬆症或是其它炎症患者。
[0047]在一個實施例中 ，人體試用顯示出單一岩蘭草 vetiveria zizanioides及其同科 屬（女口香根草 vetiver（chrysopogon zizanioides） 或 Andropogon zizanioides的提耳又物有改 善關節疼痛及僵硬的作用 ，在一個實施例中 ，而 SDTL-E複合配方比單一岩蘭草提取物 治療作用更快速 ，效果也更顯著，在一個實施例中 ，經動物實驗証實， SDTL-E配方對 去卵巢大鼠雌激素有提昇作用 ，對血清鹼性磷酸酶含量有降低作用，另觀察數例皮膚
18 替换页 （细则第 26条） 外用於貓或狗 ，對關節活動障礙也有改善的效果，能應用於其它動物的治療用途，且 配方可與包括不限於油液 、乳霜的其它物質製成不同的劑型使用。
[0048]除了以上的實驗數據外，附件二至四提供其他支持本發明特性的實驗報告， 包括 SDTL-E對細胞活力的影響及比較； SDTL-E對細胞內活性氧的影響； SDTL-E不同比 例組合物對細胞鉀離子通道的活性影響 。
[0049]儘管是可變的並且取決於應用，但是使用在此揭示的方法或成分的實例。熟 習此項技術者將會認識到 ，有些步驟可以以任何實際的順序進行，從而以期望的用途 製成成分或化合物 。
[0050；]以上描述和圖式僅解釋和說明本發明，本發明不限於此。雖然說明書是關於 某些實行方案或實施例來描述的 ，但是出於說明的目的闡述了許多細節。因此，上述 內容只是說明了本發明的原則 。例如，本發明可以具有其他具體形式而不背離其精神 或本質特徵 。所描述的佈置是說明性的而不是限制性的。對於熟習此項技術者而言， 本發明容許附加的實行方案或實施例 ，並且本申請中所描述的這些細節中的某些細節 可以在不脫離本發明的基本原理的情況下有相當大的變化 。應意識到熟習此項技術者 能設計出各種方案 ，這些方案雖然並未明確描述或顯示於本文中 ，但是體現本發明的 原則 ，因此在其範圍和精神內。
[0051]上述說明具有說明性，沒有限制性。在審查披露時，實施例的許多變化可能 會變得明顯 。因此，範圍實施例不應參照上述說明確定，而應參照待決權利請求及其 全部範圍或等價物來確定 。
19 替换页 （细则第 26条） [0052]任何實施例中的一個或多個特徵可與任何其他實施例的一個或多個特徵結合 使用 ，而無需偏離範圍實施例。對於 "一個〃 ， "單個〃 ，或 "某個〃 意在指”一個或 多個”，除非特別指出相反的陳述。背誦 "和 /或" 意在代表該術語中最具包容性的意 識 ，除非有相反的明確說明。
[0053]雖然本披露可以以許多不同的形式體現，但提交圖紙和討論時的理解是，本 披露是一項或多項發明原則的體現 ，無意將任何一個實施例限於所說明的實施例。
[0054]本披露為上述長期需求提供了解決方案。特別是，本發明的方面克服了依賴 現有使用非天然或化學配方為主的混和物來治療及改善關節退化和骨質疏鬆症 、幫助 恢復活動能力及消除疼痛 。
[0055]上述成分和方法的進一步優勢和修改，可能很容易發生在本領域技術人員。
[0056]因此，披露在更廣泛的方面並不限於具體細節、代表性制度和方法，以及上 述說明性實例 。可對上述規範作出各種修改和修改，而無須偏離本披露的範圍或精 神 ，本披露應涵蓋所有此類修改和變更，前提是這些修改和變更屬於下列權利請求及 其等同件的範圍 。
20 替换页 （细则第 26条） 附件一
SDTL-E對去勢雌性大鼠骨質疏鬆症的作用實驗 摘要 骨質疏鬆症影響全球，研究起效快、治療期短、副作用小的治療骨質疏鬆藥物有其 必要性。本實驗中，以去卵巢 （OVX）大鼠作為骨質疏鬆症模型，以天然植物提取物 SDTL- E作为治療藥物成份 。大鼠被隨機分配到假手術對照組（對照組）、去卵巢大鼠骨質疏鬆 模型對照組（模型組 、去卵巢大鼠骨質疏鬆模型 SDTL-E治療組 8011^£組＞ ，模型 組及 SDTL-E組接受卵巢切除手術，對照組接受手術但沒有切除卵巢。手術後 3個月， 去卵巢大鼠骨質疏鬆模型組 、去卵巢大鼠骨質疏鬆模型（ SDTL-E治療組）與對照組相 比 ，骨密度差異顯著，數據顯示骨質疏鬆症造模成功。將對照組和模型組皮膚外用塗抹 植物油液體 ， SDTL-E組皮膚外用塗抹油狀液體 SDTL-E，每日兩次，持續 20 日 。
20 日後實驗結果顯示，模型組血清雌二醇值仍明顯偏低 ·血清鹼性磷酸酶 ALP） 活 性 、血清鈣、尿鈣仍明顯偏髙，骨力學指標仍明顯偏低，骨小梁數目減少、變細、稀疏 及斷裂 。而 SDTL-E組雌二醇值顯著恢復至接近（假手術）對照組水平， ALP活性、 血清鈣 、尿鈣顯著降低至接近（假手術）對照組水平，骨力學指標扭轉力、扭矩和剪切 模量有提髙 ，剪切應力顯著提升至接近（假手術）對照組水平，骨小梁數目有輕度増多 趨勢 。
21 替换页 （细则第 26条） 本研究顯示，皮膚外用 SDTL-E在 20日內能迅速內源性調節、恢復去卵巢骨質疏鬆 症大鼠體內激素 、 ALP活性、血清鈣、尿鈣水平，能増加骨小梁數量和骨小梁厚度，能 改善骨質疏鬆症 ，増加骨強度及抗骨折能力。研究提示 SDTL-E有預防骨質疏鬆症骨折 發生 、减少骨質疏鬆症骨折率的藥物治療作用。 研究背景 全球 79億人口骨質疏鬆症患病率為 183%約 13.55 億人。 50 歲以上女性患病率為 37% 是男性的 4倍。激素失衡及缺乏會減少破骨細胞再吸收活性，及降低成骨細胞活 性導致骨質淨損失 ，所以藥物能降低骨折率及骨折後的死亡率才具最佳的臨床效果。 藥物治療主要分為 口服及注射兩大類 ， 一類是降低骨吸收速度， 有雙磷膦酸鹽 (Bisphosphonates)、雌激素 (Estrogen)和地諾單抗 (Denosumab) 等。另 _類是増加骨形成， 藥物有甲狀旁腺激素類似物 (Parathyroid Hormone Analogs) 等。現有藥物存在治療期遠 長於骨折後死亡時間的嚴重缺陷 。 本研究使用專利植物提取物 SDTL - E為治療藥物，以去卵巢 OVX；)骨質疏鬆症模型 大鼠皮膚外用 20 日 ，然後通過用藥前後的對比分析雌激素、骨代謝標誌、血清鹼性磷 酸酶 (ALP) 活性、血清鈣、尿鈣、骨密度、骨力學指標和骨組織變化等指標，觀察 SDTL - E對 OVX 誘導骨質疏鬆症大鼠的骨代謝、骨強度等影響，以了解天然植物成份治療 骨質疏鬆症的功能藥效及作用機制 。 研究程序
22 替换页 (细则第 26条) 實驗大鼠
3 月齡 Sprague Dawley 雌性大鼠從廣東省醫學實驗動物中心（^Foshan, Guangdong, China^f買。大鼠飼料為 SPF級顆粒鼠料，並可自由攝取瓶裝自來水。飼養條件為溫度 20°C 濕度 80%，光照明暗各 12小時。大鼠餵養 15天后，隨機分配到以下三個處理組 （每組 10-12隻大鼠）：（ 1）假手術對照組（對照組）； （2）去卵巢大鼠模型對照組（模 型組；）； C3） 去卵巢大鼠骨質疏鬆模型 SDTL-E治療組 CSDTL-E組）。 去卵巢大鼠模型和處理程序 模型組及 SDTL-E治療組給予乙酗（Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd, Shanghai, China）麻醉，無菌操作，在劍突下 4 cm處打開腹腔，約 1.5 cm，牽出脂肪墊找出兩側的 卵巢並摘除 ，送回脂肪墊縫合腹腔。對照組接受上述手術但並沒有切除卵巢。然後肌肉 注射氨节青黴素（^Sinopharm Chemical Reagents） 10萬單位 /只，連續注射 3天。上述動物 飼養 3個月 ，然後經測量重量和雙能 X線檢測骨密度，數據證實骨質疏鬆模型造模成 功 。 以上 3組大鼠給予 3%戊巴比妥鈉（ 36mg/kg）（Sinopharm Chemical Reagents） 腹腔 注射麻醉後 ，於背部塗抹脫毛劑（硫化鈉 3g， 肥皂粉 lg，澱粉 7g，加水至適量調至糊 狀 ）5分鐘左右，脫毛面積約 3cmx4cm。脫毛 48小時後開始給藥。將 100 |il/kg/d SDTL- E 及植物油 （ Shandong Luhua Group, Yantai, Shandong, China）外用塗抹於大鼠脫毛區 域 ，每天兩次，持續 20 天。 對照組和模型組皮膚外用塗抹植物油， SDTL-E組皮膚外
23 替换页 （细则第 26条） 用塗抹 SDTL-E。 給藥第 19天收集 24小時尿量， -80°C 保存待測；末次給藥 45分鐘後，用 3%戊巴 比妥鈉麻醉動物 ，腹腔動脈取血， 3000rpm離心，取上清液 -80°C保存待測。斷頸處死各 組大鼠 ，無菌條件下取大鼠右側股骨、脛骨和左側股骨，用生理鹽水濕紗布包裏 -80°C保 存待測 。
ALP 活性測定
ALP測試盒 (Nanjing Jiancheung Bioengineering Institute, Nanjing, Jiangsu, China) 將被 用作測定血清 ALP活性。根據供應商的說明，樣品中的血清 ALP與試劑 盒提供的對 硝基苯磷酸鹽底 物 (p-Nitrophenylphosphate)發生反應生成黃色產物 ，然後使用 S22PC 分光光度言十 (Shanghai Lengguang Technology Co. Ltd, Shanghai, China).在 415 nm波長 測量吸光度以量化血清 ALP活性。 鈣離子測定 金丐離子測試盒 (Nanjing Jiancheung Bioengineering Institute)被用作測定血清和尿 #5離 子水平 。根據供應商的說 明 ， 樣品中的鈣離子與試劑盒提供的甲基百里酚藍底物 (Methylthymolblue)發生反應生成藍色產物，然後使用 S22PC 分光光度計 .在 610 nm波 長測量吸光度以量化血清和尿鈣離子水平 。 肌酐測定
24 替换页 (细则第 26条) 肌酐測試盒 (Nanjing Jiancheung Bioengineering Institute)被用作測定尿肌酐水平。根據 供應商的說明 ，樣品中的尿肌酐被試劑盒提供的氧化酶氧化，產生紫紅色產物，然後使 用 S22PC 分光光度計 .在 546 nm波長測量吸光度以量化尿肌酐水平。 雌二醇測定
AxSYM 雌二醇劑盒 (Abbott, Chicago, Illinois, U.S. A)被用作測定雌二醇水平。根據 供應商的說明 ，樣品中的血清雌二醇以抗體-雌二醇-鹼性磷酸酶偶聯物的形式與基質孔 結合 ，然後與 4 -甲基饊形酮磷酸酯底物 (4-methylumbelliferyl phosphate)發生反應產生榮 光 ，然後使用 ARCHITECT i2000SR免疫檢測分析儀 (Abbott)測量榮光以量化血清雌二 醇水平 。 骨密度檢測 各組大鼠乙酗麻醉，當大鼠呈穩定的昏睡狀態達到 5min以上時，置於 Lunar Prodigy雙 能 X線骨密度儀 (GE Healthcare, Chicago, Illinois, U S A) 的探頭下，掃描速度為 60.0 mmol/L/秒， 步距 1.0x1. Ommol/L,應用小動物軟體模組校準後進行全身掃描，測定骨密度 值 BMD(CV<1%) 。 骨力學檢測 右側脛骨 CTibia；) 用於扭轉實驗 (Torsional Testing) 。扭轉實驗： 將脛骨的近端和遠端 嵌入聚甲基丙烯酸甲酯中 ，置於 858 Mini Bionix II 型材料測試系統上進行扭轉實驗
25 替换页 (细则第 26条) ( MTS Systems, Eden Prairie, Minnesota, U.S.A )。標本的遠端以 6°/min 的速度橫向旋 轉，直到觀察到骨衰竭 (Bone Failure)。從負載位移曲線計算峰值扭轉力 ( N )、扭矩 ( Nmm )、 剪切應力 ( MPa )和剪切模量 ( MPa )數據。 組織學檢查 去除大鼠左側股骨近端 1/2 軟組織，用新鮮配製的 10%的中性福馬林 (Sinopharm Chemical Reagents) 固定 24h 後 ， 用 0.01M 磷酸鹽緩衝溶液 (PBS) (Sinopharm Chemical Reagents) 沖洗 3次，再用 20%的甲酸溶液 (Sinopharm Chemical Reagents)脫金丐 6 天，每日需更換工作液， PBS沖洗後， 75%、 80%、 95%、 100%各梯度乙醇 (Sinopharm Chemical Reagents)脫水，然後用二甲苯 (Sinopharm Chemical Reagents) 處理 2次，每次 15min，再以 60°C的石臘浸瀆 3 h，包埋過夜，第 2 日按股骨縱徑方向 5 pm連續切片， 貼片於經 4%的多聚賴氨酸處理過的載玻片，烘乾，行 HE (Sinopharm Chemical Reagents) 染色 ，光學顯微鏡 (Leica, Wetzlar, Germany)下觀察骨組織的結構變化。 統計分析 所有數據均通過統計軟件 GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, U S A.) 進行分析。實驗結果以平均值 ± 標準差表示。任何兩組之間的組間差異比較 採用 t檢驗。當 P < 0.05 時，差異被認為具有統計學意義。 結果
OVX 去卵巢骨質疏鬆大鼠模型
26 替换页 (细则第 26条) 去卵巢 3個月後，模型組、 SDTL組及對照組大鼠，在準備皮膚給藥前進行骨密度 檢查 。 模型組和 SDTL-E組骨密度明顯低於對照組 （P<0.05）（表 1），與對照組比較有 明顯差異 ，顯示 OVX誘導骨質疏鬆症大鼠模型建立成功。
⑹ 分組 骨密度 ( g/cm2 )
12 模型組 0. 20±0. 02*
12 對照組 0. 22±0. 02
10 SDTL組 0. 20±0. 01** 表 1 .去卵巢 3 個月後大鼠骨密度 *^<0.05, **P<0.01 vs對照組
OVX 大鼠體重變化 所有組別大鼠在去卵巢前體重相近。去卵巢 3個月後的皮膚給藥第 1天，模型組和 SDTL- E 組體重明顯髙於對照組（P<0.01）。 SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E，模型組和對照組皮 膚外用植物油 ， 20 天後體重無明顯改變 ，模型組和 SDTL-E 組體重仍髙於對照組 （P<0.01）（表 2，附件一圖 1）。 分組 ( n ) 去卵巢前重量 給藥 1天後重量 給藥 20天後重量
(g) (g) (g)
12 模型組 266. 00± 10. 37 341. 92±34. 36** 343. 00±34. 93**
12 對照組 268. 58± 11. 02 289. 08±21. 04 291. 25±21. 78
10
SDTL組 264. 80±8. 16 346. 00±29. 62** 341. 10±28. 51**
27 替换页 （细则第 26条） 表 2 . 大鼠去卵巢前及給藥處理後體重 *^<0.01 vs對照組 大鼠體重變化 。去卵巢手術後 90天，模型組（ n = 12）和對照組（ n = 12）大鼠皮膚外 用植物油 。 SDTL-E組 = 10）大鼠皮膚外用 SDTL-E。皮膚外用每天兩次連續 20天。 大鼠體重分別在去卵巢手術前 、術後 90 天 （給藥 1天後）和術後 110 天 （給藥 20天 後）測量。結果以平均值 ± 標準差表示。 **^<0.01 vs對照組。
SDTL-E 有降低 OVX誘導骨質疏鬆症大鼠血清 ALP活性作用 ALP 測定被用作評估 SDTL-E 對骨代謝標誌物血清 ALP 活性的影響。與對照組血清 ALP 活性 19.41 ±5.76 金氏單位 /100 mL相比，模型組血清 ALP活性顯著升髙到 46.69±13.32 金氏單位 /100 mL（ ^O.Ol）° SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E 20天後血 清 ALP活性與模型組相比 ，顯著降低了 58.79%至 19.24±6.06 金氏單位 /100 mL （ ^O.Ol）與對照組水平相近（附件一圖 2），顯示有顯著的調節及降低 ALP活性作 用 。
SDTL-E降低了 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的血清 ALP活性。模型組（ n = ll）和對照組 （ n = 10）大鼠皮膚外用植物油。 SDTL-E組（n = 10）大鼠皮膚外用 SDTL-E °皮膚外用 每天兩次連續 20天。 ALP測定被用作評估血清 ALP 活性。結果以平均值 ± 標準差 表示 。 w/^cO.Ol vs模型組。
SDTL-E 有提升 OVX誘導骨質疏鬆大鼠血清雌二醇水平作用 雌二醇測 定被用作評估 SDTL-E 對血清雌二醇的影響 。與對照組血清雌二醇水平
28 替换页 （细则第 26条） 27.27±6.77 pg/mL 相比，模型組血清雌二醇顯著降低到 20.18±4.77 pg/mL ( P<0.05 ) ° SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E ， 20天後血清雌二醇與模型組相比，顯著提升了 25.37% 至 25.30±4.52 pg/mL ( P<0.05 )與對照組水平相近 (附件一圖 3 )，顯示有顯著迅速的調 節及恢復激素雌二醇的生理功能性作用 。
SDTL-E提升了 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的血清雌二醇水平 。模型組 ( n = ll )和對照組 ( n = ll )大鼠皮膚外用植物油。 SDTL-E組 (n=10)大鼠皮膚外用 SDTL-E °皮膚外用 每天兩次連續 20天。雌二醇測定被用作評估血清 雌二醇水平。結果以平均值 ± 標準 差表示 。 */3<0.05 vs模型組。
SDTL-E 有降低 OVX誘導骨質疏鬆大鼠血清 、尿鈣離子水平作用 鈣離子測定被用作評估 SDTL-E 對骨代謝標誌物血清和尿鈣離子水平的影響。與對照 組血清鈣離子水平 2.28±0.20 mM相比，模型組血清鈣離子水平顯著升髙到 2.70±0.32 mMCPO.Ol ；)。 SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E， 20天後血清鈣離子與模型組相比，顯著降 低了 28.15%至 1.94±0.21 mM ( P<0.01 )，並低於對照組水平 ( P<0.01 )(附件一圖 4a )， 顯示阻止了骨鈣丟失及鈣離子向血中的轉移 。 與對照組 尿鈣離子水平 1.39±0.79 mmol/L 相比 ， 模型組尿鈣離子水平顯著升髙到 2.45±0.76 mM (P<0.01) ° SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E， 20天後與模型組相比，尿鈣離 子水平顯著降低 28.16%至 1.76±0.80 mM ( P<0.01 ) (附件一圖 4b )，顯示有顯著阻止鈣 離子丟失及向尿中轉移的作用 。
SDTL-E降低了 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的血清和尿鈣離子水平 。模型組 ( n = ll-12 )
29 替换页 (细则第 26条) 和對照組 （ n = 10-11）大鼠皮膚外用植物油。 SDTL-E組（n = 10）大鼠皮膚外用 SDTL- E。皮膚外用每天兩次連續 20天。鈣離子測定被用作評估（a）血清 及（b） 尿鈣離子水平。 結果以平均值 ± 標準差表示。 **P<0.01 vs模型組 ; ##P<0.01 vs 對照組。
SDTL-E 對 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的尿鈣 /肌酐比率無顯著影響 鈣離子測定及肌酐測定被用作測量鈣離子及肌酐量以計算尿鈣 /肌酐比率。與對照組尿 鈣 /肌酐比率 0.36±0.33相比，模型組尿鈣 /肌酐比率雖升髙到 0.49±0.29，但沒有統計學 意義 。 SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E， 20天後尿鈣 /肌酐比率降低至 0.36±0.14，與對照 組相近 ，與模型組相比較沒有統計學意義（附件一圖 5）。
SDTL-E對 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的尿錦 /肌酐比率無顯著影響。模型組（ n = 12）和對 照組（ n = ll）大鼠皮膚外用植物油。 SDTL-E組（n = 10）大鼠皮膚外用 SDTL-E °皮膚外 用每天兩次連續 20天。鈣離子測定及肌酐測定被用作測量鈣離子及肌酐量以計算尿鈣 /肌酐比率。結果以平均值 ± 標準差表示。
SDTL-E 對 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的骨密度無顯著影響 對右股骨進行骨密度 檢測以評估 SDTL-E 對骨密的影響。與對照組骨密度 0.22±0.02 g/cm2相比，模型組骨密度顯著降低到 0.20±0.01 g/cm2 CP<0.01；）。 SDTL-E 組皮膚外用 SDTL-E ， 20天後骨密度為 0.20±0.01 g/cm2，與模型組動物相比較無顯著差異（附件一 圖 6：），顯示使用 SDTL-E 組 20日 ，對骨質疏鬆模型大鼠骨密度無顯著影響。
SDTL-E 對 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的骨密度無顯著影響 。模型組（ n = 12）和對照組
30 替换页 （细则第 26条） （ n = ll）大鼠皮膚外用植物油。 SDTL-E組（n=10）大鼠皮膚外用 SDTL-E °皮膚外用 每天兩次連續 20天。對右股骨進行骨密度檢測以評估骨密度。結果以平均值 ± 標準 差表示 。 M/^CO.OI vs模型組。
SDTL-E 提高 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的骨強度和硬度 模型組及對照組皮膚外用植物油 ， SDTL-E組皮膚外用 SDTL-E， 20日後骨扭轉實驗結 果顯示 ，模型組的扭轉力、扭矩和剪切應力均顯著低於對照組（户<0.05）（附件一圖 7a- c）-剪切模量雖然也低於對照組，但沒有統計學意義（附件一圖 7d）。 SDTL-E組剪切 應力與模型組剪切應力 178.281±45.672 Mpa相比，顯著提升了 39.93%至 249.502±63.445 Mpa （ P<0.05） 接近於對照組的剪切應力 235.540±58.097 Mpa（附件一圖 7c）。 SDTL- E 組的扭轉力、扭矩和剪切模量與模型組相比，雖然也有提髙，但無統計學意義。實驗 數據顯示 ， SDTL-E皮膚外用 SDTL-E， 20日後扭轉力、扭矩和剪切模量均接近於對照 組 （附件一圖 7a,b,d），顯示 SDTL-E提髙了骨質疏鬆大鼠的骨強度和硬度。 SDTL-E提 髙了 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的骨力度和硬度。模型組（ n=9）和對照組（ n = ll）大鼠 皮膚外用植物油 。 SDTL-E組 =9）大鼠皮膚外用 SDTL-E。皮膚外用每天兩次連續 20 天。骨扭轉實驗被用作評估（a） 扭轉力 、 （b） 扭矩 、 （c） 剪切應力 及（d） 剪切模量。 結果以平均值 ± 標準差表示。 *^<0.05 vs模型組。
SDTL-E 有改善 OVX誘導骨質疏鬆大鼠骨組織結構作用 由附件一圖 8a可見，對照組大鼠的骨組織結構清晰、骨小梁較粗、著色加深、排列較 密 、骨髓造血功能活躍、骨小梁間隙也較小。附件一圖 8b可見，模型組大鼠骨小梁數
31 替换页 （细则第 26条） 目減少 、變細、稀疏、斷裂、骨組織著色較淺、骨小梁間隙相對増寬、血紅骨髓減少， 造血功能低下、脂肪組織増多、呈骨質疏鬆圖像。附件一圖 8c可見， SDTL-E組大鼠與 對照組正常大鼠相比 ，骨小梁變細、排列稀疏、斷裂和著色較淺、骨小梁間隙増寬、血 紅骨髓減少 ，造血功能低下、脂肪組織増多，但也呈現與模型大鼠相比較骨小梁數目有 輕度増多 、増厚的趨勢，所以下一步實驗有必要延長 SDTL-E使用天數。
SDTL-E改善了 OVX誘導骨質疏鬆大鼠的骨組織結構 。模型組和對照組大鼠皮膚外用 植物油 。 SDTL-E組大鼠皮膚外用 SDTL-E。皮膚外用每天兩次連續 20天。左股骨骨 組織用 HE染色，然後在 200X放大的光學顯微鏡下觀察。以上是（ a）對照組（ b）模 型組和 （ c） SDTL-E組大鼠的代表性染色圖像。
5 5冊 更年期骨質疏鬆症或激素缺乏均會導致骨轉換増加，雌激素水平降低會導致腎臟的鈣離 子排泄増加和腸道的鈣離子吸收減少 ，從而刺激骨鈣釋放到血液中，從而令骨代謝標誌 物血清 ALP活性升髙，儘管骨代謝總體増加，但骨吸收速率超過了骨形成。一項研究 表明 ，更年期骨形成標誌物只増加了 37-52% 但骨吸收標誌物増加了 79-97%。淨骨 吸收是導致髙血清鈣離子水平的主要決定因素。以上因素導致骨代謝標誌物血清鈣離子、 尿鈣離子和尿鈣 /肌酐比率在絕經後骨質疏鬆症患者中升髙。本實驗研究結果顯示，與 模型組大鼠相比， SDTL-E大鼠皮膚外用 20 天，內源性的顯著提髙恢復了雌二醇水平， 調節性降低了血清 ALP活性及血清鈣離子、尿鈣離子水平。實驗結果表明， SDTL-E 具有內源性調節恢復骨質疏鬆症大鼠雌二醇作用 ，能減少骨代謝、淨骨吸收、骨鈣丟失
32 替换页 （细则第 26条） 和腎臟的尿鈣離子排泄 。 有研究顯示除卵巢外 ，各種性腺外器官也會產生雌二醇，如胰腺、大腦、腎上腺、皮膚 和脂肪組織等。但值得注意的是有研究顯示髙水平的雌激素藥物治療不僅會増加患乳腺 癌和子宮內膜癌的風險，還會導致血栓形成等諸多副作用。本研究中，植物成份的 SDTL- E 能迅速恢復已切除卵巢的骨質疏鬆症大鼠激素水平，可能是通過激活上述器官或相 應未知受體而產生顯著的調節雌二醇作用 。能內源性的令 OVX誘導骨質疏鬆大鼠雌二 醇水平恢復到與對照組大鼠相近的水平 ，能最大限度降低激素治療藥物的副作用風險。 骨強度與骨骼的抗骨折能力呈正相關 。本研究使用常用的骨強度標誌物骨密度，以研究 SDTL-E 對 OVX大鼠骨強度的影響 ，模型組 OVX大鼠的骨密度明顯低於對照組，骨 質疏鬆症模型成功 。而 SDTL-E組 OVX-大鼠皮膚外用 SDTL-E20天後，骨扭轉實驗數 據表明 SDTL-E 組與模型組相比，大鼠的剪切應力顯著提髙，扭轉力、扭矩和剪切模 量也有提髙及恢復至接近對照組水平 ，表明外用 SDTL-E僅 20 天可快速使 OVX-大鼠 的骨強度恢復到正常水平 ，但骨密度卻沒有明顯改變，這可能是由於研究時間比礦化新 形成骨骼需要長達 30 個月左右的時間短得多所致。 骨密度和骨骼結構都對骨強度有影響 。骨重塑過程的早期階段從骨小梁開始。骨質疏鬆 症骨小梁數量 、骨小梁厚度和連接程度降低都會影響骨強度。 OVX 大鼠外用 SDTL-E 20 天雖令骨強度恢復，但骨密度沒有顯著變化，表明外用 SDTL-E20天時，骨強度迅 速増加並不是因為骨密度的増加 ，而可能是因為其它迅速改變骨强度的作用機制。本研 究的顯微鏡觀察結果表明 ，與對照組大鼠相比，模型組和 SDTL-E 組 OVX-大鼠的骨小
33 替换页 （细则第 26条） 梁結構減少 、變細、斷裂和稀疏，但 SDTL-E 組大鼠的骨小梁數量大於模型組大鼠， 表明外用 SDTL-E 20 天 已可迅速増加骨小梁數量和厚度 ，骨小梁數目有輕度増多的 趨勢 ，通過此機制也改善了 OVX大鼠的骨強度，其它作用機制有待進一步研究了解。 芳香酶 ( Aromatase )被称为雌激素合成酶 ( estrogen synthetase )，能催化與甾體激素合 成過程中從雄激素到雌激素的芳香化反應 ，催化雄烯二酮、睾酮向雌酮及雌二醇转化， 芳香酶在生殖腺、腦、脂肪組織、血管、皮膚和骨骼中均有存在，芳香酶反應速度可由 辅酶 ( coenzyme )調節。 SDTL-E的骨質疏鬆症大鼠實驗結果提示， SDTL-E具有芳香 化加速輔酶 ( Aromatization Acceleration Coenzyme )作用，其提取物複合所產生的芳香 化加速辅酶集束 [ Aromatization Acceleration Coenzyme Cluster, we named it as (AACC) ] 對芳香酶 ( Aromatase )有調節作用，其機制是通過激活芳香酶 ( Aromatase )酶促反應 ( Enzyme catalysis )調節異常激素水平，包括雌二醇，以調節異常 ALP活性、血清鈣、 尿鈣等 ，促使了破骨細胞與成骨細胞恢復正常功能，而呈現出將異常激素恢復致正常水 平及促進骨强度恢復的藥物治療效果 。 骨質疏鬆症會使骨折及骨折後死亡率増加，絕經後雌激素缺乏會導致肥胖和骨髓脂肪増 加 ，而骨折後死亡相關的主要並發症有心臟、呼吸、腦血管和惡性腫瘤疾病。本研究實 驗顯示 SDTL-E能迅速並顯著増加恢復骨強度，可以預防骨折及顯著提髙抗骨折能力。 與對照組大鼠相比 ，模型組 OVX大鼠體重顯著増加 ，骨小梁減少，骨小梁間隙脂肪組 織増加 ，血紅骨髓減少，造成造血功能低下。表明雌激素缺乏引起肥胖和骨小梁間隙脂 肪増加從而導致貧血 ，可能是引致 OVX 大鼠骨質疏鬆的機制。 SDTL-E 組大鼠外用
34 替换页 (细则第 26条) SDTL-E - 20 天改善了雌二醇水平、骨強度和骨小梁，但沒有降低體重。而之前有研 究表明雌激素可以調節體重 ，並増加紅細胞的產生，本實驗沒有進行血紅骨髓等數值對 比是一缺陷 ，無法看到恢復的雌二醇水平對造血紅骨髓變化的影響， 所以後續研究將 増加實驗天數及相關生化指標 。 有研究烦顯示 ，其他骨質疏鬆藥物以口服灌藥或注射方式治療 OVX 骨質疏鬆大鼠，骨 強度恢復的時間遠比外用 SDTL-E恢復骨強度時間長，療效並不顯著。如雙磷膦酸鹽相 關藥（ 阿斋膦酸鈉， Alendronate Sodium） 口服灌藥 6個月（~180天） ，骨強度才能顯著 増加並恢復到正常水平， 注射甲狀旁腺激素類似物相關藥需 0^rteO®> 12 週 卜 84天） ， 骨強度 才顯著増加並 恢復到正常水平 ， 雌激素受體調節劑相關藥 雷洛 昔芬 ， Raloxifene；）口服灌藥 4 週 （:〜 28天> 骨強度仍未有顯著的増加。本研究顯示，植物成份 的 SDTL-E外用通過內源性調節作用迅速恢復雌二醇水平、 ALP活性、血清鈣水平，増 加骨小梁數量和骨小梁厚度 ，減少了骨代謝、淨骨吸收和腎臟的尿鈣離子排泄，迅速増 加了骨強度 ，使其治療有效時間，能遠比文献報導骨折後出現死亡率大増的 6 個月時 間為短 ，有明顯的治療骨質疏鬆症及増加抗骨折能力 ，對預防、治療骨質疏鬆症、大 幅降低骨折及骨折後死亡率 、提髙臨床治療效率有積極作用。 SDTL-E治療骨質疏鬆作 用機制除通過迅速調節 、恢復激素水平、迅速減少骨代謝及阻止骨钙丟失、迅速恢復骨 强度外 ，其它機制尚有待進一步研究了解。 芳香酶（ Aromatase）在人體內由基因 CYP19A1 編碼，存在於细胞色素 P450酶系中，
35 替换页 （细则第 26条） 也被稱為雌激素合成酶 ( estrogen synthetase ) 能催化與甾體激素合成過程中從雄激素 到雌激素的芳香化反應 ，催化雄烯二酮、睾酮向雌酮及雌二醇转化，芳香酶在生殖腺、 腦 、脂肪組織、血管、皮膚和骨諮中均有存在，芳香酶反應速度可由辅酶 ( coenzyme ) 調節 。從實驗結果分析， SDTL-E具有辅酶 ( coenzyme )般的作用，其 SDTL-E具有芳 香化加速辅酶集束 ［ Aromatization Acceleration Coenzyme Cluster (A ACC)］功能，可能 是通過激活芳香酶 ( Aromatase )酶促反應 ( Enzyme catalysis )調節激素水平，如雌二醇 及 ALP活性 、血清鈣、尿鈣等，促進了成骨細胞的活性並抑制了破骨細胞活性。 本研究顯示 ， SDTL-E呈現出的皮膚外用快速、顯效治療優點，能避免肝臟首過作用， 具有發展成為見效快、副作用少的治療骨質疏鬆藥物潛力，皮膚外用方式所呈現的效果 可能打破外用藥物起效時間慢於口服、注射藥物的認知，對藥物研究有積極引導作用。
36 替换页 (细则第 26条) 附件二
SDTL-E對細胞活力的影響及比較研究報告 摘 要 本研究以永生化人臍靜脈內皮細胞系 HUVEC> 作為模型細胞，並透過細胞活力測定， 評估用専利 SDTL-E提取物不同劑量及不同組合配製的 A、B、C、D、E、F、G、H試 劑 ，研究其對正常及被過氧化氫 (H2O2) 損傷的 HUVEC細胞活力的影響及各組間的效 用比較 。結果顯示，相對於正常細胞對照組，各試劑組對正常細胞活力影響微小，數據 沒有統計學意義 。 細胞活力測定結果顯示 ，油溶性試劑 A、 B、 C、 D比水溶性試劑 E、 F、 G、 H改善及 提升損傷細胞活力的能力強。 A、 B、 D 油溶性試劑濃度越髙，對損傷細胞増加活力效 果越明顯 ，濃度達到 0.1%-0.9%時為最有效峰值量。眾多試劑中， A試劑改善及提升損 傷細胞活力的能力最髙及最為明顯 ，且 0.1%-0.9%濃度 A顯著増加損傷細胞活力值最 髙 ，達 259% (p<0.05)。 實驗結果顯示 ，各試劑組對正常細胞活力影響微小，數據沒有統計學意義。各試劑組的 油溶性試劑比水溶性試劑提升損傷細胞活力的表現強，且 0.1%-0.9%濃度 A試劑改善和 提升損傷細胞活力的作用最髙及最顯著 。 以上結果對將來發展全天然植物抗氧化提取物成份產品和藥物時及成份組合、溶劑選擇 和使用量具參考價值 。
37 替换页 (细则第 26条) 研究背景 我們之前對専利 SDTL-E提取物的研究顯示，使用専利 SDTL-E提取物成份以皮膚外用方 式改善及治療骨質疏鬆和關節退化的動物實驗及（非正式人體臨床）人體試用效果顯著。 為進一步了解専利 SDTL-E提取物成份及不同組合對細胞的效果，我們用専利 SDTL-E提 取物成份不同劑量及組合共配製了 8隻不同份量的試劑： A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H， 其中實驗進行前僅知 A、 B、 C、 D為油溶性試劑，及 E、 F、 G、 H為水溶性試劑，其它 信息在實驗完結 、統計及分析完成後披露揭嘵。本實驗 _在透過細胞實驗以研究専利 SDTL-E提取物不同劑量及組合各試劑組對細胞活力的影響程度，以選出及佐証最佳使用 量及最佳效用范圍 ，為後續研發抗氧化最佳物及組合與使用量提供參考，也為相關動物 實驗提供研究參考依據 。 研究目的 通過先前 用於研究骨質疏鬆 相關藥物對細胞活 力影響的人臍靜脈 內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC）模型實驗［1］，研究了解専利 SDTL-E提取物及組合 A 、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H各組試劑對細胞活力的不同程度影響，探討以下問題：
1. 専利 SDTL-E提取物不同劑量對正常細胞及損傷細胞活力的影響研究。
2. 専利 SDTL-E提取物不同稀釋濃度對正常細胞及損傷細胞活力的影響。
3. 専利 SDTL-E提取物及組合成份對正常細胞及損傷細胞活力的影響。
4. 専利 SDTL-E提取物成分以水及油作為試劑溶液時，對正常細胞及損傷細胞細胞活力
38 替换页 （细则第 26条） 的影響。 研究程序 ： 細胞系 (Cell Line) 永生化人臍靜脈內皮細胞系 (Immortalized HUVEC ) (ATCC, Manassas, Virginia, U.S.A)被用 作這次研究的模型細胞 。細胞培養方法是根據細胞供應商 ATCC的說明，將加入了內皮 細胞生長液 (Endothelial Cell Growth Kit-VEGF) (ATCC)的血管細胞基礎培養基 (Vascular Cell Basal Medium) (ATCC) 用於培養人臍靜脈內皮細胞，培養環境為 37°C 及 5%的二氧 化碳 。 計算細胞數量 血細 胞計數板 (Hemocytometer) (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Konigshofen, Germany)被用作計算細胞數量。 10 細胞被注入血細胞計數板中 ，然後將血細胞計數 板放在細胞培養顯微鏡 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, U.S.A)下計算 細胞數量 。 細胞活力測定 (Cell viability assay)
PrestoBlue™ HS細胞活力試劑 (Thermo Fisher Scientific)被用作測定細胞活力 ， 其原理 為試劑中刃天 青素 (Resazurin) 進入活細胞後會被還原成為紅色且髙度熒光的試鹵靈 (Resorufin) °
39 替换页 (细则第 26条) 細胞活力測定是根據 PrestoBlueä HS細胞活力試劑供應商的說明，在 96孔板 (96-well plate) 中 ，先在每個孔 (well)預備 10000 個細胞浸在 90 培養基裡。然後將 10 PrestoBlueä HS細胞活力試劑加到孔中 ，並放在黑暗 37°C 恆溫箱 10分鐘。 最後 ，使用酶標儀 (Microplate Reader) (Molecular Devices, San Jose, California, U_S_A) 測 量榮光 (Fluorescence) ·榮光激發波長 (Excitation Wavelength)為 560 nm， 然後量度榮 光發射波長 (Emission Wavelength) 590 nm ·以量化測定細胞活力。 評估程序 ： 將 0.5mM過氧化氫 (Kam Sing Medicine Co. Hong Kong, China) 加至 HUVEC細胞中 30 分鐘 (受損細胞對照組)。血管細胞基礎培養基加至 HUVEC細胞中 30分鐘 (正常細胞 對照組) 。然後將血管細胞基礎培養基及被血管細胞基礎培養基稀釋至實驗所需濃度的 A 、B、C、D、E、F、G、H試劑 ，分別加到受損細胞對照組、正常細胞對照組中 15分 鐘 。再透過細胞活力測定、取值，統計，分析各試劑對細胞活力影響及差異。 統計分析 本研究分三階段進行 。每階段實驗均重複進行 3次，然後不同組別細胞和對照組及損傷 細胞對照組的細胞活力平均值差異被用作統 計學分析。如果數據是正態分佈 (Normally Distributed)的，參數化 (Parametric) t檢驗 (t-test) 將被用作分析數據，如果數據是非正態 分佈的 ，非參數化 (Non-parametric)曼惠特尼檢驗 (Mann-Whitney test) 將被用作分析數據。 當 P值＜0.05時，統計學上認為差異是顯著的。所有數據由統計學軟件 GraphPad Prism
40 替换页 (细则第 26条) 9 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, United States) 分析。第一階段實驗是在使用各組 試劑後 15分鐘測定細胞活力狀況以篩選出對細胞活力效果最好的試劑；第二階段實驗 是以第一階段篩選出的試劑稀釋至不同濃度處理細胞 15分鐘後測定細胞活力以選出各 組試劑的最佳劑量；第三階段以第一及第二階段選出的最佳試劑在最佳劑量下處理細胞 15分鐘後測定細胞活力 ， 對各組試劑影響細胞活力能力作進一步比較。 數據及結果 第 1階段實驗： 各試劑處理 15分鐘對正常及損傷細胞活力的影響 建立損傷細胞對照組模型 ，相對於正常細胞對照組，損傷細胞對照組模型的細胞活力明 顯降低了 75%（p<0.05） 顯示損傷細胞模型造模成功。（表 1） 實驗結果顯示 ，相對於正常細胞對照組，各試劑組對正常細胞活力影響輕微，數據沒有 統計學意義（表 1, 附件二圖 1）。 實驗結果顯示 ，相對於損傷細胞對照組 ， 0.1%- 0.9%濃度 A 顯著増加了損傷細胞活力 262%（p<0.05） ， 0.1%- 0.9%濃度 D顯著増加了損傷細胞活力 213%（p<0.05） ， 0.1%- 0.9% 濃度 B増加了損傷細胞活力 204%， 0.1%- 0.9%濃度 C増加了損傷細胞活力 148%。（表 1）與油溶試劑相比較，水溶性試劑 E、 F、 G、 H 増加損傷細胞活力的程度較低，（表 1 , 附件二圖 2） 所以之後階段的實驗將主要集中於 A、 B、 C、 D試劑。
41 替换页 （细则第 26条）
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表 1. 經各試劑組處理 15分鐘細胞相對於正常及損傷細胞活力的變化 註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋。經預實驗參考 ， 決定水劑的稀釋濃度為 1%-5%, 油劑的稀釋濃度為 0.1%-0.9%， A.B.C.D稀釋濃度為 0.1%-0.9%。 E.F.G.H稀釋濃 度均為 0.6%-1.5%。 註 2: a.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 b.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分鐘取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H202處理 30 分鐘 ，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異（p<0.05）; #表示與損傷細胞對 照組相比有顯著統計學差異（p<0.05） 。 附件二圖 1. 經各試劑組處理 15 分鐘 ·相對於正常細胞（以紅色虛線代表｝對照組細胞 活力的％變化。 註 1: 紅線為正常細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋 ， A、 B、 C、 D的濃度為 0.1%-0.9%; E、 F、 G、 H的
42 替换页 （细则第 26条） 濃度為 0.6%-1.5%。 註 3: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異 (p<0.05)。 附件二圖 2. 經各試劑組處理 15 分鐘 ·相對於損傷細胞對照組 (以紅色虛線代表｝細 胞活力的％變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋， A、 B、 C、 D的濃度為 0.1%-0.9%; E、 F、 G、 H的 濃度為 0.6%-1.5%。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差異 (p<0.05)。 第 2階段實驗： 不同濃度 A、 B、 D試劑處理 15分鐘對正常及損傷細胞活力的影響 為了找出 A、 B、 D試劑最佳效用範圍，本研究測試了不同濃度 A、 B、 D對正常及損傷 細胞活力的劑量效應 。 結果顯示 ，相對於正常細胞對照組，所有濃度的試劑都無顯著増加正常細胞活力，數據 無統計學意義 。 (表 2, 附件二圖 3) 相對於損傷細胞對照組， 0.001%-0.009%濃度 A顯著増加了損傷細胞活力 121% (p<0.05)， 0.01%-0.09%濃度 A顯著増加了損傷細胞活力 185% (p<0.05)， 0.1%-0.9%濃度 A顯著増加 了損傷細胞活力 190%， 1%-5%濃度 A顯著増加了損傷細胞活力 126% (p<0.05)。 相對於損傷細胞對照組 ， 0.1%-0.9%濃度 B顯著増加了損傷細胞活力 158%， 1%-5%濃度 B顯著増加了損傷細胞活力 99%。 相對於損傷細胞對照組 ， 0.1%-0.9%濃度 D増加了損傷細胞活力 79%， 1%-5%濃度 D増
43 替换页 (细则第 26条) 加了損傷細胞活力 65%。 結果顯示 ，相對於損傷細胞對照組 ，所有濃度的 A、 B、 D 試劑都升髙了損傷細胞的活 力 ，而且當 A、 B、 D試劑的濃度由 0.001%-0.009%増加到 0.1%-0.9%時， 它們増加損傷 細胞活力的程度有上升趨勢 ，而 0.1%-0.9%濃度為最佳峰值。（表 2, 圖 4）之後的油溶性 試劑 A、 B、 C、 D將都以 0.1%-0.9%濃度進行實驗。
44 替换页 （细则第 26条） SUBSTITUTED SHEET
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表 2. 經不同濃度 A、 B、 D試劑組處理 15分鐘細胞相對於正常及損傷細胞的活力變化 註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋 註 2: a.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 b.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分鐘取值。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H202處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異（p<0.05>; #表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差異（p<0.05>
附件二圖 3. 經不同濃度 A、 B、 D試劑組處理 15 分鐘 .細胞相對於正常對照組 (以紅色 虛線代表)細胞活力的％變化 註 1: 紅線為正常細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋。 註 3: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異 (p<0.05)。 附件二圖 4. 經不同濃度 A、 B、 D試劑組處理 15 分鐘 .細胞相對於損傷細胞對照組 (以紅色虛線代表｝細胞活力的％變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差異 (p<0.05)。 第 3階段實驗： 再次確認 A、 B、 C、 D試劑對正常及損傷細胞活力的影響 第 3階段實驗，再次確認 A、 B、 C、 D試劑在最佳細胞實驗濃度 0.1%-0.9%的情況下，對 正常及損傷細胞活力的影響 。 損傷細胞對照組模型相對於正常對照組的細胞活力 ，明顯降低了 77% (p<0.05) 顯示造模 成功 。 實驗顯示 ， 0.1%-0.9%濃度 A試劑顯著増加了正常細胞活力 367% (p<0.05) ， 0.1%-0.9%濃度 B試劑顯著増加了正常細胞活力 104% (p<0.05) 0.1%-0.9%濃度 D試劑顯著増加了正常細 胞活力 255% (p<0.05) ， 0.1%-0.9%濃度 C試劑僅増加了正常細胞活力 61%。 (表 3, 附件二 圖 5) 相對於損傷細胞對照組 ， 0.1%-0.9%濃度 A 試劑顯著増加了損傷細胞活力 259%
46 替换页 (细则第 26条) (p<0.05)。 0.1%-0.9%濃度 B試劑顯著増加了損傷細胞活力達 198% (p<0.05) 。 0.1%-0.9%% 濃度 D試劑顯著増加了損傷細胞活力 198% (p<0.05)。 0.1%-0.9%濃度 C試劑顯著増加了損 傷細胞活力 176% (p<0.05)。 (表 3, 附件二圖 6) 。 以上實驗結果表明 ， 0.1%-0.9%濃度 A試劑無論是在増加正常或損傷細胞活力的表現都是 最佳 ，而 C試劑對雖増加正常細胞活力的作用不明顯，但能顯著増加損傷細胞活力。 表 3. 經 A、 B、 C、 D試劑組處理 15 分鐘細胞相對於正常及損傷細胞活力的變化
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註 1: 所有試劑以細胞培養基試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度 1%-5%。 註 2: a.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 b.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分 鐘取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H202處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異 (p<0.05); #表示與損傷細胞對照組 相比有顯著統計學差異 (p<0.05)
47 替换页 (细则第 26条) 附件二圖 5. 經 A、 B、 C、 D試劑組處理 15 分鐘 .細胞相對於正常細胞對照組 （以紅色 虛線代表） 細胞活力的 ％ 變化。 註 1: 紅線為正常細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異（p<0.05）。 圖 6. 經 A、 B、 C、 D試劑組處理 15 分鐘 *細胞相對於損傷細胞對照組 （以紅色虛線代 表） 細胞活力的 ％ 變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組活力水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差異（p<0.05）。 討論 ：
H202過氧化氫是一種活性氧，能對細胞產生氧化損傷及破壞細胞活力，並在過往研究中被 廣泛應用於建立 HUVEC 損傷細胞模型 ［2］。在本研究實驗中 ，過氧化氫顯著平均降低了 HUVEC細胞活性超過 70%，成功的建立了損傷細胞模型。 第 1階段實驗結果顯示：各試劑組都整體改善及提升了受損傷細胞的活力，但沒有整體改 善或提升正常細胞的活力 ，顯示各試劑組僅作用於受損傷細胞。 實驗結果顯示 ，相對於正常細胞，各試劑組對正常細胞改善及提升活力效應不明顯，僅對 受損傷細胞有提髙活力作用 ，而且細胞受到的損傷越大，各試劑組對損傷細胞的修復與改 善活力作用就越强 。在對損傷細胞的活力改善和提升方面，油溶性試劑比水溶性試劑強， 其中 A 試劑改善和提升損傷細胞活力的能力最髙也最為顯著。
48 替换页 （细则第 26条） 第 2階段實驗結果顯示：當油溶性試劑濃度越髙，對損傷細胞増加活力的效果越明顯，濃 度達到 0.1%-0.9%時為最有效的峰值量（圖 4），提示後續涉及細胞實驗油溶性試劑將都以 0.1%-0.9%濃度處理細胞。 第 3階段實驗結果顯示：各油溶性試劑均能顯著改善及提升損傷細胞的活力，並再次顯示 A試劑 改善及提升損傷細胞活力的表現都是最佳及最為顯著。
A 、 B、 D試劑在第 1階段實驗中，對正常細胞活力沒有顯著影響，但在第 3階段實驗中卻 顯著提升了正常細胞活力 ，經翻查原始資料及數據發現，第 3階段實驗中正常細胞對照組 活力平均取值 （附錄表 3）遠低於第 1階段實驗正常細胞對照組活力平均值 （附錄表 1），其 原因可能是因為在第 3階段細胞培養過程中因未明原因而受損，例如環境化學污染物產生 自由基對細胞產生氧化損傷 ，破壞細胞活力等 ［3］ 。 以上實驗數據表明 ，實驗中，細胞本身受到的損傷越大， A、 B、 D各試劑組對細胞的修復 與改善活力作用就越顯著 ，顯示出對受損細胞强烈的修復與改善活力作用特性。而對於正 常細胞 ，各試劑組作用輕微，數據並沒有統計學意義，提示了各試劑組對受損細胞的顯著 修復及調控作用 。 結論 ： 實驗明確了専利 SDTL-E 提取物各組及各不同劑量對細胞活力的生物效應、明確了水與油 作為溶液時對細胞活力的差異性 、明確了在一定範圍內劑量與細胞活性效果存在量效關係。 實驗結果顯示 ，各組試劑對於正常細胞的生物效應作用有限，數據也沒有統計學意義。 而實驗結果也顯示，各組試劑對於受損傷細胞作用明顯，而且當細胞本身受到的損傷越大，
A 、 B、 D各試劑組對細胞的修復與改善活力作用就越顯著，結果顯示専利 SDTL-E提取物及
49 替换页 （细则第 26条） 相關組合試劑 ，對受損細胞活力具有強烈的修復與改善、調節作用。 實驗結果顯示 ，油溶性試劑比水溶性試劑提升損傷細胞活力的表現強。 實驗結果顯示 ， 0.1%-0.9%濃度 A試劑改善和提升損傷細胞活力的作用最髙及最為顯著，相 對於受損傷細胞達到 259%。
0.1%-0.9%濃度 D試劑改善和提升損傷細胞活力的作用次之，相對於受損傷細胞達 198%。 0.1%-0.9%濃度 B試劑改善和提升損傷細胞活力的作用再次之，相對於受損傷細胞達 198%。 0.1%-0.9%濃度 C試劑改善和提升損傷細胞活力的作用最次之，相對於受損傷細胞為 176%。 以上結果對發展全天然植物抗氧化 提取物成份產品和藥物時所用的成份、 組合、 使用量 與溶劑選擇都具參考價值及啟發意義 。
50 替换页 （细则第 26条） 附件三
SDTL-E對細胞內活性氧影響研究報告 摘 要 活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS) 在化學反應中是比分子氧更活潑的化合物。本研究 以永生化人臍靜脈內皮細胞系 HUVEQ 作為模型細胞，並透過細胞內活性氧測定，評估 以專利 SDTL-E提取物 A、 B及組合 D試劑使用於細胞後 15分鐘及 3分鐘時，對正常及 對被過氧化氫 (H2O2) 損傷的 HUVEC細胞內活性氧的影響，以瞭解其抗氧化功效及抗氧 化起效時間 、量效關係及部份作用機制。 細胞內活性氧測定結果顯示 ， A、 B、 D試劑都能降低損傷細胞內的活性氧水平， A、 B、 D 試劑處理損傷細胞 3分鐘，即能迅速降低細胞內活性氧水平。 各試劑組處理受損細胞 3分鐘，相對於受損傷細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A試劑顯著的 降低了損傷細胞內活性氧 67% (p<0.05)，作用最為迅速，顯著降低及改善損傷細胞內活性 氧最迅速與最顯著 。 各試劑組處理受損細胞 15分鐘，相對於受損傷細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 B試劑顯著降 低損傷細胞內活性氧 75% (p<0.05) 作用最為顯著，改善和降低損傷細胞內活性氧作用最 顯著與最持續 。 實驗結果顯示各試劑組具有顯著的降低活性氧作用 ，實驗對研究發展全天然植物抗氧化成 份和藥物所用的成份 、組合、使用量抗氧化功效、抗氧化起效速度及後續其它細胞研究具 有方向啟發意義與後續的動物實驗參考價值 。 研究背景
51 替换页 (细则第 26条) 活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS) 在化學反應中是比分子氧更活潑的化合物。活性氧 包括自由基 (Free Radical)和非自由基 (Nonfree Radical)含氧分子，可導致活性氧形成増加和 氧化應激 (Oxidative Stress)並損害氧化還原平衡。過氧化氫是一種非自由基活性氧，當它多 接受一個電子時 ，它會分裂成羥基自由基 (Hydroxyl Radical) (HO )和羥基陰離子 ( OH- )［1, 2］。 當細胞內氧氣接受細胞內正常氧化代謝產生自由電子，細胞內便會產生活性氧，如 02—、 羥基自由基以及過氧化氫 ，過量活性氧形成會導致氧化應激，直接損傷細胞蛋白質、脂質 和核酸等 ，引致氧化損傷 (Oxidative Damage)導致細胞功能障礙甚至細胞死亡，而不同身體 部位的氧化損傷會引起不同的疾病 ， 如癌症、哮喘、肺動脈髙壓和視網膜病變等『3P 相關文獻指出 ，氧化應激可損傷成骨細胞並與骨質疏鬆症有關 ，而抗氧化劑可以保護成骨 細胞免受氧化損傷 ，並有助於控制骨質疏鬆症［4, 5］。 我們之前以專利 SDTL-E提取物及組合皮膚外用 ，改善及治療骨質疏鬆和關節退化，經動 物實驗及 非正式人體臨床；)人體試用 ，治療及改善臨床症狀效果明顯。在之前 「不同植物 提取物對細胞活力影響研究」實驗中，專利 SDTL-E提取物及組合不同份量的 A、 B、 D因 應實驗環境及實際操作需要 ，以血管細胞基礎培養基稀釋至不同百分比濃度。實驗結果顯 示 ， 在稀釋至 0.1%-0.9%濃度時， 能最顯著提髙被過氧化氫 (Hydrogen Peroxide, H202)損傷 的人臍靜脈內皮細胞 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC) 的細胞活力。 本研究旨在為進一步瞭解專利 SDTL-E提取物及組合 A、 B、 D試劑是否擁有細胞內的抗 氧化功能及抗氧化程度 ，以瞭解 A、 B、 D試劑提髙細胞活力及改善治療骨質疏鬆和關節 退化的一些機制與量效關係 。 A、 B、 D試劑相關資訊在實驗完結、統計及分析完成後才會
52 替换页 (细则第 26条) 被披露 。 研究目的 通過先前 研究骨質疏鬆相 關藥物问及細胞抗 氧化實驗［7］的人臍靜脈內皮細胞 ( H u m a n Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)模型與參考相關文獻，實驗研究瞭解專利 SDTL®A、
B 、 D試劑組植物提取成份對細胞內活性氧的不同程度影響，以瞭解 A、 B、 D試劑對細胞 的抗氧化功效及抗氧化功能起效的速度與初步作用機制 。 研究程序 細胞系 (Cell Line) 永生化人臍靜脈內皮細胞系 (Immortalized HUVEC ) (ATCC, Manassas, Virginia, U.S.A)被用作 這次研究的模型細胞 。細胞培養方法是根據細胞供應商 ATCC的說明，將加入了內皮細胞 生長液 (Endothelial Cell Growth Kit-VEGF) (ATCC)的血管細胞基礎培養基 (Vascular Cell Basal Medium) (ATCC) 用於培養人臍靜脈內皮細胞，培養環境為 37°C 及 5%的二氧化碳。 計算細胞數量 血細胞計數板 (Hemocytometer) (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Konigshofen, Germany) 被用作計算細胞數量 。 10 piL細胞被注入血細胞計數板中 ，然後將血細胞計數板放在細胞 培養顯微鏡 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, U.S.A)下計算細胞數量。 細胞內活性氧測定 (Intracellular ROS Assay) 榮光細胞內活性氧測定 (Fluorometric Intracellular ROS Assay) (Sigma Aldrich)被用作測定細 胞內活性氧的含量 ，以評估 A、 B、 D試劑作用於細胞的抗氧化能力。其原理為細胞內活
53 替换页 (细则第 26条) 性氧與可滲透細胞的傳感器化學物質 (Cell-permeable Sensor Chemical)發生反應產生榮光， A 、 B、 D試劑細胞內抗氧化能力越強，熒光亮度值會越低。 熒光細胞內活性氧測定是根據供應商的說明 ，在 96孔板 (96 Well Plate)中 ，先在每個孔預 備 10000 個細胞浸在 100 培養基裡，然後加入 100 傳感器反應混合物 (Reaction Master Mix)，並放在 B7°C 30分鐘。然後使用酶標儀 (Molecular Devices) 激發波長 540 nm · 並測量發射波長 570 nm，以量化細胞內活性氧。 評估程序 將 0.5mM過氧化氫 (Kam Sing Medicine Co. Hong Kong, China) 加至 HUVEC細胞中 30分鐘 (受損細胞對照組 )。血管細胞基礎培養基加至 HUVEC細胞中 30分鐘 (正常細胞對照組)。 然後將血管細胞基礎培養基及被血管細胞基礎培養基稀釋至 0.1%-0.9%濃度的 A、 B、 D試 劑 ，分別加到受損細胞對照組、正常細胞對照組中。再透過細胞內活性氧測定、取值，統 計 ，分析各試劑對細胞內活性氧影響及差異。實驗分組為：正常細胞對照組、正常細胞加 水 、正常細胞加油、正常細胞加 A試劑、正常細胞加 B試劑、正常細胞加 D試劑、受損細 胞對照組 、受損細胞加水、受損細胞加油、受損細胞加 A試劑、受損細胞加 B試劑及受損 細胞加 D試劑共 12組。 統計分析 本研究分兩階段進行 。每階段實驗均重複進行 3次，然後不同組別細胞和對照組及損傷細 胞對照組的細胞內活性氧 平均值差異被用作統計學分析 。如果數據是正態分佈 (Normally
Distributed)的，參數化 (Parametric) t檢驗 (t-test) 將被用作分析數據，如果數據是非正態分 佈的 ，非參數化 (Non-parametric)曼惠特尼檢驗 (Mann-Whitneytest) 將被用作分析數據。當
54 替换页 (细则第 26条) P 值 <0.05 時，統計學上認為差異是顯著的。所有數據由統計學軟件 GraphPad Prism 9 （Graph Pad Software Inc., La Jolla, CA, United States） 分析。第一階段實驗是在使用各組試劑 後 15分鐘測定細胞內活性氧狀況；第二階段實驗是在使用各組試劑後 3分鐘測定細胞內 活性氧狀況 。 數據及結果 第 1階段實驗： 各試劑處理 15分鐘 對正常及損傷細胞組活性氧的影響 實驗結果顯示 相對於正常細胞對照組 ，各試劑組對正常絀胞組細胞內活性氧雖有影響 · 但沒有統計學意義 。（表 1, 圖 1） 實驗造模中顯示 ，損傷細胞對照組模型的細胞內活性氧相對於正常細胞對照組，顯著増加 了 94%（p<0.05） 顯示損傷細胞模型造模成功。（表 1） 實驗結果顯示，相對於損傷細胞對照組 · 0.1-0.9%濃度 A顯著降低了損傷絀胞內活性氧 68% （p<0.05） • 0.1-0.9%濃度 B顯著降低了損傷細胞內活性氧 75%（p<0.05） • 0.1-0.9%濃度 D降 低了損傷細胞內活性氧 36%。（表 1, 圖 2） 表 1. 經各試劑處理 15分鐘細胞相對於正常及損傷細胞組細胞內活性氧的變化
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55 替换页 （细则第 26条）
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註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 2: 1.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 2.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分 鐘取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H2O2處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異 (p<0.05); #表示與損傷細胞對照組 相比有顯著統計學差異 (p<0.05)
56 替换页 (细则第 26条) 附件三圖 1. 經各試劑組處理 15 分鐘 ·相對於正常細胞 (以紅色虛線代表｝對照組 細胞內活性氧的％變化。 註 1: 紅線為正常細胞對照組細胞內活性氧水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 附件三圖 2. 經各試劑組處理 15 分鐘 ·相對於損傷細胞對照組 (以紅色虛線代表｝ 細胞 內活性氧的％變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組細胞內活性氧水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差異 (p<0.05) 。 第 2階段實驗： 各試劑處理 3分鐘 對正常及損傷細胞組活性氧的影響 為了進一步瞭解 A、 B、 D試劑抗氧化功能的初始起效時間 本研究再測試了以各試劑處 理 3分鐘時，對正常及損傷細胞組活性氧的影響。 實驗中 ，損傷細胞對照組模型的細胞活性氧，相對於正常細胞對照組明顯増加了 148% (p<0.05) ，顯示損傷細胞模型造模成功。 實驗結果顯示，0.1%-0.9%濃度 A顯著降低了正常細胞內的活性氧 65% (p<0.05) 0.1%-0.9% 濃度 B顯著降低了正常細胞內的活性氧 56% (p<0.05) (表 2,圖 3)。相對於損傷絀胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A顯著降低了損傷絀胞內的活性氧 67% (p<0.05)。 0.1%-0.9%濃度 B顯著降 低了損傷細胞內的活性氧 60% (p<0.05)。 0.1%-0.9%濃度 D 也降低了損傷絀胞內的活性氧 19% 。 (表 2, 圖 4 )以上實驗結果表明， 0.1%-0.9%濃度 A及 B試劑處理正常及損傷細胞 3 分鐘時 ，能迅速顯著降低受損傷細胞及細胞內活性氧水平。
57 替换页 (细则第 26条) 表 2. 經各試劑處理 3分鐘 ·相對於正常及損傷細胞組細胞內活性氧的變化
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註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 2: 1.以上各試劑處理正常細胞組 3 分鐘取值。 2.以上各試劑處理損傷細胞組 3 分鐘 取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H202處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異（p<0.05）; #表示與損傷細胞對照組 相比有顯著統計學差異（p<0.05） 。 附件三圖 3. 經各試劑處理 3 分鐘 相對於正常細胞（以紅色虛線代表｝對照組 細胞內活性氧的％變化。 註 1: 紅線為正常細胞對照組細胞內活性氧水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異（p<0.05）。 附件三圖 4 經各試劑處理 3 分鐘 ·相對於損傷細胞對照組（以紅色虛線代表｝ 細胞內
58 替换页 （细则第 26条） 活性氧的％變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組細胞內活性氧水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差異（p<0.05） 冊
H202 過氧化氫是一種活性氧，能導致細胞內活性氧如超氧陰離子 CSuperoxide anions；）増加 [8] -產生及對細胞產生氧化損傷作用令細胞凋亡異常，並在過往研究中被廣泛應用於建立 HUVEC 損傷細胞模型 [9]。 在本研究建立損傷細胞模型實驗中 ，過氧化氫顯著的平均増加了 HUVEC細胞內活性氧超 過 90%，實驗結果確定損傷細胞模型建立成功。 第 1階段實驗：各試劑組處理細胞 15分鐘顯示， A、 B、 D試劑均降低了受損傷細胞內活 性氧 ，具統計學意義。而對正常細胞內活性氧沒明顯作用，無統計學意義，其中 B、 D試 劑更提升了細胞內活性氧水平 。 實驗結果顯示 ，當細胞受損細胞內活性氧水平越髙，各試劑組對損傷細胞的抗氧化功效越 大 、越顯著。在對損傷細胞的抗氧化功效上， B試劑處理損傷細胞 15分鐘時抗氧化功效 最髙及最為顯著 。 第 2階段實驗：各試劑組處理細胞 3分鐘，顯示 A、 B、 D試劑均能迅速整體降低受正常 細胞及損傷細胞內的活性氧 ，能迅速對受損傷細胞及正常細胞產生抗氧化功效，其中 A試 劑處理損傷細胞 3分鐘時抗氧化功效最髙及最為顯著。 綜合兩階段的實驗結果顯示 ， A、 B試劑處理損傷細胞 3分鐘， A比 B降低損傷細胞內活
59 替换页 （细则第 26条） 性氧水平能力強 。但 A、 B試劑處理損傷細胞 15分鐘時， B比 A降低損傷細胞內活性氧 水平能力強 。 通過兩階段實驗結果分析及比較 ，顯示 A對損傷細胞的抗氧化作用起效比 B更迅速，而 B 對損傷細胞的抗氧化作用持久性比 A强，但起效較慢。 兩階段的實驗結果亦顯示 ， : B、 D試劑處理正常細胞 3分鐘，能降低正常細胞內活性氧水 平 ，但當 B、 D試劑處理正常細胞 15分鐘時，卻提升了細胞內活性氧水平，經翻查原始資 料數據及參考相關文獻發現有兩個原因可能導致以上結果 。第一個原因是實驗原始資料數 據顯示 ，處理正常細胞 3分鐘的第 2階段實驗中，正常細胞對照組細胞內活性氧平均取值 (附錄表 2；)遠髙於處理正常細胞 15分鐘的第 1階段實驗正常細胞對照組細胞內活性氧平均 值 附錄表 ，這有可能是因為在第 2階段實驗細胞培養過程中因環境化學污染物產生自 由基對細胞產生氧化損傷所致『10；| ，由於第 2階段實驗正常細胞對照組細胞內活性氧水平 本身較髙 ， : B、 D試劑降低細胞內活性氧的效果亦較大。 第二個原因是 B、 D試劑處理細胞時間較長，反而有機會令細胞內活性氧累積而使活性氧 水平升髙 。因曾有一些研究文獻顯示，一些天然抗氧化植物分子，如 10 )iM濃度以上白藜 薦酉學 (Resveratrol)處理 HUVEC 細胞 6小時後，竟升局了細胞內活性氧水平。這現像可能 是因為外源性抗氧化劑 如白藜蘆醇在清除正常細胞中細胞信號傳導所必需的低水平活性 氧過程中 ，正常細胞通過抗異生物代謝 (Anti-xenobiotic Metabolic Pathway) 為消除白藜蘆 醇而產生了髙活性氧累積『IIP 另外 ，抗氧化物對活性氧會引起哪些影響，很大程度上取決於細胞的類型、活性氧產生的 來源 、數量、持續時間和位置［1］。以上條件在細胞實驗中與在活體動物實驗中會有一定差
60 替换页 (细则第 26条) 異 ，例如細胞實驗因素可能引致活性氧代謝物無法如在活體中產生生理代謝而排出體外， 從而使細胞內產生活性氧累積效應 ，並導致細胞內活性氧累積性的升髙。 所以 ，細胞實驗結果僅能作為動物實驗的參考，並不能完全反映動物或人體中會實際發生 的狀況 。通過本研究，實驗結果及數據分析顯示，在本實驗中，細胞內本身活性氧水平越 髙時 ， A、 B、 D各試劑組對降低細胞內活性氧水平功效就越顯著，越顯示出對受損細胞強 烈的抗氧化修復作用 ，而對於正常細胞，各試劑組效用有限，數據也較沒有統計學意義， 提示了各試劑組對正 常細胞與受損細胞的顯著抗氧化效果是來自於對細胞內活性氧的清 除及調控機制作用 。 結 論 實驗結果明確顯示了專利 SDTL-E提取物及組合 A、 B、 D試劑對受損細胞內活性氧具有顯 著的抗氧化效應及量效 、時間關係，實驗結果也顯示各試劑組，對於正常細胞內活性氧的 抗氧化功效有限 ，數據較沒有統計學意義，但也提示了各試劑組對受損及正常細胞的差異 性及調控或平衡作用 。 實驗結果顯示，各試劑組對受損傷細胞抗氧化作用明顯，而且當細胞本身受到的損傷越大， A 、 B、 D各試劑組對細胞的抗氧化功效就越顯著，顯示相關各試劑組對受損細胞內的活性 氧具有強烈的抗氧化作用 。各試劑組處理受損細胞 15分鐘， 0.1%-0.9%濃度 B試劑降低受 損傷細胞內活性氧的作用最髙及最為顯著 ，相對於受損傷細胞顯著降低了 75%。 0.1%-0.9% 濃度 A試劑降低損傷細胞內活性氧的作用次之，相對於受損傷細胞顯著降低了 68%活性 氧 。 0.1%-0.9%濃度 D試劑降低損傷細胞內活性氧的作用再次之，相對於受損傷細胞，降 低了 36%活性氧。
61 替换页 （细则第 26条） 各試劑組處理受損細胞 3分鐘， 0.1%-0.9%濃度 A試劑降低損傷細胞內活性氧的作用最迅 速及最顯著 ，相對於受損傷細胞，顯著降低了 67%活性氧。 0.1%-0.9%濃度 B試劑降低損 傷細胞內活性氧的作用次之 ，相對於受損傷細胞顯著降低了 60%活性氧。 0.1%-0.9%濃度 D 試劑降低損傷細胞內活性氧的作用再次之 ，相對於受損傷細胞降低了 19%活性氧。 以上對正常及受損細胞的實驗結果及試劑對正常及受損細胞的作用 ，對進一步發展及開發 全天然植物抗氧化提取物成份產品 ，和研究藥物成份、組合、使用量、抗氧化功效、抗氧 化起效速度 、量效關係及瞭解作用機制有啟發及參考價值。
62 替换页 （细则第 26条） 附件四
SDTL-E對細胞鉀離子通道活性影響研究報告 摘 要 鉀離子通道 Potassium lon Chaime^是跨越細胞膜的孔 ， 可選擇性地只讓鉀離子通過細胞膜。 文獻指出鉀離子通道的調節在骨質疏鬆和關節退化中發揮潛在作用。以往研究亦表明鉀離 子通道可影響細胞増殖週期 、細胞活力和細胞凋亡等。 本研究以永生化人臍靜脈內皮細胞系 HUVEC) 作為模型細胞 ，並透過鉀離子通道測定， 評估專利 SDTL-E提取物 A、 B及組合物 D三種試劑 ，使用於細胞後 15分鐘對正常及對 被過氧化氫 (H2O2) 損傷的 HUVEC細胞內鉀離子通道活性影響 ，以瞭解其調節細胞功能 的鉀離子通道形式 。 實驗結果顯示 ， A、 B、 D試劑處理正常細胞及損傷細胞 15分鐘 ，對正常及受損傷細胞都 有調降非電壓門控鉀離子通道活性的作用 。相對於受損傷細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 B 試劑顯著調降受損傷細胞非電壓門控鉀離子通道活性 65% (p<0.05) 對非電壓門控鉀離子 通道作用最明顯 。 實驗結果顯示 ， A、 B、 D試劑處理正常及受損細胞 15分鐘 ，相對於受損傷細胞對照組 ， 對正常及損傷細胞的電壓門控鉀離子通道作用極微 ，無統計學意義。 實驗結果顯示 ， A、 B、 D試劑均具有顯著調降正常及損傷細胞非電壓門控鉀離子通道活性 作用 ，而對電壓門控鉀離子通道無明顯作用，顯示其作用機制是通過非電壓門控鉀離子通 道途徑而呈現 。 實驗結果顯示 ，單一提取物與提取組合物間對電壓門控鉀離子通道活性存在明顯差異，提
63 替换页 (细则第 26条) 示在提取組合物之間所產生的複合作用值得重視。 實驗對於進一步發展及 開發全天然植物抗氧化提取物和研究作用鉀離子通道作用機制與 瞭解其它途徑 ，具有啟發與參考價值。 研究背景 鉀離子通道是跨越細胞膜的孔 ，可選擇性的只讓鉀離子通過細胞膜。鉀離子通道存在於大 多數細胞類型中 ，並控制多種生物學功能，例如調節激素分泌、上皮功能和抑制興奮性信 號等［1］。文獻指出鉀離子通道的調節在骨質疏鬆［2］和關節退化［3］中發揮潛在作用。以往 研究亦表明鉀離子通道可影響細胞増殖週期 、細胞活力和細胞凋亡等『4, 5；|。 我們之前以專利 SDTL-E提取物皮膚外用改善及治療骨質疏鬆和關節退化，經動物實驗及 人體治療試用 非正式人體臨床；)改善臨床症狀效果明顯。在之前「不同植物提取物對細胞 活力影響研究」實驗中 ，不同劑量的專利 SDTL-E提取物因應實驗環境及實際操作需要， 以血管細胞基礎培養基稀釋至不同百分比濃度實驗 ，實驗結果顯示，在稀釋至 0.1%-0.9% 濃度時 ，發現 A、 B、 D能最顯著提髙被過氧化氫 (Hydrogen Peroxide, H202)損傷的人臍靜 脈內皮細胞 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC) 細胞活力。 本研究旨在進一步瞭解專利 SDTL-E提取物 A、 B、 D試劑顯著提髙細胞活力的作用機制 及對細胞鉀離子通道活性的影響與作用途徑 ，瞭解 A、 B、 D試劑提髙細胞活力及改善治 療骨質疏鬆和關節退化的相關離子通道機制。 A、 B、 D試劑相關資訊在「不同植物提取物 對細胞活力影響研究」實驗完結 、統計及分析完成後已經披露。 研究目的
64 替换页 (细则第 26条) 通過先前 研究骨質疏鬆相關藥 物问及鉀離子通 道實驗［5］的人臍靜脈內皮細胞 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)模型及參考文獻，研究瞭解專利 SDTL-E提取物試劑 組植物成份對細胞鉀離子通道活性的影響 ，以瞭解 A、 B、 D試劑調節細胞功能的離子通 道機制及途徑 。 研究程序 細胞系 (Cell Line) 永生化人臍靜脈內皮細胞系 (Immortalized HUVEC ) (ATCC, Manassas, Virginia, U.S.A)被用作 這次研究的模型細胞 。細胞培養方法是根據細胞供應商 ATCC的說明，將加入了內皮細胞 生長液 (Endothelial Cell Growth Kit-VEGF) (ATCC)的血管細胞基礎培養基 (Vascular Cell Basal Medium) (ATCC) 用於培養人臍靜脈內皮細胞，培養環境為 37°C 及 5%的二氧化碳。 計算細胞數量 血細胞計數板 (Hemocytometer) (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Konigshofen, Germany) 被用作計算細胞數量 。 10 piL細胞被注入血細胞計數板中 ，然後將血細胞計數板放在細胞 培養顯微鏡 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, U.S.A)下計算細胞數量。 鉀離子通道測定 (Potassium Ion Channel Assay)
FluxORäll綠色紳離子通道測定 (Thermo Fisher Scientific)被用作測定細胞紳離子通道活性， 以評估 A、 B、 D試劑對細胞鉀離子通道活性的影響。其原理為利用能通過鉀離子通道進 入細胞的鉈離子 (Thallium Ion)，當鉈離子進入細胞與事先放進細胞的 FluxORäll綠色指示 劑染料 (FluxOR™ll Green Indicator Dye) 發生反應就會放出綠色榮光，以量度紳離子通道活
65 替换页 (细则第 26条) 性 。細胞鉀離子通道活性越髙 ，熒光亮度值會越髙。 鉀離子通道測定是根據 FluxORäll綠色鉀離子通道測定供應商的說明 ， 在 96孔板 (96 Well Plate)中 ，先在每個孔預備 20000個細胞浸在 80 培養基裡 ，然後加入 80 FluxORäll 綠色指示劑染料 ，並放在 24°C環境 60分鐘。之後，如要測量非電壓門控鉀離子通道 (Non- Voltage Gated Potassium Ion Channel)活性 ， 就加入 40 piL 含鉈離子的基礎紳刺激緩衝液 (Basal Potassium Stimulus Buffer); 如要測量電壓門控紳離子通道活性 (Voltage-Gated Potassium Ion Channel) · 就加入 40 piL含鉈離子的髙紳刺激緩衝液 (High Potassium Stimulus Buffer)。 最後使用酶標儀 (Molecular Devices) 測量榮光 ，榮光激發波長為 490 nm ， 然 後量度熒光發射波長 525 nm ，以量化細胞鉀離子通道活性。 評估程序 將 0.5mM過氧化氫 (Kam Sing Medicine Co. Hong Kong, China) 加至 HUVEC細胞中 30分鐘 (受損細胞對照組 )。 血管細胞基礎培養基加至 HUVEC細胞中 30分氧正常細胞對照組 )。 然後將血管細胞基礎培養基及被血管細胞基礎培養基稀釋至 0.1%-0.9%濃度的 A、 B、 D試 劑分別加到受損細胞對照組 、正常細胞對照組中 15分鐘。再透過鉀離子通道測定、取值， 統計 ，分析各試劑對細胞鉀離子通道活性影響及差異。實驗分組為：正常細胞對照組、正 常細胞加水 、正常細胞加油脂、正常細胞加 A試劑、正常細胞加 B試劑、正常細胞加 D試 劑 、受損細胞對照組、受損細胞加水、受損細胞加油脂、受損細胞加 A試劑、受損細胞加 B試劑及受損細胞加 D試劑 ，共 12組。 統計分析 本研究分兩階段進行 。每階段實驗均重複進行 3次，然後不同組別細胞和對照組及損傷細
66 替换页 (细则第 26条) 胞對照組的細胞鉀 離子通道活性平均值差異被用作統計學分析 。 如果數據是正態分佈
(Normally Distributed)的，參數化 (Parametric) t檢驗 (t-test) 將被用作分析數據，如果數據是 非正態分佈的 ，非參數化 (Non-parametric)曼惠特尼檢驗 (Mann-Whitneytest) 將被用作分析 數據 。當 P 值 <0.05 時，統計學上認為差異是顯著的。所有數據由統計學軟件 GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, United States) 分析。第一階段實驗是在使用各 組試劑後 15分鐘測定正常及損傷細胞非電壓門控鉀離子通道活性；第二階段實驗是在使 用各組試劑後 15分鐘測定正常及損傷細胞的電壓門控鉀離子通道活性。 數據及結果 第 1階段實驗： 各試劑處理 15分鐘 ·對正常細胞和損傷細胞組非電壓門控鉀離子通道活 性的影響 實驗造模顯示 ，損傷細胞對照組模型的細胞非電壓門控鉀離子通道活性相對於正常細胞對 照組 ，顯著升髙了 71% (p<0.05) 顯示損傷細胞模型造模成功。 (表 1) 實驗結果顯示 ，相對於正常細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A降低了正常細胞非電壓門控鉀 離子通道活性 68% ， 0.1%-0.9%濃度 B 降低了正常細胞非電壓門控鉀離子通道活性 55% (p<0.05) 0.1%-0.9%濃度 D降低了正常細胞非電壓門控鉀離子通道活性 67% (p<0.05)。顯 示 A、 B、 D試劑均有調降正常細胞非電壓門控鉀離子通道活性的作用。 (表 1, 附件四圖 1) 。 實驗結果顯示 ，相對於損傷細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A顯著降低了損傷細胞非電壓門 控鉀離子通道活性 54% (p<0.05) 0.1%-0.9%濃度 B顯著降低了損傷細胞非電壓門控鉀離 子通道活性 65% (p<0.05)， 0.1%-0.9%濃度 D顯著降低了損傷細胞非電壓門控鉀離子通道活
67 替换页 (细则第 26条) 性 56%（p<0.05）。顯示 A、 B、 D試劑均有調降受損傷細胞非電壓門控鉀離子通道活性的作 用 。（表 1, 附件四圖 2）。 表 1. 經各試劑處理 15分鐘細胞相對於正常及損傷細胞組非電壓門控鉀離子通道活性的 變化
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000069_0002
註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9% 水的濃度為 1%-5%。 註 2: a.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 b.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分 鐘取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H202處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異（p<0.05）; #表示與損傷細胞對照組 相比有顯著統計學差異（p<0.05）. 第 2階段實驗： 各試劑處理 15分鐘 對正常及損傷細胞組電壓門控鉀離子通道活性的影響 實驗造模顯示 ，損傷細胞模型組的電壓門控鉀離子通道活性相對於正常細胞對照組，僅降 低了 11%，沒有統計學意義。（表 1）
68 替换页 （细则第 26条） 實驗結果顯示 ，相對於正常細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A及 B雖有降低正常細胞電壓門 控鉀離子通道活性 ，但沒有統計學意義。其中 0.1%-0.9%濃度組合物 D降低正常細胞電壓 門控鉀離子通道活性值最大 44%（p<0.05）。（表 2, 附件四圖 1） 實驗結果顯示 ，相對於損傷細胞對照組， 0.1%-0.9%濃度 A提髙了損傷細胞電壓門控鉀離 子通道活性 32% ， 0.1%-0.9%濃度 B提髙了損傷細胞電壓門控鉀離子通道活性 12%， 0.1%-0.9%濃度 D則降低了損傷細胞電壓門控鉀離子通道活性 28%，雖顯示出組合物 D與 提取物 A、 B對損傷細胞電壓門控鉀離子通道活性作用相異，但數值並沒有統計學意義。 （表 2,圖 2） 也顯示 A B D試劑，無論是對正常細胞還是損傷細胞的電壓門控鉀離子通 道作用極微 。 表 2. 經各試劑處理 15分鐘 ·相對於正常及損傷細胞組電壓門控鉀離子通道活性的變化
Figure imgf000070_0001
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註 1: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。
69 替换页 （细则第 26条） 註 2: a.以上各試劑處理正常細胞組 15 分鐘取值。 b.以上各試劑處理損傷細胞組 15 分 鐘取值 。 註 3: 損傷細胞組是以 0.5 mM H202處理 30 分鐘，取值 。 註 4: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異 (p<0.05); #表示與損傷細胞對照組 相比有顯著統計學差異 (p<0.05) 。 附件四圖 1. 經各試劑處理 15 分鐘 相對於正常細胞 (以紅色虛線代表｝對照組細胞鉀離 子通道活性的％變化。 註 1: 紅線為正常細胞對照組細胞鉀離子通道活性水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與正常細胞對照組相比有顯著統計學差異 (p<0.05)。 附件四圖 2 經各試劑處理 15 分鐘 ·相對於損傷細胞對照組 (以紅色虛線代表｝ 細胞內 鉀離子通道活性的％變化。 註 1: 紅線為損傷細胞對照組細胞鉀離子通道活性水平。 註 2: 所有試劑以細胞培養基稀釋到 0.1%-0.9%，水的濃度為 1%-5%。 註 3: *表示與損傷細胞對照組相比有顯著統計學差異 (p<0.05).
5可 珊 鉀離子 通道根據其 結構和功能可 分為不同的亞 族 (Subfamily) ， 如內向整流器 (Inward
Rectifiers)、四個跨膜段 -2孔 (FourTransmembrane Segments-2 Pores, K2P)、電壓門控 (Voltage-
Gated)和鈣激活 (Calcium Activated)類型⑴。文獻指出 ，所有這些鉀離子通道根據激活方式 也可分為兩大類 ，即電壓門控鉀離子通道和配體門控鉀離子通道 (Ligand-Gated Potassium
70 替换页 (细则第 26条) Ion Channel) 也稱為非電壓門控鉀離子通道。 亦有研究表明 ，有些鉀離子通道的激活過程不僅取決於電壓，還取決於配體結合，如在非 洲爪蟾卵母細胞 (Xenopus Oocytes)中 ，香菜葉提取物 (Cilantro Leaf Extract) 能降低、激活電 壓門控離子通道 KCNQ2/B的電壓依賴性［刀。綜合之前 A、 B、 D試劑活力實驗研究結果， 本實驗證實了 A、 B、 D試劑均是通過非電壓門控鉀離子通道途徑而呈現生物效應作用。 H202過氧化氫是一種活性氧，在過往研究中被廣泛應用於建立 HUVEC損傷細胞模型［8］， 並能増加鉀離子通道活性［9］。在本研究建立損傷細胞模型實驗中，過氧化氫顯著的提髙了 HUVEC細胞非電壓門控鉀離子通道活性 71%，實驗結果確定損傷細胞模型建立成功。 第 1階段實驗：各試劑組處理細胞 15分鐘顯示 · A、 B、 D試劑均顯著降低了受損傷細胞 非電壓門控鉀離子通道活性 ，具統計學意義。而 B、 D試劑也顯著降低了正常細胞的非電 壓門控鉀離子通道活性 。 A試劑雖然也降低了正常絀胞非電壓門控鉀離子通道活性，但無 統計學意義 。 實驗結果顯示 ， B試劑處理損傷細胞 15分鐘時降低非電壓門控鉀離子通道活性功效最強 及最為顯著 。 第 2階段實驗：各試劑組處理細胞 15分鐘顯示， A、 B試劑 (提取物對損傷細胞電壓門 控鉀離子通道的活性雖有影響 ，但無統計學意義，只有 D試劑 (提取組合物 )與正常絀胞 電壓門控鉀離子通道活性值相比較具有統計學意義 ，顯示提取組合物 D與單一提取物 A、 B ，對正常細胞電壓門控鉀離子通道調控存在差異。單一提取物 A、 B試劑對於損傷細胞 電壓門控鉀離子通道活性均呈現升高狀態，而提取組合物 D試劑對於損傷細胞電壓門控鉀 離子通道活性卻呈現降低狀態 ，也顯示單一提取物與提取組合物對於損傷細胞電壓門控鉀
71 替换页 (细则第 26条) 離子通道活性調控存在差異 。其差異性應來自於組合物之間相互作用所產生的複合效應。 實驗造模過程中 ，過氧化氫顯著升高了非電壓門控鉀離子通道活性 ·但對電壓門控鉀離子 通道活性影響卻不顯著。兩階段的實驗結果顯示， A、 B、 D試劑無論是處理正常或損傷細 胞 ，對非電壓門控鉀離子通道活性的影響遠比對電壓門控鉀離子通道活性的影響顯著，說 明 A、 B、 D試劑主要是透過影響非電壓門控鉀離子通道而對正常及損傷細胞呈現生物效 應 。 過去的研究文獻表明 ，過氧化氫能提髙 HUVEC細胞鈣激活鉀電流的幅度［9］，反映過氧化 氫是提高細胞鈣而激活鉀離子通道活性。另一項研究文獻表明植物酚類化合物可以抑制鈣 而激活鉀離子通道［10］。雖然鈣激活鉀離子通道被傳統視為電壓門控鉀離子通道，但有文 獻指出一些電壓門控鉀離子通 道也可以通過直接與植物提取物結合以配體門控鉀離子通 道方式進行調節作用［7］。以往研究文獻指出，鉀離子通道中，電壓門控鉀離子通道是細胞 活力 、細胞増殖和細胞死亡的主要調節機制［4, 5］。参考上述文獻與我們之前「不同植物提 取物對細胞活力影響研究報告」中 A、 B、 D試劑能提升 HUVEC細胞活力的結果及分析本 實驗結果表明 ，在本實驗中， A、 B、 D試劑無論是處理正常或是損傷細胞，對非電壓門控 鉀離子通道活性的影響顯著 ，而對電壓門控鉀離子通道活性的影響有限，數據也較沒有統 計學意義 ，提示了各試劑組是通過調控非電壓門控鉀離子通道而對正常細胞與受損細胞呈 現功能作用 ，是透過非電壓門控鉀離子通道而調節細胞活力。 結 論 實驗結果明確顯示專利 SDTL-E提取物 A、 B及組合 D試劑對正常及受損細胞非電壓門控 鉀離子通道活性均有顯著調節作用 ，而對於正常及受損細胞的電壓門控鉀離子通道活性影
72 替换页 （细则第 26条） 響不明顯 ，數據也沒有統計學意義，顯示 A、 B、 D試劑主要是通過調控非電壓門控鉀離 子通道影響細胞 。 各試劑組處理受損細胞 15分鐘， 0.1%-0.9%濃度 B試劑降低受損傷細胞非電壓門控鉀離子 通道活性的作用最強及最為顯著 ，相對於受損傷細胞，顯著降低了 65%。 0.1%-0.9%濃度 D 試劑降低損傷細胞非電壓門控鉀離子通道活性的作用次之，相對於受損傷細胞，顯著降 低 56%。 0.1%-0.9%濃度 A試劑降低損傷細胞非電壓門控鉀離子通道活性的作用再次之， 相對於受損傷細胞降低了 54%。 各試劑組處理受損細胞 15分鐘，試劑對損傷細胞電壓門控鉀離子通道的活性無統計學意 義。相對於受損傷細胞， 0.1%-0.9%濃度 A提髙了損傷細胞電壓門控鉀離子通道 32%活性。 0.1%-0.9%濃度 B提髙了損傷細胞電壓門控鉀離子通道 12%活性。 0.1%-0.9%濃度 D則降低 了損傷細胞電壓門控鉀離子通道活性 28%。顯示組合物 D與提取物 A、 B之間因複合作用 而所產生的差異性 。 綜合文獻資料及本實驗結果表明 ， SDTL-E専利提取物 A、 B及組合物 D，都是以影響非電 壓門控鉀離子通道形式調節細胞 。 以上對正常細胞及受損細胞的實驗結果 ，對進一步發展及開發全天然植物抗氧化提取物產 品和成份 、組合、使用量及瞭解對鉀離子通道活性的作用機制有啟發及參考價值。
73 替换页 （细则第 26条）

Claims

權利請求 ：
1. 一種皮膚外用混合物，包括第一有效成分及第二有效成份，該第一有效成分包括禾本 科 ( Gramineae 或 Poaceae )中第一植物，該第一植物包括岩蘭草 vetiveria zizanioides，香根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides °
2. 根據申請專利權利請求第 1項之皮膚外用混合物，該第二有效成分包括傘形科 (Apiaceae) 的第二植物，該第二植物包括紅蘿蔔 ( Daucus carota )。
3. 根據申請專利權利請求第 1項之皮膚外用混合物，其中第一有效成分或第二有效成分 包括第一植物或第二植物的提取物。
4. 根據申請專利權利請求第 1項之皮膚外用混合物，該第一有效成分和第二有效成分改 善骨質疏鬆、關節退化、關節僵硬、關節活動能力及其引致身體反應。
5. 根據申請專利權利請求第 1項之皮膚外用混合物，該第一有效成分和第二有效成分改 善骨骼强度。
6. 根據申請專利權利請求第 1項之皮膚外用混合物，該第一有效成分和第二有效成分用 於調節激素異常，改善激素異常導致身體不適。
7. 一種皮膚外用混合物，包括第一有效成分，該第一有效成分包括禾本科 ( Gramineae 或 Poaceae )中第一植物，該第一植物包括岩蘭草 vetiveria zizanioides，香根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides。
8. 根據申請專利權利請求第 7項之皮膚外用混合物，其中第一有效成分包括第一植物的 提取物。
74 替换页 (细则第 26条)
9. 根據申請專利權利請求第 7項之皮膚外用混合物，該第一有效成分改善骨質疏鬆、關 節退化、關節僵硬、關節活動能力及其引致身體反應。
10.根據申請專利權利請求第 7項之皮膚外用混合物，該第一有效成分改善骨骼强度。
11.根據申請專利權利請求第 7項之皮膚外用混合物，該第一有效成分用於調節激素異 常，改善激素異常導致身體不適。
12. —種皮膚外用混合物，包括第一有效成分，該第一有效成分包括傘形科 (Apiaceae) 的第 _植物，該第 _植物包括紅蘿蔔 ( Daucus carota )。
13.根據申請專利權利請求第 12項之皮膚外用混合物，其中第一有效成分包括第一植物 的提取物。
14.根據申請專利權利請求第 12項之皮膚外用混合物，該第一有效成分改善骨質疏鬆、 關節退化、關節僵硬、關節活動能力及其引致身體反應。
15.根據申請專利權利請求第 12項之皮膚外用混合物，該第一有效成分改善骨骼强度。
16.根據申請專利權利請求第 12項之皮膚外用混合物，該第一有效成分用於調節激素異 常，改善激素異常導致身體不適。
17. —調節體內激素平衡的混合物，其包括組合物，其中所説是組合物包括第一有效成分 和第二有效成分，其中所述組合物適用於皮膚表面，該第一有效成分包括禾本科
( Gramineae 或 Poaceae )中第一植物，該第一植物包括岩蘭草 vetiveria zizanioides，香根草 vetiver (chrysopogon zizanioides) 或 Andropogon zizanioides，該第二有效成分包括傘形科 (Apiaceae) 的第二植物，該第二植物包括 紅蘿蔔 ( Daucus carota )。
75 替换页 (细则第 26条) 根據申請専利權利請求第 17項之調節體內激素平衡的混合物，其中所述第一有效成 分和第二有效成分的重量比例爲 1至 9 : 2至 9. 根據申請専利權利請求第 17項之調節體內激素平衡的混合物，其中所述第一有效成 分和第二有效成分的重量比例爲 1.5至 7.5 : 2.5至 8.5. 根據申請専利權利請求第 17項之調節體內激素平衡的混合物，其中所述第一有效成 分和第二有效成分的重量比例爲 2至 5 : 4.5至 8. 根據申請専利權利請求第 17項之調節體內激素平衡的混合物，其中所述組合物，該 組合物包括溶劑介質 。 根據申請専利權利請求第 21項之調節體內激素平衡的混合物，其中所述溶劑介質包 括脂質溶劑 。 根據申請専利權利請求第 21項之調節體內激素平衡的混合物，其中所述組合物和溶 劑介質的重量比例為 1至 9 : 9至 1。 根據申請専利權利請求第 21項之調節體內激素平衡的混合物，其中所述組合物和溶 劑介質的重量比例為 1至 7 : 3至 9。 根據申請専利權利請求第 21項之調節體內激素平衡的混合物，其中所述組合物和溶 劑介質的重量比例為 1至 5 : 5至 9。 根據申請専利權利請求第 17項之調節體內激素平衡的混合物，其中第一有效成分包 括第一植物的提取物 。 根據申請専利權利請求第 17項之調節體內激素平衡的混合物，其中第二有效成分包 括第二植物的提取物 。
76 替换页 （细则第 26条） 根據申請専利權利請求第 17項之調節體內激素平衡的混合物，該第一有效成分和第 二有效成分改善骨質疏鬆 、關節退化、關節僵硬、關節活動能力及其引致身體反應。 根據申請専利權利請求第 17項之調節體內激素平衡的混合物，該第一有效成分和第 二有效成分改善骨骼强度 。 根據申請専利權利請求第 17項之調節體內激素平衡的混合物，該第一有效成分和第 二有效成分用於調節激素異常 ，改善激素異常導致身體不適。
77 替换页 （细则第 26条）
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