WO2022220147A1 - 筋萎縮抑制用組成物 - Google Patents

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muscle atrophy
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muscle
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渉 小川
悠 平田
和弘 野村
良祐 黒田
隆宏 新倉
啓介 大江
友章 福井
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国立大学法人神戸大学
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present disclosure relates to a composition for suppressing muscle atrophy, a method for screening an active ingredient for suppressing muscle atrophy, and the like.
  • Muscle atrophy includes diseases of the muscles themselves (myogenic muscular atrophy), disorders of the motor nerves (neurogenic muscular atrophy), and long-term bedridden conditions (disused muscle atrophy). atrophy), etc., and in particular, immobility, immobility, and decreased physical exertion are considered to be one of the important factors for muscle mass reduction. Disuse muscle atrophy due to immobility and immobility is an important pathological condition that leads to shortened healthy life expectancy, especially in elderly people, because muscle atrophy reduces muscle mass and muscle strength. , its onset pathology is not sufficiently clear, and development of a therapeutic agent is desired (Patent Document 1).
  • muscle atrophy is caused by various factors such as aging, drugs such as steroids, endocrine diseases, cancer/wasting diseases, chronic kidney disease, chronic liver disease, chronic heart failure, and mental disorders such as depression. known to be a major health problem.
  • drugs such as steroids, endocrine diseases, cancer/wasting diseases, chronic kidney disease, chronic liver disease, chronic heart failure, and mental disorders such as depression.
  • sarcopenia age-related muscle weakness
  • CXCL10 CXC motif chemokine ligand 10
  • the object is to provide a composition for suppressing muscle atrophy. Another issue is to provide a therapeutic or preventive composition for diseases associated with muscle atrophy. Another issue is to provide a screening method for active ingredients for suppressing muscle atrophy.
  • the present inventors found that the expression of the transcription factor KLF15 (Krüppel-like factor 15) was significantly increased by immobilizing the lower limbs of mice with casts. Furthermore, the present inventors identified CXCL10, a chemokine, through comprehensive gene expression analysis of skeletal muscle of immobilizing muscle atrophy model mice and skeletal muscle of patients with immobilizing muscle atrophy, and immobilized the expression level of CXCL10. In KLF15-deficient mice, the increase in the expression level of CXCL10 due to immobilization was suppressed, and further improvements were made. The present inventors also found that administration of a cell membrane Ca 2+ channel inhibitor to mice also increased the expression level of CXCL10, and made further improvements.
  • Section 1 A composition for suppressing muscle atrophy, containing a CXCL10 expression inhibitor as an active ingredient.
  • Section 2. Item 2. The composition for suppressing muscle atrophy according to Item 1, comprising a CXCL10 inhibitor as an active ingredient.
  • Item 3. Item 3. The composition for suppressing muscle atrophy according to Item 1 or 2, comprising a CXCL10-neutralizing antibody as an active ingredient.
  • Section 4. A composition for suppressing muscle atrophy comprising a TRPV2 activator as an active ingredient.
  • Item 5. A composition for treating or preventing a disease associated with muscle atrophy, comprising a CXCL10 expression inhibitor as an active ingredient.
  • Item 6. Item 6.
  • Item 7. A composition for treating or preventing a disease associated with muscle atrophy according to item 5 or 6, comprising a CXCL10-neutralizing antibody as an active ingredient.
  • Item 8. A composition for treating or preventing a disease associated with muscle atrophy, comprising a TRPV2 activator as an active ingredient.
  • Item 10. A method of screening for an active ingredient for suppressing muscle atrophy, using a decrease in the expression level of the CXCL10 gene as an index.
  • a composition for suppressing muscle atrophy is provided. Also provided is a method of screening for an active ingredient for suppressing muscle atrophy.
  • Fig. 2 shows changes in CXCL10 expression levels by immobilization, KLF15 expression levels by cast fixation, and gastrocnemius muscle weights in wild-type mice or skeletal muscle-specific KLF15-deficient mice.
  • FIG. 3 shows the expression level of CXCL10 in patients who required cast fixation.
  • FIG. 10 shows the results of comparison of CXCL10 expression level by age in the control group.
  • FIG. The expression level of CXCL10 in KLF15-overexpressing muscle cells is shown. Weight changes of the gastrocnemius and soleus muscles due to immobilization are shown. A soleus muscle staining photograph is shown.
  • Fig. 2 shows changes in the expression level of CXCL10 by administration of a broad-spectrum membrane Ca 2+ channel inhibitor. Fig.
  • FIG. 2 shows changes in the expression level of CXCL10 due to administration of TRPV2 channel inhibitors.
  • Fig. 2 shows changes in the expression level of CXCL10 due to extracellular Ca 2+ chelating agent administration.
  • Fig. 2 shows changes in the expression level of CXCL10 due to intracellular Ca 2+ chelating agent administration.
  • Fig. 2 shows changes in the expression level of CXCL10 due to administration of ryanodine receptor inhibitors.
  • Fig. 2 shows changes in the expression level of CXCL10 by administration of a TRPV2 channel inhibitor and a TRPV2 channel activator.
  • composition for suppressing muscle atrophy included in the present disclosure may contain a CXCL10 (CXC motif chemokine ligand 10) expression inhibitor.
  • the composition for suppressing muscle atrophy included in the present disclosure may contain an activator of TRPV2 (Transient receptor potential cation channel subfamily V member 2).
  • these active ingredients can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • these compositions for suppressing muscle atrophy may be referred to as "the composition for suppressing muscle atrophy of the present disclosure”.
  • CXCL10 (also called IP-10) is a member of the CXC chemokine family that exerts its biological effects by binding to the CXCR3 receptor and is reported to be secreted from cells in response to IFN- ⁇ It is CXCL10 is known to have effects such as chemotaxis of monocytes, macrophages, T cells, NK cells, dendritic cells, etc.; antitumor activity.
  • CXCL10 expression inhibitors examples include CXCL10 inhibitors.
  • the CXCL10 inhibitor is not particularly limited as long as it inhibits the activity of CXCL10.
  • CXCL10 inhibitors include, for example, CXCL10 neutralizing antibodies.
  • the CXCL10 neutralizing antibody is not particularly limited as long as it binds to CXCL10 and inhibits the activity of CKCL10.
  • Inhibition of CKCL10 activity is confirmed, for example, by evaluating the ability to inhibit chemotaxis induced by CXCL10.
  • the CXCL10 neutralizing antibody may be a commercial product or one produced by a known method.
  • Examples of commercially available products include MAB466 (manufactured by R&D Systems).
  • the CXCL10 inhibitor may be a nucleic acid molecule capable of inhibiting the activity of CXCL10 by suppressing the expression of the CXCL10 gene.
  • nucleic acid molecules include, for example, an antisense strand targeting a polynucleotide encoding CXCL10, siRNA, miRNA, shRNA, or vectors containing these. Gene expression is confirmed by methods known in the art.
  • the CXCL10 inhibitor may be a nucleic acid molecule capable of inhibiting the activity of CXCL10 by suppressing the expression of the KLF15 gene.
  • nucleic acid molecules include, for example, an antisense strand targeting a polynucleotide encoding KLF15, siRNA, miRNA, shRNA, vectors containing these, and the like. Gene expression is confirmed by methods known in the art.
  • composition for suppressing muscle atrophy of the present disclosure may contain an antagonist of CXCR3, which is a receptor for CXCL10.
  • TRPV2 is a non-selective cation channel with high calcium ion permeability, belonging to the Transient Receptor Potential (TRP) superfamily. TRPV2 is known to be activated by, for example, heat stimulation at 52 degrees Celsius or higher and cell membrane mechanical stretching stimulation.
  • TRP Transient Receptor Potential
  • the TRPV2 activator is not particularly limited as long as it activates TRPV2.
  • TRPV2 Activation of TRPV2 is confirmed, for example, by evaluating the ability to promote calcium uptake via TRPV2.
  • TRPV2 activators include probenecid, 2-aminoethyl diphenylborate, lysophosphatidylcholine, IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), cannabidiol and the like.
  • the TRPV2 activator may be a natural product or a synthetic product, and may be purified from a natural product, commercially available, or the like, and is not particularly limited. When it is a synthetic product, it can be synthesized by a known method or the like.
  • the content of the CXCL10 expression inhibitor and/or the TRPV2 activator in the composition for suppressing muscle atrophy of the present disclosure is not particularly limited, and can be appropriately set, for example, in the range of 0.01 to 100% by mass. .
  • it may be 0.05 to 99% by mass.
  • composition for suppressing muscle atrophy of the present disclosure contains the active ingredients described above, and may further contain other ingredients.
  • Such other ingredients include pharmaceutically acceptable bases, carriers, additives (for example, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, anti oxidizing agents, preservatives, coating agents, coloring agents, other agents such as gastric mucosa protective agents, etc.) and the like. These components can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • compositions for suppressing muscle atrophy of the present disclosure is not particularly limited, and injections, tablets, pills, capsules, powders, fine granules, granules, liquids, troches, jellies, plasters, and extracts.
  • examples include preparations, suppositories, suspensions, tinctures, ointments, poultices, nasal drops, inhalants, liniments, lotions, aerosols, and the like.
  • composition for suppressing muscle atrophy of the present disclosure can be prepared by a conventional method by combining the active ingredients described above and, if necessary, other ingredients.
  • muscle atrophy is suppressed by inhibiting the activity of CXCL10 with the CXCL10 expression inhibitor. be able to.
  • the TRPV2 activator causes the extracellular to intracellular migration via TRPV2.
  • Calcium uptake is promoted.
  • TRPV2-mediated calcium uptake into cells is suppressed, the expression of CXCL10 increases. muscle atrophy can be suppressed by promoting the uptake of CXCL10 and suppressing the expression of CXCL10.
  • muscles examples include voluntary muscles (skeletal muscles) and involuntary muscles (cardiac muscles, smooth muscles). Among them, voluntary muscles (skeletal muscles) are preferable.
  • muscle atrophy examples include disuse muscle atrophy, myogenic muscle atrophy, neurogenic muscle atrophy and the like. Among them, disuse muscle atrophy is preferred, and disuse muscle atrophy caused by immobility and/or immobility is more preferred.
  • immobility refers to, for example, a state in which the range of motion of a joint cannot be exercised, such as joint fixation. The inability to produce muscle movement.
  • the dosage of the composition for suppressing muscle atrophy of the present disclosure is not particularly limited, and is determined according to the age, body weight, sex, severity of symptoms, administration method, etc. of the subject to be administered.
  • compositions for suppressing muscle atrophy of the present disclosure include oral administration and parenteral (eg, intravenous, arterial, intramuscular, subcutaneous, peritoneal, rectal, transdermal, topical, etc.) administration.
  • parenteral eg, intravenous, arterial, intramuscular, subcutaneous, peritoneal, rectal, transdermal, topical, etc.
  • Mammals are preferred subjects for administering the composition for suppressing muscle atrophy of the present disclosure. Not only humans but also non-human mammals may be used.
  • Target humans include, for example, humans with or suspected of having muscle atrophy; humans with or suspected of having sarcopenia (age-related muscle weakness); myogenic muscle atrophy such as muscular dystrophy humans with or suspected of having; humans with neurogenic muscular atrophy such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or suspected of having them; humans with drug-induced muscular atrophy such as steroids, Humans with or suspected of having muscle atrophy due to endocrine diseases such as Cushing's syndrome; Humans with or suspected of having muscle atrophy due to cancer/wasting disease; People with chronic kidney disease Humans with or suspected of having muscle atrophy; humans with or suspected of having muscle atrophy due to chronic liver disease; humans with or suspected of having muscle atrophy due to chronic heart failure; Humans with muscle atrophy due to disease, humans with suspected muscle atrophy, and the like.
  • non-human mammals examples include mammals raised as pets, domestic animals, experimental animals, and the like. Such non-human mammals include, for example, dogs, cats, monkeys, cows, horses, sheep, goats, pigs, rabbits, mice, rats, camels, llamas, and the like.
  • composition for suppressing muscle atrophy of the present disclosure muscle atrophy can be suppressed. Therefore, the composition can be suitably used for treatment or prevention of diseases associated with muscle atrophy.
  • the composition may be referred to as "therapeutic or preventive composition of the present disclosure”.
  • the above description of the “muscular atrophy-suppressing composition of the present disclosure” can be used.
  • sarcopenia (age-related muscle weakness); myogenic muscular atrophy such as muscular dystrophy; neurogenic muscular atrophy such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS); muscle atrophy such as Cushing's syndrome endocrine disease with atrophy; cancer/wasting disease with muscle atrophy; chronic kidney disease with muscle atrophy; chronic liver disease with muscle atrophy; chronic heart failure with muscle atrophy; are exemplified.
  • myogenic muscular atrophy such as muscular dystrophy
  • neurogenic muscular atrophy such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS); muscle atrophy such as Cushing's syndrome endocrine disease with atrophy; cancer/wasting disease with muscle atrophy; chronic kidney disease with muscle atrophy; chronic liver disease with muscle atrophy; chronic heart failure with muscle atrophy; are exemplified.
  • the present disclosure also includes screening methods for active ingredients for suppressing muscle atrophy.
  • the method may be referred to as "the screening method of the present disclosure”.
  • the screening method of the present disclosure preferably uses a decrease in the expression level of the CXCL10 gene as an index.
  • the expression level of the CXCL10 gene can be measured, for example, by adding a test component to cells that express the CXCL10 gene and using the PCR method or the like.
  • the screening method of the present disclosure preferably includes the step of adding a test component to cells expressing the CXCL10 gene and measuring the expression level of the CXCL10 gene in the cells.
  • the screening method of the present disclosure includes the step of selecting a component that reduces the expression level of the CXCL10 gene when the test component is added as compared to when the test component is not added, as an active ingredient for suppressing muscle atrophy.
  • the screening method of the present disclosure compares a test component with a component that reduces the expression level of the CXCL10 gene (control), and selects a test component that has been confirmed to decrease the expression level of the CXCL10 gene to the same extent as the control. , selecting as an active ingredient for inhibiting muscle atrophy.
  • a CXCL10 expression inhibitor (more specifically, a CXCL10 neutralizing antibody) suppresses muscle weight loss such as the gastrocnemius muscle and soleus muscle, suppresses muscle fiber diameter decrease, suppresses inflammatory cell infiltration, etc. Since it is possible to suppress muscle atrophy, according to the screening method of the present disclosure, an active ingredient for suppressing muscle atrophy can be screened using a decrease in the expression level of the CXCL10 gene as an index.
  • CXCL10 mRNA expression was significantly increased in the group aged 60 and over compared to the group under 60 (*P ⁇ 0.05, Unpaired t test).
  • C2C12 mouse myoblasts were grown in growth medium (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin) in an incubator (37°C, 95% air, 5% CO 2 ). maintained with After the myoblasts reached 100% confluence, the culture medium was changed to a differentiation medium (DMEM, 2% horse serum, 1% penicillin-streptomycin) to induce differentiation. It was used for the experiment after differentiating into .
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • DMEM fetal bovine serum
  • penicillin-streptomycin penicillin-streptomycin
  • C2C12 myotube cells were infected with an adenovirus incorporating mouse KLF15 cDNA (MOI (multiplicity of infection, plaque-forming units per cell) 30), collected 48 hours later, and total RNA was extracted by the method described above.
  • MOI multiplicity of infection, plaque-forming units per cell
  • CXCL10 neutralizing antibody MAB466, R&D Systems
  • normal rat IgG 6-001-F, R&D Systems
  • the mouse soleus muscle collected in Fig. 2 was immersed in formalin, embedded in paraffin, cross-sectioned with the maximum diameter, and stained with HE. Results are shown in FIG.
  • the immobilized group (IM + IgG) showed a decrease in muscle fiber diameter and inflammatory cell infiltration
  • the CXCL10-neutralizing antibody-administered group (IM + Anti-CXCL10) showed immobilization. induced muscle fiber diameter reduction and inflammatory cell infiltration.
  • SKF-96365 50 ⁇ M
  • a broad-spectrum membrane Ca 2+ channel inhibitor was added to C2C12 myotube cells, and after 6 hours the cells were harvested and total RNA was extracted by the method described above.
  • the results of analysis by real-time quantitative PCR are shown in Figure 4-1.
  • Tranilast 75 ⁇ M
  • Tranilast a TRPV2 channel inhibitor
  • EGTA (0.1 mM), an extracellular Ca 2+ chelating agent, was added to C2C12 myotube cells, and after 3 hours the cells were harvested and total RNA was extracted by the method described above.
  • the results of analysis by real-time quantitative PCR are shown in Figure 5-1.
  • BAPTA-AM (10 ⁇ M), an intracellular Ca 2+ chelator, was added to C2C12 myotube cells, and after 6 hours the cells were harvested and total RNA was extracted by the method described above.
  • the results of real-time quantitative PCR analysis are shown in Figure 5-2.
  • the ryanodine receptor inhibitor Dantrolene (20 ⁇ M) was added to the C2C12 myotube cells, and after 6 hours the cells were collected and total RNA was extracted by the method described above. The results of analysis by real-time quantitative PCR are shown in Figure 5-3. In addition, the release of calcium from the sarcoplasmic reticulum into cells is suppressed by adding a ryanodine receptor inhibitor.
  • TRPV2 channel inhibitor significantly increased CXCL10 mRNA expression
  • administration of the TRPV2 channel activator LPC decreased CXCL10 mRNA expression

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Abstract

筋萎縮抑制用組成物が提供される。 具体的にはＣＸＣＬ１０発現抑制剤を有効成分とする、筋萎縮抑制剤が提供される。

Description

筋萎縮抑制用組成物
　本開示は、筋萎縮抑制用組成物及び筋萎縮を抑制するための有効成分のスクリーニング方法等に関する。
　筋萎縮には、筋肉自体の病気によるもの（筋原性筋萎縮）、運動神経の障害によるもの（神経原性筋萎縮）、長期間の寝たきり状態等活動性の低下によるもの（廃用性筋萎縮）等が知られており、特に、不動や不働、身体運動の低下は、筋量減少の重要な要因の１つであるとされている。また筋萎縮により、筋量が減少すると共に、筋力も低下してしまうことから、特に高齢者においては、不動や不働による廃用性筋萎縮は健康寿命の短縮に至る重要な病態であるが、その発症病理は十分に明らかではなく、治療薬の開発が望まれている（特許文献１）。
　その他、筋萎縮は、例えば、加齢、ステロイドなどの薬剤、内分泌疾患、癌・消耗性疾患、慢性腎臓病、慢性肝臓病、慢性心不全、うつ病などの精神疾患等、様々な要因により引き起こされることが知られており、健康上の大きな問題となっている。特に加齢に伴う筋萎縮であるサルコペニア（加齢性筋肉減弱症）は、高齢化社会における重要な医療の課題の１つである。
　またこれまでにＣＸＣＬ１０（Ｃ－Ｘ－Ｃ　ｍｏｔｉｆ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｌｉｇａｎｄ　１０）に対する抗体が、リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、原発性胆汁性胆管炎等の治療薬として検討されているが、筋萎縮に対しての作用については知られていない。
特開２０１９－０９４３０８号公報
　筋萎縮抑制用組成物を提供することを課題とする。また、筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防用組成物を提供することも課題の１つである。また、筋萎縮を抑制するための有効成分のスクリーニング方法を提供することも課題の１つである。
　本発明者らは、マウスの下肢をギプスで固定することにより、転写因子であるＫＬＦ１５（クリュッペル様因子１５）の遺伝子発現が有意に増加することを見出した。さらに本発明者らは、不動化性筋萎縮モデルマウスの骨格筋及び不動化性筋萎縮患者の骨格筋の網羅的遺伝子発現解析から、ケモカインであるＣＸＣＬ１０を同定し、不動化によりＣＸＣＬ１０の発現量が増加すること、ＫＬＦ１５欠損マウスでは、不動化によるＣＸＣＬ１０の発現量の増加が抑制されることを見出し、さらに改良を重ねた。
　また本発明者らは、細胞膜Ｃａ２＋チャネル阻害剤をマウスに投与することによっても、ＣＸＣＬ１０の発現量が増加することを見出し、さらに改良を重ねた。
　本開示は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
ＣＸＣＬ１０発現抑制剤を有効成分とする、筋萎縮抑制用組成物。
項２．
ＣＸＣＬ１０阻害剤を有効成分とする、項１に記載の筋萎縮抑制用組成物。
項３．
ＣＸＣＬ１０の中和抗体を有効成分とする、項１又は２に記載の筋萎縮抑制用組成物。
項４．
ＴＲＰＶ２の活性化剤を有効成分とする、筋萎縮抑制用組成物。
項５．
ＣＸＣＬ１０発現抑制剤を有効成分とする、筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防用組成物。
項６．
ＣＸＣＬ１０阻害剤を有効成分とする、項５に記載の筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防用組成物。
項７．
ＣＸＣＬ１０の中和抗体を有効成分とする、項５又は６に記載の筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防用組成物。
項８．
ＴＲＰＶ２の活性化剤を有効成分とする、筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防用組成物。
項９．
筋萎縮が骨格筋の筋萎縮である、項１～８のいずれかに記載の組成物。
項１０．
ＣＸＣＬ１０遺伝子の発現量の減少を指標とする、筋萎縮を抑制するための有効成分のスクリーニング方法。
　筋萎縮抑制用組成物が提供される。また、筋萎縮を抑制するための有効成分のスクリーニング方法が提供される。
野生型マウス又は骨格筋特異的ＫＬＦ１５欠損マウスの不動化によるＣＸＣＬ１０の発現量、ギプス固定によるＫＬＦ１５の発現量、及び腓腹筋重量の変化を示す。 ギプス固定を要した患者におけるＣＸＣＬ１０の発現量を示す。 対照群における年齢によるＣＸＣＬ１０の発現量の比較結果を示す。 ＫＬＦ１５過剰発現筋細胞におけるＣＸＣＬ１０の発現量を示す。 不動化による腓腹筋及びヒラメ筋の重量変化を示す。 ヒラメ筋染色写真を示す。 広域膜Ｃａ２＋チャネル阻害薬投与によるＣＸＣＬ１０の発現量の変化を示す。 ＴＲＰＶ２チャネル阻害薬投与によるＣＸＣＬ１０の発現量の変化を示す。 細胞外Ｃａ２＋キレート薬投与によるＣＸＣＬ１０の発現量の変化を示す。 細胞内Ｃａ２＋キレート薬投与によるＣＸＣＬ１０の発現量の変化を示す。 リアノジン受容体阻害薬投与によるＣＸＣＬ１０の発現量の変化を示す。 ＴＲＰＶ２チャネル阻害薬、及びＴＲＰＶ２チャネル活性化薬投与によるＣＸＣＬ１０の発現量の変化を示す。
　以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
　本開示に包含される筋萎縮抑制用組成物は、ＣＸＣＬ１０（Ｃ－Ｘ－Ｃ　ｍｏｔｉｆ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｌｉｇａｎｄ　１０）の発現抑制剤を含んでいてもよい。
　また、本開示に包含される筋萎縮抑制用組成物は、ＴＲＰＶ２（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｃａｔｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｖ　ｍｅｍｂｅｒ２）の活性化剤を含んでいてもよい。
　なお、これらの有効成分は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　本明細書において、これらの筋萎縮抑制用組成物を「本開示の筋萎縮抑制用組成物」と表記することがある。
　ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０とも称される）はＣＸＣＲ３受容体に結合してその生物学的効果を発揮するＣＸＣケモカインファミリーの１種であり、ＩＦＮ－γに応答して細胞から分泌されることが報告されている。ＣＸＣＬ１０は、例えば、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞等の走化性；抗腫瘍活性等の作用を有することが知られている。
　ＣＸＣＬ１０発現抑制剤としては、ＣＸＣＬ１０阻害剤等が例示される。ＣＸＣＬ１０阻害剤としては、ＣＸＣＬ１０の活性を阻害する限り、特に限定されない。
　ＣＸＣＬ１０の阻害剤としては、例えば、ＣＸＣＬ１０の中和抗体等が挙げられる。ＣＸＣＬ１０の中和抗体としては、ＣＸＣＬ１０に結合し、ＣＫＣＬ１０の活性を阻害する抗体である限り特に限定されない。
　ＣＫＣＬ１０の活性阻害は、例えば、ＣＸＣＬ１０によって誘導される走化性を阻害する能力を評価することにより確認される。
　ＣＸＣＬ１０の中和抗体は、市販品であってもよく、公知の方法で製造したものであってもよい。
　市販品としては、ＭＡＢ４６６（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）等が例示される。
　また、ＣＸＣＬ１０阻害剤（ＣＸＣＬ１０発現抑制剤）は、ＣＸＣＬ１０遺伝子の発現を抑制することにより、ＣＸＣＬ１０の活性を阻害することが可能な核酸分子であってもよい。そのような核酸分子としては、例えば、ＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチドを標的としたアンチセンス鎖、siRNA、miRNA、shRNA、又はこれらを含むベクター等が挙げられる。遺伝子発現は、当該技術分野において公知の方法により確認される。
　ＫＬＦ１５は、不動化等によって遺伝子発現が有意に増加する転写因子である。後述する実施例に示す通り、ＫＬＦ１５欠損マウスでは、ＣＸＣＬ１０の発現増加が抑制されることから、ＫＬＦ１５は、ＣＸＣＬ１０の発現を制御する因子であると推測される。このことから、ＣＸＣＬ１０阻害剤は、ＫＬＦ１５遺伝子の発現を抑制することにより、ＣＸＣＬ１０の活性を阻害することが可能な核酸分子であってもよい。そのような核酸分子としては、例えば、ＫＬＦ１５をコードするポリヌクレオチドを標的としたアンチセンス鎖、siRNA、miRNA、shRNA、又はこれらを含むベクター等が挙げられる。遺伝子発現は、当該技術分野において公知の方法により確認される。
　なお、本開示の筋萎縮抑制用組成物は、ＣＸＣＬ１０の受容体である、ＣＸＣＲ３のアンタゴニストを含むものであってもよい。
　ＴＲＰＶ２は、Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＴＲＰ）スーパーファミリーに属する、カルシウムイオン透過性の高い非選択性陽イオンチャンネルである。ＴＲＰＶ２は、例えば、摂氏５２度以上の熱刺激や細胞膜機械的伸展刺激により、活性化されることが知られている。
　ＴＲＰＶ２の活性化剤としては、ＴＲＰＶ２を活性化する限り特に限定されない。
　ＴＲＰＶ２の活性化は、例えば、ＴＲＰＶ２を介したカルシウムの取り込みを促進する能力を評価することにより確認される。
　ＴＲＰＶ２の活性化剤としては、例えば、プロベネシド、ジフェニルボリン酸２－アミノエチル、リゾホスファチジルコリン、ＩＧＦ－１（Insulin-like growth factor 1）、カンナビジオール等が挙げられる。
　ＴＲＰＶ２の活性化剤は、天然物であっても合成物であってもよく、天然物から精製したものや商業的に入手可能なものなど、特に限定されない。合成物である場合には、公知の方法等によって合成することができる。
　本開示の筋萎縮抑制用組成物中、ＣＸＣＬ１０発現抑制剤及び／又はＴＲＰＶ２の活性化剤の含有量は、特に限定されず、例えば０．０１～１００質量％の範囲で適宜設定することができる。例えば、０．０５～９９質量％であってもよい。
　本開示の筋萎縮抑制用組成物は、上述した有効成分を含み、さらに他の成分を含むことができる。当該他の成分としては、薬学的に許容される基剤、担体、添加剤（例えば溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、保存剤、コーティング剤、着色料、胃粘膜保護剤などのその他の薬剤等）等が例示される。これらの成分は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　本開示の筋萎縮抑制用組成物の形態は、特に限定されず、注射剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、トローチ剤、ゼリー剤、硬膏剤、エキス剤、坐剤、懸濁剤、チンキ剤、軟膏剤、パップ剤、点鼻剤、吸入剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤等が例示される。
　本開示の筋萎縮抑制用組成物は、上述した有効成分と、必要に応じて他の成分とを組み合わせて常法により調製することができる。
　限定的な解釈を望むものではないが、本開示のＣＸＣＬ１０発現抑制剤を含む筋萎縮抑制用組成物によれば、ＣＸＣＬ１０発現抑制剤により、ＣＸＣＬ１０の活性を阻害することにより、筋萎縮を抑制することができる。
　また、限定的な解釈を望むものではないが、本開示のＴＲＰＶ２の活性化剤を含む筋萎縮抑制用組成物によれば、ＴＲＰＶ２の活性化剤により、ＴＲＰＶ２を介して細胞外から細胞内へのカルシウムの取り込みが促進される。後述する実施例に示す通り、ＴＲＰＶ２を介した細胞内へのカルシウムの取り込みが抑制されると、ＣＸＣＬ１０の発現が増加することから、ＴＲＰＶ２の活性化剤により、ＴＲＰＶ２を介した細胞内へのカルシウムの取り込みを促進し、ＣＸＣＬ１０の発現を抑制することで、筋萎縮を抑制することができる。
　筋としては、随意筋（骨格筋）、不随意筋（心筋、平滑筋）が例示される。中でも、随意筋（骨格筋）であることが好ましい。
　筋萎縮としては、廃用性筋萎縮、筋原性筋萎縮、神経原性筋萎縮等が例示される。中でも、廃用性筋萎縮が好ましく、不動及び／又は不働により生じる廃用性筋萎縮がより好ましい。
　本明細書において、「不動」とは、例えば、関節の固定など、関節の可動域の運動が不可能な状態をいい、「不働」とは、例えば、神経の切断、筋の麻痺など、筋の動きを生じることができない状態をいう。
　本開示の筋萎縮抑制用組成物の投与量としては、特に限定されず、投与する対象の年齢、体重、性別、症状の程度、投与方法等により決定される。
　本開示の筋萎縮抑制用組成物の投与方法としては、例えば、経口投与、及び非経口（例えば静脈、動脈、筋肉、皮下、腹腔、直腸、経皮、局所など）投与等が挙げられる。
　本開示の筋萎縮抑制用組成物の投与対象としては、哺乳動物が好ましい。ヒトのみならず、非ヒト哺乳動物であってもよい。対象となるヒトとしては、例えば、筋萎縮を有するヒト、又はその疑いがあるヒト；サルコペニア（加齢性筋肉減弱症）を有するヒト、又はその疑いがあるヒト；筋ジストロフィー等の筋原性筋萎縮を有するヒト、又はその疑いがあるヒト；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経原性筋萎縮を有するヒト、又はその疑いがあるヒト；ステロイドなどの薬剤性筋萎縮を有するヒト、又はその疑いがあるヒト；クッシング症候群等の内分泌疾患による筋萎縮を有するヒト、又はその疑いがあるヒト；癌・消耗性疾患による筋萎縮を有するヒト、又はその疑いがあるヒト；慢性腎臓病による筋萎縮を有するヒト、又はその疑いがあるヒト；慢性肝臓病による筋萎縮を有するヒト、又はその疑いがあるヒト；慢性心不全による筋萎縮を有するヒト、又はその疑いがあるヒト；うつ病など精神疾患による筋萎縮を有するヒト、又はその疑いがあるヒト等などが挙げられる。
　また、非ヒト哺乳動物としては、例えばペット、家畜、実験動物等として飼育される哺乳動物などが例示される。このような非ヒト哺乳動物としては、例えば、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ、リャマ等が挙げられる。
　本開示の筋萎縮抑制用組成物によれば、筋萎縮を抑制することができる。このため、当該組成物は、筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防のために好適に用いることができる。本明細書において、当該組成物を「本開示の治療又は予防用組成物」と表記することがある。
　本開示の治療又は予防用組成物については、上述した「本開示の筋萎縮抑制用組成物」についての記載を援用することができる。
　筋萎縮を伴う疾患としては、サルコペニア（加齢性筋肉減弱症）；筋ジストロフィー等の筋原性筋萎縮；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経原性筋萎縮；クッシング症候群等の筋萎縮を伴う内分泌疾患；筋萎縮を伴う癌・消耗性疾患；筋萎縮を伴う慢性腎臓病；筋萎縮を伴う慢性肝臓病；筋萎縮を伴う慢性心不全；筋萎縮を伴ううつ病などの精神疾患等が例示される。
　本開示は、筋萎縮を抑制するための有効成分のスクリーニング方法をも包含する。本明細書において、当該方法を、「本開示のスクリーニング方法」と表記することがある。
　本開示のスクリーニング方法は、ＣＸＣＬ１０遺伝子の発現量の減少を指標とすることが好ましい。
　ＣＸＣＬ１０遺伝子の発現量は、例えば、ＣＸＣＬ１０遺伝子を発現する細胞に、被験成分を添加し、ＰＣＲ法などによって測定することができる。本開示のスクリーニング方法は、ＣＸＣＬ１０遺伝子を発現する細胞に、被験成分を添加し、当該細胞のＣＸＣＬ１０遺伝子の発現量を測定する工程を含むことが好ましい。
　本開示のスクリーニング方法は、被験成分を添加しない場合と比較して、被験成分を添加する場合に、ＣＸＣＬ１０遺伝子の発現量が減少した成分を、筋萎縮を抑制するための有効成分として選択する工程を含んでいてもよい。また、本開示のスクリーニング方法は、被験成分と、ＣＸＣＬ１０遺伝子の発現量を減少させる成分（対照）とを比較して、対照と同程度のＣＸＣＬ１０遺伝子の発現量の減少が確認された被験成分を、筋萎縮を抑制するための有効成分として選択する工程を含んでいてもよい。
　後述の実施例に示す通り、ＣＸＣＬ１０発現抑制剤（より具体的には、ＣＸＣＬ１０の中和抗体）により、腓腹筋やヒラメ筋などの筋重量低下抑制、筋線維径減少抑制、又は炎症細胞浸潤抑制等、筋萎縮の抑制が可能であるため、本開示のスクリーニング方法によれば、ＣＸＣＬ１０遺伝子の発現量の減少を指標として、筋萎縮を抑制するための有効成分のスクリーニングすることができる。
　なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
　また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
　本開示の内容を以下の実施例を用いて具体的に説明する。しかし、本開示はこれらに何ら限定されるものではない。下記において、特に言及する場合を除いて、実験は大気圧及び常温条件下で行っている。また特に言及する場合を除いて、「％」は「質量％」を意味する。
　全身麻酔下にマウス（雄、10週齢）の両下肢をプラスチック製ギプスで固定することにより、不動化モデルマウスを作成した。3日間の不動化処理の後にマウスを屠殺し、骨格筋を採取して速やかに液体窒素で凍結した。全RNAをRNeasy Miniキット（Qiagen社製）を用いて抽出し、Real-Time PCR system（Applied Biosystems社製）を用いてリアルアルタイム定量PCR法を行い、筋組織におけるmRNA発現を解析した。各サンプルのCXCL10、KLF15の発現量は、内在性コントロールである36B4の発現量で補正した。結果を、図１－１に示す。
　野生型マウス（WT）の腓腹筋では、不動化（IM）によってCXCL10のmRNA発現が対照（Control）と比較して約4倍に増加した（［図１－１］（Ａ））。一方、不動化によってKLF15のmRNA発現が有意に増加することが確認され（（［図１－１］（Ｂ））、骨格筋特異的KLF15欠損マウス（M-KLF15KO、KLF15-floxマウスとMLC1f-Creマウスとの交配により作成）では、不動化によるCXCL10のmRNA発現増加が顕著に抑制された（n = 6, *P < 0.05, NS; not significant, 2-way ANOVA with Bonferroni post-hoc test）（［図１－１］（Ａ））。なお、野生型マウス及び骨格筋特異的KLF15欠損マウスについて、ギプス固定後の腓腹筋重量を測定したところ、野生型マウスでは、ギプス固定により、腓腹筋重量が有意に減少したのに対して、骨格筋特異的KLF15欠損マウスでは、ギプス固定を行っても、腓腹筋重量の減少は確認されなかった（（［図１－１］（Ｃ））。
　神戸大学医学部附属病院整形外科との共同研究（神戸大学大学院医学研究科等 医学倫理委員会、承認日：2018年6月14日、承認番号：180059）により、骨折等でギプス固定を要した患者（IM、21例、固定日数：6.5 ± 3.6日）に対して全身麻酔下で修復術を行う際に骨格筋生検を行った。また、修復術から半年以上経過後の抜釘術時にも骨格筋生検を行い、対照（Control、22例）の筋試料を得た。ヒト骨格筋組織から前述の方法で全RNAを抽出し、リアルアルタイム定量PCR法でCXCL10のmRNA発現を解析した。結果を、図１－２に示す。
　不動化群では対照群と比較して、CXCL10のmRNA発現が2倍以上に増加した（*P < 0.05, Unpaired t test）。
　対照群のヒト骨格筋生検試料を年齢で層別化し（60歳未満：13例、48.2 ± 10.4歳、60歳以上：9例、72.7 ± 7.7歳）、解析した。結果を、図１－３に示す。
　60歳以上の群では未満の群と比較して、CXCL10のmRNA発現が有意に増加した（*P < 0.05, Unpaired t test）。
　C2C12マウス筋芽細胞をgrowth medium（Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)、10% heat-inactivated fetal bovine serum、1% ペニシリン-ストレプトマイシン）を用いてインキュベーター（37℃、95% air、5% CO2）内で維持した。筋芽細胞が100%コンフルエントに達した後に、培養液をdifferentiation medium（DMEM、2% horse serum、1% ペニシリン-ストレプトマイシン）に変換して分化誘導し、4日以上経過して筋管細胞に完全に分化した後に実験に使用した。マウスKLF15 cDNAを組み込んだアデノウイルスをC2C12筋管細胞に感染（MOI (multiplicity of infection, plaque-forming units per cell) 30）させて、48時間後に回収し、前述の方法で全RNAを抽出した。リアルアルタイム定量PCR法で解析した結果を、図１－４に示す。
　KLF15の過剰発現（Ad-KLF15）によってCXCL10のmRNA発現が有意に増加した（n = 6, *P < 0.05, Unpaired t test）。
　CXCL10中和抗体（MAB466、R&D Systems）またはNormal rat IgG（6-001-F、R&D Systems）をギプス固定の3日前に、マウスへ腹腔内投与（0.1mg/匹）し、10日間の不動化処理を行った後に屠殺し、体重および骨格筋重量を測定した。結果を、図２に示す。
　対照群（Control）と比較して不動化群（IM + IgG）では、腓腹筋やヒラメ筋の体重当たりの重量が低下する一方で、CXCL10中和抗体投与群（IM + Anti-CXCL10）では不動化による筋重量低下が有意に抑制された（n = 10, *P < 0.05, 2-way ANOVA with Bonferroni post-hoc test）。
　図2において採取したマウスヒラメ筋をホルマリン浸漬し、パラフィン包埋、最大径となる横断面で切片を作成し、HE染色した。結果を、図３に示す。
　対照群（Control）と比較して不動化群（IM + IgG）では、筋線維径の減少および炎症細胞の浸潤を認める一方で、CXCL10中和抗体投与群（IM + Anti-CXCL10）では不動化による筋線維径減少や炎症細胞浸潤が抑制された。
　C2C12筋管細胞に広域膜Ca2+チャネル阻害薬であるSKF-96365（50μM）を添加し、6時間後に細胞を回収して前述の方法で全RNAを抽出した。リアルアルタイム定量PCR法で解析した結果を、図４－１に示す。
　広域膜Ca2+チャネル阻害薬の投与によってCXCL10のmRNA発現が有意に増加した（n = 6, *P < 0.05, Unpaired t test）。
　C2C12筋管細胞にTRPV2チャネル阻害薬であるTranilast（75μM）を添加し、6時間後に細胞を回収して前述の方法で全RNAを抽出した。リアルアルタイム定量PCR法で解析した結果を、図４－２に示す。
　TRPV2チャネル阻害薬の投与によってCXCL10のmRNA発現が有意に増加した（n = 6, *P < 0.05, Unpaired t test）。
　C2C12筋管細胞に細胞外Ca2+キレート薬であるEGTA（0.1mM）を添加し、3時間後に細胞を回収して前述の方法で全RNAを抽出した。リアルアルタイム定量PCR法で解析した結果を、図５－１に示す。
　細胞外Ca2+キレート薬の投与によってCXCL10のmRNA発現が有意に増加した（n = 8, *P < 0.05, Unpaired t test）。つまり、細胞外Ca2+キレート剤によって細胞外のCa2+濃度が低下するために、細胞外から細胞内へ流入するCa2+が減少し、細胞内のCa2+濃度が低下することによって、CXCL10のmRNA発現が有意に増加することが示唆された。
　C2C12筋管細胞に細胞内Ca2+キレート薬であるBAPTA-AM（10μM）を添加し、6時間後に細胞を回収して前述の方法で全RNAを抽出した。リアルアルタイム定量PCR法で解析した結果を、図５－２に示す。
　細胞内Ca2+キレート薬の投与によってCXCL10のmRNA発現は変化しなかった（n = 6, NS; not significant, Unpaired t test）。
　C2C12筋管細胞にリアノジン受容体阻害薬であるDantrolene（20μM）を添加し、6時間後に細胞を回収して前述の方法で全RNAを抽出した。リアルアルタイム定量PCR法で解析した結果を、図５－３に示す。なお、リアノジン受容体阻害薬を添加することにより、筋小胞体から細胞内へのカルシウムの放出が抑制される。
　リアノジン受容体阻害薬の投与によってCXCL10のmRNA発現は変化しなかった（n = 9, NS; not significant, Unpaired t test）。つまり筋小胞体から細胞内へのカルシウムの放出を抑制しても、CXCL10のmRNA発現量には影響を及ぼさなかったことから、CXCL10のmRNAの増加は、ＴＲＰＶ２（細胞膜Caチャネル）を介した細胞外から細胞内へのカルシウム流入阻害に起因することが示唆された。
　C2C12筋管細胞にTRPV2チャネル活性化薬であるLPC（30μM）、TRPV2チャネル阻害薬であるTranilast（75μM）を添加し、6時間後に細胞を回収して前述の方法で全RNAを抽出した。リアルアルタイム定量PCR法で解析した結果を、図６に示す（n = 6）。
　TRPV2チャネル阻害薬の投与によってCXCL10のmRNA発現が有意に増加したのに対して、TRPV2チャネル活性化薬であるLPCの投与によってCXCL10のmRNA発現が減少することが確認された。

Claims (10)

  1. ＣＸＣＬ１０発現抑制剤を有効成分とする、筋萎縮抑制用組成物。
  2. ＣＸＣＬ１０阻害剤を有効成分とする、請求項１に記載の筋萎縮抑制用組成物。
  3. ＣＸＣＬ１０の中和抗体を有効成分とする、請求項１又は２に記載の筋萎縮抑制用組成物。
  4. ＴＲＰＶ２の活性化剤を有効成分とする、筋萎縮抑制用組成物。
  5. ＣＸＣＬ１０発現抑制剤を有効成分とする、筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防用組成物。
  6. ＣＸＣＬ１０阻害剤を有効成分とする請求項５に記載の筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防用組成物。
  7. ＣＸＣＬ１０の中和抗体を有効成分とする、請求項５又は６に記載の筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防用組成物。
  8. ＴＲＰＶ２の活性化剤を有効成分とする、筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防用組成物。
  9. 筋萎縮が骨格筋の筋萎縮である、請求項１～８のいずれかに記載の組成物。
  10. ＣＸＣＬ１０遺伝子の発現量の減少を指標とする、筋萎縮を抑制するための有効成分のスクリーニング方法。
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