WO2022144482A1 - Derivados de 12-desoxiforboles y usos de los mismos - Google Patents

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Carmen CASTRO GONZÁLEZ
Rosario HERNÁNDEZ GALÁN
Antonio José MACÍAS SÁNCHEZ
Noelia GERIBALDI DOLDÁN
Rosa María DURÁN PATRÓN
Ricardo GÓMEZ OLIVA
Samuel DOMÍNGUEZ GARCÍA
José Manuel BOTUBOL ARES
Felipe ESCOBAR MONTAÑO
Abdellah EZZANAD
Pedro NÚÑEZ ABADES
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Universidad De Cádiz
Universidad De Sevilla
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • This invention is related to the synthesis of molecules structurally related to
  • 12-deoxyforboll-es with the ability to substitute growth factors that activate the EGFR receptor and thus favor the proliferation of neural precursors or neural stem cells in culture and to promote neurogenesis in the adult brain. Additionally, it is also related to the use of the same family of compounds for the preparation of a pharmaceutical composition useful in the treatment of diseases of the central nervous system that occur with neuronal loss and cognitive impairment.
  • Age has a huge impact on the brain and cognitive ability. Aging is associated with cognitive impairment and the risk of developing pathologies that lead to cognitive impairment (Murman 2015. The Impact of Age on Cognition. Semin Hear, 36: 111-121). Although there are great differences between individuals and multiple causes for these alterations, at the population level the patterns of cognitive deficiency in elderly individuals have been demonstrated (Murman 2015. The Impact of Age on Cognition. Semin Hear, 36: 111-121). This decrease in cognitive capacity, which mainly affects individuals over 65 years of age, is very disabling and constitutes an economic and social expense that is difficult to assume (WHO World Report on Aging and Health, 2015).
  • aging differentially affects different brain regions, mainly influencing some specific types of memory (Gray and Bames 2015. Distinguishing adaptive plasticity from vulnerability in the aging hippocampus. Neuroscience, 309: 17-28 ).
  • episodic memory which refers to time, geographical locations, associated emotions and contextual information
  • Memory aging and brain maintenance Trends Cogn Sci , 16: 292-305.
  • the maintenance of episodic memory in older adults is related to the integrity of structures such as the hippocampus (Thome et al. 2016. Memory impairment in aged primates is associated with region-specific network dysfunction.
  • DG hippocampal dentate gyrus
  • Neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine, 25: 554-+; Tobin et al. 2019. Human Hippocampal Neurogenesis Persists in Aged Adults and Alzheimer's Disease Patients.Cell Stem Cell, 24: 974-982 e973).
  • the process of neurogenesis, generation of neurons from neural stem cells (NSC) requires an adequate physiological environment made up of cells, trophic factors, elements of the extracellular matrix, etc. that at the cellular and molecular level directs the fate of NSCs towards neurons. This environment constitutes what is called a neurogenic niche.
  • neurogenic niches age, altering and reducing the ability of NSCs to generate neurons (Encinas et al. 2011. Division-coupled astrocytic differentiation and age-related depletion of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell, 8: 566-579; Diaz-Moreno et al. 2018. Noggin rescues age-related stem cell loss in the brain of senescent mice with neurodegenerative pathology. Proc Natl Acad Sci USA, 115: 11625-11630). For this reason, the search for strategies that promote the rejuvenation of neurogenic niches is of crucial importance when developing treatments that palliate the cognitive deterioration associated with aging.
  • the present invention is faced with the problem of providing tools that promote neurogenesis both in vitro and in vivo.
  • FIG. 1 Semisynthetic compounds P-12,13-diiBu (S1), P-12-iBu-13-PhAc (S2), P-13- ⁇ Bu-12-PhAc (S3) stimulate growth factor secretion TGF ⁇ in an in vitro real-time system.
  • C) Images of HEK293T cells transfected with the mCherry-TGFa-GFP construct, in the presence or absence of the different semisynthetic compounds for 180 min. . Images of the mCherry/GFP ratio are shown at 0, 60, 120 and 180 min. The mCherry/GFP ratio is shown in a variation of gray, with the highest ratio being white and the lowest ratio being black. The upper and lower limits of the ratio range are shown on the right.
  • the mCherry/GFP ratio was normalized to the mean mCherry/GFP ratio obtained before the addition of the semisynthetic compounds.
  • Phorbol, P-13-iBu (S7), and DP-13PhAc-16-Bz (N4) do not stimulate TGF ⁇ secretion in an in vitro real-time system. Shown in this figure are the chemical structures of phorbol, phorbol-13-isobutyrate (P-13-iBu, S7), and 12-deoxy-16-hydroxyphorboLl-16-benzoate-13-phenylacetate (DP-13-PhAc-16 -BzN4).
  • the mCherry/GFP ratio was normalized to the mean mCherry/GFP ratio obtained before the addition of phorbol and P-13-iBu.
  • FIG. 4 The compound P-12,13-diiBu (S1), which stimulates the secretion of TGF ⁇ , promotes the proliferation of neural stem cells in vitro. Effect of P-12,13 diiBu (S1) at different concentrations (1 nM, 10 nM, 50 nM, 0.1 pM, 0.5 pM and 1 pM) on the proliferation of neural progenitor cells (NPC) in vitro . Proliferation was tested in NPC cultures in the presence of basic fibroblast growth factor (bFGF). A) Phase contrast microscope images of neurospheres cultured for 72 hours in the presence or absence of P-12,13 diiBu (S1) at different concentrations.
  • the graph shows the effect of P-12,13 diiBu (S1) at different concentrations on the area of the neurospheres after 72 hours in culture. The area of a minimum of 540 neurospheres per treatment was measured.
  • Figure 5 The compound P-12,13-diAc (S5) that stimulates the secretion of TGFa, promotes the proliferation of neural stem cells in vitro. Effect of P-12,13 di Ac (S5) at different concentrations (0.1 pM, 0.5 pM, 1 pM and 5 pM) on the proliferation of neural progenitor cells (NPC) in vitro. Proliferation was tested in NPC cultures in the presence of basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • FIG. 6 The compound DPPI (N1) that stimulates the secretion of TGFa, promotes the proliferation of neural stem cells in vitro. Effect of DPPI (N1) at different concentrations (0.01 pM, 0.05 pM, 0.1 pM and 0.5 pM, 1 pM, and 5 pM) on the proliferation of neural progenitor cells (NPC) in vitro. Proliferation was tested in NPC cultures in the presence of basic fibroblast growth factor (bFGF). A) Phase contrast microscope images of neurospheres cultured for 72 hours in the presence or absence of DPPI (N1) at different concentrations. B) The graph shows the effect of DPPI (N1) at different concentrations on the area of the neurospheres after 72 hours in culture. The area of a minimum of 540 neurospheres per treatment was measured.
  • NPC neural progenitor cells
  • Phorbol which does not stimulate TGF ⁇ secretion, also does not promote neural stem cell proliferation. Effect of forboll-a at different concentrations (0.1, 0.5, 1 and 5 pM) on the proliferation of neural progenitor cells (NPC) in vitro. Proliferation was tested in NPC cultures in the presence of basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • FIG. 8 Administration of the compound P-12,13-diAc (S5) intranasally in an animal model stimulates neurogenesis in the adult brain.
  • P-12,13-diAc (S5) was administered intranasally for seven consecutive days, as was BrdU intraperitoneally. Mice were sacrificed the day after the last dose.
  • FIG. 9 Administration of the compound P-12,13-diiBu (S1) intranasally in an animal model stimulates neurogenesis in the adult brain.
  • P-12,13-diiBu (S1) was administered intranasally for seven consecutive days, as was BrdU intraperitoneally. Mice were sacrificed the day after the last dose.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • FGFR fibroblast growth factor receptor
  • ligands are amphiregulin, epiregulin, epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor alpha (TGF ⁇ ), or epidermal growth factor-like heparin-binding factor (HB-EGF).
  • EGF epidermal growth factor
  • TGF ⁇ transforming growth factor alpha
  • HB-EGF epidermal growth factor-like heparin-binding factor
  • Trophic factors also influence the function of the neurogenic niche.
  • Neurogenesis is regulated by extracellular growth factors present in the niches such as neuregulins 1 and 2 (NRG1 and NRG2) that activate the ErbB4 receptor or epidermal growth factor receptor (EGFR) ligands such as transforming growth factor alpha ( TGFa) (Alipanahzadeh et al. 2014. Transforming Growth Factor-alpha Improves Memory Impairment and Neurogenesis Following Ischemia Reperfusion. Cell J, 16: 315-324; Mahar et al. 2016. Effects of neuregulin-1 administration on neurogenesis in the adult mouse hippocampus, and characterization of immature neurons along the septotemporal axis.
  • TGFa transforming growth factor alpha
  • Transforming Growth Factor-alpha Improves Memory Impairment and Neurogenesis Following Ischemia Reperfusion. Cell J, 16: 315-324).
  • These trophic factors regulate signaling pathways that generate responses such as changes in cyclin expression that can alter the qNSC/aNSC balance (Morales and Mira 2019.
  • deletion of the neuregulin receptor ErbB4 reduces memory and spatial learning abilities in mice (Skirzewski et al. 2020. ErbB4 Null Mice Display Altered Mesocorticolimbic and Nigrostriatal Dopamine Levels as well as Deficits in Cognitive and Motivational Behaviors. eNeuro, 7).
  • EGFR receptor ligands such as TGF ⁇ are synthesized as pre-proteins that cross the membrane and are secreted into the extracellular medium in a proteolytic reaction catalyzed by the ADAM 17 convertase (Blobel 2005. ADAMs: key components in EGFR signaling and development. Nat Rev Mol Cell Biol, 6: 32-43).
  • the selectivity of this enzyme for each ligand is determined by phosphorylation reactions catalyzed by kinases of the protein kinase C (PKC) family (Dang et al. 2013. Regulated ADAM17-dependent EGF family ligand release by substrate-selecting signaling pathways Proc Natl Acad Sci U S A, 110: 9776-9781).
  • PLC protein kinase C
  • PKC kinase subfamilies: classical (cPKC), novel (nPKC), and atypical.
  • PKCa belonging to the cPKC family, is activated by phorboll-12-myristate-13-acetate (PMA), catalyzing the phosphorylation of TGFa and amphiregulin precursors, facilitating their release mediated by ADAM 17 and the release of the soluble ligand. outside the cell.
  • PMA phorboll-12-myristate-13-acetate
  • ADAM 17 phorboll-12-myristate-13-acetate
  • ADAM 17 is mediated by the activation of different PKC isoenzymes, thus playing a key role in the secretion of different types of growth factors (Dang et al. 2011. Epidermal growth factor (EGF ) ligand release by substrate-specific a disintegrin and metalloproteases (ADAMs) involves different protein kinase C (PKC) isoenzymes depending on the stimulus. J Biol Chem, 286: 17704-17713; Dang et al. 2013. Regulated ADAM 17-dependent EGF family ligand release by substrate-selecting signaling pathways.
  • EGF epidermal growth factor
  • ADAMs substrate-specific a disintegrin and metalloproteases
  • PKC protein kinase C
  • PKC activity is physiologically regulated by binding to diethylglycerol.
  • diterpenes There are also compounds of a pharmacological nature belonging to the family of diterpenes able to regulate their activity. These molecules constitute a vast group of compounds with a 20-carbon skeleton that, by deletion, generate polycyclic structures (Duran-Pe ⁇ a et. al. Biologically active diterpenes containing a gem-dimethylcyclopropane subunit: An interesting source of PKC modulators. Nat. Prod Rep. 2014, 31: 940-952) capable of mimicking DAG, thus activating PKC.
  • One of these polycyclic structures are phorboll- esters with a tiglian structure.
  • Forblol- esters are natural plant-derived diterpenes, highly abundant in the latex of plants of the Euphorbiaceae family.
  • PMA phorboll-12-myristate-13-acetate
  • Figure 1 shows a scheme of the construction carried out and the right panel shows the mCherry/GFP fluorescence rate in HEK293T cell cultures to which saline (0) or additionally the compounds S1, S2 and S3.
  • example 6 the effect of other compounds on TGF ⁇ secretion was analyzed. Specifically, the compounds P-12,13-diPhAc (84), P-12,13-diAc (S5), P-13- ⁇ Bu-12-Tig (86), DPPI (N1), DPPT (N2), and DP-13,16-diPhAc (N3) to cells transfected with the construction indicated in example 5, perceiving a change in the mCherry/GFP rate. Although the effect of all of them was somewhat less than that of those described in example 5, a reduction in the mCherry/GFP ratio was observed, indicating that in all cases there was a facilitation of TGFa secretion when the drug was administered. compound to cultures (see Figure 2).
  • ester group at C-12 is essential to induce TGFa secretion.
  • a first aspect of the invention relates to a composition
  • a composition comprising a compound of formula I, or preferably pharmaceutically acceptable salts, isomers, stereoisomers, polymorphs, or hydrates of said compound:
  • ester groups are located at C-13, C-12 and C13, or C13 and C-16.
  • the activity lies in the nature of these ester groups. Of the active ones so far, they can have chains of up to 5 carbon atoms. Those containing a phenyl acetate group have also been active, but the benzoate has not been active.
  • a second aspect of the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a compound of formula I, or preferably pharmaceutically acceptable salts, isomers, stereoisomers, polymorphs, or hydrates of said compound: Formula (II) where R 1 , R 2 and R 3 are independently selected from the above list.
  • R 1 OCOCH 2 Ph
  • R 2 CH(CH 3 ) 2
  • R 3 H
  • R 2 CH(CH 3 )2
  • R 3 H
  • R 1 OCOCH(CH 3 ) 2
  • R 2 CH 2 Ph
  • R 3 H
  • the compound is a compound of formula I selected from any of the following: a.
  • the compound consists of phorbol-12,13-diisobutyrate of the formula: or preferably pharmaceutically acceptable salts, isomers, stereoisomers, polymorphs, or hydrates of said compound.
  • the compound consists of phorblol--12-isobutyrate-13-phenylacetate of the formula:
  • the compound consists of phorblol-13-isobutyrate-12-phenylacetate of the formula: or preferably pharmaceutically acceptable salts, isomers, stereoisomers, polymorphs, or hydrates of said compound.
  • the composition further comprises neural precursors or neural stem cells.
  • neural precursors or neural stem cells are understood as those stem cells isolated from adult or fetal neural tissue, which have the capacity to self-replicate, but with limited potential, since they can only differentiate towards the three subtypes of cells of the neural lineage: neurons, astrocytes and oligodendrocytes.
  • a third aspect of the invention refers to the in vitro use of the compositions according to any of the first two aspects of the invention, to favor or promote the proliferation or expansion of neural precursors or neural stem cells in culture.
  • a fourth aspect of the invention relates to a culture medium suitable for stimulating the proliferation or expansion of neural precursors, preferably in the absence of EGF, comprising at least one compound as defined in either of the first two aspects of the invention and optionally basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • a fifth aspect of the invention relates to a method for the proliferation of neural stem cells or neural precursors in vitro, characterized in that it comprises contacting neural stem cells or neural precursors with: a. a solution or solution comprising the compounds defined in any of the first two aspects of the invention, and/or with a salt thereof, and optionally basic fibroblast growth factor (bFGF); or b. the culture medium according to the fourth aspect of the invention; for a time sufficient for the effective proliferation of neural stem cells or neural precursors.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • PBS phosphate buffered saline
  • the stem cells are they should be cultured in flotation at a density of 20 to 200 x 10 6 cells/L.
  • the compound is preferably added to a static culture, preferably at 37°C, for 1 to 14 days, preferably in a 5% CO2 atmosphere, optionally changing the medium fully or partially every two days.
  • the medium in which the cells are cultured can be any medium that does not prevent the proliferation of neural stem cells, as an example, a Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)/F-12 (1:1) medium, which contain 2% supplement B27 (Invitrogen), 2mM L-glutamine and 2pg/ml gentamicin. Additionally, the medium may or may not contain basic fibroblast growth factor (bFGF), preferably at a concentration of 10pg/L.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • F-12 1:1
  • B27 Invitrogen
  • 2mM L-glutamine 2mM L-glutamine
  • 2pg/ml gentamicin 2pg/ml gentamicin.
  • the medium may or may not contain basic fibroblast growth factor (bFGF), preferably at a concentration of 10pg/L.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • a sixth aspect of the invention relates to a composition comprising the compounds defined in any of the first two aspects of the invention, for use in therapy.
  • a seventh aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a compound as defined in any of the first two aspects of the invention, wherein said pharmaceutical composition optionally comprises one or more pharmaceutically acceptable excipients and/or pharmaceutically acceptable carriers.
  • the pharmaceutical composition of the seventh aspect of the invention is suitable or formulated for administration to the central nervous system, preferably intranasally.
  • An eighth aspect of the present invention refers to the use of the pharmaceutical composition of the present invention for the treatment of diseases or injuries that occur with neuronal loss or with a decrease in neurogenesis in neurogenic regions.
  • the present invention refers to the pharmaceutical composition of the present invention for its use in the treatment of diseases or injuries that occur with neuronal loss or with a decrease in neurogenesis.
  • the diseases or injuries that cause neuronal loss are those selected from the list consisting of:
  • Neurodegenerative diseases they occur as a result of early neuronal death. The most frequent are Alzheimer's disease, with neuronal loss in the hippocampus and cerebral cortex fundamentally, Parkinson's disease, with selective death of neurons in the substantia nigra, or amyotrophic lateral sclerosis (ALS), with a deficit of neurons in the spinal cord.
  • Alzheimer's disease with neuronal loss in the hippocampus and cerebral cortex fundamentally
  • Parkinson's disease with selective death of neurons in the substantia nigra, or amyotrophic lateral sclerosis (ALS), with a deficit of neurons in the spinal cord.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Cranioencephalic trauma it is an injury of traumatic origin that affects the skull, with brain involvement. The damage can be focal — limited to a single area of the brain — or involve more than one area of the brain. In the context of this invention, traumatic brain injury can cause brain damage due to neuronal death that could be treated by therapies aimed at favoring neuronal regeneration. 3. Hypoxic-ischemic injury: Reduction of cerebral blood flow to levels that are insufficient to maintain the metabolism necessary for normal brain function and structure. In adults, ischemia is caused primarily by cerebrovascular accidents, which may be focal (ischemic, hemorrhagic, or mixed in origin) or multiple (as in multi-infarct dementia).
  • hypoxia/ischemia is primarily due to fetal or perinatal distress.
  • hypoxia-ischemia is a condition that produces cellular suffering due to the lack of oxygen supply to brain tissue, which in most cases produces neuronal death.
  • CNS infections Brain involvement by different infectious agents that cause meningitis, encephalitis or meningoencephalitis. In the context of this invention, CNS infections cause cellular suffering either directly or indirectly due to the cerebral edema they cause, and may cause neuronal death.
  • Epilepsy Chronic disease characterized by one or several neurological disorders that leave a predisposition to generate recurrent seizures, which usually give rise to neurobiological, cognitive and psychological consequences.
  • Schizophrenia a serious mental disorder in which people interpret reality in an abnormal way. Schizophrenia can cause a combination of hallucinations, delusions, and severe disturbances in thinking and behavior that affect daily functioning and can be disabling.
  • the pharmaceutical composition is for use in the treatment of diseases or injuries that occur with neuronal loss selected from the group consisting of: focal cerebral ischemia, traumatic brain injury with neuronal damage, Parkinson's disease, Alzheimer's, epilepsy and amyotrophic lateral sclerosis.
  • said composition is administered to the central nervous system via the intranasal route.
  • Example 1 Preparation of the compounds Chemical structures of compounds structurally related to 12-deoxyforblole-s, synthesized from derivatives of forboL
  • Example 2 Compounds isolated from Euphorbia resinifera. Chemical structures of compounds structurally related to 12-deoxyforblole-s, isolated from the latex of E. resinifera. H) Chemical structure of the compound 12-deoxy-16-hydroxyphorboLl-16-isobutyrate-13-phenylacetate (DPPI, N1). I) Chemical structure of the compound 12-deoxy-16-hydroxyforboll--16-tigliato-13-phenylacetate (DPPT, N2). J) Chemical structure of the compound 12-deoxy-16-hydroxyforboll--13,16-diphenylacetate (DP-13,16-diPhAc, N3). K) Chemical structure of the compound 12-deoxy-16-hydroxyphorboLl-16-benzoato-13-phenylacetate (DP-13-PhAc-16-Bz, N4).
  • S6b was obtained, but using tiglic acid instead of isobutyric acid.
  • the products were obtained from the methanolic extract of the plant latex, which was subjected to subsequent fractionation by silica gel column chromatography, controlled by thin layer chromatography, which led to obtaining six fractions (FR 1 -FR6).
  • the FR4 fraction was again fractionated by silica gel column chromatography obtaining 4 sub-fractions (FR4-1 to FR4-4) and the latter (FR4-4) was purified by high performance liquid chromatography (HPLC) which led to to obtaining 4 products (N1-N4, Figure 2) that were identified by spectroscopic and spectrometric techniques.
  • the cDNA encoding the human pro-TGFa isoform (TGFA, NCBI reference sequence: NM_003236.4), which contains the mCherry cDNA between nucleotides 126 and 127 of the TGFA cDNA, was cloned into the vector pEGFP-N1 to add the green fluorescent protein GFP cDNA to the 3' end.
  • the construct was designed in our laboratory and synthesized by GeneCust (Boynes, France) to generate the mCherry-TGFa-GFP construct containing the cDNA. This construct was transfected into HEK293T cells as explained below. HEK293T cells were obtained from ATCC (Manassas, VA, USA).
  • Transfected HEK293T cells were then plated in 35 mm high dishes (Ibidi, Kunststoff, Germany) and treated with EOF2 or inhibitors, as described in the results and figure captions.
  • Real-time microscopy tests were performed with a Zeiss Axio Observer.ZI inverted microscope, using an objective with a 40x/0.95 Korr M27 plan-apochromat aerial lens. Images of transfected cells were obtained every 1 min. The captured images were processed with ZEN lite software and the excision efficiency of TGF ⁇ was determined by analyzing the intensity of mCherry/GFP fluorescence in all cell areas. mCherry/GFP ratios were calculated and normalized to the mean measured before stimulation with the indicated compounds using Microsoft Excel software.
  • Ratiometric images were constructed using Imaged software, after background subtraction, the mCherry/GFP image was calculated by dividing the mCherry channel by the GFP channel. For each pixel, a pseudocolor scale is used to encode the mCherry/GFP fluorescence rate.
  • Figure 1 shows a scheme of the construction carried out and in the right panel, the mCherry/GFP fluorescence rate in cultures has been represented by a gray scale of HEK293T cells to which saline (0) has been added. or the compounds S1, S2 and S3 as indicated in the figure. It can be seen how in the presence of the compounds P-12,13-diiBu (S1), P-12-iBu-13-PhAc (S2) and P-13-iBu-12-PhAc (S3) the fluorescence rate mCherry/ GFP decreases indicating that the m-Cherry protein is being released into the extracellular medium together with the soluble segment of TGF ⁇ .
  • S1 P-12,13-diiBu
  • S2 P-12-iBu-13-PhAc
  • S3 P-13-iBu-12-PhAc
  • EXAMPLE 6 The effect on the secretion of TGFa of other compounds structurally related to those of example 5.
  • EXAMPLE 7 Effect of forblol- and certain related compounds, without an ester group at C-12, on the secretion of TGFa.
  • ester group at C-12 is essential to induce TGFa secretion.
  • EXAMPLE 8 Effect of P-12,13-diiBu (S1) on the proliferation of neural precursors in culture.
  • the lateral walls of the lateral ventricles of the subventricular zone of postnatal mice of 7 days were extracted and enzymatically dissociated in cerebrospinal fluid (Ca2 low Mg2 high: 5 mM KCl, 124 mM NaCl, 3.2 mM MgCl 2 , 100 pM CaCl 2 , 26 mM NaHCO 3 , and 10 mM glucose) supplemented with 1 mg/ml trypsin and 0.2 mg/ml kynurenic acid previously heated at 37°C for 15 min. It was incubated at 37° in an oven for 13 minutes.
  • cerebrospinal fluid Ca2 low Mg2 high: 5 mM KCl, 124 mM NaCl, 3.2 mM MgCl 2 , 100 pM CaCl 2 , 26 mM NaHCO 3 , and 10 mM glucose
  • the tissue was centrifuged at 9,000 rpm for 5 minutes and resuspended in normal CSF (5 mM KCl, 124 mM NaCl, 1.3 mM MgCl 2 , 2 mM CaCl 2 , 26 mM NaHCO3, and 10 mM glucose). It was incubated in an oven for 5 minutes and centrifuged under the same conditions. Cells were then resuspended in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)/F-12 (1:1) supplemented with 0.7 mg/ml ovomucoid and mechanically disrupted with a Pasteur pipette with the diameter reduced by half.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the effect of P-12,13-diiBu (S1) on neural stem cells at different concentrations was analyzed.
  • the neurospheres were centrifuged and the cells were resuspended and disaggregated in defined neurosphere medium and seeded at 20 cells/pL to which the growth factor bFGF (10 ng/mL) was added.
  • P-12,13-diiBu was added at the same time putting a different concentration in each well.
  • the different concentrations were analyzed in triplicate. The experiments were carried out so that the The person who takes the images and performs the quantification does not know the conditions of each of the crops.
  • the number of new neurospheres formed was counted 72h later under the Olympus IX70 inverted phase contrast microscope. To measure the area of the neurospheres, images of 50 neurospheres per well were obtained and analyzed using the Image J analysis system.
  • EXAMPLE 10 Effect of DPPI (N1) on the proliferation of neural precursors in culture
  • EXAMPLE 11 Effect of forblol- on the proliferation of neural precursors in culture. Similarly, in similar assays, the effect of forboll- (without the ability to induce TGFa secretion) on the proliferation of neural stem cell cultures was analyzed using the technique described in the previous example. We can observe how in the presence of different concentrations of forboll-, the area and number of neurospheres do not vary, indicating that forboll- does not induce the proliferation of neural stem cells in culture either ( Figure 7).
  • EXAMPLE 12 Intranasal administration of the compound P-12,13-diAc (S5) for 7 days promotes neurogenesis in the adult mouse brain
  • a daily dose of 12 pL of a 5 pM solution of compound S5 was administered intranasally for 7 days to two-month-old mice.
  • Mice received injections of the thymidine analog BrdU every other day throughout treatment. The incorporation of BrdU into the cells makes it possible to determine those that have proliferated during the duration of the treatment. After 7 days the brain was perfused, and 30 ⁇ M thick sections were obtained. The BrdU markers (proliferating cells) and the doublecortin neuroblast marker (DCX) were detected by immunohistochemistry in the sections corresponding to the subventricular zone.
  • the treatment induces an increase in the number of proliferating cells and in the number of neuronal progenitors (DCX + neuroblasts).
  • DCX + neuroblasts the compound P-12,13-diAc (S5), which had previously stimulated TGF ⁇ secretion and proliferation in vitro, also facilitates neurogenesis in the mouse brain when administered intranasally.
  • EXAMPLE 13 Intranasal administration of the compound P-12,13-diiBu (S1) for 7 days promotes neurogenesis in the adult mouse brain
  • a daily dose of 12 pL of a 10 nM solution of compound S1 was administered intranasally for 7 days to two-month-old mice.
  • Mice received injections of the thymidine analog BrdU every other day throughout treatment. The incorporation of BrdU into the cells makes it possible to determine those that have proliferated during the duration of the treatment. After 7 days the brain was perfused, and 30 ⁇ M thick sections were obtained. The BrdU markers (proliferating cells) and the doublecortin neuroblast marker (DCX) were detected by immunohistochemistry in the sections corresponding to the subventricular zone.
  • the treatment induces an increase in the number of proliferating cells and in the number of neuronal progenitors (DCX + neuroblasts).
  • DCX + neuroblasts the compound P-12,13-diiBu (S1), which had previously stimulated TGF ⁇ secretion and proliferation in vitro, also facilitates neurogenesis in the mouse brain when administered intranasally.

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Abstract

Esta invención está relacionada con la síntesis y el empleo de derivados de 12- DESOXIFORBOLES (o esteres de forbol) para favorecer la diferenciación a neuronas de precursores neurales o células madre neurales en cultivo y en cerebro adulto. Adicionalmente, también se relaciona con el empleo del mismo tipo de compuesto para la elaboración de una composición farmacéutica útil en el tratamiento de daños en el sistema nervioso central que cursen con perdida neuronal.

Description

DERIVADOS DE 12-DESOXIFORBOLES Y USOS DE LOS MISMOS.
SECTOR DE LA TÉCNICA
Esta invención está relacionada con la síntesis de moléculas estructuralmente relacionados con
12-desoxiforboll-es, con capacidad para sustituir a factores de crecimiento que activan el receptor EGFR y favorecer así la proliferación de precursores neurales o células madre neurales en cultivo y para promover la neurogénesis en el cerebro adulto. Adicionalmente, también se relaciona con el empleo de la misma familia de compuestos para la elaboración de una composición farmacéutica útil en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central que cursen con perdida neuronal y deterioro cognitive.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La edad tiene un gran impacto sobre el cerebro y la capacidad cognitiva. El envejecimiento está asociado a deterioro cognitive y al riesgo de desarrollar patologías que cursan con deterioro cognitive (Murman 2015. The Impact of Age on Cognition. Semin Hear, 36: 111-121). Aunque existen grandes diferencias entre individuos y múltiples causas para estas alteraciones, a nivel poblacional los patrones de deficiencia cognitiva en individuos de avanzada edad están demostrados (Murman 2015. The Impact of Age on Cognition. Semin Hear, 36: 111-121). Esta disminución de la capacidad cognitiva, que afecta principalmente a individuos mayores de 65 años, resulta muy inhabilitante y constituye un gasto económico y social difícilmente asumióle (WHO World Report on Ageing and Health, 2015).
A nivel del sistema nervioso central (SNC), el envejecimiento afecta diferencialmente a distintas regiones cerebrales, influyendo mayoritariamente sobre algunos tipos específicos de memoria (Gray and Bames 2015. Distinguishing adaptive plasticity from vulnerability in the aging hippocampus. Neuroscience, 309: 17-28). Concretamente, la memoria episódica (que se refiere a tiempo, localizaciones geográficas, emociones asociadas e información contextual) es una de las más afectadas en la mayoría de la población envejecida (Nyberg et al. 2012. Memory aging and brain maintenance. Trends Cogn Sci, 16: 292-305). Según muestran estudios realizados en modelos animales, el mantenimiento de la memoria episódica en adultos de avanzada edad está relaciona con la integridad de estructuras como el hipocampo (Thome et al. 2016. Memory impairment in aged primates is associated with region-specific network dysfunction. Mol Psychiatry, 21: 1257-1262). Así, algunas teorías proponen incluso que la resiliencia del cerebro de algunos individuos al deterioro cognitive durante el envejecimiento está más relacionada con una alta plasticidad neural en estas regiones que con la resistencia al daño neuronal per se (Gonzalez-Escamilla et al. 2018. Brain Networks Reorganization During Maturation and Healthy Aging-Emphases for Resilience. Front Psychiatry, 9: 601 ¡Montaron et al. 2020. Responsiveness of dentate neurons generated throughout adult life is associated with resilience to cognitive aging. Aging Cell, e13161). Una de las formas de plasticidad que ayudan a proteger el cerebro durante el envejecimiento es la capacidad de algunas estructuras, particularmente el giro dentado del hipocampo (DG), para generar nuevas neuronas. Esta neurogénesis se ha observado en el cerebro adulto de muchas las especies de mamíferos incluido el humano y a lo largo de toda la vida del individuo (Aimone et al. 2014. Regulation and function of adult neurogenesis: from genes to cognition. Physiol Rev, 94: 991-1026). Las neuronas generadas influyen en la capacidad cognitive afectando a tareas como la memoria, el aprendizaje y la separación de patrones (Deng et al. 2010. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory? Nat Rev Neurosci, 11: 339-350;Aimone et al. 2011. Resolving new memories: a critical look at the dentate gyrus, adult neurogenesis, and pattern separation. Neuron, 70: 589-596). A pesar de que existe cierta controversia respecto a la existencia de neurogénesis en el hipocampo del humano adulto y durante el envejecimiento (Sorrells et al. 2018. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature, 555: 377-381 ¡Moreno-Jimenez et al. 2019. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine, 25: 554-+), estudios recientes parecen apoyar la existencia de neurogénesis a lo largo de toda la vida adulta (Moreno-Jimenez et al. 2019. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine, 25: 554-+;Tobin et al. 2019. Human Hippocampal Neurogenesis Persists in Aged Adults and Alzheimer's Disease Patients. Cell Stem Cell, 24: 974-982 e973). El proceso de neurogénesis, generación de neuronas a partir de células madre neurales (NSC), necesita de un entorno fisiológico adecuado formado por células, factores tróficos, elementos de la matriz extracelular, etc. que a nivel celular y molecular dirija el destino de las NSC hacia neuronas. Este entorno constituye lo que se denomina un nicho neurogénico. Al igual que el resto del organismo, los nichos neurogénicos envejecen alterando y reduciendo la capacidad de las NSC para generar neuronas (Encinas et al. 2011. Division-coupled astrocytic differentiation and age-related depletion of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell, 8: 566-579;Diaz-Moreno et al. 2018. Noggin rescues age-related stem cell loss in the brain of senescent mice with neurodegenerativo pathology. Proc Natl Acad Sci U S A, 115: 11625-11630). Por este motivo, la búsqueda de estrategias que promuevan la el rejuvenecimiento de los nichos neurogénicos, es de crucial importancia a la hora de desarrollar tratamientos que permitan paliar el deterioro cognitive asociado al envejecimiento.
La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar herramientas que promuevan la neurogénesis tanto in vitro como in vivo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Los compuestos semisintéticos P-12,13-diiBu (S1), P-12-iBu-13-PhAc (S2), P-13- ¡Bu-12-PhAc (S3) estimulan la secreción del factor de crecimiento TGFa en un sistema a tiempo real in vitro. A) Esquema de construcción y mecanismo de acción mCherry-TGFa-GFP. B) Análisis cuantitativo de las imágenes microscópicas obtenidas de los ensayos a tiempo real de cultivos celulares de HEK293T que expresan mCherry-TGFa-GFP. La proporción de mCherry/GFP se normalizó con respecto a la media obtenida de la proporción de mCherry/GFP antes de la adición de los compuestos semisintéticos. En las gráficas se muestra las proporciones de mCherry/GFP normalizadas del cultivo celular sin compuesto, con P-12, 13-diiBu (0,5 pM), con P-12-iBu-13-PhAc (0,5 pM) y con P-13-iBu-12-PhAc (0,5 pM), n = 40. C) Imágenes de las células HEK293T transfectadas con la construcción mCherry-TGFa-GFP, en presencia o ausencia de los diferentes compuestos semisintéticos durante 180 min. Las imágenes de la proporción de mCherry/GFP se muestran a 0, 60, 120 y 180 min. La proporción de mCherry/GFP se muestra en una variación de gris, siendo la proporción más alta blanca y la más baja negra. Los límites superior e inferior del rango de la proporción se muestran a la derecha.
Figura 2. Los compuestos P-12,13-diPhAc (S4), P-12,13-d i Ac (S5), P-13-iBu-12-Tig (S6), DPPI (N1), DPPT (N2), y DP-13,16-diPhAc (N3) estimulan la secreción del factor de crecimiento TGFa en un sistema a tiempo real in vitro. A) Esquema de construcción y mecanismo de acción mCherry-TGFa-GFP. B) Análisis cuantitativo de las imágenes microscópicas obtenidas de los ensayos a tiempo real de cultivos celulares de HEK293T que expresan mCherry-TGFa-GFP. La proporción de mCherry/GFP se normalizó respecto a la media obtenida de la proporción de mCherry/GFP antes de la adición de los compuestos semisintéticos. En las gráficas se muestra las proporciones de mCherry/GFP normalizadas del cultivo celular sin compuesto, con P-12,13-diPhAc (0,5 pM), con P-12,13-diAc (0,5 pM), con P-12,13-diAc (0,5 pM), con DPPI (0,5 pM), con DPPT (0.5 pM) y con DP-13,16-diPhAc (0,5 pM) n = 40. C) Imágenes de las células HEK293T transfectadas con la construcción mCherry-TGFa-GFP, en presencia o ausencia de los diferentes compuestos semisintéticos durante 180 min. Las imágenes de la proporción de mCherry/GFP se muestran a 0, 60, 120 y 180 min. La proporción de m mCherry/GFP se muestra en una variación de gris, siendo la proporción más alta blanca y la más baja negra. Los límites superior e inferior del rango de la proporción se muestran a la derecha.
Figura 3. El forbol, el P-13-iBu (S7) y el DP-13PhAc-16-Bz (N4) no estimulan la secreción de TGFa en un sistema a tiempo real in vitro. En esta figura se muestran las estructuras químicas del forbol, forbol-13-isobutirato (P-13-iBu, S7), y 12-desoxi-16-hidroxiforboLl-16-benzoato-13- fenilacetato (DP-13-PhAc-16-Bz N4). A) Esquema de construcción y mecanismo de acción mCherry-TGFa-GFP. B) Análisis cuantitativo de las imágenes microscópicas obtenidas de los ensayos a tiempo real de cultivos celulares de HEK293T que expresan mCherry-TGFa-GFP. La proporción de mCherry/GFP se normalizaron respecto a la media obtenida de la proporción de mCherry/GFP antes de la adición del forbol y del P-13-iBu. En las gráficas se muestra las proporciones de mCherry/GFP normalizadas del cultivo celular sin compuesto, con forblol- (0,5 pM) y con P-13-iBu (0,5 pM) y DP-13-PhAc-16-Bz (0,5 pM) n = 40. C) Imágenes de las células HEK293T transfectadas con la construcción mCherry-TGFa-GFP, en presencia o ausencia de los diferentes compuestos durante 180 min. Las imágenes de la proporción de mCherry/GFP se muestran a 0, 60, 120 y 180 min. La proporción de m mCherry/GFP se muestra en una variación de gris, siendo la proporción más alta blanca y la más baja negra. Los límites superior e inferior del rango de la proporción se muestran a la derecha.
Figura 4. El compuesto P-12,13-diiBu (S1), que estimula la secreción de TGFa, promueve la proliferación de las células madre neurales in vitro. Efecto del P-12,13 diiBu (S1) a diferentes a concentraciones (1 nM, 10 nM, 50 nM, 0,1 pM, 0,5 pM y 1 pM) sobre la proliferación de células progenitoras neurales (NPC) in vitro. La proliferación fue testada en cultivos de NPC en presencia del factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). A) Imágenes al microscopio de contraste de fase de neuroesferas cultivadas durante 72 horas en presencia o ausencia de P- 12,13 diiBu (S1) a diferentes concentraciones. B) La gráfica muestra el efecto del P-12,13 diiBu (S1) a diferentes concentraciones sobre el área de las neuroesferas después de 72 horas en cultivo. Se midió el área de un mínimo de 540 neuroesferas por tratamiento. Figura 5. El compuesto P-12,13-diAc (S5) que estimula la secreción de TGFa, promueve la proliferación de las células madre neurales in vitro. Efecto del P-12,13 di Ac (S5) a diferentes a concentraciones (0,1 pM, 0,5 pM, 1 pM y 5 pM) sobre la proliferación de células progenitoras neurales (NPC) in vitro. La proliferación fue testada en cultivos de NPC en presencia del factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). A) Imágenes al microscopio de contraste de fase de neuroesferas cultivadas durante 72 horas en presencia o ausencia de P-12,13 di AC a diferentes concentraciones. B) La gráfica muestra el efecto del P-12,13 diAc (S5) a diferentes concentraciones sobre el área de las neuroesferas después de 72 horas en cultivo. Se midió el área de un mínimo de 540 neuroesferas por tratamiento.
Figura 6. El compuesto DPPI (N1) que estimula la secreción de TGFa, promueve la proliferación de las células madre neurales in vitro. Efecto del DPPI (N1) a diferentes a concentraciones (0,01 pM, 0,05 pM, 0,1 pM y 0,5 pM, 1 pM, y 5pM) sobre la proliferación de células progenitoras neurales (NPC) in vitro. La proliferación fue testada en cultivos de NPC en presencia del factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). A) Imágenes al microscopio de contraste de fase de neuroesferas cultivadas durante 72 horas en presencia o ausencia de DPPI (N1) a diferentes concentraciones. B) La gráfica muestra el efecto de DPPI (N1) a diferentes concentraciones sobre el área de las neuroesferas después de 72 horas en cultivo. Se midió el área de un mínimo de 540 neuroesferas por tratamiento.
Figura 7. El forbol, que no estimula la secreción de TGFa, tampoco promueve la proliferación de las células madre neurales. Efecto del forboll- a diferentes a concentraciones (0,1 , 0,5, 1 y 5 pM) sobre la proliferación de células progenitoras neurales (NPC) in vitro. La proliferación fue testada en cultivos de NPC en presencia del factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). A) Imágenes al microscopio de contraste de fase de neuroesferas cultivadas durante 72 horas en presencia o ausencia de forboll- a diferentes concentraciones. B) La gráfica muestra el efecto del forblol- a diferentes concentraciones sobre el área de las neuroesferas después de 72 horas en cultivo. Se midió el área de un mínimo de 540 neuroesferas por tratamiento. Los experimentos se hicieron por triplicado y un mínimo de tres veces independientes. Estadística: *p < 0,5 comparado respecto al control mediante un post hoc de Dunnett.
Figura 8. La administración del compuesto P-12,13-diAc (S5) por vía intranasal en un modelo animal, estimula la neurogénesis en el cerebro adulto. A) Se muestran imágenes de microscopía confocal de secciones coronales de la SVZ de ratón adulto tras la administración intranasal de 12 pL de P-12,13-diAc (5 pM) durante siete días. Las imágenes fueron procesadas para la detección inmunohistoquímica del marcador de proliferación BrdU y el marcador de neuroblastos DCX. La administración del P-12,13-diAc (S5) se realizó intranasalmente durante siete días consecutivos, así como la de BrdU de forma intraperitoneal. Los ratones fueron sacrificados el día posterior a la última dosis. B) La gráfica representa el número de células positivas para el marcador de proliferación BrdU por mm3. C) La gráfica muestra el porcentaje de área ocupada por células DCX+ respecto del área total de la SVZ. D) Representación gráfica del número de células que co-expresan el marcador de proliferación BrdU y el marcador de neuroblastos DCX por mm3. Cada barra representa la media ± error estándar de al menos 6 animales por condición. Estadística: * p<0.05, representa las diferencias estadísticamente significativas mediante una prueba t de Student.
Figura 9. La administración del compuesto P-12,13-diiBu (S1) por vía intranasal en un modelo animal, estimula la neurogénesis en el cerebro adulto. A) Se muestran imágenes de microscopía confocal de secciones coronales de la SVZ de ratón adulto tras la administración intranasal de P-12,13-diiBu (0,01 pM) durante siete días. Las imágenes fueron procesadas para la detección inmunohistoquímica del marcador de proliferación BrdU y el marcador de neuroblastos OCX. La administración del P-12,13-diiBu (S1) se realizó intranasalmente durante siete días consecutivos, así como la de BrdU de forma intraperitoneal. Los ratones fueron sacrificados el día posterior a la última dosis. B) La gráfica representa el número de células positivas para el marcador de proliferación BrdU por mm3. C) La gráfica muestra el porcentaje de área ocupada por células DCX+ respecto del área total de la SVZ. D) Representación gráfica del número de células que co-expresan el marcador de proliferación BrdU y el marcador de neuroblastos DCX por mm3. Cada barra representa la media ± error estándar de al menos 6 animales por condición. Estadística: * p<0.05, representa las diferencias estadísticamente significativas mediante una prueba t de Student.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un paso importante para la comprensión de los mecanismos de proliferación, diferenciación y muerte de precursores neurales ha sido la demostración de que los progenitores inmaduros multipotenciales pueden ser aislados del SNC adulto y propagados en cultivo. Estas células crecen in vitro como agregados esféricos no adherentes llamados neuroesferas, cuando se las cultivan en presencia de factores tróficos que activan el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR)(Kuhn et al. 1997. Epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2 have different effects on neural progenitors in the adult rat brain. J Neurosci, 17: 5820-5829; Reynolds and Rietze 2005. Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship. Nat Methods, 2: 333-336) . Varios factores tróficos son capaces de activar EGFR e inducir proliferación en células en cultivo. Estos ligandos son anfiregulina, epiregulina, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGFa), o factor de unión a la heparina parecido al factor crecimiento epidérmico (HB-EGF). La presencia de estos factores tróficos es esencial a la hora de cultivar células madre neurales (Tropepe et al. 1997. Transforming growth factor-alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. J Neurosci, 17: 7850-7859).
Los factores tróficos influyen también en la función del nicho neurogénico. La neurogénesis está regulada por factores de crecimiento extracelulares presentes en los nichos como las neuregulinas 1 y 2 (NRG1 y NRG2) que activan el receptor ErbB4 o los ligandos del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como el factor de crecimiento transformante alfa (TGFa) (Alipanahzadeh et al. 2014. Transforming Growth Factor-alpha Improves Memory Impairment and Neurogenesis Following Ischemia Reperfusion. Cell J, 16: 315-324; Mahar et al. 2016. Effects of neuregulin-1 administration on neurogenesis in the adult mouse hippocampus, and characterization of immature neurons along the septotemporal axis. Sci Rep, 6: 30467;Mahar et al. 2017. Disrupted hippocampal neuregulin-1/ErbB3 signaling and dentate gyms granule cell alterations in suicide. Transí Psychiatry, 7: e1243). Curiosamente, se han encontrado alteraciones del comportamiento en individuos que presentaban una señalización alterada de la neuregulina (Mahar et al. 2017. Disrupted hippocampal neuregulin-1/ErbB3 signaling and dentate gyms granule cell alterations in suicide. Transí Psychiatry, 7: e1243) y se ha observado una mejora cognitive en modelos de isquemia en ratones tras el tratamiento con TGFa (Alipanahzadeh et al. 2014. Transforming Growth Factor-alpha Improves Memory Impairment and Neurogenesis Following Ischemia Reperfusion. Cell J, 16: 315-324). Estos factores tróficos regulan vías de señalización que generan respuestas como cambios en la expresión de ciclinas que pueden alterar el equilibrio qNSC/aNSC (Morales and Mira 2019. Adult Neural Stem Cells: Bom to Last. Front Cell Dev Biol, 7: 96;Montaron et al. 2020. Responsiveness of dentate neurons generated throughout adult life is associated with resilience to cognitive aging. Aging Cell, e13161). De igual modo, la deletion en ratones del receptor de neuregulina ErbB4 reduce las capacidades de memoria y aprendizaje espacial (Skirzewski et al. 2020. ErbB4 Null Mice Display Altered Mesocorticolimbic and Nigrostriatal Dopamine Levels as well as Deficits in Cognitive and Motivational Behaviors. eNeuro, 7).
Los ligandos de receptor EGFR como el TGFα se sintetizan en forma de pre-proteínas que atraviesan la membrana y son secretados al medio extracelular en una reacción proteolítica catalizada por la convertasa ADAM 17 (Blobel 2005. ADAMs: key components in EGFR signalling and development. Nat Rev Mol Cell Biol, 6: 32-43). La selectividad de esta enzima para cada ligando está determinada por las reacciones de fosforilación catalizadas por quinasas de la familia de las proteínas quinasa C (PKC) (Dang et al. 2013. Regulated ADAM17-dependent EGF family ligand release by substrate-selecting signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A, 110: 9776- 9781). La PKC consta de 3 subfamilias de quinasas: las clásicas (cPKC), las noveles (nPKC) y las atípicas. La PKCa, perteneciente a la familia de cPKC, es activada por el forboll- 12-miristato- 13-acetato (PMA) catalizando la fosforilación de los precursores de TGFa y anfiregulina facilitando su desprendimiento mediado por el ADAM 17 y la liberación del ligando soluble fuera de la célula. Del mismo modo, la activación de la PKC novel ó es necesaria para la secreción de neuregulina mediada por ADAM17. En general, la especificidad y selectividad del sustrato de ADAM 17 está mediada por la activación de diferentes isoenzimas de PKC, desempeñando así un papel clave en la secreción de diferentes tipos de factores de crecimiento (Dang et al. 2011. Epidermal growth factor (EGF) ligand release by substrate-specific a disintegrin and metalloproteases (ADAMs) involves different protein kinase C (PKC) isoenzymes depending on the stimulus. J Biol Chem, 286: 17704-17713;Dang et al. 2013. Regulated ADAM 17-dependent EGF family ligand release by substrate-selecting signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A, 110: 9776-9781 ;Geribaldi-Doldan et al. 2019. Protein Kinase C: Targets to Regenerate Brain Injuries? Front Cell Dev Biol, 7: 39).
La actividad de las PKC se regula fisiológicamente mediante la unión a diatilglicerol. Existen además compuestos de naturaleza farmacológica pertenecientes a la familia de los diterpenos capaces de regular su actividad. Estas moléculas constituyen un vasto grupo de compuestos de un esqueleto de 20 carbonos que, por delación, generan estructuras policídicas (Duran-Peña et. al. Biologically active diterpenes containing a gem-dimethylcyclopropane subunit: An intriguing source of PKC modulators. Nat. Prod. Rep. 2014, 31: 940-952) capaces de mimetizar al DAG activando así a las PKC. Una de estas estructuras policídicas son los ásteres de forboll- con estructura de tiglianos. Los ásteres de forblol- son diterpenos naturales derivados de plantas, muy abundantes en el látex de las plantas de la familia Euphorbiaceae. Uno de los más conoddos es el forboll- 12-miristato-13-acetato (PMA), muy usado en investigación, pero sin utilidad dínica por ser altamente tumorigénico (Deleers, M. and Malaisse, W. J. Binding of tumor-promoting and biologically inactive phorbol esters to artificial membranes. Cancer Lett. 1982, 17:135-140). Algunos estudios han testado el efecto de 12-desoxiforboll-es aislados y purificados del látex de Euphorbia resinífera, algunos de los cuáles, como el ER272 se ha demostrado que inducen la proliferadón de los NPC tanto in vitro como in vivo mediante su interacción con PKC (Geribaldi- Doldán et al. 12-Deoxyphorbols promote adult neurogenesis by inducing neural progenitor cell proliferation via PKC activation. Int. J. of Neuropsychopharmacology 2016, 19: 1-14).
El mayor problema que presenta el uso de 12-desoxiforboll-es para el desarrollo de fármacos, es la variabilidad en la producción a partir del látex de E. resinífera, y la escasa biodisponibilidad de estos compuestos. Por lo tanto, uno de los problemas con el que se enfrenta la presente invención, es que, si bien el tratamiento con 12-desoxiforboll-es promueve la neurogénesis, y puede constituir una herramienta farmacológica para el tratamiento de patologías que cursan con pérdida neuronal durante el envejecimiento, es difícil disponer de suministro suficiente de éstos a la hora de elaborar fármacos. Adicionalmente y sin perjuicio de lo anterior, la presente invención también se enfrenta al problema de buscar compuestos estructuralmente relacionados con los 12-desoxiforboll-es previamente descritos, con un efecto mayor que los ya existentes, y que puedan utilizarse a menor concentración. Por este motivo, en esta invención se han sintetizado a partir del esqueleto de forblol-, 12, 13-d ¡ásteres de forblol- con capacidad para estimular la secreción de factores tróficos, favorecer la proliferación de células madre neurales en cultivo y de estimular la neurogénesis en el cerebro adulto. Estos compuestos semisintéticos, que no han sido descritos previamente, ejercen su efecto a concentraciones menores que los 12-desoxiforblole-s previamente descritos.
En concreto, y tal y como se muestra en el ejemplo 5, se ha comprobado el efecto de los compuestos P-12,13-diiBu (S1), P-12-iBu-13-PhAc (S2) y P-13-iBu-12-PhAc (S3) sobre la secreción de factores tróficos tales como el TGFa. Más concretamente, en la figura 1 se puede ver un esquema de la construcción realizada y en el panel derecho, se ha representado la tasa de fluorescencia mCherry/GFP en cultivos de células HEK293T a las que se ha añadido suero salino (0) o adicionalmente los compuestos S1 , S2 y S3. Puede verse como en presencia de los compuestos P-12,13-diiBu (81), P-12-iBu-13-PhAc (82) y P-13-iBu-12-PhAc (S3) la tasa de fluorescencia mCherry/GFP disminuye indicando que la proteína m-Cherry está siendo liberada al medio extracelular junto con el segmento soluble de TGFa.
Adicionalmente, en el ejemplo 6, se analizó el efecto de otros compuestos sobre la secreción de TGFa. En concreto, se adicionaron, los compuestos P-12,13-diPhAc (84), P-12,13-diAc (S5), P- 13-¡Bu-12-Tig (86), DPPI (N1), DPPT (N2), y DP-13,16-diPhAc (N3) a células transfectadas con la construcción indicada en el ejemplo 5 percibiéndose un cambio en la tasa mCherry/GFP. A pesar de que el efecto de todos ellos era algo menor que el de los descritos en el ejemplo 5, se observaba una reducción de la tasa mCherry/GFP indicando que en todos los casos había una facilitación de la secreción de TGFa cuando se administraba el compuesto a los cultivos (ver Figura 2).
Más aún, en el ejemplo 7 y figura 3, se puede observar como en presencia de forboll- o de forboll-- 13-isobutirato (87) o DP-13PhAc-16-Bz (N4), la tasa de fluorescencia mCherry/GFP en células HEK293T transfectadas con la construcción mChery-TGFa-EGFP, no se ve alterada, indicando que esta modificación del forbol resulta en un compuesto que no ejerce ningún efecto sobre la escisión de TGFa.
Por lo tanto, el grupo éster en C-12 resulta fundamental para inducir la secreción de TGFa.
A partir de todos los datos mostrados a lo largo de los ejemplos y las figuras se ha comprobado como 12-desoxiforboll-es de formula (I) resultan especialmente útiles para promover la neurogénesis tanto in vitro como in vivo. Por lo tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende un compuesto de formula I, o sales, isómeros, estereoisómeros, polimorfos, o hidratos, preferiblemente farmacéuticamente aceptables, de dicho compuesto:
Figure imgf000012_0001
donde Ri, R2 y R3 se seleccionan, de manera independiente, de la lista arriba indicada.
Se hace notar que, hasta el momento, los autores de la invención ha determinado como activos para promover la neurogénesis los siguientes productos: R1=R3=H R2=CH3; R1=R3=H R2=C(CH3)=CHCH3; R1=R3=H R2=CH(CH3)2; R1=R3=H R2=CH2Ph; R,= OCOCH3 R2=CH3 R3=H; R1=OCOCH(CH3)2 R2=CH(CH3)2 R3=H; R1=OCOCH2Ph R2=CH2Ph R3=H; R1=OCOCH2Ph R2=CH(CH3)2 R3=H; R1= OCOC(CH3)=CHCH3 R2= CH(CH3)2 R3=H; R1= OCOCH(CH3)2 R2=CH2Ph R3=H; R1=H R2=CH2Ph R3=OCOCH2Ph; R1=H R2=CH2Ph R3=OCOC(CH3)=CHCH3; y R1=H R2=CH2Ph R3= OCOCH(CH3)2. Como se puede observar, han sido activos mono o diésteres donde los grupos ésterse sitúan en C-13, C-12 y C13, o C13 y C-16. La actividad radica en la naturaleza de esos grupos éster. De los activos hasta ahora, pueden tener cadenas de hasta 5 átomos de carbono. También han sido activos los que contienen un grupo fenil acetato, pero el benzoato no ha sido activo.
En concreto, en la presente invención se han testado compuestos presentando la estereoquímica indicada en la formula II. Por lo tanto, un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende un compuesto de formula I, o sales, isómeros, estereoisómeros, polimorfos, o hidratos, preferiblemente farmacéuticamente aceptables, de dicho compuesto: Formula (II)
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donde R1, R2 y R3 se seleccionan, de manera independiente, de la lista arriba indicada.
En una realización preferida del primer o segundo aspecto de la invención, el compuesto es un compuesto de formula I seleccionado de cualquiera de los siguientes: a. R1=R3— H R2— CH3; b. R1=R3=H R2=C(CH3)=CHCH3; c. R1=R3=H R2=CH(CH3)2; d. R1=R3=H R2=CH2Ph; e. R1= OCOCH3 R2=CH3 R3=H; f. R1=OCOCH(CH3)2 R2=CH(CH3)2 R3=H; g. R1=OCOCH2Ph R2=CH2Ph R3=H; h. R1=OCOCH2Ph R2=CH(CH3)2 R3=H; i. R1= OCOC(CH3)=CHCH3 R2= CH(CH3)2 R3=H; j. R1= OCOCH(CH3)2 R2=CH2Ph R3=H; k. R1=H R2=CH2Ph R3=OCOCH2Ph;
I. R1=H R2=CH2Ph R3=OCOC(CH3)=CHCH3; or m. R1=H R2=CH2Ph R3= OCOCH(CH3)2
Preferiblemente, el compuesto es un compuesto de formula I seleccionado de cualquiera de los siguientes: a. R1= OCOCH3 R2=CH3 R3=H; b. R1=OCOCH(CH3)2 R2=CH(CH3)2 R3=H; c. R1=OCOCH2Ph R2=CH2Ph R3=H; d. R1=OCOCH2Ph R2=CH(CH3)2 R3=H; e. R1= OCOC(CH3)=CHCH3 R2= CH(CH3)2 R3=H; f. R1= OCOCH(CH3)2 R2=CH2Ph R3=H; g. R1=H R2=CH2Ph R3=OCOCH2Ph; h. R1=H R2=CH2Ph R3=OCOC(CH3)=CHCH3; or i. R1=H R2=CH2Ph R3= OCOCH(CH3)2
Más preferiblemente, el compuesto consiste en forboll- 12,13-diisobutirato de fórmula:
Figure imgf000014_0001
o sales, isómeros, estereoisómeros, polimorfos, o hidratos, preferiblemente farmacéuticamente aceptables, de dicho compuesto.
Más preferiblemente, el compuesto consiste en forblol--12-isobutirato-13-fenilacetato de fórmula:
Figure imgf000015_0001
o sales, isómeros, estereoisómeros, polimorfos, o hidratos, preferiblemente farmacéuticamente aceptables, de dicho compuesto.
Más preferiblemente, el compuesto consiste en forblol- 13-isobutirato-12-fenilacetato de fórmula:
Figure imgf000015_0002
o sales, isómeros, estereoisómeros, polimorfos, o hidratos, preferiblemente farmacéuticamente aceptables, de dicho compuesto.
En otra realización preferida del primer o segundo aspecto de la invención, la composición además comprende precursores neurales o células madre neurales.
En el contexto de la presente invención, se entiende por precursores neurales o células madre neurales a aquellas células madre aisladas del tejido neural adulto o fetal, que presentan capacidad de auto-replicarse, pero con una potencialidad limitada, pues sólo pueden diferenciarse hacia los tres subtipos de células del linaje neural: neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso in vitro de las composiciones según cualquiera de los dos primeros aspectos de la invención, para favorecer o promover la proliferación o expansión de precursores neurales o células madre neurales en cultivo.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un medio de cultivo adecuado para estimular la proliferación o expansión de precursores neurales, preferiblemente en ausencia de EGF, que comprende al menos un compuesto tal y como se definen estos en cualquiera de los dos primeros aspectos de la invención y opcionalmente el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF).
Un quinto aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la proliferación de células madre neurales o precursores neurales in vitro caracterizado por que comprende poner en contacto células madre neurales o precursores neurales con: a. una solución o disolución que comprenda los compuestos definidos en cualquiera de los dos primeros aspectos de la invención, y/o con una sal de los mismos, y opcionalmente el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF); o b. el medio de cultivo según el cuarto aspecto de la invención; durante un tiempo suficiente para la proliferación efectiva de las células madre neurales o precursores neurales.
Se hace notar que para utilizar compuestos de la invención en cultivo in vitro es preferible disolverlos previo a su utilización en una solución que pueda disolver tanto el compuesto como su sal farmacéuticamente aceptada. Ejemplos del disolvente pueden ser dimetilsufóxido (DMSO), agua o similares. Adicionalmente, este compuesto puede estar disuelto en tampón fosfato salino (PBS).
En un aspecto particular de la invención, para cultivar las células madre neurales con los compuestos de la invención, es preferiblemente utilizar un rango de concentración para los compuestos de la invención de entre 1 pmol/L a 40 pmol/L, las células madre se deben cultivar en flotación a una densidad de 20 a 200 x 106 células/L. El compuesto se añade, preferiblemente, a un cultivo estático, preferiblemente a 37°C, durante 1 a 14 días, preferiblemente en una atmósfera de 5% CO2, opcionalmente cambiando el medio de forma total o parcial cada dos días. El medio en el que se cultivan las células puede ser cualquier medio que no impida la proliferación de las células madre neurales, como ejemplo se puede utilizar preferentemente un medio Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F-12 (1 :1), que contenga 2% del suplemento B27 (Invitrogen), 2mM L-glutamina y 2pg/ml de gentamicina. Adicionalmente el medio puede o no, contener el factor de básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), preferiblemente a una concentración de 10pg/L.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a una composición que comprenda los compuestos definidos en cualquiera de los dos primeros aspectos de la invención, para su uso en terapia.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto tal y como se define en cualquiera de los dos primeros aspectos de la invención, donde dicha composición farmacéutica opcionalmente comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Preferiblemente, la composición farmacéutica del séptimo aspecto de la invención es adecuada o está formulada para su administración en el sistema nervioso central, preferiblemente por vía intranasal.
Un octavo aspecto de la presente invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la presente invención para el tratamiento de enfermedades o lesiones que cursen con pérdida neuronal o con una disminución de la neurogénesis en regiones neurogénicas. Alternativamente, la presente invención se refiere a la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en el tratamiento de enfermedades o lesiones que cursen con pérdida neuronal o con una disminución de la neurogénesis.
En realización preferida del octavo aspecto de la presente invención, las enfermedades o lesiones que cursan con pérdida neuronal son las seleccionadas de la lista que consiste en:
1. Enfermedades neurodegenerativas: se producen como consecuencia de la muerte neuronal precoz. Las más frecuentes son la enfermedad de Alzheimer, con pérdida neuronal en el hipocampo y corteza cerebral fundamentalmente, la enfermedad de Parkinson, con muerte selectiva de neuronas en la sustancia negra, o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), con déficit de neuronas en la médula espinal.
2. Traumatismo craneoencefálico: es una lesión de origen traumático que incide sobre el cráneo, con afectación cerebral. El daño puede ser focal — limitado a una sola área del cerebro — o involucrar a más de un área del cerebro. En el contexto de esta invención el traumatismo craneoencefálico puede producir daño cerebral por muerte neuronal que podría ser tratado mediante terapias dirigidas a favorecer la regeneración neuronal. 3. Lesión hipóxico-isquémica: Reducción del flujo sanguíneo cerebral hasta niveles que son insuficientes para mantener el metabolismo necesario para la normal función y estructura del cerebro. En los adultos, la isquemia es causada fundamentalmente por accidentes cerebrovasculares, que pueden ser focales (de origen isquémico, hemorrágico o mixto), o múltiples (como en la demencia multiinfarto). En el recién nacido, dicha hipoxia/isquemia se debe fundamentalmente a sufrimiento fetal o perinatal. En el contexto de la presente invención la hipoxia-isquemia es una condición que produce sufrimiento celular debido a la falta de aporte de oxígeno al tejido cerebral que en la mayoría de los casos produce muerte neuronal.
4. Infecciones del SNC: Afectación cerebral por distintos agentes infecciosos que originan meningitis, encefalitis o meningoencefalitis. En el contexto de esta invención, las infecciones del SNC originan sufrimiento celular bien directamente o indirectamente por el edema cerebral que originan, pudiendo causar muerte neuronal.
5. Epilepsia: Enfermedad crónica caracterizada por uno o varios trastornos neurológicos que deja una predisposición para generar convulsiones recurrentes, que suele dar lugar a consecuencias neurobiológicas, cognitivas y psicológicas.
6. Esquizofrenia: trastorno mental grave por el cual las personas interpretan la realidad de manera anormal. La esquizofrenia puede provocar una combinación de alucinaciones, delirios y trastornos graves en el pensamiento y el comportamiento, que afecta el funcionamiento diario y puede ser incapacitante.
En una realización preferida del octavo aspecto de la invención, la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de enférmedades o lesiones que cursen con perdida neuronal seleccionadas del grupo que consiste en: isquemia cerebral focalizada, traumatismo craneoencefálico con daño neuronal, Parkinson, enfermedad de Alzheimer, epilepsia y esclerosis lateral amiotrófica. Preferiblemente, dicha composición se administra en el sistema nervioso central vía intranasal. EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Preparación de los compuestos
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Estructuras químicas de los compuestos estructuralmente relacionados con 12-desoxiforblole-s, sintetizados a partir de derivados de forboL A) Estructura química del compuesto forboll--12, 13- diisobutirato (P-12,13-diiBu, S1). B) Estructura química de forboll--12-isobutirato-13-fenilacetato (P-12-iBu-13-PhAc, S2). C) Estructura química del compuesto forboll--13-isobutirato-12- fenilacetato (P-13-iBu-12-PhAc, S3). D) Estructura química del compuesto forblol--12, 13- difenilacetato (P-12,13-diPhAc, S4), E) Estructura química del compuesto forbol-12,13-diacetato (P-12,13-diAc, S5). F) Estructura química del compuesto forbol-13-isobutirato-12-tigliato (P-13- Tig-12-iBu, S6). G) Estructura química del compuesto forboll--13-isobutirato (P-13-iBu, S7).
1.2).
Figure imgf000020_0001
Esquema de preparación de forboll--12, 13-diisobutirato (P-12,13-diiBu, S1) y forboll--12, 13- difenilacetato (P-12,13-diPhAc, S4) desde forboll--20-tritilo (P-20T, 1).
1.3).
Figure imgf000021_0001
Esquema de preparación de forboHl-2-isobutirato-13-fenilacetato (P-12-iBu-13-PhAc, S2) desde forboll--20-tritilo (P-20T, 1).
1.4)
Figure imgf000022_0001
Esquema de preparación de forboll--13-isobutirato-12-fenilacetato (P-13-iBu-12-PhAc, S3), forboll-- 13-isobutirato-12-tigliato (P-13-iBu-12-Tig, S6), y de forblol--13-isobutirato (P-13-iBu, S7) desde forboll--20-tritilo (P-20T, 1). 1.5).
Figure imgf000023_0001
Esquema de preparación de forboll--12, 13-diacetato (P-12,13-diAc, S5) desde forboll--20-tritilo (P-
20T, 1).
Ejemplo 2. Compuestos aislados de Euphorbia resinífera.
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Figure imgf000023_0003
Estructuras químicas de los compuestos estructuralmente relacionados con 12-desoxiforblole-s, aislados del látex de E. resinífera. H) Estructura química del compuesto 12-desoxi-16- hidroxiforboLl-16-isobutirato-13-fenilacetato (DPPI, N1). I) Estructura química del compuesto 12- desoxi-16-hidroxiforboll--16-tigliato-13-fenilacetato (DPPT, N2). J) Estructura química del compuesto 12-desoxi-16-hidroxiforboll--13,16-difenilacetato (DP-13,16-diPhAc, N3). K) Estructura química del compuesto 12-desoxi-16-hidroxiforboLl-16-benzoato-13-fenilacetato (DP-13-PhAc-16- Bz, N4).
EJEMPLO 3. Descripción y obtención de los compuestos de las estructuras S1-S7
Preparación de forboll--20-tritilo (P-20T, 1) desde aceite de croton
A una solución 0.01 M de HCIO4 en metanol (MeOH, 180 mL), se añadió aceite de croton (49.0 g). Al cabo de 72 horas de agitación vigorosa, se neutralizó con Acetáto sódico (AcONa 3H2O) y se lavó con hexano (3 x 150 mL). La fase metanólica se evaporó a presión reducida y el crudo resultante se fraccionó mediante cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con 1 :1 hexanoréter etílico (Et2O, 400 mL), 100% Et2O (300 mL) y finalmente MeOH (200 mL). El disolvente de la fracción obtenida al eluir con la mezcla 1 :1 hexano:Et2O, se evaporó a presión reducida para dar 13.2 g de crudo de reacción, el cual se sometió a una reacción de tritilación, añadiendo piridina (60 mL) y cloruro de tritilo (25.0 g). Tras 72 horas de reacción, el disolvente se evaporó a presión reducida y se añadió acetato de etilo (90 mL). La fase orgánica resultante se lavó, sucesivamente, con una solución saturada de NaHCO3 (120 mL) y salmuera (120 mL). Por último, la fase orgánica se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y el disolvente se evaporó a presión reducida. El crudo de reacción resultante se disolvió en MeOH (50 mL), se añadió lentamente metóxido sódico (MeONa, 550 mg) y se mantuvo en agitación durante 24 horas. Transcurrido ese tiempo, la mezcla de reacción se neutralizó con una solución de ácido acético (AcOH) 10% y el disolvente se evaporó a presión reducida. La purificación del crudo de reacción mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo, dio lugar a forboLl- 20-tritilo (1) (536 mg, 1 ,1% en peso, desde aceite de croton).
Los datos espectroscópicos de P-20T (1) son consistentes con los descritos en la literatura (Bertolini TM, Giorgione J, Harvey DF, Newton AC. Protein Kinase C Translocation by Modified Phorbol Esters with Functionalized Lipophilic Regions. J Org Chem 2003; 68: 5028-5036.). Preparación de forboll--12.13-diisobutirato-20-tritilo (P-12,13-diiBu-20T, S1a) v de forbol-12,13- difenilacetato-20-tritilo (P-12,13-diiBu-20T, S4a).
Una mezcla de forboll--20-tritilo (P-20T, S1a, 0.13 mmol), 1.13 mmol del correspondiente ácido (ácido isobutírico para S1a, ácido fenil acético para S4a) y A/,A/-dimetilaminopiridina (DMAP, 0.13 mmol) en diclorometano seco (2 mL) se agitó durante 10 minutos. A continuación se añadieron 1.13 mmol de /V-(3-dimetilaminopropil)-/V-etildicarbodiimida (EDCI) y se mantuvo en agitación durante 18 h, transcurridas las cuales, se evaporó el disolvente mediante destilación a presión reducida. El crudo resultante fue disuelto en Et2O (5 mL) y lavado secuencialmente con H2O (5 mL), una disolución saturada de NaHCO3 (5 mL) y finalmente con H2O (5 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y el disolvente se evaporó a presión reducida obteniendo los compuestos S1a y S4a, respectivamente.
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto P-12, 13-diiBu-20T, (S1a) (99% Rto): Sólido amorfo; [a]D 21 +50.9 (c=2.0 mg/mL, CH3OH); IR (KBr) Vrnáx: 3408; 3059; 2975; 2934; 1735; 1714; 1469; 1389; 1194; 1076; 980; 758 cm 1; RMN-1H (400 MHz, CD3OD) óH(ppm): 7.56 (1 H, s ancho), 7.39- 7.22 (18H, m), 5.56 (1 H, d, 6.1 Hz), 5.42 (1 H, d, 9.8 Hz), 3.58 (1 H, d, 11.0 Hz), 3.50 (1 H, d, 11.0 Hz), 2.57 (2H, de, 6.9 Hz), 3.19 (2H, m), 2.50 ( 2H, s), 2.23 (1 H, de, 9.8 y 6.3Hz), 1 ,20-1 ,14 (12H, m), 1.75 (3H, dd, 3.0 y 1.4 Hz), 1.29 (3H, s ancho), 1.24 (3H, s ancho), 1.08 (1 H, d, 5.2 Hz), 0.89 (1 H, d, 6.3 Hz); RMN-13C (100 MHz, CD3OD) δc (ppm): 210.2 (s), 180.8 (s), 178.5 (s), 160.4 (d), 145.5 (s), 140.7 (s), 134.4 (s),
130.8 (d), 129.8 (d), 128.8 (d), 128.1 (d), 88.1 (s), 79.5 (d), 78.1 (d), 74.9 (s), 69.9 (t),
66.8 (s), 57.4 (d), 44.3 (d), 40.4 (d), 38.9 (t), 37.0 (d), 35.5 (2C, d), 27.3 (s), 24.2 (c), 19.5 (c), 19.2 (c), 19.0 (c), 18.9 (c), 17.4 (c), 14.7 (c), 10.2(c); HRMS (ESI+): m/z caled para C47H54O8Na [M+Na]+ 769.3716, encontrada 769.3714.
Datos físicos y espectroscópicos de P-12,13-diPhAc, (S4a) (82% Rto): consistentes con los descritos en la literatura ( Appendino, G., Cravotto, G., Palmisano, G., Annunziata, R. & Szallasi, A. Synthesis and Evaluation of Phorboid 20-Homovanillates: Discovery of a Class of Ligands Binding to the Vanilloid (Capsaicin) Receptor with Different Degrees of Cooperativity. J. Med. Chem. 1996, 39, 3123-3131.). Procedimiento general de esterificación selectiva en la posición C-13. Preparación de forboll--13- fenilacetato-20-tritilo (P-13-PhAc-20T, S2a) y de forboll--13-isobutirato-20-tritilo (P-13-¡Bu-20T, S3a).
Una mezcla de 0.13 mmol de fortx)l-20-tritilo (P-20T, S1a), 0.4 mmol del correspondiente ácido (ácido fenilacético para S2a y ácido isobutírico para S3a) y 0.03 mmol de DMAP en diclorometano seco (2 mL) se agitó durante 10 minutos. A continuación, se añadieron 0.4 mmol de A/-(3- dimetilaminopropil)-/V-etildicarbodiimida (EDCI) y se mantuvo en agitación durante 2 h, transcurridas las cuales, se evaporó el disolvente mediante destilación a presión reducida. El crudo resultante fue disuelto en Et2O (5 mL) y lavado secuencialmente con H2O (2 x 5 mL), una disolución saturada de NaHCOs (5 mL) y finalmente con H2O (5 mL). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y el disolvente se evaporó a presión reducida obteniendo S2a (63.1 mg) y S3a (87.0 mg, 99%).
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto forbol-13-fenilacetato-20-tritilo (S2a) (67% Rto) consistentes los descritos en la literatura (Appendino, G., Cravotto, G., Palmisano, G. Synthesis and biological evaluation of phorbol-resiniferatoxin (RTX) hybrids. European J. Org. Chem. 2004, 3413-3421).
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto forbol-13-isobutirato-20-tritilo (S3a) (99% Rto): Sólido blanco amorfo; [ajo20 +0,7 (c=4,7 mg/mL, CH3OH); IR (KBr) vmáx: 3411 , 3059, 2977, 2927, 2877, 1710, 1448, 1324, 1204, 1159, 1048, 992, 758, 706 cm 1; RMN- 1 H (400 MHz, CD3OD) δH (ppm): 7.58 (1 H, s ancho), 7.39 - 7.22 (1 OH, m), 5.54 (1 H, d, 6.0 Hz), 3.87 (1 H, d, 9.9 Hz), 3.56 (1 H, d, 11.0 Hz), 3.49(1 H, d, 11.0 Hz), 3.15 (1 H, m), 2.63 (1 H, sept, 7.0 Hz), 2.49 (2H, s), 2.04 (1 H, de, 9.9 y 6.6 Hz), 1.76 (3H, dd, 3.0 y 1.4 Hz), 1.24 (6H, s), 1.19 (3H, d, 7.0 Hz), 1.06 (3H, d, 6.6 Hz), 0.98 (3H, d, 5.3 Hz); RMN-13C (100 MHz, CD3OD) δc (ppm): 210.5 (s), 181.6 (s), 160.9 (s), 145.5 (3C, s), 140.3 (s), 134.2 (s), 131.3 (s), 129.8 (2C, d), 128.8 (6C, d), 128.1(d), 88.1 (s), 79.4 (s), 77.5 (d), 74.9 (s), 70.0 (t), 69.0 (s), 57.7 (d), 46.2 (d), 40.4 (d), 39.0 (t), 36.6 (d), 35.5 (d), 27.1 (s), 24.3 (q), 19.2 (q), 19.1 (q), 17.4 (q), 15.4 (q), 10.3(q); HRMS (ESI+): m/z caled para C43H48O7Na [M+Na]+ 699.3298, encontrada 699.3287.
Preparación de forboll--12,13-d¡acetato-20-tritilo (P-12,13-diAc-20T, S5a).
Una mezcla de forboll--20-tritilo (P-20T, S1a, 0.1 mmol) y piridina (2 gotas) en anhídrido acético (2 mL) se agitó durante 18 h a temperatura ambiente. Entonces, se añade ciclohexano (5 mL) y la mezcla de disolventes resultante se evapora a presión reducida, repitiendo este proceso tres veces, para darforboll--12,13-diacetato-20-tritilo (P-12,13-diAc-20T, S5a, 99%).
Los datos espectroscópicos deforboll--12.13-diacetato-20-tritilo (S5a) son consistentes con los descritos en la literatura (Bertolini TM, Giorgione J, Harvey DF, Newton AC. Protein Kinase C Translocation by Modified Phorbol Esters with Functionalized Lipophilic Regions. J Org Chem 2003; 68: 5028-5036.).
Preparación de forboll--12-isobutirato-13-fenilacetato-20-tritilo (P-12-iBu-13-PhAc-20T, S2b).
Partiendo de fort)ol-13-fenilacetato-20-tritilo (S2a) y empleando las condiciones arriba descritas para la preparación de S1a desde forboll--20-tritilo (1), se obtuvo, S2b.
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto forbol-12-isobutirato-13-fenilacetato- 20-tritilo (P-12-iBu-13-PhAc-20T, S2b) (82% Rto.): Sólido blanco amorfo; [α]D20 +28.5 (c 1.5, CH3OH); IR (KBr) Vmáx 3414, 2976, 2924, 2878, 1715, 1626, 1469, 1269, 1218, 1154, 759, 705 cm"1; RMN-1H (CD3OD, 500 MHz) δH (ppm): 7.54 (1H, dd, J= 2.4 y 1.4 Hz), 7.39- 7.19 (20H, m), 5.51 , (1 H, d, J= 6.2 Hz), 5.46, (1 H, d, J= 10.5 Hz), 3.66 (2H, s), 3.56, (1 H, d, J= 11.0 Hz), 3.48, (1 H, d, J= 11.0 Hz), 3.14, (2H, m), 2.56 (1 H, sept , J= 7.0 Hz), 2.51- 2.46 (2H, s), 2.21 , (1 H, dq, J= 10.5, 6.4 Hz), 1.73, (3H, d, J= 2.8 Hz), 1.23, (3H, s), 1.16, (3H, d, J= 7.0 Hz), 1.15, (3H, d, J= 7.0 Hz), 1.04, (3H, s), 0.98, (1 H, d, J= 6.2 Hz), 0.87, (3H, d, J= 6.4 Hz); RMN-13C (CD3OD, 125 MHz) ) δc (ppm): 210.2 (s), 178.6 (s), 175.7 (s), 160.3 (s), 145.5 (3C, s), 140.7 (s), 134.9 (s), 134.4 (s), 130.7 (2C, d), 130.6 (d), 129.8 (6C, d), 129.5 (2C, d), 128.8 (6C, d), 128.14 (d), 128.10 (3C, d), 88.1 (s), 79.5 (s), 78.1 (d), 74.8 (s), 69.8 (t), 67.4 (s), 57.4 (d), 44.3 (d), 42.1 (t), 40.3 (d), 38.8 (t), 36.9 (d), 35.4 (d), 27.5 (s), 24.0 (q), 19.4 (q), 19.2 (q), 17.4 (q), 14.7 (q), 10.2 (q); HRMS (ESI+): m/z caled para C51H54O8Na [M+Na]+ 817.3716, encontrada 817.3706.
Preparación de forboll--13-¡sobut¡rato-12-fenilacetato-20-tritilo (P-13-¡Bu-12-PhAc-20T, S3b).
Partiendo de forboll--13-isobutirato-20-tritilo (S3a) y empleando las condiciones arriba descritas para la preparación de S1a desde forboll--20-tritilo (1), se obtuvo, S3b
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto forbol-13-isobutirato-12-fenilacetato- 20-tritilo (S3b) (73%). Sólido blanco amorfo; [a]D 20 + 26.3 (c 3.1 , CH3OH); IR (KBr) vmáx 3330, 3059, 3022, 2972, 2917, 2872, 1706, 1447, 1348, 1251 , 1157, 1049, 980, 702 cm 1; RMN-1H (CD3OD, 500 MHz) δH (ppm): 7.53 (1 H, dd, 2.6 y 1.4 Hz), 7.37-7.19 (20H, m), 5.52 (1H, d, 5.4 Hz), 5,4 (1 H, d , 10.4 Hz), 3.64 (2H, s), 3.54 (1H, d, 11.1 Hz), 3.47 (1H, d, 11.1 Hz), 3.16 (1 H, quint, 2.6 Hz), 3.12 ( 1 H, t, 5.4 Hz), 2.53 (1 H, sept, 7.0 Hz), 2.48 (2H, s), 2.18 (1H, de, 10.4 y 6.4 Hz), 1.73 (3H, dd, 2.6 y 1.4 Hz), 1.12 (6H, d, 7.0 Hz), 1.08 (3H, sa), 1.05 (3H, sa), 1.00 (1 H, d, 5.4 Hz), 0.84 (3H, d, 6.4 Hz); RMN-13C (CD3OD, 125 MHz) δc (ppm): 210.2 (s), 173.3 (s), 160.3 (s), 145.4 (s), 140.6 (s), 135.8 (s), 134.4 (s), 130,7 (d), 130.2 (d), 129.8 (s), 129.6 (d), 128.8 (d), 128.1 (2C, d), 88.1 (s), 79.4 (s), 78.7 (d), 74.8 (s), 69.9 (t), 66.6 (s), 57,3 (d), 44.1 (d), 42.5 (t), 40.3 (d), 38.8 (t), 37.0 (d), 27.3 (s), 24.0 (c), 17.0 (c), 14.7 (c), 10.3 (c ); HRMS (ESI+): m/z caled para C51H54O8Na [M+Na]+ 817.3716, encontrada 817.3705.
Preparación de forboll--13-¡sobut¡rato-12-tigliato-20-tritilo (P-13-íBu-12-PhAc-20T, S6b).
Partiendo de forboll--13-isobutirato-20-tritilo (S3a) y empleando las condiciones arriba descritas para la preparación de S1a desde forboll--20-tritilo (1), se obtuvo, S6b, pero empleando ácido tíglico, en lugar de ácido isobutírico.
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto forbol-13-isobutirato-12-tigliato-20- tritilo (S6b) (47%). Sólido blanco amorfo; [a]D 21 + 17.5 (c 1.25, CH3OH). IR (KBr) Vmax 3402, 2978, 2950, 1712, 1448, 1361 , 1254, 1219, 1156, 1082, 770, 705 cm 1. 1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δH : 7.56 (dd, J = 2.6, 1.4 Hz, 1 H), 7.41-7.37 (m, 6H), 7.30-7.21 (m, 9H), 6.85 (dq, J = 7.2, 1.4 Hz, 1 H), 5.56 (d, J = 6.1 Hz, 1 H), 5.48 (d, J = 10.4 Hz, 1 H), 3.58 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 3.50 (d, J = 11.1 Hz, 1 H), 3.20 (m, 2H), 2.57 (sept, J = 7.0 Hz, 1 H), 2.51 (s, 2H), 2.26 (dq, J= 10.4, 6.4 Hz, 1 H), 1.83 (m, 3H), 1.80 (m, 3H), 1.75 (dd, J = 2.6, 1.4 Hz, 3H), 1.31 (s, 3H), 1.23 (s, 3H ), 1.17 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.15 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.08 (d, J= 5.1 Hz, 1H), 0.87 (d, J= 6.4 Hz, 3H). 13C NMR (CD3OD, 100 MHz) δc: 210.0 (s), 180.7 (s), 169.1 (s), 160.2 (d), 145.3 (3C, s), 140.5 (s), 138.8 (d), 134.2 (s), 130.6 (d), 129.6 (6C, d), 129.4 (d) , 128.6 (6C, d), 127.9 (3C, d), 87.9 (s), 79.3 (s), 78.0 (d), 74.7 (s), 69.7 (t), 66.6 (s), 57.1 (d) , 44.3 (d), 40.2 (d), 38.7 (t), 36.9 (d), 35.2 (d), 27.1 (s), 23.9 (c), 18.80 (c), 18.79 (c), 17.3 (c), 14.5 (c), 14.2 (c), 12.1 (c), 10.0 (c); HRMS (ESI): m/z caled para C48H54O8Na [M+Na]+ 781.3716, encontrada 781.3712.
Procedimiento general para la desprotección del éter tritilo en la posición 0-20. Preparación de forboll--12,13-diisobutirato(P-12.13-diiBu, S1), forblol--12-isobutirato-13-fenilacetato (P-12-iBu-13- PhAc-20T, S2), forblol--13-isobut¡rato-12-fenilacetato-20-tritilo (P-13-iBu-12-¡Bu, S3), forblol--12,13- difenilacetato (P-12,13-d¡PhAc, S4), forboll--12,13-diacetato (P-12,13-diAc, S5), forboll--13- isobutirato-12-tigliato (P-13-iBu-12-Tiq, S6), y de forboll--13-isobutirato (P-13-iBu, S7).
HCIÜ4 (0.01 M en MeOH, 1 mL, 0.01 mmol) se añadió a una solución del correspondiente forboll- (S1a, S3a S4a, S5a, S2b, S3b, S6b) (0.05 mmol) en MeOH (1 mL). Una vez finalizada la reacción, se añadió AcONa hasta pH= 7. El disolvente fue evaporado bajo presión reducida y el crudo obtenido fue purificado en columna de silica gel eluyendo con mezclas Hexano:AcOEt (50:50) obteniéndose los correspondientes diésteres de forblol- S1-S6 y P-13-iBu (S7)
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto forbol-12,13-diisobutirato (S1) (87% Rto.): Sólido blanco amorfo; [a]D 21 + 19.1 (c 2.2, CHCI3); IR (KBr) vmáx 3405, 2975, 2926, 2878, 1712, 1469, 1389, 1275, 1160, 1080, 978, 754 cm 1; RMN-1H (CD3OD, 500 MHz) δH (ppm): 7.54 (1H, s ancho), 5.62 (1 H, d, 5.6 Hz), 5.41(1 H, d, 10.2 Hz), 3.96 (1 H, d, 13.2 Hz), 3.91 (1 H, d, 13.2 Hz), 3.30 (1H,m), 3.16 (1 H, quint, 2.8 Hz), 2.56 (2H, m), 2,52 (1 H, m), 2.48 (1 H, d, 19.0 Hz), 2.23 ( 1 H, de, 10.2 y 6.8 Hz), 1.73 (3H, s ancho), 1.27 (3H, s), 1.22 (3H, s), 1 ,16 (12H, m), 1.10 (1 H, d, 5.6 Hz), 0,88 (3H, d, 6.6 Hz); RMN-13C (CD3OD, 125 MHz) δc (ppm): 210.3 (s), 180.7 (s), 178,5 (s), 160.5 (s), 142.8 (s), 134.6 (s), 129.3 (d), 79.8 (s), 78.1 (s), 74.7 (s), 68.0 (t), 66.8 (d), 57.3 (d), 44.3 (d), 40.0 (d), 38.5 (t), 37.3 (d), 35.5 (2C, d), 27.3 (s), 24.2 (c), 19.4 (c), 19.2(c), 19.0 (c), 18.9 (c), 17.5 (c), 14.8 (c), 10.2 (c); HRMS (ESI): m/z caled para C28H39O8 [M-H]", 503.2645; encontrada 503.2641.
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto forbol-12-isobutirato-13-fenilacetato (S2) (52% Rto.): Sólido blanco amorfo; [a]D 21 + 12.8 (c 0.4, CHCI3); IR (KBr) vmáx 3430, 2924, 2854, 1710, 1457, 1376, 787 cm 1; RMN-1H (CD3OD, 400 MHz) δH (ppm): 7.53 (1H, br s), 7.32-7.22 (5H, m), 5.58 (1 H, d, 5.7 Hz), 5.47 (1 H, d, 10.4 Hz), 3.94 (1 H, d, 13.2 Hz), 3.89 (1H, d, 13.2 Hz), 3.67 (2H, s), 3.26 (1 H, t, 5.7 Hz), 3.14 (1 H, quint, 3.0 Hz), 2.56 (1H, sept, 7.0 Hz), 2.52 (1H, d, 19.0 Hz), 2.46 (1 H, d, 19.0 Hz), 2.21 (1 H, dq, 10.4 y 6.4 Hz), 1.73 (3H, dd, 3.0, 1.3 Hz), 1.23 (3H, s), 1.16 (3H, d, 7.0 Hz), 1.15 ( 3H, d, 7.0 Hz) 1.04 (1 H, d, 5.7 Hz), 1.03 (3H, s), 0.88 (3H, d, 6.4 Hz); RMN-13C (CD3OD, 100 MHz) δc: 210.3
(s), 178.7 (s), 175.7 (s), 160.5 (d), 142.9 (s), 134.9 (s), 134.6 (s), 130.7 (2C, d), 129.5 (2C, d), 129.2 (d), 128.2 (d), 79.8 (s), 78.2 (d), 74.7 (s), 67.9 (t), 67.4 (s), 57.3 (d), 44.3 (d), 42.1
(t), 40.0 (d), 38.4 (t), 37.1 (d), 35.5 (d), 27.5 (s), 24.0 (q), 19.4 (q), 19.2 (q), 17.4 (q), 14.8 (q), 10.2 (q); HRMS (ESI): m/z caled para C32H39O8 [M-H]" 551.2645, encontrada 551.2631. Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto forbol-13-isobutirato-12-fenilacetato (S3) (75% Rto.): Sólido blanco amorfo; [a]D 21 + 10.0 (c 5.1 , CHCI3); IR (KBr) vmáx 3402, 2980, 2926, 2880, 1713, 1497, 1391, 1251 , 1161 , 988, 757 cm 1; RMN-1H (CD3OD, 400 MHz) δH (ppm): 7.52 (1H, dd, 2.6 y 1.4 Hz), 7,34-7,23 (5H, m), 5.58 (1 H, d, 5.7 Hz), 5.39 (1H, d, 10.4 Hz), 3.94 (1 H, d, 13.0 Hz), 3.89 (1H, d, 13.0 Hz), 3.65 (2H, s), 3.24 (1 H, t, 5.7 Hz), 3.13 (1H, quint, 2.6 Hz), 2.53 (1 H, sept, 7.0 Hz), 2.49 (2H, s), 2.17 (1 H, de, 10.4 y 6.5 Hz), 1.72 (3H, dd, 2.6 y 1.4 Hz), 1.12 (3H, d, 7,0 Hz), 1.11 (3H, d, 7,0 Hz), 1.03 (1 H, d, 5.7 Hz), 1.03 (3H, s), 1.07 (3H, s), 0.84 (3H, d, 6.5 Hz); RMN-13C (CD3OD, 125 MHz) δc (ppm): 210.2 (s), 180.7 (s), 173.4 (s), 160.5 (d), 142.8 (s), 135.8 (s), 134.5 (s), 130.2 (2C, d), 129.6 (2C, d), 129.2 (d), 128.1 (d), 79.8 (s), 78.8 (d), 74.7 (s), 67.9 (t), 66.7 (s), 57.2 (d), 44.2 (d), 42.5 (t), 40.0 (d), 37.2 (d), 35.5 (d), 27.3 (s), 24.0 (c), 19.0 (c), 18.9 (c), 17.1 (c), 14.7 (c), 10.2 (c); HRMS (ESI+): m/z caled para C^HsoOsNa [M+Na]+ 575.2621 , encontrada 575.2639.
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto forbol 12,13-difenilacetato (S4) (90%). Sólido blanco amorfo; [a]D 21 + 24.2 (c 7.0, CHCI3). IR (KBr) vmáx3415, 2924, 2854, 1710, 1628, 1455, 1330, 1076, 998, 751 cm 1. 1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δH : 7.51 (dd, J = 2.6, 1.4 Hz, 1 H), 7.34 - 7.21 (m, 10H), 5.54 (d, J= 5.6 Hz, 1H), 5.45 (d, J= 10.4 Hz, 1 H), 3.92 (d, J = 13.1 Hz, 1 H), 3.89 (d, J = 13.1 Hz, 1 H), 3.65 (s, 4H), 3.20 (t, J = 5.6 Hz, 1 H), 3.11 (quint, J = 2.6 Hz, 1 H), 2.47 (d, J = 19.0 Hz, 1 H), 2.44 (d, J = 19.0 Hz, 1 H), 2.14 (dq, J = 10.4, 6.6 Hz, 1 H), 1.72 (dd, J = 2.6, 1.4 Hz, 3H), 0.98 (d, J = 5.6 Hz, 1 H), 0.96 (s, 3H ), 0.88 (s, 3H), 0.84 (d, J = 6.6 Hz, 3H). 13C NMR (CD3OD, 100 MHz) δc: 210.3 (s), 175.7 (s), 173.5 (s), 160.5 (d), 142.8 (s), 135.8 (s), 134.8 (s), 134.6 (s), 130.7 (2C,d), 130.3 (2C,d), 129.6 (2C, d), 129.5 (2C, d), 129.2 (d), 128.2 (d), 128.1 (d), 79.8 (s), 78.9 (d), 74.7 (s), 67.9 (t), 67.3 (s), 57.3 (d), 44.2 (d), 42.5 (t), 42.2(f), 39.9 (d) , 38.4 (d), 37.1 (d), 27.5 (s), 23.8 (c), 17.0 (c), 14.7 (c), 10.2 (c); HRMS (ESI+): m/z caled para C36H40O8Na [M+Na]+ 623.2621 , encontrada 623.2616.
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto fbrbol-12,13-diacetato (S5) (99%): son consistentes con los descritos en la literatura (Szczepanski, C. V, Schairer, H.-U., Gschwendt, M. & Hecker, E. Zur Chemie des Phorbols, III. Mono- und Diacetate des Phorbols. Justus Liebigs Ann. Chem. 1967, 705, 199-210). Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto forbol-13-isobutirato-12-tigliato (S6) (79%): son consistentes con los descritos en la literatura, a) Marshall, G. T. & Kinghom, A. D. Short-chain phorbol ester constituents of croton oil. J. Am. Oil Chem. Soc. 1984, 61, 1220-1225. b) Zhang, X.-L, Wáng, L, Li, F, Yu, K. & Wáng, M.-K. Cytotoxic Phorbol Esters of Croton tiglium. J. Nat. Prod. 2013, 76, 858-864).
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto forbol-13-isobutirato (S7) (número de registro CAS: 1349561-94-9) (84% Rto.): Sólido blanco amorfo; [a]D 21 + 48.4 (c 2.0, CHCb); IR (KBr) vmáx 3414, 2924, 2854, 1638, 1491, 1329, 1291, 1159, 1015, 792 cm 1; RMN-1H (CD3OD, 400 MHz) δH (ppm): 7.56 (1 H, m), 5.59 (1H, d, 5.7 Hz), 3.95 (1 H, d, 13.0 Hz), 3.91 (1 H, d, 13.0 Hz), 3.86 (1 H, d, 10.2 Hz), 3.26 (1 H, t, 5.7 Hz), 3.12 (1 H, m), 2,62 (1H, sept, 7.0 Hz), 2.52 (1 H, d, 12.0 Hz), 2.45 (1H, d, 12.0 Hz), 2.02 (1 H, de, 10.2, 6.5 Hz), 1.74 (3H, m), 1.23 (3H, s), 1.22 (3H, s), 1 ,19 (3H, d, 7.0 Hz), 1.18 (3H, d, 7.0 Hz), 1.06 (3H, d, 6.5 Hz), 1.01 (1H, s, 5.7 Hz); RMN-13C (CD3OD, 100 MHz) δc (ppm): 210.5 (s), 181.6 (s), 161.0 (d), 142.5 (s), 134.4 (s), 129.9 (d), 79.7 (s), 77.6 (d), 74.8 (s), 69.0 (s), 68.1 (t), 57.7 (d), 46.2(d), 40.1 (d), 38.6 (t), 36.8 (d), 35.5 (d), 27.2 (s), 24.2 (c), 19.2 (c), 19.1 (c), 17.5 (c), 15.5 (c), 10.2 (c); HRMS (ESI+): m/z caled para C24H34O7Na [M+Na]+ 457.2202, encontrada 457.2200.
EJEMPLO 4. Obtención de los diésteres de 12-desoxi-16-hidroxiforblol- (N1-N4)
Los compuestos N1-N4 fueron obtenidos por aislamiento y purificación a partir del látex de Euphorbia resinífera colectada en Demnate, Beni MellaLKhenifera province (Marruecos), en noviembre de 2016.
La obtención de los productos se realizó a partir del extracto metanólico del látex de la planta que fue sometido a un fraccionamiento posterior mediante cromatografía en columna de gel de sílice controlando mediante cromatografía en capa fina, lo que condujo a la obtención de seis fracciones (FR1-FR6). La fracción FR4 fue fraccionada nuevamente mediante cromatografía en columna de gel de sílice obteniendo 4 sub-fracciones (FR4-1 a FR4-4) y esta última (FR4-4) fue purificada mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) lo que condujo a la obtención de 4 productos (N1-N4, Figura 2) que fueron identificados mediante técnicas espectroscópicas y espectrométricas. Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto 12-desoxi-16-hidroxiforboll--16- isobutirato-13-fenilacetato (DPPI, N1): Sólido blanco amorfo; [α]D24 +9.61 (c 0.08, CD3OD); IR (KBr) vmáx 3416, 1712, 1633, 1100 cm 1; RMN-1H (CD3OD) δH (ppm): 7.53 (1 H, m), 7.31- 7.23 (5H, m), 5.56 (1 H, d, 5.9 Hz), 4.05 (1 H, d, 11.4 Hz), 3.93 (1 H, d 12.9 Hz), 3.87 (1 H, d, 12.9Hz), 3.85 (1 H, d, 11.4 Hz), 3.63 (2H, s), 3.16 (1 H, t, 2.9 Hz), 3.08 (1 H, t, 5.7 Hz), 2.53 (1 H, sp, 7.0 Hz), 2.50 (1 H, d, 19.0 Hz), 2.42 (1 H, d, 19.0 Hz), 2.13 (1 H, dd 7.0, 14.8 Hz), 2.02 (1H, dt, 11 , 6.8 Hz), 1.73 (3H, dd, 3.0, 1.4 Hz), 1.57 (1 H, dd, 11.0, 14.8 Hz), 1.15 (3H, d 7.0 Hz), 1.14 (3H, d 7.0 Hz), 1.12 (1 H, d, 5.7 Hz), 1.13 (3H, s), 0.84 (3H, d, 6.6 Hz); RMN-13C (CD3OD) δc (ppm): ): 210.5 (s), 178.6 (s), 175.23 (s), 160.8 (d), 142.4 (s), 130.4 (d), 135.0 (s), 134.9 (s), 129.9 (d), 128.3 (d), 77.6 (s), 74.7 (s), 70.2 (t), 68.2 (t), 65.1 (s), 57.2 (d), 42.3 (d), 39.3 (d), 38.6 (t), 37.4 (d), 35.2 (d), 33.0 (t), 31.6 (c), 31.5 (d), 28.3 (s), 19.4 (c), 18.9 (c), 11.7 (c), 10.2 (c); HRMS (ESI+): m/z caled, para C32H4oO8Na [M + Na]+ 575.2621 , encontrada 575.2621.
Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto 12-desoxi-16-hidroxiforboll--16-tigliato- 13-fenilacetato (DPPT, N2): Sólido blanco amorfo; [a]D 24 + 18.52 (c0.14, CD3OD); IR (KBr) Vmáx 3416, 2923, 1705, 1269 cm 1; RMN-1H (CD3OD) δH (ppm): 7.53 (1H, bs), 7.32-7.19 (5H, m), 6.84 (1 , q, 6.8 z), 5.58 (1 H, d, 5.6 Hz), 4.14 (1 H, d, 11.4 Hz), 3.94 (1 H, d 12.9 Hz), 3.84 (1 H, d, 12.9Hz), 3.84 (1 H, d, 11.4 Hz), 3.62 (2H, s), 3.16 (1H, t, 2.7 Hz), 3.10 (1 H, t, 5.7 Hz), 2.51 (1 H, d, 19.0 Hz), 2.42 (1 H, d, 19.0 Hz), 2.14 (1 H, dd 7.0, 15.0 Hz), 2.04 (1 H, m), 1.74 (3H, d, 2.8 Hz), 1.57 (1 H, dd, 11.0, 15.0 Hz),1.82 (3H, s) 1.81 (3H, d, superpuesto con H3-4”) 1.16 (3H, d, 5.6 Hz), 1.14 (3H, s), 0.89 (3H, d, 6.6 Hz); RMN-13C (CD3OD) δc (ppm): 210.5 (s), 178.6 (s), 175.1 (s), 160.8 (d), 169.5 (s), 142.4 (s), 138.8 (d),
134.9 (s), 134.6 (s), 130.4 (d), 129.7 (s), 129.6 (d), 128.2 (d), 77.7 (s), 74.7 (s), 70.5 (t), 68.3 (t), 65.2 (s), 57.2 (d), 42.4 (d), 39.3 (d), 38.6 (t), 37.4 (d), 33.1 (t), 31.5 (c), 28.3 (s),
18.9 (c), 14.4 (c), 12.2 (c), 11.8 (c), 10.2 (c); HRMS (ESI+): m/z caled, para C32H4oO8Na [M + Na]+ 587.2621 , encontrada 587.2662.
Los datos físicos y espectroscópicos de los compuestos N3 y N4 son consistentes con los compuestos 12-desoxi-16-hidroxiforboll--13,16-difenilacetato (DP-13,16-diPhAc, N3) y 12- desoxi-16-hidroxiforboll--16-benzoato-13-fenilacetato (DP-13-PhAc-16-Bz, N4)
(Hergenhahn, M., Kusumoto, S. & Hecker, E. On the active principles of the spurge family (Euphorbiaceae). J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1984, 108, 98-109) EJEMPLO 5. Efecto de los compuestos de las estructuras P-12,13-diiBu (S1), P-12-iBu-13-PhAc
(S2), P-13-iBu-12-PhAc (S3) sobre la secreción de TGFa
Se ha comprobado el efecto de los compuestos P-12,13-diiBu (S1), P-12-iBu-13-PhAc (S2), P- 13-¡Bu-12-PhAc (S3) sobre la secreción de TGFa. Para ello se ha construido un cDNA que codifica una proteína recombinante en la que TGFa está flanqueado por la proteína roja fluorescente mCherry y por la proteína verde fluorescente EGFP en los extremos N- y C-terminal respectivamente.
Para ello, el cDNA que codifica la isoforma de la pro-TGFa humana (TGFA, secuencia de referencia del NCBI: NM_003236.4), que contiene el cDNA de mCherry entre los nucleótidos 126 y 127 del cDNA de TGFA fue clonado en el vector pEGFP-N1 para añadir el cDNA de la proteína verde fluorescente GFP al final del extremo 3'. La construcción fue diseñada en nuestro laboratorio y sintetizada por GeneCust (Boynes, Francia) para generar la construcción mCherry- TGFa-GFP que contiene el cDNA. Esta construcción se transfectó en células HEK293T como se explica a continuación. Las células HEK293T se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA, USA). Se cultivaron en medio DMEM a 37 °C y 5% de CO2 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL, USA), complementadas con suero bovino fetal (10%), 1 * GlutaMATM-l (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL, USA) y penicilina/estreptomicina (1%). Para la transfección, las células se pasaron, se sembraron y se dejaron adherir durante 24 h. La transfección se realizó mediante lipofectamina 2000 (Invitrogen; Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después, se cambió el medio para eliminar la lipofectamina. Tras una incubación (Thermo Fisher Scientific) libre de suero que contiene 1% P/S, 0.25% de albúmina de suero bovino (BSA), y 1 * GlutaMAXTM-L Posteriormente se realizaron los experimentos de microscopía de fluorescencia en vivo y en tiempo real. Se realizaron controles para aseguramos de que la ausencia de suero durante 3.5 h no afectaba a la viabilidad de las células. Los porcentajes de células viables transfectadas con o sin suero fueron 95.12 ± 0.73 vs 94.97 ± 0.5 respectivamente; lo que indica que la deprivación de suero durante 3.5 h no ejercía un efecto sobre la viabilidad celular. Seguidamente, las células HEK293T transfectadas se colocaron en placas de 35 mm de alto (Ibidi, Munich, Alemania) y se trataron con EOF2 o inhibidores, como se describe en los resultados y en los pies de figuras. Los ensayos de microscopía en tiempo real se realizaron con un microscopio invertido Zeiss Axio Observer.ZI , utilizando un objetivo con una lente aérea plan- apochromat 40x/0,95 Korr M27. Se obtuvieron imágenes de las células transfectadas cada 1 min. Las imágenes capturadas se procesaron con el software ZEN lite y la eficiencia de la escisión de TGFa se determinó analizando la intensidad de la fluorescencia mCherry/GFP en todas las áreas celulares. Las proporciones de mCherry/GFP se calcularon y normalizaron con respecto a la media medida antes de la estimulación con los compuestos indicados utilizando el software Microsoft Excel. Las imágenes ratiométricas se construyeron utilizando el software Imaged, después de la sustracción del fondo, la imagen mCherry/GFP se calculó dividiendo el canal mCherry por el canal GFP. Para cada pixel, se utiliza una escala de pseudocolores para codificar la tasa de fluorescencia mCherry/GFP.
En la figura 1 se puede ver un esquema de la construcción realizada y en el panel derecho, se ha representado la tasa de fluorescencia mCherry/GFP en cultivos mediante una escala de grises de células HEK293T a las que se ha añadido suero salino (0) o los compuestos S1 , S2 y S3 tal como se indica en la figura. Puede verse como en presencia de los compuestos P-12,13-diiBu (S1), P-12-iBu-13-PhAc (S2) y P-13-iBu-12-PhAc (S3) la tasa de fluorescencia mCherry/GFP disminuye indicando que la proteína m-Cherry está siendo liberada al medio extracelular junto con el segmento soluble de TGFa.
EJEMPLO 6. El efécto sobre la secreción de TGFa de otros compuestos estructuralmente relacionados con los del ejemplo 5.
Se analizó el efecto de otros compuestos sobre la secreción de TGFa. En concreto, se adicionaron, los compuestos P-12,13-diPhAc (S4), P-12,13-diAc (S5), P-13-iBu-12-Tig (S6), DPPI (N1), DPPT (N2), y DP-13,16-diPhAc (N3) a células transfectadas con la construcción arriba indicada percibiéndose un cambio en la tasa mCherry/GFP. A pesar de que el efecto de todos ellos era algo menor que el de los descritos en el ejemplo 5 en todos los casos se observaba una reducción de la tasa mCherry/GFP indicando que en todos los casos había una facilitación de la secreción de TGFa cuando se administraba el compuesto a los cultivos (ver Figura 2).
EJEMPLO 7. Efecto de forblol- y de determinados compuestos relacionados, sin grupo éster en C- 12, sobre la secreción de TGFa.
Utilizando el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 5 o 6, se analizó la capacidad del forboll-, forboll- 13-isobutirato (S7) y DP-13PhAc-16-Bz (N4) (ver estructuras en la figura 3.1).
Como se puede observar en la figura 3.2 en presencia de forboll- o de forboll--13-isobutirato (S7) o DP-13PhAc-16-Bz (N4), la tasa de fluorescencia mCherry/GFP en células HEK293T transfectadas con la construcción mChery- TGFa -EGFP, no se ve modificada, indicando que esta modificación del fórbol resulta en un compuesto que no ejerce ningún efecto sobre la escisión de TGFa.
Por lo tanto, el grupo éster en C-12 resulta fundamental para inducir la secreción de TGFa.
EJEMPLO 8. Efecto de P-12,13-diiBu (S1) sobre la proliferación de precursores neurales en cultivo.
Se ha investigado la actividad biológica del compuesto P-12,13-diiBu (S1) sobre la proliferación células madre neurales extraídas de la zona subventricular de ratones postnatales de 7 días.
Para ello las paredes laterales de los ventrículos laterales de la zona subventricular de ratones posnatales de 7 días (P7), fueron extraídas y disociadas enzimáticamente en líquido cefalorraquídeo (Ca2 bajo Mg2 alto: 5 mM KCI, 124 mM NaCI, 3.2 mM MgCI2, 100 pM CaCI2, 26 mM NaHCO3, and 10 mM glucosa) suplementado con 1 mg/ml de tripsina y 0.2 mg/ml de ácido quinurénico calentado previamente a 37°C durante 15 minutos. Se incubó a 37° en estufa 13 minutos. El tejido fue centrifugado a 9.000 r.p.m 5 minutos y resuspendido en LCR normal (5 mM KCI, 124 mM NaCI, 1.3 mM MgCI2, 2 mM CaCI2, 26 mM NaHCO3, y 10 mM glucosa). Fue incubado en estufa 5 minutos y centrifugado en las mismas condiciones. Luego, las células fueron resuspendidas en Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F-12 (1:1) suplementado con 0.7 mg/ml de ovomucoide y disgregadas mecánicamente con una pipeta Pasteur con el diámetro reducido a la mitad. Después fueron centrifugadas nuevamente y resuspendidas en 6 mi de medio definido de neuroesferas (45ml de (DMEM)/F-12, 900 pL de B27, 2mM L-glutamina y 2pg/ml de gentamicina) suplementado con 6 pL de EGF 20ng/ml y bFGF 10ng/ml, y mantenido a 37° en atmósfera con 5% CO2 Después de 1-2 días, los agregados celulares que se forman son lo que llamamos neuroesferas. Los subcultivos fueron pasados cada 3-4 días por centrifugación de neuroesferas y disociación mecánica de las células en 1 mi de medio definido de neuroesferas; después la suspensión de células fue cultivada en nuevos flaks con medio fresco para obtener nuevas neuroesferas. Los experimentos se llevaron a cabo entre los pases 3 y 5.
Una vez obtenidas las neuroesferas se analizó el efecto de P-12,13-diiBu (S1) sobre las células madre neurales a distintas concentraciones. Para ello las neuroesferas fueron centrifugadas y las células fueron resuspendidas y disgregadas en medio definido de neuroesferas y sembradas 20 células /pL a la que se le añadió el factor de crecimiento bFGF (10 ng/mL). P-12,13-diiBu se añadió al mismo tiempo poniendo en cada pocilio una concentración diferente. Se analizaron las diferentes concentraciones por triplicado. Los experimentos se llevaron a cabo de modo que la persona que toma las imágenes y realiza la cuantificación no conoce las condiciones de cada uno de los cultivos. El número de nuevas neuroesferas formadas fue contada 72h después en el microscopio invertido y de contraste de fase Olympus IX70. Para medir el área de las neuroesferas se obtuvieron imágenes de 50 neuroesferas por pocilio y se analizaron empleando el sistema de análisis Image J.
Se observó cómo el área de las neuroesferas aumentaba en los cultivos tratados con P-12,13- diiBu (S1) de manera dosis-dependiente hasta la concentración de 100 nM, apoyando la hipótesis de que el incremento en el tamaño de las neuroesferas se debía a una estimulación de la proliferación celular (Figura 6). No se observó muerte celular inducida por P-12, 13-diiBu.
EJEMPLO 9. Efecto de P-12,13-diAc (S5) sobre la proliferación de precursores neurales en cultivo
De igual manera, en ensayos similares se analizó el efecto del P-12,13-diAc (S5) (con capacidad para inducir la secreción de TGFa) sobre la proliferación de cultivos de células madre neurales utilizando la técnica descrita en el ejemplo anterior. Se observó cómo el área de las neuroesferas aumentaba en los cultivos tratados con P-12,13-diAc (S5) a la concentración de 5 pM. El incremento en el tamaño de las neuroesferas apoyando la hipótesis de que el incremento en el tamaño de las neuroesferas se debía a una estimulación de la proliferación celular (Figura 5). No se observó muerte celular inducida por P-12,13-diAc (S5). El efecto proliferativo de este compuesto no es muy potente, y se relaciona con la baja estimulación de la secreción de TGFa.
EJEMPLO 10. Efecto de DPPI (N1) sobre la proliferación de precursores neurales en cultivo
De igual manera, en ensayos similares se analizó el efecto del DPPI (N1) (con capacidad para inducir la secreción de TGFa) sobre la proliferación de cultivos de células madre neurales utilizando la técnica descrita en el ejemplo anterior. Se observó cómo el área de las neuroesferas aumentaba en los cultivos tratados con DPPI (N1) de forma dependiente de dosis desde 10 nM hasta 5 pM (Figura 6). El incremento en el tamaño de las neuroesferas apoyando la hipótesis de que el incremento en el tamaño de las neuroesferas se debía a una estimulación de la proliferación celular. No se observó muerte celular inducida por DPPI (N1). El efecto proliferative de este compuesto es muy potente, y se relaciona con la estimulación de la secreción de TGFa.
EJEMPLO 11. Efecto de forblol- sobre la proliferación de precursores neurales en cultivo. De igual manera, en ensayos similares se analizó el efecto del forboll- (sin capacidad para inducir la secreción de TGFa) sobre la proliferación de cultivos de células madre neurales utilizando la técnica descrita en el ejemplo anterior. Podemos observar como en presencia de diferentes concentraciones de forboll-, el área y el número de las neuroesferas no varia, indicando que el forboll- no induce tampoco la proliferación de las células madre neurales en cultivo (Figura 7).
EJEMPLO 12: La administración por vía intranasal del compuesto P-12,13-diAc (S5) durante 7 días promueve la neurogénesis en el cerebro de ratón adulto
Para determinar si este tipo de compuestos ejercían un efecto neurogénico in vivo en el cerebro de ratón adulto, se administró una dosis diaria de 12 pL de una solución 5 pM del compuesto S5 durante 7 días por vía intranasal, a ratones de dos meses de edad. Los ratones recibieron inyecciones del análogo de timidina BrdU cada dos días a lo largo del tratamiento. La incorporación de BrdU a las células permite determinar aquellas que han proliferado durante la duración del tratamiento. Al cabo de los 7 días el cerebro se perfundió, y se obtuvieron secciones de 30 pM de grosor. Se detectaron mediante inmunohistoquímica los marcadores BrdU (células prolfierantes) y el marcador de neuroblastos doblecortina (DCX) en las secciones correspondientes a la zona subventricular. Como pude verse en la figura 8, el tratamiento induce un aumento en el numero de células proliferantes y en el número de progenitores neuronales (neuroblastos DCX+). Estos resultados indican que el compuesto P-12,13-diAc (S5), que previamente había estimulado la secreción de TGFa y la proliferación in vitro, también facilitan la neurogénesis en el cerebro de ratón cuando es administrado por vía intranasal.
EJEMPLO 13: La administración por vía intranasal del compuesto P-12,13-diiBu (S1) durante 7 días promueve la neurogénesis en el cerebro de ratón adulto
Para determinar si este tipo de compuestos ejercían un efecto neurogénico in vivo en el cerebro de ratón adulto, se administró una dosis diaria de 12 pL de una solución 10 nM del compuesto S1 durante 7 días por vía intranasal, a ratones de dos meses de edad. Los ratones recibieron inyecciones del análogo de timidina BrdU cada dos días a lo largo del tratamiento. La incorporación de BrdU a las células permite determinar aquellas que han proliferado durante la duración del tratamiento. Al cabo de los 7 días el cerebro se perfundió, y se obtuvieron secciones de 30 pM de grosor. Se detectaron mediante inmunohistoquímica los marcadores BrdU (células prolfierantes) y el marcador de neuroblastos doblecortina (DCX) en las secciones correspondientes a la zona subventricular. Como pude verse en la figura 9, el tratamiento induce un aumento en el numero de células proliferantes y en el número de progenitores neuronales (neuroblastos DCX+). Estos resultados indican que el compuesto P-12,13-diiBu (S1), que previamente había estimulado la secreción de TGFα y la proliferación in vitro, también facilitan la neurogénesis en el cerebro de ratón cuando es administrado por vía intranasal.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Composición que comprende un compuesto de formula I o cualquier sal o isómero del mismo:
Formula (I)
Figure imgf000039_0001
donde R1, R2 y R3 se seleccionan, de manera independiente, de la lista arriba indicada.
2. Composición que comprende un compuesto de formula II o cualquier sal del mismo:
Formula (II)
Figure imgf000040_0001
donde R1, R2 y R3 se seleccionan, de manera independiente, de la lista arriba indicada.
3. La composición según la reivindicación 1 o 2, donde el compuesto es un compuesto de formula I seleccionado de cualquiera de los siguientes: a. R1= R3— H R2—CH3; b. R1=R3=H R2=C(CH3)=CHCH3; c. R1=R3=H R2=CH(CH3)2; d. R1=R3=H R2=CH2Ph; e. R1= OCOCH3 R2=CH3 R3=H; f. R1=OCOCH(CH3)2 R2=CH(CH3)2 R3=H; g. R1=OCOCH2Ph R2=CH2Ph R3=H; h. R1=OCOCH2Ph R2=CH(CH3)2 R3=H; R1= OCOC(CH3)=CHCH3 R2= CH(CH3)2 R3=H; j R1= OCOCH(CH3)2 R2=CH2Ph R3=H; k. R1=H R2=CH2Ph R3=OCOCH2Ph;
I. R1=H R2=CH2Ph R3=OCOC(CH3)=CHCH3; or m. R1=H R2=CH2Ph R3= OCOCH(CH3)2
4. La composición según la reivindicación 1 o 2, donde el compuesto es un compuesto de formula I seleccionado de cualquiera de los siguientes: a. R1= OCOCH3 R2=CH3 R3=H; b. R1=OCOCH(CH3)2 R2=CH(CH3)2 R3=H; c. R1=OCOCH2Ph R2=CH2Ph R3=H; d. R1=OCOCH2Ph R2=CH(CH3)2 R3=H; e. R1= OCOC(CH3)=CHCH3 R2= CH(CH3)2 R3=H; f. R1= OCOCH(CH3)2 R2=CH2Ph R3=H; g. R1=H R2=CH2Ph R3=OCOCH2Ph; h. R1=H R2=CH2Ph R3=OCOC(CH3)=CHCH3; or R1=H R2=CH2Ph R3= OCOCH(CH3)2
5. La composición de acuerdo a la reivindicación 2, donde el compuesto consiste en forboll-- 12,13-diisobutirato de formula:
Figure imgf000041_0001
o cualquier sal del mismo.
6. La composición de acuerdo a la reivindicación 2, donde el compuesto consiste en forboll-- 12-isobutirato-13-fénilacetato de formula:
Figure imgf000042_0001
o cualquier sal del mismo.
7. La composición de acuerdo a la reivindicación 2, donde el compuesto consiste en forboll-- 13-isobutirato-12-fénilacetato de formula:
Figure imgf000042_0002
o cualquier sal del mismo.
8. Uso in vitro de las composiciones según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para favorecer la proliferación de precursores neurales o células madre neurales en cultivo.
9. Medio de cultivo adecuado para estimular la proliferación de los precursores neurales en ausencia de EGF que comprende al menos un compuesto tal y como se definen estos en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y opcionalmente el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF).
10. Procedimiento para la proliferación de células madre neurales o precursores neurales in vitro caracterizado por que comprende poner en contacto células madre neurales o precursores neurales con: a. una solución o disolución que comprenda los compuestos definidos en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y/o con una sal de los mismos, y opcionalmente el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF); o b. con el medio de cultivo según la reivindicación 9; durante un tiempo suficiente para la proliferación efectiva de las células madre neurales o precursores neurales.
11 . La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en terapia.
12. Composición farmacéutica que comprende un compuesto tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicha composición farmacéutica opcionalmente comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
13. La composición según la reivindicación 12, donde dicha composición es adecuada para su administración en el sistema nervioso central.
14. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de enférmedades o lesiones que cursen con perdida neuronal.
15. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de enférmedades o lesiones que cursen con perdida neuronal seleccionadas del grupo que consiste en: isquemia cerebral focalizada, traumatismo craneoencefálico con daño neuronal, Parkinson, enfermedad de Alzheimer, epilepsia y esclerosis lateral amiotrófica.
16. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 15, donde dicha composición se administra en el sistema nervioso central, preferiblemente via intranasal.
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