WO2022210522A1 - オイル抽出成分の製造方法、美白剤、色素沈着症改善剤、美白用経口組成物及び色素沈着症改善用経口組成物 - Google Patents

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    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin

Definitions

  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for producing an oil-extracted component that can easily and efficiently extract components useful for skin whitening, and a skin whitening agent and pigmentation ameliorator using the useful components. , an oral composition for whitening and an oral composition for improving hyperpigmentation.
  • a mixture of fruit pieces and vegetable oil is obtained through a pulverization step.
  • the separation step separates the extracted oil from the mixture obtained in the grinding step.
  • the extracted oil can be separated from the mixture by known methods.
  • the upper layer obtained by centrifugation may be recovered as extracted oil.
  • the upper layer obtained by centrifugation may be further filtered to remove solids.
  • Disintegrants include, for example, lactose, sucrose, starch, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethylstarch sodium, low-substituted hydroxypropylcellulose, soft anhydrous silicic acid and calcium carbonate.
  • Suspending agents include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride and glyceryl monostearate; Hydrophilic polymers such as sodium methyl cellulose, methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose and hydroxypropyl cellulose; polysorbates, polyoxyethylene hydrogenated castor oil and the like.
  • surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride and glyceryl monostearate
  • Hydrophilic polymers such as sodium methyl cellulose, methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose and hydroxypropyl cellulose
  • polysorbates polyoxyethylene hydrogenated castor oil and the like.
  • Preservatives include paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid and sorbic acid.
  • antioxidants include sulfites and ascorbates.
  • Coloring agents include water-soluble colored tar pigments, lake pigments, natural pigments, and the like.
  • Sweeteners are, for example, sodium saccharin, dipotassium glycyrrhizinate, aspartame and stevia.
  • the dosage of the whitening agent is, for example, 0.01 mg/kg to 1000 mg/kg, preferably 0.1 mg/kg to 200 mg/kg, more preferably 0.2 mg/kg to 20 mg/kg, once a day.
  • the whitening agent is administered in divided doses, the whitening agent is administered from 1 to 4 times a day.
  • the whitening agent may be administered at various dosing frequencies such as daily, every other day, once a week, every other week and once a month. Amounts outside the above ranges can also be used, if desired.
  • Mandarins and other fruit oil extract ingredients are mixed into various foods or beverages to make functional foods so that the oil extract ingredients of fruits such as mandarins can be easily orally ingested on a daily basis.
  • Fruit oil extract components can be ingested for a long period of time.
  • “Functional food” means food or beverage that is ingested for the purpose of maintaining health, and includes food with health claims, food for specified health use, food with nutrient function claims, health food, nutritional supplement, and the like. Among these, food with specified health uses or food with nutrient function claims, which are foods with health claims, are preferable.
  • functional foods include, for example, nutritional drinks, soft drinks, beverages such as black tea and green tea; sweets such as candy, cookies, tablets, chewing gum and jelly; processed grain products such as noodles, bread, rice and biscuits; These include paste products such as sausage, ham and fish paste; dairy products such as butter and yogurt; furikake;
  • the functional food may contain additives such as sweeteners, flavoring agents and coloring agents.
  • Example 1 Extraction of hydrophobic components with vegetable oil
  • Corn oil, olive oil, rice oil, castor oil and canola oil were used as vegetable oils for extraction.
  • fruits such as Unshu mandarin "Otsu No. 4", Kikai mandarin, Kunenbo, Kerajimikan, Kozu B, Sekunin, Chinazekunin and Tunugekunin were used together with their peels.
  • fruits thinned fruits and mature fruits were used. A sample frozen at ⁇ 20° C. was naturally thawed, and about 50 g was weighed into a mixer cup.
  • Fig. 7 shows examples of polymethoxyflavonoids presumed to be contained in each mandarin, etc. based on their molecular weights ( ⁇ means presumed containment). It was suggested that the extracted oil obtained from mandarins and the like contains a functional ingredient having a whitening effect.
  • the concentration was determined from the ratio of the calibration curve of the standard product and the UV absorption value of the measurement sample.
  • FIGS. 10 and 11 show HPLC chromatograms of the oil extracted from the thinned and mature fruits of Kozu B, respectively.
  • FIG. 12 shows the concentrations of nobiletin in extracted oils such as mandarins. Nobiletin tended to be contained more in thinned fruit than in mature fruit. A particularly large amount of nobiletin was found in thinned fruits of sequnin, coz B and chinazekunin.
  • C57BL/6 mouse melanoma (B16 melanoma cells) and human malignant melanoma (HMV-II cells) were obtained from RIKEN CELL BANK.
  • DMEM containing 1% PSG and 10% FBS
  • Ham'F12 containing 10% FBS
  • phosphate buffered saline PBS
  • 100 ⁇ l of each well was spread on each well of a 96-well plate, and the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured with a plate reader spectrophotometer.
  • Cell supernatants other than controls were added with 0.050 mM theophylline as a melanogenesis inducer along with the samples.
  • kojic acid which has a high whitening effect, was used as a positive control.
  • B16 melanoma cells were plated on a 6-cm dish at 1.4 ⁇ 10 5 cells/well and cultured at 37° C., 5% CO 2 for 24 hours. After adding the O/W emulsion containing the extracted oil, the cells were cultured at 37° C. and 5% CO 2 for 48 hours. The cells were scraped off with a scraper and collected in a tube together with the medium. It was centrifuged at 300G for 5 minutes at 4°C and the supernatant was removed. After centrifugation at 300G for 5 minutes at 4°C, the supernatant was aspirated and washed once with PBS.
  • Fig. 14 shows the results of comparing the effect on the amount of melanin in B16 melanoma cells with an ethanol extract extracted in the same manner as in Example 1 with 70% ethanol instead of vegetable oil.
  • the corn oil extract significantly suppressed the melanin production induced by theophylline compared to the ethanol extract.
  • FIG. 16 shows relative inhibition of intracellular tyrosinase activity. Extracted oil inhibited tyrosinase activity, the rate-limiting enzyme for melanogenesis.
  • FIG. 18 shows relative values of melanin content per cell. Extracted oil from yuzu inhibited melanin production induced by theophylline. On the other hand, the extract oil extracted from sour pomelo hardly inhibited melanin production induced by theophylline.
  • the present invention is useful for manufacturing pharmaceuticals, functional foods, beauty products, and the like.

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Abstract

オイル抽出成分の製造方法は、植物油中の果実を粉砕する粉砕ステップと、粉砕ステップで得られた混合物から抽出油を分離する分離ステップと、を含む。果実は、マンダリン類、マンダリン交雑種、シトロン類及びユズ類からなる群から選択される少なくとも１種である。

Description

オイル抽出成分の製造方法、美白剤、色素沈着症改善剤、美白用経口組成物及び色素沈着症改善用経口組成物
　本発明は、オイル抽出成分の製造方法、美白剤、色素沈着症改善剤、美白用経口組成物及び色素沈着症改善用経口組成物に関する。
　カンキツ類には、美白効果を有する機能性成分が含有されていることが知られている。例えば、特許文献１では、マンダリン類にも含有されるチラミンによるメラニン量の減少が示されている。特許文献２には、カンキツ類果実をアルコールで抽出したエキスを含有する美白剤が開示されている。
　多くのカンキツ類に含まれる成分として、カンキツ果皮から抽出した揮発性の高い精油の他、疎水性成分であるヘスペリジン、タンゲレチン及びノビレチン等のポリメトシキフラボノイド類が報告されている（特許文献３、非特許文献１及び非特許文献２参照）。ポリメトシキフラボノイド類の抽出方法としては、エタノール等のアルコール類を用いた抽出が一般的である。精油の抽出方法としては、圧搾法、蒸留法及びマイクロ波抽出法等が知られている。非特許文献３には、カンキツ類のフラベド（外果皮）を圧搾して油胞中に存在する精油を抽出する冷圧油法が開示されている。
特表２００４－５０６６７７号公報 特開２００５－１３２７９３号公報 特開２０１８－１６６９３号公報 特開２００９－２９９８９号公報
松田秀秋，外１名，「青い柑橘類果実でアンチエイジング～抗アレルギー作用を併せ持つ美白・美肌作用～」，生物工学，２０１０年，第８８巻，第５号，３１８－３１９ 安藤浩毅，外３名，「未利用柑橘資源の高度利用技術の開発」，鹿児島県工業技術センター研究報告　第２５号（２０１１年／平成２３年度），１５－１９ 受田浩之，「カンキツ精油の有する生体作用の生化学的解析」，ＡＲＯＭＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ，２００８年，９（４）：３０２－３０６
　アルコールを用いた抽出では、揮発成分である精油は濃縮の段階で揮発するため、カンキツ類に含有され得る精油を効率良く得ることができない。蒸留法では、熱によって精油が変質するおそれがある。圧搾法では収油率が低い。上記特許文献３では、圧搾法によってシィクワーサーの果実から精油が分離されているが、２８００ｋｇの果実から８００ｇしか精油が得られていない。その他、マイクロ波抽出、超臨界二酸化炭素抽出及び超高圧処理法が知られているが、いずれも特殊な装置を要し、精油を簡便に抽出できるとは言い難い。
　特許文献４には、カンキツ類の果実とオリーブの果実とを混合状態で同時に圧搾することで、カンキツ類の果実の成分を含有するオリーブオイルを得る方法が開示されている。しかし、特許文献４では、オリーブオイルに移行したカンキツ類の果実の成分としてリモネンと総ポリフェノールとが定量されているが、当該オリーブオイルの機能については検討されていない。よって、当該方法によって、その他の有用なカンキツ類の成分が抽出できているかは不明である。
　本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであり、美白に有用な成分を簡便に効率よく抽出できるオイル抽出成分の製造方法、及び当該有用な成分を利用した美白剤、色素沈着症改善剤、美白用経口組成物及び色素沈着症改善用経口組成物を提供することを目的とする。
　本発明の第１の観点に係るオイル抽出成分の製造方法は、
　植物油中の果実を粉砕する粉砕ステップと、
　前記粉砕ステップで得られた混合物から抽出油を分離する分離ステップと、
　を含み、
　前記果実は、
　マンダリン類、マンダリン交雑種、シトロン類及びユズ類からなる群から選択される少なくとも１種である。
　前記粉砕ステップでは、
　１～０．７質量部の前記植物油中で１質量部の前記果実を粉砕する、
　こととしてもよい。
　前記果実は、
　コズＢ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｄｅｐｒｅｓｓａ　Ｈａｙａｔａ）、シトロン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｍｅｄｉｃａ　Ｌ．）、シークニン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｄｅｐｒｅｓｓａ　Ｈａｙａｔａ）、クネンボ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｎｏｂｉｌｉｓ　Ｌｏｕｒ．）、シマミカン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｐ．）、キミカン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｆｌａｖｉｃｕｌｐｕｓ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、バロティンベルガモット（Ｃｉｔｒｕｓ　ｂｅｒｇａｍｉａ　Ｐｏｉｔ．eｔ　Ｔｕｒｐ．）、ロクガツミカン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｏｋｕｇａｔｓｕ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）又はユズ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｊｕｎｏｓ　Ｓｉｅｂ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）である、
　こととしてもよい。
　前記植物油は、
　トウモロコシ油、オリーブ油、コメ油、ひまし油又はキャノーラ油である、
　こととしてもよい。
　本発明の第２の観点に係る美白剤又は色素沈着症改善剤は、
　果実のオイル抽出成分を含み、
　前記果実は、
　マンダリン類、マンダリン交雑種、シトロン類及びユズ類からなる群から選択される少なくとも１種である。
　本発明の第３の観点に係る美白用経口組成物又は色素沈着症改善用経口組成物は、
　果実のオイル抽出成分を含み、
　前記果実は、
　マンダリン類、マンダリン交雑種、シトロン類及びユズ類からなる群から選択される少なくとも１種である。
　本発明によれば、美白に有用な成分を簡便に効率よく抽出できる。また、当該有用な成分を利用した美白剤、色素沈着症改善剤、美白用経口組成物及び色素沈着症改善用経口組成物が提供される。
実施例１においてマンダリン類の摘果又は成熟果実から抽出した抽出油の紫外可視分光法（ＵＶ－ｖｉｓ）のスペクトルを示す図である。 実施例１において所定量の植物油中で粉砕したマンダリン類の果実から抽出した抽出油のＵＶ－ｖｉｓのスペクトルを示す図である。 実施例１においてマンダリン類等の摘果から抽出した抽出油のＵＶ－ｖｉｓのスペクトルを示す図である。 実施例１においてマンダリン類等の成熟果実から抽出した抽出油のＵＶ－ｖｉｓのスペクトルを示す図である。 試験例１において液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）で得られたマンダリン類等の摘果から抽出した抽出油のクロマトグラムを示す図である。 試験例１においてＬＣ－ＭＳで得られたマンダリン類等の成熟果実から抽出した抽出油のクロマトグラムを示す図である。 抽出油に含まれると推定されるポリメトキシフラボノイド類を示す図である。 試験例２においてガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）で得られたマンダリン類等の摘果から抽出した抽出油のクロマトグラムを示す図である。 試験例２においてＧＣ－ＭＳで得られたマンダリン類等の成熟果実から抽出した抽出油のクロマトグラムを示す図である。 試験例３において高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で得られたコズＢの摘果から抽出した抽出油のクロマトグラムを示す図である。 試験例３においてＨＰＬＣで得られたコズＢの成熟果実から抽出した抽出油のクロマトグラムを示す図である。 試験例３に係る各マンダリン類等の抽出油におけるノビレチンの相対的な濃度を示す図である。 試験例４に係る抽出油に暴露したマウス細胞におけるメラニン量の相対値を示す図である。 試験例４に係るエタノール抽出物及び抽出油に暴露したマウス細胞におけるメラニン量の相対値を示す図である。 試験例４に係る抽出油に暴露したヒト細胞におけるメラニン量の相対値を示す図である。 試験例４に係る抽出油に暴露したヒト細胞における相対的な細胞内チロシナーゼの活性阻害を示す図である。 試験例４に係る抽出油に暴露したヒト細胞の相対的な生存率を示す図である。 試験例５に係る抽出油に暴露したマウス細胞におけるメラニン量の相対値を示す図である。 試験例６に係るＵＶ－ｖｉｓのスペクトルを示す図である。
　本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。また、本明細書においては、マンダリン類、マンダリン交雑種、シトロン類及びユズ類を“マンダリン類等”と総称することがあり、マンダリン類等は、マンダリン類、マンダリン交雑種、シトロン類及びユズ類の少なくとも１種を意味する。
　（実施の形態１）
　本実施の形態に係るマンダリン類等のオイル抽出成分の製造方法は、粉砕ステップと、分離ステップとを含む。粉砕ステップでは、植物油中の果実を粉砕する。
　植物油は、植物から抽出され精製された油である。植物油の原料である植物は特に限定されず、トウモロコシ、オリーブ、コメ、ひまし、キャノーラ、大豆、菜種、綿実、ひまわりの種、ピーナッツ、パーム果実、ココナッツ、ゴマ及びアマニ等である。植物油としては、例えば、トウモロコシ油、オリーブ油、コメ油、ひまし油及びキャノーラ油等が挙げられる。好ましくは、植物油はトウモロコシ油である。トウモロコシ油はそれ自体が美白効果を有し、マンダリン類等との相乗効果により、より美白効果が期待できる。
　上記果実は、マンダリン類、マンダリン交雑種、シトロン類及びユズ類からなる群から選択される少なくとも１種である。
　マンダリン類は、カンキツ属マンダリン類に属する品種又は系統であれば任意である。マンダリン類としては、クネンボ、トークニン、キングマンダリン（以上Ｃｉｔｒｕｓ　ｎｏｂｉｌｉｓ　Ｌｏｕｒ．）、ウンシュウミカン原木、青島温州、寿太郎温州、白川温州、十万温州、大津４号、興津早生、宮川早生、かごしま早生（以上Ｃｉｔｒｕｓ　ｕｎｓｈｕ　Ｍａｒｃ．）、ケラジ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｋｅｒａｊｉ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、喜界（キカイ）ミカン、ナツクニン、カーブチー（以上Ｃｉｔｒｕｓ　ｋｅｒａｊｉ　ｖａｒ．　Ｋａｂｕｃｈｉｉ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、オートー（Ｃｉｔｒｕｓ　ｏｔｏ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｙ．Ｔａｎａｋａ）、吉田ポンカン、薩州（以上Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ　Ｂｌａｎｃｏ）、地中海マンダリン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｄｅｌｉｃｉｏｓａ　Ｔｅｎ．）、ゲンショウカン（以上Ｃｉｔｒｕｓ　ｇｅｎｓｈｏｋａｎ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、大紅ミカン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｔａｎｇｅｒｉｎａ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、クレメンティン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｃｌｅｍｅｎｔｉｎａ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、タチバナ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｔａｃｈｉｂａｎａ（Ｍａｋ．）　Ｔａｎａｋａ）、キノクニ、桜島コミカン、ウスカワ（以上Ｃｉｔｒｕｓ　ｋｉｎｏｋｕｎｉ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、スンキ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｕｎｋｉ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、クレオパトラ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｅｓｈｎｉ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、シィクヮーサー、シークニン、シークリブ（以上Ｃｉｔｒｕｓ　ｄｅｐｒｅｓｓａ　Ｈａｙａｔａ）、コウジ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｌｅｉｏｃａｒｐａ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、キミカン及びコズ、黒島ミカン（以上Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｐ．）等が例示される。なお、コズの一部には、Ｃｉｔｒｕｓ　ｄｅｐｒｅｓｓａ　Ｈａｙａｔａに分類されるものもある。
　マンダリン交雑種は、カンキツ属におけるマンダリン類とマンダリン類以外の品種、例えば、ライム類、レモン類、ブンタン類、ダイダイ類、スイートオレンジ類又はキンカン類とが交雑して発生した品種である。マンダリン交雑種としては、例えば、ウンシュウミカンとハッサクとが交雑したスイートスプリング、ウンシュウミカンとスイートオレンジとが交雑した清見、ブンタンとキノクニとが交雑したサザンイエロー、ダンシータンゼリンとグレープフルーツとが交雑したオーランド、セミノール及びミネオラ、ネーブルオレンジとクレメンティンとが交雑したありあけ、清見とポンカンとが交雑した不知火、清見と興津早生との交雑種とページとが交雑した天草、清見とアンコールとの交雑種とマーコットとが交雑したせとか、並びに清見と興津早生とが交雑した津之香等が挙げられる。なお、ブンタンは柑橘属であるが、マンダリン類及びマンダリン交雑種ではない。
　シトロン類は、例えば、シトロン及びバロティンベルガモットである。シトロン類は、マンダリンとは独立して発生した品種である。ユズ類としては、例えば、ユズ、ハナユ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｈａｎａｙｕ　Ｈｏｒｔ．eｘ　Ｓｈｉｒａｉ）、カボス（Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐａ　Ｈｏｒｔ．eｘ　Ｔａｎａｋａ）及びスダチ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｕｄａｃｈｉ　Ｈｏｒｔ．eｘ　Ｓｈｉｒａｉ）等が挙げられる。ユズ類は、マンダリンとは独立して発生した品種である。
　好ましい果実としては、大津４号等のウンシュウミカン、キカイミカン、クネンボ、ケラジミカン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｋｅｒａｊｉ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、コズＢ、シークニン、シマミカン（チナゼクニン又はクロシマミカンともいう）、トゥヌゲクニン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｐ．）、シトロン、キミカン、バロティンベルガモット及びロクガツミカンが例示される。特に好ましくは、果実は、コズＢ、シトロン、シークニン、クネンボ、シマミカン、キミカン、バロティンベルガモット、ロクガツミカン又はユズである。
　マンダリン類等の果実は、果実が小さく緑色の状態の摘果でも成熟させた成熟果実でもよい。好ましくは、果実は油胞を含むフラベドごと使用される。果実として、収穫後に凍結させて解凍した果実を用いてもよいし、凍結乾燥させた果実を用いてもよい。なお、マンダリン類等は１種を用いてもよいし、複数種を混合して用いてもよい。
　マンダリン類等の果実は、植物油中で公知の方法で粉砕されればよく、例えば、ミキサーで粉砕される。粉砕は、段階的に行ってもよく、植物油と粉砕された果実片とを均一に混合するために粉砕の間に転倒混和を行ってもよい。
　粉砕ステップにおける果実の質量及び植物油の質量の比は、好ましくは、１：１～３：２である。例えば、粉砕ステップでは、１～０．７質量部、好ましくは１～０．８質量部、より好ましくは１～０．９質量部、特に好ましくは１質量部の植物油中で１質量部の果実を粉砕する。
　粉砕ステップを経て、果実片と植物油とが混和した混合物が得られる。分離ステップでは、粉砕ステップで得られた混合物から抽出油を分離する。抽出油は公知の方法で混合物から分離することができる。例えば、分離ステップでは、遠心分離によって得られる上層を抽出油として回収してもよい。分離ステップでは、遠心分離で得られた上層をさらにろ過して固形分を除去してもよい。
　分離ステップで得られた抽出油に含まれる成分（オイル抽出成分）には、下記実施例に示すように、フラボノイド及びカロテノイドに加え、精油（香気成分）が含まれる。当該オイル抽出成分には肌の美白作用を有する機能性物質が含まれている。
　本実施の形態に係るオイル抽出成分の製造方法によれば、特殊な装置等を使用しなくても、マンダリン類等から美白に有用な成分を簡便に効率よく抽出できる。本実施の形態に係るオイル抽出成分の製造方法における粉砕ステップでは、植物油中のマンダリン類等の果実を粉砕することとした。植物油中で粉砕することで、美白に有用な成分とともに香気成分を抽出することができる。
　なお、粉砕ステップにおいて、植物油に加え、植物油以外の油剤とともに果実を粉砕してもよい。油剤は、例えば、上記植物油以外の油であれば特に限定されず、動物油、合成油、半固形油、液体油、揮発性油、油脂類、脂肪酸類、シリコーン油類、フッ素系油類及びラノリン誘導体類等である。油剤として、具体的には、イソステアリン酸及びオレイン酸等の脂肪酸類；低重合度ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、架橋型オルガノポリシロキサン及びフッ素変性ポリシロキサン等のシリコーン油類；パーフルオロデカン及びパーフルオロオクタン等のフッ素系油剤類等が挙げられる。
　また、粉砕ステップでは、添加物の存在下で果実を粉砕してもよい。添加物は、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤である。
　賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、Ｄ－ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軟質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、キシリトール、ソルビトール及びエリスリトール等が挙げられる。
　滑沢剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ及びポリエチレングリコール等である。
　結合剤としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ－マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドン等が例示される。
　崩壊剤は、例えば、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、軟質無水ケイ酸及び炭酸カルシウム等である。
　溶剤としては、注射用水、生理食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油及び綿実油等が挙げられる。溶解補助剤は、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム及び酢酸ナトリウム等である。
　懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム及びモノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子；ポリソルベート類、並びにポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等が挙げられる。
　等張化剤は、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトール、Ｄ－ソルビトール、ブドウ糖、キシリトール及び果糖等が挙げられる。緩衝剤は、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びクエン酸塩等の緩衝液等である。無痛化剤は、例えば、プロピレングリコール、塩酸リドカイン及びベンジルアルコール等である。
　防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸及びソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、亜硫酸塩及びアスコルビン酸塩等が例示される。着色剤としては、水溶性着色タール色素、レーキ色素及び天然色素等が挙げられる。甘味剤は、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム及びステビア等である。
　（実施の形態２）
　本実施の形態に係る美白剤は、マンダリン類等の果実のオイル抽出成分を含む。オイル抽出成分は、好ましくは上記実施の形態１に係る製造方法によって製造される。美白剤は、オイル抽出成分の希釈液及び濃縮液、並びにそれらの乾燥物及び粉末として含んでもよい。
　本実施の形態に係る美白剤は、既知の方法で製造され、有効成分として０．０００００１～９９．９質量％、０．００００１～９９．８質量％、０．０００１～９９．７質量％、０．００１～９９．６質量％、０．０１～９９．５質量％、０．１～９９質量％、０．５～６０質量％、１～５０質量％又は１～２０質量％のオイル抽出成分を含む。美白剤は、固形製剤であっても、液状製剤であってもよい。美白剤は、経口投与されても局所投与されてもよいが、好適には外用剤として使用される。当該美白剤が外用剤の場合、美白剤はオイル抽出成分が経皮吸収される態様で皮膚に塗布等される。外用剤としては、軟膏、クリーム、乳液、リニメント、ローション剤及び貼付剤等が例示される。
　美白剤はオイル抽出成分に加え、薬理学上許容される任意の成分を含んでもよい。任意の成分は、例えば、上述の賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等である。また、必要に応じて、上述の防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤等の添加物が美白剤に配合されてもよい。
　美白剤の投与量は、投与対象の性別、年齢、体重及び症状等によって適宜決定される。美白剤は、オイル抽出成分が有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要なオイル抽出成分の量であり、肌の黒ずみ及び色黒等の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量である。
　美白剤の投与量は、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる美白剤を分割して投与する場合、美白剤は、１日に１～４回投与される。また、美白剤は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週及び１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
　美白剤の投与対象は、脊椎動物が好ましく、哺乳類動物がより好ましい。哺乳類動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー及びその他の霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ラット、マウス及びモルモット等の家畜動物、愛玩動物及び実験用動物等が挙げられる。特に好ましくは、哺乳類動物はヒトである。
　本実施の形態に係る美白剤に有効成分として含有されるマンダリン類等の果実のオイル抽出成分は、下記実施例に示すように、メラノーマ細胞におけるメラニン量を抑制することができる。また、当該オイル抽出成分は、細胞内のチロシナーゼの活性を阻害する。したがって、本実施の形態に係る美白剤は、メラニンの産生の抑制による美白効果を有する。
　メラニンの産生は、シミ、ソバカス及び色黒等の色素沈着症の原因となるため、別の実施の形態では、マンダリン類等の果実のオイル抽出成分を含む色素沈着症改善剤が提供される。なお、上述の美白剤及び色素沈着症改善剤は、化粧品としても使用され得る。化粧品として使用する場合、美白剤及び色素沈着症改善剤は、好ましくは、軟膏、クリーム、乳液、リニメント、ローション剤又は貼付剤等として皮膚に適用される。
　別の実施の形態では、マンダリン類等の果実のオイル抽出成分を有効成分として含む美白用経口組成物又は色素沈着症改善用経口組成物が提供される。経口組成物としては、具体的には、サプリメント、食品組成物、飲食品、機能性食品及び食品添加剤が挙げられる。
　サプリメントの形態は、特に制限されず、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、糖衣錠、フイルム剤、トローチ剤、チュアブル剤、溶液、乳濁液、懸濁液等の任意の形態でよい。サプリメントは、マンダリン類等の果実のオイル抽出成分以外に、サプリメントとして通常使用される任意の成分を含んでもよい。当該成分としては、例えば、アミノ酸、ペプチド；ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＢ及び葉酸等のビタミン類；ミネラル類；糖類；無機塩類；クエン酸又はその塩；茶エキス；油脂；プロポリス、ローヤルゼリー及びタウリン等の滋養強壮成分；ショウガエキス及び高麗人参エキス等の生薬エキス；ハーブ類；並びにコラーゲン等が挙げられる。
　マンダリン類等の果実のオイル抽出成分を日常的に経口摂取しやすいように各種の食品又は飲料にマンダリン類等の果実のオイル抽出成分を混合して機能性食品とすることで、マンダリン類等の果実のオイル抽出成分を長期的に摂取することができる。“機能性食品”とは、健康の維持の目的で摂取する食品又は飲料を意味し、保健機能食品である特定保健用食品、栄養機能食品、健康食品及び栄養補助食品等を含む。この中でも保健機能食品である特定保健用食品又は栄養機能食品が好ましい。なお、機能性食品として製品化する場合には、食品に用いられる様々な添加剤、具体的には、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、漂白剤、防菌防黴剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤及び香料等を添加してもよい。
　機能性食品の対象となる、食品及び飲料は特に限定されるものではない。機能性食品の形態は、例えば、栄養ドリンク、清涼飲料水、紅茶及び緑茶等の飲料；キャンデー、クッキー、錠菓、チューインガム及びゼリー等の菓子；麺、パン、米飯及びビスケット等の穀類加工品；ソーセージ、ハム及びかまぼこ等の練り製品；バター及びヨーグルト等の乳製品；ふりかけ；並びに調味料等である。なお、機能性食品には、甘味料、香料及び着色料等の添加物が含まれてもよい。
　マンダリン類等の果実のオイル抽出成分を機能性食品に配合する割合は任意であるが、美白の促進、色素沈着症の抑制、予防及び改善の少なくともいずれかに寄与する範囲で割合が選択される。また、マンダリン類等の果実のオイル抽出成分は、食品添加剤として使用することも可能である。
　なお、他の実施の形態では、マンダリン類等の果実のオイル抽出成分を対象に投与することにより色素沈着症を治療する方法が提供される。また、別の実施の形態は、色素沈着症を治療するためのマンダリン類等の果実のオイル抽出成分の使用である。他の実施の形態では、美白剤又は色素沈着症改善剤としての使用のためのマンダリン類等の果実のオイル抽出成分が提供される。また、別の実施の形態は、美白を促進するための医薬又は色素沈着症を抑制するための医薬の製造のためのマンダリン類等の果実のオイル抽出成分の使用である。
　なお、マンダリン類等の果実のオイル抽出成分による機能、例えば、培養細胞におけるメラニン産生の抑制活性を評価するには、マンダリン類等の果実から製造された上記抽出油と水系の培養培地との分離を抑制するために、抽出油をＯ／Ｗ（Ｏｉｌ　ｉｎ　Ｗａｔｅｒ）エマルション液とする必要がある。この場合、乳化剤としてはカゼインが好ましい。カゼインは、リチウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩等のアルカリ金属塩であってもよい。
　抽出油を含むＯ／Ｗエマルション液は、例えば、水と抽出油と乳化剤とを混合し、十分に撹拌すればよい。公知の方法で撹拌すればよいが、好ましくは短時間で乳化させるために、超音波処理によって撹拌される。水と抽出油と乳化剤との混合比は、１０～１５ｖ／ｖ％、好ましくは１１～１４ｖ／ｖ％、より好ましくは１２ｖ／ｖ％で抽出油を含む水１質量部に対してカゼインの質量部が０．００４～０．００７、好ましくは０．００５～０．００６、より好ましくは０．００５３～０．００５７である。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　［実施例１：植物油による疎水性成分の抽出］
　抽出用の植物油としてトウモロコシ油、オリーブ油、コメ油、ひまし油及びキャノーラ油を用いた。マンダリン類等としてウンシュウミカン「大津４号」、キカイミカン、クネンボ、ケラジミカン、コズＢ、シークニン、チナゼクニン及びトゥヌゲクニン等の果実を外果皮ごと用いた。果実として摘果及び成熟果実を使用した。－２０℃で凍結させたサンプルを自然解凍し、ミキサーのカップに約５０ｇ程度測り取った。果実の質量に対して所定の質量比の植物油を同じカップに測り取り、ミキサーを用いて３０秒→１０秒→２０秒の段階的に油中粉砕した。粉砕の間に転倒混和も適宜行った。冷却遠心機を用いて４℃、２３３０×ｇで５分間、遠心分離した。一番上の層（オイル層）を２枚重ねにしたコーヒーフィルター（ＦＰ１０２、カリタ社製）によりろ過することで回収した。
　（ＵＶ－ｖｉｓの測定）
　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）　２０００ｃ超微量分光光度計を用い、ＵＶ吸収スペクトルをフルスペクトル（１９０～８４０ｎｍ）で測定した。ブランクはトウモロコシ油でとり、その後、果実の質量に対して所定の質量比の植物油で抽出した各抽出油２μｌを用いて測定した。
　（結果）
　図１は、ウンシュウミカン「大津４号」の摘果又は成熟果実から抽出した抽出油の吸光度を示す。いずれの植物油でも、フラボノイドに対応する３００～４００ｎｍとカロテノイドに対応する４００～５００ｎｍにピークを確認した。油種によって、抽出効率が異なるものの、使用したすべての植物油で抽出が可能であることが示された。
　図２は、シークニンの質量とトウモロコシ油との質量比が１：１０、１：１又は３：２として成熟果実から抽出した抽出油の吸光度を示す。果実と植物油との質量比が１：１～３：２の範囲で、より多くのフラボノイド及びカロテノイドが抽出されることが示された。
　図３は、各マンダリン類等とトウモロコシ油との質量比を１：１として摘果から抽出した抽出油を測定した吸光度を示す。図４は、各マンダリン類等の質量とトウモロコシ油との質量比を１：１として成熟果実から抽出した抽出油を測定した吸光度を示す。図３及び図４に示すように、摘果であっても成熟果実であっても、フラボノイド及びカロテノイドを含む疎水性成分が抽出された。
　［試験例１：ＬＣ－ＭＳの測定］
　ＬＣ－ＭＳ測定による疎水性成分の分析を次に示す条件で行った。
　ＬＣ部条件
　（装置）ＬＣ－２０　高圧グラジエントシステム（島津製作所製）
　（分析カラム）ＣＯＳＭＯＳＩＬ，πＮＡＰ（４．６ＩＤ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）
　（移動相流量）１．０ｍｌ／分
　（注入量）５μｌ
　（カラム温度）４０℃
　（勾配）Ａ：Ｈ２Ｏ（１００％）　Ｂ：テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１００％）、３０％Ｂ（０分）→３０％Ｂ（２分）→７０％Ｂ（２０分）　ｌｉｎｅａｒ　Ｔｏｔａｌ　ｒｕｎ　ｔｉｍｅ：２５分
　（検出ＵＶ波長）３３０ｎｍ
　ＭＳ部条件
　（装置）３２００ＱＴＲＡＰ　ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ　ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢ　ＳＣＩＥＸ社製）
　（イオン源パラメーター）Ｃｕｒｔａｉｎ　Ｇａｓ：２０ｐｓｉ，Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　Ｇａｓ：Ｈｉｇｈ，Ｉｏｎ　Ｓｐｒａｙ　Ｖｏｌｔａｇｅ：５５００Ｖ，Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：６００℃，Ｉｏｎ　Ｓｏｕｒｃｅ　Ｇａｓ１：５０ｐｓｉ，Ｉｏｎ　Ｓｏｕｒｃｅ　Ｇａｓ２：８０ｐｓｉ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｈｅａｔｅｒ：ＯＮ
　（結果）
　図５は、各マンダリン類等の質量とトウモロコシ油との質量比を１：１として摘果から抽出した抽出油を測定した強度を示す。図６は、各マンダリン類等の質量とトウモロコシ油との質量比を１：１として成熟果実から抽出した抽出油を測定した強度を示す。図５及び図６に示すように、摘果であっても成熟果実であっても、抽出油にフラボノイド又は配糖体が含まれることが確認された。
　図７は各マンダリン類等に、分子量から含まれていることが推定されるポリメトキシフラボノイドを例示する（○は含有が推定されることを意味する）。マンダリン類等から得られる抽出油には美白作用を有する機能性成分が含まれていることが示唆された。
　［試験例２：ＧＣ－ＭＳの測定］
　ＧＣ－ＭＳ測定による精油（香気成分）の分析を次のように行った。各試料１ｍｌを２ｍｌバイアルに封入し、Ａｇｉｌｅｎｔ　５９７５Ｃ　シリーズＧＣ／ＭＳＤシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で測定した。ＧＣ分析の条件では、注入口温度を２５０℃、注入条件をスプリットモード、スプリット比１：２０に設定した。分離カラムとしてＨＰ－５ＭＳ（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、フイルム厚０．２５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｊ＆Ｗ社製）を使用し、ヘリウムキャリヤーガスの平均線速度を流量１ｍｌ／分とした。カラム温度を４０℃で５分間保持し、毎分３℃で１５０℃まで昇温させ、その後毎分９℃で２４０℃まで昇温させ、最終温度２４０℃で５分間保持した（Ｔｏｔａｌ　ｒｕｎ　ｔｉｍｅ：６０分）。
　質量検出器の測定条件は、ｍ／ｚ　３５－４５０のスキャン範囲でイオン化電圧７０ｅＶ（ＥＩ）、トランスファー温度２４０℃とした。香気成分の推定は質量スペクトル（ＮＩＳＴ０８ライブラリ、類似度＞８０％）を用いて行った。
　（結果）
　図８は、各マンダリン類等の質量とトウモロコシ油との質量比を１：１として摘果から抽出した抽出油を測定した吸光度を示す。図９は、各マンダリン類等の質量とトウモロコシ油との質量比を１：１として成熟果実から抽出した抽出油を測定した吸光度を示す。図８及び図９に示すように、摘果であっても成熟果実であっても、抽出油に香気成分が含まれることが確認された。
　ＧＣ－ＭＳ測定により、摘果から、アルデヒドが１４種、モノテルペンが２０種、ジテルペンが２種、セスキテルペンが１７種、アルコールが３種、モノテルペン誘導体が１１種、ジテルペン誘導体が６種、セスキテルペン誘導体が１種、その他の香気成分が８種検出されていることが推定された。また、成熟果実から、アルデヒドが１０種、モノテルペンが１７種、ジテルペンが１種、セスキテルペンが１０種、アルコールが１種、モノテルペン誘導体が９種、ジテルペン誘導体が４種、セスキテルペン誘導体が１種、その他の香気成分が３種検出されていることが推定された。以上により、抽出油中にマンダリン類等由来の美白作用を有する香気成分が含まれている可能性が示唆された。
　［試験例３：ＨＰＬＣの測定］
　ＨＰＬＣ測定による抽出油の成分分析を次に示す条件で行った。測定サンプルとして、抽出油を等量のＴＨＦで希釈した。
　（装置）ＬＣ－９００シリーズ（日本分光社製）
　（分析カラム）ＣＯＳＭＯＳＩＬ、πＮＡＰ（４．６ＩＤ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）
　（移動相流量）１．０ｍｌ／分
　（注入量）５μｌ
　（カラム温度）４０℃
　（勾配）Ａ：Ｈ２Ｏ（１００％）　Ｂ：ＴＨＦ（１００％）、３０％Ｂ（０分）→３０％Ｂ（２分）→７０％Ｂ（２０分）　ｌｉｎｅａｒ　Ｔｏｔａｌ　ｒｕｎ　ｔｉｍｅ：２５分
　（検出ＵＶ波長）３３０ｎｍ
　コズＢ抽出油中におけるノビレチン含有量については、標準品の検量線と測定サンプルのＵＶ吸収値の比率から濃度を決定した。
　（結果）
　図１０及び図１１はそれぞれコズＢの摘果及び成熟果実の抽出油について測定したＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。図１２は、各マンダリン類等の抽出油におけるノビレチンの濃度を示す。ノビレチンは成熟果実よりも摘果に多く含まれる傾向があった。シークニン、コズＢ及びチナゼクニンの摘果にノビレチンが特に多く含まれていた。
　［試験例４：細胞を用いた評価実験１］
　（Ｏ／Ｗエマルション液の調製）
　培養細胞で抽出油の美白作用を評価するため、まずは細胞培養液中で抽出油と水とが分離しない条件を検討した。食品添加物であるクエン酸三ナトリウム、レシチン及びカゼインナトリウムを乳化剤として検討した結果、カゼインナトリウムで調製した場合がＯ／Ｗエマルション液の安定性が最も高く、４８時間の水系の実験においてもエマルジョン形態が維持されることが明らかとなった。
　Ｏ／Ｗエマルション液は次に示す方法で調製した。滅菌水９８８μｌ、トウモロコシ油又はカンキツ抽出油１２μｌ、カゼインナトリウム０．００５４９６ｇを１．５ｍｌチューブに入れ、混合液とした。超音波洗浄器（ＡＳＵシリーズ、アズワン社製）に混合液の入った１．５ｍｌチューブを入れ、冷水下で１０分間、４３ｋＨｚの超音波処理を計２回行った。
　（細胞培養）
　Ｃ５７ＢＬ／６マウスメラノーマ（Ｂ１６メラノーマ細胞）及びヒト悪性黒色腫（ＨＭＶ－ＩＩ細胞）をＲＩＫＥＮ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫより入手した。それぞれ、ＤＭＥＭ（１％ＰＳＧ、１０％ＦＢＳ含有）培地及びＨａｍ’Ｆ１２（１０％ＦＢＳ含有）培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
　（細胞内メラニン量の測定）
　６ウェルプレートにＢ１６メラノーマ細胞を１．４×１０５細胞／ウェルで、ＨＭＶ－ＩＩ細胞を３．０×１０５細胞／ウェルでそれぞれ播き、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。抽出油を含むＯ／Ｗエマルション液を添加後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養した。トリプシンを５００μｌ加えて３７℃で３分間インキュベートし、細胞を回収した。４℃で５分間、３００Ｇで遠心分離後、上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を１２０μｌずつ加え、８０℃で３０分加熱したのち、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ撒き、プレートリーダー用分光光度計で４０５ｎｍ波長における吸光度を測定した。コントロール以外の細胞上清にはサンプルとともにメラニン生成誘導剤として０．０５０ｍＭテオフィリンを添加した。また、陽性対照として高い美白効果を有するコウジ酸を用いた。
　（細胞内チロシナーゼ活性阻害の測定）
　６ｃｍディッシュにＢ１６メラノーマ細胞を１．４×１０５細胞／ウェルで播き、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。抽出油を含むＯ／Ｗエマルション液を添加後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養した。スクレーパーで細胞を剥がし、培地ごとチューブに回収した。４℃で５分間、３００Ｇで遠心分離し、上清を除去した。４℃で５分間、３００Ｇで遠心分離後、上清をアスピレートし、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞のペレットに０．１％ＴｏｒｉｔｏｎＸ－１００を含有する１Ｍリン酸緩衝液を３００μｌ添加し、１２．５分間、超音波処理（氷水、Ｈｉｇｈ　ｐｏｗｅｒ、１０秒破砕と２０秒休止とを１サイクルとして２５サイクル）により細胞を破砕後、４℃で３０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、その上清２００μｌを回収してタンパク質液を得た。
　タンパク質を定量するために、１×ＰＢＳ　９０μｌにタンパク質液１０μｌを加え希釈し、希釈したタンパク質液とＢＳＡ水溶液を１５μｌずつ９６ウェルプレートに入れた。１×Ｄｙｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＲＣ　ＤＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）水溶液を１３５μｌずつ入れ、遮光条件下で１分振盪後４分静置し、プレートリーダー用分光光度計で５９５ｎｍ波長における吸光度を測定した。
　一方、タンパク質液１５０μｌに１Ｍリン酸緩衝液１５０μｌ、ＭＢＴＨ（３－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｎｅ　ｈｙｄｒａｚｏｎｅ、東京化成工業社製）水溶液１５０μｌを加え、３７℃で１０分間温めた。さらにＬ－ＤＯＰＡ（Ｌ－３－（３，４－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｌａｎｉｎｅ、ナカライテスク社製）溶液を１５０μｌ加え、３７℃で３０分間反応後、９６ウェルプレートの各ウェルに１５０μｌ入れ、プレートリーダー用分光光度計で４５０ｎｍ波長における吸光度を測定した。
　（細胞毒性実験）
　抽出油による細胞への毒性については、ＭＴＴ測定法を用いて測定した。２４時間前培養したＨＭＶ－ＩＩ細胞に抽出油を含むＯ／Ｗエマルション液を添加し、４８時間培養後、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ添加し、さらに４時間培養した。上清を除去し、ＤＭＳＯ（５００μｌ／ウェル）を添加し、ＭＴＴフォルマザンを完全に溶解させた後、プレートリーダー用分光光度計（サーモサイエンティフィック社製）で５７０ｎｍ波長における吸光度を測定した。試料添加による吸光度の減少に基づき、細胞の生存率（％）を算出した。
　（結果）
　図１３は、Ｂ１６メラノーマ細胞における細胞あたりのメラニン量の相対値を示す。なお、本試験では、果実を凍結乾燥したサンプルから上記実施例１と同様に調製した抽出油についても検討した。各マンダリン類等は、テオフィリンによって誘導されるメラニンの生成をコウジ酸（０．７ｍＭ）よりも抑制した。
　Ｂ１６メラノーマ細胞におけるメラニン量に及ぼす影響を植物油に代えて７０％エタノールで実施例１と同様に抽出したエタノール抽出物と比較した結果を図１４に示す。トウモロコシ油による抽出油は、エタノール抽出物と比較してテオフィリンによって誘導されるメラニンの生成を有意に抑制した。
　図１５は、ＨＭＶ－ＩＩ細胞における細胞あたりのメラニン量の相対値を示す。抽出油、特にコズＢはヒト由来細胞においてもテオフィリンによって誘導されるメラニンの生成を有意に抑制した。
　図１６は、相対的な細胞内チロシナーゼの活性阻害を示す。抽出油はメラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼ活性を阻害した。
　図１７は、ＨＭＶ－ＩＩ細胞の生存率を示す。抽出油はヒト由来細胞に対して毒性を示さなかった。
　［試験例５：細胞を用いた評価実験２］
　実施例１と同様にトウモロコシ油を用いてユズ及びサワーポメロから抽出油を調製した。試験例４と同様にＢ１６メラノーマ細胞を用いて、テオフィリン存在下での細胞あたりのメラニン量への抽出油の影響を評価した。なお、サワーポメロは柑橘属であるが、マンダリン類には属さない。
　（結果）
　図１８は、細胞あたりのメラニン量の相対値を示す。ユズから抽出された抽出油はテオフィリンによって誘導されるメラニンの生成を抑制した。一方、サワーポメロから抽出された抽出油はテオフィリンによって誘導されるメラニンの生成をほとんど抑制しなかった。
　［試験例６：抽出方法の比較］
　抽出用の植物油としてトウモロコシ油を用いて、実施例１と同様にキカイミカンから抽出油を抽出した（実施例Ａ）。果実と植物油との質量比を１：１とした。一方、果実をトウモロコシ油の中で粉砕する場合と、果実を粉砕後にトウモロコシ油と混合した場合とを比較するために、トウモロコシ油と混合せずに果実を実施例１と同様にミキサーで粉砕し、遠心分離後にろ過することで得られた抽出物にトウモロコシ油を混合することで比較例を調製した。なお、比較例の調製に用いた果実及びトウモロコシ油の質量はそれぞれ実施例Ａと同じである。
　（結果）
　比較例の調製では、トウモロコシ油とキカイミカンが混和しにくく、分離したままであった。試験例１と同様に、実施例Ａ及び比較例についてＵＶ吸収スペクトルを測定した結果を図１９に示す。果実の粉砕後にトウモロコシ油と混合しても疎水性成分、特にカロテノイド類はほぼ抽出できないことが示された。
　上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本出願は、２０２１年３月２９日に出願された、日本国特許出願２０２１－５５８０７号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０２１－５５８０７号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明は医薬、機能性食品及び美容製品等の製造に有用である。

Claims (6)

  1. 　植物油中の果実を粉砕する粉砕ステップと、
    　前記粉砕ステップで得られた混合物から抽出油を分離する分離ステップと、
    　を含み、
    　前記果実は、
    　マンダリン類、マンダリン交雑種、シトロン類及びユズ類からなる群から選択される少なくとも１種である、
    　オイル抽出成分の製造方法。
  2. 　前記粉砕ステップでは、
    　１～０．７質量部の前記植物油中で１質量部の前記果実を粉砕する、
    　請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記果実は、
    　コズＢ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｄｅｐｒｅｓｓａ　Ｈａｙａｔａ）、シトロン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｍｅｄｉｃａ　Ｌ．）、シークニン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｄｅｐｒｅｓｓａ　Ｈａｙａｔａ）、クネンボ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｎｏｂｉｌｉｓ　Ｌｏｕｒ．）、シマミカン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｐ．）、キミカン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｆｌａｖｉｃｕｌｐｕｓ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）、バロティンベルガモット（Ｃｉｔｒｕｓ　ｂｅｒｇａｍｉａ　Ｐｏｉｔ．eｔ　Ｔｕｒｐ．）、ロクガツミカン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｏｋｕｇａｔｓｕ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）又はユズ（Ｃｉｔｒｕｓ　ｊｕｎｏｓ　Ｓｉｅｂ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）である、
    　請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記植物油は、
    　トウモロコシ油、オリーブ油、コメ油、ひまし油又はキャノーラ油である、
    　請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　果実のオイル抽出成分を含み、
    　前記果実は、
    　マンダリン類、マンダリン交雑種、シトロン類及びユズ類からなる群から選択される少なくとも１種である、
    　美白剤又は色素沈着症改善剤。
  6. 　果実のオイル抽出成分を含み、
    　前記果実は、
    　マンダリン類、マンダリン交雑種、シトロン類及びユズ類からなる群から選択される少なくとも１種である、
    　美白用経口組成物又は色素沈着症改善用経口組成物。
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