WO2022177410A1 - 스왑 샘플링 방법을 이용한 마이크로바이옴 분석 방법 - Google Patents

스왑 샘플링 방법을 이용한 마이크로바이옴 분석 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a microbial community analysis method using a swap sampling method.
  • NGS Next generation sequencing
  • genome In the case of genome, it refers to all the genetic information possessed by an individual, whereas in the case of metagenome, it refers to the genome of all microorganisms that exist in a given environment. 1 1 Ibid., p. 223.
  • metagenome analysis there are 16S rRNA amplicon sequencing, which amplifies and analyzes 16S rRNA, and shotgun metagenome analysis, which analyzes the sequencing of all given genes in environmental samples.
  • 16S rRNA amplicon sequencing only the strain composition in the environment can be confirmed, and it is difficult to confirm the functional aspect of the microbial community.
  • Microbiome means 'the sum of all microorganisms present in a specific environment'. Diversity includes alpha diversity, beta diversity, and gamma diversity. Alpha diversity determines the distribution of different microorganisms present in a sample. Beta diversity is whether the diversity of the samples is similar. Gamma diversity refers to the total diversity of all clusters within a geographic area.
  • the present inventors have completed the present invention by discovering that the microbiome can be analyzed more accurately than when the microbiome is analyzed through the swab sampling method.
  • An object of the present invention is to provide a microbiome analysis method that more accurately reflects the community of microorganisms existing in nature.
  • the present invention provides a microbiome analysis method comprising a swap sampling step when collecting a sample in a method for analyzing a microbiome.
  • the sample obtained by the swap sampling may further include the step of preserving the sample in a storage container containing a preservation solution.
  • a preservation solution a buffer solution that prevents the destruction of microorganisms or viruses in the sample can be used.
  • it may be a phosphate buffer (Phosphate buffer saline: PBS ).
  • PBS phosphate buffer
  • it may further include a material capable of stabilizing the nucleic acid.
  • a material such as guanidine thiocyanate may be used for sample preservation.
  • the sample may further include a purification step for microbiome analysis. More preferably, impurities can be removed through filtration.
  • the sampling according to the present invention may be taken from the anus or vagina using a cotton swab.
  • the microbiome analysis method according to the present invention reflects the intestinal microbial community better than the conventional method for collecting and analyzing a stool sample, and provides a more accurate analysis for the composition of the microbiome environment and treatment using the same.
  • Swap sampling according to the present invention has a larger R value at all sites than conventional stool sampling, and reflects the actual microbiome in the large intestine 2.9 (291%) times more accurately.
  • FIG. 1 shows a flow chart for the microbiome analysis method according to the present invention.
  • Ascending colon, descending colon, sigmoid colon, rectal and anal swabs samples are AccuBuccal DNA Preparation kit (AccuGene, Incheon, Korea), and stool samples are AccuStool DNA Preparation kit (AccuGene, Incheon, Korea) according to the provided protocol.
  • DNA was extracted. Using the Ion 16STM Metagenomics Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) with 3 ng (x2) of the extracted DNA, the hypervariable regions of the 16S rRNA gene were analyzed with V2, V4, V8 primer sets and V3 according to the protocol provided. , V6-7, and V9 primer sets were used to amplify (Amplify) to prepare a library. This is shown in Table 2.
  • Ion 16S Metagenomics Kit includes various primers, so sequencing reads of 7 variable regions are provided as one FASTQ file. Using userarch (v11.0.667), primers (V2, V3, V4, V67, V8, V9) and binding regions were extracted.
  • Cutadapt (v2.8) was used to remove barcodes and adapter sequences.
  • DADA2 (v1.14) of QIIME2 was used.
  • FASTQ file divided into 7 regions, sequences of 15 bp and less than 100 bp of 5' were removed. Filter parameters of the regional FASTQ files were applied so that each Quality score >25.
  • NCBI was used for phylogenetic reference data. Taxonomic binning was performed with a similarity of 99% using the classify-consensus-vsearch algorithm of QIIME2.
  • the OTU table generated by region was calculated by applying the method of FIG. 1 .
  • An integrated OTU table was prepared by selecting only the maximum value of the overlapping OTU ID value (abundance) of the regional OTU table so that the maximum value has only one OTU value per one OUT ID.
  • CSS Cumulative Sum Scaling
  • OTUs found in less than 10 samples were removed.
  • Diversity measures alpha and beta diversity, Unifrac analysis
  • the correlation between positions was analyzed through the Pearson correlation method, and the P-value was corrected by the post hoc test (Bonfferoni).

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Abstract

본 발명은 스왑 샘플링 방법을 이용한 마이크로바이옴 분석 방법에 관한 것으로, 마이크로바이움을 분석하는 방법에 있어서, 시료 채취시 스왑 샘플링(swap sampling) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로바이옴 분석 방법이다. 본 발명에 따른 마이크로바이움 분석 방법은 종래의 대변 시료를 채취하여 분석하는 방법에 비하여 장내 미생물 군집을 더 잘 반영하여, 마이크로바이옴 환경의 구성 및 이를 이용한 치료에 더 정확한 분석을 제공한다. 본 발명에 따른 스왑 샘플링이 종래 대변 샘플링 보다 모든 부위에서 R값이 크고, 실제 대장내의 미생물군총을 2.9(291%)배 더 정확히 반영한다.

Description

스왑 샘플링 방법을 이용한 마이크로바이옴 분석 방법
본 발명은 스왑 샘플링 방법을 이용한 미생물 군집 분석 방법에 대한 것이다.
차세대 염기서열 분석 방법(Next generation sequencing; NGS)은 대량 염기서열 분석이 가능하게 하였다. 2004년 최초로 상용화된 454 Pyrosequencer 이후 현재까지 그 성능이 발전하고 있다. 하나의 유전체를 무수히 많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽어낸 뒤, 얻어지는 데이터를 생물정보학적 기법을 이용하여 조합하고 대용량의 유전체 정보를 빠르게 해독할 수 있다. Roche가 처음으로 NGS 장비를 출시한 이후 Illumina Solexa, Applied Biosystems 등이 연이어 출시하였다. NGS 장비 출시 전에는 생어 염기서열 분석법을 이용한 장비는 기껏해야 동시에 수십 개의 전기영동이 가능한 반면，NGS 장비는 수십만에서 수십억 개의 서로 다른 염기서열 분석이 가능해졌다.
유전체의 경우 한 개체가 지닌 모든 유전 정보를 말한다면， 메타게놈의 경우는 주어진 환경에서 존재하는 모든 미생물의 유전체를 말한다.1 1 Ibid., 223면. 메타게놈 분석의 경우 16S rRNA를 증폭시켜서 분석하는 16S rRNA 앰플리콘 시퀀싱 (16S rRNA amplicon sequencing)과 환경 샘플의 주어진 모든 유전자의 염기서열 분석을 하는 삿건 메타게놈(shotgun metagenome) 분석이 있다. 16S rRNA 앰플리콘 시퀀싱의 경우 환경에서의 균주 조성만을 확인 가능하며 미생물 군체의 기능적인 면까지는 확인이 어렵다. 하지만 샷건 메타게놈의 경우 군체의 균주 조성은 물론 기능적인 면까지 가능하다는 장점을 있다. 하지만 16S rRNA 앰플리콘 시퀀싱에 비해 수 많은 정보를 가지고 있기 때문에 용량이 크다는 점과 이에 분석량이 많고 비용적으로도 비싸다는 단점을 가지고 있다.
마이크로바이옴(microbiome, 미생물군집체)은 '특정 환경에 존재하는 모든 미생물의 총합'을 의미한다. 다양성은 알파 다양성, 베타 다양성, 감마 다양성이 있다. 알파 다양성은 하나의 샘플에 존재하는 다양한 미생물의 분포를 확인 하근 것이다. 베타 다양성은 샘플의 다양성이 비슷한지 여부이다. 감마 다양성은 한 지리적 지역 내 모든 군집에 대한 총 다양성을 의미한다.
본 발명자들은 스왑 샘플링(swab sampling) 방법을 통해 마이크로바이옴을 분석하였을 때 보다 더 정확하게 마이크로바이옴 분석을 수행할 수 있는 점을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
자연계에 존재하는 미생물의 군집을 보다 정확히 반영하는 마이크로바이움 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 위해서 본 발명은 마이크로바이움을 분석하는 방법에 있어서, 시료 채취시 스왑 샘플링(swap sampling) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로바이옴 분석 방법을 제공한다. 상기 스왑 샘플링에 의해 얻어진 시료는 보존 용액을 포함하는 보존 용기에 보존하는 단계를 추가적으로 더 포함할 수 있다. 보존용액에는 시료내의 미생물 또는 바이러스의 파괴를 방지하는 완충용액을 사용할 수 있다. 바람직하게는 인산염버퍼(Phosphate buffer saline: PBS)일 수 있다. 그 외 핵산을 안정화시킬 수 있는 물질을 추가적으로 더 포함할 수 있다. 예를 들어 한국 특허 출원 10-2008-0095985에서 제시한 바와 같이 시료의 보존을 위해 구아니딘 티오시안네이트(Guanidine thiocyanate)와 같은 물질을 사용할 수 있다.
상기 시료는 마이크로바이옴 분석을 위해서, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 여과를 통해서 불순물을 제거할 수 있다.
본 발명에 따른 시료 채취는 면봉을 이용하여 항문 또는 질로부터 채취되어질 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로바이움 분석 방법은 종래의 대변 시료를 채취하여 분석하는 방법에 비하여 장내 미생물 군집을 더 잘 반영하여, 마이크로바이옴 환경의 구성 및 이를 이용한 치료에 더 정확한 분석을 제공한다. 본 발명에 따른 스왑 샘플링이 종래 대변 샘플링 보다 모든 부위에서 R값이 크고, 실제 대장내의 미생물군총을 2.9(291%)배 더 정확히 반영한다.
도 1 본 발명에 따른 마이크로바이옴 분석방법에 대한 절차도를 보인다.
도 2는 장의 각 부위와 대변 시료 및 본 발명에 따른 스왑 샘플링과의 선형관계를 보인다. R값은 붉은 숫자로 나타냈고, * : P-value < 1.0E-10; ** : P-value < 1.0E-100; *** : P-value < 1.0E-200.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
[실시예 1] 본 발명에 따른 마이크로바이옴 분석
시료 채취
배설물 시료는 장의 4곳(상행결장, 하행결장, S상결장, 직장) 및 대변, 항문스왑(Anus Swab)을 포함하여 총 6개의 샘플을 수집하였다. 장에서의 시료 채취는 대장내시경시 상행결장, 하행결장, S상결장, 직장(Ascending colon, Descending colon, Sigmoid colon, Rectum(이하 A,D,S,R)) 부위에서 썩션(Suction) 하여 즉시 -80℃에 냉동하였고, 항문스왑 시료는 병원에서 수집되었다. 대변 시료는 대상자가 직접 AccuStool Collection kit(AccuGene, Incheon, Korea)을 이용하여 수집 및 제공되었다(표 1).
Figure PCTKR2022002600-appb-T000001
DNA 추출 및 서열분석
상행결장, 하행결장, S상결장, 직장 및 항문스왑 시료는 AccuBuccal DNA Preparation kit(AccuGene, Incheon, Korea)를, 대변 시료는 AccuStool DNA Preparation kit(AccuGene, Incheon, Korea)를 사용하여 제공된 프로토콜에 따라 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 3ng(x2)으로 Ion 16S™ Metagenomics Kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 사용하여 제공된 프로토콜에 따라 16S rRNA gene의 고변이지역(hypervariable regions)을 V2, V4, V8 프라이머 세트 및 V3, V6-7, V9 프라이머 세트를 이용하여 증폭(Amplify) 하여 라이브러리를 제작하였다. 이를 표 2로 나타내었다.
Figure PCTKR2022002600-appb-T000002
서열분석은 Chef Protocol - 400 bp 프로토콜에 따라 Ion Chef™(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)와 Ion S5XL™(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)에서 Ion 530™ Chip (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)을 통해 분석되었고, 각 시료 당 200,000 Reads 이상을 생산하였다.
지역의 분할(Splitting by region)
Ion 16S Metagenomics Kit에는 다양한 primer가 포함되어 있어, 7개 variable region의 sequencing reads가 하나의 FASTQ 파일로 제공된다. usearch(v11.0.667)을 이용하여 primer(V2, V3, V4, V67, V8, V9)와 binding 하는 영역을 추출하였다.
노이즈 제거 및 계통분석을 위한 처리
바코드(Barcode) 및 어답터 서열 제거는 Cutadapt(v2.8)를 사용하였다. 노이즈 제거(Denoising)은 QIIME2의 DADA2(v1.14)를 이용하였다. 7개 지역으로 구분된 FASTQ 파일에 공통적으로 5`의 15bp 및 100bp 이하의 서열을 제거하였다. 지역별 FASTQ 파일의 필터 파라미터(Filter parameter)는 각각의 Quality score >25 이 되도록 적용하였다.
계통분류적 참고자료는 NCBI를 사용하였다. QIIME2의 classify-consensus-vsearch 알고리즘을 사용하여 유사도 99%로 계통분류적 처리(Taxonomic binning)을 진행하였다.
지역별로 생성한 OTU 표는 도 1의 방식을 적용하여 계산되었다. 지역별 OTU 표의 중복된 OTU ID의 값(abundance)는 최대값만 선택하여 하나의 OUT ID당 상기 최대값 하나만의 OTU값을 가지도록 하여 통합 OTU 표를 작성하였다.
통계분석
노말화(Normalization)는 CSS(Cumulative Sum Scaling)을 사용하였고, 이때 10 시료 미만에서 발견된 OTUs는 제거하였다. 다양성 측정(alpha와 beta diversity, Unifrac analysis)를 사용하여 위치(Location), BMI 변수에 따른 그룹별 차이점 분석을 진행하였다. Pearson correlation 방법을 통해 위치 사이의 상관관계를 분석했으며, 사후검정(Bonfferoni)으로 P-value를 보정하였다.
샘플 부위간 및 본 발명에 따른 스왑 샘플링의 상관관계 비교
상행결장, 하행결장, S상결장, 직장(Ascending colon, Descending colon, Sigmoid colon, Rectum(이하 A,D,S,R)) 부위의 시료와 대변시료 및 본 발명에 따른 항문 스왑 샘플의 마이크로바이옴 상관관계를 강(class) 수준에서 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
부위 간의 상관관계를 알아보기 위해 상관분석(Pearson Correlation Analysis)를 진행하고, 사후검정(Bonferroni)을 하여 P-value를 보정하였고, 이를 표 3에 나타 내었다.
Figure PCTKR2022002600-appb-T000003

Claims (4)

  1. 마이크로바이움을 분석하는 방법에 있어서,
    시료 채취시 스왑 샘플링(swap sampling) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로바이옴 분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 스왑 샘플링에 의해 얻어진 시료를 보존 용액을 포함하는 보존 용기에 보존하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로바이옴 분석 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 보존 용기내에 시료 여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로바이옴 분석방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 시료는 항문으로부터 채취되는 것을 특징으로 하는 마이크로바이옴 분석 방법.
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