WO2022114676A1 - 그래핀 기반의 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

그래핀 기반의 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법 Download PDF

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WO2022114676A1
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mirna
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이관희
정영도
김호준
박성욱
김성찬
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한국과학기술연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a biosensor surface-modified with reduced graphene oxide and a detection method using the same.
  • a technology capable of diagnosing various diseases, including prostate cancer, using urine should minimize the patient's stress for diagnosis and examination, enabling more accurate diagnosis through comfortable patient condition.
  • prostate cancer is the fourth most common cancer and the second most common cancer in men, accounting for about 15% of male cancers. In addition, in terms of mortality, it is the fifth most common cancer among all cancers, with about 307,000 deaths recorded in 2012.
  • the currently used early diagnosis technology for prostate cancer is to detect PSA (Prostate Specific Antigen) after undergoing a sample processing process in a blood sample. However, it is difficult to confirm with a single diagnostic method because it is frequently diagnosed even below the reference value. In addition, biopsy is essential for patients in the suspected group, and through these tests, false-positive results are obtained with a total probability of 2/3. It is a situation that puts a lot of burden on patients because the appropriate treatment is not applied.
  • Current prostate cancer diagnosis technology is mainly a non-invasive method, so the patient's rejection and discomfort for repeated sample collection and examination is high, and the incidence of new secondary risks such as infection is high.
  • One aspect is to provide a biosensor comprising a reaction unit in which a physical or chemical interaction occurs with a target material in a sample, wherein the reaction unit comprises reduced graphene oxide (rGO). .
  • rGO reduced graphene oxide
  • Another aspect comprises the steps of contacting the sample to the biosensor; and observing a change in electrical conductivity of the biosensor, to provide a method for detecting a target material.
  • Another aspect is to provide an information providing method for diagnosing prostate cancer, comprising measuring the expression level of a prostate cancer marker from a biological sample isolated from an individual using the biosensor.
  • One aspect is a biosensor including a reaction unit (sensing unit) in which a physical or chemical interaction with a target material in a sample occurs, wherein the reaction unit comprises reduced graphene oxide (rGO), bio to provide a sensor.
  • a reaction unit sensing unit
  • rGO reduced graphene oxide
  • biosensor is intended to measure the presence or absence and amount of a specific biological material, and an optical or electrical recognizable physical or chemical change caused by a selective interaction between a biological element and an analyte material.
  • Applications of these biosensors include use for the analysis of pollutants in the environmental field, use for the detection of biological and chemical weapons of mass destruction in the military field, and use for the detection of hazardous substances or spoilage-promoting substances in the food field, etc. However, it is in the spotlight for the purpose of early diagnosis of disease or analysis of biological materials, especially in clinical diagnosis and medical fields.
  • the physical or chemical interaction with the target material is not particularly limited, but generally, the action by the force acting between molecules resulting from at least one of a covalent bond, a hydrophobic bond, a hydrogen bond, a van der Waals bond, and a bond by electrostatic force. indicates.
  • the covalent bond includes a coordination bond and a dipole bond.
  • coupling by electrostatic force includes electrical repulsion in addition to electrostatic coupling.
  • a binding reaction, a synthesis reaction, and a decomposition reaction generated as a result of the above action are also included in the interaction.
  • interaction examples include binding and dissociation between an antigen and an antibody, binding and dissociation between a protein receptor and a ligand, binding and dissociation between an adhesion molecule and a counterpart molecule, binding and dissociation between an enzyme and a substrate, binding and dissociation between an apoenzyme and a coenzyme, and Dissociation, association and dissociation between a nucleic acid and a protein that binds thereto, association and dissociation between a nucleic acid and a nucleic acid, association and dissociation between a protein in an information transmission system, association and dissociation between a glycoprotein and a protein, or association and dissociation between a sugar chain and a protein , binding and dissociation between cells and biological tissues and proteins, binding and dissociation between cells and biological tissues and low molecular weight compounds, and interactions between ions and ion-sensitive substances.
  • the reaction unit may include a substrate; an electrode formed on the substrate; and a reduced graphene oxide layer formed on the electrode.
  • graphene is one of the allotropes of carbon, and carbon atoms are present at the vertices of a hexagon (sp2 bond) and refer to a material forming a two-dimensional planar crystal structure of a widely spread hexagonal honeycomb.
  • Graphene is a film made of one atom thick and can exist in a stable structure.
  • the graphene oxide may be obtained by a method known to those skilled in the art. For example, the graphene oxide is first cut by applying mechanical/thermal energy to a graphite lump, and granulated graphene oxide can be obtained by mechanical or chemical exfoliation (Mechanical & Chemical exfoliation) method.
  • reduced graphene oxide refers to graphene oxide with reduced oxygen ratio through a reduction process.
  • the reduced graphene oxide may exist in various forms. For example, it may have the form of a nanofilm, a nanosheet, a nanowire, a nanorod, a nanotube, a pulverized nanowire, a nanotetrapod, a tripod, a bipod, a nanocrystal, a nanodot, a quantum wire, or a nanoparticle, Specifically, it may be included in the form of a nanosheet.
  • the reaction unit may include a reduced graphene oxide layer, and may include one or more reduced graphene oxide sheets.
  • the reduced graphene oxide layer may be bonded to the substrate of the reaction unit or an electrode formed on the substrate, specifically, the surface of the electrode is modified and reduced graphene oxide It may be functionalized with
  • the reaction unit may be configured for one-time use.
  • the substrate may be a material selected from the group consisting of silicon, glass, metal, plastic, and ceramic.
  • the substrate may be selected from the group consisting of silicon, glass, polystyrene, polymethyl acrylate, polycarbonate, and ceramic.
  • the sample may be a biological sample derived from a subject, for example, a mammal including a human.
  • the biological sample may be blood, whole blood, serum, plasma, lymph, urine, feces, tissue, cell, organ, bone marrow, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or a combination thereof, specifically urine or obtained from urine. have.
  • the biosensor may be capable of detecting a target material in a urine sample.
  • the biosensor whose electrode surface was modified with rGON showed significantly superior stability in the urine environment than the case where the electrode surface was not modified, and specifically, it was confirmed that the shift of the current signal was significantly reduced (FIG. 7) .
  • the electrode may be a working electrode, an insulating electrode, or a reference electrode.
  • the electrode may be titanium nitride, silver, silver epoxy, palladium, copper, gold, platinum, silver/silver chloride, silver/silver ions, mercury/mercury oxide or indium-tin oxide (ITO).
  • the reaction unit may include an insulating electrode formed on the substrate or the electrode.
  • the insulating electrode may include an oxide film formed naturally or artificially. Examples of the oxide layer include Sn x O y , Si x O y , H x fO y , Al x O y , Ta x O y , or Ti x O y (where x or y is an integer of 1 to 5). can do.
  • the oxide layer may be formed by a known method. For example, it can be achieved by depositing an oxide on a substrate by liquid phase deposition, evaporation, and sputtering.
  • a test cell for accommodating a sample may be attached to the insulating electrode.
  • the test cell is polydimethylsiloxane (PDMS), polyethersulfone (PES), poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), poly(styrenesulfonate) (poly(styrenesulfonate)), polyimide (polyimide), polyurethane (polyurethane), polyester (polyester), perfluoropolyether (PFPE), polycarbonate (polycarbonate), or a combination of the above polymers it could be
  • the reaction unit may include a biological probe that specifically binds to the target material.
  • biological probe may refer to a substance capable of imparting functionalization to a reactive part or a substance specifically binding to a target substance.
  • the biological probes can be DNA, RNA, PNA, nucleotides, nucleosides, proteins, polypeptides, peptides, amino acids, carbohydrates, enzymes, antibodies, antigens, receptors, viruses, substrates, ligands and membranes or combinations thereof.
  • the biological probe may be for detecting one or more miRNAs selected from the group consisting of miRNA21, miRNA1246 and let7b, specifically, the biosensor is one or more miRNAs selected from the group consisting of miRNA21, miRNA1246 and let7b One for detecting It may include one or more biological probes.
  • the biological probe is for detecting miRNA in a urine sample, specifically miRNA21 (SEQ ID NO: 4), miRNA1246 (SEQ ID NO: 5) and let7b (SEQ ID NO: 6) To detect one or more selected from the group consisting of may be for, and may be in the form of DNA, RNA or PNA.
  • a PNA probe was used as a biological probe for detecting the miRNA21, miRNA1246 and let7b.
  • the PNA probes for detecting the miRNA were named PNA-21, PNA-1246 and PNA-let7b, respectively, and the base sequences of the PNA probes were SEQ ID NO: 1 (PNA-21), SEQ ID NO: 2 (PNA-1246), respectively. and SEQ ID NO: 3 (PNA-let7b).
  • the biosensor is for detecting all of the miRNA21, miRNA1246 and let7b, and the reaction unit is divided into one or more regions, and each region has a biological probe capable of detecting one type of miRNA ( Specifically, the PNA-probe) may be separately attached.
  • the biosensor can detect all of the miRNA21, miRNA1246 and let7b with excellent accuracy, and in particular, it was confirmed that the standard curve for miRNA21 and let7b of the biosensor shows better linearity. miRNA21 and let7b can be detected with better accuracy.
  • the biological probe may include a redox enzyme.
  • the redox enzyme may refer to an enzyme that oxidizes or reduces a substrate, and may include, for example, oxidase, peroxidase, reductase, catalase or dehydrogenase.
  • oxidoreductase examples include blood sugar oxidase, lactate oxidase, cholesterol oxidase, glutamate oxidase, horseradish peroxidase (HRP), alcohol oxidase, glucose oxidase (GOx), glucose dehydrogenase (GDH), cholesterol estergenase, ascorbic acid oxidase, alcohol dehydrogenase, laccase, tyrosinase, galactose oxidase or bilirubin oxidase have.
  • HRP horseradish peroxidase
  • alcohol oxidase glucose oxidase
  • GDH glucose dehydrogenase
  • cholesterol estergenase ascorbic acid oxidase
  • laccase tyrosinase
  • galactose oxidase or bilirubin oxidase have.
  • the reaction unit may include a linker for immobilizing the biological probe to the surface of the reaction unit or the surface of the electrode.
  • immobilization may mean that a biological probe forms a chemical or physical bond to a substrate or an electrode.
  • the linker is biotin, avidin, streptavidin, carbohydrate, poly L-lysine, hydroxyl group, thiol group, amine group, alcohol group, carboxyl group, amino group, sulfur group, aldehyde group, carbonyl group, succinimide group, maleimide group, epoxy group , and a compound having an isothiocyanate group, or a combination thereof.
  • it may be pyrenebutyric acid N-hydroxy succinimide ester (PANHS).
  • target material is a detection target material that may exist in a sample, and may refer to a material that specifically binds to a biological probe. Detectable targets may include those that may be involved in specific binding interactions with one or more biological probes that may participate in a sandwich, competition or substitution assay configuration. Examples of the target material include antigens such as peptides (eg, hormones), haptens, carbohydrates, proteins (eg, enzymes), drugs, microorganisms, antibodies, and complementary sequences that participate in sequence-specific hybridization reactions. It may be a nucleic acid or a combination thereof, specifically miRNA.
  • the target material may be a prostate cancer marker, specifically, may be one or more selected from the group consisting of miRNA21, miRNA1246 and let7b.
  • prostate cancer refers to cancer occurring in the prostate.
  • the prostate is a male reproductive organ about the size of a chestnut located just below the bladder and in front of the rectum, which produces and stores part of the semen. Above, it is fixed to the pubic-prostatic ligament in the front adjacent to the bladder neck, that is, the transition from the bladder to the urethra, and below it is fixed by the genitourinary septum.
  • Most of the cancers occurring in the prostate are adenocarcinomas (cancer of adenocarcinomas) that occur in prostate cells, and types can be classified according to the degree of differentiation of tumor tissues and characteristics of cells.
  • biomarker generally refers to organic compounds such as proteins, nucleic acids (DNA, mRNA, miRNA, etc.), metabolites (lipids, glycolipids, glycoproteins and sugars, etc.). An indicator that can detect changes in the body using biomolecules.
  • a marker that can distinguish normal or pathological conditions, predict treatment response, and measure objectively means Depending on the use of biomarkers, target markers for confirming the presence of drug targets, diagnostic markers for diagnosing the presence or absence of disease, predictive markers for distinguishing responders and non-responders to specific drugs, and monitoring drug treatment effects There are prognostic biomarkers that indicate the prognosis of diseases and surrogate markers that can be used.
  • the biosensor may be for detecting a prostate cancer marker, and specifically may be a biosensor for diagnosing prostate cancer.
  • the biosensor can quantitatively detect the target material in the sample, and specifically, the detection signal shown in the biosensor is generated in a concentration-dependent manner of the target material in the sample, and the concentration-target material in the sample through the standard graph of the detection signal can be quantitatively analyzed.
  • the biosensor can quantitatively detect one or more miRNAs selected from the group consisting of a prostate cancer marker, specifically miRNA21, miRNA1246 and let7b, specifically, the detection signal for the miRNA is miRNA in the sample. Since it is proportional to the concentration of , the concentration of miRNA in the sample can be quantitatively analyzed through the concentration-detection signal standard graph.
  • the biosensor can diagnose whether or not prostate cancer develops or is at risk of developing by detecting miRNA21, miRNA1246 and/or let7b, and in particular, let7b is a voltage signal between a prostate cancer patient and a normal person significantly superior to other miRNAs. As it was confirmed that there is a variation difference, a more excellent prostate cancer diagnosis effect can be obtained. Accordingly, the biosensor may be used for diagnosing prostate cancer.
  • the biosensor may further include a signal conversion unit (signal processing unit) that recognizes the interaction and converts it into an electrical signal, and the reaction unit may be separable from the signal conversion unit.
  • a signal conversion unit signal processing unit
  • the signal conversion unit may include a field-effect transistor (FET), and may be formed of a connection between an electrode of the reaction unit and an upper gate electrode of the transistor.
  • FET field-effect transistor
  • the connection may be in the form of a plug, for example.
  • a sample is introduced through a test cell for accommodating the electrode, the biological probe, and the target material, and the target material present in the sample combines with the biological probe to generate a chemical potential gradient in the test cell.
  • the term “chemical potential gradient” may refer to a concentration gradient of an active species. When such a slope exists between the two electrodes, the potential difference will be detectable when the circuit is open and current will flow until the slope disappears when the circuit is closed.
  • the chemical potential gradient may mean any potential gradient resulting from the application of a potential difference or current flow between the electrodes.
  • the field effect transistor may include a substrate; insulating layer; a source electrode and a drain electrode spaced apart from each other; gate electrode; It may include a channel layer disposed between the source electrode and the drain electrode.
  • a field effect transistor according to an embodiment includes a lower gate electrode; a lower insulating layer formed on the lower gate electrode; a source and a drain formed on the lower insulating layer and spaced apart from each other; a channel layer formed on the lower insulating layer and disposed between the source and the drain; It may be a dual-gate field effect transistor (dual-gate FET) including an upper insulating layer formed on the source, the drain, and the channel layer, and an upper gate electrode formed on the upper insulating layer.
  • dual-gate field effect transistor dual-gate FET
  • the small surface potential voltage difference generated in the reaction part greatly amplifies the threshold voltage change of the lower field transistor due to the supercapacitive coupling occurring in the double gate ion sensing field effect transistor (ISFET) including the channel layer.
  • the amplification factor may be determined by the thickness of the lower insulating film, the thickness of the channel layer, and the insulating film thickness of the upper gate. As the thickness of the lower insulating layer increases and the thickness of the upper insulating layer and the channel layer decrease, the size of the amplification factor may increase.
  • the channel layer may be an ultra-thin layer, and for example, may have a thickness of 10 nm or less, 9 nm or less, 8 nm or less, 7 nm or less, 6 nm or less, 5 nm or less, or 4 nm or less.
  • the transistor including the ultra-thin channel layer allows a larger amplification factor compared to the conventional transistor, while also increasing the ion sensing power.
  • a transistor including an ultra-thin channel layer within the thickness range of the channel layer may improve stability compared to a conventional transistor.
  • the changing amplification factor seen in the thick channel layer is combined with the leakage current element induced in the upper interface, and may cause deterioration of the device due to ion damage.
  • the transistor according to an embodiment in which leakage current is controlled while allowing a constant amplification factor can minimize the ion damage effect.
  • the lower insulating film is excessively thick in the conventional transistor, a phenomenon occurs that the lower electric field cannot control all of the channel region, and the electrostatic coupling of the upper and lower gates is weakened.
  • the transistor can obtain a large amplification factor while maintaining the electrostatic coupling.
  • the electrostatic coupling phenomenon of the upper and lower gates occurs when the upper channel interface is completely depleted. In the conventional transistor, amplification does not occur because the electric field of the lower gate does not control the upper channel.
  • the channel layer may include any one selected from the group consisting of an oxide semiconductor, an organic semiconductor, polycrystalline silicon, and single crystal silicon.
  • the channel layer includes any one selected from the group consisting of semiconductors, organic semiconductors, polycrystalline silicon, and single crystal silicon, capacitive coupling of upper and lower gates occurs and a high-sensitivity sensor can be manufactured, and a transparent and flexible sensor can be provided. have.
  • the channel layer is not limited in width or length, and in a double gate structure, an electrostatic coupling phenomenon may be utilized by using upper and lower gate electrodes.
  • an equivalent oxide thickness of the upper insulating layer may be thinner than an equivalent oxide thickness of the lower insulating layer.
  • the thickness of the upper insulating layer may be about 25 nm or less, and the thickness of the lower insulating layer may be about 50 nm or more.
  • the equivalent oxide layer thickness of the upper insulating layer is thinner than the equivalent oxide layer thickness of the lower insulating layer, a signal sensitivity amplification phenomenon may occur.
  • the upper insulating layer and the lower insulating layer may include an oxide layer formed naturally or artificially.
  • the oxide layer may include Si x O y , H x fO y , Al x O y , Ta x O y , or Ti x O y (where x or y is an integer of 1 to 5).
  • the oxide layer may have a single, double, or triple stacked structure. Through this, by increasing the physical thickness and decreasing the equivalent oxide film thickness of the upper insulating film, the sensitivity of the sensor can be amplified and deterioration caused by leakage current can be prevented.
  • the dual gate ion sensing field effect transistor may have a structure including a field transistor including an upper insulating layer and a lower field transistor including a lower insulating layer in one device. According to each operation mode, the upper and lower gates can operate independently. When the upper and lower gates of the device are used simultaneously, the electrostatic coupling phenomenon is observed due to the structural specificity of the structure of the double gate, and the correlation between the upper and lower field transistors can be established.
  • the dual operation mode may be to use the lower gate as the main gate. Accordingly, the transistor according to an embodiment may operate in a double gate mode.
  • the sensor may include a plurality of reaction units and a plurality of transistors to detect a plurality of target materials.
  • the sensor may include a plurality of the reaction units and a plurality of the ion sensing field effect transistors, and the plurality of reaction units and the plurality of ion sensing field effect transistors may be electrically connected to each other.
  • a plurality of sources in the plurality of transistors may be commonly grounded, a plurality of upper gate electrodes may be commonly grounded, and a common voltage may be applied to the plurality of lower gate electrodes.
  • the source of the first transistor and the second transistor, and the reference electrode of the first reaction unit and the second reaction unit may be commonly grounded.
  • a constant common voltage may be applied to the lower electrodes of the first transistor and the second transistor.
  • the plurality of drains in the plurality of transistors may have a parallel structure.
  • the drains of the first transistor and the second transistor may have a parallel structure.
  • the plurality of reaction units may be independently immobilized with different biological probes. The plurality of transistors may detect the same or different target material signals from the plurality of reaction units, amplify them, and output the signals through a semiconductor parameter analyzer.
  • the signal converter may be electrically connected to the transistor and further include an arithmetic module for determining the amount of the target material in the sample from the potential difference measured from the transistor.
  • the calculation module may be for determination of a target material.
  • the term “determination of a target material” may refer to a qualitative, semi-quantitative and quantitative process for evaluating a sample. In the qualitative evaluation, the result indicates whether a target substance is detected in the sample. In a semi-quantitative evaluation, the result indicates whether the target material is present above some predefined threshold. In a quantitative assessment, the result is a numerical representation of the amount of target substance present.
  • the conversion of the measured value may use a look-up table that converts a specific value of electric current or potential into a value of a target material depending on a specific device structure and a correction value for the target material.
  • the calculation module may be determined by measuring a potential difference according to a known concentration of the target material. For example, the calculation module may be to determine the amount of the target material in the sample compared to the normal control.
  • the biosensor may further include a display unit for displaying a result.
  • the display unit may further include a frame having a display for displaying a result and one or more control interfaces (eg, a power button, a scroll wheel, etc.).
  • the frame may include a slot for receiving a sensor.
  • Inside the frame there may be a circuit for applying a potential or a current to the electrode of the sensor when the sample is provided.
  • a suitable circuit that may be used in the meter may be, for example, an ideal voltage meter capable of measuring the potential across the electrode.
  • a switch may also be provided which opens when the potential is measured or closes for the measurement of the current.
  • the switch may be a mechanical switch (eg, a relay) or a solid-state switch.
  • Such a circuit can be used to measure a potential difference or a current difference.
  • other circuits including simpler and more complex circuits, may be used to achieve the application of a potential difference or current or both.
  • the biosensor is provided with a communication means and may be configured to enable transmission and reception of information with an external server or terminal unit.
  • the communication means may employ a wired or wireless communication means. Therefore, wired communication using a cable connection means can be used, and wireless communication means including 5G, 4G, LTE, UWB, WiFi, WCDMA, USN, IrDA module, etc. as well as a Bluetooth module or Zigbee module can be used.
  • the terminal unit may include a communicator such as a computer, a notebook computer, a smart phone, a general mobile phone, a PDA, a measuring instrument or a control device having a separate communication function.
  • the terminal unit may be equipped with a central processing unit and may be based on an operating system (OS) capable of running software such as a computer program, an application program, and the like. Therefore, the terminal unit is loaded with an application program capable of interpreting, analyzing, and processing the analyte (target material) measurement data in the sample provided by the sensor, and performs a function of interpreting, analyzing, and processing the analyte measurement data in the sample.
  • OS operating system
  • the terminal unit may perform a function of displaying the analysis, analysis, and processing data of the analyte measurement data in the sample or the analyte measurement data in the sample.
  • the terminal unit since the terminal unit is connected or interlocked with the control unit of the sensor, the terminal unit may perform a function of operating and controlling the sensor.
  • Another aspect comprises the steps of contacting the sample to the biosensor; and observing a change in electrical conductivity of the biosensor, to provide a method for detecting a target material.
  • the same parts as those described above are equally applied to the above method.
  • the term “detection” may refer to discovering or confirming the appearance or existence of a target substance, and may include, for example, identifying a target substance or quantifying the target substance in a sample.
  • the detection method may be an electrochemical method of measuring a current or an electric potential generated through interaction of a target material with a biological probe.
  • Another aspect is to provide an information providing method for diagnosing prostate cancer, comprising measuring the expression level of a prostate cancer marker from a biological sample isolated from an individual using the biosensor.
  • the same parts as those described above are equally applied to the above method.
  • diagnosis refers to ascertaining the presence or characteristics of a pathological condition.
  • diagnosis may mean determining whether or not prostate cancer occurs.
  • prognosis refers to prediction of disease progression and recovery, and refers to a prospect or a preliminary evaluation.
  • prognosis means determining whether treatment success, survival, recurrence, metastasis, drug reactivity, resistance, etc. in the subject after treatment for prostate cancer.
  • a positive prognosis positive prognosis
  • a negative prognosis negative prognosis
  • a positive prognosis includes remission of disease, such as a disease-free state, and improvement or stabilization of disease, such as tumor regression.
  • prediction means presuming a medical attribution, and for the purpose of the present invention, the disease course of a patient diagnosed with prostate cancer (disease progression, improvement, cancer recurrence, tumor growth, drug resistance) in advance.
  • the term "individual” refers to any living organism that has or is likely to develop prostate cancer, and specific examples include dogs, cats, mice, rats, monkeys, cattle, pigs, mini-pigs, livestock, humans, etc. It may include mammals, farmed fish, etc., including, but not limited to.
  • the prostate cancer marker may be at least one selected from the group consisting of miRNA21 (SEQ ID NO: 4), miRNA1246 (SEQ ID NO: 5) and let7b (SEQ ID NO: 6).
  • Measuring the expression level of the prostate cancer marker using the biosensor may include contacting the sample with a biosensor capable of detecting the prostate cancer marker and observing a change in electrical conductivity of the biosensor.
  • the biosensor may be the biosensor of the present invention including a biological probe capable of detecting the prostate cancer marker.
  • the method includes measuring the expression level of a prostate cancer marker from a biological sample isolated from a control; and comparing the expression levels of the subject and the control group.
  • control group may refer to a general individual who has not developed prostate cancer, a non-prostate cancer patient group, a non-patient group, and the like.
  • the method may further include determining that the subject has developed prostate cancer or estimating the risk of developing prostate cancer at a high level when the expression level of the prostate cancer marker in the subject is higher than that of the control group.
  • a biosensor according to an aspect can effectively detect a target material in a urine sample, and has an advantage in that it is possible to quickly and accurately diagnose prostate cancer non-invasively by using the biosensor.
  • 1A is a schematic diagram of a urine miRNA detection system based on a disposable and switchable electrical sensor in patient urine
  • b is a diagram illustrating a chemical manufacturing and surface cutting process of a disposable sensor chip.
  • FIG. 2 is a diagram schematically illustrating a reaction unit of a biosensor according to an exemplary embodiment.
  • 3a is a diagram showing the line-profile results for the morphological image and thickness observed with an atomic force microscope, and the width and height of rGON were about ⁇ 500 nm and 1.5 nm, respectively, and b is UV-vis-NIR As a diagram showing the results of the absorbance spectrum, it shows the red shift of the absorbance at the ⁇ - ⁇ transition of the aromatic carbon bond of rGON by partial restoration of the sp2 carbon structural domain.
  • Figure 5 is a view showing the characteristics analysis results according to the surface modification of the disposable sensor chip, (a) SnO 2 , (b) rGON, (c) PANHS, and (d) shows an atomic force microscope phase image of the PNA probe, and ( e) The line profile is shown. As a result of the line profile, it can be seen that the heights of SnO 2 , SnO 2 /rGON, SnO 2 /rGON/PANHS, and SnO 2 /rGON/PANHS/PNA gradually increased from 0 to 3.5 nm.
  • f is a plot showing the relative surface average potentials of SnO 2 , SnO 2 /rGON, SnO 2 /rGON/PANHS and SnO 2 /rGON/PANHS/PNA, respectively, 54.4 ⁇ 0.5 and -146.7 ⁇ using neutral representatives of HOPG. 0.7, ⁇ 116.6 ⁇ 0.3 and -119.5 ⁇ 0.4 mV.
  • 6A is a diagram showing the movement curve of the miRNA sensor measured in the lower gate sweep
  • b is a diagram showing the pH sensitivity of the miRNA sensor in a buffer solution of pH 3 to 11.
  • FIG. 7A is a diagram showing the drift characteristics of the miRNA sensor measured in human urine and PBS for 60 minutes
  • b is a diagram showing the change in VBG in human urine and PBS after washing for 20 minutes.
  • FIG. 9 is a diagram illustrating electrical signal changes for a target miRNA and a miRNA having a different base in a disposable sensor chip equipped with a probe capable of detecting miRNA.
  • FIG. 10 is a diagram showing the electrical signal difference between the wells of the disposable sensor chip.
  • FIG. 11 is a view showing the I D -V G results of the miRNA sensor according to the concentration of three target miRNAs, (a, d) miR21, (b, e) miR1246, (c, f) Let7b, a, b and c is 1x PBS condition, and d, e, and f are results measured under human urine sample condition.
  • FIG. 12 is a diagram showing the standard curve of the miRNA sensor for three miRNAs, (d) miR21, (e) miR1246 and (f) Let7b, at dynamic doses ranging from 10 fM to 10 nM, where a, b and c are 1x PBS conditions, d, e, and f are results measured in human urine sample conditions.
  • FIG. 13A is a diagram illustrating a disposable sensor chip for real-time monitoring of three different miRNAs per patient at the same time
  • FIG. 13B is a diagram illustrating a voltage difference between a patient with prostate cancer and a patient without prostate cancer. Higher levels of cancer-specific miRNAs were monitored in cancer patients compared to normal, consistent with the pathological diagnosis.
  • Example 1 Patient Urine Sample Information
  • Non-cancer urine (77, 62, 62, 78 years), prostate cancer urine (69 years, GS (3+3); 80 years, GS (3+3); 58 years, GS (4+4); 80 years old) age, GS (4+4); age 56, GS (4+5); age 69, GS (4+4)).
  • Example 2 Construction of a urine miRNA detection system (biosensor)
  • the present invention provides a label-free urine miRNA detection system based on a disposable and switchable graphene-based electrical sensor with high sensitivity and specificity in patient urine and a non-invasive clinical diagnostic method using the same ( 1a).
  • the sensing module of the sensor can be easily connected to the FET body, and can rapidly and accurately detect miRNA markers in urine samples obtained from patients with prostate cancer.
  • the surface of a disposable sensor chip functionalized with reduced graphene oxide nanosheet (rGON) was designed, and then PNA (peptide nucleic acid) was immobilized on the surface ( Figure 1b).
  • a field-effect transistor (FET) corresponding to the signal processing unit (signal conversion unit) of the biosensor is manufactured according to the method described in a known document (Adv. Healthcare Mater. 2017, 6, 1700371). became
  • a disposable sensor chip corresponding to the reaction part (sensing part) of the biosensor glass of about 19*27*0.7t(mm) (width, length, thickness) was used as a substrate.
  • an indium/tin oxide film indium tin oxide, ITO, 300 nm
  • ITO indium tin oxide
  • an oxide film, SnO 2 was deposited on the ITO layer to a thickness of about 45 nm using RF sputtering. At this time, the RF power was about 50 W.
  • a sputtering process was performed under an Ar gas condition having a flow rate of about 20 sccm and a pressure condition of about 3 mtorr.
  • a base and a curing agent (Sygard 184) were formulated in a ratio of 10:1, and the mixture was cured at 60° C. for 3 hours.
  • O 2 plasma 70W, O 2 gas flow of 30 sccm for 1 minute, Plasma System Cute, Femto Science
  • a reaction part was manufactured by attaching it to the insulating electrode.
  • the test cell was fabricated as an extended gate (EG) having four wells.
  • a silver/silver chloride electrode was used as the reference electrode.
  • a reduced graphene oxide nanosheet (rGON) for use in the disposable sensor chip of the present invention was prepared as follows.
  • graphene oxide (GO) was synthesized from graphite according to the modified Hummers method and further sonicated at 4 °C for 6 hours.
  • rGON was prepared using L-ascorbic acid under thermal conditions. Specifically, 50 mg of L-ascorbic acid was dissolved in 50 mL of graphene oxide (0.1 mg/mL) in an aqueous solution, followed by vigorous stirring at 120° C. for 24 hours. After cooling at room temperature for 80 hours while maintaining stirring, rGON was collected by dialysis using a 10 kDa membrane for 48 hours, and resuspended in deionized autoclaved water (DW) for the next experiment.
  • DW deionized autoclaved water
  • the size and phase of the rGON produced above were observed with an atomic force microscopy (AFM) (XE-100, Park System). As a result, the line-profile image showed that the diameter and thickness of the rGON were ⁇ 500 nm and ⁇ 1.5 nm, respectively. , it can be seen that a typical rGON monolayer was formed (Fig. 3a).
  • UV-vis-NIR ultraviolet-visible-near-infrared
  • the surface of the disposable sensor chip was treated with an O 2 plasma system at 70 W for 1 minute, and then an amine group (-NH 2 ) as a positively charged functional group was formed To do this, an ethanol solution containing 5% 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) was treated for 1 hour.
  • the disposable sensor chip was washed with ethanol and baked at 120° C. for 30 minutes. Then, it was functionalized with rGON by electrostatic interaction between the positive charge on the SnO 2 surface and the negative charge of rGON by immersion with rGON (0.1 mg/mL) at room temperature.
  • the rGON was deposited as a two-dimensional thin film using a drop-casting method, which is a simple and rapid deposition method at room temperature.
  • rGON provides a restored sp2 carbon structural domain, which can be easily functionalized with PNA probes to capture miRNAs over large surface areas.
  • rGON improves conductivity and electron mobility, lowering intrinsic electrical noise and enabling signal enhancement without cofactors. Therefore, the disposable sensor chip on which rGON is deposited is more sensitive to electrical signals for capturing miRNAs contained in urine.
  • the Raman spectrum of ITO/SnO 2 /rGON showed two main bands, the D and G bands located at 1360 cm -1 and 1600 cm -1 , respectively, which are typical characteristics of rGON ( FIG. 4 ), with rGON It can be seen that functionalization has been achieved.
  • N,N dimethylmethanamide N,N dimethylmethanamide, DMF
  • PANHS pyrenebutyric acid N-hydroxy succinimide ester
  • PEG polyethylene glycol
  • PNA probes with a neutral peptide backbone provide greater sequence-specific affinity and stability for miRNAs compared to commonly used DNA-based probes.
  • PNA probe sequence (N ⁇ C) SEQ ID NO: PNA-21 TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A One PNA-1246 CCT GCT CCA AAA ATC CAT T 2 PNA-let7b AAC CAC ACA ACC TAC TAC CTC A 3 target miRNA sequence (5' ⁇ 3') SEQ ID NO: miRNA21 UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A 4 miRNA1246 AAU GGA UUU UUG GAG CAG G 5 let7b UGA GGU AGU AGG UUG UGU GGU U 6 mismatch UAG CUU AUC AUA CUG AUG UUG A 7
  • the miRNA sensor system of the present invention identifies the presence of a target biomarker by measuring the voltage difference between a reference and a sample at a constant and stable current, current stability from the source to the drain of the device of the present invention is important. . Therefore, the electrical properties of the sensor in buffer solution were investigated, and the transfer curve ( ID -V G ) and pH sensitivity were determined using a bottom gate sweep in a modified disposable sensor chip of the miRNA sensor.
  • Fig. 6a shows the I D -V G curve and the output characteristic curve (I D -V D ) of the sensor by a gate sweep (-13 to 20V) in 1x PBS.
  • V th threshold voltage
  • I D -V D output characteristic curve
  • the real-time drift properties as a function of the current signal were evaluated in human urine and 1 ⁇ PBS (Fig. 7).
  • the sensor comprising the disposable sensor chip modified with rGON showed an extremely small shift in the current signal, and a low change in the voltage shift in both 1 ⁇ PBS and undiluted urine. , showed a stable response.
  • stable results were obtained even when electrical signal measurement was performed in urine or 1 ⁇ PBS for 20 minutes.
  • the surface modification by rGON made it difficult to detect urine miRNA. It can be seen that interference by various pH conditions and undesirable elements such as ascorbic acid and urea compounds can be significantly suppressed, and these results show important stability as a stable and sensitive real-time biosensor.
  • the sensitivity of the sensor to various concentrations (0-10 nM) of miRNA to be detected was confirmed.
  • a PNA-21 probe (miR21) for detecting miRNA21 was applied to a disposable sensor chip.
  • the target miRNA to be detected was detected by reacting in a wide concentration range. (Fig. 9). Based on the above results, it can be seen that the miRNA sensor of the present invention has excellent specificity of the target miRNA by a sequence-specific method.
  • the following experiment was performed. Specifically, to obtain the I D -V G curve using the FET, a dual-channel parameter analyzer (A dual-channel parameter analyzer, 4200A-SCS, Keithley) was used. In the case of the I D -V G curve, the sweeping voltage and drain voltage of the lower gate ranged from -5 to 5 V, respectively. To obtain a standard curve, the voltage change according to the concentration of various miRNAs was plotted, and the initial voltage value in the I D -V G curve was determined as the V G value at 10 nA.
  • a dual-channel parameter analyzer A dual-channel parameter analyzer, 4200A-SCS, Keithley
  • the detection voltage was measured at 10 nA, and the final electrical signal was normalized by subtracting the initial signal of 1 ⁇ PBS itself from the baseline from the endpoint signal incubated for 20 min.
  • the sensor's amplification curve showed similar trends for the three target miRNAs, and specifically, the I D -V G curve showed a gradual shift in the same direction according to various miRNA concentrations in 1x PBS and undiluted normal urine. was confirmed (FIG. 11).
  • the standard curve of the sensor for the concentration range of 10 fM to 10 nM in the three miRNAs exhibited a dynamic range with excellent linearity ( FIG. 12 ).
  • the standard curves for miRNA21, miRNA1246, and let7b showed excellent linearity by showing an R 2 of 0.9 or more in the urine sample condition as well as in the PBS condition, and in particular, the standard curves for miRNA21 and let7b showed better linearity.
  • the miRNA sensor of the present invention has significantly superior analysis performance when compared with other existing analysis methods and sensors for detecting urine miRNA.
  • the sensor of the present invention exhibits excellent linearity and a low limit of detection (LOD) of 10 fM, so that it can be used for quantitative analysis of a wide range of biomarker concentrations.
  • LOD low limit of detection
  • PSA prostate-specific antigen
  • the present invention developed a label-free urine miRNA detection system comprising a disposable and switchable graphene-based electrical sensor that can simply connect a sensing module (reaction unit) to the FET body.
  • the miRNA detection system can detect miRNA in a patient's urine in real time without a pre-processing or signal amplification step, and the miRNA detection system of the present invention provides a reliable and practical method.
  • the monitoring technology of the sensor exhibits fast response time, durability, stability, improved specificity and sensitivity.
  • the performance of the sensor was reduced to sub-femtomolar concentrations of miRNAs in both 1 ⁇ PBS and human urine samples within 20 min. subfemtomolar) LOD reliability.
  • separating the disposable sensor chip from the FET body provides a highly durable and reusable transducer while maintaining sensing performance, and offers the potential to create a scalable platform for the detection of various miRNAs. do.
  • the sensor provides a complementary strategy to improve the accuracy of tests for early diagnosis of prostate cancer, allowing the combination of standard serum PSA and urine miRNA tests prior to performing a biopsy.
  • the miRNA detection system of the present invention is a promising device for field use in biomedical applications.

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Abstract

본 발명은 환원된 산화 그래핀으로 표면 개질된 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 바이오센서는 소변 시료 내의 표적물질을 효과적으로 검출할 수 있는 것으로서, 상기 바이오센서를 이용하면 비침습적으로 신속 정확하게 전립선암을 진단할 수 있다는 장점이 있다.

Description

그래핀 기반의 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법
본 발명은 환원된 산화 그래핀으로 표면 개질된 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
소변을 이용한 질병진단에 관한 연구는 1958년 당과 단백질을 검사할 수 있는 요 검사지가 개발되면서 본격적으로 주목을 받기 시작하였으며, 이후 소변을 이용하여 보다 많은 질병들을 진단하기 위한 시스템 및 이를 이용한 검사법에 대한 연구가 진행되고 있다. 소변을 이용하여 전립선암을 포함한 다양한 질병들을 진단할 수 있는 기술은, 진단 및 검사에 대한 환자의 스트레스가 최소화 되어, 편안한 상태의 환자 컨디션을 통한 보다 정확한 진단이 가능해야 한다. 또한, 아동은 물론 노령의 환자에게도 심적, 육체적 부담 없이 반복적이고 지속적인 질병에 대한 모니터링을 할 수 있게 되어야 한다.
한편, 소변을 통해 진단할 수 있는 질병 중 전립선암은 전체 발병 암으로는 네 번째, 남성만을 기준으로 했을 때는 두 번째로 높은 암으로서, 남성 암의 약 15%를 차지하고 있다. 또한, 사망률에 있어서는 전체 암 중에 다섯 번째를 기록하는 암으로서, 2012년에 약 307,000명의 사망자를 기록하였다. 현재 사용되고 있는 전립선암의 조기 진단기술은 혈액 샘플에 시료처리 과정을 거친 후, PSA (Prostate Specific Antigen)를 검출하는 것으로, 전립선암의 진단은 PSA 농도가 4 ng/mL을 초과하는지 여부를 통해서 판단하나, 기준치 이하에서도 진단되는 경우가 빈번해서 단일 진단법으로는 확정하기 어렵다. 또한, 의심군 환자를 대상으로 조직검사가 필수적으로 수반되는데, 이러한 검사를 통해서 총 2/3의 확률로 위양성 결과가 나오고 있을 뿐만 아니라, 이러한 방법들은 환자에게 고통을 안겨주며 오진에 따라 종양 단계에 따른 적절한 치료가 적용되지 않아 환자들에게 많은 부담을 안기고 있는 실정이다. 현재의 전립선암 진단 기술은 주로 비침습적인 방법이 주를 이루고 있어서, 반복적인 샘플 채취 및 검사에 대한 환자의 거부감과 불쾌감이 높고 감염 등의 새로운 2차 위험 발생률이 높은 실정이다.
따라서, 비침습적인 방법으로, 소변에서 질병을 진단 및 모니터링 할 수 있는 기기/센서 및 진단기술에 대한 요구가 존재한다.
일 양상은 시료 내의 표적물질과 물리적 또는 화학적 상호작용이 일어나는 반응부를 포함하는 바이오센서로서, 상기 반응부는 환원된 산화 그래핀(reduced graphene oxide, rGO)을 포함하는 것인, 바이오센서를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 바이오센서에 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 바이오센서의 전기 전도도 변화를 관찰하는 단계를 포함하는, 표적물질 검출 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, 상기 바이오센서를 이용하여 전립선암 마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 전립선암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 시료 내의 표적물질과 물리적 또는 화학적 상호작용이 일어나는 반응부(센싱부)를 포함하는 바이오센서로서, 상기 반응부는 환원된 산화 그래핀(reduced graphene oxide, rGO)을 포함하는 것인, 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 명세서에서의 용어 "바이오센서"는, 특정한 생물학적 물질의 존재 유무 및 그 양을 측정하기 위한 것으로, 생물학적 요소와 분석 대상 물질 간의 선택적인 상호작용으로 유발된 물리적 또는 화학적 변화를 인식 가능한 광학적 또는 전기적 신호로 변환시켜주는 장치를 말한다. 이러한 바이오 센서의 적용 분야는 환경 분야에서의 오염 물질의 분석을 위한 사용, 군사 분야에서의 대량 살상용 생화학 무기의 감지를 위한 사용, 및 식품분야에서 유해물질 또는 부패 촉진 물질의 검출을 위한 사용 등이 있으나, 특히 임상진단 및 의료분야에서 질병의 조기진단 또는 생체 물질의 분석 목적으로 각광을 받고 있다.
상기 표적물질과 물리적 또는 화학적 상호작용은 특별히 한정되지 않지만, 통상은 공유 결합, 소수결합, 수소결합, 반데르 발스 결합 및 정전력에 의한 결합 중 적어도 하나로부터 생기는 분자 간에 작용하는 힘에 의한 작용을 나타낸다. 공유 결합으로는, 배위 결합, 쌍극자 결합을 포함한다. 또, 정전력에 의한 결합이란, 정전 결합 외에, 전기적 반발도 포함한다. 또, 상기 작용의 결과 생기는 결합 반응, 합성 반응, 분해 반응도 상호작용에 함유된다. 상호작용의 구체예로는, 항원과 항체간의 결합 및 해리, 단백질 리셉터와 리간드간의 결합 및 해리, 접착 분자와 상대방 분자간의 결합 및 해리, 효소와 기질간의 결합 및 해리, 아포 효소와 보효소간의 결합 및 해리, 핵산과 그에 결합하는 단백질 간의 결합 및 해리, 핵산과 핵산간의 결합 및 해리, 정보 전달계에 있어서의 단백질 사이의 결합과 해리, 당 단백질과 단백질간의 결합 및 해리, 또는 당쇄와 단백질간의 결합 및 해리, 세포 및 생체 조직과 단백질간의 결합 및 해리, 세포 및 생체 조직과 저분자 화합물간의 결합 및 해리, 이온과 이온 감응성 물질간의 상호작용 등일 수 있다.
상기 반응부는 기판; 상기 기판상에 형성된 전극; 및 상기 전극상에 형성된 환원된 산화 그래핀 층을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "그래핀(graphene)"은 탄소의 동소체 중 하나로서, 탄소 원자들은 육각형의 꼭짓점에 존재하며(sp2 결합) 넓게 퍼진 육각형 벌집 모양의 2차원 평면 결정 구조를 이루는 물질을 말한다. 그래핀은 원자 한 개 두께로 이루어진 막으로 안정적인 구조로 존재할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "산화 그래핀(graphene oxide: GO)"은 그래핀 상에 또는 가장자리에 산화된(산소를 함유하는) 다양한 기능기(-OH, -COOH, -C=O, -CH0 등)가 결합된 구조를 갖는 것으로서, 단일층 또는 수층~수십층을 이루고 있는 물질이다. 상기 산화 그래핀은 당업자에게 알려진 방법으로 수득된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 산화 그래핀은 흑연덩어리(graphite)를 기계적/열적 에너지를 가하여 1차 절단하고, 기계적 또는 화학적 박리(Mechanical & Chemical exfoliation) 방법으로 입자화된 산화 그래핀을 수득할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "환원된 산화 그래핀(reduced graphene oxide, rGO)" 환원 과정을 거쳐 산소 비율이 줄어든 그래핀 산화물을 의미한다.
상기 환원된 산화 그래핀은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어 나노필름, 나노시트, 나노선, 나노막대, 나노튜브, 분쇄나노선, 나노테트라포드, 트리포드, 바이포드, 나노결정, 나노점, 양자선, 또는 나노입자의 형태를 가질 수 있으며, 구체적으로 나노시트의 형태로 포함되는 것일 수 있다.
상기 반응부는 환원된 산화 그래핀 층을 포함하는 것일 수 있으며, 한 개 이상의 환원된 산화 그래핀 시트를 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 환원된 산화 그래핀 층(나노시트)은 상기 반응부의 기판 또는 상기 기판상에 형성된 전극에 결합된 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 전극의 표면은 개질되어 환원된 산화 그래핀으로 관능화된 것 일 수 있다.
상기 반응부는 일회용으로 사용하도록 구성된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 기판은 실리콘, 유리, 금속, 플라스틱, 및 세라믹으로 구성되는 군으로부터 선택되는 물질일 수 있다. 구체적으로, 상기 기판은 실리콘, 유리, 폴리스티렌, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리카르보네이트 및 세라믹으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 시료는 개체, 예를 들면, 인간을 포함한 포유류 등으로부터 유래된 생물학적 시료일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합일 수 있으며, 구체적으로 소변 또는 소변으로부터 수득한 것일 수 있다.
상기 바이오센서는 소변 시료 내의 표적물질을 검출할 수 있는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, rGON으로 전극 표면이 개질된 바이오센서의 경우에는 개질되지 않은 경우보다 소변 환경에서 현저히 우수한 안정성을 나타냈으며, 구체적으로 전류 신호의 시프트가 현저히 감소되는 것을 확인하였다 (도 7).
상기 전극은 작업 전극, 절연 전극 또는 기준 전극일 수 있다. 상기 전극의 예는 타이타늄 나이트라이드, 은, 은에폭시, 팔라듐, 구리, 금, 백금, 은/염화은, 은/은이온, 수은/산화수은 또는 인듐-주석 산화물(ITO)일 수 있다. 또한, 상기 반응부는 상기 기판 또는 상기 전극 상에 형성된 절연 전극을 포함할 수 있다. 상기 절연 전극은 천연 또는 인공적으로 형성된 산화막을 포함하는 것일 수 있다. 상기 산화막의 예는 SnxOy, SixOy, HxfOy, AlxOy, TaxOy, 또는 TixOy (여기서, x 또는 y는 1 내지 5의 정수)를 포함할 수 있다. 상기 산화막을 형성하는 것은 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 산화물을 기판 상에 액상침적 (liquid phase deposition), 증발, 및 스퍼터링에 의하여 침적함으로써 이루어질 수 있다.
상기 절연 전극 상에 시료를 수용하기 위한 테스트 셀을 부착할 수 있다. 상기 테스트 셀은 폴리디메틸실록산 (polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리에테르설폰 (polyethersulfone, PES), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜) (poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리(스티렌설포네이트) (poly(styrenesulfonate)), 폴리이미드 (polyimide), 폴리우레탄 (polyurethane),　폴리에스테르 (polyester), 퍼플루오로폴리에테르 (Perfluoropolyether, PFPE), 폴리카보네이트 (polycarbonate), 또는 상기 고분자의 조합으로부터 제조된 것일 수 있다.
상기 반응부는 상기 표적물질과 특이적으로 결합하는 생물학적 탐침을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “생물학적 탐침”은 반응부에 기능화를 부여할 수 있는 물질 또는 표적물질에 특이적으로 결합하는 물질을 의미할 수 있다. 상기 생물학적 탐침은 DNA, RNA, PNA, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산, 탄수화물, 효소, 항체, 항원, 수용체, 바이러스, 기질, 리간드 및 멤브레인 또는 그의 조합일 수 있다.
상기 생물학적 탐침은 miRNA21, miRNA1246 및 let7b 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA를 검출하기 위한 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 바이오센서는 상기 miRNA21, miRNA1246 및 let7b 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA를 검출하기 위한 하나 이상의 생물학적 탐침을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 생물학적 탐침은 소변 시료 내 miRNA를 검출하기 위한 것으로서, 구체적으로 miRNA21 (서열번호 4), miRNA1246 (서열번호 5) 및 let7b (서열번호 6)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 검출하기 위한 것일 수 있으며, DNA, RNA 또는 PNA의 형태일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 miRNA21, miRNA1246 및 let7b을 검출하기 위한 생물학적 탐침으로서 PNA 프로브를 이용하였다. 상기 miRNA를 검출하기 위한 PNA 프로브는 각각 PNA-21, PNA-1246 및 PNA-let7b으로 명명하였으며, 상기 PNA 프로브의 염기서열은 각각 서열번호 1 (PNA-21), 서열번호 2 (PNA-1246) 및 서열번호 3 (PNA-let7b)으로 표현할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 바이오센서는 상기 miRNA21, miRNA1246 및 let7b을 모두 검출하기 위한 것으로서, 상기 반응부는 1 이상의 구역으로 분할되어 있으며, 각각의 구역에는 1종의 miRNA를 검출할 수 있는 생물학적 탐침(구체적으로, PNA-프로브)이 구분되어 부착될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 바이오센서는 상기 miRNA21, miRNA1246 및 let7b을 모두 우수한 정확도로 검출할 수 있으며, 특히 상기 바이오센서의 miRNA21 및 let7b에 대한 표준 곡선이 보다 우수한 선형성을 나타내고 있음을 확인하였는 바, miRNA21 및 let7b를 보다 우수한 정확도로 검출할 수 있다.
또한, 상기 생물학적 탐침은 산화 환원 효소(redox enzyme)를 포함할 수 있다. 상기 산화 환원 효소는 기질을 산화 또는 환원시키는 효소를 의미할 수 있으며, 예를 들면, 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 리덕타아제, 카탈라아제 또는 디히드로게나아제를 포함할 수 있다. 상기 산화 환원 효소의 예는 혈당 옥시다아제, 락테이트 옥시다아제, 콜레스테롤 옥시다아제, 글루타메이트 옥시다아제, HRP(horseradish peroxidase), 알코올 옥시다아제, 글루코오스 옥시다아제 (glucose oxidase; GOx), 글루코오스 디히드로게나아제(glucose dehydrogenase; GDH), 콜레스테롤 에스테르게나아제, 아스코르브산 옥시다아제(ascorbic acid oxidase), 알코올 디히드로게나아제, 락카아제(laccase), 티로시나아제(tyrosinase), 갈락토오스 옥시다아제(galactose oxidase) 또는 빌리루빈 옥시다아제(bilirubin oxidase)를 포함할 수 있다.
상기 반응부는 상기 생물학적 탐침을 상기 반응부의 표면 또는 전극의 표면에 고정화하기 위한 링커를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “고정화(immobilization)”는 생물학적 탐침이 기판 또는 전극에 화학적 또는 물리적으로 결합을 형성하는 것을 의미할 수 있다. 상기 링커는 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 탄수화물, 폴리 L-리신, 수산화기, 티올기, 아민기, 알코올기, 카르복실기, 아미노기, 설퍼기, 알데히드기, 카르보닐기, 숙신이미드기, 말레이미드기, 에폭시기, 및 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물 또는 그의 조합일 수 있다. 구체적인 예로서, PANHS (pyrenebutyric acid N-hydroxy succinimide ester)일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “표적물질”은 시료 중에 존재할 수 있는 검출 대상 물질로서, 생물학적 탐침과 특이적으로 결합하는 물질을 의미할 수 있다. 검출할 수 있는 표적물질은 샌드위치, 경쟁 또는 치환 분석법 배치 (configuration)에 참여할 수 있는 하나 이상의 생물학적 탐침과의 특이적 결합 상호 작용에 관련될 수 있는 것들을 포함할 수 있다. 상기 표적물질의 예는, 펩티드(예를 들어, 호르몬)와 같은 항원, 햅텐, 탄수화물, 단백질(예를 들어, 효소), 약물, 미생물, 항체, 및 상보적인 서열과 서열 특이적 혼성화 반응에 참여할 수 있는 핵산 또는 그의 조합일 수 있으며, 구체적으로 miRNA일 수 있다.
상기 표적물질은 전립선암 마커일 수 있으며, 구체적으로 miRNA21, miRNA1246 및 let7b으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "전립선암 (prostate cancer, PCa)"은 전립선에서 발생하는 암을 의미한다. 전립선(prostate)은 방광 바로 밑, 직장 앞쪽에 있는 밤톨만 한 크기의 남성 생식기관으로, 정액의 일부를 만들어내고 저장하는 역할을 한다. 위로는 방광경부, 즉 방광에서 요도로 이행하는 부위와 인접해 앞쪽의 치골전립 선인대에 고정되어 있고, 아래로는 비뇨생식격막에 의해 고정되어 있다. 전립선에서 발생하는 암의 대부분은 전립선 세포에서 발생하는 선암(샘세포의 암)이며, 종양 조직의 분화 정도와 세포의 특성 등에 따라 유형을 구분할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "바이오마커(biomarker)" 또는 "마커(marker)"는 일반적으로 단백질, 핵산(DNA, mRNA, miRNA 등), 대사물질(지질, 당지질, 당단백질 및 당 등) 등의 유기생체분자를 이용해 몸 안의 변화를 알아 낼 수 있는 지표를 의미하는 것으로서, 구체적으로 특정 질병이나 또는 암의 경우에서 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료 반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 의미한다. 바이오마커는 그 활용에 따라, 약물 타겟의 존재를 확인하는 타겟마커, 병의 유무를 진단하는 진단마커, 특정 약물에 대한 반응군과 비반응군을 구별할 수 있는 예상마커, 약물 치료효과를 모니터링할 수 있는 대리표지자마커, 질병의 예후를 알려주는 예후 바이오마커 등이 있다.
상기 바이오센서는 전립선암 마커를 검출하기 위한 것일 수 있으며, 구체적으로 전립선암 진단을 위한 바이오센서일 수 있다.
상기 바이오센서는 시료 내 표적물질을 정량적으로 검출할 수 있으며, 구체적으로 상기 바이오센서에서 나타나는 검출 신호는 시료 내 표적물질의 농도 의존적으로 발생하는 바, 농도-검출 신호 표준 그래프를 통해 시료 내 표적물질을 정량적으로 분석할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 바이오센서는 전립선암 마커, 구체적으로는 miRNA21, miRNA1246 및 let7b 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA를 정량적으로 검출할 수 있으며, 구체적으로 상기 miRNA에 대한 검출 신호는 시료 내 miRNA의 농도와 비례하는 바, 농도-검출 신호 표준 그래프를 통해 시료 내 miRNA을 농도를 정량적으로 분석할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 바이오센서는 miRNA21, miRNA1246 및/또는 let7b를 검출함으로서 전립선암 발병 여부 또는 발병 위험 여부를 진단할 수 있으며, 특히 let7b은 다른 miRNA보다 현저히 우수한 전립선암 환자와 정상인 간의 전압 신호 변동 차이를 나타내고 있음을 확인하였는 바, 보다 우수한 전립선암 진단 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 바이오센서는 전립선암 진단을 위한 것일 수 있다.
상기 바이오센서는 상기 상호작용을 인식하여 전기적 신호로 변환하는 신호 변환부(신호 처리부)를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 반응부는 상기 신호변환부로터 분리가능한 것일 수 있다.
상기 신호변환부는 전계 효과 트랜지스터(Field-Effect Transistor, FET)를 포함할 수 있으며, 반응부의 전극과 트랜지스터의 상부 게이트 전극 사이의 연결로 이루어진 것일 수 있다. 상기 연결은 예를 들면, 플러그 형태를 가질 수 있다.
상기 반응부에 있어서, 상기 전극, 생물학적 탐침 및 표적물질을 수용하기 위한 테스트 셀을 통해 시료가 들어오게 되고, 시료 내 존재하는 표적물질은 생물학적 탐침과 결합하여 테스트 셀 내에 화학적 전위 기울기를 일으킨다. 용어 "화학적 전위 기울기(chemical potential gradient)"는 활성종의 농도 기울기를 의미할 수 있다. 그러한 기울기가 2개의 전극 사이에 존재할 때, 전위차는 회로가 열리면 검출될 수 있을 것이고, 상기 회로가 닫히는 경우 기울기가 없어질 때까지 전류는 흐를 것이다. 화학적 전위 기울기는 상기 전극 사이의 전위차 또는 전류 흐름의 인가로부터 생겨나는 어떠한 전위 기울기를 의미할 수 있다.
상기 전계 효과 트랜지스터는 기판; 절연층; 서로 이격되어 있는 소스 전극 및 드레인 전극; 게이트 전극; 상기 소스 전극과 상기 드레인 전극 사이에 배치된 채널층을 포함하는 것일 수 있다. 일 실시예에 따른 전계 효과 트랜지스터는, 하부 게이트 전극; 상기 하부 게이트 전극 상에 형성된 하부 절연막; 상기 하부 절연막 상에 형성되고 서로 이격되어 있는 소스 및 드레인; 상기 하부 절연막 상에 형성되고 상기 소스와 상기 드레인 사이에 배치된 채널층; 상기 소스, 상기 드레인, 및 상기 채널층 상에 형성된 상부 절연막, 및 상기 상부 절연막 상에 형성된 상부 게이트 전극을 포함하는 이중 게이트 전계 효과 트랜지스터(dual-gate FET) 일 수 있다.
상기 반응부에서 발생하는 작은 표면 전위전압 차이는, 채널층을 포함하는 이중 게이트 이온 감지 전계 효과 트랜지스터(ISFET)에서 발생하는 초정전결합으로 인해, 하부 전계 트랜지스터의 문턱전압변화를 크게 증폭시킨다. 여기서 증폭인자는 하부 절연막의 두께, 채널층의 두께, 상부 게이트의 절연막 두께에 의해 결정될 수 있다. 하부 절연막의 두께가 두꺼울수록, 상부 절연막 및 채널층의 두께가 얇을수록 증폭인자의 크기는 커질 수 있다.
상기 채널층은 초박막층일 수 있고, 예를 들면, 두께가 10 nm 이하, 9 nm 이하, 8 nm 이하, 7 nm 이하, 6 nm 이하, 5 nm 이하, 또는 4 nm 이하일 수 있다.
상기 채널층의 두께의 범위 내에서, 초박막체에 유기되는 하부 게이트 전극의 강한 전기장으로 인해, 상부 계면까지 모든 조건에서 제어할 수 있는 초정전결합이 발생한다. 이를 통해, 상부 게이트 계면에 유기되는 전자 및 정공 또한 제어하고, 누설 전류를 차단할 수 있다. 또한, 안정된 증폭인자를 허용하여, 표면 전위에 따른 선형적 반응, 히스테리시스, 및 드리프트 현상을 개선시키고, 상하부 게이트의 정전 결합을 지속시킬 수 있다. 또한, 상기 채널층의 두께의 범위 내에서, 초박막 채널층을 포함하는 트랜지스터는 기존 트랜지스터에 비하여 큰 증폭인자를 허용하면서, 이온 감지력도 증대될 수 있다. 또한, 상기 채널층의 두께의 범위 내에서 초박막 채널층을 포함하는 트랜지스터는 기존 트랜지스터에 비하여 안정성도 향상시킬 수 있다. 두꺼운 채널층에서 보여지는 변화하는 증폭인자는, 상부 계면에 유기되는 누설전류 요소와 결합하여, 이온 데미지로 인한 소자의 열화 현상을 일으킬 수 있다. 반면에 일정한 증폭인자를 허용하면서 누설 전류가 제어되는 일 구체예에 따른 트랜지스터는 이온 데미지 효과를 최소화할 수 있다. 또한, 기존 트랜지스터에서 하부 절연막이 과다하게 두꺼워질 경우, 하부 전장이 채널 영역을 모두 제어하지 못하는 현상이 일어나면서, 상하부 게이트의 정전 결합이 약해지게 되는데, 일 구체예에 따른 초박막 채널층을 포함하는 트랜지스터는 정전 결합을 유지하면서 큰 증폭인자를 얻을 수 있다. 상하부 게이트의 정전 결합 현상은 상부 채널 계면이 완전 공핍이될 경우에 발생하게 되는데, 기존 트랜지스터에서는 하부 게이트의 전장이 상부 채널을 제어하지 못하기 때문에 증폭현상이 발생하지 않는다.
상기 채널층은 산화물 반도체, 유기물 반도체, 다결정 실리콘, 및 단결정 실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다. 채널층이 반도체, 유기물 반도체, 다결정 실리콘, 및 단결정 실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 경우, 상하부 게이트 정전 결합이 발생하고 고감도 센서의 제작이 가능하며, 투명하고, 유연한 센서를 제공할 수 있다. 상기 채널층은 넓이 또는 길이에 제한받지 않으며, 이중 게이트 구조에서 상하부 게이트 전극을 사용하여 정전결합 현상을 활용할 수 있다.
또한, 상기 센서에 있어서, 상기 상부 절연막의 등가 산화막 두께(Equivalent oxide thickness)는 상기 하부 절연막의 등가 산화막 두께보다 얇은 것일 수 있다. 예를 들면, 상부 절연막의 두께는 약 25 nm 이하일 수 있고, 하부 절연막의 두께는 약 50 nm 이상일 수 있다. 상기 상부 절연막의 등가 산화막 두께가 상기 하부 절연막의 등가 산화막 두께보다 얇은 경우, 신호의 감도 증폭 현상을 유발할 수 있다.
상기 상부 절연막, 하부 절연막은 천연 또는 인공적으로 형성된 산화막을 포함하는 것일 수 있다. 상기 산화막의 예는 SixOy, HxfOy, AlxOy, TaxOy, 또는 TixOy (여기서, x 또는 y는 1 내지 5의 정수)를 포함할 수 있다. 상기 산화막은 단일, 이중, 또는 삼중 적층 구조를 가질 수 있다. 이를 통해, 물리적 두께를 증가시키고, 상부 절연막의 등가 산화막 두께는 감소시킴으로써, 센서의 감도를 증폭시키고, 누설 전류에 의한 열화 현상을 방지할 수 있다.
일 구체예에 따른 이중 게이트 이온 감지 전계 효과 트랜지스터는, 한 소자 내에 상부 절연막을 포함하는 전계 트랜지스터와 하부 절연막을 포함하는 하부 전계 트랜지스터를 동시에 포함하는 구조일 수 있다. 각각의 동작 모드에 따라서, 상부와 하부의 게이트로 독립적으로 동작할 수 있다. 소자의 상하부의 게이트를 동시에 사용하였을 때, 이중 게이트의 구조의 구조적 특수성으로 인하여 정전 결합 현상이 관찰되면서, 상하부 전계 트랜지스터의 상호연관성이 수립될 수 있다. 이중 동작 모드는 하부 게이트를 주 게이트로 사용하는 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 트랜지스터는 이중 게이트 모드로 동작하는 것일 수 있다.
상기 센서는 복수의 표적물질을 검출하기 위해 복수의 반응부, 및 복수의 트랜지스터를 포함하는 것일 수 있다. 상기 센서는 복수의 상기 반응부, 및 복수의 상기 이온 감지 전계 효과 트랜지스터를 포함하고, 상기 복수의 반응부와 복수의 이온 감지 전계 효과 트랜지스터는 각각 전기적으로 연결된 것일 수 있다. 상기 복수의 트랜지스터 내의 복수의 소스는 공통으로 접지되어 있고, 복수의 상부 게이트 전극은 공통으로 접지되어 있고, 및 복수의 하부 게이트 전극은 공통 전압이 인가되는 것일 수 있다. 예를 들면, 제1 트랜지스터와 제2 트랜지스터의 소스, 및 제1 반응부와 제2 반응부의 기준 전극은 공통으로 접지된 것일 수 있다. 예를 들면, 제1 트랜지스터와 제2 트랜지스터의 하부 전극에는 일정한 공통 전압이 인가되는 것일 수 있다. 또한, 상기 복수의 트랜지스터의 내의 복수의 드레인은 병렬 구조일 수 있다. 예를 들면, 제1 트랜지스터와 제2 트랜지스터의 드레인은 병렬 구조일 수 있다. 또한, 상기 복수의 반응부는 독립적으로 상이한 생물학적 탐침이 고정화된 것일 수 있다. 상기 복수의 트랜지스터는 상기 복수의 반응부로부터 동일한 또는 상이한 표적물질 신호를 감지하고, 이를 증폭하여 반도체 파라미터 분석기(semiconductor parameter analyzer)를 통해 신호를 출력할 수 있다.
상기 신호 변환부는 상기 트랜지스터와 전기적으로 연결되고, 상기 트랜지스터로부터 측정된 전위차로부터 시료 내 표적물질의 양을 결정하기 위한 연산 모듈을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 연산 모듈은 표적물질의 결정을 위한 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "표적물질의 결정"은 시료를 평가하기 위한 정성적, 반-정량적 및 정량적 과정을 의미할 수 있다. 정성적 평가에서, 결과는 시료 중에 표적물질이 검출되는지 여부를 나타낸다. 반-정량적 평가에서, 결과는 표적물질이 미리 정의된 어떤 경계 값 이상 존재하는지 여부를 나타낸다. 정량적 평가에서, 결과는 존재하는 표적물질의 양의 수치적 표시이다. 또한 측정된 수치의 변환은 전류 또는 전위의 특이적 수치를 특이적 장치 구조 및 표적물질에 대한 보정 수치에 의존한 표적물질의 수치로 변환시키는 룩업 테이블(look-up table)을 사용할 수 있다. 상기 연산 모듈은 표적물질의 알려진 농도에 따른 전위차를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 연산 모듈은 정상 대조군 대비 시료 내 표적물질의 양을 결정하는 것일 수 있다.
상기 바이오센서는 결과를 표시하기 위한 디스플레이부를 더 포함할 수 있다. 상기 디스플레이부는 결과를 표시하는 디스플레이 및 하나 이상의 조절 인터페이스(예를 들어, 전원 버튼, 또는 스크롤 휠 등)를 갖는 틀을 더 포함할 수 있다. 상기 틀은 센서를 수신하기 위한 슬롯을 포함할 수 있다. 틀의 내부에는 시료가 제공되었을 때 센서의 전극에 전위 또는 전류를 인가하기 위한 회로가 있을 수 있다. 상기 측정기에 사용될 수 있는 적절한 회로는 예를 들어 상기 전극을 가로지르는 상기 전위를 측정할 수 있는 이상적인 전압 측정기일 수 있다. 상기 전위가 측정될 때 열리거나 또는 전류의 측정을 위해 닫히는 스위치가 또한 제공될 수 있다. 상기 스위치는 기계적인 스위치(예를 들어, 릴레이) 또는 고상(solid-state) 스위치일 수 있다. 이러한 회로는 전위차 또는 전류차를 측정하는데 사용될 수 있다. 당업자에게 이해될 수 있는 것과 같이, 더 간단하고 더 복잡한 회로를 포함하는, 다른 회로들이 전위차 또는 전류 또는 양쪽 모두의 인가를 달성하는데 사용될 수 있다.
상기 바이오센서는 통신수단이 구비되어 있어 외부의 서버 또는 단말부와 정보의 송수신이 가능하도록 구성될 수 있다. 상기한 통신수단은 유선 또는 무선의 통신수단을 채용할 수 있다. 따라서 케이블 연결수단을 이용한 유선 통신을 이용할 수 있으며, Bluetooth 모듈 또는 Zigbee 모듈뿐만 아니라 5G, 4G, LTE, UWB, WiFi, WCDMA, USN, IrDA 모듈 등을 포함하는 무선의 통신 수단을 이용할 수 있다.
상기 단말부는 컴퓨터, 노트북, 스마트폰, 일반 휴대폰, PDA, 별도의 통신기능을 가지는 계측기 또는 제어 기기 등의 통신기를 포함할 수 있다. 상기 단말부는 중앙처리장치가 구비되어 있고 컴퓨터 프로그램, 애플리케이션 프로그램 등과 같은 소프트웨어를 구동할 수 있는 OS(operationg system) 기반이 되어있는 것일 수 있다. 따라서 상기 단말부는 상기 센서에서 제공하는 시료 내 분석물(표적물질) 측정데이터를 해석, 분석, 가공할 수 있는 응용프로그램이 탑재되어 있어 시료 내 분석물 측정데이터를 해석, 분석, 가공하는 기능을 수행하게 될 수 있다. 또한 상기 단말부는 상기한 시료 내 분석물 측정데이터 또는 시료 내 분석물 측정데이터를 해석, 분석, 가공한 데이터를 디스플레이하는 기능을 수행할 수 있다. 또한 상기 단말부는 센서의 제어부와 연결 또는 연동되어 있어서, 이 단말부에서 상기 센서를 운전, 제어하는 기능을 수행할 수 있다.
다른 양상은 상기 바이오센서에 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 바이오센서의 전기 전도도 변화를 관찰하는 단계를 포함하는, 표적물질 검출 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 용어 "검출"은 표적 물질의 출현 또는 존재를 발견 또는 확인하는 것을 의미할 수 있고, 예를 들어, 표적 물질을 동정하는 것 또는 시료에서 표적물질을 정량화하는 것을 포함할 수 있다.
상기 검출방법은 표적물질이 생물학적 탐침과 상호작용을 통해 발생한 전류 또는 전위를 측정하는 전기화학적 방법일 수 있다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, 상기 바이오센서를 이용하여 전립선암 마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 전립선암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
본 명세서에서의 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상,　진단이란 전립선암의 발병 여부를 판별하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "예후"는 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명의 목적상, 예후란 전립선암의 치료 후 해당 개체에서 치료 성공 여부, 생존, 재발, 전이, 약물반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 즉, 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.
본 명세서에서의 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적 상 전립선암으로　진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 암의 재발, 종양 성장, 약 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "개체"는 전립선암이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 모든 생물체를 의미하며, 구체적인 예로, 개, 고양이, 마우스, 래트, 원숭이, 소, 돼지, 미니돼지, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전립선암 마커는 miRNA21 (서열번호 4), miRNA1246 (서열번호 5) 및 let7b (서열번호 6)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 바이오센서를 이용하여 전립선암 마커의 발현 수준을 측정하는 단계는 전립선암 마커를 검출할 수 있는 바이오센서에 상기 시료를 접촉시키는 단계 및 상기 바이오센서의 전기 전도도 변화를 관찰하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 바이오센서는 상기 전립선암 마커를 검출할 수 있는 생물학적 탐침을 포함하는 본 발명의 바이오센서일 수 있다.
상기 방법은 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료로부터, 전립선암 마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 개체 및 상기 대조군의 발현 수준을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "대조군"은 전립선암이 발병되지 않은 일반 개체, 비-전립선암 환자군, 비환자군 등을 의미하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 개체에서의 전립선암 마커의 발현 수준이 상기 대조군보다 높은 경우, 상기 개체를 전립선암이 발병한 것으로 판별하거나 발병 위험을 높은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 바이오센서는 소변 시료 내의 표적물질을 효과적으로 검출할 수 있는 것으로서, 상기 바이오센서를 이용하면 비침습적으로 신속 정확하게 전립선암을 진단할 수 있다는 장점이 있다.
도 1의 a는 환자 소변에서 일회용 및 전환 가능한 전기 센서를 기반으로 하는 소변 miRNA 감지 시스템의 개략도를 나타낸 도면이고, b는 일회용 센서칩의 화학적 제조 및 표면 개절 공정을 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 바이오 센서의 반응부를 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 3의 a는 원자력 현미경으로 관찰한 형태학적 이미지 및 두께에 대한 선-프로파일 결과를 나타낸 도면으로서, rGON의 너비와 높이는 각각 약 ~500nm 및 1.5nm로 나타났으며, b는 UV-vis-NIR 흡광도 스펙트럼 결과를 나타낸 도면으로서, sp2 탄소 구조 도메인의 부분 복원에 의한 rGON의 방향족 탄소 결합의 π-π 전이에서 흡광도의 적색 편이를 보여준다.
도 4는 ITO, ITO/SnO2, ITO/SnO2/rGON의 라만 스펙트럼 결과를 나타낸 도면으로서, ITO/SnO2/rGON의 라만 스펙트럼은 rGON의 전형적인 특징인 D 밴드와 G 밴드가 각각 1360cm-1과 1600cm-1에 위치하는 것을 보여준다.
도 5는 일회용 센서 칩의 표면 개질에 따른 특성 분석 결과를 나타낸 도면으로서, (a) SnO2, (b) rGON, (c) PANHS 및 (d) PNA 프로브의 원자력 현미경 위상 이미지를 나타내고, 및 (e) 라인 프로파일을 나타낸다. 상기 라인 프로파일 결과 SnO2, SnO2/rGON, SnO2/rGON/PANHS 및 SnO2/rGON/PANHS/PNA의 높이가 0에서 3.5 nm로 점차 증가했음을 알 수 있다. f는 SnO2, SnO2/rGON, SnO2/rGON/PANHS 및 SnO2/rGON/PANHS/PNA의 상대 표면 평균 전위를 나타내는 도면으로서, HOPG의 중성 대표자를 사용하여 각각 54.4±0.5, -146.7±0.7, - 116.6±0.3 및 -119.5±0.4mV를 나타낸다.
도 6의 a는 하단 게이트 스윕에서 측정된 miRNA 센서의 이동 곡선을 나타낸 도면이고, b는 pH 3에서 11까지의 완충 용액에서 miRNA 센서의 pH 감도를 나타낸 도면이다.
도 7의 a는 60분 동안 인간 소변 및 PBS에서 측정된 miRNA 센서의 드리프트 특성을 나타낸 도면이고, b는 20분 동안 세척한 후 인간 소변 및 PBS에서 VBG의 변화를 나타낸 도면이다.
도 8의 일회용 센서칩의 안정성 테스트 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 miRNA를 검출할 수 있는 프로브가 장착된 일회용 센서칩에서 표적 miRNA 및 1개의 염기가 다른 miRNA에 대한 전기 신호 변화를 나타낸 도면이다.
도 10은 일회용 센서칩의 웰 간의 전기 신호 차이를 나타낸 도면으로서, 사용하기 전 miRNA를 표적으로 하는 프로브가 고정된 각각의 독립적인 웰의 ID-VG 분석 결과, 웰 간의 전기 신호 차이는 없는 것을 알 수 있다.
도 11은 3개의 표적 miRNA, (a, d) miR21, (b, e) miR1246, (c, f) Let7b의 농도에 따른 miRNA 센서의 ID-VG 결과를 나타낸 도면으로서, a, b 및 c는 1x PBS 조건, d, e 및 f는 인간 소변 시료 조건에서 측정한 결과이다.
도 12는 3개의 miRNA, (d) miR21, (e) miR1246 및 (f) Let7b에 대한 miRNA 센서의 표준 곡선을 10 fM에서 10 nM 범위의 동적 용량에서 나타낸 도면으로서, a, b 및 c는 1x PBS 조건, d, e 및 f는 인간 소변 시료 조건에서 측정한 결과이다.
도 13의 a는 환자당 동시에 3개의 서로 다른 miRNA에 대한 실시간 모니터링을 위한 일회용 센서 칩을 나타낸 도면이고, b는 전립선암 환자와 전립선암이 없는 환자의 전압차를 나타낸 도면이다. 정상에 비해 암 환자에서 더 높은 수준의 암 특이적 miRNA가 모니터링되었으며 이는 병리학적 진단과 일치하였다.
도 14는 실시간-qPCR에 의한 miRNA 발현 수준 확인 결과를 나타낸 도면으로서, 환자의 소변(D)과 정상 소변(I) 사이의 miRNA(miR21, miR1246 및 Let7b)의 상대적인 발현 수준을 나타낸다 (오차 막대는 평균±SE(n = 3)을 나타낸다, ****p < 0.0001, ***p < 0.001).
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 환자 소변 시료 정보
모든 소변 샘플과 임상 결과는 고려대학교 의과대학 (서울)의 지침에 따라 사전 동의 후 환자로부터 수득하였다. 인간 소변 분석을 위한 프로토콜은 고려대학교 의과대학 윤리위원회와 고려대학교 안암병원 (IRB no. 2018AN0332)의 승인을 받았고, 인간 소변 분석 방법은 승인된 지침에 따라 수행되었다. 사용된 소변 샘플은 다음과 같다:
비-암 소변 (77, 62, 62, 78세), 전립선암 소변 (69세, GS (3+3); 80세, GS (3+3); 58세, GS (4+4); 80세, GS (4+4); 56세, GS (4+5); 69세, GS (4+4)).
실시예 2: 소변 miRNA 감지 시스템(바이오센서)의 제작
본 발명에서는 환자 소변에서 높은 감도와 특이성을 가지는 일회용 및 전환가능한 그래핀-기반 전기 센서를 기반으로 하는 무-표지(label-free) 소변 miRNA 감지 시스템 및 이를 이용한 비침습적 임상 진단 방법을 제공한다(도 1a). 상기 센서의 감지 모듈은 손쉽게 FET 본체에 연결할 수 있고, 전립선암 환자로부터 얻은 소변 샘플에서 miRNA 마커를 신속하고 전확하게 검출할 수 있다. 상기 miRNA 감지 시스템을 구성하기 위해, 환원된 산화 그래핀 나노시트 (reduced graphene oxide nanosheet, rGON)로 작용기화된 일회용 센서칩의 표면을 설계하였고, 이어서 PNA(peptide nucleic acid)을 표면에 고정시켰다(도 1b).
한편, 상기 바이오센서의 신호 처리부(신호 변환부)에 해당하는 전계 효과 트랜지스터(Field-Effect Transistor, FET)는 공지된 문헌(Adv. Healthcare Mater. 2017, 6, 1700371)에 설명된 방법에 따라 제작되었다.
또한, 본 발명의 소변 miRNA 감지 시스템의 반응부(센싱부)를 제작하기 위해 하기와 같은 과정을 수행하였다.
2-1: ITO/SnO2 - 기판 제작
상기 바이오센서의 반응부(센싱부)에 해당하는 일회용 센서 칩을 제작하기 위해, 기판은 약 19*27*0.7t(mm) (가로, 세로, 두께)의 유리(glass)를 사용하였다. 표준 RCA cleaning을 실시한 후, E-beam evaporator를 사용하여 기판 표면에 전기적 전위차를 측정하기 위한 작업 전극으로 인듐/주석 산화물 필름(indium tin oxide, ITO, 300nm)를 증착하였다. 다음에, 절연 전극으로, 산화막인 SnO2 막을 RF 스퍼터를 사용하여 상기 ITO 층 위에 약 45 nm 두께로 증착하였다. 이 때 RF power는 약 50 W이었다. 이후에, 약 20 sccm의 유동 속도(flow rate)를 갖는 Ar 가스 조건 및 약 3 mtorr 압력 조건에서 스퍼터링 공정을 수행하였다. 다음으로, PDMS(Polydimethylsiloxane) 웰을 제작하기 위해, 염기 및 경화제 (Sygard 184)를 10:1의 비율로 제형화하였고, 혼합물을 60 ℃에서 3시간동안 경화시켰다. 상기 PDMS 웰은 O2 플라즈마 처리 후(70W, 1분 동안 30 sccm의 O2 가스 흐름, Plasma System Cute, Femto Science), 상기 절연 전극 상에 부착하여 반응부를 제작하였다. 상기 테스트 셀은 4개의 웰을 가지는 연장된 게이트(extended gate: EG)로 제작하였다. 아울러, 기준 전극으로는 은/염화은 전극을 사용하였다.
2-2: rGON(reduced graphene oxide nanosheet) 제작
본 발명의 일회용 센서칩에 사용하기 위한 rGON(reduced graphene oxide nanosheet)는 하기와 같은 방법으로 제작하였다.
먼저, 산화 그래핀(graphene oxide, GO)은 수정된 Hummers 방법에 따라 그래파이트로부터 합성되었으며 추가로 4 ℃에서 6시간 동안 초음파 처리되었다.
다음으로, 열 조건에서 L-아스코르브 산을 사용하여 rGON을 제조하였다. 구체적으로, L-아스코르브 산 50mg을 산화 그래핀 50mL(0.1mg/mL) 수용액에 녹인 후 120 ℃에서 24시간 동안 격렬하게 교반하였다. 이후 교반을 유지시키며 80시간동안 실온에서 식힌 후, 48시간 동안 10kDa 막을 사용한 투석에 의해 rGON을 수집하였고, 다음 실험을 위해 DW (deionized autoclaved water)로 재현탁하였다.
상기에서 제작한 rGON의 크기와 위상은 원자력현미경 (atomic force microscopy, AFM) (XE-100, Park System) 으로 관찰한 결과, 라인-프로파일 이미지는 rGON의 직경과 두께가 각각 ~500nm 및 ~1.5nm임을 보여주어, 전형적인 rGON의 단일층을 형성했음을 알 수 있다 (도 3a). 다음으로, UV-2550 spectrophotometer (Shimadzu, Japan)을 사용하여 GO 및 rGON의 자외선 가시 근적외선 (ultraviolet-visible-near-infrared, UV-vis-NIR) 흡수 스펙트럼을 분석한 결과 235cm-1에서 GO의 전형적인 흡수 피크는 방향족 탄소 결합의 π-π 전이에 의해 관찰되었고, rGON은 적색 편이를 보였으며, 가시광선과 근적외선 영역에서 넓은 광 흡수도가 증가하여, sp2 탄소 구조 도메인의 부분 복원을 지지하는 것을 확인하였다(도 3b).
따라서, 상기 결과를 토대로, 일회용 센서칩에 사용하기 위한 rGON가 성공적으로 제작되었음을 알 수 있다.
2-3: rGON를 이용하여 ITO/SnO2 기판 개질
SnO2/ITO 기판의 SnO2 표면을 rGON로 관능화(functionalization)하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다
구체적으로, SnO2 기판에 친수성인 히드록시기(-OH)를 형성하기 위해 일회용 센서 칩의 표면을 70W에서 1분 동안 O2 플라즈마 시스템으로 처리하였으며, 이후 양전하 작용기인 아민기(-NH2)를 형성하기 위해 5% 3-아미노프로필트리에톡시실란 (3-aminopropyltriethoxysilane, APTES)를 포함하는 에탄올 용액을 1시간 동안 처리했다. 일회용 센서 칩을 에탄올로 세척하고 120℃에서 30 분간 구웠다. 그런 다음, rGON (0.1 mg/mL)으로 실온에서 침지하여 SnO2 표면의 양전하와 rGON의 음전하 사이의 정전기적 상호작용에 의해 rGON로 관능화하였다. 상기 rGON은 상온에서 진행되는 간단하고 신속한 증착 방법인 드롭 캐스팅(drop-casting) 방법을 사용하여 2차원 박막으로 증착되었다.
rGON은 복원된 sp2 탄소 구조 도메인을 제공하여, 넓은 표면적에 걸쳐 miRNA를 캡처하기 위한 PNA 프로브로 쉽게 관능화될 수 있다. 또한, rGON은 전도성과 전자 이동성을 향상시켜, 고유한 전기적 노이즈를 낮추고 보조 인자 없이 신호 향상을 가능하게한다. 따라서, rGON이 증착된 일회용 센서 칩은 소변에 포함된 miRNA를 포착하기 위한 전기 신호에 더 민감한 반응을 보인다.
상기에서 제작한 ITO/SnO2/rGON의 특성을 분석하기 위해, 대물렌즈(50Х, 개구수=0.50)가 장착된 BXFM 공초점 현미경을 통해 초점이 맞춰지고, 여기 소스로 20mW Arion CW 레이저(514.5nm)를 사용하는 LabRAM HR UV-vis-NIR(Horiba Jobin Yvon, France)를 이용하여 ITO/SnO2/rGON의 라만 스펙트럼을 분석하였다. 그 결과, ITO/SnO2/rGON의 라만 스펙트럼은 rGON의 전형적인 특징인 1360cm-1 및 1600cm-1 각각에 위치한 D 및 G 밴드의 두 개의 주요 밴드를 나타내는 것을 확인하였는 바 (도 4), rGON로 작용기화가 이루어졌음을 알 수 있다.
2-4: 프로브 고정화 (probe immobilization)
상기 실시예 2-3에서 제작된 ITO/SnO2/rGON 기판 상에 프로브를 고정화시키기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 1 μM의 PANHS (pyrenebutyric acid N-hydroxy succinimide ester)가 포함된 N, N 디메틸메탄아미드(N, N dimethylmethanamide, DMF)를 첨가하여 6시간동안 실온에서 인큐베이션하여, rGON의 표면에 π-π 상호 작용에 의해 PANHS를 안정화/부동화(passivation)하였다. 이어서 DMF와 1ХPBS를 사용하여 두 번 세척하고, 표적 miRNA와 결합할 수 있는 1μM PNA 프로브가 포함된 1ХPBS를 실온에서 밤새 배양한 후, 증류수와 1ХPBS를 사용하여 2회 세척하였다. 상기 PNA 프로브의 말단에는 중성 전하 폴리에틸렌글리콜(PEG)-아민과 추가 탄소 사슬이 존재하며, 이는 PANHS를 링커로 하여 PNA를 rGON 표면에 능동적으로 고정시킬뿐만 아니라, PNA 프로브를 사용할 때 중요한 응집을 방지할 수 있다. 또한, 중성 펩타이드 백본이 있는 PNA 프로브는 일반적으로 사용되는 DNA 기반 프로브와 비교하여 miRNA에 대해 더 큰 서열 특이적 친화도 및 안정성을 제공한다. 상기 PNA는 표적 miRNA와 PNA-miRNA 혼성화 후, 장치의 전기적 신호 이동은 miRNA의 전자 전하에 의해 결정된다. 본 발명에서 사용하는 PNA 프로브 및 표적 miRNA의 서열은 하기 표 1에 기재하였다.
PNA 프로브 서열 (N → C) 서열번호
PNA-21 TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A 1
PNA-1246 CCT GCT CCA AAA ATC CAT T 2
PNA-let7b AAC CAC ACA ACC TAC TAC CTC A 3
표적 miRNA 서열 (5' → 3') 서열번호
miRNA21 UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A 4
miRNA1246 AAU GGA UUU UUG GAG CAG G 5
let7b UGA GGU AGU AGG UUG UGU GGU U 6
mismatch UAG CUU AUC AUA CUG AUG UUG A 7
상기에서 제작한 SnO2/rGON/PANHS/PNA의 특성을 확인하기 위해, AFM 라인 스캔 분석을 수행한 결과, SnO2, SnO2/rGON, SnO2/rGON/PANHS 및 SnO2/rGON/PANHS/PNA에서 높이가 0에서 3.5nm로 점진적으로 증가했음을 확인하였다 (도 5a 내지 e). 또한, zetasizer ZSP (Malvern, UK)를 이용하여 SnO2, SnO2/rGON, SnO2/rGON/PANHS 및 SnO2/rGON/PANHS/PNA의 표면 평균 전위를 측정한 결과, 고배향 열분해 흑연 (highly oriented pyrolytic graphite, HOPG)의 중립 대표자를 사용하여, 각각 -54.4 ± 0.5, -146.7 ± 0.7, -116.6 ± 0.3 및 -119.5 ± 0.4 mV으로 결정되었다 (도 5f).
상기 결과를 종합해보면, 상기 결과는 본 발명의 miRNA 감지 플랫폼의 일회용 센서 칩의 rGON 및 PNA를 사용한 단계적 표면 작용기화의 결과와 일치하는 것을 알 수 있다.
실시예 3: miRNA 센서의 전기적 성능 및 안정성 평가
3-1: miRNA 센서의 감도 평가
본 발명의 miRNA 센서 시스템은 일정하고 안정적인 전류에서 기준(reference)과 검체 사이의 전압 차이를 측정하여 표적 바이오마커의 존재를 식별하기 때문에, 공급원으로부터 본 발명의 장치의 드레인까지의 전류 안정성이 중요하다. 따라서, 완충 용액에서 센서의 전기적 특성을 조사하고, miRNA 센서의 개질된 일회용 센서 칩에서 하단 게이트 스위프를 사용하여 전달 곡선 (ID-VG) 및 pH 감도를 결정하였다.
구체적으로, 도 6a에서는 1x PBS에서 게이트 스위프(-13 ~ 20V)에 의한 센서의 ID-VG 곡선 및 출력 특성 곡선 (ID-VD)을 보여준다. 듀얼 게이트 작동에서 센서는 낮은 임계 전압(Vth), 온/오프 전류 비율 (> 105) 및 서브임계 스윙 (1746 mV/dec)을 보여주었다. 또한, 도 5b에서 Nernst 한계 (59 mV/pH)보다 15배 더 큰 930 mV/pH의 고도로 향상된 pH 감도가 다양한 pH 값 (pH 3-11)에서 관찰되었다. 상기 결과를 토대로 상기의 개질된 일회용 센서 칩을 적용한 miRNA 센서가 높은 감도를 갖는 것을 확인할 수 있는 바, 바이오센서로 사용할 수 있음을 알 수 있다.
3-2: miRNA 센서의 내구성 및 안정성 평가
소변 환경에서 장치의 내구성과 안정성이 필수적이기 때문에, 전류 신호의 기능으로서의 실시간 드리프트 특성을 인간 소변과 1ХPBS에서 평가했다 (도 7). 구체적으로, 개질되지 않은 일회용 센서 칩과 비교하여, rGON로 개질된 일회용 센서 칩을 포함하는 센서는 전류 신호의 극히 적은 시프트를 나타냈으며, 1ХPBS 및 희석되지 않은 소변 모두에서 전압 시프트의 낮은 변화를 나타내며, 안정적인 응답을 보여주었다. 또한, 소변 또는 1ХPBS에서 20분 동안 전기 신호 측정을 수행한 경우에도 안정적인 결과를 나타냈는 바, 개질되지 않은 일회용 센서 칩의 SnO2 기판과는 달리, rGON에 의한 표면 개질은 소변 miRNA 검출에 어려움을 줄 수 있는 아스코르브산 및 요소 화합물과 같은 바람직하지 않은 요소 및 다양한 pH 조건에 의한 간섭을 현저하게 억제할 수 있음을 알 수 있으며, 이러한 결과는 안정적이고 민감한 실시간 바이오 센서로서의 중요한 안정성을 보여준다.
또한, 제작된 일회용 센서 칩을 4℃에서 2주 동안 보관한 경우에도, 원래 반응의 95% 이상이 여전히 유지될 수 있음을 확인하였는 바(도 8), 우수한 내구성 및 안정성을 가지는 것을 알 수 있다.
3-3: miRNA 농도에 따른 감도 평가
시간 함수로 드레인 전류를 모니터링하여 검출대상인 miRNA의 다양한 농도 (0-10 nM)에 대한 센서의 감도를 확인하였다. 이를 위해, miRNA21를 검출하기 위한 PNA-21 프로브 (miR21)를 일회용 센서 칩에 적용하였다. 그 결과, 측정 과정 전반에 걸쳐, 하나의 염기만이 불일치한 서열을 갖는 miRNA와 완충 용액 자체에서는 유의미한 전류 신호 변화가 검출되지 않았으나, 검출대상인 표적 miRNA는 넓은 농도 범위에서 반응하여 검출되는 것을 확인하였다 (도 9). 상기 결과를 토대로, 본 발명의 miRNA 센서는 서열-특이적 방식에 의한 표적 miRNA의 특이성이 뛰어난 것을 알 수 있다.
실시예 4: miRNA 센서의 miRNA 검출능 평가
본 발명의 miRNA 센서 시스템의 시료 조건에서 miRNA 검출능 등의 센서 성능을 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 본 발명의 일회용 센서칩의 각 웰에 Let7b, miR1246 또는 miR21를 검출할 수 있는 프로브를 고정화시키고 각 웰 간의 전기신호 차이가 있는 지 확인한 결과, 차이가 거의 없음을 확인하였다(도 10).
다음으로, miRNA의 농도에 따른 전기신호를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로 FET를 사용하여 ID-VG 곡선을 얻기 위해, 이중-채널 매개변수 분석기 (A dual-channel parameter analyzer, 4200A-SCS, Keithley)를 사용하였다. ID-VG 곡선의 경우, 하단 게이트의 스위핑 전압(sweeping voltage) 및 드레인 전압(drain voltage)의 범위는 각각 -5 내지 5 V 범위로 하였다. 표준 곡선을 얻기 위해, 다양한 miRNA의 농도에 따른 전압 변화를 플롯화하였으며, ID-VG 곡선에서 초기 전압 값은 10 nA에서 VG 값으로 결정되었다. 또한, miRNA 용액에서 20분 동안 배양한 후, 검출 전압은 10 nA에서 측정되었으며, 최종 전기 신호는 20 분 동안 배양된 종점 신호에서 기준으로부터 1Х PBS 자체의 초기 신호를 빼서 정규화되었다. 그 결과, 센서의 증폭 곡선은 3개의 표적 miRNA에 대해 유사한 경향성을 나타내며, 구체적으로 ID-VG 곡선은 1x PBS 및 희석되지 않은 정상 소변에서 다양한 miRNA 농도에 따라 동일한 방향으로 점차적으로 이동되는 것을 확인하였다 (도 11).
또한, 상기 3가지 miRNA에 10 fM 내지 10 nM 농도 범위에 대한 센서의 표준 곡선은 우수한 선형성을 가진 동적 범위를 나타내는 것을 확인하였다 (도 12). 구체적으로, miRNA21, miRNA1246 및 let7b에 대한 표준 곡선은 PBS 조건뿐만 아니라 소변 시료 조건에서도 0.9이상의 R2를 나타내 우수한 선형성을 보였으며, 특히 miRNA21 및 let7b에 대한 표준 곡선이 보다 우수한 선형성을 나타내고 있었다. 이를 토대로 소변 miRNA 검출을 위한 기존의 다른 분석방법 및 센서들과 비교할 때, 본 발명의 miRNA 센서는 현저히 우수한 분석 성능을 가지는 것을 알 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 센서는 우수한 선형성과 10 fM의 낮은 검출 한계 (limit of detection, LOD)를 나타내어, 광범위한 바이오마커 농도에 대한 정량 분석에 사용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5: miRNA 센서의 임상적 평가
본 발명의 miRNA 센서가 실제 환자 소변 샘플에서 검출대상 miRNA를 효과적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 전처리 없이 10개의 온전한 인간 환자 및 정상인의 소변 샘플을 준비하고 상기 실시예와 동일한 과정에 따라 ID-VG의 전기 신호 시프트를 측정했다. 그 결과, miRNA21, miRNA1246 및 let7b에 대해 전립선암 환자와 정상인 간의 현저한 전압 신호 변동 차이를 나타냈으며(도 13), 정상 환자 (G-J)에 비해 암 환자 (A-F)에서 더 높은 수준의 암-특이적 miRNA가 검출되었고, 각 miRNA에 해당하는 전기 신호 값은 표준 곡선의 선형 범위에 있었다. 특히, let7b은 다른 miRNA보다 현저히 우수한 전립선암 환자와 정상인 간의 전압 신호 변동 차이를 나타내고 있음을 확인하였다. 상기 결과는 표 2에 기재된 환자의 병리학적 진단 및 실시간 qPCR에 의한 miRNA 발현 프로파일(도 14)을 통해서도 확인할 수 있다.
환자 나이 PSA 레벨
(ng/mL)		 전압 변화 ΔV (mV) 병리학적
상태		 등급 세포학적
상태
miR21 miR1246 Let7b
A 69 4.99 789 365 626 선암종
(Adeno-carcinoma)		 GS6 (3+3) 음성
(negative)
B 80 9.84 820 483 576 선암종 GS6 (3+3) 음성
C 58 97.25 797 444 680 선암종 GS8 (4+4) 음성
D 80 7.93 785 824 656 선암종 GS8 (4+4) -
E 56 8.03 761 661 574 선암종 GS9 (4+5) 음성
F 69 6.85 617 517 523 선암종 GS8 (4+4) 음성
G 77 0.845 406 179 103 정상 - -
H 62 5.87 375 183 137 정상 - -
I 62 3.13 133 123 230 정상 - -
J 78 6.09 119 109 187 정상 - -
더욱이, 표 2에 나타난 바와 같이 정상인인 H와 J는 환자 A에 비해 전립선 특이 항원 (Prostate-specific antigen, PSA) 수치가 더 높았는 바, 상기 결과는 생검이 필요하기 전 전립선 암의 초기 진단 결과가 실제 결과와 차이가 있음을 나타낸다. 혈청의 PSA 수준은 전립선 암의 일차 진단을 위한 가장 중요한 표준으로 알려져 있으나, 상기와 같이 환자에서 PSA의 불규칙한 발현 양상을 나타낼 수 있기 때문에 다른 추가적인 검출 방법으로 보완되어야 할 필요성이 있다. 이러한 맥락에서, 상기 결과는 본 발명의 miRNA 센서가 전립선 암 조기 진단을 위한 표준 PSA 테스트의 정확성을 보완할 수 있는 잠재력이 있음을 알 수 있다.
종합해보면, 본 발명에서는 감지 모듈(반응부)을 FET 본체에 간단히 연결할 수 있는 일회용 및 전환 가능한 그래핀-기반 전기 센서를 포함하는 라벨이-없는 소변 miRNA 감지 시스템을 개발하였다. 상기 miRNA 감지 시스템은 전처리 또는 신호 증폭 단계없이 환자 소변에서 miRNA를 실시간으로 검출할 수 있는 바, 본 발명의 miRNA 감지 시스템은 신뢰할 수 있고 실용적인 방법을 제공한다. 상기 센서의 모니터링 기술은 빠른 응답 시간, 내구성, 안정성, 향상된 특이성 및 감도를 나타낸다. 생체 적합성 그래핀 나노시트를 사용한 일회용 센서 칩의 표면 개질과 후속 PNA 프로브의 고정화로 인한 이점을 기반으로, 센서의 성능은 20분 이내에 1Х PBS 및 인간 소변 표본 모두에서 miRNA의 펨토몰랄 농도 이하까지(subfemtomolar) LOD의 신뢰성을 보유한다. 또한, 비 침습적 현장 진단 시스템에서, FET 본체에서 일회용 센서 칩을 분리하는 것은 감지 성능을 유지하면서 높은 내구성과 재사용 가능한 변환기를 제공하고, 다양한 miRNA의 검출을 위한 확장 가능한 플랫폼을 만들 수 있는 가능성을 제공한다. 마지막으로, 상기 센서는 전립선 암의 조기 진단을 위한 테스트의 정확도를 개선하기 위한 보완 전략을 제공하여, 생검을 수행하기 전에 표준 혈청 PSA와 소변 miRNA 테스트를 결합할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 miRNA 감지 시스템은 생체 의학 응용 분야에서 현장에서 사용할 수 있는 유망한 장치이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
[부호의 설명]
110: 반응부
111: 기판
112: 작업 전극
113: 절연 전극
114: 환원된 산화 그래핀 나노시트
115: 테스트 셀
116: 기준 전극

Claims (14)

  1. 시료 내의 표적물질과 물리적 또는 화학적 상호작용이 일어나는 반응부를 포함하는 바이오센서로서,
    상기 반응부는 환원된 산화 그래핀(reduced graphene oxide, rGO)을 포함하는 것인, 바이오센서.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 반응부는 기판; 상기 기판상에 형성된 전극; 및 상기 전극상에 형성된 환원된 산화 그래핀 층을 포함하는 것인, 바이오센서.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 반응부는 상기 표적물질과 특이적으로 결합하는 생물학적 탐침을 포함하는 것인, 바이오센서.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 생물학적 탐침은 DNA, RNA, PNA, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산, 탄수화물, 효소, 항체, 항원, 수용체, 바이러스, 기질, 리간드 및 멤브레인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 바이오센서.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 생물학적 탐침은 miRNA21, miRNA1246 및 let7b 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA를 검출하기 위한 것인, 바이오센서.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 반응부는 상기 생물학적 탐침을 상기 전극의 표면에 고정화하기 위한 링커를 포함하는 것인, 바이오센서.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 링커는 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 탄수화물, 폴리 L-리신, 수산화기, 티올기, 아민기, 알코올기, 카르복실기, 아미노기, 설퍼기, 알데히드기, 카르보닐기, 숙신이미드기, 말레이미드기, 에폭시기, 및 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 바이오센서.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 표적물질은 항원, 햅텐, 탄수화물, 단백질, 약물, 미생물, 항체, 및 상보적인 서열과 서열 특이적 혼성화 반응에 참여할 수 있는 핵산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 바이오센서.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 바이오센서는 소변 시료 내의 표적물질을 검출할 수 있는 것인, 바이오센서.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 표적물질은 전립선암 마커인 것인, 바이오센서.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 바이오센서는 상기 상호작용을 인식하여 전기적 신호로 변환하는 신호 변환부를 추가로 포함하고, 상기 반응부는 상기 신호 변화부로부터 분리가능한 것인, 바이오센서.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 신호 변환부는 전계 효과 트랜지스터(Field-Effect Transistor, FET)를 포함하는 것인, 바이오센서.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 전계 효과 트랜지스터는 기판; 절연층; 서로 이격되어 있는 소스 전극 및 드레인 전극; 게이트 전극; 상기 소스 전극과 상기 드레인 전극 사이에 배치된 채널층을 포함하는 것인, 바이오센서.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 바이오센서에 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 바이오센서의 전기 전도도 변화를 관찰하는 단계를 포함하는, 표적물질 검출 방법.
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