WO2022164149A1 - 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브 및 이를 이용한 혼합 용액의 분리 방법 - Google Patents

용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브 및 이를 이용한 혼합 용액의 분리 방법 Download PDF

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WO2022164149A1
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centrifuge tube
separator
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density gradient
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최성용
김병연
서광명
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주식회사 큐리오시스
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Definitions

  • the present invention relates to a centrifuge tube including a solution separator and a method for separating a mixed solution using the same.
  • Peripheral blood mononuclear cells in the blood are composed of lymphocytes and monocytes, and the lymphocytes are the main immune cells and are responsible for an important immune response to remove abnormal cells such as bacteria and viruses or foreign invading pathogens such as bacteria or cancer cells. Therefore, peripheral blood mononuclear cells are being used in various fields requiring immune response analysis, such as immunological research, hematologic malignancy, vaccine development, transplantation therapy, toxicology, and the like.
  • red blood cells which account for the majority of blood cells (more than 99% of total blood cells), and granulocytes, which account for more than 60% of white blood cells, exist in the blood. The method is essential for such immune-related applications.
  • Density gradient centrifugation is a method for separating substances with different densities, and uses a solution having a density value between the densities of substances to separate without mixing with water.
  • a density gradient solution having a density value between them (eg, Ficoll, density is 1.077 g/mL) and centrifugation is performed (FIG. 1).
  • FOG. 1 density gradient solution having a density value between them
  • red blood cells and granulocytes which are denser than the density gradient solution, sink to the bottom of the density gradient solution
  • peripheral blood mononuclear cells which are less dense than the density gradient solution, float above the density gradient solution.
  • thinly formed peripheral blood mononuclear cells can be recovered through pipetting.
  • the separation efficiency of the density gradient centrifugation method is greatly influenced by the user's pipetting technique and separation experience, and there is a disadvantage in that there is a large variation in the separation efficiency between users.
  • FIGS. 2 and 3 In order to reduce the separation efficiency deviation between users and to easily separate peripheral blood mononuclear cells, methods for forming a physical barrier between the red blood cell and granulocyte layers and the peripheral blood mononuclear cells have been proposed ( FIGS. 2 and 3 ).
  • the physical barrier prevents mixing between the blood and the gradient solution, allowing for easy blood infusion and recovery of peripheral blood mononuclear cells.
  • SepMate it forms a funnel-shaped barrier and residual red blood cells remain on the surface of the funnel, which can decrease the separation efficiency. .
  • the present invention is to provide a centrifuge tube including a solution separator capable of supplementing the above disadvantages and a method for separating a mixed solution having a density difference using the centrifuge tube.
  • centrifuge tube body and a solution separator positioned in the centrifuge tube body and including a micro mesh having a plurality of layers;
  • centrifuge tube comprising a.
  • centrifuge tube body located in the centrifuge tube body and including a micro-mesh having a plurality of layers;
  • a centrifuge tube including a solution separator according to the present invention By using a centrifuge tube including a solution separator according to the present invention, a mixed solution including a plurality of substances having different densities can be separated simply and efficiently.
  • the enhanced Laplace pressure of the micro-mesh including a plurality of layers overcomes the head pressure caused by the water column and prevents water from pouring out when the centrifuge tube is turned over to recover the solution existing on the upper surface of the solution separator.
  • a solution separator including a plurality of layers of micro-mesh in the centrifuge tube it is possible to easily separate the upper and lower solutions separated by the density difference based on the solution separator.
  • blood is separated up and down in a solution separator by density gradient centrifugation, and desired blood fractions such as erythrocytes, granulocytes, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) can be easily separated by simply inverting the centrifuge tube. can be separated.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the principle of density gradient centrifugation and separation of peripheral blood mononuclear cells.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a separation process using SepMate.
  • CPT Cell Preparation Tube
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a centrifuge tube including a solution separator.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a process for separating peripheral blood mononuclear cells using a centrifuge tube including a solution separator.
  • FIG. 6 is a conceptual diagram of the head height in a centrifuge tube including a solution separator.
  • FIG. 7 is a graph showing the critical radius size of the mesh cell and the amount of blood compared to the density gradient capacity for each volume of the centrifuge tube.
  • FIG. 8 is a photograph of an example of isolation of peripheral blood mononuclear cells using a solution separator.
  • FIG. 9 is a graph showing (a) a solution separation experiment using a solution separator and (b) a change in operating pressure according to the mesh size.
  • FIG. 10 is a graph showing (a) a density gradient centrifugation experiment using a solution separator and (b) a graph showing the trajectory of red blood cells sedimenting according to the centrifugation time.
  • centrifugation method In general, in order to separate a mixed solution of substances having different densities, a centrifugation method is typically used.
  • the present invention relates to a centrifuge tube including a solution separator for easily separating a mixed solution containing a plurality of substances having different densities, and a method for separating a mixed solution using the same.
  • a solution to be separated using the solution separator of the present invention is a “mixed solution comprising a plurality of substances having different densities”.
  • the "mixed solution comprising a plurality of substances having different densities” may be a solution in which substances having different densities are mixed, and the type thereof is not particularly limited.
  • the mixed solution including a plurality of substances having different densities may be, for example, blood or a specific fraction of blood.
  • the types of blood cells present in the blood are very diverse, and their sizes and densities are all different depending on the types.
  • cells present in an individual have different sizes and densities depending on their type, maturity, and the like.
  • a mixed solution containing cells having different types and maturities may also be an example of the "mixed solution containing a plurality of substances with different densities" as referred to in the present invention.
  • the centrifugation method is also called the density gradient method.
  • it is efficient to use a density gradient solution that separates layers between substances having different densities.
  • a density gradient solution having a value between the densities of the substances can be used.
  • Various density gradients may be set by combining different types of solutions, or different density gradients may be set to be suitable for desired cell separation by diluting one type of solution to various concentrations.
  • the following density gradient solution can be used.
  • Ficoll-Hypaque is a mixture of Ficoll (polysucrose) and Hypaque (sodium diatrizoate).
  • Ficoll-Hypaque Plus Product No. 10771 is a mixture of polysucrose and sodium diatrizoate at a density of 1.077 g/mL.
  • Histopaque-1077 is a sterile, endotoxin tested solution of polysucrose and sodium diatrizoate, adjusted to a density of 1.077 g/mL.
  • erythrocytes have different sizes according to their maturity, and if the specific gravity is lighter than 1.090 (specific gravity 1.090), the erythrocytes are separated almost purely. Blood is only one example of a mixed solution to be separated in the present invention, but is not limited thereto.
  • the present invention is a centrifuge tube body; and a solution separator positioned in the centrifuge tube body and including a micro mesh having a plurality of layers;
  • It relates to a centrifuge tube comprising a.
  • the micro-mesh has a mesh cell that satisfies a pressure lower than the Laplace pressure acting on the droplets of the solution condensed on the micro-mesh cell in which the head pressure of the solution located under the lower surface of the solution separator including the micro-mesh is lower.
  • the centrifuge tube including the solution separator may further include a centrifuge tube cap.
  • the radius of the mesh cell may satisfy Equation 1 below:
  • Rm is the radius of the mesh cell
  • ⁇ is the density of the density gradient solution
  • g is the acceleration due to gravity
  • h is the distance from the bottom of the centrifuge tube to the top of the solution separator
  • ⁇ means the surface tension of the density gradient solution.
  • Equation 1 may be expressed as Equation 2 below.
  • the minimum value of Rm is 0.1 mm.
  • h is the distance from the bottom surface of the centrifuge tube to the top surface of the solution separator and can be referred to as the head height (see FIG. 6 ).
  • the value of h is determined based on the amount of the density gradient solution used and the amount of the mixed solution to be separated. As shown in Table 1, the amount of the density gradient solution to be used is determined according to the amount of the mixed solution to be separated, and the height of the solution separator is determined so that the solution separator is submerged to the upper surface at the height at which the density gradient solution is filled.
  • micro mesh is a type of porous membrane, and mesh cells are formed as pores on the surface of the membrane.
  • the mesh cell in the present invention may be a hexagonal, circular, square, or triangular shaped hole, and more preferably a hexagonal shape, but is not limited thereto.
  • the solution separator In the solution separator, a plurality of layers of micro-mesh are coupled to each other at regular intervals.
  • the surface tension pressure does not overcome the head pressure and when the separated solution is poured from the upper part of the solution separator, the solution from the lower part may flow out together.
  • the closer the spacing between the layers of the solution separator the smaller the gap between the upper and lower layers of the solution separator, the greater the strength of the solution
  • the greater the number of mesh layers of the solution separator the greater the separation efficiency. good night.
  • the solution separator may include a micro-mesh of 2 or 3 layers.
  • the solution separator is located in the centrifuge tube body and is fixed at a predetermined height so that it does not move during centrifugation or separation of the solution.
  • the position of the solution separator in the centrifuge tube body is determined in consideration of the above-described h value (distance from the bottom surface of the centrifuge tube to the top surface of the solution separator).
  • the solution separator is molded into a fixed type centrifugal tube, or the outer diameter of the solution separator is almost identical to the inner diameter of the centrifuge tube so that both of them fit tightly, or a fixing groove is provided for fixing at a desired height, or
  • the material and the solution may be fixed by a method such as fixing with an adhesive having physical properties that does not modify, but is not limited thereto.
  • the radius of the mesh cell of the micro-mesh may be 0.1 to 0.6 mm, preferably 0.2 to 0.6 mm, more preferably 0.28 to 0.57 mm.
  • the radius of the mesh cell and the laplace pressure are inversely proportional. If the radius is too large, the Laplace pressure will decrease. When the separated solution is poured on the upper surface of the solution separator in the centrifuge tube after centrifugation, the solution at the bottom may flow out together. If the radius is too small, the separation time is long. There may be disadvantages such as losing.
  • the height of the solution separator in the centrifuge tube may be 1.5 to 4.5 cm, preferably 1.75 to 4.25 cm, more preferably 2 to 4 cm.
  • the radius of the mesh cell and the height of the solution separator are merely examples considering the size and volume of the conventionally commercialized centrifuge tube as described above, so it depends on the density of the mixed solution to be separated, the capacity and the capacity of the centrifuge tube to be used.
  • the radius of the mesh cell and the height of the solution separator may vary.
  • the height of the solution separator is determined according to the capacity of the centrifuge tube to be used, the mixed solution and the density gradient solution containing a plurality of materials having different densities to be separated, and the height of the solution separator is The height determines the critical radius. As the amount of the density gradient solution increases, the critical radius decreases because the height of the solution separator rises.
  • centrifuge tube body located in the centrifuge tube body and including a micro-mesh having a plurality of layers.
  • the density gradient solution a solution having an intermediate density of a mixture of solutions having different densities may be used.
  • the density gradient solution may be injected at 10 vol% to 40 vol% of the total volume of the centrifuge tube, preferably 10 vol% to 35 vol%, more preferably 10 vol% to 25 vol%.
  • the smallest amount that can sufficiently cover the solution separator was injected. If there is too much density gradient solution, the separation time may be long, and if it is too small, it may not be divided neatly when pouring the separated solution on the upper surface of the solution separator after separation.
  • the density gradient solution and the mixed solution may be injected in a volume ratio of 1: 0.5 to 1: 2, preferably 1: 0.6 to 1: 1.7, more preferably 1: 0.7 to 1: 1.5 by volume.
  • the mixed solution refers to a mixed solution including a plurality of substances having different densities.
  • the mixed solution including a plurality of substances having different densities may be blood.
  • It provides a method for separating peripheral blood mononuclear cells from blood, comprising: inverting the centrifuge tube, and recovering a fraction containing peripheral blood mononuclear cells present on the upper surface of the solution separator from the centrifuge tube.
  • Example 1 Method of separating the solution precipitated at the bottom of the solution separator and the solution at the top of the solution separator
  • FIG. 4 A conceptual diagram of the solution separator ( FIG. 4 ) and a process for separating peripheral blood mononuclear cells using the same ( FIG. 5 ) are schematically shown.
  • a density gradient solution ficoll
  • a solution separator is a device designed to easily recover target cells, and can recover target cells just by inverting the centrifuge tube.
  • the micro-mesh cell was manufactured in the same hexagonal shape as the honeycomb for the convenience of manufacture, and is shown in the enlarged view of FIG. 4 .
  • the shape of the micro-mesh cell is not particularly limited and can be manufactured in various shapes such as round, square, or triangle.
  • the solution separator is a form in which two mesh layers are combined with a certain distance apart. This is a structure to compensate for the drop in solution separation efficiency when the solution separator consists of only a single mesh layer (in the case of a single mesh layer, there was a problem in that the solution was discharged when the centrifuge tube was turned over).
  • the separation of the solution by the mesh is determined by the balance between the head pressure of the solution filled inside the centrifuge and the surface tension pressure acting on the water droplets on the mesh (Equation 2).
  • the amount of the density gradient solution for each centrifuge tube volume was first set. After that, when the volume of the density gradient solution for each volume of the centrifuge tube was changed, the remaining parameters were determined.
  • the blood and PBS are diluted at a volume ratio of 1:1, and the maximum amount of each centrifuge tube was set in consideration of the amount of PBS.
  • the minimum volume of the density gradient solution (ficoll) to enter the tube should be greater than or equal to the bottom cone of the tube, it was determined to be 2 mL. At this time, the amount of separable blood should theoretically be 3 mL. Since the maximum volume of the tube is 5 mL when diluted with 1 and put into the tube, 2 mL of ficoll + 3 mL of diluted blood is the maximum volume that can be processed, so only in the case of a 5 mL tube, the maximum volume of blood that can be processed is limited to 1.5 mL.
  • a centrifuge tube including a solution separator and a centrifuge tube without a solution separator were identified and shown in FIG. 10 .
  • a major limitation of the isolation of peripheral blood mononuclear cells using the density gradient centrifugation method is that the target cells are exposed to a cell-incompatible density gradient solution for a long time.
  • the target cell separation time is determined by the amount of density gradient solution filled in the tube. That is, the deeper the depth of the density gradient solution, the longer the separation time is required.
  • a density gradient solution (ficoll) is filled to separate 10 mL of blood when using a 50 mL tube, which is 50 mL
  • the centrifuge tube is filled to a depth of approximately 3.5 cm.
  • centrifugation with 1,200 g RCF takes more than 12 minutes to separate.
  • the solution separator is a device designed to improve this and shorten the separation time, and minimize the use of the separation solution because the mesh of the solution separator can actively prevent mixing between the non-target cell layer and the target cell layer.
  • the separation solution (ficoll) can be filled to a depth of 2.4 cm in order to rise slightly higher than the height of the solution separator, and the separation time can be reduced to less than 8 minutes.

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Abstract

본 발명은 용액분리기를 이용한 밀도차가 있는 혼합 용액의 분리 방법을 제 공한다. 본 발명에 따른 용액분리기를 이용한 혼합 용액 분리 방법은 기존의 밀도구 배 원심분리 튜브를 이용한 분리법보다 간편하며 분리 시간이 단축된다.

Description

용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브 및 이를 이용한 혼합 용액의 분리 방법
본 발명은 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브 및 이를 이용한 혼합 용액의 분리 방법에 관한 것이다.
혈액 내에 존재하는 말초 혈액 단핵세포는 림프구와 단핵구로 이루어져 있으며, 이중 림프구는 주요 면역세포로서 박테리아, 바이러스와 같이 외부에서 침입한 병원균 또는 암세포와 같은 비정상적 세포를 제거하는 중요한 면역반응을 담당한다. 따라서, 말초 혈액 단핵세포는 면역학 연구, 혈액학적 악성종양, 백신 개발, 이식 치료, 독성학 등과 같이 면역반응 분석이 필요한 다양한 분야에서 활용되고 있다. 하지만, 혈액 내에는 말초 혈액 단핵세포 외에도 혈액 세포의 대다수(전체 혈액 세포의 99% 이상)를 차지하는 적혈구와 백혈구의 60% 이상을 차지하는 과립구가 존재하기 때문에 이들 세포로부터 말초 혈액 단핵세포를 효율적인 분리하는 방법은 상기 면역관련 응용을 위해서 필수적이다.
밀도구배 원심분리법은 밀도가 다른 물질을 분리하기 위한 방법으로 물과 섞이지 않으면서 분리하기 위한 물질들의 밀도 사이의 밀도값을 갖는 용액을 이용한다. 말초 혈액 단핵세포와 적혈구 및 과립구를 분리하기 위해서, 이들 사이의 밀도값을 갖는 밀도구배용액 (예, Ficoll, 밀도는 1.077 g/mL) 위에 혈액을 주입하고 원심분리를 수행한다(도 1). 원심분리 결과, 밀도구배용액보다 밀도가 높은 적혈구와 과립구는 밀도구배용액 밑으로 가라앉고 밀도구배용액보다 밀도가 낮은 말초 혈액 단핵세포는 밀도구배용액 위로 뜨게된다. 이렇게 공간적인 분리 후에 피펫팅을 통해 얇게 형성된 말초 혈액 단핵세포를 회수할 수 있다.
밀도구배 원심분리법을 이용한 말초 혈액 단핵세포 분리 과정은 밀도구배용액과 혈액 사이의 혼합 없이 조심스러운 혈액 주입과 원심분리 후 얇게 형성된 (수 mm 이내) 말초 혈액 단핵세포의 조심스러운 회수가 중요하다. 따라서 밀도구배 원심분리법의 분리 효율은 사용자의 피펫팅 기술 및 분리 경험에 의해서 크게 좌우되며, 사용자간 분리 효율의 편차가 크다는 단점이 있다.
이러한 사용자간 분리 효율 편차를 줄이고 손쉽게 말초 혈액 단핵세포를 분리하기 위해서, 적혈구 및 과립구 층과 말초 혈액 단핵세포 사이에 물리적인 장벽을 형성하는 방법들이 제시된 바 있다 (도 2 및 도 3). 물리적 장벽은 혈액과 밀도구배용액 사이의 혼합을 방지하여 손쉬운 혈액 주입 및 말초 혈액 단핵세포 회수를 가능하게 한다. 하지만, SepMate의 경우 깔데기 모양의 장벽을 형성하여 깔대기 표면에 잔류 적혈구가 남아 분리 효율을 떨어뜨릴 수 있으며, CPT의 경우 촘촘하며 불균일한 투과막에 적혈구가 남아 분리 효율을 떨어뜨릴 수 있다는 단점을 가진다.
이에 본 발명에서는 상기 단점을 보완할 수 있는 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브 및 이를 이용한 밀도차가 있는 혼합 용액의 분리 방법을 제공하고자 한다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여,
원심분리 튜브 본체; 및 상기 원심분리 튜브 본체 내에 위치하며, 복수개의 층을 갖는 마이크로 메쉬(mesh)를 포함하는 용액분리기;
를 포함하는 원심분리 튜브를 제공한다.
또한, 원심분리 튜브 본체; 및 상기 원심분리 튜브 본체 내에 위치 하며, 복수개의 층을 갖는 마이크로 메쉬(mesh)를 포함하는 용액분리기;를 포함하는 원심분리 튜브를 이용하는, 혼합 용액 분리 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 원심분리 튜브에 용액분리기 상부면을 넘는 양의 밀도구배용액을 주입하는 단계;
상기 원심분리 튜브에 밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액을 주입하는 단계;
상기 원심분리 튜브를 원심분리하는 단계; 및
상기 원심분리 튜브를 뒤집어, 상기 원심분리 튜브에서 용액분리기 상부면 위에 존재하는 용액을 회수하는 단계;를 포함하는 혼합 용액 분리 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브를 이용하면 밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액을 간단하고 효율적으로 분리할 수 있다.
복수개의 층을 포함하는 마이크로 메쉬의 강화된 라플라스 압력은 원심분리 튜브를 뒤집어 용액분리기 상부면 위에 존재하는 용액을 회수할 때, 물기둥에 의한 수두압을 이겨내고 물이 쏟아지지 않게 한다. 원심분리 튜브 내에 복수 개의 층의 마이크로 메쉬를 포함하는 용액분리기를 포함시킴으로써 용액분리기를 기준으로 밀도차이에 의해 분리된 상하의 용액을 손쉽게 분리할 수 있다.
또한, 혈액을 밀도구배 원심분리법에 의해 용액분리기의 상하로 분리시켜 적혈구 및 과립구(granulocyte)와 말초 혈액 단핵세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cells) 등의 원하는 혈액 분획을 원심분리 튜브를 뒤집는 것만으로 손쉽게 분리할 수 있다.
도 1은 밀도구배 원심분리 원리 및 말초 혈액 단핵세포 분리 모식도 이다.
도 2는 SepMate를 이용한 분리과정 모식도이다.
도 3은 Cell Preparation Tube(CPT) 분리 과정 모식도이다.
도 4는 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브의 모식도이다.
도 5는 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브를 이용한 말초 혈액 단핵세포 분리 과정 모식도이다.
도 6은 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브에서 수두높이의 개념도이다.
도 7은 원심분리 튜브의 용량 별 밀도구배용량 대비 메쉬 셀의 임계 반지름 (Critical radius) 크기 및 혈액의 양 그래프이다.
도 8은 용액분리기를 이용한 말초 혈액 단핵세포 분리 실시예 사진이다.
도 9은 (a) 용액분리기를 이용한 용액 분리 실험 및 (b) 메쉬 크기에 따른 작용 압력의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 10은 (a) 용액분리기를 이용한 밀도구배 원심분리 실험 및 (b) 원심분리 시간에 따라 침강하는 적혈구의 궤적을 보여주는 그래프이다.
일반적으로, 밀도차가 있는 물질들의 혼합 용액을 분리하기 위해서, 대표적으로 원심분리법을 사용한다.
본 발명은 밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액을 손쉽게 분리하기 위한 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브 및 이를 이용한 혼합 용액의 분리 방법에 관한 것이다.
본 발명의 용액분리기를 이용하여 분리하고자 하는 용액은 "밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액"이다.
"밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액"은 밀도가 상이한 물질들이 혼합된 용액이면 되고 그 종류가 특별히 제한되지 않는다. 다만, 구체적인 예를 들자면, 밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액은 예를 들어 혈액 또는 혈액의 특정 분획일 수 있다. 혈액 내에 존재하는 혈액 세포들은 그 종류가 매우 다양하고, 종류에 따라 크기도 밀도도 모두 상이하다. 혈액 세포 외에도, 개체 내에 존재하는 세포들은 그 종류나 성숙도 등에 따라 크기와 밀도가 모두 상이하다. 예를 들어, 흉선에는 대식세포, 수지상세포,　B세포,　상피세포, T 세포 등이 다양하게 존재하며, 같은 종류라 하더라도 분화세포와 미분화세포들이 다양하게 혼재되어 있는 상태인데, 이러한 흉선에 존재하는 다양한 세포들은 그 종류 또는 성숙도에 따라 크기와 밀도가 모두 상이하다. 따라서, 각기 다른 종류와 성숙도를 갖는 세포들을 포함하는 혼합용액 또한 본 발명에서 말하는 "밀도가 상이 한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액"의 일 예가 될 수 있다. 연구, 진단, 혹은 치료의 목적으로 개체 내에 존재하는 특정 세포를 분리해야 할 경우, 본 발명에 따른 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브를 이용하여 손쉽게 원하는 세포를 분리할 수 있다.
원심분리법은 밀도구배법이라고도 하는데, 원심분리법을 이용하여 밀도차가 있는 물질의 혼합 용액을 분리하기 위해서는, 밀도가 상이한 물질들 간의 층을 구분해 주는 밀도구배용액을 사용하는 것이 효율적이다.
분리하고자 하는 혼합 용액을 이루는 물질들의 밀도가 알려져 있는 경우에, 그 물질들의 밀도의 사이값을 가진 밀도구배용액을 사용할 수 있다. 각기 종류가 다른 용액들을 조합하여 다양한 밀도구배를 설정할 수도 있고, 다르게는 한 종류의 용액을 다양한 농도로 희석하여 원하는 세포 분리에 적합하도록 다양한 밀도 구배를 설정할 수 있다.
앞서 예시한 혈액 및 혈액 분획들에 대해, 예를 들어 다음과 같은 밀도구배용액을 사용할 수 있다.
1) Percoll: a specific gravity 1.130 g/mL
2) Ficoll-Hypaque is a mixture of Ficoll (polysucrose) and Hypaque (sodium diatrizoate). Ficoll-Hypaque Plus Product No. 10771 is a mixture of polysucrose and sodium diatrizoate at a density of 1.077 g/mL.
3) Histopaque-1077 is a sterile, endotoxin tested solution of polysucrose and sodium diatrizoate, adjusted to a density of 1.077g/mL.
예를 들어, 적혈구는 성숙도에 따라 크기가 다른데, 비중이 1.090 보다 가벼우면 (비중 1.090) 적혈구가 거의 순 수하게 분리된다. 혈액은 본 발명에서 분리하고자 하는 혼합 용액의 예시 중 하나 일 뿐이며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 원심분리 튜브 본체; 및 상기 원심분리 튜브 본체 내에 위치하며, 복수개의 층을 갖는 마이크로 메쉬(mesh)를 포함하는 용액분리기;
를 포함하는 원심분리 튜브에 관한 것이다.
상기 마이크로 메쉬는, 마이크로 메쉬를 포함하는 용액분리기 하부 면 아래에 위치하는 용액의 수두압이, 마이크로 메쉬 셀에 맺힌 용액의 물방울에 작용하는 라플라스 압력보다 낮은 압력을 만족하는 메쉬 셀(cell)을 가질 수 있다.
상기 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브는 원심분리 튜브 뚜껑을 추가로 포함할 수 있다.
상기 메쉬 셀의 반지름은 하기 수학식 1을 만족할 수 있다:
[수학식 1]
Figure PCTKR2022001206-appb-I000001
상기 수학식 1에서,
Rm은 메쉬 셀의 반지름이고,
ρ는 밀도구배용액의 밀도이며,
g는 중력가속도이고,
h는 원심분리 튜브 바닥면에서부터 용액분리기의 상부면까지의 거리 이며,
γ는 밀도구배용액의 표면장력을 의미한다.
상기 수학식 1은 다음의 수학식 2와 같이 표현될 수도 있다.
Figure PCTKR2022001206-appb-I000002
(수학식 2)
여기서, PLM은 라플라스 압력(Laplace pressure, =
Figure PCTKR2022001206-appb-I000003
), PH는 중력에 의한 수두압(Hydrostatic pressure by gravity, =
Figure PCTKR2022001206-appb-I000004
)을 의미한다. 상기 수학식 2에서, 'P=0' 이 되는 메쉬 셀의 반지름(Rm) 값이 임계 반지름(critical radius)이며, 용액의 분리는 P≤0, 다시 말해서 Rm값이 임계 반지름 값보다 작거나 같아야만 가능하다. Rm값이 임계 반지름 값보다 너무 작으면 분리 시간이 길어지는 문제가 있으며, 크면 원심분리 후 용액분리기 상부면 위에 분리된 용액을 따라낼 때, 하단 부의 용액이 함께 흘러나오는 문제점이 있을 수 있다. Rm의 최소값은 0.1mm이다.
상기 h는 원심분리 튜브 바닥면에서부터 용액분리기의 상부면까지의 거리이며 수두높이라고 할 수 있다(도 6 참조). h의 값은 사용하는 밀도구배용액의 양과 분리할 혼합 용액의 양을 기준으로 정해진다. 표 1에서와 같이 분리할 혼합 용액의 양에 따라 사용되는 밀도구배용액의 양이 결정되어서, 이 밀도구배용액이 채워지는 높이에, 용액분리기가 상부면까지 잠기도록 용액분리기의 높이가 정해진다. 실시예에서는, 50mL의 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브를 이용하여 10 mL 의 혼합용액(혈액)을 분리하기 위해 7mL의 분리용액을 주입하였으며, 그때의 용액 분리기 높이(수두높이)는 2.3cm, 밀도구배용액의 높이는 용액분리기 높이보다만 높게 올라오면 되기 때문에, 상부면이 잠기게 되는 2.4cm로 설정하였다.
본 명세서에서 용어 "마이크로 메쉬(mesh)"는 다공성 분리막의 일종이며, 막 표면에 포어(pore)로 메쉬 셀(cell)이 형성되어 있다. 본 발명에서의 메쉬 셀은 육각형, 원형, 사각형, 삼각형의 모양의 구멍일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 육각형 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
용액분리기는 복수 개의 층의 마이크로 메쉬가 일정한 간격으로 떨어져 결합되어 있다. 마이크로 메쉬가 단일층일 경우엔 표면장력 압력이 수두압을 이기지 못해 용액분리기 상단부에 분리된 용액을 따라낼 때, 하단부의 용액이 함께 흘러나올 수 있다. 용액분리기 제작 상의 문제만 없다면, 용액분리기 층 사이의 간격은 가까울수록(용액분리기의 상부층과 하부층의 갭이 작을수록 용액이 버티는 힘이 더 커짐), 용액분리기의 메쉬 층의 개수가 많을수록 분리 효율은 좋다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 용액분리기는 2 또는 3개의 층의 마이크로 메쉬를 포함하는 것일 수 있다.
용액분리기는 원심분리 튜브 본체 내에 위치하며, 소정의 높이에 고정되어 있어 원심분리 또는 용액의 분리 과정에서 움직이지 않아야 한다. 원심분리 튜브 본체 내에서의 용액분리기의 위치는 앞서 살펴본 h 값(원심분리 튜브 바닥면 에서부터 용액분리기의 상부면까지의 거리)을 고려하여 정해진다. 용액분리기가 고정된 형태의 원심분리 튜브로 성형하거나, 용액분리기의 외경을 원심분리 튜브의 내경과 거의 일치시켜 양자가 딱 들어맞게 함으로써 고정시키거나, 원하는 높이에 고정하기 위한 고정 홈을 두거나, 또는 혼합 용액을 분리할 때, 물질 및 용액을 변성시키지 않는 물성의 접착제로 고정하는 등의 방법으로 고정시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에 제한되는 것은 아니나, 종래 상업화되어 있는 원심분리 튜브의 크기와 부피를 고려할 때, 마이크로 메쉬의 메쉬 셀의 반지름은 0.1 내지 0.6 mm일 수 있으며, 바람직하게는 0.2 내지 0.6 mm, 더욱 바람직하게는 0.28 내지 0.57 mm 일 수 있다. 메쉬 셀의 반지름과 라플라스 압력(laplace pressure)은 반비례 한다. 반지름이 너무 크면 라플라스 압력이 작아져, 원심분리 후 원심분리 튜브 내에서 용액분리기 상부면 위에 분리된 용액을 따라낼 때, 하단부의 용액이 함께 흘러나올 수 있으며, 반지름이 너무 작으면 분리 시간이 길어지는 등의 단점이 있을 수 있다.
이에 제한되는 것은 아니나, 종래 상업화되어 있는 원심분리 튜브의 크기와 부피를 고려할 때, 원심분리 튜브 내의 용액분리기의 높이는 1.5 내지 4.5 cm일 수 있으며, 바람직하게는 1.75 내지 4.25 cm, 더욱 바람직하게는 2 내지 4 cm 일 수 있다.
상기 메쉬 셀의 반지름 및 용액분리기의 높이는 앞서 설명한 대로 종래 상업화되어 있는 원심분리 튜브의 크기와 부피를 고려한 예시에 불과하므로, 분리하고자 하는 혼합 용액의 밀도, 용량 및 사용하는 원심분리 튜브의 용량에 따라 메쉬 셀의 반지름 및 용액분리기의 높이는 달라질 수 있다.
실시예의 표 1 내지 3에서, 사용하고자 하는 원심분리 튜브의 용량, 분리하고자 하는, 밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액 및 밀도구배 용액에 따라 용액분리기의 높이가 정해지며, 그 용액분리기의 높이에 따라서 임계 반지름이 정해진다. 밀도구배용액의 양이 증가하면, 용액분리기의 높이가 상승하기 때문에, 임계 반지름이 감소한다.
다른 양태로서, 본 발명은
원심분리 튜브 본체; 및 상기 원심분리 튜브 본체 내에 위치하며, 복수개의 층을 갖는 마이크로 메쉬(mesh)를 포함하는 용액분리기;를 포함하는 원심 분리 튜브를 이용하는, 혼합 용액 분리 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 원심분리 튜브에 용액분리기 상부면을 넘는 양의 밀도구배용액을 주입하는 단계;
상기 원심분리 튜브에 밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액을 주입하는 단계;
상기 원심분리 튜브를 원심분리하는 단계; 및
상기 원심분리 튜브를 뒤집어, 상기 원심분리 튜브에서 용액분리기 상부면 위에 존재하는 용액을 회수하는 단계;를 포함하는 혼합 용액 분리 방법을 제공한다.
상기 밀도구배용액은 서로 다른 밀도를 가지는 용액의 혼합물의 중간 밀도인 용액을 사용할 수 있다.
밀도구배용액은 원심분리 튜브의 총 용량 대비 10 vol% 내지 40 vol%로 주입될 수 있으며, 바람직하게는 10 vol% 내지 35 vol%, 더욱 바람직하게는 10 vol% 내지 25 vol%용량으로 주입될 수 있다. 본 발명의 실험 예에서는, 용액분리기를 충분히 덮을 수 있는 가장 최소의 양이 주입되었다. 밀도구배용액이 너무 많으면 분리시간이 길어질 수 있으며, 너무 적으면 분리 후 용액분리기 상부면 위에 분리된 용액을 따라낼 때 깔끔하게 나누어 지지 않을 수 있다.
밀도구배용액과 혼합 용액은 1 : 0.5 내지 1 : 2의 부피비로 주입될 수 있으며, 바람직하게는 1 : 0.6 내지 1 : 1.7, 더욱 바람직하게는 1 : 0.7 내지 1 : 1.5의 부피비로 주입될 수 있다. 혼합 용액은 밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액을 의미한다. 실시예에서 혈액을 분리할 때 사용된 밀도구배용 액(ficoll)과 혈액의 부피비는 이론적으로 ficoll : 혈액 = 1 : 1.5일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼 합 용액은 혈액일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은
상기 본 발명의 원심분리 튜브에 용액분리기 상부면을 넘는 양의 밀 도구배용액을 주입하는 단계;
상기 원심분리 튜브에 혈액을 주입하는 단계;
상기 원심분리 튜브를 원심분리하는 단계; 및
상기 원심분리 튜브를 뒤집어, 원심분리 튜브 에서 용액분리기 상부 면 위에 존재하는 말초 혈액 단핵세포를 포함하는 분획을 회수하는 단계;를 포함하 는 혈액으로부터의 말초 혈액 단핵세포 분리 방법을 제공한다.
하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범 위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양 한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1. 용액분리기 하부에 침전된 용액과 용액분리기 상부의 용 액 분리 방법
용액분리기의 개념도 (도 4) 및 이를 이용한 말초 혈액 단핵세포 분리 과정 (도 5)을 모식도로 나타내었다. 용액분리기를 포함한 원심분리 튜브에 밀도구배 밀도구배용액(ficoll)을 용액분리기 상단부를 조금 넘치게 채운 후 혈액을 주입하고 원심분리를 수행한다. 밀도구배 원심분리에 의해서 비표적 세포인 적혈구와 과립구는 용액분리기 하단에 표적 세포인 말초 혈액 단핵세포는 용액분리기 상단에 위치하게 된다. 밀도구배 원심분리법을 이용해 말초 혈액 단핵세포의 분리 시에 가장 어려운 점은 얇게 형성된 말초 혈액 단핵세포 층을 분리하는 것이다. 하얀 색 층이 희미하게 보여 정확히 세포 층을 특정하여 회수하기 어려우며 이 때문에 표적 세포 회수율이 세포 분리 경험에 의해 크게 좌우된다. 용액분리기는 표적 세포를 손쉽게 회수하기 위해 고안된 장치로써, 원심분리 튜브를 뒤집는 것만으로 표적 세포를 회수할 수 있다.
실시예 2. 용액분리기의 마이크로 메쉬 셀의 크기 결정
마이크로 메쉬 셀은 제작의 편의상 벌집 모양과 동일하게 육각형 형태로 제작되었으며 도 4의 확대도와 같다. 마이크로 메쉬 셀의 형태는 특별히 제한 되지 않으며 원형, 사각형 또는 삼각형 등 다양한 형태로 제작이 가능하다. 용액분리기는 두 개의 메쉬 층이 일정 간격 떨어져 결합된 형태이다. 이는 용액분리기가 단일 메쉬층 만으로 구성되었을 때 용액 분리 효율이 떨어지는 현상을 보완하기 위한 구조이다 (단일 메쉬층의 경우 원심분리 튜브를 뒤집었을 때 용액이 방출되는 문제점이 있었다).
메쉬에 의한 용액 분리는 원심분리 내부에 채워진 용액에 의한 수두압과 메쉬에 맺힌 물방울에 작용하는 표면장력 압력의 균형에 의해 결정된다 (수학 식 2).
Figure PCTKR2022001206-appb-I000005
(수학식 2)
여기서, PLM은 라플라스 압력(Laplace pressure, =
Figure PCTKR2022001206-appb-I000006
), PH는 중력에 의한 수두압(Hydrostatic pressure by gravity, =
Figure PCTKR2022001206-appb-I000007
), ρ는 용액 밀도, g 는 중 력가속도, h는 수두높이, γ는 표면장력, Rm는 메쉬 단일셀의 반지름이다. 여기서 h는 원심분리 튜브 바닥면에서부터 메쉬의 상단 표면까지의 거리를 나타낸다. 표면 장력은 물질마다의 성질로 유체가 갖는 힘을 의미하고, 메쉬 셀의 반지름에 따라서 라플라스 압력(laplace pressure)이 달라지게된다. 원심분리 튜브를 뒤집었을 때 용액의 수두압을 이겨낼 수 있는 임계 Rm은 아래와 같이 나타낼 수 있다 (수학식 1).
Figure PCTKR2022001206-appb-I000008
(수학식 1)
이러한 관계식의 유효성을 평가하기 위해서 원심분리 튜브의 용량 별 밀도구배용액 용량 대비 메쉬 셀의 임계 반지름 크기 및 혈액의 양 등의 값을 찾아 표 1 에 나타내었으며, 도 7에 그래프로 나타내었다.
원심분리 튜브 용량 (mL) 밀도구배용액 용량 (mL) 용액분리기 높이 (cm) 혈액 용량(mL) 임계 반지름 (mm)
50 5 2 7.1 0.57
7 2.3 10 0.49
10 2.8 14.3 0.41
12.5 3.3 17.9 0.35
15 2 3 3 0.38
2.5 3.325 3.8 0.34
3 3.65 4.5 0.31
3.5 3.975 5.3 0.28
5 2 3 1.5 0.38
각 원심분리 튜브 용량 별 밀도구배용액의 양을 우선 설정하였다. 그 후 원심분리 튜브 용량별 밀도구배용액의 용량이 달라졌을 때, 나머지 파라미터들을 결정하였다. 혈액을 원심분리 할 때 혈액과 PBS를 부피비 1:1로 희석 (dilution)을 하는데, 이 PBS양까지 고려하여 각 원심분리 튜브 별 최대 양을 설정 하였다.
튜브에 들어가야하는 밀도구배용액(ficoll)의 최소 부피를 튜브의 바닥 cone 부분 이상이 되어야 한다고 가정을 하여 2mL로 결정하였고, 이때 분리 가능한 혈액의 양은 이론적으로 3mL이 되어야 하지만, 혈액을 PBS와 1:1로 희석해서 튜브에 넣을 때 튜브의 최대 용량이 5mL이어서 ficoll 2mL + 희석된 혈액 3mL이 처리 가능한 최대 부피이기 때문에, 5mL 튜브의 경우에서만 처리 가능한 혈액의 최대 부피가 1.5mL로 한정적이다.
그 중 가장 적절한 경우인 50mL 튜브일 때, h는 2.3 cm, γ는 55 mN/m, ρ는 0.997 g/mL로 설정하여 계산한 결과 임계 Rm값은 약 0.49 mm로 도출되 었다 (도 9(b)), 녹색 색소와 알부민이 혼합된 단백질 용액을 이용해 실험한 결과 Rm값이 1 mm 미만에서만 성공적인 용액 분리가 가능함을 확인하였다 (도 9(a)). 혈액을 이용한 실험에서도 적혈구 및 과립구 층과 말초 혈액 단핵세포 층이 성공적으로 분리됨을 확인하였다. 이를 통해 용액 분리 원리가 단백질 용액뿐만 아니라 세포가 혼합된 혈액에서도 성공적으로 적용 가능함을 검증하였다 (도 8)
실시예 3. 밀도구배 분리 시간의 단축 효과
밀도구배 분리 시간의 단축 효과를 확인하기 위해, 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브와 그렇지 않은 원심분리 튜브로 확인하여 도 10에 나타내었다. 밀도구배 원심분리법을 이용한 말초 혈액 단핵세포의 분리의 주요 한계점은 세포 비친화적인 밀도구배용액에 표적 세포가 장시간 노출된다는 점이다. 표적 세포 분리시간은 튜브 내에 채워진 밀도구배용액의 양에 의해서 결정된다. 즉, 밀도구배 용액의 깊이가 깊을수록 더 많은 분리시간이 요구된다. 기존 밀도구배 원심분리법의 경우, 적혈구 및 과립구 층과 말초 혈액 단핵세포 층 간의 혼합을 방지하기 위해서, 50mL 튜브 이용 시 10mL의 혈액을 분리하기 위해서 15mL의 밀도구배용액(ficoll)을 채워주는데, 이는 50mL 원심분리 튜브에서 대략 3.5 cm의 깊이로 채워 지는 것이다. 이 경우, 1,200 g RCF로 원심분리하면 분리 시간은 12분 이상이 걸린다. 용액분리기는 이를 개선하며 분리 시간을 단축하기 위해서 고안된 장치로써, 용액분리기의 메쉬가 비표적 세포 층과 표적 세포 층 간의 혼합을 능동적으로 방지할 수 있기 때문에 분리 용액의 사용을 최소화 한다. 용액분리기 사용 시, 용액분리기의 높이보다 조금 높게 올라오게 하기 위해 2.4 cm 깊이로 분리 용액(ficoll) 을 채워줄 수 있으며, 분리 시간을 8분 이하로 단축시킬 수 있었다.

Claims (12)

  1. 원심분리 튜브 본체; 및 상기 원심분리 튜브 본체 내에 위치하며, 복수개의 층을 갖는 마이크로 메쉬(mesh)를 포함하는 용액분리기;
    를 포함하는 원심분리 튜브.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 마이크로 메쉬는, 마이크로 메쉬를 포함하는 용액분리기 하부면 아래에 위치하는 용액의 수두압이, 마이크로 메쉬 셀에 맺힌 용액의 물방울에 작용하는 라 플라스 압력보다 낮은 압력을 만족하는 메쉬 셀(cell)을 가지는 것인, 원심분리튜브.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브는 원심분리 튜브 뚜껑을 추가로 포함하는, 원심분리 튜브.
  4. 제 1 항에 있어서,
    메쉬 셀의 반지름은 하기 수학식 1을 만족하는, 원심분리 튜브:
    [수학식 1]
    Figure PCTKR2022001206-appb-I000009
    상기 수학식 1에서,
    Rm은 메쉬 셀의 반지름이고,
    ρ는 밀도구배용액의 밀도이며,
    g는 중력가속도이고,
    h는 원심분리 튜브 바닥면에서부터 용액분리기의 상부면까지의 거리이며,
    γ는 밀도구배용액의 표면장력을 의미한다.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 용액분리기는 2 또는 3개의 층의 마이크로 메쉬를 포함하는, 원심분리 튜브.
  6. 제 1 항에 있어서,
    마이크로 메쉬의 메쉬 셀의 반지름은 0.1 내지 0.6 mm 인 원심분리 튜브.
  7. 제 1 항에 있어서,
    원심분리 튜브 내의 용액분리기의 높이는 1.5 내지 4.5 cm인 원심분리 튜브.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 원심분리 튜브에 용액분리기 상부면을 넘는 양의 밀도구배용액을 주입하는 단계;
    상기 원심분리 튜브에 밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액을 주입하는 단계;
    상기 원심분리 튜브를 원심분리하는 단계; 및 상기 원심분리 튜브를 뒤집어, 상기 원심분리 튜브에서 용액분리기 상부면 위에 존재하는 용액을 회수하는 단계;
    를 포함하는 혼합 용액의 분리 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 밀도구배용액은 상기 원심분리 튜브의 총 용량 대비 10 vol% 내지 40 vol%로 주입되는, 혼합 용액의 분리 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 밀도구배용액과 상기 혼합 용액은 1 : 0.5 내지 1 : 2의 부피비로 주입 되는, 혼합 용액의 분리 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 밀도가 상이한 복수개의 물질을 포함하는 혼합 용액은 혈액인, 혼합 용액의 분리 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 원심분리 튜브에 용액분리기 상부면을 넘는 양의 밀도구배용액을 주입하는 단계;
    상기 원심분리 튜브에 혈액을 주입하는 단계;
    상기 원심분리 튜브를 원심분리하는 단계; 및 상기 원심분리 튜브를 뒤집어, 원심분리 튜브 에서 용액분리기 상부면 위에 존재하는 말초 혈액 단핵세포를 포함하는 분획을 회수하는 단계;를 포함하는 혈액 으로부터의 말초 혈액 단핵세포 분리 방법.
PCT/KR2022/001206 2021-01-29 2022-01-24 용액분리기를 포함하는 원심분리 튜브 및 이를 이용한 혼합 용액의 분리 방법 WO2022164149A1 (ko)

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