WO2022181798A1 - 成長因子混合物を調整する方法 - Google Patents

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WO2022181798A1
WO2022181798A1 PCT/JP2022/008038 JP2022008038W WO2022181798A1 WO 2022181798 A1 WO2022181798 A1 WO 2022181798A1 JP 2022008038 W JP2022008038 W JP 2022008038W WO 2022181798 A1 WO2022181798 A1 WO 2022181798A1
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platelet
rich plasma
growth factor
centrifugation
blood
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PCT/JP2022/008038
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景真 上野
Original Assignee
株式会社同仁がん免疫研究所
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present disclosure relates to methods for preparing growth factor mixtures.
  • PRP therapy in which plasma containing a large number of platelets (platelet-rich plasma, PRP) is separated from blood and injected into the affected area.
  • PRP therapy uses platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), and epidermal growth factor (EGF) contained in platelets. ) and other growth factors to enhance healing power.
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • FGF fibroblast growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • the growth factor mixture obtained by further concentrating and activating this platelet-rich plasma and recovering platelet-derived components from the concentrated and activated platelet-rich plasma is highly safe because it is decellularized. It is highly convenient because it is already concentrated and activated. Therefore, it is expected as a promising material in the field of regenerative medicine.
  • the present disclosure provides: (Item 1) A method for preparing a growth factor mixture from blood, comprising: A step of subjecting the blood to a first centrifugation treatment and recovering the supernatant; subjecting the supernatant to a second centrifugation process to obtain platelet-rich plasma; a step of subjecting the platelet-rich plasma to a treatment for activating platelets; obtaining a growth factor mixture from the platelet-rich plasma with activated platelets; A method, including (Item 1a) The method according to any of the preceding items, wherein the supernatant contains leukocytes. (Item 1b) The method according to any one of the above items, wherein the platelet-rich plasma is leukocyte-containing platelet-rich plasma.
  • (Item 2) The method according to any one of the above items, wherein the first centrifugation treatment and the second centrifugation treatment are performed under the same conditions.
  • the first centrifugation treatment and the second centrifugation treatment are performed at about 100 G to about 3000 G for about 2 to about 30 minutes at room temperature.
  • Method. The method according to any one of the above items, wherein the first centrifugation treatment and the second centrifugation treatment are performed at about 940 G for about 15 minutes at about 24°C.
  • the activating treatment includes adding an agent that activates platelets to the platelet-rich plasma.
  • the platelet-activating agent comprises calcium chloride.
  • the growth factor mixture is not lyophilized.
  • the step of obtaining the growth factor mixture comprises removing cells from the platelet-rich plasma in which platelets have been activated.
  • removing cells from the platelet-rich plasma includes filtering.
  • a method comprising administering an effective amount.
  • (Item A2) A method for treating a disease, disorder or condition in a subject, the method comprising: obtaining blood from the subject; a step of subjecting the blood to a first centrifugation treatment and recovering the supernatant; subjecting the supernatant to a second centrifugation process to obtain platelet-rich plasma; a step of subjecting the platelet-rich plasma to a treatment for activating platelets; obtaining a growth factor mixture from the platelet-rich plasma with activated platelets; administering to said subject a therapeutically effective amount of said growth factor mixture.
  • a method for treating a disease, disorder or condition in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a growth factor mixture, the growth factor mixture comprising: A step of subjecting the blood to a first centrifugation treatment and recovering the supernatant; subjecting the supernatant to a second centrifugation process to obtain platelet-rich plasma; a step of subjecting the platelet-rich plasma to a treatment for activating platelets; obtaining a growth factor mixture from the platelet-rich plasma with activated platelets; A method prepared by a method comprising: (Item A4) A method for treating a disease, disorder or condition in a subject, the method comprising: obtaining blood from the subject; a step of subjecting the blood to a first centrifugation treatment and recovering the supernatant; subjecting the supernatant to a second centrifugation process to obtain platelet-rich plasma; a step of subjecting the platelet-rich plasma to a treatment for activating platelets; and administering to
  • (Item A5) A method for treating a disease, disorder, or condition in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of platelet-rich plasma, the platelet-rich plasma comprising: A step of subjecting the blood to a first centrifugation treatment and recovering the supernatant; subjecting the supernatant to a second centrifugation process to obtain platelet-rich plasma; a step of subjecting the platelet-rich plasma to a treatment for activating platelets; A method prepared by a method comprising: (Item A6) A method according to any one of items A1-A5 comprising the features of the method according to any one of items 1-12a. (Item B1) A growth factor mixture prepared by the method according to any one of the preceding items.
  • a blood-derived growth factor mixture comprising: A step of subjecting the blood to a first centrifugation treatment and recovering the supernatant; subjecting the supernatant to a second centrifugation process to obtain platelet-rich plasma; a step of subjecting the platelet-rich plasma to a treatment for activating platelets; obtaining a growth factor mixture from the platelet-rich plasma with activated platelets;
  • a growth factor mixture prepared by a method comprising: (Item B3) A growth factor mixture prepared by the method of any of the preceding items for treating a disease, disorder or condition of interest.
  • a blood-derived growth factor mixture for treating a disease, disorder or condition in a subject comprising: A step of subjecting the blood to a first centrifugation treatment and recovering the supernatant; subjecting the supernatant to a second centrifugation process to obtain platelet-rich plasma; a step of subjecting the platelet-rich plasma to a treatment for activating platelets; obtaining a growth factor mixture from the platelet-rich plasma with activated platelets;
  • a group of growth factors can be efficiently recovered from platelet-rich plasma and activated, which is useful in the medical field.
  • it since it is acellular, it is possible to avoid legal restrictions such as the Regenerative Medicine Safety Assurance Act, which is highly convenient.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a series of flows from blood collection to production of a growth factor mixture in one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a series of flows from blood collection to production of a growth factor mixture in another embodiment of the present disclosure.
  • growth factor mixture refers to any mixture of growth factors, typically including platelet-derived cytokines and other growth factors.
  • a mixture of growth factors is not particularly limited, as long as two or more elements coexist in a natural state, and does not have to be produced by an operation of actively mixing. good too.
  • platelet-rich plasma refers to a plasma concentrate containing more platelets than normal plasma, and can be obtained by centrifuging plasma in blood.
  • the concentration of platelets is about one or more times that of blood (whole blood), typically about two to about seven times.
  • Platelet-rich plasma has a concentration of, for example, about 10 ⁇ 10 4 / ⁇ L or more, about 25 ⁇ 10 4 / ⁇ L or more, about 50 ⁇ 10 4 / ⁇ L or more, or preferably about 100 ⁇ 10 4 / ⁇ L or more. of platelets.
  • platelet-rich plasma is also typically rich in growth factors such as PDGF, TGF- ⁇ , VEGF, EGF, FGF, IGF, or HGF.
  • the term "platelet-rich plasma containing leukocytes" refers to the above-described platelet-rich plasma containing leukocytes.
  • activation of platelets refers to a series of reactions that occur in platelets during bleeding, equivalent reactions, or partial reactions. A large number of long projections appear and form a shape like a confetti, or growth factors produced in platelets are released outside platelets, or growth factors stored inside platelets are released outside platelets. Say things.
  • a method of preparing a growth factor mixture from blood comprising the steps of subjecting the blood to a first centrifugation treatment and recovering the supernatant; a step of centrifuging to obtain platelet-rich plasma; a step of subjecting the platelet-rich plasma to platelet activation processing; and a step of obtaining a growth factor mixture from the platelet-rich plasma with activated platelets.
  • a method comprising: The method of the present disclosure is useful as a technique for providing promising materials in the field of regenerative medicine.
  • the supernatant can contain leukocytes.
  • the leukocyte-containing supernatant preferably contains leukocytes at a concentration of about 1.5 times or more than whole blood, but is not so limited.
  • the platelet-rich plasma can be leukocyte-containing platelet-rich plasma.
  • the leukocyte-containing platelet-rich plasma preferably contains leukocytes at a concentration of about 5 times or more that of whole blood, but is not limited thereto.
  • the first centrifugation treatment for blood and the second centrifugation treatment for the supernatant obtained by this first centrifugation treatment are preferably performed under the same conditions.
  • the first or second centrifugation process can be about 100 to about 3000G centrifugation, preferably about 500 to about 1000G, or about 940G.
  • Treatment times can be from about 2 to about 30 minutes, preferably from about 5 to about 20 minutes, or about 15 minutes.
  • Centrifugation of blood and supernatant is preferably performed at room temperature, for example, at about 20°C to about 27°C, more preferably at about 24°C.
  • the supernatant By subjecting the blood (whole blood) to the first centrifugation treatment as described above, the supernatant can be separated, and by subjecting the supernatant to the second centrifugation treatment , platelet-rich plasma can be separated.
  • the first centrifugation process and the second centrifugation process can also be performed multiple times as needed.
  • the step of subjecting the platelet-rich plasma collected as described above to a treatment for activating platelets is performed by adding an agent that activates platelets to the platelet-rich plasma.
  • an agent that activates platelets can also When platelets are activated in this manner, a large number of platelet-derived growth factors are released and activated.
  • the treatment to activate platelets may be drug-free.
  • a method using cold stimulation a method using ultrasonic treatment, a method of attaching platelets to a substrate, and the like may be used.
  • the cold stimulation temperature in this case may be about 0° C. or higher, preferably about 4° C. or higher, and the like.
  • Agents that activate platelets are not particularly limited, but calcium ion source compounds such as calcium chloride, calcium phosphate, calcium lactate, and calcium carbonate can be used, and platelets are activated by the presence of calcium ions. be.
  • the agent that activates platelets can be added as a solution, and its concentration is not particularly limited, but for example about 1% by mass or more, about 1.5% by mass or more, about It can be 2 wt% or more, about 2.5 wt% or more. In one embodiment, the amount added is not particularly limited. about 0.2 times or more, about 0.25 times or more, about 0.3 times or more by volume.
  • the step of obtaining a growth factor mixture from the platelet-rich plasma with activated platelets can include a process of removing cells from the platelet-activated platelet-rich plasma.
  • removal of cells is not particularly limited as long as it can remove cells from platelet-rich plasma, and filtering treatment can be preferably used.
  • the filtering process removes various cells such as leukocytes, platelets, and erythrocytes contained in the platelet-rich plasma, and the membrane pore size can be appropriately set according to the size of the cells to be removed.
  • filters with multiple membrane pore sizes can be used as needed, and these can be combined and filtered multiple times to remove cells other than platelets.
  • a membrane filter with a pore size of about 5 ⁇ m or less, about 1 ⁇ m or less, about 0.7 ⁇ m or less, about 0.5 ⁇ m or less, about 0.3 ⁇ m or less can be used, and filters cells to be removed. Anything that can be done is good.
  • filtering can be performed by centrifugation, and various cells such as platelets and leukocytes can be removed by centrifuging the platelet-rich plasma using the filter described above.
  • the conditions for the centrifugation treatment the same conditions as those for the first centrifugation treatment and the second centrifugation treatment can be employed.
  • the growth factor mixture and the cell-free plasma in the preceding stage thereof contain substantially no cells (particularly platelets) or no cells at all can be demonstrated, for example, by confirming no cells larger than 1 ⁇ m using a cell counter. . Alternatively, it may be verified by not observing platelets using a hemocytometer, a hemocytometer, or the like. It is sufficient if it can be confirmed by any means that it does not contain platelets.
  • the growth factor mixture can be made substantially cell-free. Therefore, conventional platelet-rich plasma contains cells and is subject to various legal restrictions. However, the growth factor mixture of the present disclosure does not contain cells, so it can be used as a material for regenerative medicine without restrictions. can be used.
  • the supernatant containing fibrinogen and/or albumin can also be removed after performing the second centrifugation treatment as described above.
  • precipitated (separated) blood cells can be suspended in a small amount of PBS (phosphate-buffered saline) to obtain a blood cell suspension (platelet-rich plasma).
  • a platelet-activating agent, such as those described above, is then added to this suspension.
  • fibrinogen is less than about 10 mg/mL, less than about 7 mg/mL in the growth factor mixture finally obtained by the method of the present disclosure by removing fibrinogen and/or albumin as described above. , less than about 5 mg/mL, less than about 4 mg/mL, less than about 3 mg/mL, less than about 2 mg/mL, less than about 1 mg/mL, and albumin is substantially removed at levels less than about 50 mg/mL, about It can be substantially removed at levels less than 40 mg/mL, less than about 37 mg/mL, less than about 30 mg/mL, less than about 20 mg/mL, or less than about 10 mg/mL.
  • the growth factor mixture obtained by removing cells as described above can be used without being freeze-dried.
  • the growth factor mixture obtained by the method of the present disclosure can contain growth factors contained in normal platelet-rich plasma.
  • growth factors include PDGF, TGF- ⁇ , VEGF, EGF, FGF, IGF, HGF and the like.
  • a growth factor mixture of the present disclosure can contain at least these factors.
  • various components can be included, for example, in the following ranges.
  • PDGF about 1 to about 400 ng/mL (PDGF-BB)
  • TGF- ⁇ about 2000 to about 12000 pg/mL
  • EGF about 5 to about 60 pg/mL
  • FGF about 500 to about 3200 pg/mL
  • FGF-4 VEGF: about 10 to about 2000 pg/mL
  • IGF about 250 to about 6000 pg/mL
  • PDGF about 50 to about 400 ng/mL (PDGF-BB)
  • TGF- ⁇ about 2000 to about 12000 pg/mL
  • EGF about 5 to about 60 pg/mL
  • FGF about 500 to about 3200 pg/mL
  • FGF-4 VEGF: about 10 to about 800 pg/mL
  • IGF about 250 to about 6000 pg/mL
  • the growth factor mixture obtained by the method of the present disclosure may be free or substantially free of fibrinogen and/or albumin.
  • Fibrinogen about 0 to about 10 mg/mL, about 0 to about 7 mg/mL, or about 0 to about 5 mg/mL
  • Albumin about 0 to about 50 mg/mL, about 0 to about 40 mg/mL, about 0 to about 30 mg/mL, about 0 to about 20 mg/mL, or about 0 to about 10 mg/mL
  • the above about 0 can be the lowest detectable value at the limit of detection, such as about 0.0001 mg/mL.
  • fibrinogen and/or albumin are included, the following concentrations are acceptable.
  • Fibrinogen about 0.0001 mg/mL to about 10 mg/mL, about 0.0001 mg/mL to about 7 mg/mL, or about 0.0001 mg/mL to about 5 mg/mL
  • Albumin about 0.0001 mg/mL to about 50 mg/mL, about 0.0001 mg/mL to about 40 mg/mL, about 0.0001 mg/mL to about 30 mg/mL, about 0.0001 mg/mL to about 20 mg/mL, or from about 0.0001 mg/mL to about 10 mg/mL
  • the tissue to be administered with the growth factor mixture obtained by the method of the present disclosure is not particularly limited, and can be administered to joints and muscle tendons.
  • the growth factor mixtures of the present disclosure can be stored at - about 80°C to about 25°C, and can be stored at room temperature from about 20°C to about 25°C when used.
  • the sequential flow of the method of the present disclosure may be as follows. That is, after blood collection, the first centrifugation is performed at about 2000 rpm (980 g) for 15 minutes at 20-25° C., the upper 1/2-2/3 of the serum is discarded, and the middle layer is collected. At this time, erythrocytes can be excluded using a lymphocyte separation liquid, a BD Vacutainer CPT blood collection tube, or the like. After that, about 10 ml is collected in a centrifuge tube, diluted by adding PBS so as to reduce fibrin, and subjected to a second centrifugation at about 2000 rpm (980 g) for 15 minutes at 20-25°C. Discard the supernatant, add PBS or 2% CaCl 2 if necessary, mix well, and activate platelets and release growth factors at 20-25°C.
  • the solution can then be further centrifuged at about 2000 rpm (980 g) for 2 minutes at 20-25° C. if not freeze-thawed.
  • filter treatment or the like may be performed to remove cells other than platelets (white blood cells and red blood cells) before freezing. Freeze at -80°C for 30 minutes or more. After thawing, it can be centrifuged at 14000 rpm, 5 minutes, 20-25°C.
  • the supernatant after centrifugation is filtered through a filter of about 0.45 ⁇ m, and VEGF, fibrinogen, albumin, etc. can be measured in this solution. It can also be confirmed to be free of cells and growth factor mixtures of the present disclosure.
  • a growth factor mixture or platelet-rich plasma of the present disclosure can be used to treat a disease, disorder, or condition in a subject.
  • a growth factor mixture or platelet-rich plasma of the present disclosure can be prepared using blood obtained from a subject and administered to the subject in a therapeutically effective amount to treat a disease, disorder or condition in that subject.
  • treatment with the growth factor mixture or platelet-rich plasma of the present disclosure is adjusted according to the state and type of disease, patient's condition, patient's wishes, etc. can be done.
  • two injections one injection is an arbitrary fixed amount
  • one injection may be administered to both legs.
  • one or more can be additionally administered.
  • treatment with a growth factor mixture or platelet-rich plasma of the present disclosure can also be used to treat joints, including knees, e.g., knee osteoarthritis, hip osteoarthritis, meniscus It can be used to treat injuries, ligament injuries, knee joint pain, and the like.
  • the growth factor mixture or platelet-rich plasma of the present disclosure is used in body tissues such as skin, bone, ligaments, Achilles tendon, tenosynovitis, alveolar bone, meniscus, ovary, endometrium, cornea, and other soft tissues. It can also be used for regenerative therapy.
  • the growth factor mixture or platelet-rich plasma of the present disclosure can be used to promote wound healing (early healing), relieve pain, assist healing of surgical wounds, and the like.
  • the growth factor mixture or platelet-rich plasma of the present disclosure can also be used for cosmetic purposes such as hair thinning treatment. can be adjusted.
  • the growth factor mixture or platelet-rich plasma of the present disclosure is administered for cosmetic purposes, for example, one dose every other week, or two doses every month, repeated 2-3 times. can also
  • Short Protocols in Molecular Biology A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.; M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.; A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.; M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Supplementary Volume Experimental Medicine "Gene Introduction & Expression Analysis Experimental Method” Yodosha, 1997, etc., and these are the relevant parts (may be all) of this specification. is incorporated by reference.
  • FIG. 1 shows a series of steps from blood collection to production of the growth factor mixture.
  • blood was collected (four blood collection tubes/about 40 mL) at a clinic.
  • four heparin blood collection tubes (Venoject II vacuum blood collection tube (sterilized), containing heparin sodium) were used.
  • BD Vacutainer CPT can also be used in place of the heparin blood collection tube.
  • the mixture was gently inverted about 10 times and transported under refrigeration. At this time, the blood can also be pre-chilled at 0-10° C. for 0-72 hours.
  • the blood was returned to room temperature as soon as it arrived at the cell processing facility.
  • Four heparin blood collection tubes were centrifuged using a tabletop multi-tube centrifuge H-40F (swing rotor: RF-121-S/manufactured by Kokusan Co., Ltd.) (first centrifugation: 940 G, 15 minutes, 20-25°C).
  • first centrifugation 1500G, 15 minutes.
  • the supernatant (plasma + leukocyte layer) was collected in a 50 mL centrifuge tube (manufactured by Corning) to obtain W-PRP (WBC-containing platelet-rich plasma; leukocyte-containing platelet-rich plasma).
  • W-PRP WBC-containing platelet-rich plasma; leukocyte-containing platelet-rich plasma.
  • This leukocyte-containing platelet-rich plasma was subjected to the second centrifugation (940 G, 15 minutes, 20 to 25°C) using a tabletop multiple rack centrifuge H-40F (swing rotor: RF-121-S/manufactured by Kokusan Co., Ltd.). did When using BD Vacutainer CPT, second centrifugation: 1500 G, 15 minutes.
  • the supernatant was removed (precipitate + supernatant 0.6 mL or less), and PBS (-) was added so that the total volume was 3.6 mL.
  • An additional 0.9 mL of 2% CaCl 2 was added (Nipro Calcium Chloride Injection 2% "NP"). The mixture was well stirred to activate platelets and release growth factors (20 min, 20-25° C.).
  • a 5 mL or 10 mL syringe was filled with the activated leukocyte-containing platelet-rich plasma solution, and acellular filtering was performed.
  • a cell-free filter Minisart pore size 0.45 ⁇ m (manufactured by Sartorius) was used.
  • FIG. 2 shows a series of steps from blood collection to production of the growth factor mixture.
  • blood was collected (three blood collection tubes/about 30 mL) at a clinic.
  • three heparin blood collection tubes (BD Vacutainer blood collection tube, containing heparin sodium) were used.
  • BD Vacutainer CPT can also be used in place of the heparin blood collection tube.
  • the mixture was gently inverted about 20 times and transported under refrigeration. At this time, the blood can also be pre-chilled at 0-15° C. for 0-72 hours.
  • Blood was brought to room temperature upon arrival at the cell processing facility. Transfer 30 mL of blood from three heparin collection tubes to one lymphocyte separation tube containing lymphocyte separation solution (Leucosep (trademark) blood volume 30 mL, manufactured by Greiner Japan), and centrifuge LCX-100 (Tomy Seiko Co., Ltd.) was used to centrifuge one lymphocyte separation tube (first centrifugation: 1200 G, 15 min, 15 to 25° C.). If BD Vacutainer CPT is used, centrifugation (first centrifugation: 1500 G, 15 minutes) may be performed without transferring to a lymphocyte separation tube.
  • lymphocyte separation solution Leucosep (trademark) blood volume 30 mL, manufactured by Greiner Japan
  • centrifuge LCX-100 Tomy Seiko Co., Ltd.
  • -PRP WBC-containing platelet-rich plasma; leukocyte-containing platelet-rich plasma
  • This leukocyte-containing platelet-rich plasma was subjected to a second centrifugation (1200 G, 15 min, 15-25°C) using a tabletop multi-centrifuge LCX-100 (manufactured by Tomy Seiko) (BD Vacutainer CPT was used. second centrifugation: 1500 G, 15 min).
  • the supernatant was removed (precipitate + supernatant 1.0 mL or less), and PBS (-) was added so that the total volume was 6 mL.
  • a 10 mL syringe was filled with the activated leukocyte-containing platelet-rich plasma solution, and acellular filtering was performed.
  • a cell-free filter Minisart pore size 0.2 ⁇ m (manufactured by Sartorius) was used.
  • Example 3 Analysis of growth factor mixture
  • the amount and concentration of growth factors in the growth factor mixture prepared as in Example 1 or 2 are analyzed.
  • Analysis of major growth factors using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reveals increased amounts and concentrations of platelet-derived growth factors such as PDGF, TGF- ⁇ , VEGF, EGF, and FGF.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Example 4 Preparation of growth factor mixture (3)
  • the sequence from blood collection to production of growth factor mixture is the same as in Figure 1.
  • blood was collected (four blood collection tubes/about 40 mL) at a clinic.
  • four heparin blood collection tubes (Venoject II vacuum blood collection tube (sterilized), containing heparin sodium) were used.
  • BD Vacutainer CPT can also be used in place of the heparin blood collection tube.
  • the mixture was gently inverted about 10 times and transported under refrigeration. At this time, the blood can also be pre-chilled at 0-10° C. for 0-72 hours.
  • the blood was returned to room temperature as soon as it arrived at the cell processing facility.
  • Four heparin blood collection tubes were centrifuged using a tabletop multiple centrifuge H-40F (swing rotor: RF-121-S/manufactured by Kokusan Co., Ltd.) (first centrifugation: 940 G, 15 min, 20-25° C.).
  • first centrifugation 940 G, 15 min, 20-25° C.
  • first centrifugation 1500G, 15 minutes.
  • the supernatant was collected in a 50 mL centrifuge tube (manufactured by Corning) to obtain platelet-rich plasma.
  • This platelet-rich plasma was subjected to a second centrifugation (940 G, 15 min, 20-25° C.) using a tabletop multiple rack centrifuge H-40F (swing rotor: RF-121-S/manufactured by Kokusan Co., Ltd.). .
  • second centrifugation 1500 G, 15 minutes.
  • the supernatant was removed (precipitate + supernatant 0.6 mL or less), and PBS (-) was added so that the total volume was 3.6 mL.
  • An additional 0.9 mL of 2% CaCl 2 was added (Nipro Calcium Chloride Injection 2% "NP"). The mixture was well stirred to activate platelets and release growth factors (20 min, 20-25° C.).
  • a 5 mL or 10 mL syringe was filled with the activated platelet-rich plasma solution, and acellular filtering was performed.
  • a cell-free filter Minisart pore size 0.45 ⁇ m (manufactured by Sartorius) was used.
  • Example 5 Preparation of growth factor mixture (4)
  • blood was collected (three blood collection tubes/about 30 mL) at a clinic.
  • three heparin blood collection tubes (BD Vacutainer blood collection tube, containing heparin sodium) were used.
  • BD Vacutainer CPT can also be used in place of the heparin blood collection tube.
  • the mixture was gently inverted about 20 times and transported under refrigeration.
  • the blood can also be pre-chilled at 0-15° C. for 0-72 hours.
  • Blood was brought to room temperature upon arrival at the cell processing facility. Transfer 30 mL of blood from three heparin collection tubes to one lymphocyte separation tube containing lymphocyte separation solution (Leucosep (trademark) blood volume 30 mL, manufactured by Greiner Japan), and centrifuge LCX-100 (Tomy Seiko Co., Ltd.) was used to centrifuge one lymphocyte separation tube (first centrifugation: 1200 G, 15 min, 15 to 25° C.). If BD Vacutainer CPT is used, centrifugation (first centrifugation: 1500 G, 15 minutes) may be performed without transferring to a lymphocyte separation tube.
  • lymphocyte separation solution Leucosep (trademark) blood volume 30 mL, manufactured by Greiner Japan
  • centrifuge LCX-100 Tomy Seiko Co., Ltd.
  • the supernatant was removed (precipitate + supernatant 1.0 mL or less), and PBS (-) was added so that the total volume was 6 mL.
  • a 10 mL syringe was filled with the activated platelet-rich plasma solution, and acellular filtering was performed.
  • a cell-free filter Minisart pore size 0.2 ⁇ m (manufactured by Sartorius) was used.
  • Example 6 Preparation of growth factor mixture (5)
  • blood was collected (four blood collection tubes/about 40 mL) at a clinic.
  • four heparin blood collection tubes (Venoject II vacuum blood collection tube (sterilized), containing heparin sodium) were used.
  • BD Vacutainer CPT can also be used in place of the heparin blood collection tube.
  • the mixture was gently inverted about 10 times and transported under refrigeration. At this time, the blood can also be pre-chilled at 0-10° C. for 0-72 hours.
  • the blood was returned to room temperature as soon as it arrived at the cell processing facility.
  • Four heparin blood collection tubes were centrifuged using a tabletop multi-tube centrifuge H-40F (swing rotor: RF-121-S/manufactured by Kokusan Co., Ltd.) (first centrifugation: 940 G, 15 minutes, 20-25°C).
  • first centrifugation 940 G, 15 minutes, 20-25°C.
  • centrifugation 1500 G, 15 minutes (heparin) or 20 minutes (citric acid), centrifugation at 20-25°C.
  • the centrifuge may be of another model, and the rotor may be of the swing type or of the angle type.
  • the supernatant was collected in a 50 mL centrifuge tube (manufactured by Corning) to obtain platelet-rich plasma.
  • a centrifuge tube manufactured by Corning
  • PBS - was added to this platelet-rich plasma so that the total volume was 30 mL or more, and then a desktop multi-centrifuge centrifuge H-40F (swing rotor: RF-121-S/manufactured by Kokusan Co., Ltd.) was used.
  • a second centrifugation (940 G, 15 min, 20-25° C.) was performed.
  • 2nd centrifugation 940-1800 G, 15 minutes, 20-25° C. when transferred to a lymphocyte separation tube containing a lymphocyte separation solution in the first centrifugation and centrifuged.
  • 2nd spin 1500 G-1800 G, 15-20 min if BD Vacutainer CPT is used in 1st spin. Cells other than platelets may be removed with a filter or the like before centrifugation.
  • the supernatant was removed (precipitate + 1 mL or less of supernatant), and PBS (-) was added so that the total volume was 4.8 mL.
  • An additional 1.2 mL of 2% CaCl 2 was added (Nipro Calcium Chloride Injection 2% "NP").
  • the concentration and liquid volume of the total volume and CaCl 2 may be changed. For example, if the liquid volume is 1.2 mL or less when the supernatant is removed, the total volume is PBS(-) may be added to make 4 mL, and 1 mL of 2% CaCl 2 may be added. Then, the mixture was stirred well to activate platelets and release growth factors (30 minutes, 20-25°C). The activation time can be adjusted as appropriate, and may be within 30 minutes or extended up to 120 minutes.
  • the activated platelet-rich plasma solution was frozen (30 minutes or more, -80°C) and thawed.
  • Cells other than platelets may be removed by a filter or the like before freezing.
  • Thawing may be carried out on the next day or later, and the temperature and time for thawing may be room temperature for 30 minutes or longer or 4°C for 2 hours or longer.
  • centrifugation 14000 rpm, 5 minutes, 20-25° C.
  • Minisart pore size 0.45 ⁇ m (manufactured by Sartorius) was used.
  • Example 7 Measurement of PDGF-BB and VEGF
  • a series of flows from blood collection to production of the growth factor mixture are the same as in FIG.
  • blood was collected (four blood collection tubes/about 40 mL) at a clinic.
  • four heparin blood collection tubes (Venoject II vacuum blood collection tube (sterilized), containing heparin sodium) were used.
  • the mixture was gently inverted about 10 times and transported under refrigeration.
  • the blood can also be pre-chilled at 0-10° C. for 0-72 hours.
  • the blood was returned to room temperature as soon as it arrived at the cell processing facility.
  • Four heparin blood collection tubes were centrifuged using a tabletop multi-tube centrifuge H-40F (swing rotor: RF-121-S/manufactured by Kokusan Co., Ltd.) (first centrifugation: 940 G, 15 minutes, 20-25°C).
  • the supernatant (plasma + leukocyte layer) of one of the four blood collection tubes was used as PRP.
  • the re-centrifuged supernatant was used, subjected to decellularization filtering, and then frozen and stored until measurement.
  • the remaining three supernatants (plasma + leukocyte layer) were collected in 15 mL centrifuge tubes (manufactured by Corning) to obtain W-PRP (WBC-containing platelet-rich plasma; leukocyte-containing platelet-rich plasma).
  • This leukocyte-containing platelet-rich plasma was subjected to the second centrifugation (940 G, 15 minutes, 20 to 25°C) using a tabletop multiple rack centrifuge H-40F (swing rotor: RF-121-S/manufactured by Kokusan Co., Ltd.). did
  • a 5 mL or 10 mL syringe was filled with the activated leukocyte-containing platelet-rich plasma solution, and acellular filtering was performed.
  • a cell-free filter Minisart pore size 0.45 ⁇ m (manufactured by Sartorius) was used.
  • PDGF-BB and VEGF were measured by ELISA and compared with conventional platelet-rich plasma (PRP). The results are shown in Tables 1 and 2 below.
  • growth factors can be efficiently recovered from platelet-rich plasma and activated, so a wide range of applications can be expected in the medical field, including regenerative medicine.

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Abstract

本開示は、多血小板血漿から成長因子群を効率的に回収し、活性化させた成長因子混合物を提供する。　本開示は、血液から成長因子混合物を調製する方法であって、血液に対して第一の遠心分離処理を行い、上清を回収する工程と、該上清に対して第二の遠心分離処理を行い、多血小板血漿を得る工程と、該多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程と、血小板を活性化させた該多血小板血漿から成長因子混合物を得る工程と、を含む、方法を提供する。

Description

成長因子混合物を調整する方法
　本開示は、成長因子混合物を調整する方法に関する。
　従来、血小板を多く含んだ血漿（多血小板血漿、ＰＲＰ）を血液から分離し、患部に注射するＰＲＰ療法が知られている。ＰＲＰ療法は、血小板に含まれる血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及び上皮成長因子（ＥＧＦ）などの成長因子が持つ組織修復能力を利用し、治癒力を高める手法である。
　ところで、この多血小板血漿をさらに濃縮して活性化し、濃縮活性化した多血小板血漿から血小板由来成分を回収して得られた成長因子混合物は、無細胞化されているため安全性が高く、またすでに濃縮活性化されていることから利便性が高い。そのため、再生医療分野における有望な材料として期待されている。
　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）　血液から成長因子混合物を調製する方法であって、
　血液に対して第一の遠心分離処理を行い、上清を回収する工程と、
　該上清に対して第二の遠心分離処理を行い、多血小板血漿を得る工程と、
　該多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程と、
　血小板を活性化させた該多血小板血漿から成長因子混合物を得る工程と、
を含む、方法。
（項目１ａ）前記上清が白血球を含む、上記項目に記載の方法。
（項目１ｂ）前記多血小板血漿が白血球含有多血小板血漿である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２）　前記第一の遠心分離処理と前記第二の遠心分離処理とが同じ条件で行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３）　前記第一の遠心分離処理と前記第二の遠心分離処理とが、約１００Ｇ～約３０００Ｇで約２～約３０分、室温の条件で行われる、請求項１または２に記載の方法。
（項目４）　前記第一の遠心分離処理と前記第二の遠心分離処理とが、約９４０Ｇで約１５分、約２４℃の条件で行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）　前記活性化させる処理が、前記多血小板血漿に、血小板を活性化させる薬剤を添加することを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）　前記血小板を活性化させる薬剤が塩化カルシウムを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）　前記成長因子混合物が凍結乾燥されない、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）　前記成長因子混合物を得る工程が、血小板を活性化させた前記多血小板血漿から細胞を除去する処理を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）　前記多血小板血漿からの細胞の除去が、フィルタリング処理を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）　さらに、前記多血小板血漿に対して、フィブリノーゲンを除去する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）　さらに、前記多血小板血漿に対して、アルブミンを除去する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）　前記フィブリノーゲンは約５ｍｇ／ｍＬ未満となるように除去され、及び／または前記アルブミンは約３７ｍｇ／ｍＬ未満となるように除去される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２ａ）　前記フィブリノーゲンは約５ｍｇ／ｍＬ未満となるように除去され、及び／または前記アルブミンは約１０ｍｇ／ｍＬ未満となるように除去される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１）
　対象の疾患、障害または状態を治療するための方法であって、該対象に上記項目のいずれか一項に記載の方法によって調製された成長因子混合物、または該成長因子混合物を含む組成物の治療有効量を投与する工程を含む、方法。
（項目Ａ２）
　対象の疾患、障害または状態を治療するための方法であって、該方法は、
　該対象から血液を得る工程と、
　該血液に対して第一の遠心分離処理を行い、上清を回収する工程と、
　該上清に対して第二の遠心分離処理を行い、多血小板血漿を得る工程と、
　該多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程と、
　血小板を活性化させた該多血小板血漿から成長因子混合物を得る工程と、
　該対象に該成長因子混合物の治療有効量を投与する工程と
を含む、方法。
（項目Ａ３）
　対象の疾患、障害または状態を治療するための方法であって、該対象に成長因子混合物の治療有効量を投与する工程を含み、該成長因子混合物は、
　血液に対して第一の遠心分離処理を行い、上清を回収する工程と、
　該上清に対して第二の遠心分離処理を行い、多血小板血漿を得る工程と、
　該多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程と、
　血小板を活性化させた該多血小板血漿から成長因子混合物を得る工程と、
を含む、方法によって調製される、方法。
（項目Ａ４）
　対象の疾患、障害または状態を治療するための方法であって、該方法は、
　該対象から血液を得る工程と、
　該血液に対して第一の遠心分離処理を行い、上清を回収する工程と、
　該上清に対して第二の遠心分離処理を行い、多血小板血漿を得る工程と、
　該多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程と、
　該対象に該多血小板血漿の治療有効量を投与する工程と
を含む、方法。
（項目Ａ５）
　対象の疾患、障害または状態を治療するための方法であって、該対象に多血小板血漿の治療有効量を投与する工程を含み、該多血小板血漿は、
　血液に対して第一の遠心分離処理を行い、上清を回収する工程と、
　該上清に対して第二の遠心分離処理を行い、多血小板血漿を得る工程と、
　該多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程と、
を含む、方法によって調製される、方法。
（項目Ａ６）
　項目１～１２ａのいずれか一項に記載の方法の特徴を含む、項目Ａ１～Ａ５のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１）
　上記項目のいずれか一項に記載の方法によって調製された成長因子混合物。
（項目Ｂ２）
　血液由来の成長因子混合物であって、該成長因子混合物は、
　血液に対して第一の遠心分離処理を行い、上清を回収する工程と、
　該上清に対して第二の遠心分離処理を行い、多血小板血漿を得る工程と、
　該多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程と、
　血小板を活性化させた該多血小板血漿から成長因子混合物を得る工程と、
を含む、方法によって調製される、成長因子混合物。
（項目Ｂ３）
　対象の疾患、障害または状態を治療するための、上記項目のいずれか一項に記載の方法によって調製された成長因子混合物。
（項目Ｂ４）
　対象の疾患、障害または状態を治療するための血液由来の成長因子混合物であって、該成長因子混合物は、
　血液に対して第一の遠心分離処理を行い、上清を回収する工程と、
　該上清に対して第二の遠心分離処理を行い、多血小板血漿を得る工程と、
　該多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程と、
　血小板を活性化させた該多血小板血漿から成長因子混合物を得る工程と、
を含む、方法によって調製される、成長因子混合物。
（項目Ｂ５）
　血液由来の多血小板血漿であって、該多血小板血漿は、
　血液に対して第一の遠心分離処理を行い、上清を回収する工程と、
　該上清に対して第二の遠心分離処理を行い、多血小板血漿を得る工程と、
　該多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程と、
を含む、方法によって調製される、多血小板血漿。
（項目Ｂ６）
　項目１～１２ａのいずれか一項に記載の方法の特徴を含む、項目Ｂ１～Ｂ５のいずれか一項に記載の成長因子混合物または多血小板血漿。
　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
　本開示によれば、多血小板血漿から成長因子群を効率的に回収でき、また活性化されているため、医療の現場において有用である。また、無細胞化されていることから、再生医療等安全性確保法などの法令上の制約を回避することができ、利便性が高い。
図１は、本開示の一実施形態における採血から成長因子混合物の生成までの一連の流れを示す模式図である。 図２は、本開示の他の実施形態における採血から成長因子混合物の生成までの一連の流れを示す模式図である。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
　本明細書において、「成長因子混合物」とは、任意の成長因子の混合物を言い、代表的に血小板由来のサイトカインやその他成長因子を含むものであり、例えば、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、ＥＧＦなどの成長因子が混合したものをいう。「混合物」は特に限定されず、天然の状態で２つ以上の要素が共存しているものであればよく、積極的に混合する操作によって生成されたものでなくてもよく、そうであってもよい。
　本明細書において、「多血小板血漿」（またはＰＲＰともいう）とは、通常の血漿よりも血小板を多く含む血漿濃縮物を指し、血液中の血漿を遠心分離処理することによって得ることができる。血小板の濃度は血液（全血）の約１倍以上であり、代表的に、約２～約７倍である。多血小板血漿は例えば、約１０×１０４個/μＬ以上、約２５×１０４個/μＬ以上、約５０×１０４個/μＬ以上、または好ましくは約１００×１０４個/μＬ以上の濃度の血小板を含む。あるいは、また、通常、多血小板血漿には、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、またはＨＧＦなどの成長因子が豊富に含まれる。また本明細書において、「白血球含有多血小板血漿」とは、上記のような多血小板血漿に白血球が含まれるものをいう。
　本明細書において血小板の「活性化」とは出血時に血小板に生じる一連の反応、それと同等の反応、または一部の反応をいい、衝撃や刺激物質により、血小板内の細胞骨格系が変化し、多数の長い突起を出し金平糖のような形をとること、または血小板内で生成された成長因子が血小板外へ放出されること、または血小板内に貯蔵されていた成長因子が血小板外へ放出されることをいう。
　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
　本開示の一局面において、血液から成長因子混合物を調製する方法であって、血液に対して第一の遠心分離処理を行い、上清を回収する工程と、該上清に対して第二の遠心分離処理を行い、多血小板血漿を得る工程と、該多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程と、血小板を活性化させた該多血小板血漿から成長因子混合物を得る工程と、を含む、方法が提供される。本開示の方法は、再生医療分野における有望な材料を提供する技術として有用である。
　一実施形態において、上清は白血球を含むことができる。本開示では、白血球を含む上清は、全血の約１．５倍以上の濃度で白血球を含むことが好ましいが、これに限定されない。
　一実施形態において、多血小板血漿は白血球含有多血小板血漿とすることができる。本開示では、白血球含有多血小板血漿は、全血の約５倍以上の濃度で白血球を含むことが好ましいが、これに限定されない。
　本開示の一実施形態において、血液に対する第一の遠心分離処理と、この第一の遠心分離処理によって得られる上清に対する第二の遠心分離処理とは同じ条件で行うことが好ましい。一実施形態において、第一または第二の遠心分離処理は、約１００～約３０００Ｇの遠心分離とすることができ、好ましくは約５００～約１０００Ｇ、または約９４０Ｇとしてもよい。処理時間は約２～約３０分とすることができ、好ましくは約５～約２０分、または約１５分である。
　血液や上清に対する遠心処理は、室温で行うことが好ましく、例えば約２０℃～約２７℃で行うことができ、さらに好ましくは約２４℃で行われる。
　以上のようにして血液（全血）に対して第一の遠心分離処理を行うことにより、上清を分離することができ、またこの上清に対して第二の遠心分離処理を行うことにより、多血小板血漿を分離することができる。また一実施形態において、第一の遠心分離処理と第二の遠心分離処理は必要に応じて複数回行うこともできる。
　本開示の一実施形態において、上記のようにして回収した多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程は、多血小板血漿に、血小板を活性化させる薬剤を添加することで行うこともできる。このようにして血小板が活性することによって血小板由来の成長因子が多数放出され、また活性化される。
　あるいは、血小板を活性化させる処理は、薬剤を使用しない形でもよい。例えば低温刺激による方法、超音波処理による方法、血小板を基材に付着させる方法などであってもよい。この場合の低温刺激温度は、約０℃以上、好ましくは約４℃以上などであり得る。
　血小板を活性化する薬剤は、特に限られるものではないが、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、乳酸カルシウム、炭酸カルシウム等のカルシウムイオン源化合物を用いることができ、カルシウムイオンが存在することによって血小板が活性化される。
　本開示の一実施形態において、血小板を活性化する薬剤は溶液として添加することができ、その濃度は特に限られるものではないが、例えば約１質量％以上、約１．５質量％以上、約２質量％以上、約２．５質量％以上とすることができる。また一実施形態において、その添加量は特に限られるものではないが、例えば、多血小板血漿の液量を基準として約０．０５体積倍以上、約０．１体積倍以上、約０．１５体積倍以上、約０．２体積倍以上、約０．２５体積倍以上、約０．３体積倍以上とすることができる。
　本開示の一実施形態において、血小板を活性化させた該多血小板血漿から成長因子混合物を得る工程は、血小板を活性化させた前記多血小板血漿から細胞を除去する処理を含むことができる。この場合、細胞の除去は多血小板血漿から細胞を除去することができる手段であれば特に限られるものではなく、フィルタリング処理を好ましく使用することができる。フィルタリング処理は多血小板血漿に含まれる白血球や血小板、赤血球などの種々の細胞を除去するものであり、除去対象となる細胞のサイズに応じて、メンブレン孔径は適宜設定することができる。一実施形態において、必要に応じて複数のメンブレン孔径のフィルターを用いることができ、これらを組み合わせて複数回フィルタリングすることにより、血小板以外の細胞を除去することができる。例えば、フィルターとしては、孔径が約５μｍ以下、約１μｍ以下、約０．７μｍ以下、約０．５μｍ以下、約０．３μｍ以下のメンブレンフィルターを使用することができ、除去対象となる細胞をフィルタリングできるものであればよい。
　一実施形態において、フィルタリング処理は遠心分離処理によって行うことができ、上記のようなフィルターを用いて多血小板血漿を遠心分離処理することで血小板や白血球などの種々の細胞を除去することができる。この場合、遠心分離処理の条件としては、第一の遠心分離処理及び第二の遠心分離処理と同様の条件を採用することができる。
　成長因子混合物やその前段階の無細胞系血漿が細胞（特に血小板）を実質的に含有しない、または全く含有しないことは、例えば、セルカウンターを用いて１μｍ以上の細胞が確認されないことによって実証できる。あるいは血球計算盤や血球計測機などを用いて血小板が観測されないことによって実証してもよい。いずれかの手段によって血小板を含まないことが確認できればよい。
　以上のようにして、多血小板血漿に含まれる血小板や白血球などの種々の細胞を除去することで、成長因子混合物は、細胞を実質的に含有しないものとすることができる。そのため、従来の多血小板血漿では細胞を含むものであることから種々の法令の制限を受けていたところ、本開示の成長因子混合物は、細胞を含有しないことから、制約を受けることなく再生医療の材料として使用することができる。
　本開示の一実施形態において、上記のようにして第二の遠心分離処理を行った後に、フィブリノーゲン及び／またはアルブミンが含まれる上清を除去することもできる。この場合には、沈殿した（分離した）血液細胞を少量のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で懸濁して血液細胞の懸濁物（多血小板血漿）を得ることができる。その後、この懸濁物に上記のような血小板を活性化する薬剤が添加される。
　一実施形態において、上記のようにしてフィブリノーゲン及び／またはアルブミンを除去することにより、本開示の方法によって最終的に得られる成長因子混合物において、フィブリノーゲンは、約１０ｍｇ／ｍＬ未満、約７ｍｇ／ｍＬ未満、約５ｍｇ／ｍＬ未満、約４ｍｇ／ｍＬ未満、約３ｍｇ／ｍＬ未満、約２ｍｇ／ｍＬ未満、約１ｍｇ／ｍＬ未満のレベルで実質的に除去され、またアルブミンは、約５０ｍｇ／ｍＬ未満、約４０ｍｇ／ｍＬ未満、約３７ｍｇ／ｍＬ未満、約３０ｍｇ／ｍＬ未満、約２０ｍｇ／ｍＬ未満、または約１０ｍｇ／ｍＬ未満のレベルで実質的に除去されることができる。
　本開示の一実施形態において、上記のように細胞を除去することで得られた成長因子混合物は、凍結乾燥されることなく使用することができる。
　本開示の一実施形態において、本開示の方法によって得られる成長因子混合物は、通常の多血小板血漿が含有する成長因子を含有することができる。このような成長因子としては、例えば、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ等が挙げられる。本開示の成長因子混合物は少なくともこれら因子を含有することができる。
　一実施形態において、各種成分は、例えば以下の範囲で含まれることができる。
　ＰＤＧＦ：約１～約４００ｎｇ／ｍＬ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）
　ＴＧＦ-β：約２０００～約１２０００ｐｇ／ｍＬ
　ＥＧＦ：約５～約６０ｐｇ／ｍＬ
　ＦＧＦ：約５００～約３２００ｐｇ／ｍＬ（ＦＧＦ－４）
　ＶＥＧＦ：約１０～約２０００ｐｇ／ｍＬ
　ＩＧＦ：約２５０～約６０００ｐｇ／ｍＬ
　他の実施形態において、各種成分は、例えば以下の範囲で含まれることができる。
　ＰＤＧＦ：約５０～約４００ｎｇ／ｍＬ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）
　ＴＧＦ-β：約２０００～約１２０００ｐｇ／ｍＬ
　ＥＧＦ：約５～約６０ｐｇ／ｍＬ
　ＦＧＦ：約５００～約３２００ｐｇ／ｍＬ（ＦＧＦ－４）
　ＶＥＧＦ：約１０～約８００ｐｇ／ｍＬ
　ＩＧＦ：約２５０～約６０００ｐｇ／ｍＬ
　各種成分は、少なくとも１つの成分が上記範囲内に入っていれば、本開示の範囲内にあると言えるが、好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、好ましくは全部が上記濃度範囲内にあることが好ましい。
　また本開示の一実施形態において、本開示の方法によって得られる成長因子混合物は、フィブリノーゲン及び／またはアルブミンを含まない、または実質的に含まないものとすることができる。他の実施形態において、これらの成分を含む場合には、以下の濃度を許容することができる。
　フィブリノーゲン：約０～約１０ｍｇ／ｍＬ、約０～約７ｍｇ／ｍＬ、または約０～約５ｍｇ／ｍＬ
　アルブミン：約０～約５０ｍｇ／ｍＬ、約０～約４０ｍｇ／ｍＬ、約０～約３０ｍｇ／ｍＬ、約０～約２０ｍｇ／ｍＬ、または約０～約１０ｍｇ／ｍＬ
　上記約０は、検出限界で検出し得る最低限の値であり得、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｍＬ等であり得る。したがって、フィブリノーゲン及び／またはアルブミンを含む場合には、以下の濃度を許容することができる。
　フィブリノーゲン：約０．０００１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．０００１ｍｇ／ｍＬ～約７ｍｇ／ｍＬ、または約０．０００１ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬ
　アルブミン：約０．０００１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．０００１ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬ、約０．０００１ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．０００１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、または約０．０００１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬ
　本開示の一実施形態において、本開示の方法によって得られる成長因子混合物は、その投与される組織は特に限られるものではなく、関節や筋腱にも投与することができる。また一実施形態において、本開示の成長因子混合物は、－約８０℃～約２５℃で保存することができ、使用の際には約２０～約２５℃の室温で保存することもできる。
　本開示の一実施形態において、本開示の方法の一連の流れは以下のようにすることができる。すなわち、採血後、約２０００ｒｐｍ（９８０ｇ）、１５分、２０～２５℃で第１遠心を行い、血清上部１／２～２／３は廃棄し、中間層を採取する。このとき、リンパ球分離液やＢＤバキュテイナＣＰＴ採血管などを用いて赤血球を除外することもできる。その後、約１０ｍｌ程度を遠沈管に回収し、フィブリンが低減するようにＰＢＳを加えて希釈し、約２０００ｒｐｍ（９８０ｇ）、１５分、２０～２５℃で第２遠心を行う。上清を廃棄し、必要な場合にはＰＢＳや２％　ＣａＣｌ２を加えて、よく攪拌し、２０～２５℃で血小板を活性化させ成長因子を放出させる。
　その後、この溶液を凍結融解しない場合には、約２０００ｒｐｍ（９８０ｇ）、２分、２０～２５℃でさらに遠心することができる。凍結融解する場合には、凍結する前に、血小板以外の細胞（白血球や赤血球）を除去するためのフィルター処理等を実施してもよく、
－８０℃で、３０分以上の凍結を行う。融解後、１４０００ｒｐｍ、５分、２０～２５℃で遠心することができる。
　凍結融解する場合、およびしない場合のいずれにおいても、遠心後の上清を約０．４５μｍのフィルターでろ過し、この溶液についてＶＥＧＦ、フィブリノーゲン、アルブミンなどを測定することができる。また細胞がないことを確認し、本開示の成長因子混合物とすることができる。
　本開示の成長因子混合物または多血小板血漿は、対象の疾患、障害または状態を治療するために用いることができる。例えば本開示の成長因子混合物または多血小板血漿は、対象から得た血液を用いて調整し、治療有効量を対象に投与することで、その対象の疾患、障害または状態を治療することができる。
　一実施形態において、本開示の成長因子混合物または多血小板血漿を用いた治療は、疾患の状態、種類、患者の状態、患者の希望などにより、投与量、投与期間、投与回数などを調整することができる。例えば、膝治療の場合、医師の判断で、片足に２本（１本は任意の一定量）投与したり、両足にそれぞれ１本ずつ投与することもできる。また他の実施形態において、１本投与した後に、さらに追加で１本または複数を投与することもできる。
　他の実施形態において、本開示の成長因子混合物または多血小板血漿を用いた治療は、膝を含む関節の治療にも用いることができ、例えば、変形性膝関節症、変形性股関節症、半月板損傷、靭帯損傷、膝関節痛などの治療に用いることができる。また一実施形態において、本開示の成長因子混合物または多血小板血漿は、皮膚、骨、靭帯、アキレス腱、腱鞘炎、歯槽骨、半月板、卵巣、子宮内膜、角膜、その他軟部組織などの身体組織の再生治療に用いることもできる。また一実施形態において、本開示の成長因子混合物または多血小板血漿は、損傷治癒の促進（早期治癒）や鎮痛軽減、手術創の治癒補助などのために用いることができる。
　他の実施形態において、本開示の成長因子混合物または多血小板血漿は、薄毛治療などの美容のために用いることもでき、例えば、目的の美容の種類に応じて、投与方法、投与量、投与期間を調整することができる。一実施形態において、本開示の成長因子混合物または多血小板血漿は、美容目的のために、例えば１週間おきに１本を投与したり、１ヶ月おきに２本の投与を２～３回繰り返すこともできる。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８９）．　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ，　ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．
　ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
（実施例１：成長因子混合物の作成（１））
　採血から成長因子混合物の生成までの一連の流れを図１に示した。まず診療所にて採血（採血管４本分／約４０ｍＬ）した。この際、ヘパリン採血管４本（ベノジェクトＩＩ真空採血管（滅菌品）、ヘパリンナトリウム入）を用いた。またヘパリン採血管に代えて、ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用することもできる。採血後、静かに約１０回転倒混和し、冷蔵で輸送した。この際、０～１０℃で０～７２時間に亘って血液を予冷蔵しておくこともできる。
　細胞加工施設に到着次第、血液を室温に戻した。卓上多本架遠心機Ｈ－４０Ｆ（スイングローター：ＲＦ－１２１－Ｓ／コクサン社製）を用いてヘパリン採血管４本を遠心した（第１遠心：９４０Ｇ，１５分，２０～２５℃）。ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用した場合、第１遠心：１５００Ｇ，１５分。
　上清（血漿＋白血球層）を５０ｍＬ遠沈管（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収し、Ｗ－ＰＲＰ（ＷＢＣ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ　ｐｌａｓｍａ；白血球含有多血小板血漿）を得た。この白血球含有多血小板血漿に対して、卓上多本架遠心機Ｈ－４０Ｆ（スイングローター：ＲＦ－１２１－Ｓ／コクサン社製）を用いて第２遠心（９４０Ｇ，１５分，２０～２５℃）を行った。ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用した場合、第２遠心：１５００Ｇ，１５分。
　上清を除去し（沈殿物＋上清０．６ｍＬ以下）、Ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅが３．６ｍＬとなるようＰＢＳ（－）を添加した。さらに２％　ＣａＣｌ２　０．９ｍＬを添加した（ニプロ　塩化カルシウム注２％「ＮＰ」）。よく攪拌し、血小板を活性化させ成長因子を放出させた（２０ｍｉｎ，２０～２５℃）。
　活性化させた白血球含有多血小板血漿溶液を５ｍＬまたは１０ｍＬシリンジに充填し、無細胞化フィルタリングを行った。無細胞化フィルターとしてはミニザルト孔径０．４５μｍ（ザルトリウス社製）を用いた。
　無細胞化加工済溶液中（成長因子混合物）に細胞が存在しないことを目視（血球計算盤：１０μＬ）で確認し、３ｍＬクライオジェニックバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）２本に１．５ｍＬずつ分注した（製品容量３ｍＬ）。ガラスバイアル瓶（ゴム栓、アルミキャップ付き；Ｗｅａｔｏｎまたはマムエル社製）５ｍＬを１本または３ｍＬを２本使用することもできる。残液は無菌検査等で使用した。
　診療所へ発送するまで－２０℃で凍結保存し（無菌検査結果が出るまで約３週間）、診療所へ発送した（冷凍便。ドライアイスを同封）。製品の使用期限は、冷凍保存の場合は検査結果判明日から３ヶ月、冷蔵保存の場合は解凍後２日間とした（解凍後の再凍結は控える）。
（実施例２：成長因子混合物の作成（２））
　採血から成長因子混合物の生成までの一連の流れを図２に示した。まず診療所にて採血（採血管３本分／約３０ｍＬ）した。この際、ヘパリン採血管３本（ＢＤバキュテイナ採血管、ヘパリンナトリウム入）を用いた。またヘパリン採血管に代えて、ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用することもできる。採血後、静かに約２０回転倒混和し、冷蔵で輸送した。この際、０～１５℃で０～７２時間に亘って血液を予冷蔵しておくこともできる。
　細胞加工施設に到着次第、血液を室温に戻した。ヘパリン採血管３本の血液３０ｍＬを、リンパ球分離溶液を含むリンパ球分離チューブ１本（Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（商標）　血液量３０ｍL、グライナージャパン社製）に移し、卓上多本架遠心機ＬＣＸ－１００（トミ
ー精工社製）を用いてリンパ球分離チューブ１本を遠心した（第１遠心：１２００Ｇ，１５ｍｉｎ，１５～２５℃）。ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用した場合、リンパ球分離チューブに移さず、遠心（第１遠心：１５００Ｇ，１５分）を行ってよい。
　白血球層よりも上方の５～１０ｍｍ程度残して血漿を回収（廃棄）し、残った血漿を含む細胞分画（血漿＋白血球層）を１５ｍＬ遠沈管（ＩＷＡＫＩ社製）１本に回収し、Ｗ－ＰＲＰ（ＷＢＣ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ　ｐｌａｓｍａ；白血球含有多血小板血漿）を得た。この白血球含有多血小板血漿に対して、卓上多本架遠心機ＬＣＸ－１００（トミー精工製）を用いて第２遠心（１２００Ｇ，１５ｍｉｎ，１５～２５℃）を行った（ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用した場合、第２遠心：１５００Ｇ，１５分）。
　上清を除去し（沈殿物＋上清１．０ｍＬ以下）、Ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅが６ｍＬとなるようＰＢＳ（－）を添加した。さらに２％　ＣａＣｌ２　１．５ｍＬを添加した（大塚塩化カルシウム注２％）。よく攪拌し、血小板を活性化させ成長因子を放出させた（６０ｍｉｎ，２０～２５℃）。
　活性化させた白血球含有多血小板血漿溶液を１０ｍＬシリンジに充填し、無細胞化フィルタリングを行った。無細胞化フィルターとしてはミニザルト孔径０．２μｍ（ザルトリウス社製）を用いた。
　無細胞化加工済溶液中（成長因子混合物）に細胞が存在しないことを自動セルカウンターで確認し、５ｍＬクライオジェニックバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）２本に３ｍＬずつ分注した（製品容量約６ｍＬ）。ガラスバイアル瓶（ゴム栓、アルミキャップ付き；Ｗｅａｔｏｎまたはマムエル社製）１０ｍＬを１本または５ｍＬを２本使用することもできる。残液は無菌検査等で使用した。
　診療所へ発送するまで－８０℃で凍結保存し（無菌検査結果が出るまで約３週間）、診療所へ発送した（冷凍便。ドライアイスを同封）。製品の使用期限は、冷凍保存の場合は検査結果判明日から２ヶ月、冷蔵保存の場合は解凍後３日間とした（解凍後の再凍結は控える）。
（実施例３：成長因子混合物の解析）
　実施例１または２のようにして作成した成長因子混合物における成長因子の量や濃度を解析する。主要な成長因子について酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて解析すると、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦなどの血小板由来成長因子の量や濃度が高くなることが分かる。
（実施例４：成長因子混合物の作成（３））
　採血から成長因子混合物の生成までの一連の流れ図１と同様である。まず診療所にて採血（採血管４本分／約４０ｍＬ）した。この際、ヘパリン採血管４本（ベノジェクトＩＩ真空採血管（滅菌品）、ヘパリンナトリウム入）を用いた。またヘパリン採血管に代えて、ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用することもできる。採血後、静かに約１０回転倒混和し、冷蔵で輸送した。この際、０～１０℃で０～７２時間に亘って血液を予冷蔵しておくこともできる。
　細胞加工施設に到着次第、血液を室温に戻した。卓上多本架遠心機Ｈ－４０Ｆ（スイングローター：ＲＦ－１２１－Ｓ／コクサン社製）を用いてヘパリン採血管４本を遠心した（第１遠心：９４０Ｇ，１５ｍｉｎ，２０～２５℃）。ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用した場合、第１遠心：１５００Ｇ，１５分。
　上清を５０ｍＬ遠沈管（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収し、多血小板血漿を得た。この多血小板血漿に対して、卓上多本架遠心機Ｈ－４０Ｆ（スイングローター：ＲＦ－１２１－Ｓ／コクサン社製）を用いて第２遠心（９４０Ｇ，１５ｍｉｎ，２０～２５℃）を行った。ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用した場合、第２遠心：１５００Ｇ，１５分。
　上清を除去し（沈殿物＋上清０．６ｍＬ以下）、Ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅが３．６ｍＬとなるようＰＢＳ（－）を添加した。さらに２％　ＣａＣｌ２　０．９ｍＬを添加した（ニプロ　塩化カルシウム注２％「ＮＰ」）。よく攪拌し、血小板を活性化させ成長因子を放出させた（２０ｍｉｎ，２０～２５℃）。
　活性化させた多血小板血漿溶液を５ｍＬまたは１０ｍＬシリンジに充填し、無細胞化フィルタリングを行った。無細胞化フィルターとしてはミニザルト孔径０．４５μｍ（ザルトリウス社製）を用いた。
　無細胞化加工済溶液中（成長因子混合物）に細胞が存在しないことを目視（血球計算盤：１０μＬ）で確認し、３ｍＬクライオジェニックバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）２本に１．５ｍＬずつ分注した（製品容量３ｍＬ）。ガラスバイアル瓶（ゴム栓、アルミキャップ付き；Ｗｅａｔｏｎまたはマムエル社製）５ｍＬを１本または３ｍＬを２本使用することもできる。残液は無菌検査等で使用した。
　診療所へ発送するまで－２０℃で凍結保存し（無菌検査結果が出るまで約３週間）、診療所へ発送した（冷凍便。ドライアイスを同封）。製品の使用期限は、冷凍保存の場合は検査結果判明日から３ヶ月、冷蔵保存の場合は解凍後２日間とした（解凍後の再凍結は控える）。
（実施例５：成長因子混合物の作成（４））
　採血から成長因子混合物の生成までの一連の流れは図２と同様である。まず診療所にて採血（採血管３本分／約３０ｍＬ）した。この際、ヘパリン採血管３本（ＢＤバキュテイナ採血管、ヘパリンナトリウム入）を用いた。またヘパリン採血管に代えて、ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用することもできる。採血後、静かに約２０回転倒混和し、冷蔵で輸送した。この際、０～１５℃で０～７２時間に亘って血液を予冷蔵しておくこともできる。
　細胞加工施設に到着次第、血液を室温に戻した。ヘパリン採血管３本の血液３０ｍＬを、リンパ球分離溶液を含むリンパ球分離チューブ１本（Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（商標）　血液量３０ｍL、グライナージャパン社製）に移し、卓上多本架遠心機ＬＣＸ－１００（トミ
ー精工社製）を用いてリンパ球分離チューブ１本を遠心した（第１遠心：１２００Ｇ，１５ｍｉｎ，１５～２５℃）。ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用した場合、リンパ球分離チューブに移さず、遠心（第１遠心：１５００Ｇ，１５分）を行ってよい。
　白血球層よりも上方の５～１０ｍｍ程度残して血漿を回収（廃棄）し、残った血漿を１５ｍＬ遠沈管（ＩＷＡＫＩ社製）１本に回収し、多血小板血漿を得た。この多血小板血漿に対して、卓上多本架遠心機ＬＣＸ－１００（トミー精工製）を用いて第２遠心（１２００Ｇ，１５ｍｉｎ，１５～２５℃）を行った（ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用した場合、第２遠心：１５００Ｇ，１５分）。
　上清を除去し（沈殿物＋上清１．０ｍＬ以下）、Ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅが６ｍＬとなるようＰＢＳ（－）を添加した。さらに２％　ＣａＣｌ２　１．５ｍＬを添加した（大塚塩化カルシウム注２％）。よく攪拌し、血小板を活性化させ成長因子を放出させた（６０ｍｉｎ，２０～２５℃）。
　活性化させた多血小板血漿溶液を１０ｍＬシリンジに充填し、無細胞化フィルタリングを行った。無細胞化フィルターとしてはミニザルト孔径０．２μｍ（ザルトリウス社製）を用いた。
　無細胞化加工済溶液中（成長因子混合物）に細胞が存在しないことを自動セルカウンターで確認し、５ｍＬクライオジェニックバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）２本に３ｍＬずつ分注した（製品容量約６ｍＬ）。ガラスバイアル瓶（ゴム栓、アルミキャップ付き；Ｗｅａｔｏｎまたはマムエル社製）１０ｍＬを１本または５ｍＬを２本使用することもできる。残液は無菌検査等で使用した。
　診療所へ発送するまで－８０℃で凍結保存し（無菌検査結果が出るまで約３週間）、診療所へ発送した（冷凍便。ドライアイスを同封）。製品の使用期限は、冷凍保存の場合は検査結果判明日から２ヶ月、冷蔵保存の場合は解凍後３日間とした（解凍後の再凍結は控える）。
（実施例６：成長因子混合物の作成（５））
　採血から成長因子混合物の生成までの一連の流れは図１と同様である。まず診療所にて採血（採血管４本分／約４０ｍＬ）した。この際、ヘパリン採血管４本（ベノジェクトＩＩ真空採血管（滅菌品）、ヘパリンナトリウム入）を用いた。またヘパリン採血管に代えて、ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用することもできる。採血後、静かに約１０回転倒混和し、冷蔵で輸送した。この際、０～１０℃で０～７２時間に亘って血液を予冷蔵しておくこともできる。
　細胞加工施設に到着次第、血液を室温に戻した。卓上多本架遠心機Ｈ－４０Ｆ（スイングローター：ＲＦ－１２１－Ｓ／コクサン社製）を用いてヘパリン採血管４本を遠心した（第１遠心：９４０Ｇ，１５分，２０～２５℃）。ヘパリン採血管４本の血液４０ｍＬを、リンパ球分離溶液を含むリンパ球分離チューブに移して遠心する場合は第１遠心：９４０～１８００Ｇ，１５分、２０～２５℃で遠心。ＢＤバキュテイナ　ＣＰＴを使用した場合、第１遠心：１５００Ｇ，１５分（ヘパリン）もしくは２０分（クエン酸）、２０～２５℃で遠心。なお、遠心機は他の機種でもよく、ローターはスイング式を使用してもよく、アングル式を使用してもよい。
　上清を５０ｍＬ遠沈管（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収し、多血小板血漿を得た。この上清を採取する際、血漿上部の一部～ほぼ全てを廃棄してもよく、白血球層（中間層）付近に存在する血小板をより多く採取できるよう、白血球層より下層も含めて約１０ｍＬ以上採取してもよい。この多血小板血漿に対して、Ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅが３０ｍＬ以上となるようＰＢＳ（－）を添加した後、卓上多本架遠心機Ｈ－４０Ｆ（スイングローター：ＲＦ－１２１－Ｓ／コクサン社製）を用いて第２遠心（９４０Ｇ，１５ｍｉｎ，２０～２５℃）を行った。第１遠心でリンパ球分離溶液を含むリンパ球分離チューブに移して遠心した場合、第２遠心：９４０～１８００Ｇ，１５分、２０～２５℃。第１遠心でＢＤバキュテイナＣＰＴを使用した場合、第２遠心：１５００Ｇ～１８００Ｇ，１５分～２０分。なお、上記遠心の前にフィルター等により血小板以外の細胞を除去してもよい。
　上清を除去し（沈殿物＋上清１ｍＬ以下）、Ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅが４．８ｍＬとなるようＰＢＳ（－）を添加した。さらに２％　ＣａＣｌ２　１．２ｍＬを添加した（ニプロ　塩化カルシウム注２％「ＮＰ」）。上清を除去した後の液量に応じてＴｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅおよびＣａＣｌ２の濃度や液量を変更してもよく、例えば上清を除去したときの液量が１．２ｍＬ以下の場合はＴｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅが４ｍＬとなるようＰＢＳ（－）を添加し、２％　ＣａＣｌ２　１ｍＬを添加してもよい。その後、よく攪拌し、血小板を活性化させ成長因子を放出させた（３０分，２０～２５℃）。活性化の時間は適宜調整することが可能で、３０分以内でも、１２０分までのばしてもよい。
　活性化させた多血小板血漿溶液に対して凍結（３０分以上、－８０℃）と融解を行った。凍結を行う前にフィルター等により血小板以外の細胞（白血球や赤血球）を除去してもよい。解凍は翌日以降でもよく、解凍の温度と時間は、室温３０分以上でも４℃で２時間以上でもよい。その後、卓上型遠心機５４１８（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用いて遠心（１４０００ｒｐｍ，５分，２０～２５℃）を行い、上清を５ｍＬまたは１０ｍＬシリンジに充填し、無細胞化フィルタリングを行った。無細胞化フィルターとしてはミニザルト孔径０．４５μｍ（ザルトリウス社製）を用いた。
　無細胞化加工済溶液中（成長因子混合物）に細胞が存在しないことを目視（血球計算盤：１０μＬ）で確認し、３ｍＬクライオジェニックバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）２本に約１．５ｍＬずつ分注した（製品容量約３ｍＬ）。必要に応じて他の容器・本数・容量を選択してもよく、例えば、ガラスバイアル瓶（ゴム栓、アルミキャップ付き；Ｗｅａｔｏｎまたはマムエル社製）５ｍＬを１本または３ｍＬを２本使用することもできる。残液は無菌検査等で使用した。
　診療所へ発送するまで－２０℃で凍結保存し（無菌検査結果が出るまで約３週間）、診療所へ発送した（冷蔵または冷凍便）。製品の使用期限は、冷凍保存の場合は検査結果判明日から３ヶ月、冷蔵保存の場合は解凍後２日間とした（解凍後の再凍結は控える）。
（実施例７：ＰＤＧＦ－ＢＢおよびＶＥＧＦの測定）
　採血から成長因子混合物の生成までの一連の流れは図１と同様である。まず診療所にて採血（採血管４本分／約４０ｍＬ）した。この際、ヘパリン採血管４本（ベノジェクトＩＩ真空採血管（滅菌品）、ヘパリンナトリウム入）を用いた。採血後、静かに約１０回転倒混和し、冷蔵で輸送した。この際、０～１０℃で０～７２時間に亘って血液を予冷蔵しておくこともできる。
　細胞加工施設に到着次第、血液を室温に戻した。卓上多本架遠心機Ｈ－４０Ｆ（スイングローター：ＲＦ－１２１－Ｓ／コクサン社製）を用いてヘパリン採血管４本を遠心した（第１遠心：９４０Ｇ，１５分，２０～２５℃）。
　採血管４本中１本の上清（血漿＋白血球層）をＰＲＰとした。成長因子の測定用サンプルとして、細胞がフィルターに詰まりそうな場合は再度遠心した上清を用いて、無細胞化フィルタリングを行った後、測定まで凍結して保存した。残り３本の上清（血漿＋白血球層）を１５ｍＬ遠沈管（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収し、Ｗ－ＰＲＰ（ＷＢＣ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ　ｐｌａｓｍａ；白血球含有多血小板血漿）を得た。この白血球含有多血小板血漿に対して、卓上多本架遠心機Ｈ－４０Ｆ（スイングローター：ＲＦ－１２１－Ｓ／コクサン社製）を用いて第２遠心（９４０Ｇ，１５分，２０～２５℃）を行った。
　上清を除去し（沈殿物＋上清０．６ｍＬ以下）、Ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅが３．６ｍＬとなるようＰＢＳ（－）を添加した。ＰＢＳ（－）を添加した溶液にさらに２％　ＣａＣｌ２　０．９ｍＬを添加した（ニプロ　塩化カルシウム注２％「ＮＰ」）。よく攪拌し、血小板を活性化させ成長因子を放出させた（２０ｍｉｎ，２０～２５℃）。
　活性化させた白血球含有多血小板血漿溶液を５ｍＬまたは１０ｍＬシリンジに充填し、無細胞化フィルタリングを行った。無細胞化フィルターとしてはミニザルト孔径０．４５μｍ（ザルトリウス社製）を用いた。
　成長因子の測定サンプルを用いて、ＰＤＧＦ－ＢＢおよびＶＥＧＦをＥＬＩＳＡ法により測定し、従来の多血小板血漿（ＰＲＰ）と比較した。結果を以下の表１および２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２１年２月２６日に出願された特願２０２１－３０８０７に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
　本開示の方法によって、多血小板血漿から成長因子群を効率的に回収でき、また活性化されているため、再生医療を含む医療分野において幅広い応用が期待できる。

Claims (12)

  1. 　血液から成長因子混合物を調製する方法であって、
    　血液に対して第一の遠心分離処理を行い、上清を回収する工程と、
    　該上清に対して第二の遠心分離処理を行い、多血小板血漿を得る工程と、
    　該多血小板血漿に対して、血小板を活性化させる処理を行う工程と、
    　血小板を活性化させた該多血小板血漿から成長因子混合物を得る工程と、
    を含む、方法。
  2. 　前記第一の遠心分離処理と前記第二の遠心分離処理とが同じ条件で行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記第一の遠心分離処理と前記第二の遠心分離処理とが、約１００Ｇ～約３０００Ｇで約２～約３０分、室温の条件で行われる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記第一の遠心分離処理と前記第二の遠心分離処理とが、約９４０Ｇで約１５分、約２４℃の条件で行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記活性化させる処理が、前記多血小板血漿に、血小板を活性化させる薬剤を添加することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記血小板を活性化させる薬剤が塩化カルシウムを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記成長因子混合物が凍結乾燥されない、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記成長因子混合物を得る工程が、血小板を活性化させた前記多血小板血漿から細胞を除去する処理を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記多血小板血漿からの細胞の除去が、フィルタリング処理を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 　さらに、前記多血小板血漿に対して、フィブリノーゲンを除去する工程を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　さらに、前記多血小板血漿に対して、アルブミンを除去する工程を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記フィブリノーゲンは約５ｍｇ／ｍＬ未満となるように除去され、及び／または前記アルブミンは約３７ｍｇ／ｍＬ未満となるように除去される、請求項１０または１１に記載の方法。
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