WO2022249343A1 - 粒子解析装置および粒子解析方法 - Google Patents

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WO2022249343A1
WO2022249343A1 PCT/JP2021/020018 JP2021020018W WO2022249343A1 WO 2022249343 A1 WO2022249343 A1 WO 2022249343A1 JP 2021020018 W JP2021020018 W JP 2021020018W WO 2022249343 A1 WO2022249343 A1 WO 2022249343A1
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particle
image
particles
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PCT/JP2021/020018
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明子 久田
祐介 大南
絵里乃 松本
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株式会社日立ハイテク
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N23/00—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00
    • G01N23/22—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by measuring secondary emission from the material
    • G01N23/225—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by measuring secondary emission from the material using electron or ion
    • G01N23/2251—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by measuring secondary emission from the material using electron or ion using incident electron beams, e.g. scanning electron microscopy [SEM]
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    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
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    • H01J37/26—Electron or ion microscopes; Electron or ion diffraction tubes
    • H01J37/28—Electron or ion microscopes; Electron or ion diffraction tubes with scanning beams
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2223/00—Investigating materials by wave or particle radiation
    • G01N2223/40—Imaging
    • G01N2223/401—Imaging image processing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/10—Energy storage using batteries

Definitions

  • the present invention relates to a particle analysis device and a particle analysis method.
  • Patent Literature 1 discloses a method of analyzing particles by irradiating electron beams on the collected particles one by one.
  • a specimen is placed in a sample chamber in a vacuum environment and irradiated with an electron beam, so it is difficult to analyze particles dispersed in the air or in a solution as they are. . Therefore, in order to analyze particles dispersed in the air or in a solution with an electron microscope, the particles to be analyzed are collected in equipment that can be introduced into the electron microscope sample chamber, and dried specimens are prepared. However, a method of irradiating the particles on the equipment with an electron beam is often used.
  • Patent Document 2 atmospheric fine particles having a specific particle diameter or less classified by a classifier are collected on a track-etched membrane filter, and the fine particles on the track-etched membrane filter are irradiated with an electron beam or the like. , discloses a method for analyzing particulates.
  • Patent Document 3 discloses a method of separating particles contained in a paste to prepare a sample as a dry coating film, observing the sample with a scanning electron microscope, and evaluating the particles by image analysis.
  • microparticles generated by different manufacturing processes some of the microparticles generated in each manufacturing process are sampled, specimens are placed on equipment, and electron microscope images of each specimen are obtained. .
  • specimens are prepared by placing normal cells and abnormal cells on equipment, and an electron microscope image of each specimen is obtained.
  • an electron microscope image of each specimen is obtained.
  • samples are taken over time, each sample is placed on a device to prepare a specimen, and an electron microscope image of each specimen is obtained.
  • analysis is often performed using a certain type of specimen equipment and analysis equipment according to the particles to be analyzed and the purpose of analysis. Multiple images, such as control specimens or multiple particle specimens sampled under different conditions, are then often compared with some criteria.
  • the images acquired separately have the same image adjustment conditions such as brightness and contrast.
  • one method for extracting the particle image area is to binarize the image with a threshold value that can separate the material area and the particle area, which are the background. Methods for extracting regions are known.
  • the image when analyzing a certain particle, if the image is placed on the same type of equipment and the brightness and contrast of the image are adjusted to be constant, even if the images are acquired separately, in principle, the image will be binarized with the same threshold value.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and aims to provide a particle analysis apparatus and a particle analysis method that make it easier to adjust the brightness of electron microscope images.
  • An example of the particle analysis device is A particle analysis device for placing predetermined particles to be analyzed on a device and analyzing them with an electron microscope,
  • the particle analysis device acquires a first standard value and a second standard value for brightness in an electron microscope image, the particle analysis device acquires electron microscope images and signal profiles generated through irradiating the equipment and the particles with an electron beam;
  • the particle analysis device adjusts the brightness of the electron microscope image based on the first standard value, the second standard value, and the signal profile.
  • An example of the particle analysis method according to the present invention is A particle analysis method for placing predetermined particles to be analyzed on a device and analyzing them with an electron microscope, obtaining a first standard value and a second standard value for brightness in an electron microscope image; obtaining electron microscopy images and signal profiles generated through illuminating the equipment and the particles with an electron beam; adjusting the brightness of the electron microscope image based on the first standard value, the second standard value, and the signal profile; Prepare.
  • FIG. 1 Schematic diagrams of an example of a sample configuration and a sample image according to Example 1 of the present invention.
  • Schematic configuration diagram of a particle analysis apparatus according to Example 1 Schematic diagram of an example of image brightness and contrast adjustment according to Example 1
  • Schematic diagram of example equipment according to Example 2 Flowchart of particle analysis according to Example 3
  • Example of analyzing blood cells according to Example 4 Example of analysis of cell growth rate according to Example 5
  • Example 1 when analyzing particles with an electron microscope, a sample is prepared by placing the particles on an instrument.
  • Particles include, but are not limited to: - Particles formed by pulverization, sintering, or crystallization - Three-dimensional structures such as steps and patterns deposited or formed on the surface due to corrosion, plating, or chemical reactions such as batteries - Degradation or etching of materials Generated vacancies or wounds - Foreign matter generated as an external factor - Organic substances such as fibers, microplastics, pollen, blood cells, cells, bacteria, viruses, protein aggregates, or their complexes
  • plastics and cellulose-based membranes are used as examples of materials, but the materials are not limited to them.
  • the equipment of this embodiment has a surface from which an electron microscope image of the particles to be analyzed can be obtained. It does not matter if the surface has a three-dimensional structure that is sufficiently small.
  • the difference in image brightness derived from the three-dimensional structure is defined as a region in the device where the brightness of the image differs from that of the device background.
  • Examples include, but are not limited to. For example, areas made by combining different materials, printed ones, or composites thereof are also included.
  • FIG. 1(a) 101 is a particle to be analyzed in a sample
  • 102 is a top view of the device
  • 103 is a side view of the particle to be analyzed
  • 104 is a side view of the device
  • 105 is a side view of the device.
  • SEM Sccanning Electron Microscope
  • FIG. 1(b) 106 is a top view of equipment for multiple specimens different from FIG. 1(a).
  • FIG. 1(c) 107 is a schematic diagram of the SEM image of the particles to be analyzed in the sample, 108 is a schematic diagram of the SEM image of the background region of the equipment, and 109 is a region with different brightness in the equipment.
  • 1 is a schematic diagram of an SEM image of FIG. This figure does not necessarily correspond to the device of FIG. 1(a) or FIG. 1(b).
  • the particles 101 and 103 to be analyzed are placed on the upper surfaces of the instruments 102, 104 and 106, and the instruments are placed on the sample stage 105 of the SEM.
  • the number of areas where the particles are placed on one piece of equipment may be one or more. In the example of FIG. 1A, there is one location, and in the example of FIG. 1B, there are multiple locations (five columns and four stages).
  • FIG. indicates an image in which there is a .
  • Areas darker than the background are aligned same-sized particulate patterns (i), unaligned same-sized particulate patterns (ii), unaligned different-sized particulate patterns (iii), Schematic diagrams of aligned differently sized particulate patterns (iv) and fibrous patterns (v) are provided as examples, but are not limiting.
  • the background of the equipment and the area in the equipment with different brightness are darker than the particles to be analyzed. It may be brighter than the particle to be analyzed.
  • the particle analysis apparatus is an apparatus for placing predetermined particles to be analyzed on equipment and analyzing them with an electron microscope.
  • the article when observed under an electron microscope, has a first region (e.g., background 108) that differs in brightness from the particles and a second region (e.g., region 109 that is darker than the background) that differs in brightness from the particles and the first region. and
  • the material forming the first region and the material forming the second region may be different. And/or the first region and the second region may be different parts of the device conformation. By doing so, it is easy to distinguish each region in the electron microscope image.
  • FIG. 2 103 is the particle to be analyzed
  • 104 is the equipment
  • 105 is the sample stage
  • 201 is the SEM sample chamber
  • 202 is the column
  • 203 is the electron beam to the equipment and the particles.
  • 207 an electron optical system
  • 208 is a detection signal
  • 209 is an image generation unit
  • 210 is an SEM control unit
  • 211 is an image adjustment unit
  • 212 is an image output unit
  • 213 is a monitor
  • 214 is an image analysis unit.
  • 215 is a database.
  • the monitor 213 functions as an image output unit that outputs an electron microscope image after the brightness has been adjusted, as will be described later. With such a configuration, the particle analysis device can generate an electron microscope image.
  • the particles 103 to be analyzed, the equipment 104 and the SEM sample stage 105 are installed in the SEM sample chamber 201 .
  • a detector 206 detects a signal 205 of reflected electrons and secondary electrons generated by irradiating particles with an electron beam 204 emitted from an electron gun 203, and a detector 206 for controlling the electron beam 204.
  • An image generator 209 which includes an electron optical system 207 and converts a signal 208 into image data, generates an image of the particles on the instrument.
  • the SEM control unit 210 adjusts the focus of the SEM by using the equipment background of the generated image and the boundary line image of the region with different brightness in the equipment.
  • Setting information of the particle analysis device such as the type of equipment, image brightness of the equipment, image adjustment described below, image analysis parameters, etc., can also be accumulated in the database 215 . Furthermore, the settings of the image adjustment unit 211 and the image analysis unit 214 may be updated by analyzing the information accumulated in the database.
  • FIG. 3 301 is an image of the background of the instrument, 302 is an image of a region of the instrument with different brightness, 303 is an image of the particle to be analyzed, 304 is an image of the particle whose state has changed, 305 and 306 are particle images separated from the equipment image by image binarization.
  • the particle analyzer stores the first standard value and the second standard value for brightness in the electron microscope image (simply indicated as “standard 1" and "standard 2" in the figure). These standard values can be determined and input in advance by the user of the particle analyzer. A specific example of a method for determining these standard values will be described below.
  • the first standard value can be determined based on the brightness of the first area of the instrument
  • the second standard value can be determined based on the brightness of the second area of the instrument.
  • the equipment on which the particles are placed has a background 301 and a region 302 whose brightness differs from the background 301 in the image of the equipment.
  • the first standard value and the second standard value are placed at different appropriate positions in the brightness histogram of the entire image. By setting, it is possible to appropriately adjust the brightness and contrast of the image to be generated. A specific method for adjusting the brightness and contrast of an image will be described in detail in the second and third embodiments.
  • the background 301 of the equipment, the region 302 with different brightness from the background, and the different brightness of the particles 303 and 304 to be analyzed are used to determine the brightness of the image.
  • a threshold for binarizing can be determined.
  • the image analysis section separates the particle image area and the equipment image area by binarizing the brightness of the generated image, and performs particle analysis.
  • the particles are obtained as shown in FIG. Images and equipment images can be separated. Furthermore, even when a particle 304 whose state has changed appears, the first standard value, the second standard value, and the image brightness of the particle 303 are constant. A region of 306 can be isolated, and particles 306 can be isolated by binarizing the image with a threshold of two. After separating the particles in this manner, the size, area, number, density, etc. of the particles can be analyzed.
  • the threshold value for binarizing the image in the image analysis unit it is possible to store a constant optimized threshold value in advance. It is also possible to automatically calculate a suitable threshold from the histogram.
  • the image generated after adjusting the brightness and contrast is displayed on the monitor via the image output unit.
  • Parameters such as the threshold value used when separating the particle image and the equipment image in the image analysis section can be accumulated in the database, and can be used to set the image adjustment by feeding back to the image adjustment section.
  • Example 2 of the present invention will be described below. Descriptions of portions common to the first embodiment may be omitted.
  • ⁇ Track etched membrane> An example in which a device on which particles are placed has a region with different brightness from the background of the device will be described with reference to FIG. 4(a) and 4(b), 401 is a top view of the track-etched membrane, 402 is a through-hole of the track-etched membrane, 403 is a particle to be analyzed, and 404 is a diagram.
  • 4(a) is a schematic cross-sectional view of the membrane along line A
  • 405 is a cross section of a hole penetrating the membrane
  • 406 is an electron beam
  • 407 is a backscattered electron
  • 408 is a backscattered electron detector
  • 409 is the image of the track-etched membrane
  • 410 is the image of the through holes in the track-etched membrane
  • 411 is the image of the particle to be analyzed.
  • the device is membranes 401, 404 having through holes 402, 405 passing through the device. It is preferable that the diameters of the through holes 402 and 405 are smaller than the short diameter of the particles so that the particles do not leak from the through holes 402 and 405 .
  • the particles are collected on one side of the device, and other solvents and contaminants smaller than the particles can be discharged from the holes and separated. be.
  • the diameters of the through holes 402 and 405 are, for example, diameters when the cross section of the through holes is circular.
  • the "minor axis of the particle" is the diameter when the particle is spherical, the length of the shortest axis when the particle is ellipsoid, and the particle when the size is not constant. is the diameter in the direction in which the diameter of the particle is the smallest.
  • the electron beam 406 When the electron beam 406 is irradiated, reflected electrons 407 generated by the material and particles are detected by the detector 408, and a membrane image 409 and a particle image 411 are generated. On the other hand, since the electron beam passes through the portion of the through hole 405, the reflected electrons do not reach the detector 408, and the image 410 of the through hole is the darkest portion in the generated image.
  • FIG. 4(c) shows an example of observing a polycarbonate track-etched membrane with a hole diameter of 200 nm using a scanning electron microscope (SEM) at a magnification of 7000 times.
  • SEM scanning electron microscope
  • 412, 413, and 414 are backscattered electron images using polycarbonate track-etched membranes.
  • the brightness histogram in each image is shown on the left side of the corresponding image.
  • the horizontal axis is the pixel brightness value and the vertical axis is the frequency (the number of pixels with that brightness value in the image).
  • Backscattered electron images 412, 413, and 414 are examples of images obtained by converting the brightness from one image of the same field of view.
  • the backscattered electron image 412 is obtained by applying the first conversion formula to the brightness of each pixel of the original image
  • the backscattered electron image 413 is obtained by applying the second conversion formula to the brightness of each pixel of the original image.
  • the backscattered electron image 414 is obtained by applying the third conversion formula to the brightness of each pixel of the original image.
  • the brightness indicating the frequency peak in the histogram of the image brightness of the polycarbonate membrane is taken as the first standard value
  • the brightness of the darkest part of the through-hole is taken as the second standard value.
  • the first transformation formula applied to the backscattered electron image 412 transforms the first standard value into the first target value and transforms the second standard value into the second target value.
  • the second conversion formula applied to the backscattered electron image 413 converts the first standard value to a third target value (but smaller than the first target value), and converts the second standard value to a fourth target value. (but smaller than the second target value).
  • the third conversion formula applied to the backscattered electron image 414 converts the first standard value to a fifth target value (but smaller than the third target value), and converts the second standard value to a sixth target value (but the third target value). 4 less than the target value).
  • the conversion formula can be automatically determined based on the target value.
  • the particle analysis device can acquire the first target value and the second target value by outputting a signal profile and prompting an input according to this.
  • the "signal profile" includes information representing the number of pixels having each brightness value, and is represented in the form of a histogram shown in FIG. 4(c), for example.
  • a monitor 213 may display the signal profile.
  • the histogram may show the first standard value and the second standard value.
  • the user of the particle analyzer can determine and input appropriate first target values and second target values by looking at the histogram.
  • the particle analyzer determines a conversion formula for converting the first standard value into the first target value and converting the second standard value into the second target value in the signal profile.
  • Such a conversion formula can be determined by a known method. For example, if the first standard value, first target value, second standard value, and second target value are all scalar quantities, linear transformation may be used.
  • the particle analysis apparatus adjusts the brightness of the electron microscope image by applying a conversion formula to the brightness of the electron microscope image (brightness value of each pixel), thereby adjusting the brightness of the electron microscope image. to generate
  • the brightness of the image is calculated using the first standard value and the second standard value of the equipment brightness. and contrast can be adjusted in the image analyzer.
  • the first standard value and the second standard value are set large for an instrument that produces an overall bright image, and the first standard value and the second standard value are set small for an instrument that produces an overall dark image.
  • the brightness of the overall image can be uniformed.
  • the particle image and the material image can be properly separated in all images.
  • Example 3 of the present invention will be described below. Descriptions of parts common to the first or second embodiment may be omitted.
  • Fig. 5 shows an example of the flow of the particle analysis method.
  • a user of the particle analyzer determines the type of particles to be analyzed (S1), and further determines the type of equipment (S2).
  • the particle analyzer obtains the particle type and equipment type.
  • the type may represent, for example, the properties of particles or equipment.
  • the particle analyzer refers to the database and acquires various information.
  • acquired information include, but are not limited to: - Examples of brightness signal profiles associated with particle types - Examples of brightness signal profiles associated with equipment types - Sampling conditions associated with combinations of particle types and equipment types - Particles electron microscope observation conditions associated with the combination of the type of equipment and the type of equipment - the first standard value and the second standard value associated with the combination of the type of particles and the type of equipment - the type of particles and the type of equipment a first target value and a second target value associated with a combination of - a threshold value for binarization associated with a combination of particle type and equipment type
  • the particle analyzer acquires the first standard value and the second standard value based on the type of particles and the type of equipment. This makes it possible to always obtain the same standard value for the same type of particle and equipment combination.
  • the user it is preferable for the user to select equipment that exhibits image brightness different from that of particles.
  • the type of particles to be analyzed does not exist in the database, it is preferable to select a device composed of an element different from the elements constituting the particles to be analyzed.
  • the particles are dyed particles, it may be preferable to select an instrument that exhibits a different image brightness than the particles.
  • the particle analysis apparatus may have a function of automatically setting a threshold for image binarization from the brightness of the particles and the equipment, and an algorithm for realizing such a function is acquired from the database. good too.
  • the user prepares a specimen with the particles placed on the instrument (S3), stains the particles with a dye containing metal according to the specimen preparation conditions, and uses the stained particles (S4). Staining makes it easier to distinguish from instruments. Furthermore, if the particles and equipment are non-conductive substances, they are subjected to conductive treatment such as metal coating (S5). Dyeing and conductive treatment may be performed before the particles are placed on the device.
  • the user places the device on which the particles are placed on the sample stage of the electron microscope, inserts it into the electron microscope sample chamber, and starts observation (S6). If observation conditions such as electron microscope acceleration voltage, current value, observation magnification, and degree of vacuum are registered in the database according to the combination of particles and equipment, the particle analyzer uses them to control the SEM. good too.
  • the particle analysis device uses the boundaries of regions with different brightness in the equipment to focus the image (S7). Such a focusing method can be appropriately designed based on known techniques.
  • the particle analyzer acquires electron microscope images and signal profiles generated through irradiating the equipment and particles with an electron beam.
  • the particle analyzer adjusts the image brightness and contrast (S8).
  • This adjustment can be realized, for example, by changing the detector settings of the electron microscope.
  • the particle analyzer adjusts the brightness of the electron microscope image using, for example, a conversion formula based on the first standard value, the second standard value, and the signal profile, as described in the second embodiment.
  • the contrast is adjusted by adjusting the brightness.
  • the particle analysis device may focus on the particles to be analyzed based on the electron microscope image after the brightness has been adjusted.
  • the particle analysis device generates a particle image for use in particle analysis (S9).
  • the brightness of the particle image can also be adjusted by applying the brightness conversion formula used in S8.
  • the particle analysis apparatus generates, outputs, and stores an image in which the observation position and magnification are changed according to the user's operation (S10).
  • S10 the observation position and magnification
  • the threshold for image binarization may be automatically set based on the brightness of the particles and materials depending on the purpose, such as identifying the regions of the particles and the materials, or identifying the types of the particles.
  • the threshold value may refer to a value registered in the database.
  • the macro function of image analysis software can be used to quickly generate binarized images and analyze particle size, area, etc. can be analyzed.
  • the conditions selected or set in each step of FIG. 5 and the output analysis and evaluation results are output and registered in the database (S12).
  • the particle analysis device may obtain the optimum conditions for the particle analysis flow and feed back to the settings of the particle analysis device.
  • the flow shown in FIG. 5 is an example of the particle analysis method according to this embodiment, and the flow of this embodiment is not limited to FIG.
  • the particle analysis apparatus adjusts the brightness of the electron microscope image online, but as a modification, the brightness of the electron microscope image may be adjusted offline. That is, first, the SEM is controlled to acquire and store an electron microscope image, and then the control of the SEM is terminated (for example, with the electron gun 203 and the detector 206 of the SEM stopped, or the power supply of the SEM is is turned off), a stored electron microscopy image may be obtained and its brightness adjusted. In this way, convenience for the user is improved.
  • Example 4 of the present invention will be described below. Descriptions of parts common to any of the first to third embodiments may be omitted.
  • Image 1 in FIG. 6A is a membrane image. After focusing on the outline of the through-hole, the brightness of the frequency peak corresponding to the brightness of the membrane material is set to the first standard value in the brightness histogram. The brightness and contrast of the image were adjusted by setting the horizontal axis values of the first standard value and the second standard value, with the brightness corresponding to the darkest part of the through-hole as the second standard value.
  • Image 2 in FIG. 6(b) is an image of one red blood cell.
  • Image 3 in FIG. 6(c) is an image of blood cells in which brightness differs between red blood cells.
  • Image 4 in FIG. 6D is an image of the same area as image 3 at a magnification of 500 times.
  • the first standard value and the second standard value are the same value.
  • Masks for images 2, 3, and 4 were created using image analysis software.
  • Mask 1 is a mask image created by binarizing each image with the first threshold (threshold 1) of the brightness histogram, and then removing particles much smaller than blood cells using a particle analysis algorithm.
  • Mask 2 is a mask image created by binarizing an image with a histogram threshold value of 2 and then removing particles much smaller than blood cells using a particle analysis algorithm.
  • the area ratio (% Area) of mask 1 in image 4 is 9.97%, and the area ratio of mask 2 is 0.32%. , were shown to be blood cells with different brightness.
  • Example 5 of the present invention will be described below. Descriptions of parts common to any of the first to fourth embodiments may be omitted.
  • 701 is a cell culture medium
  • 702 is a funnel
  • 703 is a track-etched membrane filter
  • 704 is a cell collection area
  • 705 is an image generation area.
  • a fixed amount of cell culture solution 701 was sampled from the cell culture vessel at regular intervals and collected in a certain area on the membrane filter using a cell collection device. Conductivity was imparted to the sample by depositing platinum-palladium on the surface of the membrane in advance.
  • the cell collection device has a structure in which a track-etched membrane filter 703 having a through-hole with a diameter of 200 nm, which is smaller than the short diameter of the cells, is placed on the bottom of a funnel-shaped container 702. be.
  • a sampled cell culture medium 701 is injected into the funnel portion, and the liquid is aspirated from the opposite side of the membrane filter to drain the liquid, and as shown in FIG. collected.
  • the cells were fixed with a fixative that has a protein cross-linking action such as 2.5% glutaraldehyde, and then the cells were stained with a staining solution containing metal. As shown in FIG. 7(c), excess staining solution was washed away with water, the membrane filter was taken out from the cell collection device and dried, and then a backscattered electron image was observed with an SEM.
  • a fixative that has a protein cross-linking action such as 2.5% glutaraldehyde
  • the magnification was set to 7000 times, and the SEM autofocus function was used to focus the image on the outline of the hole in the track-etched membrane.
  • the brightness and contrast of the image were then adjusted according to Example 2.
  • the brightness that indicates the frequency peak of the brightness of the polycarbonate membrane in the brightness histogram is the first standard value
  • the brightness that indicates the frequency peak of the brightness of the hole portion is the second standard value.
  • the same conversion formula was applied and adjusted.
  • the values of the first standard value and the second standard value were determined at the stage of preliminary examination to be suitable for separating the cell image and the equipment image by binarization.
  • the reason for setting the magnification to 7000 was that it was selected so that the outline of the track-etched membrane could be clearly imaged during focusing, but it is not limited to this.
  • the magnification was changed to 500 times, and as shown in FIG. 7(d), six images 705 were acquired at equal intervals within the cell-collected region on the membrane.
  • a plurality of images can be easily generated by using an electric sample stage built into the SEM and an automatic continuous photographing function.
  • the reason for setting the imaging magnification to 500 times is that a low magnification is used to capture a wide area with a small number of images, and a magnification that allows the cells to be distinguished from noise by looking at the shape of the cells is desirable, so one pixel is sufficiently smaller than the cell diameter.
  • 500 times was selected, it is not limited to this magnification.
  • the number of images is, for example, 6 in order to average the unevenness of the density in the area where the cells are collected, but the number is not limited to this number.
  • the image after output was input offline to the image analysis unit, and after using image analysis software to binarize all images with a certain threshold value, the image area ratio of the particle part was obtained.
  • image analysis software By using the macro function provided to the image analysis software, it is possible to perform the process of binarizing with a pre-optimized constant threshold value and the process of determining the area of the particle portion in a few seconds.
  • Cells cultured in two types of media are sampled 5 times over time, and the process of acquiring 6 images and 30 images per specimen is repeated 3 times independently to obtain 180 images. generated.
  • the graph in FIG. 7(e) shows the results of analyzing cell growth using the method of this example.
  • Cultured in Medium 1 cells grew exponentially.
  • a dotted line in the graph represents an exponential function that approximates the area ratio of the medium 1.
  • growth was suppressed when cultured in medium 2 (solid line).
  • Example 6 of the present invention will be described below. Descriptions of portions common to any of Examples 1 to 5 may be omitted.
  • the components of the nitrocellulose membrane are composed of elements that are lighter than the silicon, magnesium, and iron contained in asbestos, so the backscattered electron image obtained by SEM is darker than that of asbestos.
  • the brightness indicating the frequency peak of the brightness of the nitrocellulose is taken as the first standard value
  • the brightness frequency of the regions with different brightness is taken as the first standard value.
  • the peak brightness is adjusted.
  • a nitrocellulose membrane with areas of different brightness is used to adjust the brightness and contrast of the images.
  • the image analysis unit binarizes the image step by step using a plurality of threshold values, thereby classifying the fiber images according to the brightness of the backscattered electron image.
  • a fiber image in a range of brightness that includes asbestos is extracted by collating it with data on the brightness of backscattered electron images of asbestos that have been stored in advance. Asbestos can be identified and quantified by performing elemental analysis using SEM on the fibers thus extracted.
  • Electron beam 205 Reflected electrons and secondary electrons 206 Detector 207
  • Electron optical system 208 Detected signal 209
  • Image generation unit 210 SEM control unit 211
  • Image adjustment unit 212 Image output unit 213 Monitor (image output unit )
  • Image analysis unit 215 Database 301 Background image of equipment 302 Image of regions with different brightness of equipment 303 Image of particles 304 Image of particles whose state has changed 305, 306
  • Binary images of equipment Particle image separated from the image 401
  • Electron beam 407 Backscattered electron 408
  • Backscattered electron detector 409 Image of track-etched membrane 410 Image of through-hole of track-etched membrane 411 Image of particles to be analyzed 412, 413, 414
  • Backscattered electron image 701 Cell culture fluid 702... Funnel 703...

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Abstract

被解析対象となる所定の粒子を器材に載せて電子顕微鏡で解析するための粒子解析装置は、前記粒子解析装置は、電子顕微鏡画像における明るさに関する第１標準値および第２標準値を取得し、前記粒子解析装置は、前記器材および前記粒子に電子ビームを照射することを介して生成された電子顕微鏡画像および信号プロファイルを取得し、前記粒子解析装置は、前記第１標準値と、前記第２標準値と、前記信号プロファイルとに基づき、前記電子顕微鏡画像の明るさを調整する。

Description

粒子解析装置および粒子解析方法
　本発明は、粒子解析装置および粒子解析方法に関する。
　材料分野からバイオ分野、環境分野に至るまで、百ナノメートルから数百マイクロメートル程度の粒子の解析および評価が非常に重要となっている。材料分野では、近年のナノ・マイクロテクノロジーの発展から、粒子を利用する産業が増加している。例えば、電子回路の微細化に伴うコンデンサに使う誘電体粒子や、電池の大容量化に伴う電極材に使う導電性微粒子などである。製造の観点では、これら粒子の性状評価とともに、材料製造プロセスで混入する異物粒子の解析が重要である。またバイオ・メディカル分野では、例えば、がん細胞、血球、細菌、ウイルス、凝集体などの粒子が、臨床検査などで解析される。一方、環境分野では、産業の発展の負の側面として、例えば、アスベスト、マイクロプラスチック、微小粒子状物質（ＰＭ２．５）などの環境・健康問題を引き起こす粒子が解析される。このように、粒子の解析は、粒子自体を産業利用するのみならず、製造プロセス、疾患、環境などの評価指標としても重要である。
　例に挙げた粒子に限らず、微細な粒子を詳細に解析するためには、電子顕微鏡を用いることができる。電子顕微鏡はナノメートルサイズの分解能を持つため、前述の粒子の解析に必要な性能を有している。特許文献１では、微粒子一個一個を捕集したままで電子ビームを照射することにより粒子を解析する方法が開示されている。
　一般的に、電子顕微鏡を用いた解析では、真空環境の試料室に標本を設置して電子ビームを照射するため、空気中や溶液中に分散した状態の粒子をそのまま解析することは困難である。そこで、空気中や溶液中に分散した状態の粒子を電子顕微鏡で解析するためには、電子顕微鏡試料室に導入可能な器材に、被解析対象の粒子を捕集して、乾燥した標本を作製し、器材上の粒子に電子ビームを照射する方法が用いられることが多い。
　特許文献２では、分級器によって分級された特定の粒子径以下の大気中微粒子を、トラックエッチドメンブレンフィルター上に捕集し、トラックエッチドメンブレンフィルター上の微粒子に電子ビームなどを照射することにより、微粒子を分析する方法が開示されている。
　また、特許文献３では、ペーストに含まれる粒子を分離して乾燥塗膜として標本を作製し、走査電子顕微鏡で観察して、画像解析によって粒子を評価する方法が開示されている。
特開２０１１－１６３８７２号公報 特開２０１７－７２５９３号公報 特開２０１５－１６１５３６号公報
　しかしながら、従来の技術では、電子顕微鏡画像の明るさの調整が困難であるという課題があった。
　電子顕微鏡で粒子を解析する際には、前述した特許文献２のように、粒子を器材に載せた標本を作製することが一般的である。さらにある条件に置かれた粒子を対照の粒子と比較して検査する場合には、条件ごとに粒子をサンプリングしてそれぞれの標本を作製し、標本ごとに電子顕微鏡で解析して、各画像を比較することが多い。つまり、同一画像内で異なる条件に置かれた粒子を比較するのではなく、異なる複数の画像間で比較することが多い。
　例えば異なる製造プロセスで生成された微粒子を比較して検査する場合、製造プロセスごとに生成された微粒子の一部をサンプリングして器材に載せた標本を作製し、各標本の電子顕微鏡画像を取得する。あるいは細胞のような生物由来粒子の大きさや形などの異常度を検査する場合には、正常細胞と異常細胞を器材に載せた標本を作製し、各標本の電子顕微鏡画像を取得する。また細胞などの経時変化を検査する場合には、ある条件に置かれた細胞集団の一部を経時的にサンプリングしてそれぞれを器材に載せた標本を作製し、各標本の電子顕微鏡画像を取得する。また、環境中の微粒子濃度の変化などをモニタリングする場合には、経時的にサンプリングしてそれぞれを器材に載せた標本を作製し、各標本の電子顕微鏡画像を取得する。
　例に挙げたような検査やモニタリングでは、被解析対象の粒子や解析目的に合わせて、ある決まった種類の標本用器材や解析装置を用いて解析する場合が多い。そして、対照の標本、あるいは異なる条件でサンプリングされた複数の粒子標本などの複数の画像を、ある基準を以て、比較することが多い。
　ここで、複数の画像をある基準を以て比較するための電子顕微鏡画像取得条件として、別々に取得された画像間で、明るさやコントラストなどの画像調整条件が揃っていることが望ましい。
　その理由として、画像解析の容易さが挙げられる。例えば、電子顕微鏡画像に器材と粒子の領域が混在する場合に、粒子の画像領域を抽出する方法として、背景である器材領域と粒子領域を分割できる閾値で画像を二値化することにより、粒子領域を抽出する方法が知られている。
　ここで、ある粒子を解析する時に、同じ種類の器材に載せて、画像の明るさとコントラスト調整を一定にしていれば、別々に取得された画像でも、原理的には同じ閾値で画像を二値化することができる。
　あるいは、人工知能を用いて画像を解析する場合にも、学習画像や評価画像の取得条件が一定であれば、より精度の高い画像解析結果を得ることが可能になる。
　しかしながら、複数の標本を解析するために複数の検査装置を並列して使用する場合や、あるいは電子ビームを照射する電子銃の状態の変化、あるいはその他の要因により、同じ明るさとコントラスト調整で別々の画像を取得することは容易ではない。この問題に対処する方法の一つとして、予め用意された標準試料を用いて、画像調整条件を合わせる方法がとられている。しかしながら、この場合は、被解析対象粒子とは別に作製した標準試料を電子顕微鏡試料室に出し入れをしたり、あるいは視野を変更したりして、調整を繰り返さなければならない場合がある。
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、電子顕微鏡画像の明るさの調整をより容易にする、粒子解析装置および粒子解析方法を提供することを目的とする。
　本発明に係る粒子解析装置の一例は、
　被解析対象となる所定の粒子を器材に載せて電子顕微鏡で解析するための粒子解析装置であって、
　前記粒子解析装置は、電子顕微鏡画像における明るさに関する第１標準値および第２標準値を取得し、
　前記粒子解析装置は、前記器材および前記粒子に電子ビームを照射することを介して生成された電子顕微鏡画像および信号プロファイルを取得し、
　前記粒子解析装置は、前記第１標準値と、前記第２標準値と、前記信号プロファイルとに基づき、前記電子顕微鏡画像の明るさを調整する。
　本発明に係る粒子解析方法の一例は、
　被解析対象となる所定の粒子を器材に載せて電子顕微鏡で解析するための粒子解析方法であって、
　電子顕微鏡画像における明るさに関する第１標準値および第２標準値を取得することと、
　前記器材および前記粒子に電子ビームを照射することを介して生成された電子顕微鏡画像および信号プロファイルを取得することと、
　前記第１標準値と、前記第２標準値と、前記信号プロファイルとに基づき、前記電子顕微鏡画像の明るさを調整することと、
を備える。
　本発明に係る技術によれば、電子顕微鏡画像の明るさの調整がより容易になる。
本発明の実施例１による標本の構成と標本画像の例の概略図 実施例１による粒子解析装置の概略構成図 実施例１による画像の明るさおよびコントラスト調整例の概略図 実施例２による器材例の概略図 実施例３による粒子解析のフローチャート 実施例４によって血球を解析した例 実施例５によって細胞増殖率を解析した例
　以下、本発明の実施例について説明する。
　実施例１では、電子顕微鏡で粒子を解析する際に、粒子を器材に載せた標本を作製する。
　粒子とは以下のものを含むが、これらに限定されない。
　‐粉砕、焼結、または結晶化により形成される粒子
　‐腐食によって、メッキによって、または電池等の化学反応によって、表面に析出または形成される段差や模様などの立体構造
　‐材料の劣化またはエッチングにより発生する空孔または傷
　‐外部要因として生成される異物
　‐有機物であるファイバー、マイクロプラスチック、花粉、血球、細胞、細菌、ウイルス、蛋白質凝集体、またはそれらの複合体
　本実施例では、器材としてプラスチックやセルロース系の膜を例に挙げるが、それらに限られることはない。本実施例の器材は、被解析対象となる粒子の電子顕微鏡画像を得られる面を有しており、例えば金属板、ガラス板、シリコン基板、金属メッシュなどでもよく、また被解析対象の粒子よりも十分に小さい立体構造がある面でも構わない。
　本実施例の説明では、器材の中にあって器材背景とは画像の明るさが異なる領域として、膜に貫通した穴や繊維の重なりなどの、立体構造を由来とする画像明るさの違いを例に挙げるが、それらに限られることはない。例えば異なる素材を組み合わせて作った領域、プリントされたもの、またはそれらを複合したものも含まれる。
＜粒子解析装置の構成例＞
　本実施例の装置で解析する粒子標本の構成と標本画像の例を図１を用いて説明する。図１（ａ）において、１０１は標本内の被解析対象粒子であり、１０２は器材の上面図であり、１０３は被解析対象粒子の側面図であり、１０４は器材の側面図であり、１０５はＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）試料ステージである。なお図１および以降の図において、視線方向が異なる図に現れる同一の構成要素に異なる符号を付して示す場合がある。
　図１（ｂ）において、１０６は、図１（ａ）とは異なる複数標本用の器材上面図である。
　図１（ｃ）において、１０７は標本内の被解析対象粒子のＳＥＭ画像の模式図であり、１０８は器材の背景領域のＳＥＭ画像の模式図であり、１０９は器材内の明るさが異なる領域のＳＥＭ画像の模式図である。この図は、必ずしも図１（ａ）または図１（ｂ）の器材に対応するものではない。
　被解析対象粒子１０１、１０３は、器材１０２，１０４、１０６の上面に載っており、さらに器材はＳＥＭの試料ステージ１０５に載っている。１枚の器材上に、粒子が載っている領域は一か所でも複数箇所でもよい。図１（ａ）の例では一か所であり、図１（ｂ）の例では複数箇所（５列４段）である。
　粒子１０１を載せた領域をＳＥＭで観察したときの標本画像の一例として、図１（ｃ）に、粒子１０７と、粒子１０７よりも画像明るさが暗い器材背景１０８と、背景よりさらに暗い領域１０９が存在する画像を示す。背景より暗い領域は、整列した同じサイズの複数の粒子状パターン（ｉ）、整列していない同じサイズの複数の粒子状パターン（ｉｉ）、整列していない異なるサイズの粒子状パターン（ｉｉｉ）、整列した異なるサイズの粒子状パターン（ｉｖ）、および繊維状のパターン（ｖ）の概略図を例としたが、これに限らない。
　また、器材背景と、器材の中にあって明るさが異なる領域として、被解析対象の粒子より暗い例を示したが、被解析対象の粒子と明るさが異なれば、両方あるいはいずれかが、被解析対象の粒子よりも明るくても構わない。
　このように、本実施例に係る粒子解析装置は、被解析対象となる所定の粒子を器材に載せて電子顕微鏡で解析するための装置である。器材は、電子顕微鏡で観察した場合に、粒子とは明るさが異なる第１領域（たとえば背景１０８）と、粒子および第１領域とは明るさが異なる第２領域（たとえば背景より暗い領域１０９）とを備える。
　第１領域を構成する材料と、第２領域を構成する材料とは異なっていてもよい。および／または、第１領域および第２領域は、器材の立体構造において互いに異なる部分であってもよい。このようにすると、電子顕微鏡画像における各領域の判別が容易である。
　粒子解析装置の概略構成を図２を用いて説明する。図２において、１０３は被解析対象粒子であり、１０４は器材であり、１０５は試料ステージであり、２０１はＳＥＭ試料室であり、２０２は鏡筒であり、２０３は器材および粒子に電子ビームを照射する電子銃であり、２０４は電子ビームであり、２０５は反射電子および二次電子であり、２０６は電子ビームの照射によって生じる電子を検出する検出器であり、２０７は電子光学系であり、２０８は検出信号であり、２０９は画像生成部であり、２１０はＳＥＭ制御部であり、２１１は画像調整部であり、２１２は画像出力部であり、２１３はモニターであり、２１４は画像解析部であり、２１５はデータベースである。モニター２１３は、後述するように、明るさが調整された後の電子顕微鏡画像を出力する画像出力部として機能する。このような構成を備えることにより、粒子解析装置は、電子顕微鏡画像を生成することができる。
　被解析対象粒子１０３と器材１０４とＳＥＭ試料ステージ１０５は、ＳＥＭ試料室２０１内に設置される。ＳＥＭ鏡筒２０２内には、電子銃２０３から放出された電子ビーム２０４が粒子に照射されることにより生じた反射電子や二次電子の信号２０５を検出する検出器２０６、電子ビーム２０４を制御する電子光学系２０７があり、さらに信号２０８を画像データに変換する画像生成部２０９で、器材の上に載った粒子の画像が生成される。生成された画像の器材背景と器材の中の明るさが異なる領域の境界線画像を利用して、ＳＥＭ制御部２１０により、ＳＥＭのフォーカスを調整する。
　器材の種類、器材の画像明るさ、さらに以下に述べる画像調整、画像解析パラメータなどの、粒子解析装置の設定情報を、データベース２１５に蓄積することもできる。さらにデータベースに蓄積された情報を解析することにより、画像調整部２１１と画像解析部２１４の設定が更新されてもよい。
　画像調整部２１１における明るさおよびコントラストの調整について、図３を用いて説明する。図３において、３０１は器材背景の画像であり、３０２は器材の明るさが違う領域の画像であり、３０３は被解析対象粒子の画像であり、３０４は状態が変化した粒子の画像であり、３０５および３０６は画像の二値化によって器材画像と分離した粒子画像である。
　粒子解析装置は、電子顕微鏡画像における明るさに関する第１標準値および第２標準値を記憶している（図中では単に「標準１」「標準２」と示す）。これらの標準値は、予め粒子解析装置の使用者が決定し入力しておくことができる。以下、これらの標準値の決定方法の具体例を説明する。
　たとえば、第１標準値は、器材の第１領域の明るさに基づいて決定することができ、第２標準値は、器材の第２領域の明るさに基づいて決定することができる。粒子を載せる器材には、器材画像において、背景３０１と、背景３０１とは明るさが異なる領域３０２とがある。背景３０１の明るさを第１標準値、明るさが異なる領域３０２の明るさを第２標準値として、第１標準値と第２標準値を、画像全体の明るさヒストグラムにおいて異なる適切な位置に設定することにより、生成する画像の明るさとコントラストを適切に調整することができる。なお、画像の明るさおよびコントラストの具体的な調整方法については、実施例２および３において詳述する。
　被解析対象の粒子３０３、３０４の画像を生成する時、図３（ａ）に示すように、画像調整部において、前述の第１標準値と第２標準値を利用して明るさおよびコントラストの調整を一定に設定することにより、生成した複数の画像において、器材領域の画像明るさを一定にすることができる。
　図３（ｂ）に示すように、器材の背景３０１と、背景とは明るさが異なる領域３０２、さらに被解析対象の粒子３０３，３０４の明るさが異なることを利用して、画像の明るさを二値化する際の閾値を決定することができる。画像解析部では、生成した画像の明るさを二値化することにより、粒子画像領域と器材画像領域を分離し、粒子解析を行う。
　このとき、前述の様に、複数の画像でも器材領域の画像明るさが一定であることから、ある一定の明るさ閾値で二値化することにより、図３（ｃ）に示すように、粒子画像と器材画像を分離することができる。さらに状態が変化した粒子３０４が出現した場合にも、第１標準値、第２標準値、粒子３０３の画像明るさは一定であることから、閾値１で画像を二値化することにより３０５、３０６の領域を分離でき、閾値２で画像を二値化することにより粒子３０６を分離できる。このようにして粒子を分離した後、粒子の大きさ、面積、数、密度、などを解析できる。
　ここで、画像解析部で画像を二値化する時の閾値は、予め最適化された一定の閾値を記憶しておくことも可能であり、さらに被解析対象の粒子と器材の画像の明るさヒストグラムから、適切な閾値を自動計算することも可能である。
　明るさおよびコントラストの調整後に生成された画像は、画像出力部を介してモニターに表示される。画像解析部で粒子画像と器材画像を分離するときに用いた閾値などのパラメータをデータベースに蓄積することができ、さらに画像調整部にフィードバックすることにより、画像調整の設定に利用することもできる。
　このように、実施例１に係る粒子解析装置によれば、電子顕微鏡画像の明るさの調整がより容易になる。
　またデータベースおよび画像解析部が、粒子解析装置の内部に一体化されている例を示したが、付属装置として接続されていてもよい。
　以下、本発明の実施例２について説明する。実施例１と共通する部分については説明を省略する場合がある。
＜トラックエッチドメンブレン＞
　粒子を載せる器材で、器材背景と、明るさが異なる領域を有する例を図４を用いて説明する。図４（ａ）および図４（ｂ）において、４０１はトラックエッチドメンブレンの上面図であり、４０２はトラックエッチドメンブレンの貫通穴であり、４０３は被解析対象の粒子であり、４０４は図４（ａ）の線Ａにおけるメンブレン断面模式図であり、４０５はメンブレンを貫通する穴の断面であり、４０６は電子ビームであり、４０７は反射電子であり、４０８は反射電子検出器であり、４０９はトラックエッチドメンブレンの画像であり、４１０はトラックエッチドメンブレンの貫通穴の画像であり、４１１は被解析対象の粒子の画像である。
　例えば器材は、器材を貫通する貫通穴４０２、４０５を有するメンブレン４０１、４０４である。貫通穴４０２、４０５の径は、粒子の短径より小さくすると、粒子が貫通穴４０２、４０５から漏出せず好適である。また、たとえば粒子を分散させた液体や気体を器材に載せたときに、器材の片面に粒子を捕集し、その他の溶媒や粒子よりも小さい夾雑物を穴から排出して分離できるので好適である。
　なお、貫通穴４０２、４０５の径とは、たとえば貫通穴の断面が円形である場合には直径である。また、「粒子の短径」とは、粒子が球状である場合にはその直径であり、粒子が楕円体である場合には最も短い軸の長さであり、粒子の大きさが一定でない場合には、粒子の径が最小となる方向における径である。
　電子ビーム４０６を照射したとき、器材と粒子で生じた反射電子４０７は、検出器４０８で検出され、メンブレン画像４０９と粒子画像４１１が生成される。一方、貫通穴４０５の部分は電子ビームが通過するため反射電子が検出器４０８に届かず、生成された画像では貫通穴の画像４１０は最暗部となる。
　図４（ｃ）に、このような器材の一例として、穴径２００ｎｍのポリカーボネート製トラックエッチドメンブレンを、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて倍率７０００倍で観察した場合の例を示す。図４（ｃ）において、４１２、４１３、４１４は、ポリカーボネート製トラックエッチドメンブレンを用いた反射電子像である。
　各画像における明るさのヒストグラムを、対応する画像の左側に示す。ヒストグラムにおいて、横軸は画素の明るさ値であり、縦軸は頻度（画像においてその明るさ値を持つ画素の数）である。
　反射電子像４１２、４１３、４１４は、同じ視野を撮影した１つの画像から明るさを変換して得られる画像の例である。反射電子像４１２は、元画像の各画素の明るさに第１変換式を適用して得られたものであり、反射電子像４１３は、元画像の各画素の明るさに第２変換式を適用して得られたものであり、反射電子像４１４は、元画像の各画素の明るさに第３変換式を適用して得られたものである。
　たとえば、ポリカーボネートメンブレンの画像明るさのヒストグラムにおいて頻度ピークを示す明るさを第１標準値とし、貫通穴の最暗部の明るさを第２標準値とする。反射電子像４１２に対して適用される第１変換式は、第１標準値を第１目標値に変換し、第２標準値を第２目標値に変換する。この第１変換式を、すべての画素の明るさについて適用することにより、すべての画素の明るさが変換され、結果として反射電子像４１２が生成される。
　同様に、反射電子像４１３に対して適用される第２変換式は、第１標準値を第３目標値（ただし第１目標値より小さい）に変換し、第２標準値を第４目標値（ただし第２目標値より小さい）に変換する。
　反射電子像４１４に対して適用される第３変換式は、第１標準値を第５目標値（ただし第３目標値より小さい）に変換し、第２標準値を第６目標値（ただし第４目標値より小さい）に変換する。
　変換式は、目標値に基づいて自動的に決定することができる。たとえば、粒子解析装置は、信号プロファイルを出力し、これに応じた入力を促すことにより第１目標値および第２目標値を取得することができる。なお、本実施例において「信号プロファイル」とは、明るさ値ごとにその明るさ値を有する画素の数を表す情報を含み、たとえば図４（ｃ）に示すヒストグラムの形式で表される。モニター２１３が信号プロファイルを表示してもよい。
　ヒストグラムにおいて第１標準値および第２標準値を示してもよい。ここで、粒子解析装置の使用者は、ヒストグラムを見て適切な第１目標値および第２目標値を決定して入力することができる。そして、粒子解析装置は、信号プロファイルにおいて、第１標準値を第１目標値に変換し、第２標準値を第２目標値に変換するための変換式を決定する。このような変換式は公知の手法により決定可能である。たとえば第１標準値、第１目標値、第２標準値、第２目標値がいずれもスカラー量である場合には、線形変換を用いてもよい。そして、粒子解析装置は、電子顕微鏡画像の明るさ（各画素の明るさ値）に変換式を適用することにより、電子顕微鏡画像の明るさを調整し、これによって反射電子像４１２、４１３、４１４を生成する。
　このようにして、明るさおよびコントラストの異なる３つの画像が生成される。このように、第１標準値と第２標準値を変換した後の目標値を変えることにより、画像の明るさおよびコントラストを任意に調整することができる。
　さらに、画像生成時のみではなく、出力後であっても、同じ器材に載せた粒子の画像であれば、器材の明るさ第１標準値と第２標準値を利用して、画像の明るさおよびコントラストを、画像解析部において調整することが可能である。
　例えば画像解析ソフトなどを用いて、出力した複数の画像の明るさのヒストグラムを表示し、第１標準値と第２標準値を一定の目標値に変換することにより、画像の明るさおよびコントラストの調整を行う。ここで、全体的に明るい画像となる器材については第１標準値および第２標準値を大きく設定し、全体的に暗い画像となる器材については第１標準値および第２標準値を小さく設定しておけば、異なる明るさの器材に対して同じ目標値を入力することにより、全体的な画像の明るさを揃えることができる。その後、複数の画像を同じ閾値で二値化することにより、すべての画像において適切に粒子画像と器材画像を分離することができる。
　以下、本発明の実施例３について説明する。実施例１または２と共通する部分については説明を省略する場合がある。
　粒子解析方法のフローの一例を図５に示す。粒子解析装置の使用者は、被解析対象となる粒子の種類を決定し（Ｓ１）、さらに器材の種類を決定する（Ｓ２）。これに応じて、粒子解析装置は、粒子の種類および器材の種類を取得する。ここで種類とは、たとえば粒子または器材の性状を表すものであってもよい。
　そして、粒子解析装置はデータベースを参照し、様々な情報を取得する。取得される情報は、例として以下のものを含むが、これらに限らない。
　‐粒子の種類に関連付けられた明るさの信号プロファイルの例
　‐器材の種類に関連付けられた明るさの信号プロファイルの例
　‐粒子の種類と器材の種類との組み合わせに関連付けられた標本作製条件
　‐粒子の種類と器材の種類との組み合わせに関連付けられた電子顕微鏡観察条件
　‐粒子の種類と器材の種類との組み合わせに関連付けられた第１標準値および第２標準値
　‐粒子の種類と器材の種類との組み合わせに関連付けられた第１目標値および第２目標値
　‐粒子の種類と器材の種類との組み合わせに関連付けられた、二値化のための閾値
　とくに、粒子解析装置は、粒子の種類および器材の種類に基づいて第１標準値および第２標準値を取得する。これによって、同一種類の粒子および器材の組み合わせに対しては、常に同一の標準値を取得することができる。
　ここで、使用者は、粒子とは異なる画像明るさを示す器材を選択すると好適である。また、被解析対象となる粒子の種類がデータベースに存在しない場合には、被解析対象粒子を構成する元素とは異なる元素で構成された器材を選択すると好適である。あるいは、粒子が染色された粒子である場合には、粒子とは異なる画像明るさを示す器材を選択すると好適である。あるいは立体構造などにより、粒子とは異なる画像明るさを示す器材を選択すると好適である。
　なお、一変形例において、粒子解析装置は、粒子と器材の明るさから画像二値化の閾値を自動設定する機能を備えてもよく、そのような機能を実現するアルゴリズムをデータベースから取得してもよい。
　次に、使用者は、粒子を器材に載せた標本を作製し（Ｓ３）、標本作製条件に応じて金属を含む染色剤などにより粒子を染色し、染色された粒子を用いる（Ｓ４）。染色により器材との区別がより容易になる。さらに粒子や器材が非導電性の物質である場合には、必要に応じて金属コーティング等により導電処理を施す（Ｓ５）。なお染色と導電処理は、粒子を器材に載せる前に行ってもよい。
　次に、使用者は、粒子を載せた器材を、電子顕微鏡の試料台に載せて電子顕微鏡試料室に挿入し、観察を開始する（Ｓ６）。データベースに、粒子と器材の組み合わせによって、電子顕微鏡の加速電圧、電流値、観察倍率、真空度などの観察条件が登録されている場合は、粒子解析装置はこれを利用してＳＥＭを制御してもよい。粒子解析装置は、モニターに表示された画像において、器材の中で明るさが異なる領域の境界を利用して、画像のフォーカスを合わせる（Ｓ７）。このようなフォーカス手法は公知技術に基づいて適宜設計可能である。
　ここで、粒子解析装置は、器材および粒子に電子ビームを照射することを介して生成された電子顕微鏡画像および信号プロファイルを取得する。
　続いて、粒子解析装置は、画像明るさおよびコントラストを調整する（Ｓ８）。この調整は、たとえば電子顕微鏡の検出器の設定を変更することにより実現可能である。たとえば、粒子解析装置は、実施例２において説明したように、第１標準値と、第２標準値と、信号プロファイルとに基づき、たとえば変換式を用いて電子顕微鏡画像の明るさを調整する。また、明るさを調整することにより、コントラストを調整する。
　次に、粒子解析装置は、明るさが調整された後の電子顕微鏡画像に基づき、被解析対象粒子にフォーカスを合わせてもよい。次に、粒子解析装置は、粒子解析に用いるための粒子画像を生成する（Ｓ９）。この粒子画像の明るさについても、Ｓ８で用いた明るさの変換式を適用して調整することができる。また、粒子解析装置は、使用者の操作に応じて、観察位置、倍率を変えた画像を生成し、出力、保存する（Ｓ１０）。走査電子顕微鏡の場合には、倍率を変えても画像の明るさおよびコントラストの調整は変化しないことから、倍率の異なる複数の画像も、同じ条件で画像を生成、出力することができる。
　続いて、出力された画像の解析を行う（Ｓ１１）。たとえば、粒子と器材の領域を識別する場合、さらに粒子の種類を識別する場合などの目的に応じて、粒子と器材の明るさから画像二値化の閾値を自動設定してもよい。または、閾値は、データベースに登録されている値を参照してもよい。
　同じ明るさおよびコントラスト調整（たとえば同じ変換式）で生成した複数の画像の場合、画像解析ソフトのマクロ機能などを用いることにより、迅速に二値化画像を生成し、粒子の大きさ、面積などを解析することができる。
　図５の各ステップで選択または設定した条件と、出力された解析と評価結果は、出力されデータベースに登録される（Ｓ１２）。粒子解析装置は、登録されたデータを解析することにより、粒子解析フローの最適条件を求め、粒子解析装置の設定にフィードバックしてもよい。
　図５に示したフローは、本実施例による粒子解析方法の例であり、本実施例のフローは図５に限定されるものではない。
　たとえば、本実施例では粒子解析装置はオンラインで電子顕微鏡画像の明るさを調整するが、変形例として、オフラインで電子顕微鏡画像の明るさを調整してもよい。すなわち、まずＳＥＭを制御して電子顕微鏡画像を取得して保存し、その後、ＳＥＭの制御を終了して（たとえばＳＥＭの電子銃２０３および検出器２０６の動作を停止した状態で、またはＳＥＭの電源をオフにした状態で）、保存された電子顕微鏡画像を取得し、その明るさを調整してもよい。このようにすると、使用者の利便性が向上する。
　以下、本発明の実施例４について説明する。実施例１～３のいずれかと共通する部分については説明を省略する場合がある。
＜血球の解析＞
　本実施例を用いて血球を解析した例を図６を用いて説明する。ヒト血液を生理食塩水で希釈し、直径２００ｎｍの貫通穴があるトラックエッチドメンブレンフィルターに載せた。メンブレン表面には、予め白金パラジウムを蒸着することによって標本に伝導性を付与しておいた。
　メンブレン上の血球を、グルタルアルデヒドなどのタンパク架橋作用がある固定液で固定してから、金属を含む染色液を用いて血球を染色し、水で余分な染色液を洗い流してから乾燥した後に、走査電子顕微鏡試料室に挿入し、５０００倍で反射電子像を観察した。
　図６（ａ）の画像１はメンブレン画像であり、貫通穴の輪郭でフォーカスを合わせた後、明るさヒストグラムの中で、メンブレン素材の明るさに対応する頻度ピークの明るさを第１標準値とし、貫通穴である最暗部に対応する明るさを第２標準値として、第１標準値と第２標準値の横軸の値を設定することにより、画像の明るさおよびコントラストを調整した。
　図６（ｂ）の画像２は赤血球１個の画像である。図６（ｃ）の画像３は赤血球と赤血球とは明るさが異なる血球の画像である。図６（ｄ）の、画像４は画像３と中心が同じ領域の倍率５００倍の画像である。図６（ａ）～図６（ｄ）の画像の右側に示すヒストグラムでは、第１標準値および第２標準値は同じ値である。
　画像解析ソフトを用いて、画像２、３、４のマスクを作成した。マスク１は、各画像の明るさヒストグラムの第１閾値（閾値１）で二値化した後、粒子解析アルゴリズムで血球よりも著しく小さい粒子を除去して作成したマスク画像である。マスク２は、ヒストグラムの閾値２で、画像を二値化した後、粒子解析アルゴリズムで血球よりも著しく小さい粒子を除去して作成したマスク画像である。
　粒子解析で面積を求めた結果、画像４のマスク１の面積率（％Ａｒｅａ）は９．９７％であり、マスク２の面積率は０．３２％であることから、約３％の血球が、明るさの異なる血球であることが示された。
　以下、本発明の実施例５について説明する。実施例１～４のいずれかと共通する部分については説明を省略する場合がある。
＜細胞増殖の解析＞
　本実施例を用いて、細胞の増殖率を求めた例を、図７を用いて説明する。図７において、７０１は細胞培養液であり、７０２は漏斗であり、７０３はトラックエッチドメンブレンフィルターであり、７０４は細胞捕集領域であり、７０５は画像生成領域である。
　細胞培養容器から、一定時間ごとに定量の細胞培養液７０１をサンプリングし、細胞捕集デバイスを用いて、メンブレンフィルター上の一定の領域に捕集した。メンブレン表面には、予め白金パラジウムを蒸着することによって標本に伝導性を付与しておいた。
　図７（ａ）に示すように、細胞捕集デバイスは、漏斗状の容器７０２の底面に、細胞の短径よりも小さい直径２００ｎｍの貫通穴があるトラックエッチドメンブレンフィルター７０３を設置した構造である。サンプリングした細胞培養液７０１を漏斗部分に注入し、メンブレンフィルターの反対側から液を吸引することにより、液を排出して、図７（ｂ）に示すように、細胞をメンブレンフィルター上面７０４に捕集した。
　細胞が変化しないように、２．５％グルタルアルデヒドなどのタンパク架橋作用がある固定液で固定した後、金属を含む染色液を用いて細胞を染色した。図７（ｃ）に示すように、水で余分な染色液を洗い流してから、細胞捕集デバイスからメンブレンフィルターを取り出して乾燥させた後に、ＳＥＭで反射電子像を観察した。
　観察の工程として、まず標本の中の細胞が載っていない領域で、倍率７０００倍に設定して、ＳＥＭのオートフォーカス機能を用い、トラックエッチドメンブレンの穴の輪郭で画像のフォーカスを合わせた。次に実施例２に従って画像の明るさとコントラストを調整した。経時的にサンプリングするすべての標本の画像で、明るさヒストグラムにおいてポリカーボネートメンブレンの明るさの頻度ピークを示す明るさを第１標準値、穴の部分の明るさの頻度ピークを示す明るさを第２標準値として、同じ変換式を適用して調整した。第１標準値と第２標準値の値は、予備検討の段階で、細胞画像と器材画像を二値化によって分離するのに適切な値を決めておいた。
　倍率７０００倍にした理由は、フォーカス合わせの時にトラックエッチドメンブレンの輪郭が明確に画像化できる倍率として選んだが、これに限定されるものではない。
　続いて倍率５００倍に変更し、図７（ｄ）に示すように、メンブレン上の細胞を捕集した領域内で等間隔に６つの画像７０５を取得した。この時、ＳＥＭに内蔵されている電動試料ステージと、自動連続撮影機能を用いることにより、簡便に複数の画像を生成することができる。
　撮像倍率を５００倍にした理由は，少ない画像枚数で広い領域を撮像するために低倍率とし，なおかつ細胞の形を見てノイズと分別できる倍率が望ましいため，１ピクセルが細胞の直径より十分小さい５００倍を選択したが、この倍率に限定するものではない。また画像枚数は、細胞を捕集した領域内の密度の偏りを平均化するため例えば６枚としたが、この枚数に限定するものではない。
　出力後の画像をオフラインで画像解析部に入力し、画像解析ソフトを用いて、一定の閾値ですべての画像を二値化したのち、粒子部分の画像面積率を求めた。画像解析ソフトに付与されているマクロ機能を用いることにより、予め最適化された一定の閾値で二値化する工程と、粒子部分の面積を求める工程を数秒で行うことが可能である。
　２種類の培地で培養している細胞を、経時的に５回サンプリングして、標本あたり６画像、３０枚の画像を取得する工程を、独立して３回繰り返すことにより、１８０枚の画像を生成した。
　図７（ｅ）のグラフに、本実施例の方法を用いて細胞の増殖を解析した結果を示した。培地１で培養した場合には、細胞は指数関数的に増殖した。グラフ中の点線は培地１の面積率を近似する指数関数を表す。一方、培地２で培養した場合（実線）には増殖が抑制された。このように、本実施例の方法を用いることにより、培養細胞の増殖を、簡便に解析することが可能である。
　以下、本発明の実施例６について説明する。実施例１～５のいずれかと共通する部分については説明を省略する場合がある。
＜アスベストの解析＞
　建材にアスベスト繊維が含まれている建築物の解体現場では、アスベストの漏洩を監視するため、大気濃度測定が行われる場合がある。作業環境の大気を一定時間フィルターに吸引し、フィルター表面を光学顕微鏡あるいは電子顕微鏡を用いて、アスベスト繊維濃度が測定される。一方、アスベストによる健康被害の例として中皮腫が挙げられ、患者救済の根拠とするために患者検体の溶解液に含まれるアスベスト繊維をニトロセルロースメンブレンフィルターなどに回収して定量する場合がある。このようなアスベストの解析において、本実施例の装置と方法を適用することが可能である。
　例えばニトロセルロースメンブレンの成分は、アスベストに含まれる珪素、マグネシウム、鉄などに比べると軽い元素で構成されているため、ＳＥＭで取得した反射電子像においては、アスベストよりも暗い画像になる。ニトロセルロースメンブレンに、明るさの異なる領域を１種類以上設けることにより、ニトロセルロースの明るさの頻度ピークを示す明るさを第１標準値とし、これとは明るさの異なる領域の明るさの頻度ピークを示す明るさを第２標準値として、画像取得時の明るさおよびコントラストを調整する。
　異なる標本の画像を取得する際にも、明るさが異なる領域を設けたニトロセルロースメンブレンを用いて、画像の明るさおよびコントラストを調整する。このようにして生成した複数の画像を、画像解析部において、適切な閾値で二値化することにより、器材と器材上の明るい繊維の画像を分離することができる。
　実際の検体中には、アスベスト以外の繊維状異物が多く含まれている場合が多い。またアスベストの種類により構成元素や繊維の太さが異なることにより画像明るさが異なる。これらを分類するため、画像解析部において、複数の閾値を用いて段階的に画像を二値化することにより、反射電子画像の明るさにより繊維画像を分類することができる。
予め蓄積したアスベストの反射電子画像の明るさに関するデータと照合することにより、アスベストが含まれる明るさの範囲の繊維画像を抽出する。このようにして抽出された繊維について、ＳＥＭを用いた元素分析を行うことにより、アスベストを同定して定量することができる。
　１０１…粒子
　１０２…器材の上面図
　１０３…粒子の側面図
　１０４…器材の側面図
　１０５…試料ステージ
　１０３…粒子
　１０４…器材
　１０５…試料ステージ
　２０１…ＳＥＭ試料室
　２０２…鏡筒
　２０３…電子銃
　２０４…電子ビーム
　２０５…反射電子および二次電子
　２０６…検出器
　２０７…電子光学系
　２０８…検出信号
　２０９…画像生成部
　２１０…ＳＥＭ制御部
　２１１…画像調整部
　２１２…画像出力部
　２１３…モニター（画像出力部）
　２１４…画像解析部
　２１５…データベース
　３０１…器材背景の画像
　３０２…器材の明るさが違う領域の画像
　３０３…粒子の画像
　３０４…状態が変化した粒子の画像
　３０５、３０６…画像の二値化によって器材画像と分離した粒子画像
　４０１…トラックエッチドメンブレンの上面図
　４０２…トラックエッチドメンブレンの貫通穴
　４０３…粒子
　４０４…メンブレン断面模式図
　４０５…メンブレンを貫通する穴の断面
　４０６…電子ビーム
　４０７…反射電子の信号
　４０８…反射電子検出器
　４０９…トラックエッチドメンブレンの画像
　４１０…トラックエッチドメンブレンの貫通穴の画像
　４１１…被解析対象の粒子の画像
　４１２、４１３、４１４…反射電子像
　７０１…細胞培養液
　７０２…漏斗
　７０３…トラックエッチドメンブレンフィルター
　７０４…細胞捕集領域
　７０５…画像生成領域

Claims (11)

  1. 　被解析対象となる所定の粒子を器材に載せて電子顕微鏡で解析するための粒子解析装置であって、
    　前記粒子解析装置は、電子顕微鏡画像における明るさに関する第１標準値および第２標準値を取得し、
    　前記粒子解析装置は、前記器材および前記粒子に電子ビームを照射することを介して生成された電子顕微鏡画像および信号プロファイルを取得し、
    　前記粒子解析装置は、前記第１標準値と、前記第２標準値と、前記信号プロファイルとに基づき、前記電子顕微鏡画像の明るさを調整する、
    粒子解析装置。
  2. 　請求項１に記載の粒子解析装置であって、
    　前記粒子解析装置は、粒子の種類および器材の種類を取得し、前記粒子の種類および前記器材の種類に基づいて前記第１標準値および前記第２標準値を取得する、
    粒子解析装置。
  3. 　請求項１に記載の粒子解析装置であって、
    　前記器材は、前記電子顕微鏡で観察した場合に、前記粒子とは明るさが異なる第１領域と、前記粒子および前記第１領域とは明るさが異なる第２領域とを備え、
    　前記第１標準値は、前記第１領域の明るさに基づいて決定された値であり、
    　前記第２標準値は、前記第２領域の明るさに基づいて決定された値である、
    粒子解析装置。
  4. 　請求項３に記載の粒子解析装置であって、
    　前記第１領域を構成する材料と、前記第２領域を構成する材料とは異なる、
    粒子解析装置。
  5. 　請求項３に記載の粒子解析装置であって、
    　前記第１領域および前記第２領域は、前記器材の立体構造において互いに異なる部分である、
    粒子解析装置。
  6. 　請求項１に記載の粒子解析装置であって、
    　前記粒子は染色された粒子である、
    粒子解析装置。
  7. 　請求項１に記載の粒子解析装置であって、
    　前記器材および前記粒子に電子ビームを照射する電子銃と、
    　前記電子ビームの照射によって生じる電子を検出する検出器と、
    　明るさが調整された後の電子顕微鏡画像を出力する画像出力部と、
    を備える粒子解析装置。
  8. 　請求項７に記載の粒子解析装置であって、
    　オフラインで前記電子顕微鏡画像の明るさを調整する、
    粒子解析装置。
  9. 　請求項１に記載の粒子解析装置であって、
    　前記器材は、前記器材を貫通する貫通穴を有し、前記貫通穴の径は前記粒子の短径より小さい、
    粒子解析装置。
  10. 　請求項１に記載の粒子解析装置であって、
    　前記粒子解析装置は、前記信号プロファイルを出力し、
    　前記粒子解析装置は、第１目標値および第２目標値を取得し、
    　前記粒子解析装置は、前記信号プロファイルにおいて前記第１標準値を前記第１目標値に変換し、前記第２標準値を前記第２目標値に変換するための変換式を決定し、
    　前記粒子解析装置は、前記電子顕微鏡画像の明るさに前記変換式を適用することにより、前記電子顕微鏡画像の明るさを調整する、
    粒子解析装置。
  11. 　被解析対象となる所定の粒子を器材に載せて電子顕微鏡で解析するための粒子解析方法であって、
    　電子顕微鏡画像における明るさに関する第１標準値および第２標準値を取得することと、
    　前記器材および前記粒子に電子ビームを照射することを介して生成された電子顕微鏡画像および信号プロファイルを取得することと、
    　前記第１標準値と、前記第２標準値と、前記信号プロファイルとに基づき、前記電子顕微鏡画像の明るさを調整することと、
    を備える、粒子解析方法。
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