WO2022098191A1 - 하이드로겔화 핵산을 이용한 고분자량 단백질 생산용 원형 핵산 템플릿의 제조방법 및 고분자량 단백질 생산 시스템 - Google Patents

하이드로겔화 핵산을 이용한 고분자량 단백질 생산용 원형 핵산 템플릿의 제조방법 및 고분자량 단백질 생산 시스템 Download PDF

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WO2022098191A1
WO2022098191A1 PCT/KR2021/016143 KR2021016143W WO2022098191A1 WO 2022098191 A1 WO2022098191 A1 WO 2022098191A1 KR 2021016143 W KR2021016143 W KR 2021016143W WO 2022098191 A1 WO2022098191 A1 WO 2022098191A1
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WO
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nucleic acid
sequence
template
promoter
protein
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PCT/KR2021/016143
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엄숭호
오성
강재현
안소연
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프로지니어 주식회사
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a circular nucleic acid template for production of a high molecular weight protein capable of producing a nucleic acid hydrogel and a high molecular weight protein production system using the same, wherein the double comprising a G-quadruplexed sequence and a target sequence It relates to a method for producing a strand circular nucleic acid template and a system for producing a high molecular weight protein using the template.
  • Central dogma refers to a flow path of genetic information that was identified and named by British molecular biologist Francis Crick in 1956. DNA replication, DNA to RNA transcription , and RNA to protein translation. The initial concept meant the flow of expression from DNA to protein, but the current central dogma includes reverse transcription from RNA to DNA, and as various functions other than the protein coding function of RNA have been demonstrated, the function of genetic information and a concept that encompasses all flows.
  • the synthesis technology of genomes (DNA and RNA, etc.) and proteins (peptides) from the perspective of each stage of the central dogma has been developed in the life sciences, medicine, and alternative energy industries. It has been researched and developed as the most fundamental technology that has a significant impact on
  • Techniques currently used for DNA synthesis mainly include PCR and typical plasmid purification procedures from bacterial and other cellular sources. Methods for purifying plasmids from bacteria and other cells are expensive in time/human/economical, and PCR, which is in vitro amplification, relies on rapid thermal cycling, which is impractical for large-scale use.
  • RNA-based development applications e.g., siRNA or RNAzyme therapeutics or miRNA or piwi RNA-based diagnostic platforms, etc.
  • RNA-based development applications e.g., siRNA or RNAzyme therapeutics or miRNA or piwi RNA-based diagnostic platforms, etc.
  • RNA According to the central dogma that sustains biology, it is produced from DNA to RNA to the final protein.
  • RNA has a very short viability of a few seconds or minutes compared to DNA or protein, but it has a DNA genome code and a unique function of a protein at the same time, so its potential application is great.
  • the potential of RNA is illuminated, and various biological techniques for commercial use are plentiful, but there is a technically and costly very difficult in extracting RNA in cells or synthesizing it by chemical techniques.
  • the degradation rate of intracellular RNA is faster than that of DNA, extraction or storage is difficult, and it is difficult to synthesize more than 50 bases in length with current chemical synthesis technology, and even if successful, the yield is very low.
  • Current RNA production methods are divided into intracellular culture and chemical synthesis, both of which have limitations in spite of excellent applications of RNA due to high cost and low yield.
  • the G-quadraplex is a secondary structure of DNA found in the terminal region of chromosomes and transcriptional regulatory regions of various genes, and is divided into four It refers to a complex of G-quadrued strands formed in the form of hydrogen bonds by pairing DNA strands with each other.
  • Telomeres are rich in guanine to form G-quadrules, which inhibit the activity of telomerase. Inhibition of the activity of telomerase using the characteristics of the G-quadrel has been proposed as a therapy for inducing apoptosis of tumor cells.
  • the G-quadrel regulates the transcription of genes according to the formation site of the structure.
  • RNA synthesized by the nucleic acid production system is hydrogelled by forming a G-quartet structure, the stability of RNA can be significantly increased, and it is useful as a platform technology for cell-free protein synthesis from which peptides or proteins can be produced.
  • the method has a disadvantage in that hydrogelation is remarkably reduced when the target sequence is 150 bp or more or an unintentional secondary structure is formed.
  • the target sequence is 150 bp or more or an unintentional secondary structure is formed.
  • hydrogelation is remarkably reduced when the target sequence is 150 bp or more or an unintentional secondary structure is formed.
  • a significant reduction in hydrogelation has a disadvantage that makes it difficult to put the nucleic acid production system into practical use.
  • the present inventors added a double-wide band template having a short sequence of 30 to 100 bp or less, confirming that the nucleic acid is smoothly hydrogelled even when it has a long nucleotide sequence, and applied for a patent.
  • Korean Patent Application No. 10-2020-0077146 unpublished.
  • the present inventors have made intensive efforts to produce a template containing a sequence encoding a high molecular weight protein in the production and protein production system of the nucleic acid hydrogel, and as a result, the target sequence and G- After cloning and amplifying a double-stranded DNA sequence containing a quadruplex motif, it is possible to mass-produce circular nucleic acid templates for production of nucleic acid hydrogels and/or high molecular weight proteins even at low cost through restriction enzymes or infusion cloning. It was confirmed that high molecular weight protein can be produced in high yield in a cell-free protein synthesis system using the produced circular nucleic acid template or RNA hydrogel prepared therefrom, and completed the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a double-stranded circular nucleic acid template prepared by the method for preparing the double-stranded circular nucleic acid template.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a protein or peptide using the double-stranded circular nucleic acid template.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a nucleic acid hydrogel using the double-stranded circular nucleic acid template and a nucleic acid hydrogel prepared by the method.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the nucleic acid hydrogel.
  • Another object of the present invention is to provide a use for producing a peptide or protein of the nucleic acid hydrogel.
  • the present invention is (a) a promoter sequence; target sequence; And in a vector containing a G-quadruplex sequence (G-quadruplex seqeuence) sequence, by amplifying a nucleic acid sequence comprising a promoter sequence, a target sequence and a G- quadruplex sequence (G-quadruplex seqeuence), the promoter sequence, the target sequence and obtaining a linear nucleic acid strand comprising a G-quadruplex sequence; and
  • the present invention also provides a double-stranded circular nucleic acid template prepared by the method for preparing the double-stranded nucleic acid template.
  • the present invention also relates to the present invention.
  • the present invention also provides a method for producing a nucleic acid hydrogel comprising the step of amplifying or transcribed from the double-stranded circular nucleic acid template.
  • the present invention is also prepared by the method for producing the nucleic acid hydrogel, a promoter; target sequence; And it provides a nucleic acid hydrogel comprising a G- tetramerization sequence.
  • the present invention also provides a method for producing a peptide or protein comprising the step of synthesizing the peptide or protein by translating the nucleic acid hydrogel.
  • FIG. 1 schematically shows a method for preparing a double-stranded circular nucleic acid template of the present invention.
  • FIG. 1a Development view of cloning green fluorescent protein (GFP) into an E. coli expression vector
  • Figure 1b schematically shows a method for preparing a circular nucleic acid template using the conjugation method.
  • Figure 1c schematically shows a method for preparing a circular nucleic acid template using the infusion cloning method.
  • the infusion cloning kit was processed and both ends were spliced.
  • T7 exonuclease only circular nucleic acid template (circular DNA) was obtained and in vitro transcription was performed to synthesize RCT transcript.
  • Figure 2a shows the results of the presence or absence of the purification process after treatment with BamHI.
  • the PCR-amplified product of GFP was treated with BamHI to compare the presence or absence of the purification process, but it was confirmed that there was no significant difference on 1% agarose gel electrophoresis.
  • Figure 2b It is confirmed that the purified product and the unrefined product are each ligated, showing the difference in ligation, and various complexes are formed in the purified product, while the unrefined product has a large amount of monomers. did
  • FIG. 3e As a result of confirming whether T7 exonuclease degrades only linear DNA, it was confirmed that all of them were not degraded by treatment with a circular nucleic acid template (circular DNA) for 10, 20, or 30 minutes.
  • RNA transcript 4 is a result of confirming the RNA transcript by performing circular circulation transcription (RCT) using a circular nucleic acid template as a template through a 1% agarose gel electrophoresis image.
  • RCT circular circulation transcription
  • Figure 4f A result of confirming the morphological difference of RNA transcripts synthesized using linear and circular nucleic acid templates as templates.
  • Figure 4g The concentration of the RNA transcript according to the amount of the template nucleic acid template (linear and circular) was confirmed.
  • FIG. 5 shows the results of preparing a circular nucleic acid template through infusion cloning using 1% agarose gel electrophoresis.
  • Figure 5a A PCR product (linear nucleic acid) for infusion cloning was confirmed.
  • Figure 5c Treated with T7 exonuclease to digest all of the linear DNA, and only the circular nucleic acid template was obtained.
  • Lane 1 negative control
  • Lane 2 linear DNA
  • Lane 3 linear DNA+agarose
  • Lane 4 donut1(circular DNA1)
  • Lane 5 donut1(circular DNA1)+agarose
  • Lane 6 donut2(circular DNA2)
  • Lane 7 donut2 (circular DNA2) + agarose.
  • 6A A graph quantifying the fluorescence value (RFU) of green fluorescent protein produced after in vitro protein expression using RCT transcripts.
  • FIG. 7 shows GFP expression when using an RNA hydrogel generated by simultaneously performing in vitro transcription of the double-stranded circular nucleic acid template (first nucleic acid template) and the double-wide band nucleic acid template (second nucleic acid template) of the present invention. This is the efficiency verification result.
  • Lane 7a Lane 1 (negative control): 168.46, Lane 2 (positive control): 4312.26, Lane 3: (GFP angel 30T-0.125 ⁇ M: 4614.99), Lane 4: (GFP angel 30T-0.25 ⁇ M: 4561.78), Lane 5: (GFP angel 30T-0.5 ⁇ M: 7257.58), Lane 6: (GFP angel 30T-0.75 ⁇ M: 7007.31), Lane 7: (GFP angel 30T-1 ⁇ M: 7185.96).
  • Lane 1 (negative control): 168.46, Lane 2 (positive control): 4312.26, Lane 3: (GFP angel 90T-0.125 ⁇ M: 7075.71), Lane 4: (GFP angel 90T-0.25 ⁇ M: 7406.6), Lane 5: (GFP angel 90T-0.5 ⁇ M: 8556.68), Lane 6: (GFP angel 90T-0.75 ⁇ M: 9388.27), Lane 7: (GFP angel 90T-1 ⁇ M: 9658.04).
  • Lane 1 (negative control): 168.46, Lane 2 (positive control): 4312.26, Lane 3: (GFP angel 120T-0.125 ⁇ M: 4486.84), Lane 4: (GFP angel 120T-0.25 ⁇ M: 6813.15), Lane 5: (GFP angel 120T-0.5 ⁇ M: 6666.26), Lane 6: (GFP angel 120T-0.75 ⁇ M: 8943.02), Lane 7: (GFP angel 120T-1 ⁇ M: 8098.43).
  • RNA is extracted and purified in cells, and with the current method, it is not easy to obtain an appropriate amount of RNA due to a fast degradation rate, and the post-purification process is very complicated, resulting in low yield and high cost.
  • the present inventors provide a circular nucleic acid template capable of producing a stable nucleic acid without a separate additional process by allowing the nucleic acid containing the target sequence to hydrogel through the automatic formation of the G-quadruplex formed in the living organism.
  • nucleic acid template of the present invention when the target sequence is a gene encoding a protein of 6 kDa or more, it is difficult to mass-produce a nucleic acid template having a complex sequence structure such as a promoter sequence and a G-quartet motif, which is isolated, and a high molecular weight protein There was a limit to applying the nucleic acid template to the production of
  • the present inventors introduced a nucleic acid having a simple structure including a target sequence and a G-tetramerization sequence into a vector, and then a promoter sequence, a target sequence, and a G- Using ligation or infusion cloning technology, the linear nucleic acid strand prepared by amplifying the nucleic acid sequence containing the quadruplex sequence is converted into a circular template, which is complementary to the promoter sequence even through a low-cost and simple procedure. It was confirmed that mass production of a double-stranded circular nucleic acid template including a sequence, a sequence complementary to a target sequence, and a G-tetramerization motif sequence in an antisense strand is possible.
  • the double-stranded circular nucleic acid template produced by the production method of the present invention includes a sequence complementary to a promoter sequence, a sequence complementary to a target sequence, and a G-quadruplex motif sequence in the sense strand, and It is characterized in that the antisense strand contains a complementary sequence, a sequence complementary to a target sequence, and a G-tetramerization motif sequence.
  • the double-stranded circular nucleic acid template or a single-stranded (partially double-stranded) circular nucleic acid template composed of an antisense strand thereof is disclosed in Korean Patent Application Nos. 10-2019-0136416 and 10-2020-0077146, which were patented by the present inventors. described in detail.
  • a nucleic acid produced by performing amplification or transcription using the antisense strand of the double-stranded circular nucleic acid template as a template forms a G-quartet and is hydrogelled to form a more stable structure.
  • the double-stranded circular nucleic acid template may be used for production of a nucleic acid hydrogel.
  • the double-stranded circular nucleic acid template may be used for the production of proteins or peptides.
  • the present invention overcomes the limitation that mass production is difficult with the existing method for preparing a nucleic acid template in the production of a protein having a high molecular weight of 6 kDa or more in the conventional G-quadrued-based nucleic acid synthesis technology of the present inventors, It has the advantage of being able to mass-produce circular nucleic acid templates for nucleic acid hydrogel production at low cost. Therefore, the prototype nucleic acid template for producing a nucleic acid hydrogel of the present invention is preferably used for the production of a high molecular weight protein.
  • the "double-stranded circular nucleic acid template” may be described as "a circular nucleic acid template for the production of high molecular weight proteins" when used for production of a high molecular weight protein.
  • Nucleic acid hydrogel of the present invention means a nucleic acid that has formed a gel through various interactions such as hydrogen bonding, covalent bonding, and hydrophobic interactions between nucleic acid sequences, and in the present invention, in particular, the G-tetramerization sequence is hydrogen It is characterized in that it forms a unique structure in the shape of a cube that forms a quadruple strand in the form of a bond to form a gel.
  • the present inventors use a nucleic acid including a G-quadruplex motif sequence as a template.
  • nucleic acid hydrogel eg, DNA hydrogel or RNA hydrogel
  • hydrogelled nucleic acid eg, hydrogelled DNA or hydrogelled RNA
  • the vector of step (a) may be introduced into a vector template through various methods or artificially synthesized and manufactured.
  • restriction enzymes NdeI and SalI
  • MCS multiple cloning site
  • a vector including a target sequence and a G-tetramerization sequence was prepared, but the present invention is not limited thereto, and when the vector does not include a promoter, each of the promoter sequence, the target sequence and the G-tetramerization sequence, or a nucleic acid strand including the same It can also be introduced to prepare a vector.
  • the promoter sequence; target sequence; and the G-tetramerization sequence may be characterized in that it is introduced into the sense strand of the vector, and in this case, a sequence complementary thereto is introduced into the antisense strand of the vector.
  • the G-tetramerization sequence may be characterized in that it is linked to the 5' end or 3' end of the target sequence.
  • the term "vector” refers to a carrier used to transport, replicate or express a specific nucleic acid sequence by recombination with a specific nucleic acid sequence (eg, a target sequence). Depending on the type of vector, it is divided into a plasmid vector, a viral vector, a cosmid vector, an artificial chromosome, etc., and it is divided into a cloning vector and an expression vector depending on the application. As the vector of the present invention, all types of vectors described above may be used without limitation.
  • the vector is used as a template for cloning and amplifying a nucleic acid template in large quantities.
  • the vector may include an origin of replication, a restriction enzyme cleavage site, a multiple cloning site (MCS), and/or a selection marker.
  • the vector may be characterized in that it contains a sequence necessary for gene expression, such as an expression vector.
  • the vector may include an enhancer, a promoter sequence, a transcription initiation sequence, and/or a stop codon, and the like.
  • the vector may be characterized in that it does not include a transcription termination sequence for continuous nucleic acid transcription. Examples of vectors that can be used in the present invention include, but are not limited to, pK7, pIVEX, pET, pTXB, pUC, pF3K, and the like.
  • promoter refers to a gene region capable of regulating transcription initiation in the process of protein expression.
  • the promoter can be used by selecting a suitable promoter by those skilled in the art according to the type of template, the synthesis method, the type of nucleic acid to be produced, and the target sequence.
  • a promoter is generally a concept including both a sense strand and an antisense strand, but in the present invention, for the distinction between both strands, a 'promoter sequence (sense sequence)' and a 'promoter sequence complementary sequence (antisense sequence) sequence)'.
  • the promoter is, for example, T7 promoter, T5 promoter, T3 promoter, lac promoter, tac and trc promoter, cspA promoter, lacUV5 promoter, Ltet0-1 promoter, phoA promoter, araBAD promoter, trp promoter, tetA
  • promoters Ptac promoters, SP6 promoters, and the like, and may preferably be selected from the above examples, but is not limited thereto.
  • target sequence refers to a 'nucleic acid sequence to be produced (Sense)'.
  • a nucleic acid hydrogel including "a nucleic acid to be produced” can be produced.
  • the nucleic acid to be produced may be DNA, RNA, PNA, LNA, etc., preferably DNA or RNA.
  • the nucleic acid to be produced may be a functional moiety, preferably mRNA or sense strand DNA encoding a specific protein, but is not limited thereto.
  • the target sequence may be characterized as a sense strand of a gene encoding a protein or peptide.
  • the protein or peptide may be included without limitation, but preferably has a molecular weight of 5 kDa or more, more preferably 6 kDa or more.
  • the target sequence in the double-stranded circular nucleic acid template of the present invention, may be included in the sense strand of the double-stranded circular nucleic acid template, and a complementary sequence may be included in the antisense strand.
  • G-quadruplex refers to a structure in which two or more G-tetraplexes appearing in a DNA nucleotide sequence having a high ratio of guanosine residues are vertically stacked.
  • G-quadrel refers to a unique cube-shaped DNA structure in which four guanosine-rich DNA strands are paired with each other to form a quadruple in a hydrogen bond form, and four guanine bases form a Hoogsteen hydrogen bond (Hoogsteen hydrogen bonding) refers to a rectangular structure formed densely.
  • the G-quadrel is very stable under various biochemical conditions, and the orientation within the quaternary is variable.
  • the cation (mainly K+) at the center of the G-quartet contributes to maintaining the structure of the G-quartet more stably.
  • G-quadrules are known to have diverse biological functions in the telomere region and in the promoter region (Henderson E, et al., Telomeric DNA oligonucleotides form novel intramolecular structures containing guanine-guanine base pairs., Cell (December 1987)).
  • "G-tetramer" may be used interchangeably in the same meaning as "G-tetrapolymer”.
  • G-quartets are formed predominantly at guanine-rich sequence sites (Murat P, Balasubramanian S (April 2014)). However, not all guanine-rich sequence sites form G-quartets.
  • a method of predicting the ability to form a G-quadrel has been previously reported (Todd AK, Johnston M, Neidle S (2005)). For example, Todd AK, Johnston M et al.
  • the G-quartet may be characterized in that it is formed by three or more consecutive guanines and a sequence in which 1 to 7 random sequences are repeated one or more times,
  • G-quadruplex sequence refers to a sequence capable of forming a G-quadruplex, and the nucleic acid strand including the G-quadruplex sequence forms a G-quadruplex. make it possible The G-tetramerization sequence included in the nucleic acid strand transcribed using the nucleic acid template of the present invention as a template forms a G-quartet, thereby hydrogelation.
  • the G-tetramerization sequence may be characterized as a nucleic acid sequence in which 3 or more consecutive guanines and 1 to 7 random sequences are repeated one or more times, most preferably 5'-TAGGGTTAGGGT -3' (SEQ ID NO: 1).
  • G-quadruplex motif sequence refers to any sequence capable of forming a G-quadruplex when amplified or transcribed as a template.
  • the G- quadruplex motif sequence may be characterized in that it is complementary to the G- quadruplex sequence.
  • the G-quartet motif sequence may be characterized in that it is complementary to a nucleic acid sequence in which 3 or more consecutive guanines and 1 to 7 random sequences are repeated one or more times, most preferably It may be characterized as 5'-ACCCTAACCCTA-3' (SEQ ID NO: 2).
  • the 5'-UAGGGUUAGGGU-3' sequence of the RNA transcribed using the G-quartet motif contained in the antisense strand of the double-stranded circular nucleic acid template of the present invention as a template forms a G-quartet. designed.
  • a G-tetramerization sequence may be included in the sense strand of a vector or nucleic acid template, and a G-tetramerization motif sequence may be included in the antisense strand of the vector or nucleic acid template.
  • the RNA transcribed using the double-stranded circular nucleic acid template of the present invention as a template includes a G-tetramerization sequence, and may be characterized in that it is hydrogelled.
  • step (a) may be performed through various nucleic acid amplification methods.
  • the step (a) is a rolling circle amplification (Rolling Circle RCA), polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction (LCR), strand displacement amplification (SDA) and transcription-mediated (TMA) amplification), and as in one embodiment of the present invention, preferably isothermal amplification using polymerase chain reaction (PCR), but is not limited thereto.
  • the vector used for the amplification of step (b), the introduced nucleic acid sequence (target sequence, G-tetramerization sequence, etc.), the enzyme used (polymerase) , restriction enzymes, ligases, etc.) may be appropriately designed and used, and it is preferable that the amplified nucleic acid strand be designed and used so that it can include a promoter sequence, a target sequence, and a G-tetramerization sequence.
  • the nucleic acid sequence including the promoter sequence, the target sequence and the G-quadruplexed sequence is amplified to prepare a linear nucleic acid strand including the promoter sequence, the target sequence and the G-quadruplexed sequence in the sense strand.
  • a primer pair was designed and synthesized for use.
  • a pair of primers may be used for amplification of a nucleic acid sequence including the promoter sequence, the target sequence, and the G-tetramerization sequence.
  • the primer pair may be designed so that a double-stranded nucleic acid sequence including at least a promoter sequence, a target sequence, and a G-tetramerization sequence included in a vector in a sense strand can be amplified.
  • the primer pair may be characterized in that it consists of a forward primer and a reverse primer.
  • the forward primer may be characterized in complementary binding to the 5'-end upstream of the sense strand of the nucleic acid sequence to be amplified, and complementary to part or all of the promoter sequence. can be done with
  • the reverse primer may be characterized in that it complementarily binds to the 5'-end upstream of the antisense strand of the nucleic acid sequence to be amplified, and also complementarily binds to a part of the nucleic acid sequence to be amplified. It can be characterized as
  • step (a) amplifies a nucleic acid sequence comprising a promoter sequence, a target sequence, and a G-quadruplex sequence using a primer pair,
  • nucleic acid sequences complementary to each other are included in the reverse order at the 5' end of the Forward primer and the 5' end of the Reverse primer.
  • the same BamHI cleavage sequence is inserted at the 5' end of each primer in order to generate identical cleavage sites at both ends of the amplified nucleic acid strand.
  • it was designed and manufactured.
  • the present invention may be characterized by including the same restriction enzyme cleavage site at the 5' end of the primer pair, wherein the same restriction enzyme at the 3' end and 5' end of the linear nucleic acid strand obtained by amplification It may include a cleavage site.
  • the present invention when converting into a circular nucleic acid template using conjugation, it may be characterized in that adhesive ends are generated at both ends by treatment with restriction enzymes, and then these are joined through ligase. In this case, as in one embodiment of the present invention, it may be characterized in that the ligation is performed without performing a DNA purification process.
  • the "DNA purification process” refers to purifying and obtaining only the nucleic acid strand to be converted into a circular template by removing the cleavage fragment except for the desired nucleic acid strand after treatment with a restriction enzyme.
  • the same sequence when converting into a circular nucleic acid template using infusion cloning, the same sequence must be located at both ends of the amplified nucleic acid strand, so G-tetramerization is also performed at the 5' end of the reverse primer. The sequence was added so that both ends of the amplified sequence were identical to the G-tetramerization sequence.
  • step (b) after amplifying a linear nucleic acid strand including a promoter sequence, a target sequence, and a G-quadruplex sequence from a vector, ligation or infusion cloning Two methods were used to convert the original nucleic acid. Accordingly, in the present invention, step (b) may be characterized in that the circular nucleic acid template is converted through conjugation or infusion cloning, but is not limited thereto.
  • ligation refers to linking two nucleic acid ends. Conjugation may be one in which both ends of one nucleic acid strand or the ends of different nucleic acid strands are connected, and in step (b) of the present invention, the 3' and 5 ends of the nucleic acid strand amplified for conversion into a circular nucleic acid template 'After the end is cut with the same restriction enzyme, it can be spliced.
  • the amplified nucleic acid strand when converted into a cyclic nucleic acid template through ligation, it may be characterized by including the same restriction enzyme cleavage site at both ends of the amplified nucleic acid strand, , therefore, both ends of the amplified nucleic acid strand can be cleaved using the same restriction enzyme for conjugation.
  • the restriction enzyme for cutting the amplified nucleic acid strand can be used without limitation, and depending on the restriction enzyme used, the cut end may be a sticky end or a blunt end, It is preferable that it is an adhesive end.
  • the term "infusion cloning” refers to a Gibson assembly method using crossover of double-stranded nucleic acid strands having the same sequence.
  • the "Gibson assembly method” is a DNA binding method using the crossover of double-stranded nucleic acid strands devised by Daniel G. Gibson, and detailed protocols and principles are described in Nature Methods. 6 (5): 343-345.
  • both ends of the linear nucleic acid strand obtained in step (a) may include the same sequence.
  • a primer designed to amplify a nucleic acid strand including a G-tetramerization sequence at both ends of the linear nucleic acid strand was amplified and then converted into a circular nucleic acid template by an infusion cloning method.
  • nucleic acid template refers to a nucleic acid strand that can serve as a template for nucleic acid replication or transcription.
  • the nucleic acid template may be, for example, a DNA or RNA template.
  • the linear nucleic acid strand obtained through the amplification of step (a) includes a promoter sequence, a target sequence and a G-tetramerization sequence in a sense strand, and, if necessary, without limitation 5'UTR, additional purpose It may include a sequence such as a sequence.
  • the term “circular nucleic acid template” refers to a circular nucleic acid strand serving as a template for transcription or replication.
  • the circular nucleic acid template can be used as a template for amplification or transcription techniques called “Rolling Circle” or “Rolling Circle”. In the present invention, it is used as a rolling circle amplification (RCA) and a rolling circle transcription (RCT).
  • RCA and RCT are selectively used depending on the type of nucleic acid to be prepared. RCA is used for the production of DNA complementary to the template, and RCT is used for the production of RNA complementary to the template.
  • the polymerization reaction does not end until the material (e.g., dNTP, ddNTP) is depleted, and a nucleic acid having an N fold from one template can be prepared. , characterized in that it exhibits a higher production yield than the linear template.
  • the transcription termination sequence can optionally be removed. Accordingly, the nucleic acid template of the present invention may be characterized in that it does not include a transcription termination sequence.
  • the nucleic acid when a nucleic acid hydrogel or RNA is prepared using the double-stranded circular nucleic acid template, the nucleic acid may be synthesized using the antisense strand as a template.
  • the present invention relates to a double-stranded circular nucleic acid template prepared by the method for preparing the double-stranded circular nucleic acid template.
  • the double-stranded circular nucleic acid template comprises a sequence complementary to a promoter; a sequence complementary to the target sequence; and a G-quadruplex motif sequence in the sense strand.
  • the double-stranded circular nucleic acid template comprises a sequence complementary to the promoter; a sequence complementary to the target sequence; and a G-quadruplex motif sequence may be included in the antisense strand.
  • the double-stranded circular nucleic acid hydrogel when used for the production of an RNA hydrogel or for the production of a protein or peptide, it may be characterized in that the nucleic acid is synthesized using the antisense strand as a template.
  • the double-stranded circular nucleic acid template of the present invention comprises a sequence complementary to a promoter; a sequence complementary to the target sequence; and a G-quadruplex motif sequence.
  • Nucleic acid (DNA or RNA, etc.) obtained by performing rolling circle amplification (RCA) and rolling circle transcription (RCT) using the antisense strand of the double-stranded circular nucleic acid template of the present invention as a template is G- It can be hydrogelled by forming a quadruplex.
  • nucleic acid hydrogel Since the nucleic acid hydrogel has stronger physical properties than a single strand, stability can be significantly increased, and it can be usefully used as a platform technology for producing peptides or proteins therefrom.
  • a template for preparing a nucleic acid hydrogel including a G-quadruplex motif sequence and a protein synthesis system using the same are disclosed in detail in Korean Patent Application No. 2019-0136416 of the present inventors.
  • linkage means that nucleic acids or nucleic acid strands having a specific function (promoter, target sequence, G-tetramerization motif/sequence, etc.) are operably linked to each other, and the “operably linked” refers to each other Refers to two components placed in a functional relationship.
  • operably linked when used in the context of a G-tetramerization motif, includes a sequence complementary to the target sequence when amplified or transcribed into a template from the G-tetramerization motif sequence linked to the target sequence. It means that the nucleic acid strand is capable of forming a G-tetramerized structure.
  • Each linked sequence may be located upstream and/or downstream of each component.
  • the linking may be achieved by ligation at the restriction site. If such a site does not exist, a synthetic oligonucleotide adapter or linker is used according to conventional practice. However, each element need not be contiguous to be operatively connected.
  • the present invention relates to a method for producing a nucleic acid hydrogel comprising the step of amplifying or transcribed using the double-stranded circular nucleic acid template prepared by the method of the present invention as a template.
  • the nucleic acid hydrogel may be characterized in that RNA or DNA.
  • a DNA hydrogel when amplification is performed using the double-stranded circular nucleic acid template as a template, a DNA hydrogel can be obtained by self-assembly by the G-tetramerization sequence included in the synthesized DNA.
  • the RNA hydrogel when transcription is performed using the antisense strand of the double-stranded circular nucleic acid template as a template, the RNA hydrogel can be obtained by hydrogelation by self-assembly by the G-tetramerization sequence included in the transcribed RNA.
  • the amplification refers to synthesizing a nucleic acid having the same sequence using a nucleic acid template as a template.
  • the amplification of the present invention can be performed without limitation using a variety of methods. For example, to be performed through Rolling Circle RCA, Polymerase Chain Reaction (PCR), ligase chain reaction (LCR), strand displacement amplification (SDA), and transcription-mediated amplification (TMA).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LCR ligase chain reaction
  • SDA strand displacement amplification
  • TMA transcription-mediated amplification
  • the circular nucleic acid template is used as a template, it is preferable to use circular cyclic amplification (RCA), but is not limited thereto.
  • an appropriate nucleic acid polymerase (Polymerase), primer, etc. may be selected or manufactured by a person skilled in the art and used.
  • the transcription is one of the DNA expression processes.
  • the transcription refers to synthesizing RNA using the double-stranded circular nucleic acid template, preferably its antisense strand, as a template. do.
  • the transcription of the present invention may be performed without limitation using various methods, but it is preferable to perform a rolling circle transcription (RCT) method.
  • RCT rolling circle transcription
  • the salt conditions in the RNA solution in which the G-quadruplex structure of RNA is formed was confirmed through a specific flatness tendency according to the formation of the G-quadruplex structure of nucleic acids. Specifically, the formation of the G-quadruplex structure of the RNA through the RCT of the above Example in the conditions of 0, 0.1, 1, 10 or 100 mM KCl, NaCl and MgCl2 salt concentration was confirmed by circular dichroism analysis. As a result, under the conditions of 100 mM KCl and NaCl, a synthetic RNA having a G-quadruplex sequence of a half (containing only two sets of consecutive C (cytosine) sequences encoding continuous G, not all four sets) was produced.
  • the method further comprises the step of adding a cation, for example, most preferably a potassium ion or sodium ion, or a cation , for example, most preferably, it may be characterized in that amplification or transcription is performed in the presence of potassium ions or sodium ions.
  • a cation for example, most preferably a potassium ion or sodium ion
  • a cation for example, most preferably, it may be characterized in that amplification or transcription is performed in the presence of potassium ions or sodium ions.
  • the target sequence included in the nucleic acid template has a sequence size of 150 bp or more or forms a secondary structure that inhibits hydrogelation of the produced nucleic acid
  • the productivity of the nucleic acid hydrogel is reduced.
  • the target sequence encoding a high molecular weight protein has a very large sequence size, hydrogelation of the nucleic acid is very difficult.
  • the present inventors when adding a double-wide band template having a short sequence of 30 to 100 bp or less, the length of the target sequence of the nucleic acid template is 150 bp or more, or the hydrogelation of the produced nucleic acid is inhibited In the case of forming a secondary structure of
  • the circular template for nucleic acid hydrogel production of the present invention and the double-wide band template are amplified or transcribed together, it is confirmed that the difference in mechanical properties and strength changes according to the concentration, and the protein The concentration of the double-wide band template most suitable for expression was optimized.
  • a second nucleic acid template comprising a sequence complementary to a promoter sequence, a second target sequence, and a G-quadruplex motif sequence is simultaneously amplified or transcribed. It may further include a step, wherein the second target sequence may be characterized as a short nucleotide sequence of less than 150 bp, preferably 30 to 120 bp, more preferably 60 to 90 bp in length.
  • the length of the second target sequence may have an effect on the formation of a double-wide band, and the sequence may have a relatively insignificant effect.
  • the second target sequence may be a poly T sequence in which thymine is repeated.
  • a poly T sequence in which 30 to 120 thymines are repeated was used as the second target sequence, but the present invention is not limited thereto.
  • secondary structure that inhibits hydrogelation of nucleic acid means a secondary structure of a nucleic acid formed by various characteristics such as the length of a base sequence and GC content, for example, a loop structure, GC There is a structure in which is included in an amount of 30% to 75%, but is not limited thereto.
  • second target sequence refers to a sequence included in the second nucleic acid template (double-wide band template) and an inserted short nucleotide sequence that further improves hydrogelation of nucleic acids.
  • the double-wide band template is a second nucleic acid template
  • the circular nucleic acid template for nucleic acid hydrogel production of the present invention is a first nucleic acid template to distinguish it from a double-wide band template. is referred to as
  • second nucleic acid template is used interchangeably with the same meaning as “double-band template” in the present invention, and 'first' and 'second' are numbers assigned to distinguish the two templates.
  • "Double-wide band” refers to a first nucleic acid template (the double-stranded circular nucleic acid template of the present invention) and a G-quartet sequence of each nucleic acid produced using the double-stranded band template as a template to form a G-quartet.
  • nucleic acid hydrogel is prepared using the double-wide band template together, it was confirmed that the mechanical properties change according to the concentration, and simply increase the ratio of the double-wide band template Accordingly, it was confirmed that hydrogelation of nucleic acids does not increase, but when it has a specific ratio, it shows hydrogelation appropriate for protein expression and affects protein expression efficiency.
  • the second nucleic acid template (double-wide band template) is amplified or transcribed by mixing in a molar ratio of 1:1 to 600:1 compared to the double-stranded circular nucleic acid template (first nucleic acid template) of the present invention. It may be characterized in that it is mixed and amplified or transcribed, preferably in a molar ratio of 75:1 to 300:1, more preferably in a molar ratio of 150:1 to 300:1.
  • the first nucleic acid template and the second nucleic acid template are mixed and amplified or transcribed at the same time.
  • amplification may be performed using a nucleic acid amplification kit or method known in the art.
  • a nucleic acid amplification kit or method known in the art.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LCR ligase chain reaction
  • SDA strand displacement amplification
  • TMA transcription-mediated amplification
  • transcription may be performed through a DNA transcription kit or method known in the art, and changes in RNA polymerase, dNTPs, reagents, etc. can be easily made by those skilled in the art.
  • the present invention relates to a nucleic acid hydrogel prepared by the method for preparing the hydrogelized nucleic acid.
  • the nucleic acid hydrogel comprises a target sequence; And it is characterized in that it comprises a G- quadruplex sequence (G-quadruplex sequence) sequence.
  • the target sequence included in the nucleic acid hydrogel corresponds to the mRNA of a gene encoding a protein or peptide, it can be translated to synthesize a protein or peptide.
  • the cell-free protein synthesis system uses key elements (ATP (adenosine triphosphate), amino acids, etc.) for protein synthesis by adding a substrate or enzyme to cell lysates or extracts.
  • ATP adenosine triphosphate
  • a method for synthesizing proteins in Such a cell-free protein synthesis system can overcome the disadvantages of the existing protein production method using cells, and cell-free protein synthesis uses only the intracellular machinery and its factors related to protein production in the cell.
  • nucleic acid hydrogel transcribed from the nucleic acid template of the present invention as a template to perform in vitro protein expression (in vitro translation)
  • protein expression compared to negative control or linear DNA It was confirmed that this was improved by 4 to 6 times or more. In particular, it was confirmed that protein expression was further improved when using a nucleic acid template prepared using the infusion cloning method.
  • a peptide or protein is produced using the nucleic acid hydrogel system by the method of the present invention, there is an advantage that the production yield can be maximized, and in particular, it can be usefully used in a cell-free synthesis system for synthesizing a peptide or protein.
  • the present invention provides the steps of: (i) synthesizing RNA by performing circular circular transcription using the antisense strand of the double-stranded circular nucleic acid template of the present invention as a template; and
  • (ii) translating the synthesized RNA relates to a method for producing a peptide or protein comprising the step of synthesizing the peptide or protein.
  • the target sequence may be characterized as a sense sequence of a gene encoding a protein, preferably an mRNA sequence.
  • cell-free protein synthesis system refers to a 'cell-free or in vitro synthesis system' or a 'cell-free peptide synthesis system' depending on the production target. (cell-free or in vitro peptide synthesis system)' or 'cell-free protein/peptide synthesis system' can be used interchangeably with the same meaning.
  • steps (i) and (ii) may be coupled and performed at the same time, or may be performed separately from each other.
  • the circular circulation transcription of step (i) and translation of step (ii) are performed by purchasing HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit and NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System from New England Biolabs.
  • the circular circulation transcription of step (i) and the translation of step (ii) can be performed using various enzymes known in the art or commercially available kits.
  • RNA hydrogel produced by adding a double-wide band template to the double-stranded circular nucleic acid template of the present invention and transcribed together showed additional improvement in protein production ability at an appropriate concentration did
  • the method for producing a nucleic acid hydrogel and nucleic acid hydrogel of the present invention not only have very excellent structural stability outside the cell, but also have very excellent protein production ability through a cell-free protein or peptide expression system, so that the existing cell-free protein synthesis system Various limitations of this can be overcome, and thus it can be usefully used as a next-generation protein expression system.
  • a second circular sequence comprising a sequence complementary to the promoter sequence, a second target sequence having a length of 30 bp to 120 bp, and a G-quadruplex motif sequence
  • RNA is synthesized by performing circular transcription (transcription).
  • the second nucleic acid template (double-wide band template) may be mixed with the first nucleic acid template in a molar ratio of 1:1 to 600:1 and amplified or transcribed, preferably 75: It may be characterized in that it is added and transferred in a molar ratio of 1 to 300:1, more preferably in a molar ratio of 150:1 to 300:1.
  • translation refers to synthesizing a peptide or protein from RNA encoding a specific peptide or protein sequence through ribosomes.
  • the method for producing a peptide or protein through translation of the protein may be characterized in that it is performed by an in vivo or cell-free protein/peptide synthesis system.
  • Nucleic acid produced by using the template of the nucleic acid as a template has excellent stability outside the cell through hydrogelation, so it can be preferably used in a cell-free protein/peptide synthesis system.
  • the present invention provides a method for producing a peptide or protein comprising the step of synthesizing the peptide or protein using the nucleic acid hydrogel of the present invention.
  • the nucleic acid hydrogel is an RNA hydrogel, and it may be characterized in that it is translated to synthesize a peptide or protein.
  • the nucleic acid hydrogel is pulverized and translated.
  • the method for producing a peptide or protein through translation of the protein may be characterized in that it is performed by an in vivo or cell-free protein/peptide synthesis system.
  • Nucleic acid produced by using the template of the nucleic acid as a template has excellent stability outside the cell through hydrogelation, so it can be preferably used in a cell-free protein/peptide synthesis system.
  • Example 1 Preparation of vector for preparing nucleic acid template for production of high molecular weight protein
  • a nucleic acid strand containing a green fluorescent protein (GFP, green fluorescent protein) gene and a G-tetramerization sequence was cloned into pK7-vector, an E. coli expression vector (Fig. 1 (a)).
  • Restriction enzymes used for cloning are NdeI and SalI.
  • a nucleic acid strand including a green fluorescent protein (GFP) gene and a G-tetramerization sequence was synthesized by IDT (SEQ ID NOs: 3 and 4). Specifically, the GFP gene was amplified by PCR using the pK7-GFP-NdeI-F and pK7-GFP-SalI-R primers of [Table 1].
  • PCR For PCR, after mixing the composition of Genetbio's HS Prime Taq DNA Polymerase product according to the manual, at 94°C for 10 minutes (1 cycle), at 94°C for 30 seconds, at 56°C for 30 seconds, at 72°C for 1 minute (30 cycles), 5 min (1 cycle) at 72°C.
  • the pK7-vector and the green fluorescent protein gene were treated with the restriction enzymes NdeI and SalI of ThermoFisher, respectively, and both ends were cut (enzyme digestion) and then ligated using Promega's T4 DNA ligase product according to the manual.
  • a vector (pK7-GFP) for preparing a nucleic acid template for GFP production was prepared.
  • PCR was performed to include the T7 promoter, 5' UTR, GFP gene and G-tetramerization sequence.
  • linear nucleic acid strands T7-GFP-G4-BamHI, SEQ ID NOs: 9 and 10.
  • PCR after mixing the composition of Genetbio's HS Prime Taq DNA Polymerase product according to the manual, at 94°C for 10 minutes (1 cycle), at 94°C for 30 seconds, at 56°C for 30 seconds, at 72°C for 1 minute (30 cycles), 5 min (1 cycle) at 72°C.
  • the prepared linear nucleic acid strand (T7-GFP-G4-BamHI) was treated at 37 °C for 30 minutes using ThermoFisher's BamHI to cut both ends, and then spliced for 3 hours at room temperature using Promega's T4 DNA ligase product. It was converted into a circular nucleic acid template through ligation ( FIGS. 1B and 2A ).
  • the linear nucleic acid strand and the circular nucleic acid template were treated with T7 exonuclease at room temperature for 10 minutes, 20 minutes, and 30 minutes, respectively. All of the linear nucleic acid strands were degraded from 10 minutes ( FIG. 3D ), and the circular DNA showed the same state as the control group (not treated with T7 exonuclease) in all treatment groups ( FIG. 3E ). This means that the T7 exonuclease degrades only the linear nucleic acid strand.
  • Example 5 Preparation of nucleic acid template (Infusion cloning method) and circular circulation transcription
  • the vector prepared in Example 1 was amplified by PCR using the primers pK7-GFP-infusion-F3 and pK7-GFP-infusion-R4 of Table 3 as a template to prepare a linear nucleic acid strand (G4-T7-GFP-G4).
  • FIG. 5A SEQ ID NOs: 11 and 12.
  • PCR after mixing the composition of Genetbio's HS Primer Taq DNA Polymerase product according to the manual, at 94°C for 10 minutes (1 cycle), at 94°C for 30 seconds, at 56°C for 30 seconds, at 72°C for 1 minute (30 cycles), 5 min (1 cycle) at 72°C.
  • the produced linear nucleic acid strand (G4-T7-GFP-G4) was converted into a circular template by processing at 50 °C for 15 minutes using Takara's In-Fusion® HD Cloning kit (FIGS. 1c and 5b).
  • Example 7 RNA hydrogel (hydrogel) formation and physical properties confirmation using a double-wide band template
  • T7 promoter (the T7 promoter is separated into two parts and is present at 5' and 3' of the oligonucleotide), 30 poly T, 60 poly T, 90 poly T, 120 poly T and an oligonucleotide containing a G-tetramerization motif
  • the T7 promoter sequence is nicked by mixing an intact oligonucleotide complementary to the entire sequence of the isolated promoter to 45 ⁇ M and annealing from 95°C to 4°C in 100 mM NaCl condition.
  • the annealed T7 promoter nick was ligated using Promega's T4 DNA ligase product at a concentration of 10 ⁇ M according to the manual, and the nick was removed to include the T7 promoter-each Poly T sequence-G-tetramerization motif.
  • a circular double-wide band template (SEQ ID NOs: 15 to 18) was prepared.
  • In vitro transcription was performed by adding double-wide band templates (G4-30T, -60T, -90T, -120T) at various concentrations together with the circular nucleic acid template of Example 2 obtained by the conjugation method. Based on protein expression, 1 ⁇ M of double-wide band template (G4-30T, -60T, -90T, -120T) was set as a negative control group, and 20 ng of a circular nucleic acid template for GFP expression was set as a positive control group. For the experimental group, transcription was performed by adding 0.125 ⁇ M to 1 ⁇ M of a double-wide band template to 20 ng of a circular nucleic acid template for GFP expression.
  • Example 8 Verification of GFP expression efficiency when using a double-wide band template
  • the method for preparing a double-stranded circular nucleic acid template of the present invention is that it is difficult to mass-produce a conventional nucleic acid template in the production of a protein having a high molecular weight of 6 kDa or more in the conventional G-quartet-based nucleic acid synthesis technology of the present inventors.
  • By overcoming the limitations it is possible to mass-produce a nucleic acid template including a gene encoding a protein of 6 kDa or more as a target sequence even at low cost.
  • a peptide or protein is prepared using the nucleic acid template and the nucleic acid hydrogel system prepared by the method of the present invention, there is an advantage that the production yield can be maximized, and in particular, a cell-free synthesis system for synthesizing a peptide or protein can be usefully used for Therefore, it can be usefully used in various fields such as life science, medicine, food, etc. based on the synthesis of functional peptides or proteins, functional nucleic acids, and the like.

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Abstract

본 발명은 단백질 핵산 하이드로겔의 생산이 가능한 고분자량의 단백질 생산용 DNA 이중가닥 템플릿 제조방법 및 이를 이용한 고분자량 단백질 생산시스템에 관한 것으로, 본 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 제조방법은 기존의 본 발명자들의 G-사중체 기반의 핵산 합성기술에서, 6 kDa 이상의 고분자량을 가지는 단백질의 제조에 있어서, 기존의 핵산 템플릿의 대량제조가 어렵다는 한계를 극복하여, 저비용으로도 6kDa 이상의 단백질을 암호화하는 유전자를 목적서열로 포함하는 핵산 템플릿을 대량 제조할 수 있다. 나아가, 본 발명의 방법으로 제조된 핵산 템플릿 및 핵산 하이드로겔 시스템을 사용하여 펩타이드 또는 단백질을 제조하는 경우, 생산 수율을 극대화 할 수 있다는 장점이 있으며, 특히 펩타이드 또는 단백질을 합성하기 위한 무세포 합성 시스템에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 기능성 펩타이드 또는 단백질의 합성, 기능성 핵산 등을 기반으로 하는 생명과학, 의료, 식품 등 다양한 분야의 기술에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

하이드로겔화 핵산을 이용한 고분자량 단백질 생산용 원형 핵산 템플릿의 제조방법 및 고분자량 단백질 생산 시스템
본 발명은 핵산 하이드로겔의 생산이 가능한 고분자량 단백질 생산용 원형 핵산 템플릿 제조방법 및 이를 이용한 고분자량 단백질 생산시스템에 관한 것으로, G-사중체(G-quadruplex)화 서열 및 목적서열을 포함하는 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 제조방법 및 상기 템플릿을 이용한 고분자량 단백질의 생산 시스템에 관한 것이다.
센트럴 도그마(Central dogma)는 1956년 영국의 분자생물학자 크릭(Francis Crick)에 의해 입증 및 명명된 유전정보의 흐름 경로를 의미하는 것으로서, DNA의 복제(replication), DNA에서 RNA로의 전사(transcription), 및 RNA에서 단백질로 번역(translation)을 포함한다. 초기 개념은, DNA에서 단백질로 발현되는 흐름을 의미하였으나, 현재의 센트럴 도그마는 RNA에서 DNA로의 역전사(reverse transcription)를 포함하고, RNA의 단백질 코딩 기능 이외의 다양한 기능이 입증되면서, 유전정보의 기능 및 흐름을 모두 포괄하는 개념으로 확장되었다. 유전정보의 흐름 및 센트럴 도그마의 구성의 기능에 대한 연구가 지속되면서, 센트럴 도그마의 각 단계의 관점에서 유전체(DNA 및 RNA 등) 및 단백질(펩타이드)의 합성기술이 생명과학, 의학, 대체 에너지 산업에 중대한 영향을 미치는 가장 원천적인 기술로서 연구 및 발전되어 왔다.
기존의 유전자 합성 기술에서는 특정 유전자의 정확한 핵산 염기서열을 짧은 올리고뉴클레오티드로 나누어 합성한 뒤 이를 연결하는 방법이 이용되고 있는데, 이는 올리고뉴클레오티드의 합성, 올리고뉴클레오티드의 조립(assembly)을 통한 유전자의 합성, 핵산 염기서열 분석 시 발생하는 여러 요인의 에러를 찾아 정확한 염기서열 분석을 하기 어렵고, 특정 핵산 염기서열의 유전자만을 한 번에 한 종류만 합성할 수 있다는 단점이 있다(Mol Biosyst. 2009 Jul;5(7):714-22. doi:10.1039/b822268c. Epub 2009 Apr 6.).
현재 DNA 합성에 사용되는 기술로는 주로 PCR 및 박테리아 및 다른 세포 공급원으로부터의 전형적인 플라스미드 정제 과정 등이 있다. 박테리아 및 다른 세포에서 플라스미드를 정제하는 방법은 시간적/인적/경제적 비용이 많이 발생하며, 시험관 내 증폭인 PCR은 빠른 열 순환에 의존하며, 이는 대량 사용시에 비실용적이라는 단점이 있다.
기능적 단일-가닥 (예를 들어 mRNA) 및 이중-가닥 RNA 분자는 살아있는 세포에서 및 정제된 재조합 효소 및 정제된 뉴클레오티드 트리포스페이트를 사용하여 시험관 내에서 생산되었다 (유럽 특허 제1631675호 및 미국 특허 출원 공개 더블와이드 밴드014/0271559 A1호 참조). 그럼에도 불구하고, 광범위한 상업적 적용을 가능하게 하는 규모에서의 RNA의 생산은 과도한 비용을 필요로 한다. 최근 RNA 기반의 개발 응용품들 (예, siRNA 혹은 RNAzyme의 치료제 혹은 miRNA 혹은 piwi RNA 기반의 진단플랫폼 등)이 다양한 분야, 특히 의약학 분야에서 새롭게 태동하여 기존 DNA와 단백질을 대신하며 활발히 이용되고 있다. 생물학을 유지하는 중심이론(central dogma)에 따라 DNA에서 RNA를 거쳐 최종 단백질로 생산된다. RNA는 DNA나 단백질과 비교하면 수초 혹은 수분의 매우 짧은 생존력을 가지고 있으나 그 내부에는 DNA 유전체 암호와 단백질의 독특한 기능성을 동시에 가지고 있어서 그 잠재적 응용력이 크다. 이와 같이, RNA의 가능성이 조명되며 이를 상업적으로 이용하기 위한 다양한 생물학적 기술들이 난무하나 세포 속 RNA를 추출하거나 화학적 기술들로 합성하는데 기술적으로 비용적으로 매우 큰 어려움이 있다. 예를 들어, 세포 내 RNA의 분해 속도가 DNA에 비해 빨라서 추출이나 보관이 어려우며, 현재 화학적 합성기술로는 50 염기 길이 이상을 합성하는 것이 어렵고 성공하여도 그 수율이 매우 낮은 실정이다. 현재의 RNA 생산 방법은 세포 내 배양과 화학적 합성으로 나누어 지는데, 두 가지 모두 고비용과 저수율로 인하여 RNA의 우수한 응용성에도 불구하고 그 한계가 끊임없이 지적되고 있다.
한편, G-사중체(G-quadraplex, G4)는 염색체의 말단 부위, 다양한 유전자의 전사조절부위에서 발견되는 DNA의 2차 구조로서, 핵산 내에 구아닌(guanine, G)이 풍부한 부분에 의해 4개의 DNA 가닥이 서로 짝을 이루어, 수소결합 형태로 형성된 G-사중가닥의 복합체를 의미한다. 텔로미어는 구아닌이 풍부하여, G-사중체를 형성하고, 형성돤 G-사중체는 텔로머레이즈의 활성을 억제한다. 이러한 G-사중체의 특징을 이용한 텔로머레이즈의 활성 억제가 종양세포의 사멸을 유도하는 요법으로 제시되고 있다. 또한, G-사중가닥은 구조의 형성 부위에 따라, 유전자의 전사를 조절하는 것으로도 알려져 있다.
본 발명자들은 상기한 RNA 합성(전사) 및 단백질 생산(번역) 시스템 및 합성 RNA의 문제를 해결하기 위해, G-사중체(G-quadruplex) 모티프 서열을 포함하는 핵산을 템플릿으로 사용하는 원형 순환 전사(Rolling circle transcription: RCT)를 기반의 하이드로겔화 핵산의 생산 및 단백질 생산 시스템을 발명하고, 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제10-2019-0136416호, 미공개). 상기 핵산의 생산 시스템으로 합성된 RNA는 G-사중체 구조를 형성하여 하이드로겔화되기 때문에, RNA의 안정성을 현저히 높일 수 있으며, 이로부터 펩타이드 또는 단백질을 생산할 수 있는 무세포 단백질 합성의 플랫폼 기술로서 유용하게 이용될 수 있다. 그러나, 상기 방법은 목적서열이 150bp 이상 또는 의도치 않은 2차 구조를 형성하는 경우에, 하이드로겔화가 현저하게 감소되는 단점이 있다. 일반적으로, 다양한 산업 및 의료분야에 사용되는 단백질을 코딩하는 유전자는 대부분 150bp 이상의 긴 염기서열을 가지기 때문에, 이러한 하이드로겔화의 현저한 감소는 상기 핵산 생산시스템의 실용화를 어렵게 하는 단점이 있다.
상기한 한계를 극복하기 위해, 본 발명자들은 30 내지 100bp 이하의 짧은 서열을 갖는 더블와이드 밴드 템플릿을 추가하여, 긴 염기서열을 갖는 경우에도, 핵산이 원활하게 하이드로겔화되는 것을 확인하고, 특허출원 하였다(대한민국 특허출원 제10-2020-0077146호, 미공개). 그러나, 상기 제10-2019-0136416호의 원천특허와 제10-2020-0077146호 더블와이드 밴드 특허는 나뉘어진 프로모터, 목적서열에 상보적인 서열, G-사중체 서열의 복잡한 구조를 별도로 합성해야하며, 단일가닥 형태로 합성한 뒤 프로모터 서열에 상보적인 프라이머 서열을 디자인하여 어닐링, 접합(ligation) 등의 복잡한 과정을 거쳐야 하는 불편함이 있었으며, 특히 수 kDa의 고분자량의 단백질을 합성하는 핵산 하이드로겔을 생산하기 위해서는 수백 bp에서 수천 bp 이상의 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 템플릿을 합성해야하기 때문에, 대량생산이 현실적으로 어렵다는 단점이 있었다.
이러한 배경기술 아래에서, 본 발명자들은 상기 핵산 하이드로겔의 생산 및 단백질 생산 시스템에서 고분자량의 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 템플릿을 대량으로 생산하기 위해, 예의 노력한 결과, 벡터에 목적서열 및 G-사중체 모티프를 포함하는 이중가닥 DNA 서열을 클로닝하여 증폭한 뒤 제한효소 또는 인퓨전 클로닝(infusion cloning)을 통해 저비용으로도 핵산 하이드로겔의 생산 및/또는 고분자량 단백질 생산을 위한 원형 핵산 템플릿을 대량생산할 수 있고, 생산된 원형 핵산 템플릿 또는 이로부터 제조된 RNA 하이드로겔을 이용한 무세포 단백질 합성 시스템에서 고분자량 단백질을 높은 수율로 생산이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열을 포함하는 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 제조방법으로 제조된 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 사용한 단백질 또는 펩타이드의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 사용한 핵산 하이드로겔의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 핵산 하이드로겔을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 하이드로겔의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 하이드로겔의 펩타이드 또는 단백질의 제조 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 프로모터 서열; 목적서열; 및 G-사중체화 서열(G-quadruplex seqeuence) 서열을 포함하는 벡터에서, 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열(G-quadruplex seqeuence)을 포함하는 핵산 서열을 증폭하여, 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열(G-quadruplex seqeuence)을 포함하는 선형 핵산 가닥을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 증폭된 선형 핵산 가닥을 원형으로 변환하여, 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 수득하는 단계를 포함하는 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 이중가닥 핵산 템플릿의 제조방법으로 제조된 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 제공한다.
본 발명은 또한,
(i) 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 안티센스 가닥을 주형으로 원형 순환 전사를 수행하여 RNA를 합성하는 단계; 및
(ii) 합성된 RNA를 번역하여 번역(translation)하여, 펩타이드 또는 단백질을 합성하는 단계를 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 증폭(amplification) 또는 전사(transcription)하는 단계를 포함하는 핵산 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 하이드로겔의 제조방법으로 제조되고, 프로모터; 목적서열; 및 G-사중체화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 하이드로겔을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 하이드로겔을 번역(translation)하여, 펩타이드 또는 단백질을 합성하는 단계를 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 제조방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 제조방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 1a: 녹색 형광 단백질(GFP)를 대장균 발현 벡터에 클로닝하는 전개도
도 1b: 접합방법을 이용한 원형 핵산 템플릿의 제조방법을 개략적으로 나타낸 것이다. T7 프로모터 서열부터 G-사중체까지 PCR 증폭한 후 제한효소(BamHI)를 처리하여 양말단을 절단 한 후 리가아제(ligase)를 처리하여 접합하였다. T7 exonuclease를 이용하여 원형핵산 템플릿(circular DNA)만을 획득하여 in vitro transcription을 수행하여 RCT 전사체를 합성하였다.
도 1c: 인퓨전 클로닝 방법을 사용한 원형 핵산 템플릿의 제조방법을 개략적으로 나타낸 것이다. T7 프로모터 서열부터 G-quadruplex까지 PCR 증폭한 후 infusion cloning kit를 처리하여 양말단을 접합하였다. T7 exonuclease를 이용하여 원형 핵산 템플릿(circular DNA)만을 획득하여 in vitro transcription을 수행하여 RCT 전사체를 합성하였다.
도 2는 1% 아가로스겔 전기영동을 통해 원형 핵산 템플릿의 형성을 확인한 결과이다.
도 2a: BamHI을 처리한 후 정제 과정 유무에 대한 결과를 나타낸 것이다. GFP를 PCR 증폭한 산물을 BamHI 처리하여 정제과정의 유무를 비교하였으나, 1% 아가로스겔 전기영동 상에 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다.
도 2b: 정제를 한 산물과 정제하지 않은 산물을 각각 접합(ligation)한 이미지로 접합의 차이를 보이며 정제를 한 산물은 다양한 복합체가 형성된 반면 정제하지 않은 산물은 단량체 (monomer)가 다량 생긴 것을 확인하였다.
도 2c: T7 exonuclease 처리한 결과로, 정제하지 않은 산물에서만 원형 핵산 템플릿(circular DNA)이 분해되지 않고 존재하는 것을 확인하였다.
도 3은 선형 및 원형 핵산 템플릿에 대한 T7 Exonuclease의 반응을 확인한 것이다.
도 3d: T7 exonuclease가 선형 DNA만을 분해하는지 확인한 결과로, PCR 산물(선형 핵산 가닥)에 10, 20, 30분간 처리하여 모두 분해되는 것을 확인하였다.
도 3e: T7 exonuclease가 선형 DNA만을 분해하는지 확인한 결과로, 원형 핵산 템플릿(circular DNA)에 10, 20, 30분간 처리하여 모두 분해되지 않은 것을 확인하였다.
도 4는 1% 아가로스겔 전기영동 이미지를 통해 원형 핵산 템플릿을 주형으로 원형순환전사(RCT)를 수행하여, RNA 전사체를 확인한 결과이다.
도 4f: 선형 및 원형 핵산 템플릿을 주형으로 하여 합성된 RNA 전사체의 형태적 차이를 확인한 결과이다.
도 4g: 주형 핵산 템플릿(선형 및 원형)의 양에 따른 RNA 전사체의 농도를 확인한 것이다.
도 5는 1% 아가로스겔 전기영동법을 사용하여, 인퓨전 클로닝을 통한 원형 핵산 템플릿 제조 결과를 확인한 것이다.
도 5a: 인퓨전 클로닝을 위한 PCR 산물(선형 핵산)을 확인한 것이다.
도 5b: 인퓨전 클로닝을 통해 원형 핵산 템플릿이 생성된 것을 확인한 것으로 다양한 복합체가 생성된 것을 확인하였다.
도 5c: T7 exonuclease를 처리하여, 선형 DNA를 모두 분해하고, 원형 핵산 템플릿만을 수득한 결과이다.
도 5d: 수득한 원형 핵산 템플릿을 in vitro transcription 하여 RCT 전사체가 생산된 것을 확인한 결과이다.
도 6은 12% SDS-PAGE를 사용하여 RCT를 통해 합성된 RNA 하이드로겔을 이용한 GFP 발현 효율 검증한 결과이다.
각 레인의 정보는 다음과 같다:
Lane 1 : negative control, Lane 2 : linear DNA, Lane 3 : linear DNA+agarose, Lane 4 : donut1(circular DNA1), Lane 5 : donut1(circular DNA1)+agarose, Lane 6 : donut2(circular DNA2), Lane 7 : donut2(circular DNA2)+agarose.
도 6a: RCT 전사체를 이용하여 시험관내 단백질 발현을 수행한 후 생산된 녹색 형광 단백질의 형광값(RFU)을 정량화한 그래프이다.
도 6b: 생산된 녹색 형광 단백질을 12% SDS-PAGE 전기영동을 통해 단백질 밴드를 확인한 결과이다.
도 7은 이 사건 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿(제1 핵산 템플릿)과 더블와이드 밴드 핵산 템플릿(제2 핵산 템플릿)을 동시에 in vitro transcription을 수행하여 생성된 RNA 하이드로겔을 사용하는 경우의 GFP 발현 효율 검증 결과이다.
각 레인의 정보는 다음과 같다:
도 7a : Lane 1(음성대조군) : 168.46, Lane 2(양성대조군) : 4312.26, Lane 3 : (GFP angel 30T-0.125 μM : 4614.99), Lane 4 : (GFP angel 30T-0.25 μM : 4561.78), Lane 5 : (GFP angel 30T-0.5 μM : 7257.58), Lane 6 : (GFP angel 30T-0.75 μM : 7007.31), Lane 7 : (GFP angel 30T-1 μM : 7185.96).
도 7b : Lane 1(음성대조군) : 168.46, Lane 2(양성대조군) : 4312.26, Lane 3 : (GFP angel 60T-0.125 μM : 6320.14), Lane 4 : (GFP angel 60T-0.25 μM : 6950.44), Lane 5 : (GFP angel 60T-0.5 μM : 6132.26), Lane 6 : (GFP angel 60T-0.75 μM : 7492.49), Lane 7 : (GFP angel 60T-1 μM : 9491.85).
도 7c : Lane 1(음성대조군) : 168.46, Lane 2(양성대조군) : 4312.26, Lane 3 : (GFP angel 90T-0.125 μM : 7075.71), Lane 4 : (GFP angel 90T-0.25 μM : 7406.6), Lane 5 : (GFP angel 90T-0.5 μM : 8556.68), Lane 6 : (GFP angel 90T-0.75 μM : 9388.27), Lane 7 : (GFP angel 90T-1 μM : 9658.04).
도 7d : Lane 1(음성대조군) : 168.46, Lane 2(양성대조군) : 4312.26, Lane 3 : (GFP angel 120T-0.125 μM : 4486.84), Lane 4 : (GFP angel 120T-0.25 μM : 6813.15), Lane 5 : (GFP angel 120T-0.5 μM : 6666.26), Lane 6 : (GFP angel 120T-0.75 μM : 8943.02), Lane 7 : (GFP angel 120T-1 μM : 8098.43).
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본 명세서에 기재된 모든 염기서열은 5'말단에서 3'말단으로 작성하였다.
현재 대부분의 RNA는 세포 내에서 추출하고 정제하여 사용하고 있으며, 현재 방법으로는 빠른 분해 속도 때문에 적정의 RNA 필요량을 얻기가 쉽지 않고 후반 정제 공정이 매우 복잡하여 낮은 수율과 고비용이 큰 단점이다.
이에 본 발명자들은 생명체 내에서 형성되는 G-사중체(G-quadruplex)의 자동형성을 통해 목적서열을 포함하는 핵산이 하이드로겔화 되도록 하여, 별도의 추가 공정 없이도 안정적인 핵산의 생산이 가능한 원형 핵산 템플릿을 설계하였으며, 특히 이를 원형순환증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 또는 원형순환전사(Rolling Circle Transcription, RCT) 시스템에 도입하여, DNA 또는 RNA의 생산 수율 및 안정성을 현저히 증가시키고, 나아가 무세포 단백질 합성시스템에서도 본 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿 또는 이로부터 제조된 핵산 하이드로겔을 사용하여 단백질 또는 펩타이드를 합성하는 경우 현저히 뛰어난 단백질 발현율 및 생산수율을 나타내는 것을 확인하고 발명을 완성하여 특허출원한 바 있다. 다만, 상기 발명의 핵산 템플릿은 목적서열이 6kDa 이상의 단백질을 코딩하는 유전자인 경우에 분리된 프로모터 서열, G-사중체 모티프 등의 복잡한 서열 구조를 가지는 핵산 템플릿의 대량제조가 어려워, 고분자량의 단백질의 제조에 상기 핵산 템플릿을 적용하는데 한계가 있었다.
본 발명자들은 상기한 한계의 극복을 위해, 본 발명의 일 실시예에서, 목적서열 및 G-사중체화 서열을 포함하는 간단한 구조의 핵산을 벡터에 도입한 뒤, 프로모터서열, 목적서열, 및 G-사중체화 서열을 포함하는 핵산 서열을 증폭하여 제조된 선형 핵산 가닥을 접합(ligation) 또는 인퓨전 클로닝(Infusion cloning)기술을 이용하여, 원형 템플릿으로 변환하여, 저비용 및 간단한 절차를 통해서도 프로모터서열에 상보적인 서열, 목적서열에 상보적인 서열, 및 G-사중체화 모티프 서열을 안티센스 가닥에 포함하는 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 대량생산이 가능함을 확인하였다.
본 발명의 제조방법으로 생성되는 이중가닥 원형 핵산 템플릿은 프로모터서열에 상보적인 서열, 목적서열에 상보적인 서열, G-사중체 모티프 서열(G-quadruplex motif)을 센스가닥에 포함하며, 프로모터서열에 상보적인 서열, 목적서열에 상보적인 서열, 및 G-사중체화 모티프 서열을 안티센스 가닥에 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿 또는 이의 안티센스가닥으로 구성된 단일가닥(부분 이중가닥) 원형 핵산 템플릿은 본 발명자들에 의해 특허출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0136416호 및 제10-2020-0077146호에 상세히 기재되어 있다. 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 안티센스 가닥을 주형으로 하여, 증폭(amplification) 또는 전사(Transcription)을 수행하여 생산되는 핵산은 G-사중체를 형성하여 하이드로겔화 되어 보다 안정한 구조를 형성한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기한 방법으로 제조한 템플릿을 사용하여 고분자량의 단백질을 발현하는 경우에도 약 4배 내지 6배의 현저히 높은 발현 효율을 나타내는 것을 확인하였으며, 나아가 더블와이드 밴드 템플릿을 함께 사용하는 경우에는 약 2배의 추가적인 단백질 발현효율의 증가를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서,
(a) 프로모터 서열; 목적서열; 및 G-사중체화 서열(G-quadraplex sequence)을 포함하는 벡터에서 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열(G-quadraplex sequence)을 포함하는 핵산 서열을 증폭하여, 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열(G-quadruplex seqeuence)을 포함하는 선형 핵산 가닥을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 선형 핵산 가닥을 원형으로 변환하여, 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿은 핵산 하이드로겔 생산용도로 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿은 단백질 또는 펩타이드의 제조용도로 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 기존의 본 발명자들의 G-사중체 기반의 핵산 합성기술에서, 6 kDa 이상의 고분자량을 가지는 단백질의 제조에 있어서, 기존의 핵산 템플릿의 제조방법으로는 대량제조가 어렵다는 한계를 극복하여, 저비용으로도 핵산 하이드로겔 생산용 원형 핵산 템플릿을 대량 제조할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 하이드로겔 생산용 원형 핵산 템플릿은 고분자량 단백질의 제조를 위해 사용되는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명에서, 상기 " 이중가닥 원형 핵산 템플릿"은 고분자량 단백질의 생산을 위해 사용되는 경우, "고분자량 단백질 제조용 원형 핵산 템플릿"으로 기재될 수 있다.
본 발명의 "핵산 하이드로겔"이란, 핵산 서열간의 수소결합, 공유결합, 소수성 상호작용 등의 다양한 상호작용을 통해 겔을 형성한 핵산을 의미하며, 본 발명에서는 특히, G-사중체화 서열이 수소결합 형태로 4중 가닥을 형성하는 입방체 모양의 독특한 구조를 형성하여 겔을 형성하는 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 상기한 RNA 합성방법 및 합성 RNA의 문제를 해결하기 위해, G-사중체(G-quadruplex) 모티프 서열을 포함하는 핵산을 템플릿으로 사용하는 원형 순환 전사(Rolling circle transcription: RCT)를 기반의 하이드로겔화 핵산의 생산 시스템을 발명하고, 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제10-2019-0136416호). 상기 핵산의 생산 시스템으로 합성된 RNA는 G-사중체 구조를 형성하여 하이드로겔화되기 때문에, RNA의 안정성을 현저히 높일 수 있으며, 이로부터 펩타이드 또는 단백질을 생산할 수 있는 플랫폼 기술로서 유용하게 이용될 수 있다. 상기 "핵산 하이드로겔(예, DNA 하이드로겔 또는 RNA 하이드로겔)"은 "하이드로겔화 핵산(예, 하이드로겔화 DNA 또는 하이드로겔화 RNA)" 또는 “핵산 수화겔”과 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 상기 (a) 단계의 벡터는 다양한 방법을 통해 벡터 템플릿에 도입되거나 인공적으로 합성되어 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 제한효소(NdeI 및 SalI)를 사용하여 T7 프로모터를 포함하는 pk7 벡터의 다중클로닝부위(MCS)에 목적서열 및 G-사중체화 서열을 포함하는 핵산을 클로닝하여, 프로모터 서열; 목적서열 및 G-사중체화 서열을 포함하는 벡터를 제조하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 벡터가 프로모터를 포함하지 않는 경우, 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열 각각 또는 이를 포함하는 핵산가닥을 도입하여 벡터를 제조할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터 서열; 목적서열; 및 G-사중체화 서열은 벡터의 센스 가닥에 도입되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이 경우, 벡터의 안티센스 가닥에는 이에 상보적인 서열이 도입된다..
본 발명에 있어서, G-사중체화 서열은 목적서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "벡터(Vector)"는 특정 핵산서열(예, 목적서열)등과 재조합 하여, 상기 특정 핵산서열을 수송, 복제 또는 발현하기 위해 사용되는 운반체를 총칭하는 것이다. 벡터의 종류에 따라, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터 및 인공 염색체 등으로 구분되며, 응용에 따라 클로닝 벡터 및 발현벡터 등으로 구분된다. 본 발명의 벡터는 상기한 모든 종류의 벡터가 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 벡터는 핵산 템플릿을 대량으로 복제 및 증폭하기 위한 주형으로 사용된다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터는 복제 기점, 제한효소 절단부위, 다중 클로닝 부위(MCS), 및/또는 선택 마커 등을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터와 같이 유전자 발현에 필요한 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터는 인핸서, 프로모터 서열, 전사개시서열, 및/또는 종결코돈 등을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터는 지속적인 핵산의 전사를 위해, 전사 종료서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 벡터의 예로, pK7, pIVEX, pET, pTXB, pUC, pF3K 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "프로모터"는 단백질의 발현과정에서 전사 개시를 조절할 수 있는 유전자 부위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 템플릿의 종류, 합성 방식, 생산하고자하는 핵산의 종류, 목적서열에 따라 통상에 기술자에 의해 적합한 프로모터가 선택되어 사용될 수 있다. 이중가닥 핵산에서 프로모터는 일반적으로 센스가닥과 안티센스가닥 모두를 포함하는 개념이나, 본 발명에 있어서, 양 가닥의 구분을 위해, '프로모터 서열(센스 서열)' 및 '프로모터 서열에 상보적인 서열(안티센스 서열)'로 구분하여 명칭될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 예를 들어, T7 프로모터, T5 프로모터, T3 프로모터, lac 프로모터, tac과 trc 프로모터, cspA 프로모터, lacUV5 프로모터, Ltet0-1 프로모터, phoA 프로모터, araBAD 프로모터, trp 프로모터, tetA 프로모터, Ptac 프로모터 및 SP6 프로모터 등이 있으며, 바람직하게는 상기 예에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "목적서열"은 '생산하고자 하는 핵산 서열(Sense)'을 의미한다. 상기 핵산 템플릿을 주형으로 하여 DNA 또는 RNA를 합성하는 경우, "생산하고자 하는 핵산"을 포함하는 핵산 하이드로겔을 생산할 수 있다. 상기 생산하고자 하는 핵산은 DNA, RNA, PNA, LNA 등일 수 있으며, 바람직하게는 DNA 또는 RNA이다. 예를 들어, 상기 생산하고자 하는 핵산은 기능성 부위(functional moiety)인 것일 수 있으며, 바람직하게는 특정 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 센스가닥 DNA 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 목적서열은 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 유전자의 센스가닥인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 5kDa 이상, 보다 바람직하게는 6kDa 이상의 분자량을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 이중 가닥 원형 핵산 템플릿에서, 상기 목적서열은 상기이중가닥 원형 핵산 템플릿의 센스가닥에 포함될 수 있으며, 이에 상보적인 서열이 안티센스 가닥에 포함될 수 있다.
본 발명의 용어 "G-사중체(G-quadruplex)"는 구아노신 잔기의 비율이 높은 DNA 염기서열에서 나타나는 G-사중가닥(G-tetraplex)이 2개 이상 수직적으로 쌓여 형성하는 구조를 의미하며, 여기에서, G-사중가닥은 구아노신이 풍부한 4개의 DNA 가닥이 서로 짝을 이루어 수소결합 형태로 4중 가닥을 형성하는 입방체 모양의 독특한 DNA 구조를 의미하며, 4개의 구아닌 염기가 후그스틴 수소결합(Hoogsteen hydrogen bonding)으로 밀집되어 형성된 사각형 구조를 말한다. G-사중가닥은 다양한 생화학적 조건에서 매우 안정적이며 사중 가닥 내의 방향성은 다양하다. 특히, G 사중가닥의 중앙에 있는 양이온(주로 K+)은 G-사중체의 구조를 더욱 안정되게 유지하는 데 기여한다. G-사중체는 텔로미어 영역 및 프로모터 영역에서, 다양한 생물학적 기능을 하는 것으로 알려져 있다(Henderson E, et al., Telomeric DNA oligonucleotides form novel intramolecular structures containing guanine-guanine base pairs., Cell(December 1987)). 본 발명에서 "G-사중체"는 "G-사중합체"와 동일한 의미에서 호환적으로 사용될 수 있다.
G-사중체는 구아닌이 풍부한 서열 부위에서 주로 형성된다(Murat P, Balasubramanian S (April 2014)). 그러나, 모든 구아닌 풍부 서열 부위에서 G-사중체가 형성되는 것은 아니다. G-사중체 형성 능력의 예측방법은 이전의 보고를 통해 보고된 바 있다(Todd AK, Johnston M, Neidle S (2005)). 예를 들어, Todd AK, Johnston M 등은 d(G3+N1-7G3+N1-7G3+N1-7G3+)(여기서, 아랫 첨자는 각 염기의 개수 범위, N은 임의의 염기, d는 1이상의 정수로서, 괄호 안의 염기서열의 반복을 의미함)은 G-사중체를 형성하는 일반적인 패턴으로 보고한 바있다. 본 발명에 있어서, G-사중체는 3개이상의 연속적인 구아닌 및 1 내지 7개의 임의의 서열이 1번 이상 반복되는 서열에 의해 형성되는 것을 특징으로 할 수 있다,
본 발명의 용어 "G-사중체화 서열(G-quadruplex sequence)"은 G-사중체를 형성할 수 있는 서열을 의미하며, 상기 G-사중체화 서열을 포함하는 핵산 가닥이 G-사중체를 형성할 수 있도록 한다. 본 발명의 핵산 템플릿을 주형으로 전사된 핵산 가닥에 포함된 G-사중체화 서열이 G-사중체를 형성하여, 하이드로겔화 된다.
본 발명에 있어서, 상기 G-사중체화 서열은 3개이상의 연속적인 구아닌 및 1 내지 7개의 임의의 서열이 1번 이상 반복되는 핵산서열인 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 5'-TAGGGTTAGGGT-3'(서열번호 1) 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, "G-사중체 모티프(G-quadruplex motif) 서열"은 이를 주형으로 증폭 또는 전사되는 경우, G-사중체를 형성할 수 있도록 하는 모든 서열을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 G-사중체 모티프 서열은 상기 G-사중체화 서열에 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 G-사중체 모티프 서열은 3개이상의 연속적인 구아닌 및 1 내지 7개의 임의의 서열이 1번 이상 반복되는 핵산서열에 상보적인 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 5'-ACCCTAACCCTA-3'(서열번호 2)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 안티센스 가닥에 포함된 상기 G-사중체 모티프를 주형으로 전사된 RNA의 5'-UAGGGUUAGGGU-3'서열이 G-사중체를 형성하도록 설계하였다.
본 발명에 있어서, 벡터 또는 핵산 템플릿의 센스 가닥에 G-사중체화 서열이 포함되고, 벡터 또는 핵산 템플릿의 안티센스 가닥에 G-사중체화 모티프 서열이 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 주형으로 전사된 RNA는 G-사중체화 서열을 포함하며, 이를 통해 하이드로겔화 되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 다양한 핵산 증폭 방법을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 (a) 단계는 원형 순환 증폭(Rolling Circle RCA), 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR), LCR(ligase chain reaction), SDA(strand displacement amplification) 및 TMA(transcription-mediated amplification) 을 통해 수행될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서와 같이, 바람직하게는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용하여 등온 증폭하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, PCR을 통해 핵산 가닥을 증폭하는 경우, 상기 (b) 단계의 증폭을 위해 사용된 벡터, 도입된 핵산서열(목적서열, G-사중체화 서열 등), 사용되는 효소(중합효소, 제한효소, 리가아제 등) 등에 따라 적절하게 프라이머가 설계 및 사용될 수 있으며, 증폭된 핵산 가닥이 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열을 포함할 수 있도록 설계 및 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열을 포함하는 핵산 서열을 증폭하여, 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열을 센스가닥에 포함하는 선형 핵산 가닥을 제조하기 위해 프라이머 쌍을 설계 및 합성하여 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열을 포함하는 핵산 서열의 증폭을 위해 프라이머 쌍이 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 적어도 벡터에 포함된 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열을 센스가닥에 포함하는 이중가닥 핵산 서열이 증폭될 수 있도록 설계되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 Forward 프라이머와 Reverse 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 할 수 잇다.
본 발명의 용어, Forward 프라이머는 증폭하고자하는 상기 핵산 서열의 센스가닥의 5’-말단 상류와 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 프로모터 서열 일부 또는 전부와도 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, Reverse 프라이머는 증폭하고자하는 상기 핵산 서열의 안티센스가닥의 5’-말단 상류와 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 증폭하고자하는 상기 핵산 서열의 일부와도 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 프라이머 쌍을 사용하여, 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열(G-quadruplex seqeuence)을 포함하는 핵산 서열을 증폭하고,
상기 프라이머 쌍은 각각
i) 5' 말단에 동일한 제한효소 절단부위를 포함하거나;
ii) Forward 프라이머의 5'말단 및 Reverse 프라이머의 5'말단에 서로 상보적인 핵산서열이 역순으로 포함된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 접합(ligation)을 사용하여 원형 핵산 템플릿으로 변환하는 경우, 증폭된 핵산 가닥의 양 끝에 동일한 절단부위를 생성하기 위해, 각 프라이머의 5'말단에 동일한 BamHI 절단 서열을 추가하여 설계 및 제작하였다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 프라이머 쌍의 5' 말단에 동일한 제한효소 절단부위를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때 증폭되어 수득되는 선형 핵산 가닥의 3’ 말단 및 5’ 말단에는 동일한 제한 효소 절단 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 접합을 사용하여 원형 핵산 템플릿으로 변환하는 경우, 제한효소를 처리하여 양 말단에 접착 말단을 생성한 후, 이를 리가아제(ligase)를 통해 접합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 일 실시예에서와 같이, DNA 정제과정을 수행하지 않고 접합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 "DNA 정제과정"이란 제한효소를 처리한 후, 목적하는 핵산가닥을 제외한 절단 단편을 제거하여, 원형템플릿으로 변환하고자 하는 핵산 가닥만을 정제하여 수득하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 인퓨전 클로닝(Infusion Cloning)을 사용하여 원형 핵산 템플릿으로 변환하는 경우, 증폭된 핵산 가닥의 양 끝에 동일한 서열이 위치해야 하므로, Reverse 프라이머의 5' 말단에도 G-사중체화 서열을 추가하여 증폭된 서열의 양 말단이 동일한 G-사중체화 서열이 위치하도록 하였다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 Forward 프라이머의 5'말단 및 Reverse 프라이머의 5'말단에 서로 상보적인 핵산서열이 역순으로 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 벡터로부터 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열(G-quadruplex sequence) 을 포함하는 선형의 핵산 가닥을 증폭한 뒤, 접합(ligation) 또는 인퓨전 클로닝(Infusion cloning)의 두 가지 방법을 통해 원형 핵산으로 변환하였다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 접합 또는 인퓨전 클로닝을 통해 원형 핵산 템플릿으로 변환되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "접합(ligation)"두 개의 핵산 말단을 연결하는 것을 의미한다. 접합은 하나의 핵산가닥의 양 말단 또는 서로 다른 핵산가닥의 말단이 연결되는 것일 수 있으며, 본 발명의 (b) 단계에서, 원형 핵산 템플릿으로의 변환을 위해 증폭된 핵산가닥의 3'말단 및 5'말단이 동일한 제한효소로 절단된 뒤, 접합될 수 잇다.
본 발명의 일 구현예에서, 증폭된 핵산 가닥이 접합(ligation)을 통해 고리형 핵산 템플릿으로 변환되는 경우, 증폭된 핵산 가닥의 양 말단에 동일한 제한효소 절단부위를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 따라서, 접합을 위해 동일한 제한효소를 사용하여 증폭된 핵산가닥의 양 말단을 절단될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 증폭된 핵산 가닥을 절단하기 위한 제한효소는 제한없이 사용될 수 있으며, 사용되는 제한효소에 따라 절단된 말단이 접착 말단(sticky end) 또는 평활 말단(blunt end)일 수 있으나, 접착말단인 것이 바람직하다.
본 발명의 용어, "인퓨전 클로닝(Infusion cloning)"은 동일한 서열을 갖는 이중가닥 핵산가닥의 교차를 이용하는 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly) 방법을 의미한다. 상기 "깁슨 어셈블리(Gibson Assembly) 방법"은 Daniel G. Gibson에 의해 고안된 이중가닥 핵산가닥의 교차를 이용한 DNA 결합방법으로 자세한 프로토콜 및 원리는 Nature Methods. 6 (5): 343-345에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 인퓨전 클로닝(Infusion cloning) 방법으로 원형 핵산 템플릿으로 변환되는 경우, (a) 단계에서 수득된 선형 핵산 가닥의 양 말단은 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 선형 핵산 가닥의 양 말단에 G-사중체화 서열을 포함하는 핵산가닥을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 증폭한 뒤, 인퓨전 클로닝 방법으로 원형 핵산 템플릿으로 변환하였다.
본 발명의 용어, "핵산 템플릿"은 핵산의 복제 또는 전사에 있어서, 주형이 될 수 있는 핵산 가닥을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산 템플릿은 예를 들어, DNA 또는 RNA 템플릿 일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 증폭을 통해 수득된 선형 핵산 가닥은 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열을 센스가닥에 포함하며, 필요에 따라, 제한없이 5'UTR, 추가적인 목적서열과 같은 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "원형 핵산 템플릿"이란 전사 또는 복제에서 주형이 되는 원형의 핵산 가닥을 의미한다. 상기 원형 핵산 템플릿은 "원형회전" 또는"회전환"으로 불리는(Rolling Circle) 증폭(amplification) 또는 전사(transcription) 기술에 주형으로 사용될 수 있다. 본 발명에서, 원형회전증폭(Rolling Circle amplification; RCA) 및 원형회전전사(Rolling Circle Transcription; RCT)로 사용된다. 상기 RCA 및 RCT는 제조할 핵산의 종류에 따라 선택적으로 사용된다. RCA는 템플릿에 상보적인 DNA의 생산을 위해 사용되며, RCT는 템플릿에 상보적인 RNA의 생산을 위해 사용된다. 상기 원형 핵산 템플릿을 사용하여, RCT 또는 RCA를 수행하는 경우, 재료(예, dNTP, ddNTP)가 고갈될 때까지 중합반응이 종료되지 않고, 하나의 템플릿에서 N배수를 갖는 핵산을 제조할 수 있어, 선형 템플릿보다 높은 생산 수율을 나타내는 것을 특징으로 한다. 전사가 1배수에 그치지 않고 지속되도록 하기 위해, 선택적으로 전사종료서열을 제거할 수 있다. 따라서 본 발명의 핵산 템플릿은 전사종료서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 사용하여 핵산하이드로겔 또는 RNA를 제조하는 경우, 안티센스 가닥을 주형으로 핵산이 합성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 제조방법으로 제조된 이중가닥 원형 핵산 템플릿에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿은 프로모터에 상보적인 서열; 목적서열에 상보적인 서열; 및 G-사중체 모티프(G-quadruplex motif) 서열을 센스가닥에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿은 상기 프로모터에 상보적인 서열; 목적서열에 상보적인 서열; 및 G-사중체 모티프(G-quadruplex motif) 서열은 안티센스 가닥에 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 원형 핵산 하이드로겔을 RNA 하이드로겔의 제조용도 또는 단백질 또는 펩타이드의 제조용도로 사용하는 경우, 안티센스 가닥을 주형으로 핵산을 합성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿은 프로모터에 상보적인 서열; 목적서열에 상보적인 서열; 및 G-사중체 모티프(G-quadruplex motif) 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 안티센스 가닥을 주형으로 원형회전증폭(Rolling Circle amplification; RCA) 및 원형회전전사(Rolling Circle Transcription; RCT)를 수행하여 수득되는 핵산(DNA 또는 RNA 등)은 G-사중체를 형성하여 하이드로겔화 될 수 있다.
핵산 하이드로겔은 단일가닥보다 견고한 물성을 가지므로 안정성을 현저히 높일 수 있으며, 이로부터 펩타이드 또는 단백질을 생산할 수 있는 플랫폼 기술로서 유용하게 이용될 수 있다
G-사중체 모티프 서열을 포함하는 핵산 하이드로겔의 제조용 템플릿 및 이를 이용한 단백질 합성시스템은 본 발명자들의 대한민국 특허출원 제2019-0136416호에 상세히 개시되어 있다.
본 발명의 용어 "연결"은 핵산 또는 특정기능을 가지는 핵산 가닥(프로모터, 목적서열, G-사중체화 모티프/서열 등)이 서로 작동 가능하게 연결된 것을 의미하며, 상기 "작동가능하게 연결된"은 서로 기능적 관계로 배치된 2종의 성분을 지칭한다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 G-사중체화 모티프와 관련하여, 사용되는 경우에, 목적서열과 연결된 G-사중체화 모티프 서열을 주형으로 증폭 또는 전사되는 경우, 목적서열에 상보적인 서열을 포함하는 핵산 가닥이 G-사중체화 구조를 형성할 수 있음을 의미한다. 각각의 연결된 서열은 각 성분의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 상기 연결은 제한 부위에서의 접합(ligation)에 의해 달성될 수 있다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에, 통상적인 실시에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 사용된다. 그러나, 각각의 요소는 작동가능하게 연결되기 위해 인접할 필요는 없다
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 제조방법으로 제조된 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 주형으로, 증폭(amplification) 또는 전사(transcription)하는 단계를 포함하는 핵산 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 하이드로겔은 RNA 또는 DNA인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 주형으로 증폭을 수행하는 경우 합성된 DNA에 포함된 G-사중체화 서열에 의한 자가 조립으로 하이드로겔화 되어 DNA 하이드로겔이 수득될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 안티센스 가닥을 주형으로 전사를 수행하는 경우 전사된 RNA에 포함된 G-사중체화 서열에 의한 자가 조립으로 하이드로겔화 되어 RNA 하이드로겔이 수득될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭(amplification)은 핵산 템플릿을 주형으로 하여 동일한 서열을 갖는 핵산을 합성하는 것을 의미한다. 본 발명의 증폭은 다양한 방법을 사용하여 제한없이 수행될 수 있다. 예를 들어, 원형 순환 증폭(Rolling Circle RCA), 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR), LCR(ligase chain reaction), SDA(strand displacement amplification) 및 TMA(transcription-mediated amplification) 을 통해 수행될 수 있으며, 본 발명에 있어서, 원형 핵산 템플릿을 주형으로 하므로, 원형 순환 증폭(RCA)을 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 증폭을 위해 통상의 기술자에 의해 적절한 핵산중합효소(Polymerase), 프라이머 등이 선택 또는 제작되어 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전사(transcription)는 DNA 발현 과정 중의 하나로서, 본 발명에 있어서, 상기 전사는 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿, 바람직하게는 이의 안티센스 가닥을 주형으로 하여, RNA를 합성하는 것을 의미한다. 본 발명의 전사는 다양한 방법을 사용하여 제한없이 수행될 수 있으나, 원형회전전사(Rolling Circle Transcription; RCT) 방법을 수행하는 것이 바람직하다.
RNA의 G-quadruplex 구조가 형성되는 RNA 용액 내 염 조건을, 핵산의 Gquadruplex 구조 형성에 따른 특정한 편평률 경향을 통해 확인하였다. 구체적으로, 0, 0.1, 1, 10 또는 100 mM의 KCl, NaCl 및 MgCl2 염농도 조건에서 상기 실시예의 RCT를 통한 RNA의 G-quadruplex 구조 형성을 원편광 이색성 (circular dichroism) 분석으로 확인하였다. 그 결과, 100 mM의 KCl 및 NaCl 조건에서, 반절의 (연속한 G를 암호화하는 연속적인 C (사이토신) 서열을 4 세트 전부가 아닌 2 세트만 포함함) G-quadruplex sequence를 가지는 합성 RNA가 G-quadruplex 구조를 이루어 다른 조건들과 구분되는 편평률 경향을 나타냈다. 또한, 뒤섞인 G-quadruplex sequence를 가지는 합성 RNA는 염 조건에 영향을 받지 않아 G-quadruplex sequence를 가지는 합성 RNA와 구분되는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 있어서, 생산된 핵산의 G-사중체의 형성을 촉진하여 하이드로겔화를 촉진하기 위해, 양이온, 예를 들어, 가장 바람직하게는 칼륨이온 또는 나트륨이온을 추가하는 단계를 더 포함하거나, 양이온, 예를 들어, 가장 바람직하게는 칼륨이온 또는 나트륨이온이 존재하는 조건에서 증폭 또는 전사를 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 템플릿에 포함된 목적서열이 서열 크기가 150bp 이상이거나, 생산된 핵산의 하이드로겔화를 저해하는 2차 구조를 형성하는 경우에는 핵산 하이드로겔의 생산력이 떨어진다. 특히 고분자량의 단백질을 암호화하는 목적서열은 그 서열크기가 매우 크기 때문에, 핵산의 하이드로겔화가 매우 어렵다.
따라서, 본 발명자들은 일 실시예에서, 30 내지 100bp 이하의 짧은 서열을 갖는 더블와이드 밴드 템플릿을 추가하는 경우에, 상기 핵산 템플릿의 목적서열의 길이가 150bp 이상이거나, 생산된 핵산의 하이드로겔화를 저해하는 2차 구조를 형성하는 경우에도, 핵산이 원활하게 하이드로겔화되는 것을 확인하였으며, 이를 특허출원 하였다(대한민국 특허출원 제10-2020-0077146호, 미공개). 또한 본 발명의 일 실시예에서도 본 발명의 핵산 하이드로겔 생산용 원형 템플릿과 상기 더블와이드 밴드 템플릿을 함께 증폭 또는 전사하는 경우에, 그 농도에 따라 기계적 물성 강도의 차이가 변화하는 것을 확인하고, 단백질 발현에 가장 적합한 더블와이드 밴드 템플릿의 농도를 최적화하였다.
따라서 본 발명에 있어서, 프로모터 서열에 상보적인 서열, 제2 목적서열, 및 G-사중체 모티프(G-quadruplex motif) 서열을 포함하는 제2 핵산 템플릿을 동시에 증폭(amplification) 또는 전사(transcription)하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며 여기서, 상기 제2 목적서열은 150bp 미만, 바람직하게는 30 내지 120bp, 더욱 바람직하게는 60 내지 90bp 길이의 짧은 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 목적서열은 그 길이가 더블와이드 밴드의 형성에 영향이 있으며, 서열(sequence)은 비교적 영향이 미미한 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서, 상기 제2 목적서열은 티민(thymine)이 반복되는 poly T 서열일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 제2 목적서열은 30개 내지 120개의 티민이 반복되는 poly T 서열을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "핵산의 하이드로겔화를 저해하는 2차 구조"란, 염기서열의 길이, GC 함량 등 다양한 특징에 의해 형성되는 핵산의 2차 구조를 의미하며, 예를 들어, 루프 구조, GC가 30% 내지 75% 함량으로 포함된 구조 등이 있으나 이에 제한되는 것이 아니다.
본 발명의 용어, "제2 목적서열"은 제2 핵산 템플릿 (더블와이드 밴드 템플릿)에 포함된 서열로, 핵산의 하이드로겔화를 더욱 향상시키는 삽입된 짧은 염기 서열을 의미한다. 본 명세서에서, 더블와이드 밴드 템플릿을 언급하는 경우, 상기 더블와이드 밴드 템플릿은 제2 핵산 템플릿으로, 본 발명의 핵산 하이드로겔 생산용 원형 핵산 템플릿은 더블와이드 밴드 템플릿과의 구별을 위해 제1 핵산 템플릿으로 언급된다.
본 발명의 용어, "제2 핵산 템플릿"은 본 발명에서 "더블와이드 밴드 템플릿"과 동일한 의미로 상호호환적으로 사용되며, '제1' 및 '제2'는 두 템플릿을 구분하기 위해 붙여진 번호이다. "더블와이드 밴드"는 제1 핵산 템플릿(이 사건 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿)과 더블와이드 밴드 템플릿을 주형으로 하여 생산된 각각의 핵산의 G-사중체 서열이 복합적으로 G-사중체를 형성하여 생성되는 구조를 의미한다. 상기 더블와이드 밴드는 G-사중체 간의 거리가 너무 멀어 하이드로겔의 형성이 저해되는 것을 방지하고 목적서열의 의도하지 않은 2차구조에 의한 G-사중체의 형성이 저해되는 것을 방지하여, 보다 효과적인 하이드로겔화를 유도할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 확인한 것과 같이, 더블와이드 밴드 템플릿을 함께 사용하여 핵산 하이드로겔을 제조하는 경우에, 그 농도에 따라 기계적 물성이 변화하는 것을 확인하였으며, 단순히 더블와이드 밴드 템플릿의 비율의 증가에 따라 핵산의 하이드로겔화가 증가하는 것이 아니라, 특정 비율을 갖는 경우에, 단백질 발현에 적절한 하이드로겔화를 나타내며, 단백질 발현효율에도 영향을 미치는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 핵산 템플릿(더블와이드 밴드 템플릿)은 본 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿(제1 핵산 템플릿) 대비 1:1 내지 600:1의 몰비로 혼합되어 증폭 또는 전사되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 75:1 내지 300:1의 몰비로, 더욱 바람직하게는 150:1 내지 300:1의 몰비로 혼합되어 증폭 또는 전사되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 제1 핵산 템플릿과 제2 핵산 템플릿은 혼합되어, 동시에 증폭 또는 전사되는 것이 바람직하나, 각각의 템플릿을 주형으로 증폭 또는 전사 결과물을 혼합하여 핵산 하이드로겔을 생산하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 증폭은 당업계에 공지된 핵산 증폭 키트 또는 방법을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 원형 순환 증폭(Rolling Circle RCA), 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR), LCR(ligase chain reaction), SDA(strand displacement amplification) 및 TMA(transcription-mediated amplification) 방법 등이 있으며, 등온 증폭 방법을 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 원형 순환 증폭(Rolling Circle RCA)을 통해 증폭하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 전사는 당업계에 공지된 DNA 전사 키트 또는 방법을 통해 수행될 수 있으며, 통상의 기술자에 의해 RNA 중합효소, dNTP, 시약 등의 변경이 용이하게 이루어질 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 하이드로겔(hydrogel)화 핵산의 제조방법으로 제조된 핵산 하이드로겔에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 하이드로겔은 목적서열; 및 G-사중체화 서열(G-quadruplex sequence) 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 하이드로겔에 포함된 목적서열이 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 유전자의 mRNA에 해당하는 경우, 이를 번역하여 단백질 또는 펩타이드를 합성할 수 있다.
현재까지 알려진 상업적 단백질 생산 방법은 살아있는 세포의 세포질을 파괴하는 방법이나 화학적으로 아미노산을 중합하는 방법이 주로 이용되어 왔다. 그러나 이들 방법은 세포 파쇄 과정 및 정제/분리 과정에 있어서 매우 복잡한 생산 과정을 거치며, 제작된 단백질이 정상적으로 발현이 되지 않거나, 체내에서 잘 받아들여지지 못하고 면역반응을 일으키며, 긴 사슬의 단백질 중합에서 아미노산 서열의 정확성이 떨어지는 등의 단점들을 가지고 있었다. 따라서 최근에는 펩타이드 또는 단백질 생산과정에서 세포를 이용하지 않는 무세포 단백질 합성시스템(cell-free 혹은 in vitro protein synthesis system)의 개발이 활발히 진행되고 있다.
무세포 단백질 합성 시스템은 세포 파쇄액(cell lysates)이나 추출액에 기질(substrate)이나 효소(enzyme)를 첨가하여 단백질 합성에 필요한 핵심 요소들(ATP(adenosine triphosphate), 아미노산 등)을 이용하여 시험관 내에서 단백질을 합성하는 방법이다. 이러한 무세포 단백질 합성 시스템은 기존의 세포를 이용한 단백질 생산 방법의 단점을 극복할 수 있고, 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis)은 세포에서 단백질 생산에 관련되는 세포 내 기구와 이의 인자들만을 추출하여 세포 외부에서 세포의 생리적 조절 기작이 배제된 상태로 단백질의 합성 과정만을 인위적으로 반복시켜 단기간에 목적 단백질을 대량 생산함으로써, 세포 배양공정을 거치지 않고 고속으로 단백질을 합성할 수 있을 뿐만 아니라 세포막과 세포벽의 공간 안에서 단백질 발현이 진행되는 세포 배양공정에 비해 물리적인 장벽이 존재하지 않는 완전히 열린 시스템으로서, 다양한 연구에 적용하기 위해서 단백질 합성의 조건을 자유롭게 변형시킬 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한, 세포 내 단백질 합성 시스템은 생산되는 단백질이 세포독성을 나타내는 경우, 그 생산 및 수율에 커다란 문제가 있으나, 무세포 단백질 합성 시스템을 사용하는 경우 이러한 문제에서 자유롭게 펩타이드 또는 단백질을 생산 할 수 있다. 또한 단백질이 합성될 때의 pH, 온도, 이온 세기 등 다양한 외부 조건에 대해서 자유로울 수 있기 때문에 생산성을 증가시킬 수 있을 것으로도 기대된다. 그러나 이러한 장점들을 가지고 있음에도 불구하고 실질적으로 이용되고 있지 않는 이유는, 짧은 반응시간과 낮은 단백질 생산 속도로 인해 소비되는 시약의 비용이 높기 때문이다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 요오도아세트아미드(iodoacetamide), 글루타티온(glutathione) 등과 같은 다양한 화학물질을 첨가하거나, 연속 유동 시스템을 개발하여 생산성을 높이기 위한 다양한 시도들이 진행되고 있지만 여전히 산업적으로 이용되기에는 부족한 실정이다.
본 발명의 일 실시예에서, 같이 본 발명의 핵산 템플릿을 주형으로 전사한 핵산 하이드로겔을 번역하여 단백질을 시험관내 단백질 발현(in vitro translation)을 수행하는 경우, 음성대조군 또는 선형 DNA에 비해 단백질 발현이 4~6배 이상 향상되는 것을 확인하였다. 특히, 인퓨전 클로닝 방법을 사용하여 제조한 핵산 템플릿을 사용하는 경우에 더욱 단백질 발현이 향상되는 것을 확인하였다. 본 발명의 방법으로 핵산 하이드로겔 시스템을 사용하여 펩타이드 또는 단백질을 제조하는 경우, 생산 수율을 극대화 할 수 있다는 장점이 있으며, 특히 펩타이드 또는 단백질을 합성하기 위한 무세포 합성 시스템에 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (i) 본 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 안티센스 가닥을 주형으로 원형 순환 전사를 수행하여 RNA를 합성하는 단계; 및
(ii) 상기 합성된 RNA를 번역(translation)하여, 펩타이드 또는 단백질을 합성하는 단계를 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 목적서열은 단백질을 코딩하는 유전자의 센스 서열, 바람직하게는 mRNA 서열인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서, "무세포 단백질 합성 시스템(cell-free 혹은 in vitro protein synthesis system)"은 생산 대상에 따라 '무세포 합성 시스템(cell-free 또는 in vitro synthesis system)','무세포 펩타이드 합성 시스템(cell-free 혹은 in vitro peptide synthesis system)' 또는 '무세포 단백질/펩타이드 합성 시스템'과 동일한 의미로 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (i) 단계와 (ii) 단계는 커플링되어 동시에 수행될 수 있으며, 각각 분리되어 별도로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 (i) 단계의 원형 순환 전사 및 (ii) 단계의 번역은 New England Biolabs 사의 HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit 및 NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System을 구매하여 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 다양한 효소 또는 상업적으로 구매가능한 키트를 사용하여 (i) 단계의 원형 순환 전사 및 (ii) 단계의 번역을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿에 더블와이드 밴드 템플릿을 추가하고, 함께 전사하여 생성된 RNA 하이드로겔을 사용한 단백질 발현이 적절한 농도에서 단백질 생성능의 추가적인 향상을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 핵산 하이드로겔의 제조방법 및 핵산 하이드로겔은 세포외에서도 그 구조적 안정성이 매우 뛰어날 뿐만 아니라, 무세포 단백질 또는 펩타이드 발현시스템을 통한 단백질의 생산능력도 매우 뛰어나, 기존의 무세포 단백질 합성 시스템이 갖는 여러가지 한계를 극복할 수 있으며, 따라서 차세대 단백질 발현 시스템으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (i)단계는 프로모터 서열에 상보적인 서열, 30bp 내지 120bp의 길이를 갖는 제2 목적서열, 및 G-사중체 모티프(G-quadruplex motif) 서열을 포함하는 원형의 제2 핵산 템플릿을 추가한 다음, 원형 순환 전사(transcription)를 수행하여 RNA를 합성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 핵산 템플릿(더블와이드 밴드 템플릿)은 제1 핵산 템플릿 대비 1:1 내지 600:1 의 몰비로 혼합되어 증폭 또는 전사되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 75:1 내지 300:1 의 몰비로, 더욱 바람직하게는 150:1 내지 300:1의 몰비로 추가되어 전사되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, "번역(translation)"은 특정 펩타이드 또는 단백질 서열을 암호화하는 RNA로부터, 리보솜을 통해 펩타이드 또는 단백질을 합성하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질의 번역을 통한 펩타이드 또는 단백질의 제조방법은 세포 내(in vivo) 또는 무세포(cell-free) 단백질/펩타이드 합성 시스템에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 템플릿을 주형으로 하여 생산되는 핵산은 하이드로겔화를 통해 세포 외에서도 안정성이 뛰어나기 때문에, 무세포(cell-free) 단백질/펩타이드 합성 시스템에 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 핵산 하이드로겔을 사용하여, 펩타이드 또는 단백질을 합성하는 단계를 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 하이드로겔은 RNA 하이드로겔이며, 이를 번역하여 펩타이드 또는 단백질을 합성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 표면적을 증가시키기 위해, 핵산 하이드로겔을 분쇄하여 번역하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질의 번역을 통한 펩타이드 또는 단백질의 제조방법은 세포 내(in vivo) 또는 무세포(cell-free) 단백질/펩타이드 합성 시스템에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 템플릿을 주형으로 하여 생산되는 핵산은 하이드로겔화를 통해 세포 외에서도 안정성이 뛰어나기 때문에, 무세포(cell-free) 단백질/펩타이드 합성 시스템에 바람직하게 사용될 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 고분자량 단백질 생산용 핵산 템플릿 제조용 벡터의 제조
녹색 형광 단백질(GFP, green fluorescent protein) 유전자 및 G-사중체화 서열을 포함하는 핵산가닥을 대장균 발현 벡터(e.coli expression vector)인 pK7-vector에 클로닝(cloning)하였다(도 1 (a)). 클로닝에 사용된 제한효소는 NdeI 및 SalI이다. 녹색 형광 단백질(GFP, green fluorescent protein) 유전자 및 G-사중체화 서열을 포함하는 핵산가닥은 IDT 사에서 합성하였다(서열 번호 3 및 4). 구체적으로 [표 1]의 pK7-GFP-NdeI-F, pK7-GFP-SalI-R 프라이머를 이용하여 GFP 유전자를 PCR 증폭하였다. PCR은 Genetbio 사의 HS Prime Taq DNA Polymerase 제품을 매뉴얼에 따라 조성물을 섞은 후 94℃에서 10분(1 사이클), 94 ℃에서 30초, 56 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분(30 사이클), 72℃에서 5분(1 사이클)로 수행하였다. pK7-vector와 녹색 형광 단백질 유전자를 각각 ThermoFisher 사의 제한효소(restriction enzyme) NdeI과 SalI을 처리하여 양말단을 절단(enzyme digestion)한 후 Promega 사의 T4 DNA ligase 제품을 매뉴얼에 따라 사용해 접합(ligation)하여 GFP 생산용 핵산 템플릿 제조용 벡터(pK7-GFP)를 제작하였다.
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실시예 2: 원형 핵산 템플릿의 제조(접합(ligation) 방법)
실시예 1에서 제조한 벡터를 주형으로 [표 1]의 pK-T7-F2, pK-T7-R2 프라이머를 이용하여 T7 promoter, 5' UTR, GFP 유전자 및 G-사중체화 서열까지 포함하도록 PCR로 증폭하여, 선형 핵산 가닥(T7-GFP-G4-BamHI, 서열 번호 9 및 10)을 제조하였다. PCR은 Genetbio 사의 HS Prime Taq DNA Polymerase 제품을 매뉴얼에 따라 조성물을 섞은 후 94℃에서 10분(1 사이클), 94 ℃에서 30초, 56 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분(30 사이클), 72℃에서 5분(1 사이클)로 수행하였다. 제조한 선형 핵산 가닥(T7-GFP-G4-BamHI)을 ThermoFisher 사의 BamHI을 사용해 37 °C에서 30분간 처리하여 양 말단을 절단한 후, Promega 사의 T4 DNA ligase 제품을 사용한 상온에서 3시간동안의 접합(ligation)을 통해 원형 핵산 템플릿으로 변환하였다(도 1b 및 도 2a).
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실시예 3: 핵산 템플릿 제조 시, DNA 정제과정의 필요 여부 확인
BamHI 처리 후, 접합(ligation)을 위해, DNA 정제과정의 유무에 따른 원형 핵산 템플릿의 생성을 확인하였다(도 2b). DNA의 정제는 BamHI처리 후, 잘려져 나간 단편을 제거하고, 원형 핵산 템플릿으로 변환을 위한 핵산 가닥만을 정제함을 의미한다. 원형 핵산 템플릿으로의 변환을 명확히 확인하고자 NEB 사의 T7 exonuclease를 상온에서 30분간 처리한 결과를 확인하였다. 결과적으로 DNA 정제과정을 미수행한 유전자에서만 원형 핵산 템플릿이 생성되는 것을 1% 아가로스겔(agarosegel) 전기영동으로 확인하였다(도 2c).
T7 exonuclease가 핵산 템플릿만을 특이적으로 분해하는지를 검증하기 위해 선형 핵산 가닥과 원형 핵산 템플릿을 대상으로 T7 exonuclease를 상온에서 각각 10분, 20분, 30분 처리하였다. 선형 핵산 가닥은 10분부터 모두 분해되었고(도 3d), 원형 DNA는 모든 처리군에서 대조군(T7 exonuclease 무처리)과 동일한 상태를 보였다(도 3e). 이는 T7 exonuclease가 선형 핵산 가닥만을 분해하는 것을 의미한다.
실시예 4: 제조된 핵산 템플릿을 사용한 원형 순환 전사
실시예 2에서 제조된 원형 핵산 템플릿과 선형 핵산 가닥의 전사체의 형태적 차이와 핵산 템플릿의 농도별 획득 RNA양의 상관관계를 확인하기 위해, New England Biolabs 사의 HiScribe쪠 T7 High Yield RNA Synthesis Kit 제품을 매뉴얼에 따라 사용하여 시험관내 전사(in vitro transcription)를 수행하였다. 선형 핵산 가닥을 주형으로 한 결과에서는 GFP 유전자의 단량체(monomer)크기의 전사체가 생성된 반면(도 4f, lane 1, 3, 5), 원형 핵산 템플릿을 주형으로 한 결과에서는 smeared band 형태의 원형 순환 전사(RCT)에 의한 대량의 전사체가 생산된 것을 확인하였다(도 4f, lane 2, 4, 6). 핵산 템플릿의 농도와 전사체 획득 수율은 비례를 나타내었으나, 정비례하지는 않았으며(도 4g), 100 ng~ 200ng에서 가장 효율적인 전사체(RNA) 획득 수율을 나타내었다.
실시예 5: 핵산 템플릿의 제조(인퓨전 클로닝 (Infusion cloning) 방법) 및 원형 순환 전사
실시예 1에서 제조한 벡터를 주형으로 표 3의 pK7-GFP-infusion-F3, pK7-GFP-infusion-R4 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하여 선형 핵산 가닥(G4-T7-GFP-G4)을 제조하였다(도 5a, 서열 번호 11 및 12). PCR은 Genetbio 사의 HS Primer Taq DNA Polymerase 제품을 매뉴얼에 따라 조성물을 섞은 후 94℃에서 10분(1 사이클), 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분(30 사이클), 72℃에서 5분(1 사이클)로 수행하였다. 생산된 선형 핵산 가닥(G4-T7-GFP-G4)을 Takara 사의 In-Fusion® HD Cloning kit를 사용해 50 °C에서 15분간 처리하여 원형 템플릿으로 변환하였다(도 1c 및 도 5b).
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원형 핵산 템플릿으로 변환여부를 확인하기 위해, NEB 사의 T7 exonuclease를 상온에서 30분간 처리한 결과, PCR 결과물인 선형 핵산 가닥은 모두 분해된 반면 인퓨전 클로닝을 수행한 핵산 템플릿은 분해되지 않아 원형 핵산 템플릿으로 변환되었음을 확인하였다(도 5c). New England Biolabs 사의 HiScribe쪠 T7 High Yield RNA Synthesis Kit를 이용하여 시험관내 전사 결과, donut을 주형으로 한 결과에서 smeared band 형태의 원형 순환 전사기술에 의한 RCT 전사체가 생산된 것을 확인하였다(도 5d).
실시예 6: 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 이용한 GFP 발현 효율 검증
상기 실시예 2 및 4에서 생산된 핵산 하이드로겔을 이용하여, 시험관내 단백질 발현(in vitro translation)을 수행하였다. 선형 핵산 가닥, 원형 핵산 템플릿(접합방법, donut 1), 및 원형 핵산 템플릿(인퓨전 클로닝 방법, donut 2)에서 전사된 RNA를 2.5μg 사용하여, New England Biolabs 사의 NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System을 이용하여 시험관내 단백질 발현을 수행하였으며, 추가로, 각 RNA가 첨가된 양에 맞춰 2% 아가로스겔을 추가하여 최종 농도 1%로 조정한 RNA gel을 추가하여 37도에서 16시간 동안 단백질 발현을 진행하였다. 발현된 녹색 형광 단백질의 형광을 측정한 결과, 대조군인 선형 핵산 가닥의 RFU (relative fluorescence units) 값이 5621.9인 반면 donut1 : 22,000, donut2 : 30000으로 약 4배~6배 높은 RFU 값을 나타내는 것을 확인하였다. 상대적으로 아가로스겔을 추가한 donut1+agarose : 16,000, donut2+agarose : 21,000로 아가로스겔을 미첨가한 조건보다 낮은 RFU 값을 나타내었다(도 6a). 각 조건별로 발현된 4 μg의 녹색 형광 단백질을 12% SDS-PAGE에서 확인한 결과, 26.86 kDa의 녹색 형광 단백질의 밴드가 관찰되었다(도 6b). 결과적으로 본 발명의 원형 핵산 템플릿은 정상적으로 GFP를 발현시켰으며, 선형 핵산 가닥보다 높은 발현 효율을 나타낸다는 것을 의미한다.
실시예 7: 더블와이드 밴드 템플릿을 이용한 RNA 하이드로겔(hydrogel) 형성 및 물성확인
T7 프로모터(T7 프로모터는 두 부분으로 분리되어 올리고뉴클레오타이드의 5'및 3'에 존재), 30 poly T, 60 poly T, 90 poly T, 120 poly T 및 G-사중체화 모티프를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드를 제조하고, 분리된 프로모터의 전체 서열에 상보적인 온전한 올리고뉴클레오타이드를 45 μM이 되도록 섞어주고 100 mM NaCl 조건에서 95°C에서 부터 4°C까지 어닐링(annealing)하여 T7 프로모터 서열이 닉(nick)이 있는 이중가닥을 형성하도록 하였다. 상기 어닐링 된 T7 프로모터의 닉을 10 μM 농도에서 promega 사의 T4 DNA ligase 제품을 매뉴얼에 따라 사용하여 접합(ligation)하여, nick을 제거하여 T7 프로모터-각각의 Poly T 서열-G-사중체화 모티프를 포함하는 원형의 더블와이드 밴드 템플릿(서열 번호 15 내지 18)을 제조하였다.
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접합 방법으로 획득한 실시예 2의 원형 핵산 템플릿과 함께, 더블와이드 밴드 템플릿(G4-30T, -60T, -90T, -120T)을 다양한 농도로 첨가하여, 시험관내 전사를 수행하였다. 단백질 발현을 기준으로 음성대조군으로는 1 μM의 더블와이드 밴드 템플릿(G4-30T, -60T, -90T, -120T), 양성대조군으로는 20 ng의 GFP 발현용 원형 핵산 템플릿을 설정하였다. 실험군으로는 20 ng의 GFP 발현용 원형 핵산 템플릿에 0.125 μM 내지 1 μM의 더블와이드 밴드 템플릿을 첨가하여 전사를 수행하였다. 그 결과 더블와이드 밴드 템플릿의 농도에 따라 RNA 하이드로겔의 형성 여부 및 기계적 물성이 변화하는 것을 평가하였다. 음성대조군의 기계적 물성을 최고(+++++)로 두었을 때, 더블와이드 밴드 템플릿의 크기와 농도에 따라 적절한 강도를 나타내는 것을 확인하였다(표 5).
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실시예 8: 더블와이드 밴드 템플릿을 이용한 경우의 GFP 발현효율 검증
실시예 7에서 제조한 28개의 RNA 하이드로겔을 이용한 시험관내 단백질 발현(in vitro translation)을 수행하여 녹색 형광 단백질을 발현하였다. 음성대조군, 양성대조군 그리고 GFP angel까지 총 28개의 실험군을 New England Biolabs 사의 NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System을 이용하여 37도에서 4시간 동안 단백질 발현을 진행하고, 발현된 녹색 형광 단백질의 RFU 값을 측정하였다(표 6).
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그 결과, 음성대조군(168.46), 양성대조군(4312.26) 보다 더블와이드 밴드 템플릿을 높은 농도로 추가한 경우에 RFU값이 상승하는 경향을 나타냈었다. 특히 GFP angel #14(60T-1 μM)는 9491.85, GFP angel #20(90T-0.75 μM)은 9388.27, GFP angel #21(90T- 1 μM)은 9658.04, GFP angel #27(120T-0.75 μM)은 8943.02로 양성대조군 대비 각각 120%, 118%, 124%, 107% 높은 RFU 값을 나타내어 더블와이드 밴드로 인한 단백질 발현 상승 효과를 관찰하였다(도 7).
본 발명의 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 제조방법은 기존의 본 발명자들의 G-사중체 기반의 핵산 합성기술에서, 6 kDa 이상의 고분자량을 가지는 단백질의 제조에 있어서, 기존의 핵산 템플릿의 대량제조가 어렵다는 한계를 극복하여, 저비용으로도 6kDa 이상의 단백질을 암호화하는 유전자를 목적서열로 포함하는 핵산 템플릿을 대량 제조할 수 있다. 나아가, 본 발명의 방법으로 제조된 핵산 템플릿 및 핵산 하이드로겔 시스템을 사용하여 펩타이드 또는 단백질을 제조하는 경우, 생산 수율을 극대화 할 수 있다는 장점이 있으며, 특히 펩타이드 또는 단백질을 합성하기 위한 무세포 합성 시스템에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 기능성 펩타이드 또는 단백질의 합성, 기능성 핵산 등을 기반으로 하는 생명과학, 의료, 식품 등 다양한 분야의 기술에도 유용하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (18)

  1. (a) 프로모터 서열; 목적서열; 및 G-사중체화 서열(G-quadruplex seqeuence) 서열을 함유하는 벡터에서, 프로모터 서열; 목적서열; 및 G-사중체화 서열(G-quadruplex seqeuence)을 포함하는 핵산 서열을 증폭하여 상기 프로모터 서열, 목적서열 및 G-사중체화 서열(G-quadruplex seqeuence)을 센스가닥에 포함하는 선형 핵산 가닥을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 수득된 선형 핵산 가닥을 원형으로 변환하여, 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 수득하는 단계를 포함하는 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 증폭은 다음 특성을 가지는 프라이머 쌍을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법:
    i) 상기 프라이머 쌍의 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 각각의 5' 말단에 동일한 제한효소 절단부위를 포함하거나;
    ii) 상기 프라이머 쌍의 리버스 프라이머의 5’ 말단은 포워드 프라이머의 5'말단에 서로 상보적인 핵산서열이 역순으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 증폭된 핵산 가닥을 접합(ligation) 또는 인퓨전 클로닝(Infusion cloning)을 통해 원형 핵산 템플릿으로 변환하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿은 DNA 또는 RNA 템플릿인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 벡터는 pK7, pIVEX, pET, pTXB, pUC, pF3K 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 T7 프로모터, T5 프로모터, T3 프로모터, lac 프로모터, tac과 trc 프로모터, cspA 프로모터, lacUV5 프로모터, Ltet0-1 프로모터, phoA 프로모터, araBAD 프로모터, trp 프로모터, tetA 프로모터, Ptac 프로모터 및 SP6 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 상기 G-사중체화 서열은 3개 이상의 연속적인 구아닌 및 1 내지 7개의 임의의 서열이 1번 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 G-사중체화 서열은 서열 번호 1(TAGGGTTAGGGT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고,
    프로모터 서열; 목적서열; 및 G-사중체화 서열(G-quadruplex seqeuence)을 센스가닥에,
    프로모터 서열에 상보적인 서열; 목적서열에 상보적인 서열; 및 G-사중체 모티프(G-quadruplex motif) 서열을 안티센스 가닥에 포함하는 것을 특징으로 하는 이중가닥 원형 핵산 템플릿.
  10. (i) 제9항의 이중가닥 원형 핵산 템플릿의 안티센스 가닥을 주형으로 원형 순환 전사를 수행하여 RNA를 합성하는 단계; 및
    (ii) 합성된 RNA를 번역하여 번역(translation)하여, 펩타이드 또는 단백질을 합성하는 단계를 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (ii) 단계는 무세포 단백질 합성 시스템(cell free protein synthesis system)을 통해 펩타이드 또는 단백질을 합성하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
  12. 제9항의 이중가닥 원형 핵산 템플릿을 증폭(amplification) 또는 전사(transcription)하는 단계를 포함하는 핵산 하이드로겔의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 프로모터 서열에 상보적인 서열, 30bp 내지 120bp의 길이를 갖는 제2 목적서열, 및 G-사중체 모티프(G-quadruplex motif) 서열을 포함하는 원형의 제2 핵산 템플릿을 추가한 다음, 증폭(amplification) 또는 전사(transcription)하는 단계를 포함하는 핵산 하이드로겔의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제2 템플릿은 상기 이중가닥 원형 핵산 템플릿(제1 템플릿) 대비 150:1 내지 300:1의 몰비로 추가되는 것을 특징으로 하는 핵산 하이드로겔의 제조방법.
  15. 제12항의 방법으로 제조되고, 목적서열; 및 G-사중체화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 하이드로겔.
  16. 제15의 핵산 하이드로겔 중 핵산이 RNA인 RNA 하이드로겔을 번역(translation)하여, 펩타이드 또는 단백질을 합성하는 단계를 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 번역은 상기 RNA 하이드로겔을 분쇄한 뒤 수행되는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
  18. 제16항에 있어서, 무세포 단백질 합성 시스템(cell free protein synthesis system)을 통해 펩타이드 또는 단백질을 합성하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 단백질의 제조방법.
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