WO2022102747A1

WO2022102747A1 - 植物における環境ストレス診断装置、及び、環境ストレス診断方法

Info

Publication number: WO2022102747A1
Application number: PCT/JP2021/041742
Authority: WO
Inventors: 親弘三宅; 孝行早乙女
Original assignee: 国立大学法人神戸大学; 分光計器株式会社
Priority date: 2020-11-12
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2022-05-19
Also published as: EP4245125A1; JPWO2022102747A1; US20230408478A1

Abstract

本発明は、植物における環境ストレス状態を把握して診断する装置の改良技術に関する。　制御回路２０ｂは、第１測定光ＭＬ１よりも第２測定光ＭＬ２を高出力にすると共に第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２とが逆位相の矩形波となるよう測定用光源１２を制御し、さらに第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２を同期して出力させるよう測定用光源１２を制御して第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２を５ｋＨｚ～３０ｋＨｚの疑似的な１つの合成矩形波測定光ＭＬ３として形成する。　透過光検出器１８は植物試料Ｓを透過した合成矩形波測定光ＭＬ３を合成矩形波透過光ＴＬとして検出する。　解析回路２０ａは合成矩形波透過光ＴＬを利用して光吸収差を算出し、光吸収差を利用してＰ７００の酸化状態であるＹ（ＮＤ）をＲＯＳマーカーとして算出し、ＲＯＳマーカーを利用して植物の環境ストレス状態を診断する。

Description

植物における環境ストレス診断装置、及び、環境ストレス診断方法

関連出願

　本出願は、２０２０年１１月１２日付け出願の日本国特許出願２０２０－１８９００９号の優先権を主張しており、ここに折り込まれるものである。

　本発明は光合成活性を測定する装置、特に光合成活性を測定することで植物における環境ストレス状態を把握して診断する装置（環境ストレス診断装置）の改良技術に関する。

　従来から植物の光合成活性を知るための手段としてクロロフィル蛍光測定が利用されている。このクロロフィル蛍光測定は、主に光合成の初発段階である光化学系ＩＩの活性を検出する技術である。クロロフィル蛍光測定では、クロロフィルから放出されたわずかな光エネルギー（クロロフィル蛍光）をモニターすることで、光化学反応において水分子からどれだけの電子が生み出されたかを定量的に把握することができる。

　ところで、植物は日常的に様々な環境ストレスを受けている。この環境ストレスは植物の光合成を阻害し、余った光エネルギーは活性酸素（ＲＯＳ）の発生を伴って、植物の生長にダメージを与え得る。

　具体的には、植物細胞内にＲＯＳが蓄積すると、活性窒素、過酸化脂質、活性カルボニルの生成を引き起こし、その結果、細胞機能の損傷や枯死にもつながる恐れがある。例えばウリ科の作物のモデル植物であり低温感受性の作物として知られているキュウリは、低温ストレス下でＲＯＳによる生育障害を受ける。そのため、特に冬季のハウス栽培においては、温度管理に大きなコストがかかっている。

　つまり、植物におけるＲＯＳの発生、しいては植物の環境ストレスを早期に発見することができれば、上記キュウリのハウス栽培の例では適切な温度管理が可能となる。さらに、環境ストレスの早期発見は、植物育成におけるコスト削減効果や植物の生育評価に加えてストレス耐性品種等の選抜に役立てることもできる。他にも、環境ストレスの早期発見は植物における無機栄養素の欠乏状態を早期に発見し得る。このような観点から、近年では植物における環境ストレスの早期診断に関する研究が取り組まれている。

　例えば特許文献１には、クロロフィル蛍光強度の経時変化曲線において、クロロフィル蛍光強度が最大となる極大点ｐ以降に生じる最小の極小点ｓ（Ｓと定義する）、および、極小点ｓ以降に生じる最初の極大点ｍ（Ｍと定義する）を求め、ＳとＭの値を比較することで植物の健康状態を診断する植物健康診断装置に関する技術が開示されている。

特許第５８８１０８２号公報

　上記の特許文献１では、クロロフィル蛍光測定を利用して所定条件による解析をすることで植物の健康状態を早期に発見することができる。しかしながら、上述のようにクロロフィル蛍光測定は、主に光合成の初発段階である光化学系ＩＩの活性を検出する技術である。言い換えれば、クロロフィル蛍光測定のみでは光化学反応による電子が電子伝達の下流（光化学系Ｉ）においてどのように使用されているかについて知ることができない。

　すなわち、光化学系Ｉにおいて電子が酸素にわたって活性酸素（ＲＯＳ）を発生させている状態であっても、クロロフィル蛍光の測定のみでは有効な光化学系ＩＩの活性として検出されるおそれがあり、精度の良い環境ストレス診断を行うためにはまだまだ改良の余地がある。

　本発明は上記従来技術の課題に鑑みて行われたものであって、その目的は従来よりも精度良く早期に非破壊で植物の環境ストレス状態を診断することができ、且つ、屋外でも使用可能な植物における環境ストレス診断装置、及び、環境ストレス診断方法を実現することにある。

　上記課題を解決するために、本発明に係る環境ストレス診断装置は、
　植物試料へ測定光を照射する測定用光源と、前記植物試料へ光合成誘導光を照射する誘導用光源と、前記植物試料が収容されるとともに前記測定光および光合成誘導光が内部へ進入可能な密閉チャンバと、前記植物試料を透過した測定光を透過光として検出する透過光検出器と、該透過光検出器で検出された透過光を測定信号として受信する制御ユニットと、を含み、前記植物試料の環境ストレス状態を診断する環境ストレス診断装置であって、
　前記測定用光源は、波長が異なる２種類の第１測定光および第２測定光を出力し、
　前記誘導用光源は、波長が異なる２種類の第１光合成誘導光および第２光合成誘導光を出力し、
　前記制御ユニットは、前記透過光検出器で得られた検出結果を解析する解析回路と、前記測定用光源および誘導用光源を前記植物試料に対応させて制御する制御回路と、を有し、
　前記制御回路は、前期第１測定光と第２測定光とを異なる出力振幅に調整制御するとともに前記第１測定光と第２測定光とが逆位相の矩形波となるよう前記測定用光源を制御し、
　前記制御回路は、前記第１測定光と第２測定光を同期して出力させるよう前記測定用光源を制御して該第１測定光と第２測定光をＤＣ成分が含まれる５ｋＨｚ～３０ｋＨｚの疑似的な１つの合成矩形波測定光として形成し、
　前記透過光検出器は、前記植物試料を透過した前記合成矩形波測定光を合成矩形波透過光として検出し、
　前記解析回路は、前記合成矩形波透過光を利用して前記植物試料を透過した第１測定光および第２測定光の光吸収差を算出し、該光吸収差を利用して光合成において光化学系ＩのＰ７００が酸化された状態であるＹ（ＮＤ）を植物の活性酸素抑制指標であるＲＯＳマーカーとして算出し、
　前記解析回路は、前記ＲＯＳマーカーを利用して前記植物試料の環境ストレス状態を診断することを特徴とする。

　また、本発明に係る環境ストレス診断装置において、
　当該環境ストレス診断装置にはネットワーク接続するための通信部が設けられ、該通信部を介して当該環境ストレス診断装置は通信端末にネットワーク接続され、
　前記通信端末は当該環境ストレス診断装置の操作に利用され、且つ、測定結果としてのＲＯＳマーカーおよび環境ストレス診断結果が表示され、
　前記通信端末は環境ストレス診断データが蓄積されたデータサーバーにネットワーク接続され、該環境ストレス診断データと前記ＲＯＳマーカーとを比較して前記植物試料の環境ストレス状態を診断することを特徴とする。

　また、本発明に係る環境ストレス診断装置において、
　前記制御回路は、ＰＷＭ制御によって前記測定用光源から出力される前記第１測定光および第２測定光を同期させ、
　前記制御回路は、前記第１測定光および第２測定光における矩形波の立ち下がりのタイミングを指令周波数としてのリファレンス信号波形と比較し、
　前記制御回路は、前記測定用光源からの出力に起因して前記第１測定光および第２測定光における立ち下りのタイミングがずれた場合には該立ち下がりのタイミングを０．２５μｓ単位で調整して同期を維持することを特徴とする。

　また、本発明に係る環境ストレス診断装置において、
　前記誘導用光源は、前記第１光合成誘導光を連続的な照射として定常照射し、該定常照射した後に休止期間を設けずに該定常照射よりも高出力な照射としてパルス照射し、その後に休止期間を設けて前記第２光合成誘導光を定常照射し、該定常照射した後に休止期間を設けずにパルス照射し、
　前記パルス照射の照射時間は、１ｍｓ～３００ｍｓであることを特徴とする。

　また、本発明に係る環境ストレス診断装置において、
　前記密閉チャンバには、該密閉チャンバ内部における植物試料の酸素発生速度を測定する酸素濃度検出器が設けられ、
　前記解析回路は、前記ＲＯＳマーカーと前記酸素発生速度（光合成速度）との相関を利用して前記植物試料の環境ストレス状態を診断することを特徴とする。

　また、本発明に係る環境ストレス診断装置において、
　前記密閉チャンバには、温度センサー、湿度センサー、気圧センサーの全部ないしいずれかが環境センサーとして設けられ、
　前記解析回路は、前記環境センサーで得られた検出結果に基づいて前記酸素濃度検出器で検出された酸素発生速度を補正処理することを特徴とする。

　また、本発明に係る環境ストレス診断装置において、
　前記酸素濃度検出器は、ガルバニ電池式の酸素濃度検出器であることを特徴とする。

　また、本発明に係る環境ストレス診断装置において、
　前記密閉チャンバには、外部から呼気を導入するための呼気導入ポートおよび当該密閉チャンバ内部のエアーを入れ替えるためのエアー出力ポートが設けられていることを特徴とする。

　また、本発明に係る環境ストレス診断装置において、
　当該環境ストレス診断装置には、前記植物試料からのクロロフィル蛍光を検出する蛍光検出器が設けられ、
　前記解析回路は、前記蛍光検出器で得られたクロロフィル蛍光検出結果（飽和CO2状態時）から光合成速度としてのＹ（ＩＩ）と、光合成に利用できない光エネルギーとしてのＹ（ＮＰＱ）と、光化学系ＩＩにおける基礎的熱散逸能としてのＹ（ＮＯ）と、プラストキノン還元率としての１－ｐＬと、を算出し、
　前記解析回路は、前記光吸収差を利用してＰ７００の基底状態であるＹ（Ｉ）と、Ｐ７００が光エネルギーを吸収している状態であるＹ（ＮＡ）と、を算出し、
　前記解析回路は、前記Ｙ（ＩＩ）、Ｙ（ＮＰＱ）、Ｙ（ＮＯ）、１－ｐＬ、Ｙ（Ｉ）、Ｙ（ＮＡ）、およびＲＯＳマーカーであるＹ（ＮＤ）の全部ないしいずれかを利用して前記植物試料における無機栄養素の欠乏状態を診断することを特徴とする。

　また、本発明に係る環境ストレス診断装置において、
　前記解析回路は、時間経過を円状に表現してＹ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）をＹ（ＩＩ）で除した値がプロットされたサンプル診断グラフを作成し、
　前記解析回路は、無機栄養素がコントロールされた植物を示した基本診断グラフと前記サンプル診断グラフとを比較することで前記植物試料における必須栄養素であるＮ，Ｐ，Ｋ，Ｓ，Ｍｇ，Ｃａ，Ｂ，Ｚｎ、Ｍｏ，Ｃｕ，Ｆｅ，Ｍｎの全部ないしいずれかの欠乏状態を診断することを特徴とする。

　また、本発明に係る環境ストレス診断装置において、
　前記密閉チャンバには、該密閉チャンバ内部に位置する前記植物試料の温度を制御するための温調ユニットが設けられることを特徴とする。

　そして、本発明に係る植物における環境ストレス診断方法は、
　植物試料を密閉チャンバへ収容し、制御回路により測定用光源から出力される第１測定光および第２測定光を調整するとともに誘導用光源から出力させる第１光合成誘導光および第２光合成誘導光を調整する工程と、
　前記第１測定光よりも前記第２測定光を高出力にするとともに前記第１測定光と第２測定光とが逆位相の矩形波となるよう前記制御回路により前記測定用光源を制御し、且つ、前記制御回路により前記第１測定光と第２測定光を同期して出力させるよう前記測定用光源を制御して前記第１測定光と第２測定光をＤＣ成分が含まれる５ｋＨｚ～３０ｋＨｚの疑似的な１つの合成矩形波測定光として形成し、該合成矩形波測定光を前記第１光合成誘導光および第２光合成誘導光とともに前記植物試料へ照射する工程と、
　前記植物試料を透過した前記合成矩形波測定光を透過光検出器で１つの周波数の合成矩形波透過光として検出する工程と、
　前記合成矩形波透過光を利用して前記植物試料を透過した第１測定光および第２測定光の光吸収差を解析回路により算出し、該解析回路が該光吸収差を利用して光合成において光化学系ＩのＰ７００が酸化された状態であるＹ（ＮＤ）を植物の活性酸素抑制指標であるＲＯＳマーカーとして算出する工程と、
　前記ＲＯＳマーカーを利用して前記植物試料の環境ストレス状態を診断する工程と、を含むことを特徴とする。

　本発明によれば、制御回路は第１測定光よりも第２測定光を僅かに高く出力にするとともに第１測定光と第２測定光とが逆位相の矩形波となるよう測定用光源を制御する。さらに制御回路は、第１測定光と第２測定光を同期して出力させるよう測定用光源を制御して第１測定光と第２測定光をＤＣ成分が含まれる５ｋＨｚ～３０ｋＨｚの疑似的な１つの合成矩形波測定光として形成する。そして、植物試料を透過した合成矩形波透過光を利用してＲＯＳマーカーを算出し、得られたＲＯＳマーカーを利用した環境ストレス診断を行うことで、従来のクロロフィル蛍光測定に比べて精度良く早期に植物の環境ストレス状態を診断できる環境ストレス診断装置を提供することができる。

　その結果、本発明に係る環境ストレス診断装置で測定（および算出）したＲＯＳマーカー（またはＲＯＳマーカーと酸素発生速度等との相関）は、例えば低温ストレス耐性品種の選抜マーカーとして利用することができる。さらにＲＯＳマーカー（またはＲＯＳマーカーと酸素発生速度との相関や、これに加えてクロロフィル蛍光パラメータ）は、植物における無機栄養素の欠乏状態の診断（無機栄養ストレスの診断）にも利用することができる。

本発明の実施形態に係る環境ストレス診断装置の概略構成図を示す。本発明の実施形態に係る環境ストレス診断装置の概略イメージ図を示す。本発明の実施形態に係る誘導用光源の概略動作説明図を示す。本実施形態において光合成誘導光の照射によって得られるＰ７００吸収変化の概略イメージ図を示す。本発明の実施形態に係る呼気導入ポートおよびエアー出力ポートの概略説明図を示す。本発明の実施形態に係る呼気導入ポートおよびエアー出力ポートの概略イメージ図を示す。本発明の実施形態に係る環境ストレス診断装置の変形例を示す。本発明の実施形態に係る環境ストレス相関の一例を示す。本発明の実施形態における実測によるＲＯＳマーカーと光合成速度との相関イメージ図を示す。本実施形態においてデータサーバーを利用した環境ストレス診断の概略イメージ図を示す。本実施形態に係る携帯端末における表示画面の一例を示す。本発明の本実施形態に係る測定光照射の概略説明図を示す。本実施形態に係る合成矩形波測定光におけるＤｕｔｙ比の概略イメージ図を示す。本発明の実施形態に係る合成矩形波透過光の概略イメージ図を示す。本発明の実施形態に係る同期制御の概略説明図を示す。ＲＯＳマーカー（Ｙ（ＮＤ））の誘導原理の概略説明図を示す。本実施形態におけるＲＯＳマーカーと酸素発生速度の関係例を示す。本実施形態におけるＲＯＳマーカーと酸素発生速度との相関イメージ図を示す。Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（Ｉ）、Ｙ（ＮＡ）、Ｖ（Ｏ_２）の測定例を示す。無機栄養素が正常な状態の植物（ｃｏｎｔｒｏｌ）と無機栄養素が不足している状態の植物（ｆｒｅｅ）の比較イメージ図を示す。無機栄養素が正常な状態の植物（ｃｏｎｔｒｏｌ）と無機栄養素が不足している状態の植物（ｆｒｅｅ）の比較イメージ図を示す。本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０においてクロロフィル蛍光測定を行う場合の概略構成図を示す。クロロフィル蛍光検出における各パラメータの概略イメージ図を示す。光化学系Ｉにおける各パラメータの概略イメージ図を示す。時間経過を円状に表現してＹ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）、Ｙ（ＩＩ）をプロットした測定結果グラフの一例を示す。Ｙ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）をＹ（ＩＩ）で除した値を示した測定結果グラフの一例を示す。時間経過を円状に表現してＹ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）、Ｙ（ＩＩ）、Ｙ（ＮＯ）、Ｙ（ＮＰＱ）、１－ｑＬをプロットした測定結果グラフの一例を示す。Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）、Ｙ（ＮＰＱ）、１－ｑＬをＹ（ＩＩ）で除した値を示した測定結果グラフの一例を示す。Ｙ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）、Ｙ（ＩＩ）、Ｙ（ＮＯ）、Ｙ（ＮＰＱ）、１－ｑＬのそれぞれの値の大きさを円状に表現した測定結果グラフの一例を示す。本実施形態に係るＹ（ＮＤ）－Ｙ（ＩＩ）診断プロットの一例を示す。播種から２ヶ月経過後のヒマワリの生育した様子の概略イメージを示す。本実施形態におけるサンプル診断グラフによる診断イメージの概略図を示す。本実施形態に係る環境ストレス診断装置において温調ユニットを追加した概略構成図を示す。本実施形態において温調ユニットを利用した測定結果の一例を示す。

　以下、本発明の環境ストレス診断装置について図面を用いて説明するが、本発明の趣旨を超えない限り何ら以下の例に限定されるものではない。

　図１に本発明の実施形態に係る環境ストレス診断装置の概略構成図を示す。本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０は、主に屋外で使用するものである。すなわち、環境ストレス診断装置１０は、フィールド環境に持ち出せる可搬式の装置であるとともに、現場に持ち込んで直接植物（生葉）を計測して環境ストレス診断を行うものである。本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０は、５Ｖ～２０Ｖの電源バッテリー（例えば１２Ｖ電源バッテリー）を使用して駆動することができる。

　本実施形態では、例えば環境ストレス診断装置１０における筐体の一部に操作表示部を設け、該操作表示部により当該装置の操作や診断結果表示を行うことができる（図２（ａ）を参照）。

　また、環境ストレス診断装置１０には操作表示部を設けず（図２（ｂ）を参照）、当該装置の操作や診断結果表示をスマートフォンやタブレッドなどの通信端末（携帯端末）で行うようにしても良い。この場合、通信端末と環境ストレス診断装置１０との通信は、無線通信により行うことができる（この場合、環境ストレス診断装置には通信部が設けられている）。

　本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０は可搬式の装置であるため実際にはバッテリーや他の電気部品等も必要であるが、図１では環境ストレス診断に必要な主要構成以外の部品等は図示を省略している。

　図１に示す環境ストレス診断装置１０は、植物試料Ｓへ測定光ＭＬを照射する測定用光源１２と、前記植物試料Ｓへ光合成誘導光ＰＬを照射する誘導用光源１４と、前記植物試料Ｓが収容されるとともに前記測定光ＭＬおよび光合成誘導光ＰＬが内部へ進入可能な密閉チャンバ１６と、前記植物試料Ｓを透過した測定光ＭＬを透過光として検出する光検出器１８と、該光検出器１８で検出された透過光を測定信号（電気信号）として受信する制御ユニット２０と、を含んで構成されている。

　本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０は、密閉チャンバ１６に収容された植物試料Ｓ（植物の生葉）に対して、特徴的な測定光照射を行うことで活性酸素抑制指標としてのＲＯＳマーカーを測定するものである。

　測定用光源１２は、波長が異なる２種類の第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２を出力する。本実施形態では、この第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２を利用して特徴的な測定光照射および二波長光吸収差測定を行う。具体的には、図１に示すように第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２は合成した１つの測定光ＭＬ３（合成矩形波測定光と呼ぶ。詳細は後述する）として植物試料Ｓへ照射される。

　測定用光源１２は、例えば２種類のＬＥＤを含んで構成されている。本実施形態における第１測定光ＭＬ１の波長は８１０ｎｍまたは８３０ｎｍであり、第２測定光ＭＬ２の波長は８８０ｎｍまたは９１０ｎｍである。なお、第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２の波長は、植物試料Ｓの種類や測定に応じて適宜変更することができる。

　ここで、本実施形態における二波長光吸収差測定では第２測定光ＭＬ２が植物試料Ｓを透過して得られる透過光ＴＬの波形データから第１測定光ＭＬ１が植物試料Ｓを透過して得られる透過光ＴＬの波形データを差し引くことで二波長の光吸収差波形を得ることができる。

　すなわち、詳細は後述するが測定対象であるＰ７００には基底状態にあるＰ７００（Ｙ（ＮＤ））、励起状態にあるＰ７００（Ｙ（ＮＡ））、酸化状態にあるＰ７００＋（Ｙ（ＮＤ））の３状態が存在する。そこで、Ｙ（ＮＤ）の量を見積るため、Ｙ（ＮＤ）に依存して大きく変化する波長領域を第１測定光ＭＬ１として選択し、３状態に共通し、Ｙ（ＮＤ）に大きくは依存しない波長領域を第２測定光ＭＬ２として選択することにより、第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２の差分を得ているのである。

　そして、本実施形態ではＭＬ１とＭＬ２とが合成された１つの測定光ＭＬ３を利用して二波長の光吸収差波形を得ることができる。本実施形態では、この光吸収差波形を利用してＲＯＳマーカー等を算出することができる。

　また、植物試料Ｓは光合成活性状態になるとＲＯＳマーカー等の各種パラメータが経時的に変化することになる。この時、光吸収の測定（植物試料Ｓを透過した光の検出）においては植物試料Ｓのバックグラウンドも経時的に変化してしまう。

　そこで本実施形態では、上記二波長光吸収差測定を行うことで測定におけるバックグラウンドを補正することもできる。すなわち、本実施形態における二波長吸収差測定は、バックグラウンドの経時変化をキャンセルさせるので正確な測定が実現できる。

　本実施形態の第２測定光ＭＬ２は、吸収変化が小さく、且つ、第１測定光ＭＬ１の波長（８１０ｎｍまたは８３０ｎｍ）に近い波長として８８０ｎｍまたは９１０ｎｍを採用している。

　誘導用光源１４は、波長が異なる２種類の第１光合成誘導光ＦＲおよび第２光合成誘導光ＡＬを植物試料Ｓに照射する。誘導用光源１４は、例えば２種類のＬＥＤを含んで構成されている。本実施形態における第１光合成誘導光ＦＲの波長は７４０ｎｍであり、第２光合成誘導光ＡＬの波長は６４０ｎｍである。なお、第１光合成誘導光ＦＲおよび第２光合成誘導光ＡＬの波長は、植物試料Ｓの種類や測定に応じて適宜変更することができる。例えば、第２光合成誘導光ＡＬの波長は４００ｎｍ～７００ｎｍ未満の範囲で適宜変更することもできる。

　本実施形態では、第１光合成誘導光ＦＲを出力するためのＬＥＤと密閉チャンバ１６との間にフィルタを設けることもできる。フィルタを設けることで、測定光ＭＬと第１光合成誘導光ＦＲとの干渉を抑制することができる。さらに本実施形態では、密閉チャンバ１６と光検出器１８の間（光検出器１８の前）に第１光合成誘導光ＦＲとＡＬを遮断する光学フィルタを設けることもできる。

　第１光合成誘導光ＦＲおよび第２光合成誘導光ＡＬは、図３に示されるように連続的な照射（定常照射と呼ぶ）と該定常照射よりも高出力照射であるパルス的な照射（パルス照射と呼ぶ。図３のＳＰ部分）が組み合わされて植物試料Ｓへ照射される。

　具体的には、誘導用光源１４は第１光合成誘導光ＦＲを連続的な照射として定常照射し、該定常照射した後に休止期間を設けずに該定常照射よりも高出力の照射としてパルス照射し、その後に休止期間を設けて第２光合成誘導光ＡＬを定常照射し、該定常照射した後に休止期間を設けずにパルス照射する。

　その後は、図３のように第２光合成誘導光ＡＬのみを植物試料Ｓへ照射する。なお、第１光合成誘導光ＦＲの照射は、例えば誘導光照射の最後に行うこともできる。また、本実施形態における定常照射は、第１光合成誘導光ＦＲおよび第２光合成誘導光ＡＬともに５秒～６０秒程度行われている。なお、この定常照射の時間は、測定する植物試料Ｓの種類によって６０秒以上行う場合もある。

　また、本実施形態では、第１光合成誘導光ＦＲの照射（定常照射およびパルス照射）を２回以上行うようにしても良い。第１光合成誘導光ＦＲの照射を２回以上行うことで後述する植物試料Ｓのアイドリング状態をより安定的に得ることができる。

　本実施形態における第１光合成誘導光ＦＲの定常照射による光量（光量子束密度）は、３０μｍｏｌｍ^－２ｓ^－１～７０μｍｏｌｍ^－２ｓ^－１程度である。また、第２光合成誘導光ＡＬの定常照射による光量（光量子束密度）は、１００μｍｏｌｍ^－２ｓ^－１～２０００μｍｏｌｍ^－２ｓ^－１程度である。

　図４には、本実施形態において光合成誘導光の照射によって得られるＰ７００吸光変化の概略イメージ図を示す。図４に示すように第１光合成誘導光ＦＲの定常照射は、植物試料Ｓにおける光化学系Ｉを定常動作状態（アイドリング状態）にするために行われる（密閉チャンバ１６内部は暗所であることから、植物試料Ｓにおける光化学系Ｉの光合成サイクルのきっかけを与える）。そして第１光合成誘導光ＦＲのパルス照射は、光化学系ＩにおけるＰ７００の全量（後述するＰ７００における各状態を示したＹ（Ｉ）、Ｙ（ＮＡ）、Ｙ（ＮＤ）の全量）を把握するために行われている。

　本実施形態では第１光合成誘導光ＦＲ（７４０ｎｍ）を植物試料Ｓへパルス照射することで、光化学系ＩＩを駆動させずに光化学系Ｉのみを駆動さることができる（または光化学系ＩＩの駆動よりも早く光化学系Ｉを駆動させることができる）。

　具体的には、植物試料Ｓにおける光化学系ＩはＦＲの定常照射によって定常動作状態になる。このときにＦＲのパルス照射をすることでＰ７００が完全酸化の状態になる。すなわち、光化学系Ｉにおける光合成サイクルが動作する前にＰ７００は完全酸化の状態となり、この状態を計測することで光化学系ＩにおけるＰ７００の全量を把握することができる。

　加えて、第１光合成誘導光ＦＲの波長が７００ｎｍ以上であれば光化学系Ｉのみを駆動させることができる。このように、本実施形態ではＦＲのパルス照射により光化学系Ｉのみを駆動させることでＰ７００の全量を適切に把握することができる。

　第２光合成誘導光ＡＬの定常照射は、植物試料Ｓにおける光合成サイクル（光化学系ＩＩおよび光化学系Ｉの両方を動作させる光合成サイクル）をアイドリング状態にするとともにＰ７００が酸化された状態であるＹ（ＮＤ）を把握するために行われる。すなわち、第２光合成成誘導光ＡＬは疑似的な太陽光照射の役割を果たしている。

　そして第２光合成誘導光ＡＬのパルス照射は、還元され基底状態にあるＰ７００（Ｙ（Ｉ））を把握するために行われている。また、ＦＲパルス照射によるＰ７００の全量とＡＬ照射によって把握できるＹ（Ｉ）＋Ｙ（ＮＤ）との差を算出することで光エネルギーを吸収している状態であるＰ７００＊（Ｙ（ＮＡ））を把握することができる。

　パルス照射ＳＰの照射時間は１ｍｓ～３００ｍｓであることが好ましく、より好ましくは５０ｍｓ～２５０ｍｓであることが好ましく、さらに好ましくは２００ｍｓであることが好適である。また、本実施形態におけるＡＬパルス照射の光量（光量子束密度）は、５０００μｍｏｌｍ^－２ｓ^－１～１５０００μｍｏｌｍ^－２ｓ^－１程度である。本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０は、この特徴的な誘導光照射技術により光化学系ＩにおけるＰ７００の酸化状態（ＲＯＳマーカー）を精度良く測定することができる。

　密閉チャンバ１６には、測定対象としての植物試料Ｓが収容される。本実施形態では、生葉を８～１６ｍｍ角程度に切ったものを植物試料Ｓとして利用することができる（植物試料Ｓは非破壊で測定される）。図１では図示を省略しているが、密閉チャンバ１６には測定用光源１２からの測定光ＭＬ（ＭＬ３）および誘導用光源１４からの光合成誘導光ＰＬ（ＦＲ、ＡＬ）がその内部に侵入できる位置に導光窓が設けられている。

　また、本実施形態では、測定用光源１２および誘導用光源１４から密閉チャンバ１６までの間にライトガイドを設けることもできる。ライトガイドを設けることで、測定光ＭＬおよび光合成誘導光ＡＬは同一光路で照射されるとともに測定試料Ｓ（Ｓの表面）への均一照射を実現することができる。

　同様に、例えば密閉チャンバ１６から光検出器１８までの間にライトガイドを設けることもできる。この位置にライトガイドを設けることで、効率良く透過光ＴＬを検出することができる。具体的には、ライトガイドを設けることで透過光検出器１８は透過光ＴＬを従来よりも２０％～３０％多く検出することができる。

　本実施形態における密閉チャンバ１６の体積は、２ｍｌから２０ｍｌ程度であることが好ましく、より好ましくは５ｍｌ～１０ｍｌであることが好ましく、特に８ｍｌであることが好適である。密閉チャンバ１６をこのような体積にすることで、飽和ＣＯ_２状態からおよそ２０分～３０分程度はＣＯ_２を枯渇せず測定を行うことができる。ここで、本明細書における飽和ＣＯ_２状態とは、二酸化炭素濃度が１％～４％程度になった状態を意味する。本実施形態では、密閉チャンバ１６内部の二酸化炭素濃度を１％～４％程度にして測定を行っている。また、本実施形態に係る密閉チャンバ１６は円柱形状であるが、例えば四角柱形状、半球型等、他の形状でも構わない。

　さらに本実施形態では、例えば図５および図６（ａ）に示すように密閉チャンバ１６に（または装置外部から密閉チャンバ１６へ接続されるように）、人の呼気（呼吸）を導入するための呼気導入ポート３０ａを設けることもできる。

　密閉チャンバ１６は、この呼気導入ポート３０ａによって人の呼気が導入されることで該密閉チャンバ１６内部において飽和ＣＯ_２状態を簡単に作り出すことができる（図６（ｂ））。この飽和ＣＯ_２状態を作り出すことで、測定時（特に屋外測定時）には最大光合成能力を計測することができる。すなわち、本実施形態では最大の光合成能評価ができるので、気孔の状態に依存しない再現性の高い比較評価しやすい高精度な測定（ＲＯＳマーカーの測定や後述する酸素濃度測定）を行うことができる。

　また、本実施形態では、例えば重炭酸ナトリウム溶液を密閉チャンバ１６内に入れることで該密閉チャンバ１６内に二酸化炭素を発生させることもできる。例えば、本実施形態では布やフェルトに重炭酸ナトリウム溶液を染み込ませ、該布やフェルトを密閉チャンバ１６内に入れることで酸素濃度測定を行うこともできる。

　一方で、呼気を入れずに呼気導入ポート３０ａを閉じれば密閉チャンバ１６は密閉状態を維持できるので、結果的に低ＣＯ_２状態を作り出し、最小光合成能力を計測することもできる。

　あわせて、図５および図６（ａ）に示すように密閉チャンバ１６にはエアー出力ポート３０ｂを設けることもできる。本実施形態ではこのエアー出力ポート３０ｂを設けることで、密閉チャンバ１６内部に植物試料Ｓが収容されている状態であっても密閉チャンバ１６内部のエアーを簡単に入れ替えることができる。これら呼気導入ポート３０ａおよびエアー出力ポート３０ｂを設ける位置は、特に限定されるものではない。

　透過光検出器１８は、植物試料Ｓを透過した合成矩形波測定光ＭＬ３（ＭＬ１とＭＬ２）を合成矩形波透過光ＴＬとして検出するものである。本実施形態に係る透過光検出器１８には、例えばＰＩＮフォトダイオードを利用することができる。

　制御ユニット２０は、透過光検出器１８で得られた検出結果を解析する解析回路２０ａと、測定用光源１２および誘導用光源１４を植物試料Ｓに対応させて制御する制御回路２０ｂと、を有している。解析回路２０ａおよび制御回路２０ｂには、例えばマイクロプロセッサやＦＰＧＡを利用することができる。解析回路２０ａでは、本実施形態において特徴的なデータ解析および植物の環境ストレス診断が行われることになる。

　次に、本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０による植物試料Ｓの測定（および環境ストレス診断）の流れについて説明する。測定用光源１２から出力された第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２は、密閉チャンバ１６内部に位置する植物試料Ｓへ到達する。

　この時、本実施形態では測定用光源１２から出力される第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２が制御回路２０ｂによる特徴的な制御により疑似的な１つの測定光（合成矩形波測定光ＭＬ３）として植物試料Ｓに照射されることとなる。また、測定用光源１２から出力される測定光ＭＬ（ＭＬ１、ＭＬ２）の強度は、植物試料Ｓの種類に合わせて制御ユニット２０（制御回路２０ｂ）により信号強度が同じになるように自動調整される（測定光ＭＬは、適正な透過測定ができるように自動調整される）。

　測定開始時においては光合成誘導光ＰＬ（ＦＲ、ＡＬ）を植物試料Ｓへ照射せず、暗状態による測定を行う。なお、本実施形態ではこの暗状態による測定を省略することもできる。その後、合成矩形波測定光ＭＬ３（ＭＬ１およびＭＬ２）とともに第１光合成誘導光ＦＲおよび第２光合成誘導光ＡＬが植物試料Ｓに照射される。

　植物試料Ｓは、光合成誘導光ＰＬ（ＦＲ、ＡＬ）が照射されることで光合成活性（光化学反応）の状態となる。そして、植物試料Ｓへ照射された合成矩形波測定光ＭＬ３は植物試料Ｓを透過し、該植物試料Ｓを透過した合成矩形波透過光ＴＬは透過光検出器１８により検出される。検出された合成矩形波透過光ＴＬは測定信号（電気信号）として制御ユニット２０の解析回路２０ａへ送られる。

　解析回路２０ａでは、上記検出結果に基づいて解析が行われる。解析回路２０ａは合成矩形波透過光ＴＬを利用して植物試料Ｓを透過した第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２の光吸収差を算出する（二波長吸収差計測）。

　その後、解析回路２０ａは、この光吸収差を利用して光合成における光化学系ＩのＰ７００が酸化された状態であるＹ（ＮＤ）を植物の活性酸素抑制指標であるＲＯＳマーカーとして算出する。そして解析回路２０ａは、ＲＯＳマーカーを利用して植物における環境ストレス診断を行う。このＲＯＳマーカーを利用することで、従来よりも精度よく早期に環境ストレス診断を行うことができる。

変形例
　次に本実施形態に係る環境ストレス診断装置の変形例について説明する。図７には、本実施形態に係る環境ストレス診断装置の変形例を示す。なお、図７では、図１に示した環境ストレス診断装置１０と共通する構成については同一の符号を付して説明する。同図に示すように本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０の密閉チャンバ１６には、該密閉チャンバ１６内部における植物試料Ｓの酸素発生速度（酸素濃度変化とも呼ぶ）を測定する酸素濃度検出器２２と、該密閉チャンバ１６内部の環境状態を把握するための環境センサー２４が設けられている。

　密閉チャンバ１６に設けられた酸素濃度検出器２２は、密閉チャンバ内部における植物試料Ｓの光合成活性を酸素発生速度として測定するものである。酸素濃度検出器２２は、例えばガルバニ電池式の酸素濃度検出器であることが好ましい。

　本実施形態では、ガルバニ電池式（酸素電極方式とも呼ぶ）の酸素濃度検出器２２を使用することで屋外使用時において該酸素濃度検出器２２の駆動電源が不要となり、且つ、メンテナンス性向上効果も期待できる。

　さらに、ガルバニ電池式の酸素濃度検出器は、酸素を電圧で検出するために濃度による検出限界がなく、ＣＯ_２濃度をより高い条件で設定することができる（４００００ｐｐｍ程度）。ＣＯ_２濃度を高い条件にすることができれば、気孔の開閉状態に関わらず迅速に葉内部（植物試料Ｓの内部）にＣＯ_２を供給することができ、迅速な定常状態光合成活性測定が可能となる。

　例えば一般的なガス交換測定で酸素濃度を検出する場合は、一定流量の空気を密閉チャンバ１６内部へ流し続けなければならない。これは、植物試料Ｓに常に空気が噴射されていることを意味する。すなわち、水生植物のように乾燥に弱い植物ではガス交換測定途中で空気の連続噴射により水分が失われ、植物試料Ｓが痛んでしまう可能性がある。
　なお、本発明において光を照射しない状態でも酸素測定を行っており、これは暗呼吸速度（酸素消費）を見ている。
　本実施形態の解析では、光合成誘導光照射時の酸素濃度変化速度（見かけの光合成速度）と暗呼吸速度を加えた総合光合成速度（光合成活性能）を見ている。
　また、クロロフィル蛍光から光合成能を見るときにはＹ（ＩＩ）を使用するが、飽和ＣＯ_２状態のときの値を用いる。飽和ＣＯ_２状態でないときのＹ（ＩＩ）は、光合成能を正しく表していないためである。
　また、酸素濃度変化速度（光合成活性能）からの光合成能をＹ（ＩＩ）に変換して、Ｙ（ＮＤ）－Ｙ（ＩＩ）グラフやＹ（ＮＤ）／Ｙ（ＩＩ）値で評価する場合も、酸素濃度変化速度（光合成活性能）には暗呼吸速度も加えている。酸素濃度変化速度（光合成能）をＹ（ＩＩ）に変換する利点は、次元をＹ（ＮＤ）と統一できる点である。
　酸素発生速度Ｖ（Ｏ_２）からＹ（ＩＩ）は、以下の式により算出される。
　Y(II) = 4 / (α × PFD) × {V’(t) + |V’_O(t)|}
        = 4 / (α × PFD) × {V(O₂)}
　　　α：定数　0.42～0.48
      PFD : 光量子束密度(Photon Flux Density)：光合成誘導光AL[μmol/m²/s]
      V’(t) : 見かけの酸素発生速度(見かけの光合成速度)
      V’₀(t) : 暗呼吸速度 (光照射前の安定状態の値：酸素センサ消費速度を引いた値)

　一方で、ガルバニ電池式の酸素濃度検出器２２では、密閉チャンバ１６内部を密閉状態かつチャンバー内部に水を含ませたフェルトを設置することもできるため、高度な湿潤状態として維持することができるので、酸素濃度測定途中に植物試料Ｓの水分が失われることはない。

　環境センサー２４は、密閉チャンバ１６内部の環境状態（環境情報）を測定するために設けられている。環境センサー２４には、例えば温度センサー、湿度センサー、気圧センサーの全部ないしいずれかのセンサーを利用することができる。また、環境センサー２４は、温度センサー、湿度センサー、気圧センサーに限られず、他の環境パラメータを測定するためのセンサーであってもよい。

　上述したように本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０は、主に屋外で使用するものである。当然のことながら、屋外のフィールド現場では、温度、湿度、気圧等、それぞれの条件がその地域や環境によって異なることになる。図７における環境ストレス診断装置１０では環境の異なる屋外使用時において、密閉チャンバ１６内部の温度、湿度、および気圧を検出することで密閉チャンバ１６内部における植物試料Ｓの酸素発生速度のデータ補正（補正処理）を行うことができる。

　具体的には、湿度、温度、気圧の経時的な変動によって酸素濃度が変化してしまうので、それを補正する補正係数γを利用して密閉チャンバ１６内部における植物試料Ｓの酸素発生速度のデータ補正を行うことができる。

　　［数１］

　γ＝P(t)/ P(t0)×[{(-4×10^-7)×T²(t) - (2×10^-6)×T(t)}×H(t)+1]

　　　　H(t)：計測時間ｔの時の湿度センサ値 [%]
　　　　T(t)：計測時間ｔの時の温度センサ値 [℃]
　　　　P(t)：計測時間ｔの時の気圧センサ値 [hPa]
　　　　t0　：キャリブレーション時の時間

　本実施形態では、この補正係数γを利用することで酸素濃度Ｏ_２を以下の式で算出することができる。

　　［数２］

　O₂[μmol O₂] = K(t₀)×Vs(t)×γ(t)

　　　　Vs(t)：計測時間ｔの時の酸素センサの電圧信号[V]
　　　　K(t₀)：キャリブレーション時における酸素濃度と電圧信号との変換係数

　さらに、酸素発生速度Ｖ（Ｏ_２）は以下の式で算出することができる。

　　［数３］

　V(O₂)[μmol O₂/m²・s]　= 10⁴/ A × K(t₀)× d/dt {Vs(t)×γ(t)}

　　　　A：葉面積[cm²]

　図７における解析回路２０ａは、合成矩形波透過光ＴＬを利用して植物試料Ｓを透過した第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２の光吸収差を算出する（二波長吸収差計測）。その後、解析回路２０ａは、この光吸収差を利用して光合成における光化学系ＩのＰ７００が酸化された状態であるＹ（ＮＤ）を植物の活性酸素抑制指標であるＲＯＳマーカーとして算出する。
　本実施形態において、測定光はLED光源の定電流制御により照射強度調整を行っており、ドライブ電流をリニアに変更することができる。
　本実施形態において、サンプルを透過して光検知器を経たのちの波形が、一つの合成矩形波波形となることが特徴的である。サンプルをセットして、２つの測定光の光検出信号はできるだけ同じ値とすることで、２つの分光特性を同じにすることができる。
　この状態で光照射（光合成誘導光）を行うことで、２つの光吸収差を精度よく算出することができる。
　具体的には、二波長吸収差測定では、初めにサンプルをセットして、測定光の２波長の信号強度が同等になるようにするが、実際にはノイズ幅があり、ＤＣ信号では同じ信号強度にすることは困難である。本実施形態においては、一つの合成矩形波波形にすることで、信号処理でロックインアンプ処理を行う。このロックインアンプ処理でノイズ幅以下の信号強度差を算出し、２波長測定光の信号さを小さくすることができ、サンプルや光学系を透過させたときの光吸収、光検知器の分光感度特性をキャンセルすることができる。
　なお、ロックインアンプ処理では、２つの信号の凹凸がないと周波数ロックされないので、検出できる程度に凹凸を作るが、その凹凸の差は約１～２％程度で識別可能である。この凹凸差は、通常ノイズ幅以下であるため、実測定に影響はない。
　本実施形態において、二波長の測定光の各強度は、以下のように調整される。
　まず、いずれか一方の測定光（ここではＭＬ２）を、サンプルを介して信号強度測定し、所望の信号強度となるようにＭＬ２光源（ＬＥＤ）への供給電流を調整する。
　次に、他方の測定光（ＭＬ１）を照射し、サンプルを介して信号強度測定し、ロックインアンプ処理によりＭＬ２との信号強度差が前記所望信号強度の約１～２％となるようにＭＬ１光源（ＬＥＤ）への供給電流を調整する。
　これらは、サンプル設置後に自動的に実行され、ＭＬ１、ＭＬ２ともに所望信号強度で、且つ強度差が２％以下に調整されることになる。

　この時、酸素濃度検出器２２は密閉チャンバ１６内部における植物試料Ｓの酸素発生速度を検出し、得られた検出結果は解析回路２０ａへ送られる。同様に、環境センサー２４は、密閉チャンバ１６内部の環境情報（温度、湿度、気圧等）を検出し、得られた検出結果は解析回路２０ａへ送られる。

　解析回路２０ａは、酸素濃度検出器２２で得られた酸素発生速度を環境センサー２４で得られた環境情報に基づいて補正処理する。この酸素発生速度の補正処理は、さまざまな環境状態が想定される屋外測定時において特に有効である。

　そして解析回路２０ａは、ＲＯＳマーカーと酸素発生速度との相関を解析し（相関解析結果または相関解析グラフとも呼ぶ）、得られた相関解析結果を利用して植物における環境ストレス診断を行う。

　この相関解析結果は、例えば図８に示すようにあらかじめ解析回路２０ａに記憶されている環境ストレス相関データ（酸化障害診断マニュアルとも呼ぶ）と比較されることで、植物における環境ストレス状態（環境ストレスを受けているか否か、または環境ストレスの度合い等）を精度良く早期に診断することができる。

　また、例えば図９に示すように実測によるＲＯＳマーカーと光合成活性（酸素発生速度）Ｖ（Ｏ_２）との相関から、植物に対してストレス負荷が増えているか、あるいはストレス負荷が軽減されているか否かを診断することもできる。なお、酸素発生速度Ｖ（Ｏ_２）からＹ（ＩＩ）を算出し、ＲＯＳマーカーと光合成速度としてのＹ（ＩＩ）との相関を利用することもできる。

　さらに本実施形態における環境ストレス診断装置は、例えばネットワーク上のデータサーバーを利用して植物の環境ストレス診断を行うこともできる。図１０にはデータサーバーを利用した環境ストレス診断の概略イメージ図を示す。

　同図に示すように本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０はスマートフォンやタブレット端末などの通信端末にインターネット接続が可能である。この場合、当該環境ストレス診断装置１０にはネットワーク接続するための通信部（図示は省略）が設けられている。環境ストレス診断装置１０はこの通信部を介して（図１０では無線通信で）通信端末にネットワーク接続される。なお、ネットワーク接続は有線接続により行うこともできる。

　図１０に示すように当該環境ストレス診断装置１０は通信端末を利用して操作される。また、通信端末には例えば測定結果としてのＲＯＳマーカーや環境ストレス診断結果などが表示される。

　例えば図１１の画面イメージに示すように、携帯端末の画面には設定画面の他、リアルタイム計測表示や診断プロット画面等も表示することができる。その他、本実施形態では例えばアプリなどを利用して測定結果や環境ストレス診断結果を表示しても良い。

　通信端末は例えば環境ストレス診断データ等が蓄積されたデータサーバーにネットワーク接続されている。データサーバーには、過去の測定データ（ＲＯＳマーカー、当該装置で測定されたその他の測定結果等）や気象情報、その他の生育情報等がデータベースとして蓄積されている（これらを総称して環境ストレス診断データとも呼ぶ）。

　そして環境ストレス診断装置１０（ないし携帯端末）は、データサーバーに蓄積された環境ストレス診断データと測定結果（ＲＯＳマーカー等）とを比較して植物試料の環境ストレス状態を診断することもできる。なお、例えば機械学習による分類予知や環境ストレス診断を行うようにしても良い。

　このように本実施形態における環境ストレス診断装置では、ＲＯＳマーカーを利用することで植物を測定する場所を選ぶことなく（屋外でも）精度良く早期に植物試料の環境ストレスを診断することができる。本実施形態における環境ストレス診断は、概略以上のような流れで行われる。

　合成矩形波測定光について
　次に合成矩形波測定光について詳しく説明する。本実施形態では、ＲＯＳマーカーを精度良く測定するために合成矩形波測定光を利用した測定光照射が行われている。図１２には本実施形態に係る測定光照射の概略説明図を示す。図１２は、図１（および図７）における制御回路２０ｂの動作（制御）を示したブロック図である。

　制御回路２０ｂは合成矩形波測定光を形成するためにＰＷＭ制御（ＰＷＭ制御におけるＯＮ／ＯＦＦスイッチング制御）を利用した定電流制御を行っている。図１２に示すように制御回路２０ｂは、第１測定光ＭＬ１を制御するためのＣＨ１と第２測定光ＭＬ２を制御するためのＣＨ２を有する。ＣＨ１およびＣＨ２は、制御指令としてのデジタル信号を出力する。

　制御回路２０ｂ（ＣＨ１およびＣＨ２）からのデジタル信号は、Ｄ／Ａコンバータ１（ＤＡＣ１）およびＤ／Ａコンバータ２（ＤＡＣ２）でそれぞれ所定の電流値（アナログ信号）へと変換され、該変換されたアナログ信号は定電流ドライバー１および定電流ドライバー２へと入力される。

　この時、制御回路２０ｂはＰＷＭ制御をするためのＰＷＭ信号（オンオフ信号）を定電流ドライバー１および定電流ドライバー２に出力する。このＰＷＭ信号により定電流ドライバー１および定電流ドライバー２は該ＰＷＭ信号に応じた動作をする。具体的には定電流ドライバー１と定電流ドライバー２には、ＭＬ１とＭＬ２がそれぞれ逆位相の矩形波となるようＰＷＭ信号が同期して入力される。

　さらに、本実施形態に係る制御回路２０ｂは、第１測定光ＭＬ１よりも第２測定光ＭＬ２が高出力となるように定電流ドライバー１および定電流ドライバー２を制御する。なお、制御回路２０ｂは、第２測定光ＭＬ２よりも第１測定光ＭＬ１が高出力となるように定電流ドライバー１および定電流ドライバー２を制御することもできる。このＰＷＭ信号に基づいて定電流ドライバー１は測定用光源１２に第１測定光ＭＬ１を出力させ、定電流ドライバー２は測定用光源１２に第２測定光ＭＬ２を出力させている。

　測定用光源１２からの第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２は、それぞれが逆位相の矩形波として制御されているので、図１２に示すようにＤＣ成分が含まれる疑似的な１つの矩形波（合成矩形波測定光ＭＬ３）を形成する。合成矩形波測定光ＭＬ３の周波数は、ＲＯＳマーカーを得るための良好な光吸収差測定を行うために５ｋＨｚ～３０ｋＨｚであることが好ましく、特に８ｋＨｚ～２０ｋＨｚであることが好適である。本実施形態における合成矩形波測定光ＭＬ３の周波数は、１０ｋＨｚに制御されている。また、制御回路２０ｂは、第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２の出力振幅を調整制御することができる。

　つまり、本実施形態に係る制御回路２０ｂは、第１測定光ＭＬ１よりも第２測定光ＭＬ２を高出力にするとともに第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２とが逆位相の矩形波となるよう測定用光源１２を制御する。さらに制御回路２０ｂは、第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２を同期して出力させるよう測定用光源１２を制御して第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２をＤＣ成分が含まれる５ｋＨｚ～３０ｋＨｚの疑似的な１つの合成矩形波測定光ＭＬ３として形成する。

　本実施形態では、第１測定光ＭＬ１の出力値と第２測定光ＭＬ２の出力値が同出力値になるように透過光検出器１８でモニタリングしながらフィードバック制御をし、植物試料Ｓを透過した第２測定光ＭＬ２（または第１測定光ＭＬ１）の検出信号を目的設定検出値の１～５％、あるいは１～２％以内に制御することで精度の良い測定が実現できる。

　制御回路２０ｂは、第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２の出力値（出力振幅）の差が１％～５％、あるいは１％～２％以内になるように測定用光源１２を制御している（この数値は実際のノイズレベルに近い数値）。但し、この出力値の差が０（同じ出力値）になってしまうと後述するロックインアンプ信号処理が出来なくなってしまう。すなわち、ＡＣ成分を含んだ合成矩形波測定光ＭＬ３を得ることができないため、第１測定光ＭＬ１の出力値と第２測定光ＭＬ２の出力値には僅かな差があるように制御する。

　具体的には、本実施形態では第１測定光ＭＬ１の出力値（電流値または電圧値）を１００％とした場合、第２測定光ＭＬ２の出力値は１０１％～１０５％程度、あるいは１０１％～１０２％程度となる。第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２の出力値をこの範囲内に調整することで精度の良い測定が実現できる。

　また、制御回路２０ｂによるＰＭＷ制御（ＰＷＭ信号）は、例えば図１３（ａ）に示すように位相差を９０度、デューティー比をＭＬ１とＭＬ２それぞれ５０％（Ｄｕｔｙ比５：５）としても良いし、図１３（ｂ）のように位相差を９０度、デューティー比はＭＬ１を８０％としてＭＬ２を２０％（Ｄｕｔｙ比８：２）とすることもできる。ＭＬ１とＭＬ２のＤｕｔｙ比は図１０に示したものに限られず、測定に応じて適宜設定すればよい。本実施形態では、波形成形技術の容易性や解析の利便性等を考慮して位相差を９０度、デューティー比をＭＬ１とＭＬ２それぞれ５０％としている。

　また、２つの測定光の重なり具合は、２つの測定光の立下り時間をそれぞれＰＷＭ制御で調整できるため、デューティー比を４８：４８または４７：４７にして重なり時間の間隔を作ることも出来る。

　第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２によって得られた合成矩形波測定光ＭＬ３は、ＤＣ成分とＡＣ成分を有する疑似的な矩形波として得られる。そして、植物試料Ｓを透過した合成矩形波測定光ＭＬ３は透過光検出器１８（図１を参照）によって合成矩形波透過光ＴＬとして検出される（図１４を参照）。図１４に示すように、合成矩形波透過光ＴＬにはＤＣ成分とＡＣ成分とが含まれている。この合成矩形波透過光ＴＬのＡＣ成分は、植物試料Ｓを透過した第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２の二波長光吸収差に対応している。

　すなわち、本実施形態では植物試料Ｓを透過した２つの透過光を１つの透過光検出器１８で検出することが可能となる。そのため、本実施形態に係るストレス診断装置１０は従来品に比べて構成部品を減らすことができるため小型化が実現できる。

　透過光検出器１８は、合成矩形波透過光ＴＬをＤＣ成分の上に僅かに凹凸（ＡＣ成分）のある１０ｋＨｚの矩形波として検出している（図１４）。本実施形態では、例えばＡＣカップリングを利用することでＤＣ成分を除去してＡＣ成分のみを検出することができる。そして、このＡＣ成分を増幅アンプで増幅することで、十分なダイナミックレンジを確保することができる（微小信号変化であっても十分に拡大して計測することが可能となる）。

　また、本実施形態ではこのような合成矩形波測定光ＭＬ３（合成矩形波透過光ＴＬ）を利用することで、従来どおりに第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２を利用して二波長光吸収差を検出する場合と比較してノイズ低減効果も期待できる。さらにＭＬ１とＭＬ２の測定においてベースラインが不規則に変化してしまう場合でも、合成矩形波測定光ＭＬ３を利用してロックインアンプ信号処理を行うことで、二波長吸収の微小変化の差を高Ｓ／Ｎ比で算出することができる。

　ここで、上記のように第１測定光ＭＬ１よりも第２測定光ＭＬ２を高出力にする（具体的には、１％～５％程度の範囲で僅かに高く出力にする）とともに第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２とを逆位相の矩形波として同期制御することで合成矩形波測定光ＭＬ３を得ることができる。しかしながら、実際には非常に高速な光源出力波形の制御（周波数５ｋＨｚ～３０ｋＨｚ）が行われており、測定するサンプルの吸収の違いにより第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２のＬＥＤ制御電流を可変調整している。

　そのため、その設定電流（ＬＥＤ制御電流）によりセトリング時間が異なるため、第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２とが重なってしまうことがある（第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２の同期がずれてしまう、または合成波形の崩れが起きてしまうことがある）。本実施形態においては、セトリング時間（立下り時間）は数十から数百ｎｓｅｃで行っている。このような高速制御の場合、少しでも同期がずれてしまうと合成矩形波測定光ＭＬ３を得ることができなくなってしまう。

　そこで本実施形態に係る制御回路２０ｂは、合成矩形波測定光ＭＬ３を形成する制御に加えて、さらに第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２の同期のズレに対する制御（同期制御）も同時に行っている。

　図１５には本実施形態に係る同期制御の概略説明図を示す。同図に示すように制御回路２０ｂは、第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２における矩形波の立ち上がりおよび立ち下がりのタイミング、指令周波数としてのリファレンス信号を測定開始の際の測定用光源調整時に監視している。そして、制御回路２０ｂはＭＬ１およびＭＬ２における矩形波の立ち下がりのタイミングとリファレンス信号波形との比較を行っている。

　ここで、制御回路２０ｂは第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２における立ち上がりのタイミングを同期させることはできる。一方で、第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２における立ち下がりのタイミングは、サンプルの透過率等による測定用光源１２の出力（出力電流等）に起因してずれてしまう恐れがある（実際には出力値の違いにより矩形波の下がり方が異なる）。例えば、第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２の出力値の違いにより、該第１測定光ＭＬ１と第２測定光ＭＬ２とでは異なる立ち下がりタイミングになってしまうことがある。

　そこで本実施形態に係る制御回路２０ｂは、第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２の立ち下がりタイミングがずれた場合には該立ち下がりタイミングを０．２５μｓ単位（－０．２５μｓ～＋０．２５μｓ）で調整して同期を維持している。具体的には、制御回路２０ｂは第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２における矩形波の立ち下がりのタイミングを指令周波数としてのリファレンス信号波形と比較している。そして制御回路２０ｂは、測定用光源１２からの出力に起因して第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２における立ち下りのタイミングがずれた場合には該立ち下がりのタイミングを０．２５μｓ単位で調整して同期を維持している。

　制御回路２０ｂは、ＰＷＭ制御によって測定用光源１２から出力される第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２における各矩形波の互いの立ち上りタイミングを半周期遅らせるように同期させている。そして、第１測定光ＭＬ１および第２測定光ＭＬ２における立ち下りのタイミングは、測定光強度の違いから生じる立ち下り時間の違いによるタイミングのずれ（二つの測定光の重なり具合）を０．２５μｓ単位で調整することができる。

　このように本実施形態では、測定光の制御において必ず起こり得る同期ズレにも対応することで、安定した合成矩形波測定光を得ることができる。その結果、精度の良い環境ストレス診断を実現することができる。

ＲＯＳマーカー（活性酸素抑制指標）について
　ここで、本実施形態におけるＲＯＳマーカーについて説明する。本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０は、ＲＯＳマーカーと酸素発生速度（またはＶ（Ｏ_２）から算出した光合成速度Ｙ（ＩＩ））の相関を利用して従来よりも精度良く早期に植物の環境ストレスを診断するものである。すなわち、従来は光化学系ＩＩにおける光合成活性等のみにより植物の環境ストレス診断を行っていたが、本実施形態では光化学系ＩＩ（または酸素発生速度）に加えてさらに光化学系ＩにおけるＰ７００の状態も解析して診断を行っている。

　図１６には、本実施形態に係るＲＯＳマーカー（Ｙ（ＮＤ））の誘導原理の概略説明図を示す。植物は、環境ストレスに晒されると光合成によるＣＯ_２固定が抑制される。近年の研究では、光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩとも呼ぶ）からの電子供給を適切に抑制することで、活性酸素（ＲＯＳ）の生成を回避できることが明らかになっている。

　植物においてＰ７００（光化学系Ｉの反応中心クロロフィル）は、還元され基底状態にあるＰ７００（Ｙ（Ｉ））、光エネルギーを吸収している状態Ｐ７００＊（Ｙ（ＮＡ））、光エネルギーを放出して酸化されている状態Ｐ７００＋（Ｙ（ＮＤ））の３つ状態を取り、Ｙ（Ｉ）＋Ｙ（ＮＡ）＋Ｙ（ＮＤ）＝１になる関係をもつ。

　Ｐ７００が電子をもつＹ（Ｉ）あるいはＹ（ＮＡ）の状態にあるとＲＯＳ生成の危険性が高くなる。一方で、Ｐ７００が電子を持たないＹ（ＮＤ）の状態にあるとＲＯＳ生成が抑制される。つまり、Ｙ（ＮＤ）の存在比から植物においてＲＯＳ生成が抑制されているかの判断、すなわち、植物における環境ストレス状態を非破壊で早期に把握することができる。

　具体的には、光化学系ＩＩからの電子供給を受けると光化学系Ｉ（ＰＳＩとも呼ぶ）のＰ７００は酸化されてＰ７００＋となる。このＰ７００＋（Ｙ（ＮＤ））を検出することで、光合成低下によるＲＯＳ発生の危機を早期に検出できるのである。本実施形態では、この（Ｙ（ＮＤ））を活性酸素抑制指標としてＲＯＳマーカーと呼んでいる。

ＲＯＳマーカーと酸素発生速度の相関について
　次に本実施形態に係るＲＯＳマーカー（Ｙ（ＮＤ））と酸素発生速度（光合成速度）の相関関係について説明する。上述したように、本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０は、透過光検出器１８とともに酸素濃度検出器２２を備え、解析回路２０ａによってＲＯＳマーカーと酸素発生速度との相関を算出することで植物における環境ストレス診断を従来よりも精度良く早期に行うものである。

　図１７にはＲＯＳマーカーと酸素発生速度の関係例を示す。図１７は、圃場Ａ（環境ストレスを受けている植物（小麦）を育成、図１７のＡ）、圃場Ｂ（環境ストレスを受けていない植物（小麦）を育成、図１７のＢ）、圃場Ｃ（環境ストレスを受けていない植物（小麦）を育成、図１７のＣ）それぞれの圃場において植物試料を測定し解析した結果である。

　同図に示すように、環境ストレスを受けている植物を育成している圃場ＡではＹ（ＮＤ）／Ｖ（Ｏ_２）の数値が大きくなっている。一方で、環境ストレスを受けていない植物を育成している圃場Ｂおよび圃場Ｃではこの数値が圃場Ａに比べて小さくなっている。このように、ＲＯＳマーカー（Ｙ（ＮＤ））と酸素発生速度（Ｖ（Ｏ_２））との関係を把握することで、植物の環境ストレス状態を精度良く診断することができる。

　また、図１８には本実施形態におけるＲＯＳマーカーと酸素発生速度との相関イメージ図を示す。図１８におけるＡ、Ｂ、Ｃは図１７におけるＡ（圃場Ａ）、Ｂ（圃場Ｂ）、Ｃ（圃場Ｃ）を示している。図１８の中央に位置する直線は、植物が環境ストレスを受けているか否かを判別するための判別直線である。

　同図に示すように、圃場Ａ（環境ストレスを受けている植物を育成）の測定結果は判別直線の上側（環境ストレスを受けていると診断）に集まっている一方、圃場Ｂおよび圃場Ｃの測定結果は判別直線の下側（環境ストレスを受けていないと診断）に集まっていることが分かる。つまり、図１８はＲＯＳマーカーと酸素発生速度との相関を利用することで、精度の良い環境ストレス診断結果が得られることを示している。

　このように本発明によれば、制御回路２０ｂによって合成矩形波測定光ＭＬ３を形成し（ＭＬ１よりもＭＬ２を高出力にするとともにＭＬ１とＭＬ２とを逆位相の矩形波として同期制御し）、透過光検出器１８とともに酸素濃度検出器２２を利用して密閉チャンバ１６内部に収容された植物試料Ｓの合成矩形波透過光ＴＬ（解析回路２０ａでＲＯＳマーカーを算出）および酸素発生速度を同時計測する。さらに解析回路２０ａによってＲＯＳマーカーと酸素発生速度との相関を利用した環境ストレス診断を行うことで、従来のクロロフィル蛍光測定に比べて精度良く早期に植物の環境ストレス状態を診断できる環境ストレス診断装置１０を得ることができる。

　また、本実施形態では植物における環境ストレス診断装置について説明したが、例えば本装置と同様の工程を行うことで従来よりも精度良く早期に環境ストレス診断を行うことができる。

　具体的には、はじめに植物試料を密閉チャンバへ収容し、制御回路により測定用光源から出力される第１測定光および第２測定光を調整するとともに誘導用光源から出力させる第１光合成誘導光および第２光合成誘導光を調整する工程を行う。

　その後に第１測定光よりも第２測定光を高出力にするとともに前記第１測定光と第２測定光とが逆位相の矩形波となるよう制御回路により前記測定用光源を制御し、且つ、前記制御回路により前記第１測定光と第２測定光を同期して出力させるよう前記測定用光源を制御して前記第１測定光と第２測定光をＤＣ成分が含まれる５ｋＨｚ～３０ｋＨｚの疑似的な１つの合成矩形波測定光として形成し、該合成矩形波測定光を前記第１光合成誘導光および第２光合成誘導光とともに前記植物試料へ照射する工程を行う。

　その後に、植物試料を透過した前記合成矩形波測定光を透過光検出器で合成矩形波透過光として検出する工程を行う。そして、前記合成矩形波透過光を利用して前記植物試料を透過した第１測定光および第２測定光の光吸収差を解析回路により算出し、該解析回路が該光吸収差を利用して光合成において光化学系ＩのＰ７００が酸化された状態であるＹ（ＮＤ）を植物の活性酸素抑制指標であるＲＯＳマーカーとして算出する工程を行う。最後にＲＯＳマーカーを利用して植物の環境ストレス状態を診断する工程を行うことで、従来よりも精度良く早期に環境ストレス診断を行うことができる。

　また、本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０は、例えば図１９に示すようにＹ（ＮＤ）と酸素発生速度Ｖ（Ｏ２）とともにＹ（Ｉ）やＹ（ＮＡ）を算出することもできる。これら他のパラメータも組み合わせることで最適な解析（環境ストレス診断）を行うことができる。

無機栄養ストレスの診断について
　上記のとおり本実施形態では、光化学系Ｉの測定情報（主にＲＯＳマーカー）と酸素発生速度（または光合成速度）を利用して環境ストレス診断を行っている。これに加えて本発明者らは、光化学系Ｉの測定情報とともに光化学系ＩＩにおける他の測定情報も合わせて利用することで、植物における無機栄養ストレスの診断ができることを見出した。

　図２０および図２１には、無機栄養素が正常な状態の植物（ｃｏｎｔｒｏｌ）と無機栄養素が不足している状態の植物（ｆｒｅｅ）の比較イメージ図を示す。本明細書における無機栄養素とは、植物の必須栄養素のうち、ＣとＯとＨを除いた他の元素を意味する。図２０には、植物の必須栄養素であるＮ、Ｐ、Ｋ、Ｓ、Ｍｇ、Ｃａの比較イメージが示されている。また、図２１にはＢ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎの比較イメージが示されている。

　図２０および図２１は、ヒマワリの生育比較を行ったものである。具体的には、ヒマワリを２週間栽培し、その後にそれぞれの無機栄養素の濃度を変えている。そして、その１週間後にそれぞれの生育比較等を行った。以下、植物試料Ｓとしてヒマワリの生葉を利用した測定結果等を示すものとする。

　図２０および図２１に示すように、無機栄養素が不足していることは植物の生育に大きな影響を及ぼしていることが分かる。本実施形態では、光化学系Ｉおよび光化学系ＩＩの各種パラメータを検出することで無機栄養素の欠乏状態を早期に発見することができる。植物における無機栄養ストレスの診断は、例えば追肥時期のミスマッチを減少させ、結果として安定した植物の収穫を確保できる効果が期待できる。

　上記のとおり本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０は、主にＲＯＳマーカーと酸素発生速度を測定しているが、これに加えてクロロフィル蛍光の測定を行うことで無機栄養ストレス診断を実現することができる。図２２には本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０においてクロロフィル蛍光測定を行う場合の概略構成図を示す。なお、図２２では、図１および図７に示した環境ストレス診断装置１０と共通する構成については同一の符号を付して説明する。

　同図に示すように環境ストレス診断装置１０には、透過光検出器１８、酸素濃度検出器２２（および環境センサー２４）に加えてクロロフィル蛍光を測定するための蛍光検出器４０が設けられている。本実施形態では、クロロフィル蛍光測定を行うために、例えば４５０ｎｍのＬＥＤを光源として利用することができる。本実施形態では、例えば誘導用光源１４に４５０ｎｍのＬＥＤを追加することができる。

　このようにＲＯＳマーカーおよび酸素発生速度とともにクロロフィル蛍光を測定し、得られたクロロフィル蛍光検出結果を解析することでさらに具体的な環境ストレス診断、例えば植物における無機栄養ストレスの診断を行うことが可能となる。

　図２２における解析回路２０ａは、蛍光検出器４０で得られたクロロフィル蛍光検出結果を利用して光合成速度としてのＹ（ＩＩ）と、光合成に利用できない光エネルギーとしてのＹ（ＮＰＱ）と、光化学系ＩＩにおける基礎的熱散逸能としてのＹ（ＮＯ）と、プラストキノン還元率としての１－ｐＬと、を算出することができる（図２３）。

　また、上述のとおり解析回路２０ａは、前記光吸収差を利用してＰ７００の基底状態であるＹ（Ｉ）と、Ｐ７００が光エネルギーを吸収している状態であるＹ（ＮＡ）と、ＲＯＳマーカーとしてのＹ（ＮＤ）を算出することができる（図２４）。

　図２５には時間経過を円状（円グラフ）に表現してＹ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）、Ｙ（ＩＩ）をプロットした測定結果グラフ（ＲＦＭ　Ｏｒｉｇｉｎａｌ　Ｐｌｏｔとも呼ぶ）の一例を示す。図２５では円グラフの１周を１０分の時間経過として表現している。図２５では、プロットの軌跡（軌跡形状）を比較してみても欠乏元素の違いによる軌跡形状の変化が明確にあらわれているとは言えない。

　一方で、図２６には図２５のＹ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）をＹ（ＩＩ）で除した値を示した測定結果グラフ（ＲＦＭ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　Ｐｌｏｔとも呼ぶ）の一例を示す。図２６では、上記図２５と比較した場合には欠乏元素の違いによる軌跡形状の特徴があらわれていることが分かる。

　つまり、図２６によれば、無機栄養素がコントロールされた植物により得られた基本診断グラフと植物試料Ｓにより得られたサンプル診断グラフとの軌跡形状を比較することで、植物における無機栄養ストレスの診断（無機栄養素の欠乏状態の診断）を行うことができる。また、基本診断グラフにおける軌跡形状とサンプル診断グラフにおける軌跡形状との比較は、例えばＡＩの機械学習を利用して軌跡形状パターンを自動認識させて行うこともできる。

　同様に図２７には、時間経過を円状に表現してＹ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）、Ｙ（ＩＩ）、Ｙ（ＮＯ）、Ｙ（ＮＰＱ）、１－ｑＬをプロットした測定結果グラフ（Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　Ｐｌｏｔとも呼ぶ）の一例を示す。また、図２８には、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）、Ｙ（ＮＰＱ）、１－ｑＬをＹ（ＩＩ）で除した値を示した測定結果グラフ（Ｏｒｉｇｉｎａｌ　Ｐｌｏｔとも呼ぶ）の一例を示す。図２７と図２８とを比較してみると、図２７では軌跡形状の違いが分かりづらい一方、図２８では欠乏元素による軌跡形状の違いを比較的容易に把握することができる。

　また、図２９にはＹ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）、Ｙ（ＩＩ）、Ｙ（ＮＯ）、Ｙ（ＮＰＱ）、１－ｑＬのそれぞれの値の大きさを円状に表現した測定結果グラフ（Ｒａｄａｒ　ｃｈａｒｔとも呼ぶ）の一例を示す。本実施形態に係る無機栄養ストレスの診断には、この図２９の測定結果を利用することもできる。

　つまり、図２５～図２９の測定結果について検討すると、本実施形態に係る解析回路２０ａは、Ｙ（ＩＩ）、Ｙ（ＮＰＱ）、Ｙ（ＮＯ）、１－ｐＬ、Ｙ（Ｉ）、Ｙ（ＮＡ）、およびＲＯＳマーカーであるＹ（ＮＤ）の全部ないしいずれかを利用して植物における無機栄養ストレスの診断（無機栄養素の欠乏状態の診断）をすることができる。

　さらに、解析回路２０ａは、時間経過を円状に表現してＹ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）をＹ（ＩＩ）で除した値がプロットされたサンプル診断グラフを作成し、無機栄養素がコントロールされた植物を示した基本診断グラフと前記サンプル診断グラフとを比較することで植物において必須栄養素であるＮ，Ｐ，Ｋ，Ｓ，Ｍｇ，Ｃａ，Ｂ，Ｚｎ、Ｍｏ，Ｃｕ，Ｆｅ，Ｍｎの全部ないしいずれかの欠乏状態を診断することができる。

　例えば本実施例に示したヒマワリの生育比較によれば、図３０に示すようにＡ～Ｄの圃場においてＲＯＳマーカーとＹ（ＩＩ）との相関を示すプロット位置には違いがあるのが分かる。このプロット位置の違いは、図３０の相関図においてそれぞれＡ領域、Ｂ領域、Ｃ領域、Ｄ領域というような区別（分類）をすることができる。本実施形態では、このプロット位置の領域を解析することで植物の生育予想をすることもできる。

　具体的には図３０に示すように圃場Ｃ（Ｃ領域）が健全で生育がよい圃場であるところ（ＲＯＳマーカーの発生が少ない領域）、本実施例の結果による生育予想としては、Ｃ＞Ｂ＞Ａ＞Ｄということが予測される（光合成活性が減少するとともにＲＯＳマーカーの発生が増加傾向にある領域の生育が悪い）。

　そして、図３１には播種から２ヶ月経過後のヒマワリの生育した様子の概略イメージを示す。同図に示すとおり、図３０の生育予想と同様に生育順はＣ＞Ｂ＞Ａ＞Ｄであった。このように本実施形態に係る環境ストレス診断装置を利用することで、ＲＯＳマーカーと光合成活性（Ｙ（ＩＩ）やＶ（Ｏ_２））との相関から、植物の生育具合を予測することができる。

　さらに、上述したように時間経過を円状に表現してＹ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）をＹ（ＩＩ）で除した値がプロットされたサンプル診断グラフ（例えば図２６や図２８）のプロット形状から植物における必須栄養素の欠乏状態をより詳しく予測ないし診断することもできる。

　具体的には、図３２に示すようにコントロールされた植物におけるプロット形状に対して例えばＮやＭｎが欠乏している状態のプロット形状ではその形状に違いがはっきりと見える。このように本実施形態に係る環境ストレス診断装置を利用してサンプル診断グラフのプロット形状を解析することで、植物における必須栄養素の欠乏状態を早期に診断することも可能となる。

　また、本実施形態に係る環境ストレス診断装置は、図３３に示すように密閉チャンバ１６に温調ユニット４２を設けることもできる。本実施形態では密閉チャンバ１６にこの温調ユニット４２を設けることで内部の葉温度（植物試料Ｓの温度）を制御することができる。

　例えば、図３４（ａ）に示すように、ヒマワリとコムギ（小麦）の測定結果を比較した場合、同じ温度（２５℃）で測定を行うとヒマワリに対してコムギは光誘導現象の動きが速いために特徴がとらえづらくなってしまう。

　そこで図３４（ｂ）に示すようにコムギの測定時に温調制御を行うことで（図３４（ｂ）では１７℃）、解析パラメータの動きを緩やかにしてその特徴をとらえやすくすることができる（酸素反応の速度を強制的に遅くさせてコムギの栄養欠乏を特定・診断することが可能となる）。

　本実施形態では光化学系ＩＩないし光化学系Ｉの測定情報を利用して植物における環境ストレス診断を行っているが、例えば本実施形態に係る環境ストレス診断装置１０で得られた測定情報や解析結果を植物の生育診断や品種改良等、他の用途に利用することもできる。

　また、本実施形態に係る環境ストレス診断装置は密閉チャンバの内部に植物試料を入れる構造であるが、例えば葉を挟みこんで測定する構造にすることで（葉を切り取らずに測定することで）、非破壊による経時的なモニタリングを実現することもできる。加えて、本実施形態では複数の環境ストレス診断装置を利用することで（携帯端末やデータサーバー等も利用することで）、同時刻に複数のサンプルを一括計測することも可能である。

１０　　　　環境ストレス診断装置
１２　　　　測定用光源
１４　　　　誘導用光源
１６　　　　密閉チャンバ
１８　　　　透過光検出器
２０　　　　制御ユニット
２０ａ　　　解析回路
２０ｂ　　　制御回路
２２　　　　酸素濃度検出器
２４　　　　環境センサー
３０ａ　　　呼気導入ポート
３０ｂ　　　エアー出力ポート
４０　　　　蛍光検出器
４２　　　　温調ユニット
ＭＬ　　　　測定光
ＭＬ１　　　第１測定光
ＭＬ２　　　第２測定光
ＭＬ３　　　合成矩形波測定光
ＰＬ　　　　光合成誘導光
ＦＲ　　　　第１光合成誘導光
ＡＬ　　　　第２光合成誘導光
ＴＬ　　　　合成矩形波透過光

Claims

　植物試料へ測定光を照射する測定用光源と、前記植物試料へ光合成誘導光を照射する誘導用光源と、前記植物試料が収容されるとともに前記測定光および光合成誘導光が内部へ進入可能な密閉チャンバと、前記植物試料を透過した測定光を透過光として検出する透過光検出器と、該透過光検出器で検出された透過光を測定信号として受信する制御ユニットと、を含み、前記植物試料の環境ストレス状態を診断する環境ストレス診断装置であって、
　前記測定用光源は、波長が異なる２種類の第１測定光および第２測定光を出力し、
　前記誘導用光源は、波長が異なる２種類の第１光合成誘導光および第２光合成誘導光を出力し、
　前記制御ユニットは、前記透過光検出器で得られた検出結果を解析する解析回路と、前記測定用光源および誘導用光源を前記植物試料に対応させて制御する制御回路と、を有し、
　前記制御回路は、前期第１測定光と第２測定光とを異なる出力振幅に調整制御するとともに前記第１測定光と第２測定光とが逆位相の矩形波となるよう前記測定用光源を制御し、
　前記制御回路は、前記第１測定光と第２測定光を同期して出力させるよう前記測定用光源を制御して該第１測定光と第２測定光をＤＣ成分が含まれる５ｋＨｚ～３０ｋＨｚの疑似的な１つの合成矩形波測定光として形成し、
　前記透過光検出器は、前記植物試料を透過した前記合成矩形波測定光を合成矩形波透過光として検出し、
　前記解析回路は、前記合成矩形波透過光を利用して前記植物試料を透過した第１測定光および第２測定光の光吸収差を算出し、該光吸収差を利用して光合成において光化学系ＩのＰ７００が酸化された状態であるＹ（ＮＤ）を植物の活性酸素抑制指標であるＲＯＳマーカーとして算出し、
　前記解析回路は、前記ＲＯＳマーカーを利用して前記植物試料の環境ストレス状態を診断することを特徴とする環境ストレス診断装置。
　請求項１に記載の環境ストレス診断装置であって、
　当該環境ストレス診断装置にはネットワーク接続するための通信部が設けられ、該通信部を介して当該環境ストレス診断装置は通信端末にネットワーク接続され、
　前記通信端末は当該環境ストレス診断装置の操作に利用され、且つ、測定結果としてのＲＯＳマーカーおよび環境ストレス診断結果が表示され、
　前記通信端末は環境ストレス診断データが蓄積されたデータサーバーにネットワーク接続され、該環境ストレス診断データと前記ＲＯＳマーカーとを比較して前記植物試料の環境ストレス状態を診断することを特徴とする。
　請求項１または請求項２に記載の環境ストレス診断装置であって、
　前記制御回路は、ＰＷＭ制御によって前記測定用光源から出力される前記第１測定光および第２測定光を同期させ、
　前記制御回路は、前記第１測定光および第２測定光における矩形波の立ち下がりのタイミングを指令周波数としてのリファレンス信号波形と比較し、
　前記制御回路は、前記測定用光源からの出力に起因して前記第１測定光および第２測定光における立ち下りのタイミングがずれた場合には該立ち下がりのタイミングを０．２５μｓ単位で調整して同期を維持することを特徴とする環境ストレス診断装置。
　請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の環境ストレス診断装置であって、
　前記誘導用光源は、前記第１光合成誘導光を連続的な照射として定常照射し、該定常照射した後に休止期間を設けずに該定常照射よりも高出力な照射としてパルス照射し、その後に休止期間を設けて前記第２光合成誘導光を定常照射し、該定常照射した後に休止期間を設けずにパルス照射し、
　前記パルス照射の照射時間は、１ｍｓ～３００ｍｓであることを特徴とする環境ストレス診断装置。
　請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の環境ストレス診断装置であって、
　前記密閉チャンバには、該密閉チャンバ内部における植物試料の酸素発生速度を測定する酸素濃度検出器が設けられ、
　前記解析回路は、前記ＲＯＳマーカーと前記酸素発生速度との相関を利用して前記植物試料の環境ストレス状態を診断することを特徴とする環境ストレス診断装置。
　請求項５に記載の環境ストレス診断装置であって、
　前記密閉チャンバには、温度センサー、湿度センサー、気圧センサーの全部ないしいずれかが環境センサーとして設けられ、
　前記解析回路は、前記環境センサーで得られた検出結果に基づいて前記酸素濃度検出器で検出された酸素発生速度を補正処理することを特徴とする環境ストレス診断装置。
　請求項５または請求項６に記載の環境ストレス診断装置であって、
　前記酸素濃度検出器は、ガルバニ電池式の酸素濃度検出器であることを特徴とする環境ストレス診断装置。
　請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の環境ストレス診断装置であって、
　前記密閉チャンバには、外部から呼気を導入するための呼気導入ポートおよび当該密閉チャンバ内部のエアーを入れ替えるためのエアー出力ポートが設けられていることを特徴とする環境ストレス診断装置。
　請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の環境ストレス診断装置であって、
　当該環境ストレス診断装置には、前記植物試料からのクロロフィル蛍光を検出する蛍光検出器が設けられ、
　前記解析回路は、前記蛍光検出器で得られたクロロフィル蛍光検出結果から光合成速度としてのＹ（ＩＩ）と、光合成に利用できない光エネルギーとしてのＹ（ＮＰＱ）と、光化学系ＩＩにおける基礎的熱散逸能としてのＹ（ＮＯ）と、プラストキノン還元率としての１－ｐＬと、を算出し、
　前記解析回路は、前記光吸収差を利用してＰ７００の基底状態であるＹ（Ｉ）と、Ｐ７００が光エネルギーを吸収している状態であるＹ（ＮＡ）と、を算出し、
　前記解析回路は、前記Ｙ（ＩＩ）、Ｙ（ＮＰＱ）、Ｙ（ＮＯ）、１－ｐＬ、Ｙ（Ｉ）、Ｙ（ＮＡ）、およびＲＯＳマーカーであるＹ（ＮＤ）の全部ないしいずれかを利用して前記植物試料における無機栄養素の欠乏状態を診断することを特徴とする環境ストレス診断装置。
　請求項９に記載の環境ストレス診断装置であって、
　前記解析回路は、時間経過を円状に表現してＹ（Ｉ）、Ｙ（ＮＤ）、Ｙ（ＮＡ）をＹ（ＩＩ）で除した値がプロットされたサンプル診断グラフを作成し、
　前記解析回路は、無機栄養素がコントロールされた植物を示した基本診断グラフと前記サンプル診断グラフとを比較することで前記植物試料における必須栄養素であるＮ，Ｐ，Ｋ，Ｓ，Ｍｇ，Ｃａ，Ｂ，Ｚｎ、Ｍｏ，Ｃｕ，Ｆｅ，Ｍｎの全部ないしいずれかの欠乏状態を診断することを特徴とする環境ストレス診断装置。
　請求項９または請求項１０に記載の環境ストレス診断装置であって、
　前記密閉チャンバには、該密閉チャンバ内部に位置する前記植物試料の温度を制御するための温調ユニットが設けられることを特徴とする環境ストレス診断装置。
　植物における環境ストレス診断方法であって、
　植物試料を密閉チャンバへ収容し、制御回路により測定用光源から出力される第１測定光および第２測定光を調整するとともに誘導用光源から出力させる第１光合成誘導光および第２光合成誘導光を調整する工程と、
　前記第１測定光よりも前記第２測定光を高出力にするとともに前記第１測定光と第２測定光とが逆位相の矩形波となるよう前記制御回路により前記測定用光源を制御し、且つ、前記制御回路により前記第１測定光と第２測定光を同期して出力させるよう前記測定用光源を制御して前記第１測定光と第２測定光をＤＣ成分が含まれる５ｋＨｚ～３０ｋＨｚの疑似的な１つの合成矩形波測定光として形成し、該合成矩形波測定光を前記第１光合成誘導光および第２光合成誘導光とともに前記植物試料へ照射する工程と、
　前記植物試料を透過した前記合成矩形波測定光を透過光検出器で１つの周波数の合成矩形波透過光として検出する工程と、
　前記合成矩形波透過光を利用して前記植物試料を透過した第１測定光および第２測定光の光吸収差を解析回路により算出し、該解析回路が該光吸収差を利用して光合成において光化学系ＩのＰ７００が酸化された状態であるＹ（ＮＤ）を植物の活性酸素抑制指標であるＲＯＳマーカーとして算出する工程と、
　前記ＲＯＳマーカーを利用して植物の環境ストレス状態を診断する工程と、を含むことを特徴とする植物における環境ストレス診断方法。