WO2022202043A1 - 細胞培養容器および細胞培養方法 - Google Patents

細胞培養容器および細胞培養方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2022202043A1
WO2022202043A1 PCT/JP2022/007072 JP2022007072W WO2022202043A1 WO 2022202043 A1 WO2022202043 A1 WO 2022202043A1 JP 2022007072 W JP2022007072 W JP 2022007072W WO 2022202043 A1 WO2022202043 A1 WO 2022202043A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
container
cell culture
culture vessel
posture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2022/007072
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
誠太郎 ▲高▼城
真輝 山▲崎▼
清香 日野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyoda Gosei Co Ltd
Original Assignee
Toyoda Gosei Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyoda Gosei Co Ltd filed Critical Toyoda Gosei Co Ltd
Priority to DE112022000594.7T priority Critical patent/DE112022000594T5/de
Priority to US18/547,168 priority patent/US20240124818A1/en
Publication of WO2022202043A1 publication Critical patent/WO2022202043A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/44—Multiple separable units; Modules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/46—Means for fastening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters

Definitions

  • the present disclosure relates to cell culture vessels and cell culture methods.
  • Patent Document 1 a cell culture device equipped with culture membranes for culturing cells on both sides has been known (for example, Patent Document 1).
  • a culture membrane is arranged at one end of an inner cylinder, and the other end of the inner cylinder is open.
  • an instrument such as a pipette is inserted into the inner cylinder, the instrument is inserted from the other end toward the culture membrane.
  • the tip of the device is more likely to come into contact with the cell membrane because the device is inserted into the inner cylinder toward the culture membrane. If the tip of the instrument comes into contact with the cell membrane, the cell membrane may be damaged. Therefore, in the conventional technique, careful manipulation is required so that the tip of the instrument does not come into contact with the cell membrane, which may reduce workability.
  • a cell culture vessel includes a first vessel, a second vessel, and a culture membrane held between the first vessel and the second vessel, and are respectively a first surface having a holding portion for holding the culture membrane, a second surface facing the first surface, and a first surface perpendicular to the first direction from the first surface to the second surface.
  • a first cell and a second cell adjacent to each other in two directions and a partition wall partitioning the first cell and the second cell, the partition wall extending from the first surface toward the second surface; and the second surface, and a communicating portion for communicating the first cell and the second cell, facing the partition wall in the second direction and connecting the second cell together with the second surface a third surface for partitioning, the third surface having an insertion opening formed thereon;
  • the partition wall further comprises a first cell surface that partitions the first cells, and the second cell surface is inclined toward the third surface as the second surface is approached. It may have one cell surface.
  • the air mixed in the liquid placed in the cell culture vessel is lifted by buoyancy. , moves upward along the inclined first cell face.
  • the first cell further has a second cell surface facing the partition wall and extending from the first surface toward the second surface, wherein the second surface may have a second cell surface that slopes away from the third surface as it approaches .
  • the liquid put in the cell culture vessel is tilted by gravity. Move downward along the second cell surface. Since the liquid put into the cell culture vessel accumulates below the second cell surface of the first cell, the liquid can be easily sucked out.
  • at least one of the first vessel and the second vessel further has a fourth surface facing the second cell surface, and the fourth surface is a horizontal surface.
  • a fourth surface may be provided to support the second cell surface so that the second cell surface is inclined with respect to the horizontal direction in the posture of the cell culture vessel installed in the container.
  • the second cell surface is inclined with respect to the horizontal surface. be able to.
  • (6) A cell culture method using the cell culture vessel of the above aspect, wherein the cell culture vessel is arranged in a first posture in which the first cell is positioned below the second cell, and the first a first step of injecting a first cell suspension into the first container through the insertion port of the container; and after the first step, placing the cell culture container above the second container.
  • the cell culture vessel is arranged in a third posture in which the second vessel is positioned above the first vessel, and the second cells contained in the second cell suspension are attached to the culture membrane.
  • co-cultivation can be performed satisfactorily in the cell culture vessel of the above aspect.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of a cell culture vessel;
  • FIG. FIG. 2 is a side view of a cell culture vessel shown in partial cross section.
  • 1 is a flow chart showing the steps of a liquid-air cell culture method. It is a schematic diagram of a cell culture vessel corresponding to the first step. It is a schematic diagram of a cell culture container corresponding to the second step. It is a schematic diagram of a cell culture vessel corresponding to the third step. It is a schematic diagram of a cell culture vessel corresponding to the fourth step. It is a figure which shows a cell culture container in the middle of rotation to a 3rd attitude
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of a cell culture vessel 100.
  • FIG. FIG. 2 is a side view of the cell culture vessel 100 shown in partial cross section.
  • the cross-section shown in FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II--II in FIG. 1 and 2 show an X-axis, a Y-axis, and a Z-axis, which are orthogonal to each other.
  • the cell culture vessel 100 is typically used with the Z direction aligned with the vertical direction.
  • the +Z direction may be referred to as the upward direction
  • the ⁇ Z direction may be referred to as the downward direction.
  • a cell culture vessel 100 includes a culture membrane 10 , a first vessel 20 and a second vessel 40 .
  • the culture membrane 10 is sandwiched between the first vessel 20 and the second vessel 40 and used as an integrated unit.
  • the cell culture vessel 100 is a vessel used for co-culturing cells on both sides of the culture membrane 10 .
  • the first container 20 and the second container 40 have generally plane-symmetrical shapes.
  • the first container 20 and the second container 40 are made of hard resin material, for example. Examples of hard resin materials include polystyrene, polycarbonate, and acrylic resins, and transparent resins are particularly preferred.
  • the culture membrane 10 has a membrane support portion 11 and a cell culture membrane 12.
  • the membrane support portion 11 is an annular frame.
  • a circular cell culture membrane 12 is joined to the membrane supporting portion 11 .
  • the cell culture membrane 12 is a membrane that serves as a scaffold for cell culture when performing cell culture.
  • a porous membrane made of a synthetic polymer or a porous membrane made of a natural polymer having a large number of pores penetrating in the thickness direction of the membrane can be used.
  • porous membranes include track etching membranes, nanofiber membranes, collagen vitrigel membranes, and porous polyurethane membranes.
  • porous polyurethane film examples include a porous polyurethane film manufactured using a manufacturing method comprising a first step and a second step described below.
  • the first step is to form a layer of uncured polyurethane raw material on a substrate.
  • water vapor is supplied to the exposed surface of the polyurethane raw material layer formed on the substrate, which is separated from the substrate, to promote curing of the polyurethane raw material and form a plurality of irregularities in the polyurethane raw material layer. This is a step of forming a porous shape on the exposed surface.
  • the first container 20 is a container having an approximately rectangular parallelepiped outer shape and an internal space.
  • the first container 20 includes a first surface 21 , a second surface 22 , a third surface 23 , a fourth surface 24 , a fifth surface 25 , a sixth surface 26 , a holding portion 28 and an insertion opening 29 . and have The first surface 21 faces the second container 40 when integrated with the second container 40 , and has a holding portion 28 for holding the culture membrane 10 .
  • the holding portion 28 has an annular shape and protrudes in the ⁇ Y direction orthogonal to the first surface 21 with the first surface 21 as a base end.
  • a hole 21 a having a smaller diameter than the inner peripheral surface of the holding portion 28 is formed in the first surface 21 along the inner peripheral surface of the holding portion 28 . Therefore, the internal space of the first container 20 and the outside communicate with each other via the holding portion 28 .
  • the culture membrane 10 is arranged inside the holding part 28 and outside the first surface 21 .
  • the diameter of hole 21 a is smaller than the diameter of the inner peripheral surface of holding portion 28 . Therefore, the first surface 21 protrudes toward the central axis CX of the holding portion 28 in the radial direction with respect to the inner peripheral surface of the holding portion 28 . This restricts the movement of the culture membrane 10 toward the inner space of the first container 20 .
  • the second surface 22 is a surface facing the first surface 21 in the Y direction.
  • the direction from the first surface 21 to the second surface 22 is also called the first direction.
  • the +Y direction is the first direction.
  • the third surface 23 and the fourth surface 24 are surfaces that intersect the first surface 21 and the second surface 22 .
  • two surfaces "intersect" means that the two surfaces intersect each other, the extension surface of one surface intersects the other surface, and the extension surface of the two surfaces intersects It means that it is either a state that intersects with
  • the third surface 23 and the fourth surface 24 are surfaces facing each other in the Z direction.
  • the fifth surface 25 and the sixth surface 26 are surfaces that intersect the first surface 21 , the second surface 22 , the third surface 23 and the fourth surface 24 .
  • the fifth surface 25 and the sixth surface 26 are surfaces facing each other.
  • An insertion opening 29 is provided on the third surface 23 .
  • the insertion port 29 is used when an instrument such as a pipette is inserted into the first container 20 .
  • the insertion port 29 has a cylindrical shape and protrudes in the +Z direction orthogonal to the third surface 23 with the third surface 23 as a base end.
  • a hole is formed in the third surface 23 along the inner peripheral surface of the insertion port 29 . Therefore, the internal space of the first container 20 and the outside communicate with each other through the insertion port 29 .
  • the thickness of the side wall of the insertion port 29 is not uniform, and the outer peripheral surface of the distal end protrudes outward in the radial direction with respect to the outer peripheral surface of the proximal end. This can prevent the first lid 201 from coming off when the first lid 201 described later is attached.
  • the fifth surface 25 is formed with a first locking portion 25a, a second locking portion 25b, and a lid locking portion 25c.
  • the first locking portion 25a and the second locking portion 25b have the same shape.
  • the first locking portion 25a is formed above the center of the fifth surface 25 in the Z direction.
  • the first locking portion 25a is formed on the fifth surface 25 at a position closer to the first surface 21 than the second surface 22 in the Y direction.
  • the first locking portion 25 a has a plate shape elongated in the Y direction, and the base end portion is fixed to the fifth surface 45 .
  • the tip of the first engaging portion 25a protrudes from the edge of the fifth surface 45 in the -Y direction.
  • a claw for engaging with the first locking concave portion 45a of the second container 40 is formed at the tip of the first locking portion 25a. Specifically, the tip of the first locking portion 25a protrudes in the +X direction.
  • the second locking portion 25b is arranged below the first locking portion 25a.
  • the lid locking portion 25c is a convex portion for locking the second lid 202, which will be described later.
  • the position of the lid locking portion 25c in the Z direction is approximately the same as that of the first locking portion 25a.
  • the lid locking portion 25c is formed on the fifth surface 25 at a position closer to the second surface 22 than the first surface 21 in the Y direction.
  • the lid locking portion 25 c has a rectangular shape elongated in the Y direction and protrudes from the fifth surface 25 .
  • the sixth surface 46 also has a first locking portion 26a, a second locking portion 26b, and a lid locking portion 26c.
  • the first locking portion 26a, the second locking portion 26b, and the lid locking portion 26c are respectively arranged with the YZ plane passing through the central axis CX as a plane of symmetry. , and the lid locking portion 25c.
  • Each of the first locking portion 26a, the second locking portion 26b, and the lid locking portion 26c has the same shape as each of the first locking portion 25a, the second locking portion 25b, and the lid locking portion 25c. , the description is omitted.
  • the first container 20 has a first cell 31, a second cell 32, a partition wall 33, and a communicating portion 36 in addition to the above configuration.
  • the first cell 31 and the second cell 32 are spaces formed by dividing the internal space of the first container 20 by the partition wall 33 .
  • the first cell 31 and the second cell 32 are adjacent to each other in the Z direction, which is the second direction perpendicular to the +Y direction, which is the first direction from the first surface 21 to the second surface 22 .
  • the second cell 32 is partitioned by a third surface 23 facing the partition wall 33 in the second direction and a second surface 22 .
  • the partition wall 33 extends in a direction from the first surface 21 toward the second surface 22 with the first surface 21 as a base end.
  • the tip of the partition wall 33 is separated from the second surface 22 .
  • the tip of the partition wall 33 is positioned between the second surface 22 and the central portion CP between the inner surface of the first surface 21 and the inner surface of the second surface 22 in the first direction.
  • the partition wall 33 has a first cell surface 34 and a third cell surface 35 .
  • the first cell 31 further has a second cell surface 37 .
  • the second cell surface 37 is a surface facing the partition walls 33 .
  • the first cell surface 34 and the second cell surface 37 are surfaces that partition the first cell 31 .
  • the first cell surface 34 inclines so as to approach the third surface 23 as it approaches the second surface 22 . Accordingly, as will be described in detail later, when the first cell 31 is filled with liquid, air mixed in the liquid can be easily released.
  • the communicating portion 36 is formed between the partition wall 33 and the second surface 22 and allows the first cell 31 and the second cell 32 to communicate with each other.
  • the communicating portion 36 can also be said to be a gap between the tip of the partition wall 33 and the second surface 22 .
  • the first cell 31 and the second cell 32 communicate with each other only through the communicating portion 36 .
  • the communicating portion 36 is located between the central portion CP and the inner surface of the second surface 22 in the first direction, that is, the +Y direction for the first container 20 .
  • the second cell surface 37 connects the first surface 21 and the fourth surface 24 .
  • the second cell surface 37 is inclined away from the third surface 23 as it approaches the second surface 22 . That is, in the first posture in which the fourth surface 24 is set horizontally and serves as the bottom surface and the third surface 23 is the top surface, the second cell surface 37 is inclined downward as it approaches the second surface 22 . This makes it easier to suck out the liquid contained in the first cell 31, as will be described in detail later. Note that in the first posture, the first cell 31 is positioned below the second cell 32 . In the first posture, the pipette 300 is inserted through the insertion opening 29 and the first cell suspension 401 is injected, as will be described later.
  • a gap is formed between the second cell surface 37 and the fourth surface 24 in this embodiment.
  • the fourth surface 24 is notched in the X-direction central portion, and is formed at the +X-direction end and the ⁇ X-direction end of the first container 20 .
  • the insertion port 29 is projected in the Z direction, which is the second direction orthogonal to the first direction from the first surface 21 to the second surface 22. , are formed at positions overlapping with the communicating portion 36 .
  • an instrument such as the pipette 300 can be inserted from the insertion port 29 through the communicating portion 36 and generally along the second direction, thereby improving workability.
  • the insertion port 29 in the first direction, that is, in the +Y direction for the first container 20, the insertion port 29 is positioned between the central portion CP between the inner surface of the first surface 21 and the inner surface of the second surface 22 when projected. , and the second surface 22 .
  • the second container 40 like the first container 20, has a first surface 41, a second surface 42, a third surface 43, a fourth surface 44, and a fifth surface 45. , a sixth surface 46 , a holding portion 48 , and an insertion opening 49 .
  • the holding portion 48 of the second container 40 differs in size from the holding portion 28 of the first container 20 .
  • the outer diameter of the ring-shaped holding portion 48 is smaller than the inner diameter of the holding portion 28 .
  • the holding portion 48 is covered with the holding portion 28 .
  • the outer diameter of the holding portion 48 is substantially the same as the outer diameter of the culture membrane 10 .
  • the first container 20 and the second container 40 are integrated with the culture membrane 10 sandwiched between the +Y direction end surface of the holding portion 48 and the first surface 21 of the first container 20 inside the holding portion 28. become. Thereby, the culture membrane 10 is held by the first container 20 and the second container 40 .
  • the fifth face 45 is formed with a first engaging recess 45a, a second engaging recess 45b, and a lid engaging portion 45c. Since the lid locking portion 45c has the same configuration as the lid locking portion 25c of the first container 20, description thereof is omitted.
  • the first locking recess 45a and the second locking recess 45b are formed so as to engage the first locking portion 25a and the second locking portion 25a of the first container, respectively. It is formed at a position corresponding to each tip of the portion 25b.
  • the first locking recess 45 a and the second locking recess 45 b have a rectangular shape elongated in the Y direction and are recessed with respect to the fifth surface 25 .
  • the tip of the first locking portion 25a is fitted into the first locking recess 45a, and the tip of the second locking portion 25b is the second locking portion. It fits into the stop recess 45b.
  • the sixth surface 46 also has a first locking recess 46a and a second locking recess 46b corresponding to the first locking portion 26a and the second locking portion 26b of the first container 20. is formed. Then, when the first container 20 and the second container 40 are integrated, the respective tips of the first locking portion 26a and the second locking portion 26b are aligned with the first locking recess 46a and the second locking recess 46a. It fits in each of the locking recesses 46b.
  • first locking portions 25a, 26a and the second locking portions 25b, 26b of the first container 20 and the first locking recesses 45a, 46a and the second locking recesses 45b of the second container 40 are connected to each other.
  • 46b, the first container 20 and the second container 40 are integrated.
  • the engagement between the first container 20 and the second container 40 is released.
  • the first container 20 and the second container 40 can be handled together. Therefore, workability of work using the cell culture vessel 100 can be improved.
  • the first surface 41, the second surface 42, the third surface 43, the fourth surface 44, the fifth surface 45, the sixth surface 46, and the insertion opening 49 are the first surface 21 and the second surface of the first container 20, respectively. Since the configuration is the same as that of the surface 22, the third surface 23, the fourth surface 24, the fifth surface 25, the sixth surface 26, and the insertion opening 29, the description thereof is omitted.
  • the second container 40 has a first cell 51, a second cell 52, a partition wall 53, and a communicating portion 56 in addition to the above configuration.
  • the partition wall 53 has a first cell surface 54 and a third cell surface 55 .
  • the first cell 51 also has a second cell surface 57 .
  • the first cell 51, the second cell 52, the partition wall 53, the communicating portion 56, and the second cell surface 57 are respectively the first cell 31, the second cell 32, the partition wall 33, and the first cell 31 of the first container 20.
  • the configuration is the same as that of the communicating portion 36 and the second cell surface 37, so the description thereof is omitted.
  • FIG. 3 is a flow chart showing the steps of the liquid-air cell culture method using the cell culture vessel 100.
  • FIG. 4 to 10 are schematic diagrams of the cell culture vessel 100 for explaining each step shown in FIG. 4 to 10 show the X-axis, Y-axis, and Z-axis in the mode of use of the cell culture vessel 100.
  • the Z direction indicates the vertical direction
  • the XY plane indicates the horizontal plane.
  • the +Z direction is also called up, and the ⁇ Z direction is also called down.
  • the cell culture container 100 shown in FIG. 4 with the first lid 201 attached to the insertion port 49 of the second container 40 is prepared.
  • the first lid 201 is made of, for example, a soft resin or an elastic material such as an elastomer.
  • Soft resins include LDPE (Low Density Polyethylene) and PP (polypropylene).
  • elastomers include silicone rubbers, polyurethanes, olefinic thermoplastic elastomers, and the like.
  • the first lid 201 has a shape that covers the insertion opening 49 . When attached to the insertion port 49 , the first lid 201 is stretched and attached so as to cover the insertion port 49 . As a result, the end surface of the insertion port 49 in the Z direction is in close contact with the first lid 201, and the second container 40 is kept airtight.
  • the cell culture vessel 100 is placed in a first posture (injection posture) in which the first cell 31 is positioned below the second cell 32.
  • first posture injection posture
  • the first cell suspension 401 is injected into the first container 20 through the insertion port 29 of the first container 20 .
  • First cell suspension 401 contains first cells 402 and a first medium, which is a liquid for first cells 402 .
  • the first cells 402 are seeded on the culture membrane 10 by injecting the first cell suspension 401 .
  • a pipette 300 is used to inject a first cell suspension 401.
  • the pipette 300 is inserted from the insertion port 29 through the communicating portion 36 until the tip reaches the vicinity of the fourth surface 24 .
  • the culture membrane 10 is arranged on the first surface 21 intersecting the fourth surface, and movement of the pipette 300 toward the culture membrane 10 is restricted by the partition wall 33 . Therefore, contact between the pipette 300 and the culture membrane 10 can be suppressed. As a result, damage to the culture membrane 10 can be suppressed.
  • the pipette 300 is used by an operator, but the injection work may be performed automatically using a device or the like without human intervention. According to the cell culture vessel 100 according to this embodiment, movement of the instrument toward the culture membrane 10 is restricted by the partition wall 33 .
  • the insertion port 29 is fitted with the first lid 201 .
  • the cell culture vessel 100 is arranged in a second posture (first fixing posture) in which the first container 20 is positioned above the second container 40 as shown in FIG.
  • the cell culture vessel 100 is maintained in the second posture until the first cells 402 contained in the cell suspension 401 settle on the culture membrane 10 .
  • the second posture is a posture in which the second surface 42 of the second container 40 is the bottom surface and the second surface 22 of the first container 20 is the top surface.
  • the cell culture vessel 100 is rotated from the state of the first posture shown in FIG. 4 to the second posture shown in FIG. Since the insertion port 29 is fitted with the first lid 201 , the outflow of the first cell suspension 401 from the insertion port 29 is suppressed.
  • FIG. 5 the state in which the first cell suspension 401 is contained only in the first cell 31 is depicted. 32 may also contain the first cell suspension 401 .
  • the fixation of the first cells 402 to the culture membrane 10 is promoted. The period until the first cells 402 settle on the culture membrane 10 is, for example, about half a day to one day.
  • the cell culture vessel 100 is placed in the first posture, the cell culture vessel 100 is maintained in the first posture, and the cultivation of the first cells 402 is continued.
  • the cell culture vessel 100 is rotated from the second posture shown in FIG. 5 to the first posture shown in FIG. After that, the first lids 201, 201 attached to the respective insertion openings 29, 49 are removed, and the second lid 202 is attached.
  • the second lid 202 is made of hard resin material. Examples of hard resin materials include polystyrene, polycarbonate, and acrylic resins, and transparent resins are particularly preferred.
  • the second lid 202 is attached to the cell culture vessel 100 so as to cover the insertion openings 29 and 49 .
  • the second lid 202 has a box shape that opens in the -Z direction.
  • the inner peripheral surface of the second lid 202 is formed with four protrusions 202a that protrude inward. Each of the four projecting portions 202a is formed at a position corresponding to each of the lid locking portions 25c, 26c, 45c, and 46c of the cell culture vessel 100 when the second lid 202 is attached to the cell culture vessel 100. ing.
  • each of the four projecting portions 202a abuts on each of the lid engaging portions 25c, 26c, 45c, 46c, and the bottom surface of the second lid 202 is separated from the insertion openings 29, 49.
  • Attachment of the second lid 202 suppresses contamination during culture. Since the second lid 202 is attached to the cell culture vessel 100 while being separated from the end surfaces of the insertion ports 29 and 49, the internal space of the cell culture vessel 100 and the outside are kept in communication. Thereby, the gas in the internal space of the cell culture vessel 100 can be replaced.
  • the cell culture vessel 100 is placed in an incubator adjusted to the target oxygen concentration and carbon dioxide concentration.
  • the first medium is replaced as appropriate, and the first cells 402 are cultured until they become confluent.
  • the culture period is, for example, several days.
  • step P50 of FIG. 3 the second lid 202 is removed, the first culture medium is added to the first cell 31, and the first lid 201 is attached to the insertion port 29.
  • the second cell suspension 403 is injected through the insertion port 49 of the second container 40 into the second container 40 of the cell culture container 100 arranged in the first posture.
  • Second cell suspension 403 contains second cells 404 and a second medium, which is a liquid for second cells 404 .
  • the pipette 300 is used to inject the second cell suspension 403 in the same manner as in the first step P20.
  • the culture membrane 10 is arranged on the first surface 41 intersecting the fourth surface 44 , and movement of the pipette 300 toward the culture membrane 10 is restricted by the partition wall 53 . Therefore, contact between the pipette 300 and the culture membrane 10 can be suppressed.
  • the insertion port 49 is fitted with the first lid 201 .
  • the cell culture vessel 100 is maintained in the third posture until the contained second cells 404 settle on the culture membrane 10 .
  • the third posture is a posture in which the second surface 22 of the first container 20 is the bottom surface and the second surface 42 of the second container 40 is the top surface.
  • FIG. 8 is a diagram showing a state in which the cell culture vessel 100 is being rotated from the first posture to the third posture.
  • a first cell suspension 401 is placed in the first container 20 with a space left above. The air in the space moves above the first container 20 as the cell culture container 100 rotates.
  • the internal space of the first container 20 is not partitioned by the partition wall 33 , the air will move below the culture membrane 10 .
  • the internal space of the first container 20 is partitioned by the partition wall 33 , so air is retained within the second cell 32 .
  • residual air under the culture membrane 10 is suppressed, and the first cells 402 are kept in contact with the first culture medium.
  • the membrane surface of the culture membrane 10 is arranged horizontally, thereby promoting the fixation of the second cells 404 to the culture membrane 10 .
  • the period until the second cells 404 settle on the culture membrane 10 is, for example, about half a day to one day.
  • the cell culture vessel 100 is placed in the first posture, and the cell culture vessel 100 is maintained in the first posture to continue culturing the second cells 404. .
  • the cell culture vessel 100 is rotated from the state of the third posture shown in FIG. 9 to the first posture shown in FIG. After that, the first lids 201, 201 attached to the respective insertion openings 29, 49 are removed, and the second lid 202 is attached.
  • the second medium is appropriately replaced, and the second cells 404 are cultured until they become confluent.
  • the culture period is, for example, several days.
  • the insertion openings 29, 49 are inserted into each of the two TEER electrodes.
  • the cell culture vessel 100 is formed with an insertion port 29 and an insertion port 49 facing each other with the culture membrane 10 interposed therebetween. Therefore, by inserting each of the two TEER electrodes into the insertion port 29 and the insertion port 49, measurement can be easily performed. Note that the measurement of the transepithelial electrical resistance is not limited to the end of the culturing step.
  • the measurement can be performed in a state in which the first medium is injected into the second container 40.
  • FIG. 11 is a flow chart showing steps of a liquid-liquid cell culture method using the cell culture vessel 100 .
  • the same steps as in FIG. 3 are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof will be omitted as appropriate.
  • the first culture medium is injected into the second container 40 with the pipette 300 in step P25.
  • the first cells 402 can be cultured while both surfaces of the cell culture membrane 12 are in contact with the first medium.
  • a second step P30 and a third step P40 are performed, and the first cells 402 are cultured until they become confluent.
  • the first medium is aspirated from the second container 40 using, for example, the pipette 300, and the second cell suspension 403 is injected.
  • Process P65 is also called a fourth process. After that, the first lid 201 is attached to the insertion port 49 .
  • the first culture medium since the second cell surface 57 is inclined, the first culture medium accumulates below the second cell surface 57 . Therefore, the first culture medium can be easily sucked out of the second container 40 .
  • the suction of the first medium may be performed by an aspirator.
  • movement of the instrument toward the culture membrane 10 is restricted by the partition wall 33 . Therefore, high positional accuracy is not required for the operation of the instrument to prevent damage to the culture membrane 10, and the operation can be performed automatically.
  • a fifth step P70 and a sixth step P80 are performed to culture the second cells until they become confluent, and the main culture step ends.
  • the first container 20 includes the partition walls 33 that partition the first cells 31 and the second cells 32
  • the second container 40 includes the first cells 51 and the second cells 52. It has a partition wall 53 that partitions the
  • the partition walls 33 and 53 reduce the possibility of the pipette 300 contacting the culture membrane 10 .
  • the cell culture vessel 100 when the cell culture vessel 100 is projected in a second direction orthogonal to the first direction from the first surface 21 to the second surface 22, at least a part of the insertion port 29 is formed at a position overlapping the communicating portion 36. It is As a result, the pipette 300 can be inserted along the second direction from the insertion port 29 through the communicating portion 36, thereby improving workability.
  • the partition wall 33 also has a first cell surface 34 that slopes toward the third surface 23 as it approaches the second surface 22 .
  • the first cell 31 has a second cell surface 37 that slopes away from the third surface 23 as it approaches the second surface 22 .
  • the cell culture vessel 100 has a fourth surface 24 that supports the second cell surface 37 so as to be inclined with respect to the horizontal direction in the orientation of the cell culture vessel 100 in which the fourth surface 24 is placed on a horizontal surface.
  • the fourth surface 24 of the cell culture vessel 100 is placed on the horizontal surface, and the second cell surface 37 is inclined with respect to the horizontal surface, thereby improving the workability of operations such as sucking out liquid. can.
  • the cell culture method that includes the first step P20 to the sixth step P80 and uses the cell culture vessel 100, it is possible to perform good co-cultivation in the cell culture vessel of the above configuration.
  • both the first container 20 and the second container 40 are formed with the fourth surfaces 24 , 44 .
  • either the fourth surface 24 or the fourth surface 44 may be formed on either one of the first container 20 and the second container 40 . Since the first container 20 and the second container 40 are used in an integrated manner, by having the fourth surface 24 on either one of the first container 20 and the second container 40, the second cell surface 37 , 57 can be maintained at an angle to the horizontal.
  • the second cell surface 37 is inclined all the way to the second surface 22 .
  • the second cell surface 37 may be configured to be inclined halfway to the second surface 22 . Even when a part is inclined, the liquid can be collected in the part, and the liquid can be easily sucked out.
  • the tip of the partition wall 33 is positioned between the central portion CP and the second surface 22 .
  • the tip of the partition wall 33 may be configured to be positioned between the central portion CP and the first surface 21 or in the central portion CP in the first direction.
  • the partition wall 53 is also the same.
  • the partition wall 33 is positioned on a line connecting the tip opening of the insertion port 29 and the culture membrane 10 (an arbitrary portion of the culture membrane 10). By doing so, when a rod-shaped instrument such as a pipette 300 is inserted into the cell culture vessel 100 through the insertion port 29, the partition wall 33 serves as a barrier to prevent the instrument from coming into contact with the culture membrane 10 more reliably. .
  • the present disclosure is not limited to the above-described embodiments, and can be implemented in various configurations without departing from the scope of the present disclosure.
  • the technical features of the embodiments corresponding to the technical features in each form described in the outline of the invention are used to solve some or all of the above problems, or Alternatively, replacements and combinations can be made as appropriate to achieve all. Also, if the technical features are not described as essential in this specification, they can be deleted as appropriate.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

第１容器と、第２容器と、第１容器と、第２容器との間に保持される培養膜と、を備え、第１容器と、第２容器とは、それぞれ、培養膜を保持する保持部を有する第１面と、第１面と対向する第２面と、第１面から第２面に向かう第１方向と直交する第２方向に隣り合う第１セルおよび第２セルと、第１セルと第２セルとを区画する隔壁であって、第１面から第２面へ向かって延びる隔壁と、隔壁と第２面との間に形成された第１セルと第２セルとを連通させる連通部と、隔壁と第２方向において対向し、第２面と共に第２セルを区画する第３面であって、挿入口が形成された第３面と、を備える、細胞培養容器。

Description

細胞培養容器および細胞培養方法
　本開示は、細胞培養容器および細胞培養方法に関する。
　従来、両面において細胞を培養する培養膜を備える細胞培養器具が知られている（例えば、特許文献１）。特許文献１の細胞培養器具は、内筒の一方の端部に培養膜が配置されており、内筒の他方の端部が開放されている。そして、例えばピペットなどの器具が内筒の内部に挿入される際には、他方の端部から、培養膜に向かって、器具が挿入される。
特開２０１５－２０８２８３号公報
　しかしながら、特許文献１に記載の細胞培養器具では、器具が培養膜に向かって内筒に挿入されるため、器具の先端が細胞膜と接触する可能性が高くなる。器具の先端が細胞膜に接触した場合、細胞膜が傷つくおそれが生じる。よって、従来の技術では、器具の先端が細胞膜に接触しないように慎重な操作が要求されるため、作業性が低下するおそれがある。
　本開示は、以下の形態として実現することが可能である。
（１）本開示の一形態によれば、細胞培養容器が提供される。この細胞培養容器は、第１容器と、第２容器と、前記第１容器と、前記第２容器との間に保持される培養膜と、を備え、前記第１容器と、前記第２容器とは、それぞれ、前記培養膜を保持する保持部を有する第１面と、前記第１面と対向する第２面と、前記第１面から前記第２面に向かう第１方向と直交する第２方向に隣り合う第１セルおよび第２セルと、前記第１セルと前記第２セルとを区画する隔壁であって、前記第１面から前記第２面へ向かって延びる隔壁と、前記隔壁と前記第２面との間に形成された前記第１セルと前記第２セルとを連通させる連通部と、前記隔壁と前記第２方向において対向し、前記第２面と共に前記第２セルを区画する第３面であって、挿入口が形成された第３面と、を備える。この形態によれば、ピペットなどの器具が挿入口から挿入される際、ピペットの培養膜への接触の可能性は、隔壁によって低減される。これにより、ピペットが培養膜に接触しないようにピペットの操作を慎重に行う程度を低減できるため、作業性を向上させることができる。
（２）上記形態の細胞培養容器において、前記第２方向に前記細胞培養容器を投影した場合に、前記挿入口の少なくとも一部は、前記連通部と重なる位置に形成されていてもよい。この形態によれば、器具を挿入口から連通部を通るように、第２方向に沿って挿入することができるため、作業性を向上させることができる。
（３）上記形態の細胞培養容器において、前記隔壁は、さらに、第１セルを区画する第１セル面であって、前記第２面に近づくにつれ、前記第３面に近づくように傾斜する第１セル面を有していてもよい。この形態によれば、細胞培養容器が、第２セルに対して第１セルが下方に位置する第１姿勢に配置された場合、細胞培養容器に入れられた液体に混入した空気は、浮力により、傾斜している第１セル面に沿って、上方に移動する。よって、培養膜の下における空気の残留は抑制されるため、培養膜での培養を良好に行うことができる。
（４）上記形態の細胞培養容器において、前記第１セルは、さらに、前記隔壁と対向し、前記第１面から前記第２面に向かって延びる第２セル面であって、前記第２面に近づくにつれ、前記第３面から遠ざかるように傾斜する第２セル面を有していてもよい。この形態によれば、細胞培養容器が、第２セルに対して第１セルが下方に位置する第１姿勢に配置された場合、細胞培養容器に入れられた液体は、重力により傾斜している第２セル面に沿って、下方に移動する。細胞培養容器に入れられた液体は、第１セルの第２セル面の下方に溜まるため、液体を吸い出し易くすることができる。
（５）上記形態の細胞培養容器において、前記第１容器および前記第２容器の少なくとも何れか一方は、さらに、前記第２セル面と対向する第４面であって、前記第４面が水平面に設置された前記細胞培養容器の姿勢において、前記第２セル面が水平方向に対して傾斜するように支持する第４面を備えていてもよい。この形態によれば、細胞培養容器の第４面が水平面に設置されることにより、第２セル面は水平面に対して傾斜した状態となるため、液体の吸い出しなどの作業の作業性を向上させることができる。
（６）上記形態の細胞培養容器を用いた細胞培養方法であって、前記細胞培養容器を前記第２セルに対して前記第１セルが下方に位置する第１姿勢に配置し、前記第１容器の前記挿入口を介して前記第１容器に第１細胞懸濁液を注入する第１工程と、前記第１工程の後に、前記細胞培養容器を前記第１容器が前記第２容器の上方に位置する第２姿勢に配置し、前記第１細胞懸濁液に含まれる第１細胞が前記培養膜に定着するまで前記培養容器を前記第２姿勢に維持する第２工程と、前記第２工程の後に、前記細胞培養容器を前記第１姿勢となるように配置し、前記細胞培養容器を前記第１姿勢に維持して前記第１細胞の培養を継続するための第３工程と、前記第３工程の後に、前記第１姿勢に配置された前記細胞培養容器の前記第２容器に第２細胞懸濁液を前記第２容器の前記挿入口を介して注入する第４工程と、前記第４工程の後に、前記細胞培養容器を前記第２容器が前記第１容器の上方に位置する第３姿勢に配置し、前記第２細胞懸濁液に含まれる第２細胞が前記培養膜に定着するまで前記細胞培養容器を前記第３姿勢に維持する第５工程と、前記第５工程の後に、前記細胞培養容器を前記第１姿勢となるように配置し、前記細胞培養容器を前記第１姿勢に維持して前記第２細胞の培養を継続するための第６工程と、を備えていてもよい。この形態によれば、上記形態の細胞培養容器において、良好に共培養を行うことができる。
細胞培養容器の分解斜視図である。 一部断面にて示す細胞培養容器の側面図である。 液－気細胞培養方法の工程を示すフローチャートである。 第１工程に対応する細胞培養容器の模式図である。 第２工程に対応する細胞培養容器の模式図である。 第３工程に対応する細胞培養容器の模式図である。 第４工程に対応する細胞培養容器の模式図である。 第３姿勢への回転途中の細胞培養容器を示す図である。 第５工程に対応する細胞培養容器の模式図である。 第６工程に対応する細胞培養容器の模式図である。 液－液細胞培養方法の工程を示すフローチャートである。
Ａ．実施形態：
Ａ１．細胞培養容器の構成：
　図１は、細胞培養容器１００の分解斜視図である。図２は、一部断面にて示す細胞培養容器１００の側面図である。図２に示す断面は、図１のＩＩ－ＩＩ線を切断線とする断面図である。図１および図２では、互いに直交する、Ｘ軸と、Ｙ軸と、Ｚ軸とを示している。細胞培養容器１００は、典型的には、Ｚ方向が鉛直方向と沿うように配置されて使用される。以下では、＋Ｚ方向を上方向、－Ｚ方向を下方向として説明する場合がある。細胞培養容器１００は、培養膜１０と、第１容器２０と、第２容器４０とを備える。細胞培養容器１００が細胞培養に用いられる際には、第１容器２０と第２容器４０との間に培養膜１０が挟まれた状態で、一体化されて用いられる。細胞培養容器１００は、培養膜１０の両面に細胞を培養する共培養のために用いられる容器である。第１容器２０と第２容器４０とは、概ね面対称となる形状を有している。第１容器２０および第２容器４０は、例えば、硬質樹脂材料で形成されている。硬質樹脂材料としては、ポリスチレンや、ポリカーボネート、アクリル樹脂等が挙げられ、特に透明な樹脂が好ましい。
　図１に示すように、培養膜１０は、膜支持部１１と、細胞培養膜１２とを有する。膜支持部１１は、円環形状の枠である。そして、膜支持部１１に円形の細胞培養膜１２が接合されている。細胞培養膜１２は、細胞培養を行う際に、細胞培養の足場となる膜である。細胞培養膜１２として、膜の厚み方向に貫通する多数の細孔を有する、合成高分子製の多孔質膜や天然高分子製の多孔質膜を用いることができる。具体的には、多孔質膜として、トラックエッチング膜や、ナノファイバー膜や、コラーゲンビトリゲル膜や、多孔質ポリウレタン膜などが挙げられる。多孔質ポリウレタン膜としては、次に記載する、第１工程および第２工程を備える製造方法を用いて製造された多孔質ポリウレタン膜などが挙げられる。第１工程は、基板上に未硬化であるポリウレタン原料の層を形成する工程である。第２工程は、基板上に形成されたポリウレタン原料の層における基板から離間した露出面に対して水蒸気の供給を行なって、ポリウレタン原料の層において、ポリウレタン原料の硬化を進行させると共に複数の凹凸を露出面に有する多孔質形状を形成させる工程である。
　第１容器２０は、概ね直方体の外形形状を有し、内部空間を有する容器である。第１容器２０は、第１面２１と、第２面２２と、第３面２３と、第４面２４と、第５面２５と、第６面２６と、保持部２８と、挿入口２９と、を有する。第１面２１は、第２容器４０と一体化される際に、第２容器４０と対向する面であり、培養膜１０を保持するための保持部２８を有する。保持部２８は、円環形状であり、第１面２１を基端として、第１面２１と直交する－Ｙ方向に突設されている。そして、第１面２１には、保持部２８の内周面に沿って、保持部２８の内周面の直径よりも直径の小さい孔２１ａが形成されている。したがって、保持部２８を介して、第１容器２０の内部空間と外部とが連通している。図２に示すように、第１容器２０と第２容器４０とが一体化された場合には、保持部２８の内側、かつ、第１面２１の外側に、培養膜１０が配置される。孔２１ａの直径は、保持部２８の内周面の直径よりも小さい。よって、保持部２８の内周面に対して、第１面２１は径方向において保持部２８の中心軸ＣＸに向かって突出している。これにより、培養膜１０の第１容器２０の内部空間側への移動が規制される。
　図１に示すように、第２面２２は、Ｙ方向において、第１面２１と対向する面である。第１面２１から第２面２２へ向かう方向を第１方向とも呼ぶ。本実施形態の第１容器２０においては、＋Ｙ方向が第１方向である。第３面２３および第４面２４は、第１面２１および第２面２２と交差する面である。ここで、２つの面が「交差する」とは、２つの面が相互に交差する状態に加え、一方の面の延長面が他方の面に交差する状態と、２つの面の延長面が相互に交差する状態と、のいずれかの状態であることを意味する。第３面２３と、第４面２４とは、Ｚ方向において互いに対向する面である。第５面２５および第６面２６は、第１面２１と、第２面２２と、第３面２３と、第４面２４と交差する面である。第５面２５と、第６面２６とは、互いに対向する面である。
　第３面２３には、挿入口２９が設けられている。挿入口２９は、ピペットなどの器具が、第１容器２０に挿入される際に用いられる。挿入口２９は、円筒形状を有し、第３面２３を基端として、第３面２３と直交する＋Ｚ方向に突設されている。そして、第３面２３には、挿入口２９の内周面に沿って孔が形成されている。よって、挿入口２９を介して、第１容器２０の内部空間と外部とが連通している。挿入口２９の側壁の厚さは均一ではなく、先端部の外周面が、基端部の外周面に対して、径方向において、外側に突出している。これにより、後述する第１蓋２０１が取り付けられた場合における、第１蓋２０１の脱落を抑制することができる。
　第５面２５には、第１係止部２５ａと、第２係止部２５ｂと、蓋係止部２５ｃとが形成されている。第１係止部２５ａと、第２係止部２５ｂとは、同様の形状を有している。第１係止部２５ａは、Ｚ方向において、第５面２５の中央よりも上側に形成されている。また、第１係止部２５ａは、Ｙ方向において、第２面２２よりも第１面２１に近い位置の第５面２５に形成されている。第１係止部２５ａは、Ｙ方向に長い板形状を有しており、基端部は第５面４５に固定されている。そして、第１係止部２５ａの先端は、第５面４５の－Ｙ方向の端辺から突出している。第１係止部２５ａの先端には、第２容器４０の第１係止凹部４５ａと係合するための爪が形成されている。具体的には、第１係止部２５ａの先端は、＋Ｘ方向に向かって突出している。第２係止部２５ｂは、第１係止部２５ａよりも下方に配置されている。蓋係止部２５ｃは、後述する第２蓋２０２を係止するための凸部である。蓋係止部２５ｃのＺ方向における位置は、第１係止部２５ａと同程度である。また、蓋係止部２５ｃは、Ｙ方向において、第１面２１よりも第２面２２に近い位置の第５面２５に形成されている。蓋係止部２５ｃは、Ｙ方向に長い矩形形状を有し、第５面２５に突設されている。第５面２５と同様に、第６面４６にも、第１係止部２６ａと、第２係止部２６ｂと、蓋係止部２６ｃとが形成されている。第１係止部２６ａ、第２係止部２６ｂ、および蓋係止部２６ｃは、中心軸ＣＸを通るＹＺ平面を対称面として、それぞれ、第１係止部２５ａ、第２係止部２５ｂ、および蓋係止部２５ｃと面対称となる位置に形成されている。第１係止部２６ａ、第２係止部２６ｂ、および蓋係止部２６ｃのそれぞれは、第１係止部２５ａ、第２係止部２５ｂ、および蓋係止部２５ｃのそれぞれと同様の形状を有するため、説明を省略する。
　図２に示すように、第１容器２０は、上記構成の他に、第１セル３１と、第２セル３２と、隔壁３３と、連通部３６とを有する。第１セル３１と第２セル３２とは、第１容器２０の内部空間が隔壁３３により区画されて形成された空間である。第１セル３１および第２セル３２は、第１面２１から第２面２２に向かう第１方向である＋Ｙ方向と直交する第２方向であるＺ方向に隣り合う。第２セル３２は、隔壁３３と第２方向において対向する第３面２３と、第２面２２とにより区画されている。隔壁３３は、第１面２１を基端として、第１面２１から第２面２２へ向かう方向に延びる。そして、隔壁３３の先端は、第２面２２と離れている。本実施形態において、隔壁３３の先端は、第１方向について、第１面２１の内面と第２面２２の内面との中央部ＣＰと、第２面２２との間に位置する。
　隔壁３３は、第１セル面３４と第３セル面３５とを有する。第１セル３１は、さらに第２セル面３７を有する。第２セル面３７は、隔壁３３と対向する面である。第１セル面３４および第２セル面３７は、第１セル３１を区画する面である。第１セル面３４は、第２面２２に近づくにつれ、第３面２３に近づくように傾斜する。これにより、後に詳述するように、第１セル３１に液体が入れられた場合、液体に混入した空気を抜け易くすることができる。
　連通部３６は、隔壁３３と第２面２２との間に形成されており、第１セル３１と第２セル３２とを連通させる。つまり、連通部３６は、隔壁３３の先端と第２面２２との隙間であるとも言える。第１セル３１と第２セル３２とは、連通部３６のみによって連通している。本実施形態では、連通部３６は、第１方向、すなわち第１容器２０については＋Ｙ方向について、中央部ＣＰと第２面２２の内面との間に位置する。
　第２セル面３７は、第１面２１と、第４面２４とを連結する。第２セル面３７は、第２面２２に近づくにつれ、第３面２３から遠ざかるように傾斜する。つまり、第４面２４が水平面に設置され底面となり、第３面２３が上面となる第１姿勢において、第２セル面３７は、第２面２２に近づくにつれ下方に位置するように傾斜する。これにより、後に詳述するように、第１セル３１に入れられた液体を吸い出し易くすることができる。なお、第１姿勢では、第２セル３２に対して第１セル３１が下方に位置する。第１姿勢では、後述するように、挿入口２９からピペット３００が挿入されて第１細胞懸濁液４０１が注入される。
　本実施形態では、第２セル面３７と第４面２４との間には、隙間が形成されている。図１に示すように、第４面２４は、Ｘ方向の中央部分が切り欠かれており、第１容器２０の＋Ｘ方向の端部と、－Ｘ方向の端部とに形成されている。第４面２４が形成されていることにより、細胞培養容器１００の第１姿勢では、第１セル面３４および第２セル面３７が水平面に対して傾斜した状態を容易に維持することができる。
　図２に示すように、挿入口２９の少なくとも一部は、第１面２１から第２面２２に向かう第１方向と直交する第２方向であるＺ方向に細胞培養容器１００を投影した場合に、連通部３６と重なる位置に形成されている。これにより、ピペット３００などの器具を挿入口２９から連通部３６を通るように、概ね第２方向に沿うように挿入することができるため、作業性を向上させることができる。本実施形態では、第１方向、すなわち、第１容器２０については＋Ｙ方向において、挿入口２９は、投影した場合に、第１面２１の内面と第２面２２の内面との中央部ＣＰと、第２面２２との間に位置する。
　図１に示すように、第２容器４０は、第１容器２０と同様に、第１面４１と、第２面４２と、第３面４３と、第４面４４と、第５面４５と、第６面４６と、保持部４８と、挿入口４９と、を有する。第２容器４０の保持部４８は、第１容器２０の保持部２８と、大きさが異なる。具体的には、円環形状である保持部４８の外径は、保持部２８の内径よりも小さい。そして、図２に示すように、第１容器２０と第２容器４０とが一体化された際、保持部４８は保持部２８により覆われる。また、保持部４８の外径は、培養膜１０の外径と略同一である。保持部４８の＋Ｙ方向端面と、第１容器２０の保持部２８より内側の第１面２１との間に培養膜１０が挟まれた状態で、第１容器２０と第２容器４０とが一体化される。これにより、培養膜１０は、第１容器２０と第２容器４０とにより保持される。
　図１に示すように、第５面４５には、第１係止凹部４５ａと、第２係止凹部４５ｂと、蓋係止部４５ｃとが形成されている。蓋係止部４５ｃは、第１容器２０に係る蓋係止部２５ｃと同様の構成であるため、説明を省略する。第１係止凹部４５ａおよび第２係止凹部４５ｂのそれぞれは、第１容器２０と第２容器４０とが一体化された場合に、第１容器の第１係止部２５ａおよび第２係止部２５ｂのそれぞれの先端に対応する位置に形成されている。第１係止凹部４５ａおよび第２係止凹部４５ｂは、Ｙ方向に長い矩形形状を有し、第５面２５に対して凹んでいる。第１容器２０と、第２容器４０とが一体化される際には、第１係止部２５ａの先端が第１係止凹部４５ａに嵌り、第２係止部２５ｂの先端が第２係止凹部４５ｂに嵌る。第６面４６にも、第５面２５と同様に、第１容器２０の第１係止部２６ａおよび第２係止部２６ｂに対応する、第１係止凹部４６ａおよび第２係止凹部４６ｂが形成されている。そして、第１容器２０と、第２容器４０とが一体化される際には、第１係止部２６ａおよび第２係止部２６ｂのそれぞれの先端が、第１係止凹部４６ａおよび第２係止凹部４６ｂのそれぞれに嵌る。このように、第１容器２０の第１係止部２５ａ，２６ａ、第２係止部２５ｂ，２６ｂのそれぞれと、第２容器４０の第１係止凹部４５ａ，４６ａ、第２係止凹部４５ｂ，４６ｂのそれぞれとが係合されることにより、第１容器２０と第２容器４０とが一体化される。例えば、培養膜１０を交換する際は、第１容器２０と第２容器４０との係合を解き、培養を行う場合には、第１容器２０と第２容器４０とを係合させ、第１容器２０と第２容器４０とを一体に扱うことができる。よって、細胞培養容器１００を用いた作業の作業性を向上させることができる。
　第１面４１、第２面４２、第３面４３、第４面４４、第５面４５、第６面４６、および挿入口４９は、それぞれ、第１容器２０の第１面２１、第２面２２、第３面２３、第４面２４、第５面２５、第６面２６、および挿入口２９と同様の構成であるため、説明を省略する。図２に示すように、第２容器４０は、上記構成の他に、第１セル５１と、第２セル５２と、隔壁５３と、連通部５６とを有する。隔壁５３は、第１セル面５４および第３セル面５５を有する。第１セル５１は、さらに、第２セル面５７を有する。第１セル５１と、第２セル５２と、隔壁５３と、連通部５６、第２セル面５７は、それぞれ、第１容器２０の第１セル３１と、第２セル３２と、隔壁３３と、連通部３６、および第２セル面３７と同様の構成であるため、説明を省略する。
Ａ２．細胞培養容器を用いた液－気細胞培養方法：
　細胞培養容器１００を用いた液－気細胞培養方法について説明する。図３は、細胞培養容器１００を用いた細胞の液－気細胞培養方法の工程を示すフローチャートである。図４～図１０は、図３に示す各工程を説明するための細胞培養容器１００の模式図である。図４～図１０には、細胞培養容器１００の使用態様における、Ｘ軸と、Ｙ軸と、Ｚ軸とが示されている。Ｚ方向は、鉛直方向を示し、ＸＹ平面は、水平面を示す。＋Ｚ方向を上、－Ｚ方向を下とも呼ぶ。
　まず図３の工程Ｐ１０にて、図４に示す、第２容器４０の挿入口４９に第１蓋２０１が装着されている細胞培養容器１００が用意される。第１蓋２０１は、例えば、軟質樹脂や、エラストマーなどの弾性を有する材料で作製されている。軟質樹脂としては、ＬＤＰＥ（Low Density Polyethylene）、ＰＰ（polypropylene）を挙げることができる。エラストマーとしては、シリコーンゴム、ポリウレタン、オレフィン系熱可塑性エラストマー等を挙げることができる。第１蓋２０１は、挿入口４９を覆う形状を有する。挿入口４９に取り付けられる際には、第１蓋２０１が引き延ばされて、挿入口４９を覆うように装着される。これにより、挿入口４９のＺ方向の端面は、第１蓋２０１と密着し、第２容器４０は、気密に保たれる。
　図３の第１工程Ｐ２０では、細胞培養容器１００は第２セル３２に対して第１セル３１が下方に位置する第１姿勢（注入姿勢）に配置される。この第１姿勢にて、第１容器２０の挿入口２９を介して第１容器２０に第１細胞懸濁液４０１が注入される。第１細胞懸濁液４０１には、第１細胞４０２と、第１細胞４０２用の液体である第１培地とが含まれている。第１細胞懸濁液４０１が注入されることにより、第１細胞４０２が培養膜１０に播種される。図４に示すように、第１工程Ｐ２０では、ピペット３００を用いて、第１細胞懸濁液４０１が注入される。この際、ピペット３００は、挿入口２９から連通部３６を通り、先端が第４面２４近傍まで挿入される。培養膜１０は、第４面と交差する第１面２１に配置されており、また、ピペット３００の培養膜１０に向かう移動は、隔壁３３により制限される。よって、ピペット３００と培養膜１０との接触を抑制することができる。これにより、培養膜１０の破損を抑制することができる。なお、本実施形態では、作業者によりピペット３００を用いて作業されるが、人の手を介さず、装置などを用いて自動で注入作業が行われてもよい。本実施形態に係る細胞培養容器１００によれば、器具の培養膜１０に向かう移動は、隔壁３３により制限される。このため、培養膜１０を損傷させないための器具の操作に係る高い位置精度は要求されず、自動で行うことができる。これにより、作業時間を短縮することができる。第１細胞懸濁液４０１が注入された後、挿入口２９に第１蓋２０１が装着される。
　図３の第２工程Ｐ３０では、細胞培養容器１００は、図５に示すように第１容器２０が第２容器４０の上方に位置する第２姿勢（第１定着姿勢）に配置され、第１細胞懸濁液４０１に含まれる第１細胞４０２が培養膜１０に定着するまで細胞培養容器１００は第２姿勢に維持される。第２姿勢は、第２容器４０の第２面４２が底面となり、第１容器２０の第２面２２が上面となる姿勢である。
　第２工程Ｐ３０では、細胞培養容器１００は、図４に示す第１姿勢の状態から図５に示す第２姿勢となるように回転される。挿入口２９には、第１蓋２０１が装着されているため、挿入口２９からの第１細胞懸濁液４０１の流出は抑制される。なお、図５では、第１細胞懸濁液４０１が第１セル３１のみに入っている状態が描かれているが、第１細胞懸濁液４０１の量が多い場合などには、第２セル３２にも第１細胞懸濁液４０１が入る場合がある。培養膜１０の膜面が水平方向に配置されることにより、第１細胞４０２の培養膜１０への定着が促される。第１細胞４０２が培養膜１０に定着するまでの期間は、例えば、半日から１日で程度である。
　図３の第３工程Ｐ４０では、細胞培養容器１００は第１姿勢となるように配置され、細胞培養容器１００は第１姿勢に維持され、第１細胞４０２の培養が継続される。第３工程Ｐ４０では、細胞培養容器１００は、図５に示す第２姿勢の状態から、図６に示す第１姿勢となるように回転される。その後、挿入口２９，４９の各々に装着されていた第１蓋２０１，２０１が取り外され、第２蓋２０２が装着される。
　ここで、第２蓋２０２について説明する。第２蓋２０２は、硬質樹脂材料で作製されている。硬質樹脂材料としては、ポリスチレンや、ポリカーボネート、アクリル樹脂等が挙げられ、特に透明な樹脂が好ましい。第２蓋２０２は、挿入口２９，４９を覆うように細胞培養容器１００に装着される。第２蓋２０２は、－Ｚ方向に向かって開放された箱形状を有する。第２蓋２０２の内周面には、内側に向かって突出する４つの突出部２０２ａが形成されている。４つの突出部２０２ａの各々は、第２蓋２０２が細胞培養容器１００に装着された場合に、細胞培養容器１００の蓋係止部２５ｃ，２６ｃ，４５ｃ，４６ｃの各々と対応する位置に形成されている。これにより、４つの突出部２０２ａの各々は、蓋係止部２５ｃ，２６ｃ，４５ｃ，４６ｃの各々と当接し、第２蓋２０２の底面が挿入口２９，４９と離隔した状態で配置される。第２蓋２０２が装着されることにより、培養中のコンタミネーションが抑制される。第２蓋２０２は、挿入口２９，４９の端面と離隔した状態で細胞培養容器１００に装着されるため、細胞培養容器１００の内部空間と、外部とは連通した状態が維持される。これにより、細胞培養容器１００の内部空間の気体の置換を行うことができる。培養中は、細胞培養容器１００は、目標の酸素濃度や二酸化炭素濃度に調整されたインキュベータ内に配置される。適宜、第１培地の交換が行われ、第１細胞４０２がコンフルエントになるまで培養される。培養期間は、例えば、数日程度である。
　図３の工程Ｐ５０では、第２蓋２０２が取り外され、第１セル３１に第１培地が加えられ、挿入口２９に第１蓋２０１が装着される。第４工程Ｐ６０では、第１姿勢に配置された細胞培養容器１００の第２容器４０に第２細胞懸濁液４０３が第２容器４０の挿入口４９を介して注入される。第２細胞懸濁液４０３には、第２細胞４０４と、第２細胞４０４用の液体である第２培地とが含まれている。第２細胞懸濁液４０３が注入されることにより、第２細胞懸濁液４０３に含まれる第２細胞４０４が培養膜１０に播種される。図７に示すように、第４工程Ｐ６０では、第１工程Ｐ２０と同様にピペット３００を用いて第２細胞懸濁液４０３が注入される。培養膜１０は、第４面４４と交差する第１面４１に配置されており、また、ピペット３００の培養膜１０に向かう移動は、隔壁５３により制限される。よって、ピペット３００と培養膜１０との接触を抑制することができる。第２細胞懸濁液４０３が注入された後、挿入口４９に第１蓋２０１が装着される。
　図３の第５工程Ｐ７０にて、細胞培養容器１００は第２容器４０が第１容器２０の上方に位置する第３姿勢（第２定着姿勢）に配置され、第２細胞懸濁液４０３に含まれる第２細胞４０４が培養膜１０に定着するまで、細胞培養容器１００は第３姿勢に維持される。第３姿勢は、第１容器２０の第２面２２が底面となり、第２容器４０の第２面４２が上面となる姿勢である。
　図８は、細胞培養容器１００が、第１姿勢から第３姿勢になるように回転される途中の状態を示す図である。第１容器２０には、上部に空間を残した状態で、第１細胞懸濁液４０１が入れられている。空間の空気は、細胞培養容器１００の回転に応じて、第１容器２０の上方へ移動する。ここで、第１容器２０の内部空間が、隔壁３３により区画されていない場合には、空気は、培養膜１０の下方へ移動してしまう。この点、本実施形態では、第１容器２０の内部空間は、隔壁３３により区画されているため、空気は、第２セル３２内に留められる。これにより、培養膜１０の下方における空気の残留が抑制され、第１細胞４０２は第１培地と接触された状態が確保される。さらに、回転の際に、第１細胞懸濁液４０１に泡が生じた場合にも、泡は第２セル３２に留められる。よって、培養を良好に行うことができる。図９に示す第３姿勢では、培養膜１０の膜面が水平方向に配置されることにより、第２細胞４０４の培養膜１０への定着が促される。第２細胞４０４が培養膜１０に定着するまでの期間は、例えば、半日から１日で程度である。
　図３の第６工程Ｐ８０では、細胞培養容器１００は第１姿勢となるように配置され、細胞培養容器１００は、第１姿勢に維持されることで、第２細胞４０４の培養が継続される。第６工程Ｐ８０では、細胞培養容器１００は、図９に示す第３姿勢の状態から図１０に示す第１姿勢となるように回転される。その後、挿入口２９，４９の各々に装着されていた第１蓋２０１，２０１が取り外され、第２蓋２０２が装着される。第３工程Ｐ４０と同様に、適宜、第２培地の交換が行われ、第２細胞４０４がコンフルエントになるまで培養される。培養期間は、例えば、数日程度である。第２細胞４０４の培養が終了すると、本培養工程は、終了する。
　培養終了後、第１細胞４０２および第２細胞４０４が培養された培養膜１０について、バリヤ性を評価するために、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）が測定される場合には、挿入口２９，４９の各々に２本のＴＥＥＲ電極の各々が挿入される。細胞培養容器１００は、培養膜１０を挟んで対向するように、挿入口２９と挿入口４９とが形成されている。よって、挿入口２９と挿入口４９とに、２本のＴＥＥＲ電極の各々を挿入することで、測定を容易に行うことができる。なお、経上皮電気抵抗が測定されるのは、培養工程の終了後に限られない。例えば、培養膜１０に第１細胞４０２が培養された後、第２容器４０に第１培地が注入された状態で、測定することもできる。すなわち、培養膜１０の片面のみに細胞が培養された状態でも、ＴＥＥＲを測定可能にすることができる。
Ａ３．細胞培養容器を用いた液－液細胞培養方法：
　細胞培養容器１００を用いた液－液細胞培養方法について説明する。図１１は、細胞培養容器１００を用いた細胞の液－液細胞培養方法の工程を示すフローチャートである。図３と同じ工程については、同じ符号を付し、詳細な説明は、適宜省略する。
　第１工程Ｐ２０にて第１容器２０に第１細胞懸濁液４０１が注入された後、工程Ｐ２５では、第２容器４０に第１培地がピペット３００にて注入される。これにより、細胞培養膜１２の両面が、第１培地に接触した状態で、第１細胞４０２の培養を行うことができる。その後、第２工程Ｐ３０と、第３工程Ｐ４０とが行われ、第１細胞４０２がコンフルエントになるまで培養される。工程Ｐ６５では、第２細胞４０４の培養を行うため、第２容器４０から第１培地が例えばピペット３００を用いて吸い出され、第２細胞懸濁液４０３が注入される。工程Ｐ６５を第４工程とも呼ぶ。その後、挿入口４９に第１蓋２０１が装着される。ここで、第２セル面５７は、傾斜しているため、第１培地は、第２セル面５７の下方に溜まる。よって、第２容器４０から第１培地を容易に吸い出すことができる。なお、第１培地の吸い出しは、アスピレーターにより行われてもよい。本実施形態に係る細胞培養容器１００によれば、器具の培養膜１０に向かう移動は、隔壁３３により制限される。このため、培養膜１０を損傷させないための器具の操作に係る高い位置精度は要求されず、自動で行うことができる。その後、第５工程Ｐ７０と、第６工程Ｐ８０とが行われることにより、第２細胞がコンフルエントになるまで培養され、本培養工程は終了する。
　以上、説明した実施形態によれば、第１容器２０は、第１セル３１と第２セル３２とを区画する隔壁３３を備え、第２容器４０は、第１セル５１と第２セル５２とを区画する隔壁５３とを有する。これにより、ピペット３００などが挿入口２９，４９から挿入される際、ピペット３００の培養膜１０への接触の可能性は、隔壁３３，５３によって低減される。これにより、ピペット３００が培養膜１０に接触しないように、ピペット３００の操作を慎重に行う程度を低減できるため、作業性を向上させることができる。また、第１面２１から第２面２２に向かう第１方向と直交する第２方向に細胞培養容器１００を投影した場合に、挿入口２９の少なくとも一部は、連通部３６と重なる位置に形成されている。これにより、ピペット３００を挿入口２９から連通部３６を通るように、第２方向に沿って挿入することができるため、作業性を向上させることができる。また、隔壁３３は、第２面２２に近づくにつれ、第３面２３に近づくように傾斜する第１セル面３４を有している。これにより、細胞培養容器１００が第１姿勢に配置された場合、培養膜１０の下における空気の残留は抑制されるため、培養膜１０での培養を良好に行うことができる。また、第１セル３１は、第２面２２に近づくにつれ、第３面２３から遠ざかるように傾斜する第２セル面３７を有する。これにより、細胞培養容器１００に入れられた液体は、第１セル３１の第２セル面３７の下方に溜まるため、液体を吸い出し易くすることができる。また、細胞培養容器１００は、第４面２４が水平面に設置された細胞培養容器１００の姿勢において、第２セル面３７が水平方向に対して傾斜するように支持する第４面２４を備える。これにより、細胞培養容器１００の第４面２４が水平面に設置されることにより、第２セル面３７は水平面に対して傾斜されるため、液体の吸い出しなどの作業の作業性を向上させることができる。また、上記、第１工程Ｐ２０から第６工程Ｐ８０を備え、細胞培養容器１００を用いる細胞培養方法を用いることにより、上記形態の細胞培養容器において、良好に共培養を行うことができる。
　Ｂ．他の実施形態：
（Ｂ１）上記実施形態では、第１容器２０と第２容器４０との両方に第４面２４，４４が形成されている。これに対して、第１容器２０と第２容器４０とのいずれか一方に第４面２４および第４面４４のいずれかが形成されている構成としてもよい。第１容器２０と第２容器４０とは、一体化されて使用されるため、第１容器２０と第２容器４０とのいずれか一方に第４面２４を有することにより、第２セル面３７，５７を水平面に対して傾斜した状態に維持することができる。
（Ｂ２）上記実施形態では、第２セル面３７は、第２面２２に至るまで傾斜している。これに対して、第２セル面３７は、第２面２２に至る途中まで傾斜している構成としてもよい。一部分が傾斜している場合にも、液体を一部分に集めることができ、液体を吸い出し易くすることができる。
（Ｂ３）上記実施形態では、隔壁３３の先端は、中央部ＣＰと、第２面２２との間に位置する。これに対して、隔壁３３の先端は、第１方向について、中央部ＣＰと第１面２１との間、または、中央部ＣＰに位置する構成としてもよい。隔壁３３の先端位置に拘わらず、隔壁３３があることによって、器具が挿入口２９から挿入される際、器具の培養膜１０への接触の可能性を低減させることができる。隔壁５３についても同様である。ただし、上記実施形態において、挿入口２９と隔壁３３と培養膜１０との位置は以下の位置関係を有することが好ましい。すなわち、挿入口２９の先端開口と培養膜１０（培養膜１０の任意の部分）とを繋ぐ線分上に、隔壁３３が位置していることが好ましい。こうすることで、ピペット３００などの棒状の器具を挿入口２９から細胞培養容器１００内部に挿入した場合に、隔壁３３が障壁となって器具が培養膜１０に接触することをより確実に防止できる。
　本開示は、上述の実施形態に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態の技術的特徴は、上述の課題の一部又は全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部又は全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。
１０…培養膜、１１…膜支持部、１２…細胞培養膜、２０…第１容器、２１，４１…第１面、２１ａ…孔、２２，４２…第２面、２３，４３…第３面、２４，４４…第４面、２５，４５…第５面、２５ａ…第１係止部、２５ｂ…第２係止部、２５ｃ，２６ｃ，４５ｃ，４６ｃ…蓋係止部、２６，４６…第６面、２６ａ…第１係止部、２６ｂ…第２係止部、２８，４８…保持部、２９，４９…挿入口、３１，５１…第１セル、３２，５２…第２セル、３３，５３…隔壁、３４，５４…第１セル面、３５，５５…第３セル面、３６，５６…連通部、３７，５７…第２セル面、４０…第２容器、４５ａ…第１係止凹部、４５ｂ…第２係止凹部、４６ａ…第１係止凹部、４６ｂ…第２係止凹部、１００…細胞培養容器、２０１…第１蓋、２０２…第２蓋、２０２ａ…突出部、３００…ピペット、４０１…第１細胞懸濁液、４０２…第１細胞、４０３…第２細胞懸濁液、４０４…第２細胞、ＣＰ…中央部、ＣＸ…中心軸、Ｐ１０，Ｐ２５，Ｐ５０，Ｐ６５…工程、Ｐ２０…第１工程、Ｐ３０…第２工程、Ｐ４０…第３工程、Ｐ６０…第４工程、Ｐ７０…第５工程、Ｐ８０…第６工程

Claims (6)

  1. 　細胞培養容器であって、
    　第１容器と、
    　第２容器と、
    　前記第１容器と、前記第２容器との間に保持される培養膜と、を備え、
    　前記第１容器と、前記第２容器とは、それぞれ、
    　　前記培養膜を保持する保持部を有する第１面と、
    　　前記第１面と対向する第２面と、
    　　前記第１面から前記第２面に向かう第１方向と直交する第２方向に隣り合う第１セルおよび第２セルと、
    　　前記第１セルと前記第２セルとを区画する隔壁であって、前記第１面から前記第２面へ向かって延びる隔壁と、
    　　前記隔壁と前記第２面との間に形成された前記第１セルと前記第２セルとを連通させる連通部と、
    　　前記隔壁と前記第２方向において対向し、前記第２面と共に前記第２セルを区画する第３面であって、挿入口が形成された第３面と、を備える、細胞培養容器。
  2. 　請求項１に記載の細胞培養容器であって、
    　前記第２方向に前記細胞培養容器を投影した場合に、前記挿入口の少なくとも一部は、前記連通部と重なる位置に形成されている、細胞培養容器。
  3. 　請求項１または２に記載の細胞培養容器であって、
    　前記隔壁は、さらに、
    　前記第１セルを区画する第１セル面であって、前記第２面に近づくにつれ、前記第３面に近づくように傾斜する第１セル面を有する、細胞培養容器。
  4. 　請求項１から３の何れか一項に記載の細胞培養容器であって、
    　前記第１セルは、さらに、
    　前記隔壁と対向し、前記第１面から前記第２面に向かって延びる第２セル面であって、前記第２面に近づくにつれ、前記第３面から遠ざかるように傾斜する第２セル面を有する、細胞培養容器。
  5. 　請求項４に記載の細胞培養容器であって、
    　前記第１容器および前記第２容器の少なくとも何れか一方は、さらに、
    　前記第２セル面と対向する第４面であって、前記第４面が水平面に設置された前記細胞培養容器の姿勢において、前記第２セル面が水平方向に対して傾斜するように支持する第４面を備える、細胞培養容器。
  6. 　請求項１から５の何れか一項に記載の細胞培養容器を用いた細胞培養方法であって、
    　前記細胞培養容器を前記第２セルに対して前記第１セルが下方に位置する第１姿勢に配置し、前記第１容器の前記挿入口を介して前記第１容器に第１細胞懸濁液を注入する第１工程と、
    　前記第１工程の後に、前記細胞培養容器を前記第１容器が前記第２容器の上方に位置する第２姿勢に配置し、前記第１細胞懸濁液に含まれる第１細胞が前記培養膜に定着するまで前記細胞培養容器を前記第２姿勢に維持する第２工程と、
    　前記第２工程の後に、前記細胞培養容器を前記第１姿勢となるように配置し、前記細胞培養容器を前記第１姿勢に維持して前記第１細胞の培養を継続するための第３工程と、
    　前記第３工程の後に、前記第１姿勢に配置された前記細胞培養容器の前記第２容器に第２細胞懸濁液を前記第２容器の前記挿入口を介して注入する第４工程と、
    　前記第４工程の後に、前記細胞培養容器を前記第２容器が前記第１容器の上方に位置する第３姿勢に配置し、前記第２細胞懸濁液に含まれる第２細胞が前記培養膜に定着するまで前記細胞培養容器を前記第３姿勢に維持する第５工程と、
    　前記第５工程の後に、前記細胞培養容器を前記第１姿勢となるように配置し、前記細胞培養容器を前記第１姿勢に維持して前記第２細胞の培養を継続するための第６工程と、を備える、細胞培養方法。
PCT/JP2022/007072 2021-03-25 2022-02-22 細胞培養容器および細胞培養方法 Ceased WO2022202043A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE112022000594.7T DE112022000594T5 (de) 2021-03-25 2022-02-22 Zellkulturbehälter und zellkulturverfahren
US18/547,168 US20240124818A1 (en) 2021-03-25 2022-02-22 Cell culture container and cell culture method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-050919 2021-03-25
JP2021050919A JP7452481B2 (ja) 2021-03-25 2021-03-25 細胞培養容器および細胞培養方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022202043A1 true WO2022202043A1 (ja) 2022-09-29

Family

ID=83397053

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/007072 Ceased WO2022202043A1 (ja) 2021-03-25 2022-02-22 細胞培養容器および細胞培養方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20240124818A1 (ja)
JP (1) JP7452481B2 (ja)
DE (1) DE112022000594T5 (ja)
WO (1) WO2022202043A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5583037A (en) * 1995-03-30 1996-12-10 Becton, Dickinson And Company Trans-membrane co-culture insert and method for using
JP2015208283A (ja) * 2014-04-28 2015-11-24 豊田合成株式会社 細胞培養器具
JP2018064519A (ja) * 2016-10-20 2018-04-26 高砂電気工業株式会社 灌流培養装置及び灌流培養方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05219934A (ja) * 1992-02-04 1993-08-31 Shibata Hario Glass Kk 混合培養解析装置
JP6751587B2 (ja) 2016-04-28 2020-09-09 株式会社アルバック 培養装置及び培養方法
WO2019026284A1 (ja) 2017-08-04 2019-02-07 株式会社ギンレイラボ 細胞培養容器、フィルター、フィルター切抜き用シート、及びフィルターの製造方法
JP7061356B2 (ja) 2018-02-28 2022-04-28 国立大学法人横浜国立大学 培養装置、２種類以上の細胞構造体を構築する方法及びオンチップ臓器デバイス
JP7223311B2 (ja) 2018-08-21 2023-02-16 ウシオ電機株式会社 細胞培養チップ、及びこれを用いた細胞培養方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5583037A (en) * 1995-03-30 1996-12-10 Becton, Dickinson And Company Trans-membrane co-culture insert and method for using
JP2015208283A (ja) * 2014-04-28 2015-11-24 豊田合成株式会社 細胞培養器具
JP2018064519A (ja) * 2016-10-20 2018-04-26 高砂電気工業株式会社 灌流培養装置及び灌流培養方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022149006A (ja) 2022-10-06
US20240124818A1 (en) 2024-04-18
JP7452481B2 (ja) 2024-03-19
DE112022000594T5 (de) 2023-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11905506B2 (en) Multilayered cell culture apparatus
JP2573793B2 (ja) 培養容器
US7771991B2 (en) Cell cultivating flask
US7078228B2 (en) Cell cultivating flask
JP7505431B2 (ja) 細胞培養容器および細胞培養方法
WO2022202043A1 (ja) 細胞培養容器および細胞培養方法
JP5161929B2 (ja) 培養装置
JP2023091889A (ja) 細胞培養器具および細胞培養方法
JP2020150819A (ja) 収納容器

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22774843

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18547168

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 112022000594

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22774843

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1