WO2022129663A1 - Nuevo biomaterial para ingeniería tisular - Google Patents

Nuevo biomaterial para ingeniería tisular Download PDF

Info

Publication number
WO2022129663A1
WO2022129663A1 PCT/ES2021/070889 ES2021070889W WO2022129663A1 WO 2022129663 A1 WO2022129663 A1 WO 2022129663A1 ES 2021070889 W ES2021070889 W ES 2021070889W WO 2022129663 A1 WO2022129663 A1 WO 2022129663A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
tissue
ossicle
ossicles
cells
Prior art date
Application number
PCT/ES2021/070889
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Miguel Alaminos Mingorance
Ingrid Johanna GARZÓN BELLO
Fernando CAMPOS SÁNCHEZ
Jesús CHATO ASTRAIN
Cristina BLANCO ELICES
David SÁNCHEZ PORRAS
Roke Iñaki ORUEZABAL GUIJARRO
Ricardo FERNÁNDEZ VALADÉS
Original Assignee
Universidad De Granada
Servicio Andaluz De Salud
Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad De Granada, Servicio Andaluz De Salud, Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud filed Critical Universidad De Granada
Publication of WO2022129663A1 publication Critical patent/WO2022129663A1/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/616—Echinodermata, e.g. starfish, sea cucumbers or sea urchins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease

Definitions

  • the present invention is within the field of biomedicine and tissue engineering. Specifically, it refers to a new biomaterial and an in vitro method of preparing it. It also refers to its uses in regenerative medicine.
  • the holothuria is an animal belonging to the echinoderm phylum, class Holothuroidea and, as such, has numerous calcified elements immersed in its external tissues, especially in the skin ( Figure 1).
  • sea cucumbers have microstructures called spicules, ossicles, dermal ossicles, sclerites or calcareous corpuscles that are independent of each other and allow the animal great freedom of movement in extreme conditions. relaxed, and a great resistance when the tissues contract and the ossicles approach each other.
  • the morphology of these ossicles is specific to each holoturia species and, in fact, is used to identify the different species existing in nature (Figure 2).
  • Figure 2 Regarding its composition, it is about elements constituted fundamentally by calcium carbonate mineralized as calcite, and it can contain 5-13% of magnesium carbonate in ionic substitution.
  • Each ossicle is synthesized by one or several cells of the animal, which adhere intimately to the surface of the ossicle. For this reason, the surface and size of the ossicles is potentially highly biocompatible, which supports its clinical use as an inducing agent of bone regeneration.
  • FIG. 1 Histological images of different tissues of Holothur ⁇ a sanctori stained with hematoxylin and eosin in which abundant ossicles can be seen inside the soft tissue (some ossicles are marked with arrows).
  • FIG. 1 Ossicles of different holothurian species analyzed by light microscopy.
  • A Rook-type ossicles.
  • B Smooth buttons and rough buttons.
  • C Different types of ossicles.
  • FIG. 3 Artificial fibhna-agarose tissues with dermal ossicles inside and human fibroblasts. Above: two images of hematoxylin-eosin stained non-decalcified artificial tissue showing the particles at the base of fibrin agarose (FA). Bottom: artificial tissues decalcified for histological processing and stained with hematoxylin-eosin in which the morphology is observed. of the cells (arrows) and the empty spaces in which the particles were lodged before decalcification. The bottom right image shows a tubularized artificial tissue.
  • FIG. 4 Histological analysis of the artificial tubularized fiber-agarose tissues implanted in nude mice.
  • A fibhna-agarose without ossicles
  • B fibhna-agarose with 0.25% ossicles
  • C fibhna-agarose with 0.5% ossicles
  • D fibhna-agarose with 1% ossicles
  • E fibhna-agarose with 2% ossicles
  • F fibhna-agarose with 3% ossicles.
  • Figure 5 In vivo functionality assays. On the left, the rabbit tibia is shown in which 4 defects have been made, each one being treated with a different product. On the right, the result is shown 60 days after the intervention.
  • the authors of the present invention propose to use a biomaterial that is highly biocompatible and that presents better results in terms of bone regeneration than other currently available materials.
  • its natural origin, from highly abundant fishery products in nature, gives it a potential benefit as an enhancer of the development of local fishing communities.
  • a first aspect of the invention relates to echinoderm ossicles, hereinafter ossicles of the invention, for use as a medicine or, alternatively, for use in medicine.
  • the authors of the present invention have extracted and purified the ossicles from the skin of various genera of sea cucumbers belonging to the genus Holothuria (fundamentally H. tubulosa, H. helleri and H. san Diego). Therefore, more preferably the ossicles are dermal ossicles from organisms of the genus Holothuria.
  • the endoskeleton of echinoderms is composed of calcium carbonate ossicles found in a dermis derived from the mesoderm and located below the epidermis. Beneath the dermis layer are muscle layers and the peritoneum of the coelom.
  • the ossicles that make up the skeleton are calcite with small amounts of magnesium carbonate. They usually have spines (fixed or mobile) and also projections (such as tubercles or granules). In holothurians, the ossicles are very small and these animals have very well developed muscular layers.
  • holothurians or holothuroidea commonly known as cucumbers, cucumbers, sea cairns, polloburro or sea carajos, are a class of the Echinodermata phylum that includes animals with an elongated and soft vermiform body that live in the bottoms of the seas around the world. world.
  • organisms of the Phylum Echinodermata, or echinoderms are understood to mean those cellular organisms that belong to the superkingdom Eukaryota, ciado Opisthokonta, Kingdom Metazoa, ciado Eumetazoa, ciado Bilateria, ciado Deuterostomia.
  • Echinoderms comprise several classes: Asteroidea (starfish), Ophiuroidea (brittle stars), Echinoidea (sea urchins), Crinoidea (sea lilies or commats), Concentricycloidea (sea daisies), and Holoturioidea (holothurians).
  • the organisms of the genus Holothur ⁇ a belong to the superkingdom Eukariota, ciate Opisthokonta, Kingdom Metazoa, ciate Eumetazoa, ciate Bilateria, ciate Deuterostomia, Phylum Echinodermata, Superclass Echinozoa, Class Holothuroidea, Order Aspidochirotida, Family Holothuriidae
  • the type species of the genus is Holothuria physalis Linnaeus 1758
  • Holothuriidae also refers to a family of organisms having a nucleotide sequence homologous to the region corresponding to the cytochrome oxidase I gene of mitochondrial DNA with at least 70% identity to SEQ ID NO. 1, and more preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity to SEQ ID NO: 1. More preferably, the Homologous sequence of the region corresponding to the cytochrome oxidase I gene of mitochondrial DNA has 100% identity with SEQ ID NO: 1.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides between two nucleotide sequences when compared. Sequence comparison methods are known in the art, and include, but are not limited to, BLASTP, BLASTN, and FASTA (S.F. Altschul etal., "Basic Local Alignment Search Tool", J. Mol Biol. 1990 , 215, 403-410).
  • homologous nucleotide sequence refers to a sequence that is equivalent to the fragment of the region corresponding to the cytochrome oxidase I gene of the mitochondrial DNA of sequence SEQ ID NO: 1 of Holothuria sp, preferably Tubular holothuria.
  • sequence that is equivalent means a nucleotide sequence that is within the cytochrome b or equivalent region in that particular species of Holothuria, and performs the same function. The skilled person is able to identify these equivalent regions with routine protocols.
  • % identity refers to the percentage (%) of identity between two or more nucleotide sequences or amino acids. % Identity is a count of the number of positions along the length of the alignment of two sequences where all of the nucleotides or amino acids at that position are identical. The % identity is calculated based on homologous sequences of the same length.
  • echinoderm ossicles can be used in the treatment of patients with severe bone injuries that require the implantation of materials that enhance bone regeneration.
  • another aspect of the invention relates to echinoderm ossicles to partially or completely increase, restore or replace the functional activity of a diseased or damaged tissue or organ.
  • the diseased or damaged tissue is bone tissue.
  • the ossicles are dermal ossicles from organisms of the genus Holothuria.
  • drug refers to any substance used for the prevention, diagnosis, alleviation, treatment or cure of diseases in man and animals.
  • composition of the invention comprising the ossicles of the invention. More preferably the ossicles are dermal ossicles from organisms of the genus Holothuria.
  • compositions of the invention may comprise other components useful for the medical purpose of the invention, mainly for tissue regeneration. Therefore, in another preferred embodiment, the composition of the invention also comprises fibrin and agarose. In another even more preferred embodiment, the composition of the invention further comprises a cell.
  • composition of the invention may therefore comprise one or more cells, giving rise to an artificial tissue. Therefore, another aspect of the invention refers to an artificial tissue, hereinafter artificial tissue of the invention, comprising: a) the biomaterial or the composition of the invention, and b) at least one cell.
  • the cell is a human cell.
  • the cell is selected from: human hyaline, elastic or fibrous cartilage chondrocytes, liver cells, epithelial cells (for example, keratinocytes), fibroblasts or vascular cells, among others, or any combination thereof.
  • the biomaterial of the invention can be used to totally or partially repair or replace bone that does not solidify, or that forms a pseudarthrosis (bone graft for regeneration of lost bone tissue, or as a bone substitute). ).
  • Bone repair or replacement as a result of injury or fracture closely resembles the normal osteogenesis process of the skeleton, although it differs in some respects such as inflammation and increased mechanical forces in adults. It can be divided into sequential stages involving various cell types and growth factors:
  • hematoma proinflammatory cascade with release of cytokines (mainly IL-1, IL-6 and TNF-a).
  • BMP bone morphogenic proteins
  • the osteoprogenitor cells differentiate into osteoblasts to regenerate the bone. If it is unstable, it differentiates into chondrocytes to form a layer of collagen that acts as a bridge between the ends of the fracture, thus constituting what is known as a soft callus; it is then calcified to form a bony callus and subsequently remodeled to form lamellar bone.
  • Different cell types participate in this repair process in a coordinated manner (osteoprogenitor cells, fibroblasts, macrophages, chondroblasts, osteoblasts, osteoclasts).
  • the cell and/or the cell population is selected from the list consisting of: fibroblasts, osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, chondroblasts, chondrocytes, mesenchymal stem cells, or any combination thereof.
  • the cell is a stem cell. More preferably, the stem cell is selected from: mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, embryonic stem cells, induced pluhpotent stem cells, adult stem cells, or combinations thereof. Even more preferably, it is a mesenchymal stem cell. More preferably, the mesenchymal stem cell is obtained from bone marrow, adipose tissue, liver, spleen, testes, menstrual blood, amniotic fluid, pancreas, periosteum, synovial membrane, skeletal muscle, dermis, pericytes, trabecular bone, umbilical cord, lung, dental pulp and peripheral blood.
  • mesenchymal stem cells is obtained from bone marrow, adipose tissue, liver, spleen, testes, menstrual blood, amniotic fluid, pancreas, periosteum, synovial membrane, skeletal muscle, dermis, pericytes, trabecular bone,
  • the cell of any aspect of the invention can be genetically modified by any conventional method including, by way of illustration, without limitation, transgenesis processes, deletions or insertions in its genome that modify the expression of genes that are important for their basic properties (proliferation, migration, differentiation, etc.), or by inserting nucleotide sequences that encode proteins of interest, such as proteins with therapeutic properties. Therefore, in another preferred embodiment, the cell of any aspect of the invention has been genetically modified.
  • the progeny of a single clonal cell can be expanded by multiple passages without apparently suffering from any chromosomal abnormality, or loss of growth and differentiation properties.
  • cells of any aspect of the invention may be clonally expanded using any method suitable for cloning cell populations.
  • a proliferating population of cells can be harvested physically and plated on a separate plate (or in the wells of a "multi-well” plate).
  • cells can be subcloned into a "multi-well” plate in a statistical ratio to facilitate placing a single cell in each well (eg, from about 0.1 to about one cell/well or even approximately 0.25 to 0.5 cells/well, such as 0.5 cells/well).
  • Cells can, of course, be cloned at low density (eg, into a Peth dish or other suitable substrate) and isolated from other cells using devices such as cloning rings.
  • the production of a clonal population can be expanded in any suitable culture medium.
  • the isolated cells can be cultured to a suitable point where their developmental phenotype can be assessed.
  • Another aspect of the invention relates to a population of isolated cells, hereinafter a population of cells of the invention, comprising at least one cell of any aspect of the invention, preferably an adult cell.
  • the cell population of the invention comprises at least 20%, preferably 40% and even more preferably 50%, 60%, 80%, 90%, 95% or 99% of cells of the invention.
  • the cell population of the invention comprises at least 20%, preferably 40% and even more preferably 50%, 60%, 80%, 90%, 95% or 99% of cells of the invention.
  • it is a cell population.
  • the cell of the invention may be of autologous, allogeneic or xenogeneic origin. Preferably, they are of autologous origin.
  • adult stem cell means that the stem cell is isolated from a tissue or organ of a person or animal in a state of growth after the embryonic state.
  • the stem cells of the invention have been isolated in a postnatal state.
  • they have been isolated from a mammal, and more preferably from a human, including neonates, juveniles, adolescents, and adults.
  • chondrocyte used in the present invention refers to a cell type present in cartilage, responsible for the production and maintenance of the cartilaginous matrix, which mainly comprises collagen and proteoglycans.
  • the organization of this cell type in cartilage differs depending on the type of cartilage and the tissue where it is found.
  • mesenchymal stem cells of mesodermal origin
  • differentiate towards the osteochondrogenic lineage in reference to bone or cartilage.
  • These undifferentiated mesenchymal stem cells proliferate and accumulate in a dense assembly of chondrogenic cells (cartilage) in the chondrification center.
  • chondrogenic cells differentiate into chondroblasts capable of synthesizing the extracellular matrix of cartilage, which comprises proteoglycans, low osmotic potential glycosaminoglycans, and fibers.
  • the chondroblasts are then confined to a small space or lacuna that is no longer in contact with the newly created matrix and contains extracellular fluid.
  • the chondroblast at this stage is the chondrocyte, which is generally inactive but can still secrete and degrade matrix depending on conditions.
  • osteocyte used in the present invention refers to a cell type formed from osteoblast differentiation, which in turn derives from osteoprogenitor cells.
  • the osteocyte together with the osteoclast, constitutes the cellular element of bone tissue.
  • the osteocyte is characterized by a slightly elongated and basophilic cytoplasm, with an enormous number of cytoplasmic extensions, a rough endoplasmic reticulum and an underdeveloped Golgi apparatus, presenting small lipid droplets and small amounts of glycogen. This cell type has the ability to secrete or reabsorb the surrounding bone matrix.
  • osteoblasts are derived from osteoblasts that become trapped in matrix lacunae.
  • osteoclast refers to those cells responsible for resorption of the bone matrix. They are large polynuclear cells that are located on bone surfaces firmly associated with the bone matrix. Osteoclasts are formed by the fusion of various mononuclear cells derived from a blood stem cell in the bone marrow, displaying many properties of macrophages. Osteoclasts are characterized by having a "wrinkled” portion of their membrane, brush-shaped, surrounded by a cytoplasm free of organelles, called “clear zone” with which it adheres to the surface of the bone through integhnas, specialized bone receptors.
  • the resorption process begins when the cell's Golgi apparatus excretes lysosomes with enzymes capable of producing an acidic microenvironment below the wrinkled membrane as a consequence of proton transport by the ATP-dependent proton pump, Na+/H+ exchange. and carbonic anhydrase.
  • the osteoclast lysosomal enzymes involved in this process are cysteine proteases such as cathepsin and, above all, tartrate-resistant acid phosphatase (the latter is used as a marker of the osteoclastic phenotype).
  • the lysosomal enzymes are only released in the clear area near the wrinkled border, producing in this area the degradation reactions of the matrix that must occur before the acid medium dissolves the mineral salts of the bone.
  • Osteoclastic resorption is dependent on a number of external regulatory factors such as parathyroid hormone, 1,25-dihydroxyvitamin D3, and calcitonin. Other factors that affect the functionality of osteoclasts are glucocorticoids and prostaglandins.
  • proliferation or “expansion” in the context of the present invention is used to refer to an increase in cell number, resulting from cell division.
  • subject includes any animal, in particular, vertebrate animals, preferably mammals, such as mice, rats, horses, pigs, rabbits, cats, sheep, dogs, cows, humans, etc.
  • mammal refers to any organism of the superkingdom Eukaryota, kingdom Metazoa, Phylum Chordata, class Mammalia. Therefore, the cells used in the artificial tissue of the invention can belong to any animal, preferably a mammal. In another even more preferred embodiment, the mammal is human.
  • composition of the invention or the artificial tissue of the invention for its use in medicine, or alternatively, for its use as a medicine.
  • Another aspect of the invention refers to the composition of the invention or the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged tissue or organ. More preferably, the diseased or damaged tissue is bone tissue.
  • the composition or artificial tissue of the invention further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition of the invention also comprises at least one active ingredient or therapeutic agent.
  • Said therapeutic agent is preferably selected from an analgesic agent (in the treatment of inflammation and pain) or an anti-infective agent (in the prevention of infection). Even more preferably it comprises pharmaceutically acceptable excipients.
  • therapeutic agents useful according to the invention include the following therapeutic categories: analgesics, such as nonsteroidal anti-inflammatory drugs, opiate agonists, and salicylates; anti-infective agents, such as anthelmintics, antianaerobics, antibiotics, aminoglycoside antibiotics, antifungal antibiotics, cephalosporins, macrolide antibiotics, various beta-lactam antibiotics, penicillins, quinolone antibiotics, sulfonamide antibiotics, tetracycline antibiotics, antimycobacterials, antituberculous antimycobacterials, antiprotozoals, antiprotozoals antimalarials, antiviral agents, anti-retroviral agents, scabicides, anti-inflammatory agents, anti-inflammatory corticosteroids, topical antipruritic/local anesthetics, anti-infectives, topical anti-infective antifungals, topical anti-infective antivirals, electrolyte and
  • the therapeutic agents useful according to the previous categories include: (1) analgesics in general, such as lidocaine or its derivatives, and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) analgesics, including diclofenac, ibuprofen, ketoprofen, naproxen and, ( 2) opioid agonist analgesics, such as codeine, fentanyl, hydromorphone, and morphine, (3) salicylate analgesics, such as aspirin (ASA), (4) antihistamine H1 blockers, such as terfenadine, clemastine, and (5) anti-inflammatory agents.
  • analgesics in general such as lidocaine or its derivatives
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • opioid agonist analgesics such as codeine, fentanyl, hydromorphone, and morphine
  • salicylate analgesics such as aspirin (ASA)
  • ASA aspirin
  • anti-infective antianaerobics such as chloramphenicol and clindamycin
  • anti-infective antibiotic antifungals such as amphotehcin B, clotrimazole, fluconazole, and ketoconazole
  • macrolide antibiotic -infectious such as azithromycin and ehthromycin
  • various beta-lactam anti-infectives such as aztreonam and imipenem
  • anti-infective penicillin antibiotic such as nafcillin, oxacillin, penicillin G, penicillin V and
  • quinolone anti-infective antibiotics such as ciprofloxacin and norfloxacin
  • anti-infective tetracycline antibiotic such as doxycycline, minocycline and tetracycline
  • antiinfective antimycobacterial antituberculous agents such as isonia
  • the therapeutic agent can be a growth factor or another molecule that affects cell differentiation and/or proliferation, such as, but not limited to, platelet derivative (PDGF), transforming (TGF), insulin (IGF), hepatic (HGF), epidermal (EGF), vascular endothelial (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), or any of their combinations.
  • PDGF platelet derivative
  • TGF transforming
  • IGF insulin
  • HGF hepatic
  • EGF epidermal
  • VEGF vascular endothelial
  • FGF fibroblast growth factor
  • a variant can be generated by making conservative amino acid changes and testing the resulting variant in one of the functional assays described above or another functional assay known in the art.
  • Conservative amino acid substitutions refer to the interchangeability of residues having similar side chains.
  • one group of amino acids that have aliphatic side chains is glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine; a group of amino acids having aliphatic-hydroxyl in their side chains is serine and threonine;
  • a group of amino acids that have amide-containing side chains is asparagine and glutamine; a group of amino acids having aromatic side chains is phenylalanine, tyrosine, and thptophan; a group of amino acids that have basic side chains is lysine, arginine, and histidine, and a group of amino acids that have sulfur-containing side chains is cysteine and methionine.
  • Preferred amino acid substitution groups are: valine-leucine-isoleucine,
  • polypeptide growth factor variants or fragments can be generated using conventional techniques, such as mutagenesis, including the creation of discrete point mutation(s), or by truncation.
  • mutation can give rise to variants that retain substantially the same, or just a subset, of the biological activity of a polypeptide growth factor from which it was derived.
  • the therapeutic agent can be Plasma Rich in Growth Factors PRGF (Plasma Rich in Growth Factors). It is based on the use of platelets as a vehicle for the controlled release of different cellular signals that accelerate and optimize the repair of damaged tissues for various reasons, such as surgical treatment, trauma or disease.
  • PRGF Plasma Rich in Growth Factors
  • the therapeutic agent is basic fibroblast growth factor.
  • basic fibroblast growth factor or "bFGF” (basic fibroblast growth factor) or “FGF2" or “FGF-[3” refers to a factor that is a member of the family of fibroblast growth factors that allows the maintenance of of cells undifferentiated human embryonic stem cells, and that stimulates the proliferation of cells of mesodermal origin, as well as many cells of neuroectodermal, ectodermal and endodermal origin.
  • bFGF is encoded by the FGF2 gene. This protein is activated during tissue damage or tumor development mediating angiogenic processes.
  • pharmaceutically acceptable carrier means a carrier that must be approved by a federal or state government regulatory agency or listed in the United States Pharmacopoeia or European Pharmacopoeia, or other generally recognized pharmacopoeia for use in animals, and more specifically in humans.
  • vehicle refers to a diluent, adjuvant, excipient or carrier with which the biomaterial or the composition of the invention must be administered. Obviously, said vehicle must be compatible with said biomaterial and with other components that the composition of the invention may comprise, for example, but not limited to, cells.
  • active ingredient means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different effect in the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of disease, or affecting the structure or function of the body of man or other animals.
  • the term includes those components that promote a chemical change in the drug formulation and are present in the drug in a modified form intended to provide the specific activity or effect.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be stored until the moment of its application by means of conventional procedures known to those skilled in the art.
  • This pharmaceutical composition can also be stored together with additional drugs, useful in the treatment of diseases, in an active form that comprises a combined therapy.
  • the invention consists of obtaining and using holoturia dermal ossicles for the treatment of bone lesions. To do this, first of all, we proceeded to extract and purify the skin ossicles of various genera of holothurians belonging to the genus Holothur ⁇ a (in our environment, fundamentally, H. tubulosa, H. helleri and H. sanctori).
  • the ossicles After confirming the presence of the ossicles by means of direct visualization in a phase contrast microscope or polarized light, they are sterilized by treatment with 70% ethanol for 20 minutes, and then left to dry in a sterile laminar flow cabinet. These particles can also be sterilized by any other method, including autoclaving.
  • the product obtained will contain buttons, towers, plates or other types of ossicles.
  • the results show an adequate repair of the three lesions treated with holoturia ossicles, with or without associated biomaterials, while the hole without biomaterial seemed to have defects on its surface.

Abstract

Nuevo biomaterial para ingeniería tisular. La presente invención propone un nuevo biomaterial basado en osículos de equinodermo, método in vitro de preparación del mismo y usos en medicina regenerativa.

Description

DESCRIPCIÓN
NUEVO BIOMATERIAL PARA INGENIERÍA TISULAR
CAMPO DE LA TÉCNICA
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina e ingeniería tisular. Específicamente, se refiere a un nuevo biomaterial y un método in vitro de preparación del mismo. También se refiere a sus usos en medicina regenerativa.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los enormes avances de la ingeniería de tejidos y los biomateriales han permitido desarrollar nuevos biomateriales para el tratamiento de las lesiones de la mayor parte de los tejidos y órganos humanos. Sin embargo, los tejidos duros, especialmente el hueso, son muy difíciles de tratar debido a sus especiales características biológicas y funcionales, y la mayoría de los biomateriales actualmente disponibles para el tratamiento de las lesiones óseas presentan muy escasa biocompatibilidad y funcionalidad in vivo.
Hasta la fecha, las lesiones graves del hueso humano se tratan mediante injerto de hueso humano procedente de donante, hueso de animal liofilizado, partículas de hidroxiapatita y materiales similares, cuya biointegración en el hueso es muy lenta y presenta bajas tasas de éxito. Por ello, la búsqueda de nuevos materiales altamente biocompatibles para uso en la reparación de defectos óseos es una prioridad en el campo de la traumatología.
En este contexto, la holoturia es un animal perteneciente al filo de los equinodermos, clase Holothuroidea y, como tal, posee numerosos elementos calcificados inmersos en sus tejidos externos, especialmente en la piel (Figura 1 ). A diferencia de otros equinodermos, la holoturia posee microestructuras denominadas espículas, osículos, osículos dérmicos, escleritos o corpúsculos calcáreos que son independientes unas de otras y permiten al animal una gran libertad de movimientos en condiciones relajadas, y una gran resistencia cuando los tejidos se contraen y los osículos se acercan unos a otros.
En general, la morfología de estos osículos es propia de cada especie de holoturia y, de hecho, se utiliza para identificar las diferentes especies existentes en la naturaleza (Figura 2). Respecto a su composición, se trata de elementos constituidos fundamentalmente por carbonato cálcico mineralizado como calcita, y puede contener un 5 - 13% de carbonato magnésico en sustitución iónica.
Cada osículo es sintetizado por una o vahas células del animal, las cuales se adhieren íntimamente a la superficie del osículo. Por ese motivo, la superficie y el tamaño de los osículos es, potencialmente, altamente biocompatible, lo cual apoya su utilización clínica como agente inductor de la regeneración ósea.
Actualmente los biomatehales que se emplean en medicina regenerativa para reparar tejido duro (óseo) son muy poco biocompatibles, lo que hace necesario desarrollar nuevos biomatehales que tengan poros de un tamaño adecuado y una rugosidad que los haga óptimos para ser empleados en medicina regenerativa.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Imágenes histológicas de distintos tejidos de Holothuría sanctori teñidos mediante hematoxilina y eosina en la que se aprecian abundantes osículos en el interior del tejido blando (se marcan algunos osículos con flechas). A: tejido branquial. B: epidermis. C: pared muscular.
Figura 2. Osículos de distintas especies de holoturia analizados mediante microscopía óptica. A: Osículos de tipo torre. B: Botones lisos y botones rugosos. C: Distintos tipos de osículos.
Figura 3. Tejidos artificiales de fibhna-agarosa con osículos dérmicos en su interior y fibroblastos humanos. Arriba: dos imágenes del tejido artificial no descalcificado teñido con hematoxilina-eosina en las que se observan las partículas en la base de la fibrina agarosa (FA). Abajo: tejidos artificiales descalcificados para su procesamiento histológico y teñidos con hematoxilina-eosina en los que se observa la morfología normal de las células (flechas) y los espacios vacíos en los que se alojaban las partículas antes de la descalcificación. La imagen de abajo a la derecha muestra un tejido artificial tubulizado.
Figura 4. Análisis histológico de los tejidos artificiales tubulizados de fibhna-agarosa implantados en ratones desnudos. A: fibhna-agarosa sin osículos, B: fibhna-agarosa con 0.25% osículos, C: fibhna-agarosa con 0.5% osículos, D: fibhna-agarosa con 1 % osículos, E: fibhna-agarosa con 2% osículos, F: fibhna-agarosa con 3% osículos.
Figura 5. Ensayos de funcionalidad ¡n vivo. A la izquierda, se muestra la tibia del conejo en la que se han realizado 4 defectos, tratándose cada uno con un producto diferente. A la derecha, se muestra el resultado a los 60 días de la intervención.
Figura 6. Imagen histológica a bajo aumento de la tibia del conejo a los 60 días de la intervención quirúrgica.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención proponen emplear un biomatehal altamente biocompatible y que presenta mejores resultados en términos de regeneración ósea que otros materiales actualmente disponibles. Además, su origen natural, procedente de productos de la pesca altamente abundantes en la naturaleza, le aporta un potencial beneficio como potenciador del desarrollo de las comunidades pesqueras locales.
Bl O MATERIAL DE LA INVENCIÓN
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a osículos de equinodermos, de ahora en adelante osículos de la invención, para su uso como medicamento o, alternativamente, para su uso en medicina.
Los autores de la presente invención han extraído y purificado los osículos de la piel de diversos géneros de holoturias pertenecientes al género Holothuria (fundamentalmente H. tubulosa, H. helleri y H. sanción). Por tanto, más preferiblemente los osículos son osículos dérmicos de organismos del género Holothuría.
El endoesqueleto de los equinodermos está compuesto por osículos de carbonato cálcico que se encuentran en una dermis que deriva del mesodermo y que se encuentra debajo de la epidermis. Por debajo de la capa de dermis hay capas musculares y el peritoneo del celoma.
Los osículos que componen el esqueleto son de calcita con pequeñas cantidades de carbonato de magnesio. Suelen presentar espinas (fijas o móviles) y también salientes (como tubérculos o granulos). En las holoturias, los osículos son muy pequeños y estos animales poseen capas musculares muy bien desarrolladas.
Las holoturias u holoturoideos (Holothuroidea) conocidos vulgarmente como pepinos, cohombros, mojón de mar, pollaburro o carajos de mar, son una clase del filo Equinodermos que incluye animales de cuerpo vermiforme alargado y blando que viven en los fondos de los mares de todo el mundo.
En esta memoria, se entiende por organismos del Phylum Echinodermata, o equinodermos, a aquellos organismos celulares que pertenecen al superreino Eukariota, ciado Opisthokonta, Reino Metazoa, ciado Eumetazoa, ciado Bilateria, ciado Deuterostomia.
Los equinodermos comprenden vahas clases: Asteroidea (estrellas de mar), Ophiuroidea (ofiuras), Echinoidea (erizos de mar), Crinoidea (lirios de mar o comátulas), Concentricycloidea (margaritas del mar) y Holoturioidea (holoturias).
Los organismos del género Holothuría pertenecen al superreino Eukariota, ciado Opisthokonta, Reino Metazoa, ciado Eumetazoa, ciado Bilateria, ciado Deuterostomia, Phylum Echinodermata, Superclase Echinozoa, Clase Holothuroidea, Orden Aspidochirotida, Familia Holothuriidae
La especie tipo del género es Holothuría physalis Linnaeus 1758
Alternativamente, Holothuriidae también se refiere a una familiase un organismo que tiene una secuencia nucleotídica homologa de la región correspondiente al gen citocromo oxidasa I del ADN mitocondhal con una identidad de al menos un 70% con la SEQ ID NO. 1 , y más preferiblemente una identidad de al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la SEQ ID NO: 1. Más preferiblemente, la secuencia homologa de la región correspondiente al gen citocromo oxidasa I del ADN mitocondhal tiene una identidad del 100% con la SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 1
Holothuría tubulosa cytochrome oxidase I (COI) gene, partial cds; mitocondhal (GenBank: GU797718.1 ) ataggagggtttggaaaatgactcatacctttaatgataggagctcccgatatggccttccctcgaatgaaaaacatga gcttctggttaatccccccatcctttatactactcttagcctcagcaggagtagaaagaggtgccggcacaggttggaca atttaccctccattgtccagaaacattgcccacgccggaggatcagtcgacctggctattttttccctacatttggccgga gcttcatcaatactagcctcaattaacttcataacaacaatcataaaaatgcggaccccaggagtaaccttcgaccgg ctcccactattcgtatggtctgttttcataacagcattcctactactactcagactcccagttctagcaggagcaataacaa tgctcttaacagaccgaaacataaaaacaaccttcttcgaccccgctggaggaggagaccctatactattccaacattt attctggttttttggacatccagaagtctacattctaatcctacctggattcgggatgatatcccacgtgataaccca
El término “identidad”, como se usa aquí, se refiere a la proporción de nucleótidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas cuando se comparan. Los métodos de comparación de las secuencias son conocidos en el estado del arte, e incluye, pero no se limita a, BLASTP, BLASTN, y FASTA (S.F. Altschul etal., “Basic Local Alignment Search Tool”, J. Mol Biol. 1990, 215, 403-410).
El término "secuencia de nucleótidos homologa", como se usa en este documento, se refiere a una secuencia que es equivalente al fragmento de la región correspondiente al gen citocromo oxidasa I del ADN mitocondhal de secuencia SEQ ID NO: 1 de Holothuría sp, preferiblemente Holothuría tubulosa. La expresión "una secuencia que es equivalente" significa una secuencia de nucleótidos que está dentro del citocromo b o región equivalente en esa especie de Holothuría en particular, y realiza la misma función. La persona experta es capaz de identificar estas regiones equivalentes con protocolos de rutina.
El término "% de identidad", como se entiende en esta invención, se refiere al porcentaje (%) de identidad entre dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El % de identidad es un recuento del número de posiciones sobre la longitud de la alineación de dos secuencias donde todos los nucleótidos o aminoácidos en esa posición son idénticos. El % de identidad se calcula en base a secuencias homologas de la misma longitud.
Los autores de la presente invención han demostrado que los osículos de equinodermos pueden emplearse en el tratamiento de pacientes con graves lesiones del hueso que requieran el implante de materiales potenciadores de la regeneración ósea.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a osículos de equinodermos para aumentar, restaurar o reemplazar parcial o completamente la actividad funcional de un tejido u órgano enfermo o dañado. En una realización preferida, el tejido enfermo o dañado es un tejido óseo. Más preferiblemente, los osículos son osículos dérmicos de organismos del género Holothuría.
El término “medicamento”, tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales
COMPOSICIONES Y TEJIDO ARTIFICIAL DE LA INVENCIÓN
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende los osículos de la invención. Más preferiblemente los osículos son osículos dérmicos de organismos del género Holothuría.
Las composiciones de la invención pueden comprender otros componentes útiles para la finalidad médica de la invención, principalmente para la regeneración de tejidos. Por tanto, en otra realización preferida, la composición de la invención además comprende fibrina y agarosa. En otra realización aún más preferida, la composición de la invención además comprende una célula.
La composición de la invención puede, por tanto, comprender una o más células, dando lugar a un tejido artificial. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un tejido artificial, de ahora en adelante tejido artificial de la invención, que comprende: a) el biomaterial o la composición de la invención, y b) al menos una célula.
En una realización preferida de la invención, la célula es una célula humana. En otra realización preferida, la célula se selecciona de entre: condrocitos de cartílago hialino, elástico o fibroso humano, células hepáticas, células epiteliales (por ejemplo, queratinocitos), fibroblastos o células vasculares, entre otras, o cualquiera de sus combinaciones.
Tal y como se muestra en los ejemplos, el biomaterial de la invención se puede emplear para reparar o reemplazar total o parcialmente el hueso que no solidifica, o que forma una pseudoartrosis (injerto óseo para regeneración de tejido perdido de hueso, o como sustituto óseo).
La reparación o reemplazamiento del hueso como consecuencia de una lesión o fractura se asemeja mucho al proceso de osteogénesis normal del esqueleto, aunque difiere en algunos aspectos tales como la inflamación y el aumento de fuerzas mecánicas en los adultos. Se puede dividir en etapas secuenciales que involucran vahos tipos celulares y factores de crecimiento:
1.- Respuesta inflamatoria: hematoma, cascada proinflamatoha con liberación de citoquinas (principalmente IL-1 , IL-6 y TNF-a).
2.- Expresión y liberación de proteínas morfogénicas óseas (BMP) por parte de células osteoprogenitoras cercanas a la fractura, y liberación de citoquinas que reclutan células mesenquimales.
3.- Si la fractura es mecánicamente estable, las células osteoprogenitoras se diferencian a osteoblastos para regenerar el hueso. Si es inestable, se diferencia a condrocitos para formar una capa de colágeno que actúa como puente entre los extremos de la fractura, constituyéndose así lo que se conoce como callo blando; luego es calcificado para formar un callo óseo y posteriormente se remodela para formar hueso laminar. En este proceso de reparación participan coordinadamente diferentes tipos celulares (células osteoprogenitoras, fibroblastos, macrófagos, condroblastos, osteoblastos, osteoclastos).
Por tanto, en otra realización más preferida, la célula y/o la población celular se selecciona de la lista que consiste en: fibroblastos, osteoblastos, osteocitos, osteoclastos, condroblastos, condrocitos, células madre mesenquimales, o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización preferida de la invención, la célula es una célula madre. Más preferiblemente, la célula madre se selecciona de entre: células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias, células madre pluhpotentes inducidas, células madre adultas o combinaciones de las mismas. Aún más preferiblemente, es una célula madre mesenquimal. Más preferiblemente, la célula madre mesenquimal se obtiene a partir de médula ósea, tejido adiposo, hígado, bazo, testículos, sangre menstrual, fluido amniótico, páncreas, periostio, membrana sinovial, músculo esquelético, dermis, pericitos, hueso trabecular, cordón umbilical, pulmón, pulpa dental y sangre periférica.
Si se desea, la célula de cualquier aspecto de la invención puede modificarse genéticamente mediante cualquier método convencional incluyendo, a modo de ilustración, sin limitación, procesos de transgénesis, deleciones o inserciones en su genoma que modifiquen la expresión de genes que son importantes por sus propiedades básicas (proliferación, migración, diferenciación, etc.), o mediante la inserción de secuencias de nucleótidos que codifiquen proteínas de interés como, por ejemplo, proteínas con propiedades terapéuticas. Por tanto, en otra realización preferida, la célula de cualquier aspecto de la invención ha sido modificada genéticamente.
En ciertos casos, la progenie de una sola célula clonal puede expandirse mediante numerosos pases, sin que aparentemente sufra ninguna anomalía cromosómica, o la pérdida de sus propiedades de crecimiento y diferenciación.
Por tanto, si se desea, las células de cualquier aspecto de la invención se pueden expandir clonalmente usando un método adecuado para clonar poblaciones celulares. Por ejemplo, una población proliferada de células puede recolectarse físicamente y sembrarse en una placa separada (o en los pocilios de una placa de "múltiples pocilios"). Otra opción es que las células se pueden subclonar en una placa de "múltiples pocilios" en una relación estadística para facilitar la operación de colocar una sola célula en cada pocilio (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente una célula / pocilio o incluso aproximadamente 0,25 a 0,5 células / pocilio, como 0,5 células / pocilio). Por supuesto, las células pueden clonarse a baja densidad (por ejemplo, en una placa de Peth u otro sustrato adecuado) y aislarse de otras células usando dispositivos tales como anillos de clonación. La producción de una población clonal se puede expandir en cualquier medio de cultivo adecuado. En cualquier caso, las células aisladas se pueden cultivar hasta un punto adecuado en el que se pueda evaluar su fenotipo de desarrollo. Otro aspecto de la invención se refiere a una población de células aisladas, en adelante población de células de la invención, que comprende al menos una célula de cualquier aspecto de la invención, preferiblemente una célula adulta. En una realización preferida, la población celular de la invención comprende al menos el 20%, preferiblemente el 40% e incluso más preferiblemente el 50%, 60%, 80%, 90%, 95% o 99% de células de la invención. En una realización preferida, la población celular de la invención comprende al menos el 20%, preferiblemente el 40% e incluso más preferiblemente el 50%, 60%, 80%, 90%, 95% o 99% de células de la invención.
Por tanto, en una realización aún más preferida, es una población celular.
La célula de la invención, o la población celular de la invención, puede ser de origen autólogo, alogénico o xenogénico. Preferiblemente, son de origen autólogo.
El término "célula madre adulta" significa que la célula madre se aísla de un tejido u órgano de una persona o animal en un estado de crecimiento después del estado embrionario. Preferiblemente, las células madre de la invención se han aislado en un estado posnatal. Preferiblemente, se han aislado de un mamífero y, más preferiblemente, de un ser humano, incluidos neonatos, jóvenes, adolescentes y adultos.
El término "condrocito" empleado en la presente invención hace referencia a un tipo celular presente en el cartílago, responsable de la producción y mantenimiento de la matriz cartilaginosa, la cual comprende fundamentalmente colágeno y proteoglucanos. La organización de este tipo celular en el cartílago difiere en función del tipo de cartílago y el tejido en donde se encuentre. En referencia al hueso o al cartílago, las células madre mesenquimales (de origen mesodérmico) se diferencian hacia el linaje osteocondrogénico. Dichas células madre mesenquimales no diferenciadas proliferan y se acumulan en un conjunto denso de células condrogénicas (cartílago) en el centro de condrificación. Estas células condrogénicas se diferencian a condroblastos capaces de sintetizar la matriz extracelular del cartílago, que comprende proteoglucanos, glucosaminoglucanos de bajo potencial osmótico y fibras. A continuación, los condroblastos quedan confinados en un espacio pequeño o laguna que ya no está en contacto con la matriz de nueva creación y que contiene líquido extracelular. El condroblasto en dicho estadio es el condrocito, que es generalmente inactivo pero aún pueden secretar y degradar la matriz dependiendo de las condiciones.
El término "osteocito" empleado en la presente invención hace referencia a un tipo celular formado a partir de la diferenciación del osteoblasto, que a su vez deriva de células osteoprogenitoras. El osteocito, junto con el osteoclasto, constituye el elemento celular del tejido óseo. El osteocito se caracteriza por presentar un citoplasma ligeramente alargado y basófilo, con una enorme cantidad de prolongaciones citoplásmaticas, retículo endoplásmico rugoso y aparato de Golgi poco desarrollados, presentando pequeñas gotas de lípidos y pequeñas cantidades de glucógeno. Este tipo celular tiene la capacidad de segregar o reabsorber la matriz ósea que le rodea. A pesar de la distancia que hay entre los osteocitos, y de la cantidad de matriz que los separa, estos permanecen en contacto a través de pequeños canales presentes a lo largo del hueso, de modo que la comunicación de los osteocitos es importante para controlar la cantidad de hueso que se forma y deteriora. Los osteocitos derivan de osteoblastos que quedan atrapados en las lagunas de la matriz.
El término "osteoclasto" hace referencia a aquellas células responsables de resorción de la matriz ósea. Son células polinucleadas de gran tamaño que se localizan en las superficies óseas firmemente asociadas a la matriz ósea. Los osteoclastos se forman por la fusión de vahas células mononucleares derivadas de una célula madre sanguínea de la médula ósea mostrando muchas propiedades de los macrofagos. Los osteoclastos se caracterizan por disponer de una porción de su membrana "arrugada", en forma de cepillo, rodeada de un citoplasma libre de orgánulos, llamada "zona clara" con la que se adhiere a la superficie del hueso mediante integhnas, unos receptores especializados del hueso. El proceso de resorción se inicia cuando el aparato de Golgi de la células excreta lisosomas con enzimas capaces de producir un microambiente ácido por debajo de la membrana arrugada como consecuencia del transporte de protones mediante la bomba de protones ATP-dependiente, el intercambio Na+/H+ y la anhidrasa carbónica. Las enzimas lisosomales de los osteoclastos implicadas en este proceso son cistein-proteasas como la catepsina y sobre todo, la fosfatasa ácida tartrato-resistente (esta última se utiliza como marcador del fenotipo osteoclástico). Las enzimas lisosomales solo son liberadas en la zona clara en las proximidades del borde arrugado, produciéndose en este área las reacciones de degradación de la matriz que deben producirse antes de que le medio ácido disuelva las sales minerales del hueso. La resorción osteoclástica depende de una serie de factores reguladores externos como la hormona paratiroidea, la 1 ,25-dihidroxivitamina D3 y la calcitonina. Otros factores que afectan la funcionalidad de los osteoclastos son los glucocorticoides y las prostaglandinas.
El término "proliferación" o "expansión" en el contexto de la presente invención se emplea para hacer referencia a un aumento en el número celular, derivado de la división celular.
El término "sujeto" incluye cualquier animal, en particular, animales vertebrados, preferiblemente mamíferos, tales como ratones, ratas, caballos, cerdos, conejos, gatos, ovejas, perros, vacas, seres humanos, etc. El término mamífero, como se entiende aquí, se refiere a cualquier organismo del superreino Eukaryota, reino Metazoa, Phylum Chordata, clase Mammalia. Por tanto, las células que se emplean en el tejido artificial de la invención pueden pertenecer a cualquier animal, preferiblemente un mamífero. En otra realización incluso más preferida, el mamífero es el ser humano.
Otro aspecto se refiere a la composición de la invención o al tejido artificial de la invención para su uso en medicina, o alternativamente, para su uso como medicamento. Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención o al tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado. Más preferiblemente, el tejido enfermo o dañado es el tejido óseo.
En una realización preferida de este aspecto, la composición o el tejido artificial de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida, la composición de la invención además comprende al menos un principio activo o agente terapéutico. Dicho agente terapéutico se selecciona, preferiblemente, de entre un agente analgésico (en el tratamiento de la inflamación y del dolor) o un agente anti infeccioso (en la prevención de infección). Aún más preferiblemente comprende excipientes farmacéuticamente aceptables.
En particular, ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos de utilidad de acuerdo a la invención incluyen las siguientes categorías terapéuticas: analgésicos, como los medicamentos anti-inflamatorios no esteroideos, agonistas opiáceos y salicilatos; agentes anti-infecciosos, tales como antihelmínticos, antianaeróbicos, antibióticos, antibióticos aminoglucósidos, antibióticos antifúngicos, cefalosporinas, antibióticos macrólidos, diversos antibióticos beta-lactámicos, penicilinas, antibióticos quinolonas, antibióticos sulfonamidas, antibióticos de tetraciclina, antimicobactehanos, antimicobacterianos antituberculosos, antiprotozoarios, antiprotozoarios antimaláricos, agentes antivirales, agentes anti-retrovirales, escabicidas, agentes antiinflamatorios, corticosteroides antiinflamatorios, antipruriginosos/anestésicos tópicos locales, antiinfecciosos, antimicóticos tópicos antiinfecciosos, antivirales tópicos antiinfecciosos, agentes electrolíticos y renales, tales como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, diuréticos, inhibidores de la anhidrasa carbónica, diuréticos, diuréticos de asa, diuréticos osmóticos, diuréticos ahorradores de potasio, diuréticos de tiazida, suplementos de electrolitos, y agentes uricosúricos, enzimas, tales como enzimas pancreáticas y las enzimas trombolíticos, agentes gastrointestinales, tales como antidiarreicos, antieméticos, gastrointestinales agentes anti-inflamatorios gastrointestinales, el salicilato de agentes anti-inflamatorios, antiácidos anti-úlcera gástrica, agentes inhibidores de la bomba de ácido antiulcerosos agentes, mucosa gástrica antiulcerosos agentes bloqueantes H2, antiulcerosos, agentes colelitolíticos digestants, eméticos, laxantes y ablandadores de heces y agentes procinéticos, anestésicos generales como los anestésicos inhalatorios halogenados anestésicos inhalatorios, anestésicos intravenosos, barbitúricos, benzodiazepinas anestésicos intravenosos anestésicos por vía intravenosa de opiáceos y anestésicos intravenosos agonistas, hormonas y modificadores hormonales, como abortivos, agentes corticosteroides suprarrenales, agentes suprarrenales, los andrógenos, antiandrógenos, inmunobiológicos agentes, tales como inmunoglobulinas, inmunosupresores, toxoides, y vacunas; anestésicos locales, tales como amida de los anestésicos locales y de los anestésicos locales de tipo éster, agentes musculoesqueléticos, tales como anti-gota agentes antiinflamatorios, corticosteroides anti-inflamatohos, agentes, compuestos de oro anti-inflamatoha agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, fármacos anti-inflamatohos no esteroideos (AINE), agentes anti-inflamatohos salicilato, minerales y vitaminas, como la vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E y vitamina K.
En una realización particular, los agentes terapéuticos útiles según las categorías anteriores incluyen: (1 ) analgésicos en general, tales como lidocaína o sus derivados, y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) analgésicos, incluyendo diclofenaco, ibuprofeno, ketoprofeno, naproxeno y, (2) analgésicos opiáceos agonistas, como la codeína, fentanilo, hidromorfona y la morfina, (3) analgésicos de salicilato, como la aspirina (ASA), (4) bloqueadores H1 antihistamínicos, tales como terfenadina, clemastina y (5) agentes anti-infecciosos, tales como mupirocina; (6) antianaeróbicos anti-infecciosos, tales como cloranfenicol y clindamicina; (7) antifúngicos antibióticos antiinfecciosos, tales como anfotehcina B, clotrimazol, fluconazol y ketoconazol; (8) contra el antibiótico macrólido -infecciosos, tales como la azitromicina y ehtromicina; (9) diversos beta-lactámico antiinfecciosos, tales como aztreonam y imipenem; (10) antibiótico de penicilina antiinfecciosos, tales como nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V y; (11 ) quinolona antibióticos antiinfecciosos, tales como ciprofloxacina y norfloxacina; (12) antibiótico tetraciclina antiinfecciosos, tales como doxiciclina, minociclina y tetraciclina; (13) antituberculosos antimicobactehanos antiinfecciosos, tales como isoniazida (INH), hfampicina y; (14) antiprotozoarios antiinfecciosos, como atovacuona y dapsona; (15) antipalúdicos antiprotozoahos antiinfecciosos, tales como cloroquina y pihmetamina; (16) anti- retrovirales antiinfecciosos, tales como ritonavir y zidovudina; (17) contra el antiviral - infeccioso agentes, tales como aciclovir, ganciclovir, interferon alfa, y hmantadina; (18) antifúngicos tópicos antiinfecciosos, tales como anfotehcina B, clotrimazol, miconazol, nistatina y; (19) antivirales tópicos antiinfecciosos, tales como el aciclovir; (20) agentes electrolíticas y renales, como la lactulosa; (21 ) diuréticos de asa, como la furosemida, (22) diuréticos ahorradores de potasio, como thamtereno; (23) diuréticos tiazídicos, tales como hidroclorotiazida (HCTZ), (24) agentes uricosúricos, tales como probenecid; (25) enzimas, tales como RNasa y DNasa; (26) antieméticos, tales como proclorperazina; (27) salicilato gastrointestinales inflamatorias anti-agentes, tales como sulfasalazina; (28) de la bomba gástrica de ácido anti-inhibidor agentes de úlceras, tales como el omeprazol; (29) bloqueantes H2, agentes anti-úlcera, tales como cimetidina, famotidina, nizatidina y ranitidina; (30) digestivos, tales como pancrelipase; (31 ) agentes procinéticos, tales como la eritromicina (32; éster) anestésicos locales, tales como benzocaína y procaína; (33) musculoesqueléticos corticosteroides anti-inflamatohos, agentes, tales como beclometasona, betametasona, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, y prednisona; (34) musculoesqueléticos antiinflamatohos inmunosupresores, tales como azatiophna, ciclofosfamida y metotrexato; (35) musculoesqueléticos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), tales como diclofenaco, ibuprofeno, ketoprofeno, ketorlac, y naproxeno; (36) minerales, tales como hierro, calcio y magnesio; (37) Los compuestos de vitamina B , tales como la cianocobalamina (vitamina B12) y la niacina (vitamina B3); (38) compuestos de vitamina C, tales como ácido ascórbico, y (39) compuestos de vitamina D, tales como calcitriol.
En otra realización preferida, el agente terapéutico puede ser un factor de crecimiento u otra molécula que afecta a la diferenciación celular y/o proliferación, como por ejemplo, pero sin limitarnos, el derivado de las plaquetas (PDGF), transformante (TGF), insulínico (IGF), hepático (HGF), epidérmico (EGF), endotelio vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), o cualquier de sus combinaciones. Los factores de crecimiento que inducen la diferenciación de estados finales son bien conocidos en la técnica, y puede ser seleccionado de cualquiera de esos factores que se ha demostrado que induce un estado de diferenciación final. Los factores de crecimiento para uso en los métodos aquí descritos pueden, en ciertas realizaciones, ser variantes o fragmentos de un factor de crecimiento de origen natural. Por ejemplo, una variante puede ser generada al hacer cambios de aminoácidos conservadores y prueba de la vahante resultante en uno de los ensayos funcionales descritos anteriormente u otro ensayo funcional conocido en la técnica. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen alifático-hidroxilo en sus cadenas laterales es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen que contiene amida en las cadenas laterales es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y thptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina, y un grupo de aminoácidos que tienen que contiene azufre en las cadenas laterales es cisteína y metionina. Grupos preferidos de sustitución de aminoácidos son: valina-leucina- isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina- glutamina.
Como los expertos en la técnica apreciarán, las variantes o fragmentos de factores de crecimiento de polipéptidos se pueden generar usando técnicas convencionales, tales como mutagénesis, incluyendo la creación de mutación de punto discreto (s), o por truncamiento. Por ejemplo, la mutación puede dar lugar a vahantes que conservan sustancialmente la misma, o simplemente un subconjunto, de la actividad biológica de un factor de crecimiento polipeptídico de la que se derivó.
En otra realización preferida, el agente terapéutico puede ser Plasma Rico en Factores de Crecimiento PRGF (Plasma Rich in Growth Factors). Se basa en la utilización de las plaquetas como vehículo para la liberación controlada de distintas señales celulares que aceleran y optimizan la reparación de los tejidos dañados por diversas razones como puede ser un tratamiento quirúrgico, un traumatismo o una enfermedad.
Aun más preferiblemente, es el el agente terapéutico es el factor de crecimiento de fibroblastos básico.
El término "factor de crecimiento de fibroblastos básico" o "bFGF" (basic fibroblast growth factor) o "FGF2" o "FGF-[3" hace referencia a un factor miembro de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos que permite el mantenimiento de células madre embrionarias humanas no diferenciadas, y que estimula la proliferación de células de origen mesodérmico, así como de muchas células de origen neuroectodérmico, ectodérmico y endodérmico. bFGF está codificado por el gen FGF2. Esta proteína se activa durante el daño tisular o el desarrollo tumoral mediando procesos angiogénicos.
El término “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a un vehículo que debe estar aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal o enumerado en la Farmacopea Estadounidense o la Farmacopea Europea, u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más concretamente en humanos.
El término “vehículo” se refiere a un diluyante, coadyuvante, excipiente o portador con el que se debe administrar el biomaterial o la composición de la invención. Obviamente, dicho vehículo debe ser compatible con dicho biomaterial y con otros componentes que pueda comprender la composición de la invención, por ejemplo, pero sin limitarnos, células.
Como se emplea aquí, el término “principio activo”, “sustancia activa”, “sustancia farmacéuticamente activa”, “ingrediente activo” o “ingrediente farmacéuticamente activo” significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.
La composición farmacéutica de la invención, si se desea, se puede almacenar hasta el momento de su aplicación mediante los procedimientos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. Esta composición farmacéutica también se puede almacenar junto a medicamentos adicionales, útiles en el tratamiento en enfermedades, en una forma activa que comprende una terapia combinada.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y las variantes de la misma no pretenden excluir otras características técnicas, suplementos, componentes o pasos. Para los expertos en la técnica, otros objetos, ventajas y características de la invención se entenderán en parte a partir de la descripción y en parte a partir de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
La invención consiste en la obtención y utilización de osículos dérmicos de holoturia para el tratamiento de lesiones óseas. Para ello, en primer lugar, se procedió a extraer y purificar los osículos de la piel de diversos géneros de holoturias pertenecientes al género Holothuría (en nuestro medio, fundamentalmente, H. tubulosa, H. helleri y H. sanctori).
Para la extracción, varios ejemplares de holoturia fueron sumergidos en una solución de hipoclorito sódico al 1 -2% durante 6h en un decantador o embudo de decantación. Tras ello, se recuperó el componente depositado en la parte inferior del decantador, el cual se lavó varias veces con abundante agua corriente. Las partículas así recogidas se purificaron a continuación con una solución al 5-10% de peróxido de hidrógeno en agua, lavándose varias veces con abundante agua corriente.
Tras confirmar la presencia de los osículos mediante visualizaron directa en un microscopio de contraste de fases o luz polarizada, se procede a su esterilización mediante tratamiento con etanol 70% durante 20 minutos, dejándose secar a continuación en una cabina de flujo laminar estéril. Estas partículas también pueden esterilizarse mediante cualquier otro método, incluyendo el autoclavado.
Dependiendo de la especie escogida, el producto obtenido contendrá botones, torres, placas u otros tipos de osículos.
Para determinar la biocompatibilidad de los osículos dérmicos, se realizaron ensayos a diferente nivel:
1 ) Análisis de biocompatibilidad ex vivo en cultivos celulares puestos en contacto indirecto con los osículos. 2) Análisis de biocompatibilidad ex vivo en sistemas tridimensionales consistentes en tejidos artificiales de fibrina-agarosa y osículos dérmicos con células humanas en su interior.
3) Análisis de biocompatibilidad in vivo de tejidos artificiales de fibrina-agarosa y osículos dérmicos con células humanas en su interior.
4) Análisis de eficacia in vivo en un modelo animal de lesión ósea.
La metodología utilizada y los principales resultados obtenidos en cada caso, se resumen brevemente a continuación:
1) Contacto indirecto con los osículos. En primer lugar, se cultivaron fibroblastos humanos en la base de un inserto de membrana porosa para cultivo celular, depositándose a continuación los osículos dérmicos en la parte superior del sistema. De este modo, las células no contactaban directamente con las partículas, pero sí con cualquier metabolite o agente tóxico que éstas pudieran liberar.
Los resultados mostraron que las células eran viables, no existiendo ninguna alteración morfológica o funcional derivada de la presencia de los osículos dérmicos, y sugieren que éstos son altamente biocompatibles.
2) Sistemas tridimensionales ex vivo. En este caso, se generaron biomatehales de fibrina-agarosa que contenían diferentes concentraciones de osículos dérmicos (0, 0.05, 0.1 , 0.2, 0.3, 1 , 2 y 3% p/v) con células humanas en su interior (fibroblastos). Estos tejidos fueron sometidos a nanoestructuración una vez generados, y algunos de ellos se tubulizaron para fabricar cilindros macizos concéntricos mediante enrollamiento del material sobre sí mismo. El resultado mostró que las células mantenían su viabilidad en el interior de los tejidos artificiales, no habiéndose detectado ningún tipo de alteración morfológica o funcional en las mismas. Es importante destacar que las partículas se concentraron fundamentalmente en la base del biomatehal de fibrina-agarosa, probablemente debido a su tendencia a decantar en medios líquidos (Figura 3). 3) Sistemas tridimensionales in vivo. Una vez generados los diferentes tejidos artificiales de fibrina-agarosa-osículos con fibroblastos humanos en su interior, se procedió a su implante subcutáneo en ratones desnudos (inmunodeficientes) para determinar su biocompatibilidad in vivo. En este caso, se utilizaron tejidos artificiales tubulizados. Los resultados a los 12 días del implante (Figura 4) mostraron adecuada biocompatibilidad in vivo, con ausencia de signos de necrosis, tumoración, infección, hemorragia o rechazo. Únicamente se observó un proceso normal de biointegración del biomaterial de fibhna-agarosa.
4) Eficacia in vivo en un modelo animal de lesión ósea. Para determinar el potencial regenerativo de los osículos de holoturia, se utilizó un modelo animal de lesión ósea (Figura 5). En concreto, se utilizó la tibia del conejo Wistar de laboratorio, realizándose una lesión cortical ósea en cuatro puntos de la tibia utilizando una fresa de 4 mm de diámetro. Tras ello, se trató cada lesión de forma diferente: la lesión más proximal se dejó sin tratar (control no reparado), la siguiente, se trató con un biomaterial de fibhna-agarosa nanoestructurado que contenía un 1 % de osículos de holoturia en su interior, y las dos lesiones más distales se trataron con partículas de holoturia directamente inyectadas en el orificio con una jeringuilla. 60 días más tarde, se sacrificaron los animales y se procedió a su análisis.
A nivel macroscópico y clínico, los resultados muestran una adecuada reparación de las tres lesiones tratadas con osículos de holoturia, con o sin biomatehales asociados, mientras que el orificio sin biomaterial parecía tener defectos en su superficie.
A nivel microscópico, una vez descalcificadas las tibias, se observó mayor regeneración y adecuada estructura ósea en los defectos óseos reparados con osículos de holoturia que en el control que se dejó sin tratar (Figura 6).
Todos estos resultados nos permiten concluir que la utilización de los osículos de holoturia favorece la generación y reparación ósea.

Claims

REIVINDICACIONES
1 Un osículo de equinodermo para su uso como medicamento.
2.- El osículo según la reivindicación anterior, donde el osículo es un osículo dérmico de organismos del género Holothuría.
3.- El osículo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, para aumentar, restaurar o reemplazar parcial o completamente la actividad funcional de un tejido u órgano enfermo o dañado.
4.- Una composición que comprende el osículo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, fibrina y agarosa.
5.- La composición según la reivindicación 4 para su uso como medicamento.
6.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, para aumentar, restaurar o reemplazar parcial o completamente la actividad funcional de un tejido u órgano enfermo o dañado.
7.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, que además comprende otro principio activo.
9.- Un tejido artificial que comprende:
- un osículo según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 -8,
- al menos una célula.
10.- El tejido artificial según la reivindicación 9, donde la célula se selecciona de la lista que consiste en: fibroblastos, osteoblastos, osteocitos, osteoclastos, condroblastos, condrocitos, células madre mesenquimales, o cualquiera de sus combinaciones.
11.- El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, donde la célula es una célula madre que se selecciona de la lista que consiste en: células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias, células madre pluhpotentes inducidas, células madre adultas o combinaciones de las mismas.
12.- El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 , donde la célula es un fibroblasto.
13.- El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 9-12, que además comprende otro principio activo.
14.- La composición según la reivindicación 8, o el tejido artificial según la reivindicación 13, donde el otro principio activo se selecciona de la lista que consiste en: un agente analgésico, un agente antiinfeccioso, un factor de crecimiento, o cualquiera de sus combinaciones.
15.- El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 9-14, para su uso como medicamento.
16.- El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 9-15, para aumentar, restaurar o reemplazar parcial o completamente la actividad funcional de un tejido u órgano enfermo o dañado.
17.- El osículo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, la composición cualquiera de las reivindicaciones 4-8, el tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 9-16, para aumentar, restaurar o reemplazar parcial o completamente la actividad funcional de un tejido u órgano enfermo o dañado, donde el tejido u órgano enfermo o dañado es el tejido óseo.
PCT/ES2021/070889 2020-12-15 2021-12-14 Nuevo biomaterial para ingeniería tisular WO2022129663A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES202031250 2020-12-15
ESP202031250 2020-12-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022129663A1 true WO2022129663A1 (es) 2022-06-23

Family

ID=82058980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2021/070889 WO2022129663A1 (es) 2020-12-15 2021-12-14 Nuevo biomaterial para ingeniería tisular

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2022129663A1 (es)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2353990A1 (es) * 2009-08-25 2011-03-09 Fundacion Para Ala Investigacion Biosanitaria De Andalucia Oriental (Fibao) Elaboracion de tejidos artificiales mediante ingenieria tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2353990A1 (es) * 2009-08-25 2011-03-09 Fundacion Para Ala Investigacion Biosanitaria De Andalucia Oriental (Fibao) Elaboracion de tejidos artificiales mediante ingenieria tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa.

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALTHUNIBAT O Y ET AL.: "Antioxidant and cytotoxic properties of two sea cucumbers, Holothuria edulis Lesson and Stichopus horrens Selenka", ACTA BIOLOGICA HUNGARICA, vol. 64, no. 1, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 10 - 20, ISSN: 0236-5383, DOI: 10.1556/ABiol.64.2013.1.2 *
EBRAHIMI HADI, VAZIRIZADEH AMIR, NAJAFI AKRAM, NABIPOUR IRAJ: "In vitro study of antibacterial activities of ethanol, methanol and acetone extracts from sea cucumber Holothuria parva", IRANIAN JOURNAL OF FISHERIES SCIENCES, vol. 17, no. 3, 1 January 2018 (2018-01-01), pages 542 - 551, XP055950169, DOI: 10.22092/IJFS.2018.116472 *
MARTINA, M. ; SUBRAMANYAM, G. ; WEAVER, J.C. ; HUTMACHER, D.W. ; MORSE, D.E. ; VALIYAVEETTIL, S.: "Developing macroporous bicontinuous materials as scaffolds for tissue engineering", BIOMATERIALS, vol. 26, no. 28, 1 October 2005 (2005-10-01), AMSTERDAM, NL , pages 5609 - 5616, XP027767513, ISSN: 0142-9612 *
S.A. CLARKE; P. WALSH; C.A. MAGGS; F. BUCHANAN;: "Designs from the deep: Marine organisms for bone tissue engineering", BIOTECHNOLOGY ADVANCES, vol. 29, no. 6, 12 April 2011 (2011-04-12), GB , pages 610 - 617, XP028306397, ISSN: 0734-9750, DOI: 10.1016/j.biotechadv.2011.04.003 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kang et al. Functionally graded multilayer scaffolds for in vivo osteochondral tissue engineering
Song et al. The homing of bone marrow MSCs to non-osseous sites for ectopic bone formation induced by osteoinductive calcium phosphate
Lin et al. Optimization of photocrosslinked gelatin/hyaluronic acid hybrid scaffold for the repair of cartilage defect
ES2357224T3 (es) Matrices de proteína del plasma y métodos para su preparación.
Badylak et al. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling
US8618258B2 (en) Freeze-dried fibrin matrices and methods for preparation thereof
ES2775977T3 (es) Implantes prostéticos similares al hueso
Beigi et al. Activated platelet‐rich plasma improves cartilage regeneration using adipose stem cells encapsulated in a 3D alginate scaffold
KR101472045B1 (ko) 코어-쉘 섬유상 세포전달체 및 이를 포함하는 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물
KR20090113849A (ko) 연골 질환 치료용 조성물
BRPI0614534A2 (pt) uso de células estromais derivadas de tecido adiposo em fusão espinal
Nie et al. Musculoskeletal tissue engineering by endogenous stem/progenitor cells
Zayed et al. Xenogenic implantation of equine synovial fluid-derived mesenchymal stem cells leads to articular cartilage regeneration
Liu et al. Urine‐derived stem cells loaded onto a chitosan‐optimized biphasic calcium‐phosphate scaffold for repairing large segmental bone defects in rabbits
Yu et al. Engineered periosteum-diaphysis substitutes with biomimetic structure and composition promote the repair of large segmental bone defects
KR101850206B1 (ko) 이온방출형 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체 및 이의 용도
JP2014511864A (ja) 骨及び軟骨の自己ヒト成体多能性極小胚様（ｈＶＳＥＬ）幹細胞再生
EP2001409B1 (en) Functionalized artificial bone and joint compositions and methods of use and manufacture
WO2022129663A1 (es) Nuevo biomaterial para ingeniería tisular
ES2930011T3 (es) Complejo que comprende lisado sin condrocitos y células madre para promover la diferenciación del cartílago y uso del mismo
Feng et al. Age-related regeneration of osteochondral and tibial defects by a fibrin-based construct in vivo
WO2011148025A1 (es) Biomarcador de células cartilaginosas humanas
Gugjoo Therapeutic Applications of Mesenchymal Stem Cells in Veterinary Medicine
ES2423904T3 (es) Matrices de fibrina liofilizadas y métodos de preparación de las mismas
Jensen et al. Esophageal Tissue Engineering

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21905872

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21905872

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1