WO2022217705A1 - 一种改造的酸性磷酸酶及其应用 - Google Patents

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    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03002—Acid phosphatase (3.1.3.2)

Definitions

  • the invention relates to a modified acid phosphatase and its application, and belongs to the technical field of biological engineering.
  • vitamin C phosphate As a vitamin C derivative, vitamin C phosphate has the chemical formula C 6 H 6 O 9 P. It is a phosphate group bridged at the 2-position by the carbon skeleton of vitamin C.
  • the present invention provides an acid phosphatase mutant, using the acid phosphatase derived from Pseudomonas aeruginosa as the parent enzyme, the amino acid sequence of the acid phosphatase is shown in SEQ ID NO: 1, and the 57th and 58th positions of the parent enzyme are At least one of position 94 and position 135 is mutated.
  • the mutant is any one of (a)-(f):
  • the present invention provides genes encoding the mutants.
  • the present invention provides a microbial cell expressing the mutant, or carrying the recombinant plasmid.
  • the invention provides a method for synthesizing vitamin C phosphate, which utilizes the microbial cells to use vitamin C as a substrate to transform and produce vitamin C phosphate.
  • the microbial cells of claim 5 are added to a reaction system containing vitamin C and sodium pyrophosphate, and the pH in the reaction system is 3.8-4.3.
  • the pH in the reaction system is 4.0-4.2.
  • the concentration of the microbial cells in the reaction system is 30 g/L
  • the concentration of vitamin C is 88 g/L
  • the concentration of sodium pyrophosphate is 223 g/L.
  • Figure 5 is a graph showing the relationship between transformation temperature and vitamin C phosphate production.
  • Chromatographic column APS-2 HYPERSIL column (150mm ⁇ 4.6mm, 5 ⁇ m), the column temperature is 35°C.
  • UV absorption wavelength is 254nm.
  • the cells containing the target plasmids were sonicated with a sonicator with a power of 36%, working for 2 s, and intermittently for 3 s, until the fragmentation was complete, and the whole cell fragmentation solution was obtained; the cell fragmentation solution was set in a refrigerated centrifuge. Centrifuge at 12,000 rpm for 30 min.
  • the obtained recombinant bacteria containing PaAPase Mu3 (Q57H/W58P/D135R) were inserted into LB medium, and the activation solution was obtained after culturing for 12 hours.
  • the activation solution was inoculated into fresh TB medium, and after culturing for 2 hours, the final concentration was 0.2mM.
  • the IP TG was cultured at 25°C for 14 hours to induce the expression of the recombinant target protein, and the enzyme solution was collected, and the enzyme solution was sonicated for protein gel verification (Figure 1).
  • M is the marker
  • 1 is the crude enzyme solution.
  • 2 is the purified target protein band (29KDa); the other mutants were also expressed and purified by the same method.
  • the pH stability of PaAPase was detected in the range of pH 2.5-8.0. It can be seen from Figure 2 that when the pH was between 3.0 and 8.0, the enzyme activity loss of PaAPase stored at 4°C for 12h was small, and the residual enzyme activity was all above 90%. However, when the pH was lower than 2.5, the residual enzyme activity of PaAPase was only 60% of the initial enzyme activity. The above results show that PaAPase has good pH stability at pH 3.0-8.0, and the enzyme activity loss is greater under strong acidic conditions.
  • PaAPase The temperature stability of PaAPase was tested in the range of 0-55 °C. The results are shown in Figure 3. PaAPase is relatively stable in an environment below 20 °C, and PaAPase can retain more than 90% of its initial activity. When the temperature is 20-55 °C In between, the loss of enzymatic activity gradually increased, and the enzymatic activity lost nearly 50% at 50 °C for 1 h. The above results show that the increase of temperature helps the catalysis of protease molecules, but with the increase of temperature, the tendency of protein denaturation and inactivation becomes more and more obvious.
  • Example 3 Whole cell production of vitamin C phosphate by recombinant bacteria PaAPase Mu3
  • the strains stored in the glycerol tube were spread on LB solid medium, and incubated at a constant temperature of 37°C until a single clone was grown. Pick a single clone into a fresh LB liquid medium, and cultured at a constant temperature of 200rpm and 37°C. After 12 h, the activation solution was obtained, and the activation solution was inoculated into fresh TB medium. After culturing for 2 h, IPTG with a final concentration of 0.2 mM was added, and the culture was induced at 25 °C for 14 h, and the cells were collected after the end.
  • the yield of vitamin C phosphate was determined according to the assay method described above. The results are shown in Table 4 and Figure 4.
  • the conversion rate of PaAPase mu3 enzyme increases with the increase of pH within pH 3.0-4.0, and the production of vitamin C phosphate between pH 3.8-4.3 can reach 85g/L and above. , it could reach 90.1 g/L at pH 4.0 with a molar yield of 75.1%, and then decreased with further increase of pH.
  • the yield of vitamin C phosphate converted by PaAPase mu3 under different temperature conditions (20, 25, 30, 37° C.) for 14 h was measured every 2 hours, and the molar yield was calculated. Rate.
  • the results are shown in Figure 5.
  • the PaAPase mu3 enzyme can have a higher output of vitamin C phosphate at 25-30 °C, and the conversion rate is the highest at 25 °C.
  • the output of vitamin C phosphate is 90.1 g/L, and the molar yield is The yield was 75.1%, the yield of vitamin C phosphate at 30°C was 84 g/L, and the molar yield was 70%. Therefore, the conversion temperature of 25-30 °C is more favorable for PaAPase mu3 enzyme to catalyze the phosphorylation reaction.

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Abstract

提供了一种改造的酸性磷酸酶及其应用。该突变改造的酸性磷酸酶PaAPase mu3，通过在大肠杆菌中表达所述改造的酸性磷酸酶PaAPase mu3，利用全细胞转化法，将维生素C转化为维生素C磷酸酯。并从反应的pH、温度方面对改造的酸性磷酸酶PaAPase mu3的催化体系进行优化，可使得维生素C磷酸酯产量达到90.1g/L，摩尔产率达75.1％。

Description

一种改造的酸性磷酸酶及其应用 技术领域
本发明涉及一种改造的酸性磷酸酶及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
维生素C磷酸酯作为一个维生素C的衍生物，其化学式为C 6H 6O 9P。它是由维生素C的碳骨架在2位桥连一个磷酸基。
目前，维生素C磷酸酯的主要生产方法为化学合成法，主要为基团保护法合成，但是这种方法虽然得率高，能耗却较大，同时会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。通过生物法制备维生素C磷酸酯具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种有效的生物法高效制备维生素C磷酸酯。
目前，微生物法生产维生素C磷酸酯涉及到一个关键的酶酸性磷酸酶，它具有广泛的底物谱，可以催化维生素C，使其C2位磷酸化，形成维生素C磷酸酯。而微生物法制备维生素C磷酸酯主要为酶转化法。目前，由于酶转化法具备环境友好、反应条件温和及操作简便等优点而更具备工业应用价值。但是，天然筛选的酸性磷酸酶本身存在水解能力，会水解产物，导致维生素C磷酸酯的产率低下，限制了酶转化法大规模生产制备，提高酶酸性磷酸酶的磷酸化能力，减弱水解能力是目前研究的重点问题。
发明内容
在目前的研究中，酸性磷酸酶都会对产物进行水解，导致产量低。因而，为实现磷酸化反应，酶改造的酸性磷酸酶往往需要对特定的关键残基进行突变改造的，以期来提高酶的实用性能。
本发明提供了一种酸性磷酸酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明提供了酸性磷酸酶突变体，以来源于Pseudomonas aeruginosa的酸性磷酸酶为亲本酶，所述酸性磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，将亲本酶的第57位、第58位、第94位和第135位中的至少一个位点突变。
在一种实施方式中，所述突变体为(a)-(f)所示任一：
(a)第58位突变为F；
(b)第94位突变为F；
(c)第135位突变为R；
(d)第94位突变为F、第135位突变为R；
(e)第58位突变为P、第135位突变为R；
(f)第57位突变为H、第58位突变为P、第135位突变为R。
本发明提供了编码所述突变体的基因。
本发明提供了携带所述基因的重组质粒。
本发明提供了表达所述突变体，或携带所述重组质粒的微生物细胞。
本发明提供了一种合成维生素C磷酸酯的方法，利用所述微生物细胞以维生素C为底物，转化生产维生素C磷酸酯。
在一种实施方式中，将权利要求5所述微生物细胞加入含有维生素C和焦磷酸钠的反应体系，反应体系中的pH为3.8-4.3。
在一种实施方式中，反应体系中的pH为4.0-4.2。
在一种实施方式中，在25-37℃下反应不少于8小时。
在一种实施方式中，在25-30℃下反应不少于10小时。
在一种实施方式中，所述微生物细胞在反应体系中的浓度为20-40g/L，维生素C的浓度为70-100g/L，焦磷酸钠的浓度为180-240g/L。
在一种实施方式中，所述微生物细胞在反应体系中的浓度为30g/L，维生素C的浓度为88g/L，焦磷酸钠的浓度为223g/L。
在一种实施方式中，所述微生物细胞在反应体系中的浓度为25-35g/L，维生素C的浓度为70-90g/L，焦磷酸钠的浓度为200-240g/L。
本发明提供了所述突变体，或所述微生物细胞在制备维生素C磷酸酯、含有维生素C磷酸酯的产品和维生素C磷酸酯衍生物中的应用。
本发明提供了所述微生物细胞在制备维生素C磷酸酯、含有维生素C磷酸酯的产品和维生素C磷酸酯衍生物中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种改造的酸性磷酸酶PaAPase mu3，用于催化生产维生素C磷酸酯。该改造的酸性磷酸酶不仅大大提高了改造的酸性磷酸酶的催化效率，同时对产物水解能力很低，有效降低了生产成本。本发明提供的改造的酸性磷酸酶以维生素C为底物时维生素C磷酸酯的产量可达90.1g/L，摩尔产率可达75.1％，加快了酶转化法生产维生素C磷酸酯的工业化进程。
附图说明
图1为改造的酸性磷酸酶PaAPase mu3的SDS-PAGE图。
图2为改造的酸性磷酸酶在不同pH下的酶活图。
图3为改造的酸性磷酸酶在不同温度下的酶活图。
图4为转化体系缓冲液pH和维生素C磷酸酯生产量的关系图。
图5为转化温度和维生素C磷酸酯生产量的关系图。
具体实施方式
(1)液相色谱分析方法：
样品分析采用液相色谱仪Waters ACQUITY UPLCTM；
流动相成分：用超纯水配制1L 0.1mo1·L -1KH 2PO 4溶液，再加入500mL乙腈混合在一起，用磷酸调混合溶液pH至3.0；流动相通过0.22μm的有机滤膜真空抽滤后，超声脱气20min。
进样程序：每8分钟进一个样品，每个样品的取样量为12μL。
洗脱程序：流动相流速恒定为1mL·min -1。
色谱柱：APS-2 HYPERSIL column(150mm×4.6mm，5μm)，柱温为35℃。
检测器：紫外吸收波长为254nm。
(2)蛋白纯化
用超声破碎仪对含有目的质粒的细胞进行超声处理，功率为36％，工作2s，间歇3s，直至破碎完全，得到全细胞破碎液；将细胞破碎液在冷冻离心机中设置离心温度4℃，转速12000rpm离心30min，离心后将上清液通过0.22μm水系滤膜过滤后收集滤液；将滤液利用AKTAxpress系统的纯化仪纯化，纯化柱使用5mL规格的HisTrap HP纯化柱；洗脱时用含1M咪唑的缓冲液(20mMTris-HCl，150mMNaCl)，以2-3mL·min -1的流速进行洗脱；然后，用10％(w/v)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证纯化的组分，并将最纯的组分用PD-10脱盐柱进行脱盐，脱盐时使用低盐缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl；pH 6.0)，收集得到纯化脱盐的蛋白。
表1突变过程中使用的引物
Figure PCTCN2021096674-appb-000001
Figure PCTCN2021096674-appb-000002
实施例1：PaAPase酶突变体的构建和筛选
以氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的PaAPase酶为亲本(其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，对其第56位、58位、135位、194位进行饱和突变(引物如表1所示)，筛选有益突变体：
将PCR获得的片段与pET-28a(+)载体连接(BamH I和Hind Ⅲ酶)，利用表1中相应的引物进行全质粒PCR，获得含有突变体的重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌，构建得到重组菌，将重组菌涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，37℃培养至长出单克隆。
将无菌的96孔深孔板(一级板)在超净台中打开，用排枪在每一个孔中加入400μL LB培养基(含0.1g·L -1的卡那霉素)，再用牙签挑取平板上饱和突变的大肠杆菌转化子接种到96孔深孔板中，其中第十二列的板孔中加入起始菌株作为对照，37℃，600rpm在高通量摇床中过夜培养。用排枪取50μL的一级板中的种子液接种至每孔含有800μL乳糖自诱导培养基(含0.1g·L -1的卡那霉素)的96孔深孔板(二级板)中37℃，600rpm培养3～4h(OD 600约为1)，将高通量摇床的温度调整为25℃，诱导12h。然后在3000×g下离心5min，倒掉96孔深孔板(二级板)中的上清液，收集细胞并保存在-80℃备用。将-80℃冷冻的含有突变体细胞的96孔深孔板取出，在室温下放置30min解冻，然后用排枪在每孔中加入底物溶液(4g·L -1L-抗坏血酸，30g·L -1焦磷酸，pH 4.0)200μL，用排枪反复吹吸使细胞悬浮于底物溶液中，然后将细胞悬浮液置于25℃保温16h。3000×g下离心20min分离沉淀，将深孔板中的上清取出，稀释5倍数后使用HPLC进行测定，并计算摩尔转化率。
根据HPLC结果并测序，筛选出3个有益突变体：W58F、V94F和D135R，摩尔转化率分别为37.6％、41.3％、45.3％。
在得到了3个有益突变体的基础上，按照上述步骤，将W58F、V94F和D135R进行组合突变(在单突突变体的基础上利用相应的引物进行突变，构建得到双突突变体)，并按照步骤2，测定转化效率。
结果显示组合突变体W58F/D135R，W58F/V94F和V94F/D135R转化率分别为19.7％、17.9％、40.9％，转化率均不如D135R。因此，选择以PaAPase Mu1(D135R)为模板，对Trp58和Val94进行位点饱和突变。
结果显示，在双突变体中，PaAPase Mu2(W58P/D135R)转化率增加了1.56倍。以PaAPase Mu2(W58P/D135R)为模板，将Gln57突变为阳性氨基酸(Lys、Arg和His)，其中PaAPase Mu3(Q57H/W58P/D135R)，比野生型的转化率提高了1.9倍。
表2突变体转化效果
Figure PCTCN2021096674-appb-000003
实施例2：突变体的酶学性质
将获得的含有PaAPase Mu3(Q57H/W58P/D135R)的重组菌接入LB培养基，培养12h后得到活化液，将活化液接种至新鲜的TB培养基，培养2h后，加入终浓度为0.2mM的IP TG，25℃培养14h，诱导表达重组目的蛋白，并收集酶液，并将酶液超声破碎，进行蛋白胶验证(图1)，图1中M为marker，1为粗酶液条带，2为纯化目标蛋白条带(29KDa)；其余的突变体也采用的相同的方法进行表达和纯化。
(1)比酶活测定
采用高效液相色谱法测定PaAPase及其突变体的活性。底物溶液(500mM L-抗坏血酸和500mM焦磷酸钠)500μL(pH 5.0)，酶液5μL，30℃反应30min，加95μL 42％磷酸终止反应；活性单位的定义是在1分钟内产生1μmol维生素C磷酸酯所需的酶量(表3)。
(2)动力学参数测定
在30℃下，通过测量不同浓度维生素C和维生素C磷酸酯(1-1000mM)的初始产物生成速率其余条件与比酶活测定一致，计算了动力学参数，包括Vmax、Km和kcat。所有的活性测定重复三次(表3)。
表3各突变体的比酶活和动力学参数
Figure PCTCN2021096674-appb-000004
Figure PCTCN2021096674-appb-000005
(3)pH对PaAPase mu3活性的影响
在pH 2.5-8.0范围内检测PaAPase的pH稳定性，由图2可知，PaAPase在pH在3.0-8.0时4℃保存12h的酶活损失较小，残余酶活都在90％以上。但是，当pH低于2.5时，PaAPase的残余酶活仅为初始酶活的60％。上述结果表明PaAPase在pH 3.0-8.0具有很好的pH稳定性，在强酸性条件下，酶活损失较大。
(4)温度对PaAPase mu3活性的影响
在0-55℃的范围内检测PaAPase的温度稳定性，结果如图3表示，PaAPase在低于20℃的环境中较稳定，PaAPase可保留初始活性的90％以上，当温度处于20-55℃之间，酶活的损失逐渐增加，在50℃条件下放置1h，酶活损失将近50％。上述结果表明，温度升高有助于蛋白酶分子进行催化作用，但随着温度的升高，蛋白质变性失活的趋势也越来越明显，当温度超过50℃时，酶活开始急剧下降，主要原因是此时大量蛋白变性失活，而在25-50℃时，温度升高对反应体系中酶催化活性的提高要超出由于蛋白变性而失去的活性，所以酶活总体上呈上升趋势。
实施例3：重组菌PaAPase Mu3全细胞生产维生素C磷酸酯
(1)全细胞最适反应pH
将从甘油管中保存的菌株涂布于LB固体培养基上，在37℃下恒温培养至长出单克隆，挑取单克隆至新鲜的LB液体培养基中，以200rpm、37℃下恒温培养12h后得到活化液，将活化液接种至新鲜的TB培养基，培养2h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，于25℃下诱导培养14h，结束后收集细胞。
在100mL锥形瓶中分别加入3g诱导培养后表达PaAPase mu3蛋白的全细胞分别于pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5和pH5.0的反应体系，反应体系中有88g/L维生素C、223g/L焦磷酸钠、盐酸调节pH，25℃反应12h后，过0.22μm水膜，进行液相色谱分析。
按照上述检测方法测定维生素C磷酸酯的产量。结果如表4和图4所示，PaAPase mu3酶在pH3.0-4.0内转化率随着pH的上升而增长，在pH3.8-4.3之间维生素C磷酸酯产量可达到85g/L及以上，在pH4.0时可达到90.1g/L，摩尔产率为75.1％，随后随pH的进一步升高而下降。
表4不同pH下维生素C磷酸酯产量
Figure PCTCN2021096674-appb-000006
Figure PCTCN2021096674-appb-000007
(2)全细胞最适反应温度
按照(1)中的步骤，在反应体系pH为4的条件下每2小时测定PaAPase mu3在不同温度条件下(20、25、30、37℃)转化14h的维生素C磷酸酯产量，计算摩尔产率。结果如图5所示，PaAPase mu3酶在25-30℃时均能有较高的维生素C磷酸酯的产量，在25℃时转化率最高，维生素C磷酸酯产量为90.1g/L，摩尔产率为75.1％，在30℃维生素C磷酸酯产量为84g/L，摩尔产率为70％。因而，在25-30℃的转化温度对PaAPase mu3酶催化磷酸化反应更有利。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (13)

  1. 一种酸性磷酸酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
  2. 酸性磷酸酶突变体，其特征在于，以来源于Pseudomonas aeruginosa的酸性磷酸酶为亲本酶，所述酸性磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，将亲本酶的第57位、第58位、第94位和第135位中的至少一个位点突变。
  3. 根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体为(a)-(f)所示任一：
    (a)第58位突变为苯丙氨酸；
    (b)第94位突变为苯丙氨酸；
    (c)第135位突变为精氨酸；
    (d)第94位突变为苯丙氨酸、第135位突变为精氨酸；
    (e)第58位突变为脯氨酸、第135位突变为精氨酸；
    (f)第57位突变为组氨酸、第58位突变为脯氨酸、第135位突变为精氨酸。
  4. 编码权利要求1～3任一项所述突变体的基因。
  5. 携带权利要求4所述基因的重组质粒。
  6. 表达权利要求1或2所述突变体，或携带权利要求4所述重组质粒的微生物细胞。
  7. 一种合成维生素C磷酸酯的方法，其特征在于，利用权利要求6所述微生物细胞以维生素C为底物，转化生产维生素C磷酸酯。
  8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将权利要求5所述微生物细胞加入含有维生素C和焦磷酸钠的反应体系，反应体系中的pH为3.8-4.3。
  9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在25-37℃下反应不少于8小时。
  10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述微生物细胞在反应体系中的浓度为20-40g/L，维生素C的浓度为70-100g/L，焦磷酸钠的浓度为180-240g/L。
  11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述微生物细胞在反应体系中的浓度为30g/L，维生素C的浓度为88g/L，焦磷酸钠的浓度为223g/L。
  12. 权利要求1～3任一项所述突变体在制备维生素C磷酸酯、含有维生素C磷酸酯的产品和维生素C磷酸酯衍生物中的应用。
  13. 权利要求6所述微生物细胞在制备维生素C磷酸酯、含有维生素C磷酸酯的产品和维生素C磷酸酯衍生物中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116009609A (zh) * 2023-03-28 2023-04-25 广东省农业科学院动物科学研究所 一种单宁提取过程中的环境控制方法及系统

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4147026A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 Waters Technologies Corporation Methods for heat-assisted enzyme digestion
US12411064B2 (en) 2020-05-08 2025-09-09 Waters Technologies Corporation Methods for heat-assisted enzyme digestion
CN113088504B (zh) * 2021-04-12 2022-10-11 江南大学 一种改造的酸性磷酸酶及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282081A (zh) * 2016-08-31 2017-01-04 江南大学 一种高产维生素c‑2‑磷酸酯的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0937785A (ja) * 1995-05-25 1997-02-10 Ajinomoto Co Inc ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法
CN113088504B (zh) * 2021-04-12 2022-10-11 江南大学 一种改造的酸性磷酸酶及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282081A (zh) * 2016-08-31 2017-01-04 江南大学 一种高产维生素c‑2‑磷酸酯的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE PROTEIN 10 October 2019 (2019-10-10), ANONYMOUS : "Sequence 2 from patent US 10308919", XP055977207, retrieved from NCBI Database accession no. QFN31972.1 *
DOMENECH, C. E. ET AL.: "Pseudomonas Aeruginosa Acid Phosphatase Activation by Divalent Cations and Inhibition by Aluminium Ion", FEBS LETTERS, vol. 299, no. 1, 2 March 1992 (1992-03-02), XP055858859, DOI: 10.1016/0014-5793(92)80108-S *
PRAMANIK KRISHNENDU, GHOSH PALLAB KUMAR, RAY SOUMYAJIT, SARKAR ANUMITA, MITRA SOUMIK, MAITI TUSHAR KANTI: "An in silico structural, functional and phylogenetic analysis with three dimensional protein modeling of alkaline phosphatase enzyme of Pseudomonas aeruginosa", JOURNAL OF GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY, vol. 15, no. 2, 1 December 2017 (2017-12-01), pages 527 - 537, XP055977209, ISSN: 1687-157X, DOI: 10.1016/j.jgeb.2017.05.003 *
ZHENG KAI, SONG WEI, SUN ANRAN, CHEN XIULAI, LIU JIA, LUO QIULING, WU JING: "Enzymatic Production of Ascorbic Acid-2-phosphate by Recombinant Acid Phosphatase", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 65, no. 20, 24 May 2017 (2017-05-24), US , pages 4161 - 4166, XP055977212, ISSN: 0021-8561, DOI: 10.1021/acs.jafc.7b00612 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116009609A (zh) * 2023-03-28 2023-04-25 广东省农业科学院动物科学研究所 一种单宁提取过程中的环境控制方法及系统

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