WO2022119054A1 - Dna 나노구조체를 포함하는 동결 보호용 조성물 및 그 이용방법 - Google Patents

Dna 나노구조체를 포함하는 동결 보호용 조성물 및 그 이용방법 Download PDF

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WO2022119054A1
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cells
cell
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김도년
이예담
이찬석
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고려대학교 산학협력단
서울대학교산학협력단
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    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA

Definitions

  • the present invention relates to a composition for cryoprotection comprising a DNA nanostructure and a method for using the same.
  • a cryoprotectant is a compound that, when present in solution, can reduce or inhibit ice crystal formation in solution exposed to temperatures below 0°C.
  • Current cryoprotectants include small molecules, synthetic polymers, and cryoprotectant proteins. Small molecules currently used require very high effective concentrations (eg, more than 60%) and are sometimes toxic to tissues. In addition, in the case of a protein that exists in nature, it is difficult to purify and mass-produce, so the price is very high.
  • An antifreezing protein that protects cells and tissues by preventing freezing of body fluids exists in living organisms living in a cryogenic environment.
  • Each anti-freeze protein has a unique structure, but it is known that a regular arrangement of a peptide called threonine has an effect of inhibiting crystal growth by engaging with a specific surface of an ice crystal.
  • DNA origami utilizes the complementary self-association property between the unique four bases of DNA to form a very long single DNA strand, usually called scaffold DNA, which has more than 7000 bases, and a number of methods for splicing it into a specific shape. It is a bottom-up fabrication technique to make nanostructures using short staple DNA of
  • DNA origami technology can fabricate 2D/3D nanostructures with complex shapes that cannot be made with conventional top-down fabrication techniques with high precision within a few nanometers (nm). Through this, applications such as arranging various nanomaterials precisely at desired positions are possible, and since biomolecules are used, the biocompatibility of the manufactured nanostructures is very good.
  • the cryoprotectant acts complexly inside and outside the cell.
  • the structure absorbed inside the cell inhibits the formation and growth of ice crystals inside the cell, and the structure outside the cell inhibits the formation and growth of ice crystals around the cell. At the same time, it functions to prevent cell damage by piercing the cell membrane by ice crystals outside the cell.
  • the mixing ratio with the cell culture agent is about 10% (v/v), and it is used in a very large amount and is a cytotoxic substance. Because of this, it adversely affects the cell viability and has a problem that it must be removed quickly after thawing.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • An object of the present invention is to provide a composition for cryoprotection of cells or tissues comprising DNA nanostructures.
  • An object of the present invention is to provide a composition for food cryoprotection comprising a DNA nanostructure.
  • An object of the present invention is to provide a method for cryoprotection of a cell or tissue.
  • An object of the present invention is to provide a method for freeze protection of food.
  • a scaffold nucleic acid that is folded at a predetermined position to form a plurality of strands, at least a portion of the sequence has a sequence complementary to the scaffold nucleic acid, and is bound to at least one of the strands of the scaffold nucleic acid to form a double strand a plurality of first staple nucleic acids and at least some of their sequences are complementary to, and at least not at one end of, the scaffold nucleic acid, such that they bind to at least one of the strands of the scaffold nucleic acid to form a double strand and a single strand at the ends a nucleic acid construct comprising a second staple nucleic acid;
  • composition for cryoprotection comprising a cryoprotectant peptide bound to at least one of the linkers.
  • composition of 1 above, wherein the linker is DNA, RNA, or PNA.
  • composition of the above 1, wherein the peptide consists of 1 to 10 amino acids in length.
  • composition of 4 above, wherein the amino acid is alanine or threonine.
  • composition of 1 above, wherein the nucleic acid construct comprises two or more helical bundles and a face capable of contacting the ice crystal.
  • composition for cryoprotection of cells or tissues comprising the composition of any one of 1 to 7 above.
  • composition for food freeze protection comprising the composition of any one of 1 to 7 above.
  • a method of cryoprotecting cells or tissues comprising exposing the subject cells or tissues to sub-zero temperatures in the presence of the composition of 8 above.
  • a method for freeze protection of food comprising exposing the subject food to sub-zero temperatures in the presence of the composition of 9 above.
  • composition of the present invention has an excellent cryoprotective effect on cells and tissues.
  • the survival rate of cells can be increased.
  • composition of the present invention is excellent in the cryoprotective effect of food.
  • the texture of the food can be maintained.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a case in which a scaffold nucleic acid and a staple nucleic acid are combined to form a construct.
  • A is a 4 helix bundle (rigid construction)
  • B is a 4 helix bundle (flexible construction)
  • C is a 24 helix patch construction
  • D is a 12 helix bundle (rigid construction)
  • E is a 12 helix bundle (90 degree bent construction)
  • F is a 12 helix bundle (45 degree bent structure).
  • Figure 3 shows a 4, 6, 12 helix bundle rigid structure.
  • FIG. 4 shows a flexible structure of a four-helix bundle and a flexible structure of a six-helix bundle.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing a method for measuring the RI effect.
  • 9 and 10 are RI measurement results for a solution in which unstructured single-stranded DNA exists.
  • 11 and 12 are RI measurement results of a scaffold DNA sample.
  • FIG. 13 shows a four-helix bundle rigid structure and a flexible structure.
  • 15 shows a structure of a 24-helix patch.
  • 16 shows a 12-helix bundle rigid structure and a bent structure.
  • 21 shows the growth process of ice crystals according to observation time for a 6-helix bundle rigid structure.
  • FIG. 22 shows a schematic diagram of a DNA-PNA-peptide patch.
  • AFM 24 is an atomic force microscope (AFM) image of the actual appearance of the DNA origami structure used in the experiment.
  • 25 is an agarose gel electrophoresis test result in which the stability test of the construct (peptide-free patch structure) in phosphate buffered saline (PBS) and cell culture medium (DMEM) is performed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • DMEM cell culture medium
  • 26 is a result of an agarose gel electrophoresis experiment after stability test of the construct (peptide-free patch structure) in PBS and cell culture medium.
  • FIG. 27 shows the distribution of structures absorbed inside or outside HSC-3 cells (purple: peptide patch, blue: cell nucleus).
  • 29 is a graph showing the cell viability (the same cryopreservation time as 24 hours) according to the incubation time of each origami nanostructure compared to DMSO 10%.
  • 30 is a graph showing the results of measuring cell viability after incubation for 2 hours and cryopreservation for one month.
  • the present invention relates to a composition for cryoprotection comprising a DNA nanostructure.
  • cryoprotection refers to protecting cells, tissues, food, etc. from freezing damage that may occur during cryopreservation of cells, tissues, and food.
  • freeze damage refers to damage that may occur to cells, tissues, foods, etc. when cells, tissues, and foods are frozen.
  • damage to the cell membrane by ice crystallization of water may occur.
  • the non-penetrating cryoprotectant when used, only the extracellular salt concentration is affected, and thus, a high solute concentration may cause osmotic stress in the cell membrane.
  • high concentrations of cryoprotectants required for vitrification may cause damage due to low water chemical potential or chemical toxicity.
  • the present invention is not limited thereto.
  • cryoprotection may be exhibited by a complex action of DNA nanostructures and the like inside and outside cells and tissues.
  • a structure absorbed inside a cell inhibits the formation and growth of ice crystals inside the cell
  • a structure outside the cell inhibits the formation and growth of ice crystals around the cell
  • ice crystals outside the cell prevent the formation and growth of ice crystals around the cell membrane. It means to prevent damage to cells by stabbing them.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the composition for cryoprotection may be a material used to protect a living tissue, cell or organism and food from freeze damage.
  • the composition for cryoprotection may inhibit the formation or growth of ice crystals.
  • Ice crystals can grow through ice recrystallization, which refers to the process of growing from small ice crystals to larger ice crystals, and this growth follows the Ostwald ripening mechanism. Ostwald ripening can proceed as a melting-diffusion-refreezing or sublimation-diffusion-condensation mechanism due to the pressure due to the difference in surface energy between the crystals and room temperature. In other words, the growth of ice crystals does not grow by adhering to each other, but occurs as small ice crystals melt between crystals, diffuse toward larger ice crystals, and then become part of large ice crystals and refreeze.
  • the inhibition of the growth of ice crystals refers to the action of preventing the formation of ice or slowing the rate of ice formation, preventing the recrystallization of ice, slowing the rate of ice recrystallization, or maintaining the size of the ice crystals small.
  • composition for cryoprotection of the present invention can prevent freezing of cells or tissues.
  • the effect of preventing and inhibiting freezing of cells or tissues may vary depending on the degree of icephilic properties according to the type and structure of the base constituting the DNA nanostructure included in the composition.
  • composition for cryoprotection of the present invention includes a nucleic acid construct.
  • the nucleic acid construct may be a nucleic acid origami construct.
  • the nucleic acid may be DNA, RNA or PNA. However, the present invention is not limited thereto.
  • the nucleic acid origami construct is a construct in which a predetermined portion of the scaffold nucleic acid is folded while the scaffold nucleic acid is combined with a plurality of staple nucleic acids.
  • the scaffold nucleic acid is a single-stranded nucleic acid, and its length may be appropriately selected according to the length, size, shape, etc. of the structure to be formed, and a type having a length of about 7000 to 8000 nucleotides (nt) may be used.
  • nt nucleotides
  • M13mp18 DNA of 7,249 nt length was used, but the present invention is not limited thereto.
  • the molecular weight of one construct is about 5 megadaltons, which corresponds to about 10 -20 kg, but is not limited thereto.
  • a staple nucleic acid may have a sequence in which at least a portion of the sequence is complementary to the scaffold nucleic acid, such that the scaffold nucleic acid is folded or fixed at a specific position.
  • the staple nucleic acid may be a plurality of staple nucleic acids (hereinafter, 'first staple nucleic acid') that are bound to at least one of the strands of the scaffold nucleic acid to form a double strand.
  • the staple nucleic acid has a plurality of staples that bind to at least one of the strands of the scaffold nucleic acid to form a double strand and a single strand at the ends, such that at least a portion of its sequence is complementary to the scaffold nucleic acid, and at least one end is not. It may be a nucleic acid (hereinafter, 'second staple nucleic acid').
  • the first staple nucleic acid has a sequence complementary to the scaffold nucleic acid, so that it can bind to the scaffold nucleic acid to form a double strand.
  • the second staple nucleic acid may include a portion having a sequence complementary to the scaffold nucleic acid and a portion in which at least one end (at one end) is not complementary to the scaffold nucleic acid.
  • one end may not be complementary to the scaffold nucleic acid, and both ends may not be complementary to the scaffold nucleic acid.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the staple nucleic acid may include a plurality of first staple nucleic acids alone, a plurality of second staple nucleic acids alone, or a plurality of first and second staple nucleic acids, but is not limited thereto.
  • the length of the staple nucleic acid may be appropriately selected according to the length, size, shape, etc. of the construct to be formed, for example, 20 to 50 nt, but is not limited thereto.
  • At least one end portion of the second staple nucleic acid that is not complementary to the scaffold nucleic acid in the second staple nucleic acid increases the length of a portion when designing the nucleotide sequence of the staple nucleic acid, so that the nucleotide sequence of the scaffold nucleic acid among the nucleotide sequences of the staple nucleic acid is at least One end may be a site designed to avoid complementary binding.
  • the at least one end may be exposed to one side of the nucleic acid origami.
  • this is referred to as a handle.
  • a nucleic acid origami construct is one in which a staple nucleic acid binds to a specific position of a scaffold nucleic acid and the staple nucleic acid is folded at a specific position to form a specific structure, and the staple nucleic acid is designed such that the scaffold nucleic acid has such a specific structure.
  • the design of the staple nucleic acid may be performed according to a conventional method, for example, a design program such as caDNAno may be used, but is not limited thereto.
  • Nucleic acid origami constructs can be prepared using conventional thermal annealing techniques.
  • nucleic acid strands have a melting temperature depending on the nucleotide sequence. Above this temperature, they are mainly single-stranded, and below this temperature, they mainly exist as double-stranded. After that, if the temperature of the reaction solution is slowly lowered, the nucleic acid strands begin to exist as double strands while complementary binding. struct is created.
  • the binding time is slightly different, but the normal thermal annealing technique gradually lowers the temperature over a sufficient period of time (several hours or more), which is a sufficient condition for all staple nucleic acids to bind. Regardless of the sequence, it can be manufactured to have a desired shape.
  • the scaffold nucleic acid is folded at a predetermined position to form a plurality of strands, and the staple nucleic acid has sequences designed to fold the scaffold nucleic acid at a predetermined position. to form
  • the scaffold nucleic acid strand and the staple nucleic acid may bind to form a double strand (double helix), and the nucleic acid origami construct is, for example, 2 to 50, 2 to 45, 2 to 40, 2 to 35, 2 to 30, 2 to 25 or 2 to 20, 2 to 12, 4 to 12 helix bundles, specifically, may have 4 to 12 helix bundles, but is not limited thereto.
  • 2 and 4 illustrate a nucleic acid origami construct having multiple helical bundles.
  • the linker may be bound to at least one of the single strands of the nucleic acid construct. Specifically, the linker may be bound to at least one of the single strands present at the end of the second staple nucleic acid constituting the nucleic acid construct.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the linker may be, for example, a nucleic acid at least a portion of which has a nucleotide sequence complementary to the handle, and may be, for example, a nucleic acid strand such as DNA, RNA, or PNA.
  • the linker may be a strand to which a functional material such as a fluorescent material or a peptide is additionally attached to the end thereof.
  • a functional material such as a fluorescent material or a peptide is additionally attached to the end thereof.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the connector is coupled to at least one of the handles, and may be coupled to one, a plurality, or all of the handles, but is not limited thereto.
  • the length of the linker may be appropriately selected according to the length and base configuration of the handle, the length, size, shape, etc. of the construct to be formed, for example, 5 nucleotides to 50 nucleotides, specifically 5 nucleotides to 30 nucleotides.
  • the present invention is not limited thereto.
  • cryoprotectant peptide may be a peptide bound to at least one of the above linkers.
  • the cryoprotectant peptide may bind to at least a portion of the linker. At least a part of the linker may be bound to one or a plurality of single strands of the nucleic acid construct, or bound to all or a part of the entire nucleotide sequence of one of the linkers. For example, the peptide may bind to one end of the linker, or it may bind to both ends of the linker.
  • the bond between the linker and the cryoprotectant peptide may be formed of a hydrogen bond, a covalent bond, a peptide bond, or the like. However, the present invention is not limited thereto.
  • a linker eg, a peptide nucleic acid strand (PNA) having a base complementary to the base sequence of the handle region
  • a peptide may be bound to at least one of the linkers ( hereinafter 'probe').
  • the probe may bind to a handle, which is a site designed in the process of making a nucleic acid origami construct in aqueous solution (see FIG. 24 ).
  • the peptide refers to a peptide that exhibits a cryoprotective effect.
  • the effect of inhibiting the growth of ice crystals may vary depending on the degree of icephilic properties according to the type of the peptide and the density of the peptide sequence.
  • the peptide may be a single or complex type of amino acid polymer.
  • the amino acid may have a cryoprotective effect.
  • the amino acid may be alanine or threonine, but is not limited thereto.
  • the length of the amino acid polymer may be appropriately selected according to the length and base composition of the linker, the length and base composition of the exposed single strand, the length, size, shape, etc. of the structure to be formed, for example, 1 to 20 Dog amino acids, 1 to 10 amino acids, may be 2 to 10 amino acids, but is not limited thereto.
  • cryoprotectant peptides may be arranged at regular intervals in the nucleic acid origami construct. In one embodiment of the present invention, an array of cryoprotectant peptides may be generated on one side of the nucleic acid origami sheet structure.
  • the number of cryoprotective peptides attached to the handle increases, so that the cryoprotection efficiency may be higher.
  • an origami structure having 96 cryoprotective peptides arranged at intervals of 16 nucleotides in the transverse direction on one side of the nucleic acid origami sheet structure (a construct in which cryoprotective peptides are arranged at all handle positions in FIG. 22)
  • the cell viability was higher than that of the origami construct having 48 cryoprotective peptide arrays at 32 nucleotide intervals in the transverse direction (see FIG. 29 ).
  • the construct of the present invention may be absorbed inside the cell or may wrap the cell in a form that adheres to the cell outer wall.
  • the material absorbed inside the cell can inhibit the formation and growth of ice crystals that occur inside during the cell freezing/thawing process.
  • the material absorbed inside the cell can prevent and inhibit the freezing of cells and tissues.
  • the structure attached to the outside of the cell can inhibit the formation and growth of ice crystals occurring around the cell, inhibit the penetration of the ice crystal into the cell, and protect the cell membrane from damage.
  • the structure attached to the outside of the cell can prevent and inhibit freezing of cells and tissues, and prevent damage.
  • the construct used in the present invention may have a weight/volume percent of about 0.001% to 0.03% in an aqueous solution and 0.001% to 0.003% in a cell culture solution.
  • the nucleic acid origami structure of the present invention can have an effect of inhibiting ice crystal growth even at an extremely low weight ratio. and may have a cryoprotective effect on cells or tissues. In addition, it is possible to improve the viability of cells upon thawing after cryopreservation of the cells.
  • Nucleic acid origami constructs according to the present invention may include twisted or curved helical bundles.
  • the twisting direction of a helix bundle can be controlled by insertion or deletion of bases, and a base may be inserted into the helix to twist the bundle to the right, or a base may be deleted to twist it to the left.
  • the degree of distortion can be controlled by the number of bases.
  • the number of bases to be inserted or deleted may be 1 or 2 for every 21 bases in length of the double rotation of the helix, and even if it is more, it is not particularly limited as long as there is no problem in maintaining the structure.
  • a base may be inserted into one helix of the plurality of helices and no base inserted into the other helix, or a base may be deleted to make a difference in length between the helices to make the helix bundle curved.
  • the nucleic acid origami structure may include a surface capable of contacting the ice crystal growth surface in terms of ice crystal formation or growth inhibition. It is possible to maximize the effect of ice crystal formation or growth inhibition by contacting the ice crystal growth surface with a large area in the form of a plane rather than a shape of a line. In addition, it is possible to maximize the effect of preventing freezing of cells or tissues by having a large area in the form of cotton.
  • the present invention relates to a composition for cryoprotecting cells or tissues comprising the composition.
  • the nanostructures included in the composition of the present invention may wrap food in a form that is absorbed into cells and tissues, or adheres to the outer walls of cells and tissues.
  • Materials absorbed inside cells and tissues can inhibit the formation and growth of ice crystals that occur inside during the freezing/thawing process of cells and tissues.
  • the material absorbed inside the cells and tissues can prevent and inhibit the freezing of food.
  • structures attached to the outside of cells and tissues can prevent and inhibit freezing of cells and tissues, and prevent damage.
  • composition of the present invention can be applied to all cells that are usually frozen and used for preservation, for example, prokaryotic cells; eukaryotic cells; microbe; zooblast; cancer cells, sperm; egg cell; stem cells, including adult stem cells, embryonic stem cells, and retrodifferentiated stem cells; blood cells, including cord blood, white blood cells, red blood cells, and platelets; tissue cells including, but not limited to, kidney cells, liver cells, and muscle cells.
  • tissue all tissues that are frozen and used for preservation may be applied, for example, all tissues such as cornea, kidney, heart, small intestine, pancreas, lung, liver, etc. may be used without limitation.
  • the composition of the present invention may include a preservative solution for cryopreservation of cells and tissues.
  • the preservation solution may be water, saline, PBS (phosphate buffered saline), various cell culture solutions, and the like, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may include a nucleic acid construct in an amount of 0.001 to 0.5% (w/v), specifically 0.001 to 0.03% (w/v), but is not limited thereto.
  • the nucleic acid origami structure of the present invention can have an effect of inhibiting ice crystal growth even at an extremely low content. It may be more advantageous for preservation. In addition, it is possible to improve the viability of cells upon thawing after cryopreservation of the cells.
  • the present invention relates to a method for cryoprotection of a cell or tissue comprising the step of exposing a subject cell or tissue to a sub-zero temperature in the presence of the composition.
  • the target cell or tissue When the target cell or tissue is frozen in the presence of the composition, it is possible to prevent damage to the cell or tissue by inhibiting ice recrystallization during subsequent thawing. In addition, it is possible to improve the viability of cells upon thawing after cryopreservation of the cells.
  • the present invention relates to a food cryoprotection composition comprising the composition, and to a food cryoprotection method comprising the step of exposing the food to a sub-zero temperature in the presence of the composition.
  • composition of the present invention can be applied to all frozen foods, and when used, it is possible to minimize the decrease in the texture of the food when thawing.
  • the structure of the present invention can be absorbed into the food or wrap the food in a form that sticks to the outer wall of the food.
  • the material absorbed into the food can inhibit the formation and growth of ice crystals that occur inside during the freezing/thawing process of food.
  • the material absorbed into the food can prevent and suppress the freezing of the food.
  • the structure attached to the outside of the food can prevent and suppress the freezing of the food, and prevent damage.
  • a commonly known splat cooling experimental technique was used (see FIG. 6 ).
  • the solution touches the cover glass, it rapidly cools, spreads thinly and freezes, and a large number of very small ice crystals are generated due to the rapid cooling.
  • the cover glass is moved to a cold stage, which is perforated and can be observed under an optical microscope.
  • the cold stage is maintained at -6°C, and the small crystals gradually coalesce for 30 minutes and the growth of ice grains is observed. Thereafter, the size of the ice crystals is measured and compared to the control group (a sample with only a solution without an anti-freeze material), how less ice crystals have grown.
  • RI measurement experiment was performed on a buffer solution containing only MgCl 2 in pure distilled water, and it was confirmed that ice crystal growth was inhibited as the ion concentration increased (see FIGS. 7 and 8 ). Based on the results of this experiment, the MgCl 2 concentration of the reference buffer solution in subsequent experiments was 5 mmol (mM). The RI performance of the sample was measured by comparing the relative RI performance of the sample to the reference buffer, and a smaller value means higher RI performance.
  • RI measurement experiment was performed on a solution in which unstructured single-stranded DNA was present.
  • the concentration of DNA used in the experiment was 50 to 200 ng/uL, similar to the concentration of a DNA construct made through a conventional manufacturing process.
  • As a result of measuring the RI performance of samples in which 169 kinds of staple DNA constituting the 6-Helix bundle rigid structure were mixed in a single-stranded state it was observed that the RI performance was between 0.87 and 1.0, and almost no effect of inhibiting ice crystal growth compared to the buffer (Fig. 9 and see 10).
  • the DNA strand has an effect of aggregating Mg 2+ ions, macroscopically, the RI effect hardly occurs because Mg 2+ ions cannot be held unless a structure having a certain shape and rigidity is formed in an aqueous solution. It was confirmed experimentally that it does not.
  • the RI value of the scaffold DNA sample performed in the same way was measured to be about 0.7 at most (see FIGS. 11 and 12 ).
  • the reason that scaffold DNA has slightly higher RI performance compared to staple DNA is that, due to the nature of long scaffold DNA, the entire region does not exist in a single-stranded state, but a part of it has complementarity with each other and is a secondary binding double-stranded DNA. It is presumed that this is because the structure (secondary structure) is formed.
  • the nine constructs designed as examples of the DNA origami technique are (1) 4 helix bundle rigid structure, (2) 4 helix bundle flexible structure (gap 5nt), (3) 6 helix bundle rigid structure, (4) 6 helix bundle flexible structure Structure (Gap 3nt), (5) 6 Helix Bundle Flexible Structure (Gap 5nt), (6) 24 Helix Patch, (7) 12 Helix Bundle Rigid Structure, (8) 12 Helix Bundle Bent Structure (90°), (9) ) 12 helix bundles are curved structures (45°).
  • the design method for each structure is as follows.
  • Constructs (1) and (2) have a cross section of four double-stranded DNAs, and are packed in a square shape with a side of about 4.5 nm ( FIG. 13 ). Based on the length of about 192 nt, it has a structure in which the same type of connection is repeated, and the total length of the structure is about 600 nm.
  • the rigid structure of (1) is designed so that both ends of all staple DNAs present in the structure are in direct contact, and the flexible structure of (2) consists of 5nt ssDNA between both ends of 150 adjacent staple DNAs.
  • (3), (4), and (5) constructs are composed of six double-stranded DNA cross-sections and are packed in a hexagonal shape (see FIG. 14 ). Based on the length of about 168 nt, it has a structure in which the same type of connection is repeated, and the total length of the structure is about 400 nm.
  • the rigid structure of (3) is designed so that both ends of all the staple DNAs present in the structure are in direct contact, and in the flexible structures of (4) and (5), between the ends of 169 adjacent staple DNAs are 3 nt and 5 nt, respectively. It is made up of ssDNA.
  • Construct (6) has a cross-section composed of twenty-four double-stranded DNA, arranged in a straight line to form a sheet (see FIG. 15).
  • the length of the structure is 256 nt, about 90 nm, and the width is about 55 nm. All ends of the 192 staple DNA present in the construct were designed to directly abut.
  • Constructs (7), (8), and (9) have a cross section of twelve double-stranded DNAs, and are packed in a hexagonal lattice shape (see FIG. 16 ).
  • the rigid structure (7) was designed so that all ends of 180 staple DNAs were in direct contact.
  • constructs (8) and (9) 11 staple DNAs present in the middle of the structure were removed to make a 42 nt flexible region, and the DNA connecting both ends of the structure was shortened to 357 nt and 189 nt, respectively. The center was bent at 90 degrees and 45 degrees.
  • the manufacturing process of the DNA origami structure was performed by mixing the raw materials and buffer together and heating to 80°C, then lowering the temperature to 65°C over 1 hour, and then using a thermal annealing technique in which the temperature was lowered by 1°C per 1°C hour until 25. .
  • a thermal annealing technique in which the temperature was lowered by 1°C per 1°C hour until 25.
  • excess unreacted material was filtered out using Amicon's centrifugal purification filter. After purification, the concentration of the structure was measured using absorbance at a wavelength of 260 nm, and the target concentration was adjusted by diluting through a buffer.
  • the shape of the structure made according to the above design was measured through an atomic force microscope (refer to the first thermal images in FIGS. 17, 18 and 19).
  • a maximum RI value of 0.53 was measured (see FIG. 20).
  • the rest of the samples showed higher RI performance compared to the 4-helix bundle (samples 1 and 2) with the narrowest cross-sectional area, and the higher the concentration of the structure, the higher the overall RI performance was.
  • composition including the DNA construct in which the cations are aggregated can exert a higher effect of inhibiting the growth of ice crystals compared to the DNA in which the construct is not formed.
  • the DNA-PNA-peptide construct was designed to have scaffold DNA, staple DNA, handle, Cy3 dye, and a PNA-peptide binding site (see FIG. 22 ).
  • scaffold DNA which is all nucleic acid materials constituting the construct, staple DNA including handles, and PNA-peptide were mixed simultaneously.
  • a DNA-PNA-peptide structure with a PNA-peptide probe attached to the handle portion of the DNA origami was formed through the same thermal annealing process as in the preparation of the DNA origami structure.
  • the purification process of the formed DNA-PNA-peptide construct was also performed in the same manner as in the DNA origami construct.
  • Examples of the present invention were carried out using HSC-3 cells, which are cancer cells.
  • the concentration of the nucleic acid origami construct used in the experiment was 100ng/uL and 200ng/uL, and when a peptide probe was attached, the maximum was 300ng/uL.
  • the cell culture solution and the cryoprotectant material were mixed in a volume ratio of 9:1, and the concentration of the final material used for the cell experiment was from 10 ng/uL to 30 ng/uL.
  • cryoprotection effect of the structure itself was measured without a peptide probe on the nucleic acid origami structure, and then cryoprotection of the DNA-peptide composite material using the PNA probe with the cryoprotective peptides alanine and threonine attached.
  • a performance measurement experiment was conducted.
  • the shape of the nucleic acid origami used to confirm the cytoprotective performance was (1) 4-helix bundle structure, (2) 6-helix bundle structure, (3) 12-helix bundle structure), (4) 24-helix patch structure, and the above design
  • the shape of the structure made according to the method was measured through an atomic force microscope (see FIG. 24).
  • the DNA construct was mixed in 10% phosphate-buffered saline (PBS) and DMEM cell culture in a 9:1 ratio for up to 8 h at 37 Incubated at °C.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Hoechst 33258 was used for cell nucleus staining with a fluorescent label, and Cy3 was used for DNA origami material. Nuclei are shown in blue, and origami locations are shown in magenta.
  • the solution containing the DNA-PNA-peptide patch was mixed with 10% of the cell culture solution and incubated, and observed immediately after incubation, after 1 hour, and after 2 hours. It was confirmed that the amount of patches present in the
  • the cell viability showed a tendency to increase according to the incubation time.
  • the single-layered patch structure showed the best cell protection performance, which is believed to be due to the fact that the material has the largest cross-sectional area to volume ratio and the structure is flexible, which effectively interacts with the cell membrane to show cryoprotection performance.
  • cell viability was measured by thawing after cryopreservation at liquid nitrogen temperature for one month to confirm the cell viability during cryopreservation for longer than 24 hours (FIG. 30) Reference).
  • cryopreservatives using origami structures can be used for long-term cryopreservation.
  • the RI performance measurement experiment of the material inside the cell was performed at -6 °C for 30 minutes. After staining the cell nuclear part (blue staining), cytoplasmic part (green), and cell membrane part (red), the characteristics according to temperature change were observed through a fluorescence microscope.
  • the control PBS buffer
  • the size of the ice crystals inside the cell increased rapidly during the RI measurement process, and hardly remained after thawing, confirming that most of the cytoplasm disappeared due to cell damage.

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Abstract

본 발명은 기결정된 위치에서 접혀 복수개의 가닥을 이룬 스캐폴드 핵산, 및 적어도 일부가 상기 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 가져, 상기 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥을 형성하는 복수개의 스테이플 핵산을 포함하는 핵산 구조체, 핵산 구조체의 적어도 일부에 결합된 연결자 및 연결자의 적어도 일부에 결합된 펩타이드를 포함함으로써, 동결 보호 효과가 우수하여, 세포 및 조직의 동결 보존 시에 세포의 생존률을 높일 수 있으며, 식품의 동결에 사용시에도 그 식품의 식감을 유지할 수 있도록 하는 동결 보호용 조성물에 관한 것이다.

Description

DNA 나노구조체를 포함하는 동결 보호용 조성물 및 그 이용방법
본 발명은 DNA 나노구조체를 포함하는 동결 보호용 조성물 및 그 이용방법에 관한 것이다.
동결 방지 소재는 용액에 존재할 때 0℃ 아래의 온도에 노출된 용액에서 얼음 결정 형성을 감소 또는 저해시킬 수 있는 화합물이다. 현재의 동결 방지 소재는 소분자, 합성 폴리머, 및 동결방지제 단백질을 포함한다. 현재 사용하는 소분자의 경우 매우 높은 유효 농도를 요구하여(가령 60% 이상) 조직 독성이 있는 경우가 있다. 또한 자연에 존재하는 단백질의 경우 정제 및 대량생산이 어려워 가격이 매우 높은 한계점을 가진다.
극저온의 환경에서 살아가는 생명체에는 체액의 동결을 방지하여 세포 및 조직을 보호하는 동결 방지 단백질(antifreezing protein)이 존재한다. 동결 방지 단백질은 저마다 고유한 구조를 갖고 있으나, 트레오닌(threonine)이라는 펩타이드의 규칙적인 배열이 얼음 결정의 특정 면과 맞물리면서 결정의 성장을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
DNA 오리가미는 DNA의 고유한 네 가지 염기 사이의 상보적인 자가결합 특성을 이용하여, 통상 7000개 이상의 염기를 가진 스캐폴드(scaffold) DNA라 불리는 매우 긴 단일 DNA 가닥과 이를 특정한 형상으로 접합시키기 위한 다수의 짧은 스테이플DNA(staple DNA)를 사용하여 나노구조물을 만드는 상향식(bottom-up) 제작기법이다.
DNA 오리가미 기술은 수 나노미터(nm) 이내의 높은 정밀도로 기존의 하향식 제작기법으로 만들 수 없는 복잡한 형상의 2차원/3차원 나노구조물을 제작할 수 있다. 이를 통해 다양한 나노재료들을 원하는 위치에 정밀하게 배열하는 등의 응용이 가능하며, 또한 생체분자를 이용하므로 제작된 나노구조물의 생체적합성이 매우 우수하다.
동결보호제는 세포 내부 및 외부에서 복합적으로 작용하는데, 세포 내부에 흡수된 구조체는 세포 내부 얼음 결정의 형성 및 성장을 억제하고, 세포 외부에 있는 구조체는 세포 주위의 얼음 결정의 형성 및 성장을 억제함과 동시에 세포 외부의 얼음 결정이 세포막을 찔러 세포가 손상되는 것을 방지하는 기능을 한다.
한편, 상용하는 세포 동결보존제로 널리 사용되는 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)의 경우 세포배양약과의 혼합비율이 10% (v/v) 정도로 매우 많은 양을 사용하며, 세포 독성을 가진 물질이기 때문에 세포 생존률에 악영향을 주며 해동 이후 빠른 시간 안에 제거해야 하는 문제가 있다.
또한 DNA 오리가미 소재가 세포 독성이 발생하지 않는다는 것에 대해서는 선행 연구가 존재하나, 동결 방지 성능을 가진 펩타이드가 결합되어 있는 경우의 세포 독성 여부 및 다양한 세포에 대한 세포독성 여부는 아직 밝혀지지 않은 부분이 있어, 상용화를 위해서는 위 부분에 대한 평가가 추가로 필요하다.
본 발명은 DNA 나노구조체를 포함하는 세포 또는 조직 동결 보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 DNA 나노구조체를 포함하는 식품 동결 보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 세포 또는 조직의 동결 보호 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 식품의 동결 보호 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 기결정된 위치에서 접혀 복수개의 가닥을 이룬 스캐폴드 핵산, 그 서열 중 적어도 일부가 상기 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 가져, 상기 스캐폴드 핵산의 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥을 형성하는 복수개의 제1 스테이플 핵산 및 그 서열 중 적어도 일부는 상기 스캐폴드 핵산과 상보적이고, 적어도 일단은 그렇지 않아, 상기 스캐폴드 핵산의 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥 및 말단에 단일 가닥을 형성하는 복수개의 제2 스테이플 핵산을 포함하는 핵산 구조체;
상기 핵산 구조체의 단일 가닥 중 적어도 하나에 결합된 연결자; 및
상기 연결자 중 적어도 하나에 결합된 동결 방지 펩타이드를 포함하는 동결 보호용 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 연결자는 DNA, RNA, 또는 PNA인, 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 연결자는 길이가 5 뉴클레오티드 내지 20 뉴클레오티드인, 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 펩타이드는 길이가 1 내지 10 아미노산으로 이루어진 것인, 조성물.
5. 위 4에 있어서, 상기 아미노산은 알라닌 또는 트레오닌인, 조성물.
6. 위 1에 있어서, 상기 핵산 구조체는 2개 이상의 나선 다발을 포함하면서, 얼음 결정과 접촉할 수 있는 면을 포함하는, 조성물.
7. 위 1에 있어서, 상기 핵산 구조체는 비틀림을 갖거나 곡선의 나선 다발을 포함하는, 조성물.
8. 위 1 내지 7 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 세포 또는 조직 동결 보호용 조성물.
9. 위 1 내지 7 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 식품 동결 보호용 조성물.
10. 위 8의 조성물 존재 하에 대상 세포 또는 조직을 영하의 온도에 노출시키는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직의 동결 보호 방법.
11. 위 9의 조성물 존재 하에 대상 식품을 영하의 온도에 노출시키는 단계를 포함하는, 식품의 동결 보호 방법.
본 발명의 조성물은 세포 및 조직의 동결 보호 효과가 우수하다.
본 발명의 조성물을 이용하여 세포 동결 보존 시, 세포의 생존률을 높일 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품의 동결 보호 효과가 우수하다.
본 발명의 조성물을 이용하여 식품 동결 시, 상기 식품의 식감을 유지할 수 있다.
도 1은 스캐폴드 핵산과 스테이플 핵산이 결합하여 구조체를 형성하는 경우를 나타낸 도면이다.
도 2는 여러 핵산 오리가미 구조체를 도시한 것이다. A는 4 나선 다발 (견고 구조), B는 4 나선 다발(유연구조), C는 24나선 패치 구조, D는 12 나선 다발(견고구조), E는 12 나선 다발(90도 굽은 구조), F는 12 나선 다발(45도 굽은 구조)이다.
도 3은 4, 6, 12 나선 다발 견고 구조를 도시한 것이다.
도 4는 4 나선 다발 유연구조, 6 나선 다발 유연구조를 도시한 것이다.
도 5는 갭을 갖는, 또는 갖지 않는 오리가미 구조체를 도시한 것이다.
도 6은 RI 효과 측정 방법을 나타낸 개략도이다.
도 7 및 8은 순수한 증류수에 MgCl 2만 함유된 버퍼 용액에 대한 RI 측정 결과이다.
도 9 및 10은 구조화되지 않은 단일 가닥 상태의 DNA가 존재하는 용액에 대한 RI 측정 결과이다.
도 11 및 12는 스캐폴드 DNA 시료의 RI 측정 결과이다.
도 13은 4헬릭스 번들 견고 구조 및 유연 구조를 나타낸 것이다.
도 14는 6헬릭스 번들 견고 구조 및 유연 구조를 나타낸 것이다.
도 15는 24헬릭스 패치 구조를 나타낸 것이다.
도 16은 12헬릭스 번들 견고 구조 및 굽은 구조를 나타낸 것이다.
도 17 내지 20은 DNA 오리가미 구조체의 RI 효과를 나타낸 것이다.
도 21은 6헬릭스 번들 견고 구조에 대해, 관찰 시간에 따른 얼음 결정의 성장 과정을 나타낸 것이다.
도 22는 DNA-PNA-펩타이드 패치의 설계도를 나타낸다.
도 23은 완성된 DNA-PNA-펩타이드 패치의 아가로스 젤 전기영동 결과를 나타낸다.
도 24는 실험에 사용된 DNA 오리가미 구조체의 실제 모습을 원자힘현미경(AFM) 이미지로 관찰한 결과이다.
도 25는 인산완충생리식염수(PBS) 및 세포배양액(DMEM) 속에서 구조체(펩타이드 없는 패치 구조)의 안정성 테스트를 한 아가로스 젤 전기영동 실험 결과이다.
도 26은 PBS 및 세포배양액 속에서 구조체(펩타이드 없는 패치 구조)의 안정성 테스트 후 아가로스 젤 전기영동 실험을 한 결과이다.
도 27은 HSC-3 세포 내부에 흡수되었거나 외부에 흡착된 구조체 분포를 나타낸다(보라색: 펩타이드 패치, 파란색: 세포핵).
도 28은 DNA 패치 또는 대조군(PBS 버퍼)를 포함하는 경우에 동결 후 해동시 세포 보호 성능을 관찰한 결과이다.
도 29는 DMSO 10% 대비, 각 오리가미 나노구조체의 인큐베이션 시간에 따른 세포생존율(동결보존 시간은 24시간으로 동일)을 나타낸 그래프이다.
도 30은 2시간 동안 인큐베이션 및 한 달 동안 동결 보존 후 세포생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 31은 DNA 오리가미의 동결 보호 효과를 In-situ 에서 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 DNA 나노구조체를 포함하는 동결 보호용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 동결 보호란 세포, 조직 및 식품 등의 동결 보존시에 일어날 수 있는 동결 손상으로부터 상기 세포, 조직 및 식품 등을 보호하는 것을 말한다.
본 발명에서 동결 손상이란 세포, 조직 및 식품 등이 동결되는 경우, 상기 세포, 조직 및 식품 등에 발생할 수 있는 손상을 말한다. 예를 들어, 물의 얼음 결정화에 의한 세포막의 손상이 일어날 수 있다. 또한, 비침투성 동결보호제를 사용하는 경우 오직 세포외 염분 농도만이 영향받으므로, 이에 따른 높은 용질 농도는 세포막에 삼투성 스트레스(osmotic stress)를 야기할 수 있다. 그리고 유리화 과정에 필요한 고농도의 동결보호 제제가 낮은 물 화학 퍼텐셜 또는 화학 독성에 의한 손상을 야기할 수도 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 동결 보호는 DNA 나노구조체 등이 세포 및 조직의 내부 및 외부에서 복합적으로 작용하여 나타날 수 있다. 예를 들어, 세포 내부에 흡수된 구조체는 세포 내부 얼음 결정의 형성 및 성장을 억제하고, 세포 외부에 있는 구조체는 세포 주위의 얼음 결정의 형성 및 성장을 억제함과 동시에 세포 외부의 얼음 결정이 세포막을 찔러 세포가 손상되는 것을 방지하는 것을 말한다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 동결 보호용 조성물은 생체 조직, 세포 또는 유기체 및 식품을 동결 손상으로부터 보호하기 위해 사용되는 물질일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 동결 보호용 조성물은 얼음 결정의 형성 또는 성장을 억제할 수 있다.
얼음 결정은 얼음 재결정화를 통해 성장할 수 있는데, 이는 작은 얼음 결정으로부터 더 큰 얼음 결정으로 성장하는 과정을 의미하고, 이 성장은 오스왈드 숙성(Ostwald ripening) 메커니즘을 따라 일어난다. 오스왈드 숙성(Ostwald ripening)은 상온 및 결정 사이 표면 에너지 차이로 인한 압력으로 인해 융해-확산-재동결 또는 승화-확산-응축 메커니즘으로 진행될 수 있다. 다시 말하자면, 얼음 결정의 성장은 얼음끼리 붙어서 성장하는 것이 아니라, 작은 얼음 결정이 결정 사이에서 융해되어 큰 얼음 결정 쪽으로 확산된 후 큰 얼음 결정의 일부가 되어 재동결되면서 일어나게 된다.
얼음 결정의 성장 억제는 얼음이 형성되지 않도록 하거나 얼음 형성 속도를 늦추거나, 얼음의 재결정화가 되지 않도록 하거나, 얼음 재결정화 속도를 늦추거나, 얼음 결정의 크기를 작게 유지하는 작용을 의미한다.
본 발명의 동결 보호용 조성물은 세포 또는 조직의 동결을 방지할 수 있다. 또한, 세포의 동결 보존 후 해동시에 세포의 생존률을 향상시킬 수 있다.
상기 조성물에 포함된 DNA 나노구조체를 구성하는 염기의 종류, 구조 등에 따른 얼음친화적(icephilic) 성질의 정도에 따라 세포 또는 조직의 동결을 방지 및 억제하는 효과가 달라질 수 있다.
본 발명의 동결 보호용 조성물은 핵산 구조체를 포함한다.
핵산 구조체는 핵산 오리가미 구조체일 수 있다.
핵산은 DNA, RNA 또는 PNA일 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
핵산 오리가미 구조체는 도 1에 예시된 바와 같이, 스캐폴드 핵산이 복수개의 스테이플 핵산과 결합하면서, 스캐폴드 핵산의 소정 부분이 접혀 형성되는 구조체이다.
스캐폴드 핵산은 단일가닥의 핵산으로서 그 길이는 형성하고자 하는 구조체의 길이, 크기, 모양 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 통상적으로 7000 내지 8000 뉴클레오티드(nt) 정도의 길이를 가진 종류를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 7,249nt 길이의 M13mp18 DNA를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. M13mp18 스캐폴드 DNA를 사용하여 DNA 구조체를 제작한 경우, 만들어진 구조체 하나의 분자량은 약 5 메가달턴이며, 이는 약 10 -20 kg에 상응하나 이에 제한되는 것은 아니다.
스테이플 핵산은 그 서열 중 적어도 일부가 상기 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 가져, 스캐폴드 핵산이 특정 위치에서 접히거나 고정되도록 할 수 있다.
본 발명에서 스테이플 핵산은 상기 스캐폴드 핵산의 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥을 형성하는 복수개의 스테이플 핵산(이하 '제1 스테이플 핵산') 일 수 있다. 또한, 스테이플 핵산은 그 서열 중 적어도 일부는 상기 스캐폴드 핵산과 상보적이고, 적어도 일단은 그렇지 않아, 상기 스캐폴드 핵산의 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥 및 말단에 단일 가닥을 형성하는 복수개의 스테이플 핵산(이하 '제2 스테이플 핵산') 일 수 있다.
제1 스테이플 핵산은 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 가져, 스캐폴드 핵산과 결합하여 이중 가닥을 형성할 수 있다.
제2 스테이플 핵산은 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 갖는 부분 및 적어도 한 쪽 말단(일단)이 스캐폴드 핵산과 상보적이지 않은 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일단이 스캐폴드 핵산과 상보적이지 않을 수 있고, 양단이 스캐폴드 핵산과 상보적이지 않을 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 스테이플 핵산은 복수개의 제1 스테이플 핵산 단독, 복수개의 제2 스테이플 핵산 단독, 또는 복수개의 제1 및 제2 스테이플 핵산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
스테이플 핵산은 그 길이는 형성하고자 하는 구조체의 길이, 크기, 모양 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 예를 들면 20 내지 50nt일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 제2 스테이플 핵산에서 스캐폴드 핵산과 상보적이지 않은 적어도 일단 부분은 스테이플 핵산의 염기서열의 설계시에 일부의 길이를 늘려, 스테이플 핵산의 염기서열 중 스캐폴드 핵산의 염기서열과 적어도 일단이 상보적인 결합을 하지 않도록 설계된 부위일 수 있다. 제2 스테이플 핵산이 스캐폴드 핵산과 결합하면 상기 적어도 일단은 핵산 오리가미 한쪽 면에 노출될 수 있다. 이하 이를 핸들이라 칭한다. 핵산 오리가미 구조체는 스테이플 핵산이 스캐폴드 핵산의 특정 위치에 결합하여 스테이플 핵산이 특정 위치에서 접혀 특정의 구조체를 형성하는 것으로서, 스테이플 핵산은 스캐폴드 핵산이 그러한 특정 구조체를 갖도록 설계된다.
스테이플 핵산의 설계는 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들면 caDNAno 등의 디자인 프로그램을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
핵산 오리가미 구조체는 통상의 열풀림(thermal annealing) 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
이는 원재료인 스캐폴드 핵산과 스테이플 핵산을 고온(예를 들어 80~95℃)으로 가열하여 모든 핵산 가닥이 단일가닥 상태로 있도록 만들어 주는 것으로 시작한다. 핵산 가닥은 염기서열에 따라 녹는점(melting temperature)이 존재하며 이 온도 이상이면 주로 단일가닥, 이하일 경우 주로 이중가닥으로 존재하게 된다. 이후 반응 용액의 온도를 천천히 낮춰주게 되면, 핵산 가닥이 상보적으로 결합하면서 이중가닥으로 존재하기 시작하며, 핵산 오리가미에서는 200개 정도의 스테이플 핵산이 협력적으로 결합하면서 설계했던 위치에 결합, 원하는 형상의 구조체가 생성된다.
스테이플 핵산마다 염기서열이 다르므로 결합 시점은 조금씩 다르지만 통상의 열풀림 기법은 충분한 시간(수 시간 이상)에 걸쳐 서서히 온도를 낮추기 때문에 모든 스테이플 핵산이 결합하기 충분한 조건이며, 따라서 구성하는 스테이플 핵산의 염기서열과 무관하게 원하는 형상을 갖도록 제작할 수 있다.
스캐폴드 핵산은 기결정된 위치에서 접혀 복수개의 가닥을 이루고, 스테이플 핵산은 스캐폴드 핵산이 기결정된 위치에서 접히도록 설계된 서열들을 갖는 것으로서, 상기 방법으로 스캐폴드 핵산에 결합하면서 스캐폴드 핵산이 소정의 구조를 형성하도록 한다.
스캐폴드 핵산 가닥과 스테이플 핵산이 결합하여 이중 가닥(이중 나선)을 이룰 수 있는데, 핵산 오리가미 구조체는 예를 들면 2 내지 50, 2 내지 45, 2 내지 40, 2 내지 35, 2 내지 30, 2 내지 25 또는 2 내지 20, 2 내지 12, 4 내지 12 나선 다발(helix bundle)을 가질 수 있고, 구체적으로는 4 나선 다발 내지 12 나선 다발을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 도 2 및 4에는 여러 개의 나선 다발을 갖는 핵산 오리가미 구조체가 예시되어 있다.
연결자는 핵산 구조체의 단일 가닥 중 적어도 하나에 결합될 수 있다. 구체적으로 연결자는 핵산 구조체를 이루는 제 2 스테이플 핵산의 말단에 존재하는 단일 가닥 중 적어도 하나에 결합될 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
연결자는 예를 들면 적어도 일부가 상기 핸들에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산일 수 있고, 예를 들면, DNA, RNA, PNA 등의 핵산 가닥일 수 있다. 연결자는 그 말단에 형광물질, 펩타이드 등의 기능성 물질이 추가로 부착되어 있는 가닥일 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
연결자는 상기 핸들 중 적어도 하나에 결합되는 것으로서, 하나 또는 복수개 또는 모든 핸들에 다 결합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 연결자의 길이는 상기 핸들의 길이 및 염기 구성, 형성하고자 하는 구조체의 길이, 크기, 모양 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 예를 들면, 5 뉴클레오티드 내지 50 뉴클레오티드, 구체적으로 5 뉴클레오티드 내지 30 뉴클레오티드 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 동결 방지 펩타이드는 상기 연결자 중 적어도 하나에 결합된 펩타이드일 수 있다.
상기 동결 방지 펩타이드는 연결자의 적어도 일부에 결합할 수 있다. 상기 연결자의 적어도 일부란, 핵산 구조체의 단일 가닥 중 하나 또는 복수개에 결합된 경우, 또는 상기 연결자 중 하나의 전체 염기서열 중 전체 또는 일부에 결합된 경우일 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드는 연결자 일단에 결합할 수 있으며, 또는 상기 연결자의 양단에 결합할 수 있다. 상기 연결자와 동결 방지 펩타이드 간의 결합은 수소 결합, 공유 결합, 펩타이드 결합 등으로 이루어질 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 핸들 부위의 염기서열과 상보적인 염기를 갖는 연결자(예를 들어, 펩타이드 핵산 가닥(PNA))를 설계하고, 상기 연결자 중 적어도 하나에 펩타이드를 결합시킬 수 있다(이하 ‘프로브’). 상기 프로브는 수용액 상에서 핵산 오리가미 구조체가 만들어지는 과정에서 설계된 부위인 핸들에 결합할 수 있다(도 24 참조).
본 발명에서 펩타이드는 동결 방지 효과를 나타내는 펩타이드를 말한다. 상기 펩타이드의 종류에 따른 얼음친화적(icephilic) 성질의 정도 및 상기 펩타이드 배열의 밀도에 따라 얼음 결정의 성장을 억제하는 효과가 달라질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 펩타이드는 단일 또는 복합 종류의 아미노산 중합체 일 수 있다. 상기 아미노산은 동결 방지 효과를 가지는 것 일 수 있다. 예를 들어, 상기 아미노산은 알라닌(alanine) 또는 트레오닌(threonine) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 아미노산 중합체의 길이는 상기 연결자의 길이 및 염기 구성, 상기 노출된 단일 가닥의 길이 및 염기 구성, 형성하고자 하는 구조체의 길이, 크기, 모양 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 예를 들면 1개 내지 20개 아미노산, 1개 내지 10개 아미노산, 2개 내지 10개 아미노산 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 핵산 오리가미 구조체에는 일정한 간격으로 동결 방지 펩타이드가 배열되어 있을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 핵산 오리가미 시트 구조의 한쪽 면에 동결 방지 펩타이드의 배열이 생성될 수 있다.
본 발명에서 오리가미 구조체가 더 많은 핸들 개수를 가질수록, 상기 핸들에 부착되는 동결 방지 펩타이드의 수가 증가하여, 동결 방지 효율이 더 높을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 핵산 오리가미 시트 구조의 한쪽 면에 횡 방향으로 16 뉴클레오티드 간격으로 96개의 동결 방지 펩타이드 배열을 가진 오리가미 구조체(도 22의 모든 핸들 위치 부분에 동결 방지 펩타이드가 배열된 구조체)의 경우, 횡 방향으로 32 뉴클레오티드 간격으로 48개의 동결 방지 펩타이드 배열을 가진 오리가미 구조체에 비해 세포생존율이 더 높았다(도 29 참조).
본 발명의 구조체는 세포 내부에 흡수되거나, 세포 외벽에 달라붙는 형태로 세포를 감쌀 수 있다. 세포 내부에 흡수된 소재는 세포의 냉/해동 과정에서 내부에서 발생하는 얼음 결정의 형성 및 성장을 억제할 수 있다. 또한, 세포 내부에 흡수된 소재는 세포 및 조직의 동결을 방지 및 억제할 수 있다. 또한, 세포의 동결 보존 후 해동시에 세포의 생존률을 향상시킬 수 있다.
세포 외부에 붙은 구조체는 세포 주위에서 발생하는 얼음 결정의 형성 및 성장을 억제하고, 얼음 결정의 세포 내부로의 침투를 억제하고, 세포막의 손상을 보호할 수 있다. 또한, 세포 외부에 붙은 구조체는 세포 및 조직의 동결을 방지 및 억제하고, 손상을 방지할 수 있다. 또한, 세포의 동결 보존 후 해동시에 세포의 생존률을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 사용된 구조체는 수용액 상에서 약 0.001% 내지 0.03%, 세포 배양액 상에서 0.001% 내지 0.003%의 무게/부피비(weight/volume percent)를 가질 수 있다.
기존의 조직 보존 과정에서 사용되는 침투성 소분자가 수십 퍼센트에 이르는 높은 무게/부피비(weight/volume percent)를 요구하는 것에 비해, 본 발명의 핵산 오리가미 구조체는 월등히 낮은 무게비에서도 얼음 결정 성장 억제 효과를 가질 수 있으며, 세포 또는 조직의 동결 방지 효과를 가질 수 있다. 또한, 세포의 동결 보존 후 해동시에 세포의 생존률을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 오리가미 구조체는 비틀림을 가지거나 곡선인 나선 다발을 포함할 수 있다.
예를 들면 나선 다발의 비틀리는 방향은 염기의 삽입 또는 결실로 조절될 수 있는 것으로, 나선에 염기가 삽입되어 다발이 오른쪽 방향으로 뒤틀리거나, 염기가 결실되어 왼쪽 방향으로 뒤틀릴 수 있다. 뒤틀리는 정도는 염기의 개수로 조절될 수 있다. 삽입 또는 결실되는 염기의 수는 나선이 두 번 회전하는 매 21염기 길이당 1개 또는 2개일 수 있고, 그 이상인 경우라도 구조가 유지되는 데에 문제가 없다면 특별히 제한되지 않는다.
또한, 예를 들면 복수개의 나선 중 일측의 나선에는 염기를 삽입하고, 타측의 나선에는 염기를 삽입하지 않거나, 염기를 결실시켜, 나선 간 길이 차이가 나도록 하여 나선 다발이 곡선이 되도록 할 수 있다.
또한, 핵산 오리가미 구조체는 얼음 결정 생성 또는 성장 억제 측면에서 얼음 결정 성장면과 접촉할 수 있는 면을 포함할 수 있다. 선의 형태가 아닌, 면의 형태로 넓은 면적으로 얼음 결정 성장면과 접촉하여 얼음 결정 생성 또는 성장 억제 효과를 극대화할 수 있다. 또한, 면의 형태로 넓은 면적을 가져 세포 또는 조직의 동결 방지 효과를 극대화할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 세포 또는 조직 동결 보호용 조성물에 관한 것이다.
세포 또는 조직의 동결 보존하면, 이후 사용하고자 할 때 동결된 세포 또는 조직을 녹이는 과정에서 얼음 재결정화는 세포막을 손상시키고 세포 탈수를 진행시킴으로 인해 세포 및 조직에 손상을 입힌다. 저온 환경에 사는 유기체들은 얼음 재결정화로 인해 더 쉽게 손상을 받을 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함된 나노구조체는 세포 및 조직의 내부에 흡수되거나, 세포 및 조직 외벽에 달라붙는 형태로 식품을 감쌀 수 있다. 세포 및 조직 내부에 흡수된 소재는 세포 및 조직의 냉/해동 과정에서 내부에서 발생하는 얼음 결정의 형성 및 성장을 억제할 수 있다. 또한, 세포 및 조직 내부에 흡수된 소재는 식품의 동결을 방지 및 억제할 수 있다. 또한, 세포 및 조직 외부에 붙은 구조체는 세포 및 조직의 동결을 방지 및 억제하고, 손상을 방지할 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상 보존을 위해 동결하여 사용하는 모든 세포가 그 적용대상이 될 수 있으며, 예를 들면 원핵 세포; 진핵 세포; 미생물; 동물 세포; 암 세포, 정자; 난자; 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 역분화 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포; 제대혈, 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함하는 혈액 세포; 신장 세포, 간 세포, 및 근육 세포를 포함하는 조직 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 조직으로는 마찬가지로 보존을 위해 동결하여 사용하는 모든 조직이 그 적용대상이 될 수 있으며, 예를 들면, 각막, 신장, 심장, 소장, 췌장, 폐, 간 등 모든 조직이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 세포, 조직 동결 보존을 위한 보존액을 포함할 수 있다. 보존액은 물, 식염수, PBS (phosphate buffered saline), 각종 세포배양액 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 핵산 구조체를 0.001 내지 0.5%(w/v), 구체적으로 0.001 내지 0.03%(w/v)로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
현재 조직 보존 과정에서 사용되는 침투성 소분자가 최대 수십 퍼센트에 이르는 높은 무게비를 요구하는 것에 비해, 본 발명의 핵산 오리가미 구조체는 월등히 낮은 함량에서도 얼음 결정 성장 억제 효과를 가질 수 있어 세포 및 조직의 동결시, 보존에 보다 유리할 수 있다. 또한, 세포의 동결 보존 후 해동시에 세포의 생존률을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물 존재 하에 대상 세포 또는 조직을 영하의 온도에 노출시키는 단계를 포함하는 세포 또는 조직의 동결 보호 방법에 관한 것이다.
상기 조성물 존재 하에 대상 세포 또는 조직을 동결시키는 경우에, 이후 해동시에 얼음 재결정을 저해하여 세포 또는 조직이 손상되는 것을 방지할 수 있다. 또한, 세포의 동결 보존 후 해동시에 세포의 생존률을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 식품 동결 보호용 조성물, 그리고 상기 조성물 존재 하에 식품을 영하의 온도에 노출시키는 단계를 포함하는 식품의 동결 보호 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 모든 냉동 식품에 적용될 수 있으며, 이를 사용하면 해동시에 그 음식의 식감이 저감되는 것을 최소화 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 구조체는 식품 내부에 흡수되거나, 식품 외벽에 달라붙는 형태로 식품을 감쌀 수 있다. 식품 내부에 흡수된 소재는 식품의 냉/해동 과정에서 내부에서 발생하는 얼음 결정의 형성 및 성장을 억제할 수 있다. 또한, 식품 내부에 흡수된 소재는 식품의 동결을 방지 및 억제할 수 있다. 또한, 식품 외부에 붙은 구조체는 식품의 동결을 방지 및 억제하고, 손상을 방지할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. 실험을 통한 양이온 및 DNA 구조체에 의한 얼음 결정 성장 억제 효과 확인
1.1. 얼음 결정 성장 실험 방법
RI 효과 측정을 위해서 통상적으로 알려진 스플랫 쿨링(splat cooling) 실험 기법을 이용하였다 (도 6 참조). 우선 액체질소로 미리 냉각된 금속 판 위에 커버글라스를 올리고(커버글라스 표면온도 약 -150°C), 약 1.5 m의 높이에서 RI 효과를 측정하고자 하는 소재가 분산된 용액을 20 ㎕ 떨어뜨린다. 용액은 커버글라스 위에 닿자마자 급속 냉각되면서 얇게 퍼지며 얼어붙게 되고, 급격한 냉각으로 인해 매우 작은 얼음 결정이 다수 생성된다. 이후 커버글라스를 구멍이 뚫려 있어 광학 현미경으로 관찰이 가능한 콜드 스테이지(cold stage)로 옮긴다. 콜드 스테이지는 -6°C로 유지되며, 30분간 작은 결정들이 점차 합쳐지면서 얼음 결정(ice grain)이 성장하는 모습을 관측한다. 이후 얼음 결정의 크기를 측정하여 대조군(동결 방지 소재 없이 용액만 있는 샘플)과 비교해 얼마나 얼음 결정이 덜 성장하였는지를 비교한다.
1.2. 양이온이 포함된 수용액 및 구조화되지 않은 DNA 시료의 RI 효과 관측
우선, 순수한 증류수에 MgCl 2만 함유된 버퍼 용액에 대한 RI 측정 실험을 진행하였으며, 이온 농도가 증가함에 따라 얼음 결정 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 7 및 8 참조). 본 실험 결과를 바탕으로, 이후 실험에서의 기준(reference) 버퍼 용액의 MgCl 2 농도는 5 밀리몰(mM)로 하였다. 시료의 RI 성능은 기준 버퍼 대비 시료의 상대적인 RI 성능 비교를 통해 측정되었으며, 값이 작을수록 높은 RI 성능을 의미한다.
다음으로는, 구조화되지 않은 단일 가닥 상태의 DNA가 존재하는 용액에 대한 RI 측정 실험을 진행하였다. 실험에서 사용한 DNA의 농도는 통상의 제조 공정을 통해 만들어진 DNA 구조체의 농도와 유사한 50 내지 200ng/uL로 하였다. 6힐릭스 번들 견고 구조를 구성하는 169종류의 스테이플 DNA가 단일가닥 상태로 섞인 시료의 RI 성능을 측정한 결과 0.87에서 1.0 사이로, 버퍼 대비 거의 얼음 결정 성장 억제 효과가 없음이 관찰되었다(도 9 및 10 참조). 즉, DNA 가닥이 Mg 2+ 이온을 결집시키는 효과가 있다고 하나, 수용액 속에서 일정한 형상 및 강성을 갖는 구조체를 이루고 있지 않으면 Mg 2+ 이온을 붙잡아둘 수 없기 때문에 거시적으로는 RI 효과가 거의 발생하지 않는 것을 실험적으로 확인하였다.
또한 같은 방식으로 수행한 스캐폴드 DNA 시료의 RI 값은 최대 0.7 정도로 측정되었다(도 11 및 12 참조). 스캐폴드 DNA가 스테이플 DNA에 비해 약간의 RI 성능을 갖는 이유는 길이가 긴 스캐폴드 DNA의 특성 상, 전 영역이 단일가닥 상태로 존재하는 것이 아니라, 일부분이 서로 상보성을 갖고 이중가닥으로 결합하는 세컨더리 스트럭쳐(secondary structure)를 형성하고 있기 때문인 것으로 추정된다.
1.3. 구조화된 DNA 오리가미 설계
이제 DNA 가닥끼리 밀집하게 연결되어 일정한 단면 형상 및 강성을 지니는 DNA 구조체에 대한 실험을 진행하였다. DNA 오리가미 기법의 예시로 설계된 9종의 구조체는 (1) 4헬릭스 번들 견고 구조, (2) 4헬릭스 번들 유연 구조(갭 5nt), (3) 6헬릭스 번들 견고 구조, (4) 6헬릭스 번들 유연 구조 (갭 3nt), (5) 6헬릭스 번들 유연 구조 (갭 5nt), (6) 24헬릭스 패치, (7) 12헬릭스 번들 견고 구조, (8) 12헬릭스 번들 굽은 구조 (90°), (9) 12헬릭스 번들 굽은 구조 (45°)이다.
각각의 구조체에 대한 설계 방법은 아래와 같다.
(1) 4헬릭스 번들 견고 구조 및 (2) 4헬릭스 번들 유연(갭 5nt) 구조
(1)번 및 (2)번 구조체는 단면이 네 개의 이중가닥 DNA로 구성되어 있으며, 한 변이 약 4.5 nm인 정사각형 모양으로 패킹(packing)되어 있다 (도 13). 약 192nt 길이를 기본으로 하여 같은 형태의 연결이 반복되는 구조를 지니며, 구조체의 총 길이는 약 600 nm이다. (1)번의 견고 구조체는 구조에 존재하는 모든 스테이플 DNA의 양 말단이 직접 맞닿게 설계되었으며, (2)번의 유연 구조체는 150개의 인접한 스테이플 DNA의 양 말단 사이가 5nt의 ssDNA로 구성되어 있다.
(3) 6헬릭스 번들 견고 구조, (4) 6헬릭스 번들 유연 구조 (갭 3nt) 및 (5) 6헬릭스 번들 유연 구조 (갭 5nt)
(3), (4), (5)번 구조체는 단면이 여섯 개의 이중가닥 DNA로 구성되어 있으며, 육각형 모양으로 패킹(packing)되어 있다 (도 14 참조). 약 168nt 길이를 기본으로 하여 같은 형태의 연결이 반복되는 구조를 지니며, 구조체의 총 길이는 약 400 nm이다. (3)번의 견고 구조체는 구조에 존재하는 모든 스테이플 DNA의 양 말단이 직접 맞닿게 설계되었으며, (4), (5)번의 유연 구조체는 169개의 인접한 스테이플 DNA의 양 말단 사이가 각각 3nt 및 5nt의 ssDNA로 구성되어 있다.
(6) 24헬릭스 패치
(6)번 구조체는 단면이 스물 네 개의 이중가닥 DNA로 구성되어 있으며, 일직선으로 배열되어 시트 형태를 이룬다 (도 15 참조). 구조체의 길이는 256nt로 약 90nm이며, 폭은 약 55nm이다. 구조에 존재하는 192개의 스테이플 DNA의 모든 말단은 직접 맞닿게 설계되었다.
(7) 12헬릭스 번들 견고 구조, (8) 12헬릭스 번들 굽은 구조 (90°), (9) 12헬릭스 번들 굽은 구조 (45°)
(7), (8), (9)번 구조체는 단면이 열두 개의 이중가닥 DNA로 구성되어 있으며, 육각형 격자 모양으로 패킹(packing)되어 있다(도 16 참조). (7)번 견고 구조체는 180개의 스테이플 DNA의 모든 말단이 직접 맞닿게 설계되었다. (8)번 및 (9)번 구조체는 구조체 중간에 존재하는 스테이플 DNA 11개를 제거하여 42nt 길이의 유연부위를 만들었으며, 구조물 양 끝을 연결하는 DNA의 길이를 각각 357nt 및 189nt로 짧게 하여 구조 가운데를 90도 및 45도로 굽은 모양을 제작하였다.
1.4. DNA 오리가미의 제작 및 RI 효과 관측
이제 일정한 단면 형상 및 크기를 갖도록 구조화된 DNA 구조체의 얼음 결정 성장 억제 효과를 확인하였다. DNA 오리가미 구조체의 제작 과정은 원재료 및 버퍼를 한데 섞어 80℃로 가열한 후, 65℃까지 1시간에 걸쳐 온도를 낮추고, 이후 25까지 1℃시간 당 1℃씩 온도를 낮추는 열풀림 기법을 이용하였다. 열풀림 기법으로 만들어진 구조체를 따로 분리하기 위해 Amicon사의 원심분리 정제 필터를 이용하여 반응하지 않은 여분의 재료를 걸러내었다. 정제 이후 구조체의 농도는 260nm 파장에서의 흡광도를 이용하여 측정하였으며, 버퍼를 통해 희석시키는 방식으로 목표 농도를 맞추었다.
상기 설계에 따라 만들어진 구조체의 형상은 원자힘현미경을 통해 측정되었다(도 17, 18 및 19의 첫 번째 열 이미지 참조). 적어도 두 종류의 서로 다른 밀도를 가진 상기 아홉 가지 DNA 구조체에 대하여 30분 동안 영하 6℃에서 얼음 결정 성장 과정을 관찰한 RI 실험을 수행한 결과, 최대 0.53의 RI값이 측정되었다(도 20 참조). 단면의 면적이 가장 좁은 4헬릭스 번들(1,2번 샘플)에 비해 나머지 샘플이 더 높은 RI성능을 보였으며, 구조체의 농도가 높을수록 전반적으로 RI성능이 향상되는 경향을 보였다. 이는 단면 넓이가 일정 수준이 되어야 RI성능이 발휘될 만큼 Mg 2+이온을 충분히 결집시킬 수 있고, 수용액 상에서 구조체의 개수가 많을수록 얼음 결정 성장을 억제할 수 있는 영역이 증가하기 때문인 것으로 보인다. 6헬릭스 번들 견고 구조에 대하여 30분 이후 얼음 결정 성장 과정을 관찰한 결과, 2시간 정도 경과 시 소재가 포함되어 있지 않은 버퍼의 얼음 결정과 비슷한 크기로 성장하는 것을 관측하였다 (도 21 참조).
일련의 실험을 통해 양이온이 결집된 DNA 구조체를 포함한 조성물은 구조체를 형성하고 있지 않은 DNA와 대비하여 더 높은 얼음 결정 성장 억제 효과를 발휘할 수 있음을 실증하였다.
2. DNA-PNA-펩타이드 오리가미 구조체 제작
2.1. DNA-PNA-펩타이드 오리가미 구조체 설계
DNA-PNA-펩타이드 구조체를 스캐폴드 DNA, 스테이플 DNA, handle, Cy3 dye 및 PNA-펩타이드 결합 부위를 가지도록 하여 설계하였다(도 22 참조).
2.2. DNA-PNA-펩타이드 오리가미 구조체 제작(도 23 참조)
PNA-peptide 프로브가 부착된 구조체를 만들기 위해서는 구조체를 구성하는 모든 핵산 재료인 스캐폴드 DNA, 핸들이 포함된 스테이플 DNA와 PNA-펩타이드를 동시에 혼합하였다. 이후 DNA 오리가미 구조체의 제작과정과 동일한 열풀림 과정을 거쳐 DNA 오리가미의 핸들 부위에 PNA-peptide 프로브가 부착된 DNA-PNA-펩타이드 구조를 형성하였다. 상기 형성된 DNA-PNA-펩타이드 구조체의 정제 과정 역시 DNA 오리가미 구조체와 동일하게 진행되었다.
3. 각 DNA 구조체에 의한 세포보호 성능 확인
3.1. 실험 재료 및 조건
본 발명의 실시예는 암세포인 HSC-3 세포를 이용하여 실시되었다. 실험에서 사용한 핵산 오리가미 구조체의 농도는 100ng/uL 및 200ng/uL로 하였으며, 펩타이드 프로브를 부착시킨 경우 최대 300ng/uL로 하였다. 세포 배양액과 상기 동결보호 소재를 9:1의 부피비로 혼합하여, 세포 실험에 쓰인 최종 소재의 농도는 10ng/uL에서 30ng/uL로 하였다.
먼저 핵산 오리가미 구조체에 대해 펩타이드 프로브 없이 구조 자체만의 동결보호 효과를 측정하였으며, 이후 동결 방지 펩타이드인 알라닌(alanine) 및 트레오닌(threonine)이 붙은 PNA 프로브를 이용하여 DNA-펩타이드 복합 소재에 대한 동결보호 성능측정 실험을 진행하였다.
세포보호 성능 확인에 사용된 핵산 오리가미의 모양은 (1) 4헬릭스 번들 구조, (2) 6헬릭스 번들 구조, (3) 12헬릭스 번들 구조), (4) 24헬릭스 패치 구조를 이용하였으며, 상기 설계에 따라 만들어진 구조체의 형상은 원자힘현미경을 통해 측정되었다(도 24 참조).
3.2. 식염수 및 세포배양액 조건에서 구조 안정성 확인
DNA 오리가미 구조체가 세포와 상호작용하는 기간 동안 구조를 유지할 수 있는지 확인하기 위해, 10% 인산완충생리식염수(PBS) 및 DMEM 세포배양액에 DNA 구조체를 9:1의 비율로 혼합하여 최대 8시간 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다.
0, 1, 2, 4, 및 8시간째에 인큐베이션을 완료하고 원자힘현미경(AFM) 및 아가로스 젤 전기영동을 통해 DNA 구조체의 모습을 관찰하여 구조적 안정성을 확인하였다(도 25, 26 참조).
3.3. 세포 흡수 여부 확인
제작된 패치 구조가 세포의 내/외부에 흡수 및 부착되는지 여부를 공초점 형광현미경을 통해 확인하였다(도 27 참조).
형광 표지로 세포핵 염색에는 Hoechst 33258, DNA 오리가미 소재에는 Cy3를 이용하였다. 핵은 파란색으로, 오리가미가 위치하는 곳은 마젠타색으로 표시되었다.
DNA-PNA-펩타이드 패치가 포함된 용액을 세포 배양액의 10% 비율로 섞어 인큐베이션 하고, 인큐베이션 직후, 1시간 경과 이후, 2시간 경과 이후 각각 관찰한 결과, 인큐베이션 시간이 지남에 따라 점차 세포 내/외부에 존재하는 패치의 양이 증가하는 것을 확인하였다.
3.4. 세포 생존율 확인
3.4.1. 동결 직후 해동 시 현미경을 통한 세포 생존률 변화 확인
먼저 일반 DNA 패치 구조의 동결보호 성능을 현미경을 통해 확인하였다. 세포를 PBS 10% 및 DNA 패치 구조와 섞어 인큐베이션 시킨 후, RI실험과 유사하게 냉동 후 해동 과정을 거치며 세포의 생존 여부를 이미지를 통해 확인하였다. 실험 결과 PBS 상태에서는 거의 모든 세포가 파괴된 반면, DNA 패치 구조와 혼합된 경우 상당 수의 세포가 생존하는 것을 확인하였다(도 28 참조).
3.4.2. 24시간 동결 보존 후 해동시 MTT assay를 통한 세포 생존율 확인
각 DNA 구조체 및 이와 결합한 각 PNA-펩타이드를 포함하는 세포배양액에서 세포를 37℃에서 인큐베이션 하였을 때, 시간에 따른 세포 생존률을 확인하였다(도 29 참조).
패치(PNA-펩타이드 프로브)를 포함하는 샘플들의 경우, 2시간 인큐베이션하는 경우에 제일 높은 세포 생존율을 보였다. 이 중, 트레오닌 5개(Thr x5) 프로브가 달린 300 mg/ul 농도의 DNA 구조체를 2시간 액체질소 온도에서 인큐베이션 하고, 24시간 동결보존 후 해동하였을 때, 전체 샘플 중 가장 높은 세포 생존율을 보였다.
반면, 번들 형태의 구조체의 경우, 인큐베이션 시간에 따라 세포 생존율이 증가하는 경향을 보였다.
각 DNA 오리가미 구조체 샘플들과 동결보존제 DMSO 10%의 세포생존율을 대비하여 확인하였다(도 29 참조).
단층 형태의 패치 구조가 가장 뛰어난 세포 보호 성능을 보였으며, 이는 소재의 부피 대비 단면적이 가장 넓고 구조가 유연하기 때문에 세포막과 효율적으로 상호작용하여 동결보호 성능을 보이기 때문인 것으로 파악되었다.
패치 구조에 알라닌 및 트레오닌 펩타이드를 부착한 소재의 경우, 훨씬 높은 동결보호 성능을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 동결보호 성능이 있는 펩타이드가 세포 내부 및 주위에서 우수한 얼음결정 형성 및 성장 억제 성능을 발휘하는 것을 확인하였다. 96개의 프로브를 이용하여 트레오닌을 부착한 소재의 경우 상용 동결보호제인 DMSO 10%보다 뛰어난 성능을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
3.4.2. 장기간 동결 보존 후 해동시 세포 생존율 확인
제일 높은 세포생존율을 보였던 2시간 인큐베이션 하는 실험 조건을 기본으로, 24시간 보다 더 장시간 동결 보존 시의 결 세포생존율 확인을 위해 액체질소 온도에서 한달 간 동결 보존 후 해동하여 세포생존율을 측정하였다(도 30 참조).
그 결과, 24시간 동결 보존한 결과와 마찬가지로 Thr x5 프로브가 달린 DNA 구조체의 세포생존율이 제일 높았으며, 200ng/ul 및 300ng/ul의 농도에서 DMSO 10%의 대조군에 비해 여전히 더 높은 성능을 유지하고 있음을 확인하였다. 이를 통해 오리가미 구조체를 이용한 동결보존제가 장기간 동결 보관에도 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
3.5. In-situ 에서의 RI 및 세포 상태 확인
실시예 1.1에서의 실험 방법과 유사하게, -6 ℃에서 30분 동안 세포 내부에서의 소재의 RI 성능 측정 실험을 진행하였다. 세포의 세포핵 부분(파란색 염색), 세포질 부분(녹색), 세포막 부분(적색)을 각각 염색한 후 형광현미경을 통해 온도 변화에 따른 특성을 관찰하였다. 대조군(PBS 버퍼)의 경우, 저온 동결을 거친 세포의 핵은 손상이 일어나 모양이 일정하지 않아 핵을 확인하기 어려웠다. 세포질의 경우 RI 측정 과정에서 세포 내부의 얼음 결정의 크기가 급격히 증가하여 해동 이후 거의 남아 있지 않아, 세포 손상으로 인해 세포질의 대부분이 사라졌음을 확인할 수 있었다. 또한, 세포막은 초기에 찌그러진 상태를 보이다가 파괴되는 것을 확인할 수 있었다(도 31 참조).
패치 구조를 10% 농도로 세포배양액과 혼합한 실험군의 경우, 저온 동결을 거친 세포의 핵은 초기와 유사하게 유지되는 것을 확인하였다. 세포질을 통해 관찰한 세포 내 얼음 결정의 크기 역시 대조군에 비해 훨씬 작은 것을 통해, 소재가 세포 내부에서도 얼음 결정의 성장을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 또한 동결 이후 해동한 상태에서도 세포질의 밝기가 유지되는 것을 통해 세포의 손상이 매우 적음을 확인할 수 있었으며, 세포막 형광 이미지에서도 동결 및 해동 이후 비슷한 형태를 유지하고 있는 것을 통해 소재의 세포 동결보호 효과를 관측하였다.

Claims (11)

  1. 기결정된 위치에서 접혀 복수개의 가닥을 이룬 스캐폴드 핵산, 그 서열 중 적어도 일부가 상기 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 가져, 상기 스캐폴드 핵산의 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥을 형성하는 복수개의 제1 스테이플 핵산 및 그 서열 중 적어도 일부는 상기 스캐폴드 핵산과 상보적이고, 적어도 일단은 그렇지 않아, 상기 스캐폴드 핵산의 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥 및 말단에 단일 가닥을 형성하는 복수개의 제2 스테이플 핵산을 포함하는 핵산 구조체;
    상기 핵산 구조체의 단일 가닥 중 적어도 하나에 결합된 연결자; 및
    상기 연결자 중 적어도 하나에 결합된 동결 방지 펩타이드를 포함하는 동결 보호용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 연결자는 DNA, RNA, 또는 PNA인, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 연결자는 길이가 5 뉴클레오티드 내지 20 뉴클레오티드인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 길이가 1 내지 10 아미노산으로 이루어진 것인, 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 아미노산은 알라닌 또는 트레오닌인, 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 구조체는 2개 이상의 나선 다발을 포함하면서, 얼음 결정과 접촉할 수 있는 면을 포함하는, 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 구조체는 비틀림을 갖거나 곡선의 나선 다발을 포함하는, 조성물.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 세포 또는 조직 동결 보호용 조성물.
  9. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 식품 동결 보호용 조성물.
  10. 청구항 8의 조성물 존재 하에 대상 세포 또는 조직을 영하의 온도에 노출시키는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직의 동결 보호 방법.
  11. 청구항 9의 조성물 존재 하에 대상 식품을 영하의 온도에 노출시키는 단계를 포함하는, 식품의 동결 보호 방법.
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