WO2022071829A1 - Method for stimulating autophagy - Google Patents
Method for stimulating autophagy Download PDFInfo
- Publication number
- WO2022071829A1 WO2022071829A1 PCT/RU2021/000526 RU2021000526W WO2022071829A1 WO 2022071829 A1 WO2022071829 A1 WO 2022071829A1 RU 2021000526 W RU2021000526 W RU 2021000526W WO 2022071829 A1 WO2022071829 A1 WO 2022071829A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- cells
- inducer
- abisil
- autophagy
- terpenoid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims abstract description 63
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 claims abstract description 45
- 230000021125 mitochondrion degradation Effects 0.000 claims abstract description 40
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 28
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 241000218641 Pinaceae Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 92
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 11
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 4
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 125000002298 terpene group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 241000218645 Cedrus Species 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 13
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 12
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 12
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 12
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 12
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 12
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 12
- 239000010478 argan oil Substances 0.000 description 12
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 12
- 235000004426 flaxseed Nutrition 0.000 description 12
- 239000000944 linseed oil Substances 0.000 description 12
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 12
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 12
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 12
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 11
- MJYQFWSXKFLTAY-OVEQLNGDSA-N (2r,3r)-2,3-bis[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methyl]butane-1,4-diol;(2r,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O.C1=C(O)C(OC)=CC(C[C@@H](CO)[C@H](CO)CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 MJYQFWSXKFLTAY-OVEQLNGDSA-N 0.000 description 10
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 10
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 10
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 241000218642 Abies Species 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000218657 Picea Species 0.000 description 9
- 235000005205 Pinus Nutrition 0.000 description 9
- 241000218602 Pinus <genus> Species 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 6
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 6
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 6
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 6
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 6
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 6
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 6
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 6
- 240000008669 Hedera helix Species 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 235000010082 Averrhoa carambola Nutrition 0.000 description 3
- 240000006063 Averrhoa carambola Species 0.000 description 3
- BMZRVOVNUMQTIN-UHFFFAOYSA-N Carbonyl Cyanide para-Trifluoromethoxyphenylhydrazone Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(NN=C(C#N)C#N)C=C1 BMZRVOVNUMQTIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PFYWPQMAWCYNGW-UHFFFAOYSA-M [6-(dimethylamino)-9-(2-methoxycarbonylphenyl)xanthen-3-ylidene]-dimethylazanium;perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C21 PFYWPQMAWCYNGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M mitoTracker Red Chemical compound [Cl-].C1=CC(CCl)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- -1 triterpene acids Chemical class 0.000 description 3
- XBZYWSMVVKYHQN-MYPRUECHSA-N (4as,6as,6br,8ar,9r,10s,12ar,12br,14bs)-10-hydroxy-2,2,6a,6b,9,12a-hexamethyl-9-[(sulfooxy)methyl]-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-icosahydropicene-4a-carboxylic acid Chemical compound C1C[C@H](O)[C@@](C)(COS(O)(=O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CCC(C)(C)C[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C XBZYWSMVVKYHQN-MYPRUECHSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013291 Alisma plantago aquatica Nutrition 0.000 description 2
- 240000004615 Alisma plantago-aquatica Species 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000827338 Homo sapiens Mitochondrial fission 1 protein Proteins 0.000 description 2
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 2
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 2
- 235000017822 Melilotus officinalis Nutrition 0.000 description 2
- 240000000366 Melilotus officinalis Species 0.000 description 2
- 102100023845 Mitochondrial fission 1 protein Human genes 0.000 description 2
- 244000302512 Momordica charantia Species 0.000 description 2
- 235000009811 Momordica charantia Nutrition 0.000 description 2
- 244000248557 Ophiopogon japonicus Species 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000001978 Withania somnifera Nutrition 0.000 description 2
- 240000004482 Withania somnifera Species 0.000 description 2
- 241000192248 [Candida] saitoana Species 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229940125384 geroprotector Drugs 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930003658 monoterpene Natural products 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- SASUFNRGCZMRFD-JCUIILOWSA-N withanolide D Chemical compound C1C(C)=C(C)C(=O)O[C@H]1[C@](C)(O)[C@@H]1[C@@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)C(=O)C=C[C@H](O)[C@@]54O[C@@H]5C[C@H]3[C@@H]2CC1 SASUFNRGCZMRFD-JCUIILOWSA-N 0.000 description 2
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 2
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNKZMNRKLCTJAY-UHFFFAOYSA-N 4'-Methylacetophenone Chemical compound CC(=O)C1=CC=C(C)C=C1 GNKZMNRKLCTJAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052813 Aerophagia Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 235000011446 Amygdalus persica Nutrition 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- KGEKLUUHTZCSIP-HOSYDEDBSA-N Bornyl acetate Natural products C1C[C@]2(C)[C@H](OC(=O)C)C[C@H]1C2(C)C KGEKLUUHTZCSIP-HOSYDEDBSA-N 0.000 description 1
- 244000197813 Camelina sativa Species 0.000 description 1
- 235000014595 Camelina sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 235000013912 Ceratonia siliqua Nutrition 0.000 description 1
- 240000008886 Ceratonia siliqua Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 235000007542 Cichorium intybus Nutrition 0.000 description 1
- 244000298479 Cichorium intybus Species 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 235000017367 Guainella Nutrition 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 206010020710 Hyperphagia Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 235000010666 Lens esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000213996 Melilotus Species 0.000 description 1
- 235000000839 Melilotus officinalis subsp suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 235000009815 Momordica Nutrition 0.000 description 1
- 241000218984 Momordica Species 0.000 description 1
- 235000016698 Nigella sativa Nutrition 0.000 description 1
- 244000090896 Nigella sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 description 1
- 240000008114 Panicum miliaceum Species 0.000 description 1
- 235000007199 Panicum miliaceum Nutrition 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 240000005809 Prunus persica Species 0.000 description 1
- 235000000539 Rosa canina Nutrition 0.000 description 1
- 240000008530 Rosa canina Species 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 235000004424 Tropaeolum majus Nutrition 0.000 description 1
- 240000001260 Tropaeolum majus Species 0.000 description 1
- 240000001519 Verbena officinalis Species 0.000 description 1
- 235000018718 Verbena officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940115397 bornyl acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 150000004141 diterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000001711 nigella sativa Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 235000020830 overeating Nutrition 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 229940080817 rotenone Drugs 0.000 description 1
- JUVIOZPCNVVQFO-UHFFFAOYSA-N rotenone Natural products O1C2=C3CC(C(C)=C)OC3=CC=C2C(=O)C2C1COC1=C2C=C(OC)C(OC)=C1 JUVIOZPCNVVQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001076 sarcopenia Diseases 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000276 sedentary effect Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 239000011885 synergistic combination Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930186301 urolithin Natural products 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/13—Coniferophyta (gymnosperms)
- A61K36/15—Pinaceae (Pine family), e.g. pine or cedar
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
Definitions
- the present invention relates to the field of medicine, namely, to methods for stimulating mitophagy and autophagy in a cell, involving the treatment of cells with a terpenoid-based inducer extracted from plants of the coniferous (Pinaceae) family, such as fir, pine or cedar, to methods for stimulating autophagy or mitophagy for treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction.
- a terpenoid-based inducer to stimulate mitophagy and autophagy in a cell
- a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy or mitophagy to treat a condition associated with mitochondrial dysfunction.
- geroprotectors Compounds that can slow down aging, so-called geroprotectors, usually slow down the onset of aging and related diseases and reduce the risk of mortality.
- geroprotectors that activate the process of mitophagy in cells either chemical compounds of a certain composition, obtained chemically, or multicomponent mixtures, usually of an indefinite composition and extracted from plant materials or waste products of yeasts and microorganisms, are usually used as an active ingredient (inducer).
- a method for the prevention or treatment of a neurodegenerative disorder in a subject which involves the introduction into his body in a therapeutically effective amount of an inducer agent that increases Nix-mediated mitophagy in the cell, or rather, increases the biological activity or expression of the Nix polypeptide, its fragment, variant or an analogue and/or polypeptide of GABARAP-L1, its fragment, variant or analogue in a cell and containing the indicated components (US 2019/091291 A1).
- a method for activating mitophagy in skin cells which consists in exposing skin cells to a cosmetic composition containing an active substance (inductor) extracted from at least one plant selected from Helianthus annuus, Ceratonia siliqua, Nigella sativa, Withania somnifera, Secale Comutum, Sesamum indicum, Ophiopogon japonicus, Alisma plantago-aquatica, Oryza sativa, Tropaeolum majus, Cichorium intybus, Prunus persica, Verbena officinalis, Panicum miliaceum, Rosa canina, Camelina sativa and Phaseolus vulgaris, or from specific algae or yeasts specific species, as well as adjuvants and excipients (WO 2013/178965).
- an active substance extracted from at least one plant selected from Helianthus annuus, Ceratonia siliqua, Nigella sativa, Withania somnifera, Secale Comutum
- the known method is based on the use of an active substance extracted from plants, some of which grow in tropical countries or are cultivated in small quantities as an imported plant. Since the composition and properties of the active substances contained in plants depend on the conditions of their growth, the therapeutic effect of the substances isolated from them is unstable. Many of these plants contain not one, but a whole set of biologically active substances of multidirectional action, and some of them, for example, substances contained in Secale Comutum, Alisma plantago-aquatica, have a strong toxic effect, cause addiction (Withania somnifera) or are simply not used in official medicine in Russia (Ophiopogon japonicus). For these reasons, the known method is industrially inapplicable without additional time-consuming research.
- Stimulation of autophagy which includes mitophagy as a special case, also promotes cell health and has a positive therapeutic effect on the subject, although, unlike mitophagy, not all mechanisms of the healing action of autophagy have been fully elucidated.
- methods for stimulating autophagy and pharmaceutical preparations for this purpose There are a number of methods for stimulating autophagy and pharmaceutical preparations for this purpose.
- substances of chemical origin of a simple composition compared to substances of plant origin are used (WO 2019/204183, JP 2019218316, KR 20190114900, US 2019/160033, US 2019/336483).
- WO 2019/099531 proposes the use of a synergistic combination of compounds from at least two and preferably three classes of compounds in an autophagy-stimulating inducer. Due to this, some increase in the efficiency of the method is achieved, but not the expansion of the scope of its effective application.
- WO 2019/204183 proposes seven options for a method of treating or promoting hair growth by administering to a subject one or more autophagy-inducing agents of chemical origin. Each of the variants of this method uses its own specific combination of agents. The very abundance of the proposed options suggests that none of them is uniquely and in all cases effective.
- autophagy-inducing substances of chemical origin used according to the above-mentioned prior art are xenobiotics for cells and organisms, additionally load their metabolizing and eliminating systems, and can cause side reactions.
- a method for activating autophagy of skin cells in order to detoxify or prevent aging which consists in applying to the skin a cosmetic composition containing, as an active ingredient (inducer), a biological substance extracted from algae, yeast or plants selected from the group Lithothamnium calcareum, Yarrowia lipolytica, Melilotus officinalis, Citrus limonum, Candida saitoana, Lens culinaris, Averrhoa carambola, Momordica charantia, as well as adjuvants and excipients.
- an active ingredient in order to detoxify or prevent aging
- a cosmetic composition containing, as an active ingredient (inducer), a biological substance extracted from algae, yeast or plants selected from the group Lithothamnium calcareum, Yarrowia lipolytica, Melilotus officinalis, Citrus limonum, Candida saitoana, Lens culinaris, Averrhoa carambola, Momordica charanti
- coumarin contained in the herb of sweet clover (Melilotus officinalis), has a depressant effect on the central nervous system and has a narcotic effect.
- the bioactive ingredient which is derived from Candida saitoana yeast, is so toxic that it is used as a pesticide.
- the present invention was based on the task of proposing methods for stimulating autophagy and mitophagy of cells by exposing cells to an inducer, the active principle of which is selected from a wide range of inexpensive, accessible and non-toxic terpenoids obtained from plants from the Pinaceae family common in the Russian wild nature: the genus Spruce (Picla ), the genus pine (Pinus), the genus cedar (Cedrus) and the genus fir (Abies).
- an inducer the active principle of which is selected from a wide range of inexpensive, accessible and non-toxic terpenoids obtained from plants from the Pinaceae family common in the Russian wild nature: the genus Spruce (Picla ), the genus pine (Pinus), the genus cedar (Cedrus) and the genus fir (Abies).
- Another object of the present invention was to develop methods for stimulating autophagy or mitophagy for the treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject using said inducer.
- Another object of the present invention was to provide a terpenoid-based inducer suitable for use in stimulating mitophagy and autophagy in a cell and suitable for use in stimulating autophagy or mitophagy to treat a condition associated with mitochondrial dysfunction.
- the technical result of using the solution proposed in the invention is to increase the stability and effectiveness of the effect on cells and to reduce the toxicity of herbal preparations that stimulate the process of eliminating dysfunctional cell components by autophagy and mitophagy, leading to relief and treatment of conditions associated with mitochondrial dysfunction.
- an inductor extracted from plants of the Pinaceae family is used as such an inductor based on terpenoids, for example: spruce (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), and having the following physical constants: acid value from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ether value from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
- the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 ⁇ g/ml, preferably 45 to 200 ⁇ g/ml.
- the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
- the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
- Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art.
- the cells when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells.
- the inducer In carrying out the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or tissues, it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy.
- Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
- the preparation "Abisil”, “Abisil-1” or “Abisil-2” can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted supplement that is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
- preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example a 3-15% by weight oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
- oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
- the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 ⁇ g/ml, preferably 45 to 200 ⁇ g/ml.
- the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
- the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
- Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art.
- the cells when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells.
- the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or canals it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy.
- the introduction of the inducer can be carried out in various ways, for example, by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary administration, administration by inhalation or by intrabronchial, oral or rectal administration.
- Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
- a targeted additive which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
- preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of a saline solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
- oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
- a terpenoid-based inducer extracted from plants is used as such an inducer.
- a terpenoid-based inducer extracted from plants is used as such an inducer.
- the family Pinaceae for example: the genus spruce (Picla), the genus pine (Pinus), the genus cedar (Cedrus) and the genus fir (Abies), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, essential number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
- the subject is a person.
- a condition associated with mitochondrial dysfunction is selected from a condition including mutations and/or epigenetic abnormalities of the mitochondrial or nuclear genome leading to disruption of mitophagy, defects in mitochondrial morphology, and disturbances in mitochondrial membrane potential, and a condition including lysosomal storage diseases.
- the terpenoid inducer is administered to the subject at a dose of 4 to 40 mg/kg body weight, preferably 4 to 24 mg/kg body weight.
- the introduction of the inducer can be carried out in various ways, for example, by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary administration, administration by inhalation or by intrabronchial, oral or rectal administration.
- Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, linseed, soybean, coconut or argan oil. and vitamin E.
- preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
- oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
- This technical result is further achieved through the use of an inductor based on terpenoids to stimulate mitophagy in cells.
- This application involves the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, which inductor is used in an effective concentration of an inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies ), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
- the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 ⁇ g/ml, preferably 45 to 200 ⁇ g/ml.
- the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
- the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
- Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art.
- the cells when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells.
- the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or tissues it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy.
- the inducer can be administered in a variety of ways, for example by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhalation, or intrabronchial, oral or rectal administration.
- Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
- a targeted additive which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
- preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
- oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
- a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy in cells.
- This application involves the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, which inductor is used in an effective concentration of an inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies ), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
- the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 ⁇ g/ml, preferably 45 to 200 ⁇ g/ml.
- the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
- the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
- Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art.
- it is possible to culture the cells in the presence of the inducer in the culture medium, or by adding the inducer to the cells.
- it can, for example, be introduced into the body of the subject in ways known to the person skilled in the art, especially any of the ways that are commonly used in the field of gene therapy.
- Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
- Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
- a targeted additive which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
- preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
- oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
- a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy or mitophagy for the treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject.
- Said use includes the step of administering the inductor at an effective dose to the subject.
- a terpenoid-based inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
- the subject is a person.
- a condition associated with mitochondrial dysfunction is selected from a condition including mutations and/or epigenetic abnormalities of the mitochondrial or nuclear genome leading to disruption of mitophagy, defects in mitochondrial morphology, and disturbances in mitochondrial membrane potential, and a condition including lysosomal storage diseases.
- the terpenoid inducer is administered to the subject at a dose of 4 to 40 mg/kg body weight, preferably 4 to 24 mg/kg body weight.
- Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
- Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, linseed, soybean, coconut or argan oil. and vitamin E.
- preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
- oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
- an active substance based on terpenoids extracted from plants of the Pinaceae family for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), stability of the process and result of activation of autophagy and mitophagy in cells with the complete exclusion of the possibility of toxic effects on the cell, which is explained by the stability of the composition and characteristics and the absence of toxicity of the original plant material extracted from these plants.
- terpenoid-based inducer and, in particular, the preparation "Abisil”, “Abisil-1” or “Abisil-2” as such or with a target additive allows to achieve a significant activation of autophagy and mitophagy in cells without the need to use terpenoid-based inducers with others parameters that are obtained using a different technology and the effectiveness of which has yet to be tested and proved.
- the drug "Abisil-2” and the method of its production are described in patent RU 2338547.
- the drug “Abisil-2” is obtained on the basis of a capsular extract of plants of the Pinaceae family subjected to short-term stress, and contains the following components: sequiterpenoids 3-6 wt.%, neutral diterpenoids 11-15 wt.%, diterpenic acids 23-24 wt.%, triterpene acids 8-16 wt.%, unsaturated and saturated fatty acids 0.1-0.3 wt.%, phenolic compounds 0, 1-0, 2 wt.%, monoterpenoids the rest, while the content of bornylacetate monoterpenoid should be at least 10.0 wt.% of the total composition of terpenoids.
- the terpenoid composition is a thick liquid with a color from yellow transparent to milky white with a specific odor and has the following physical constants: acid number 70-90, saponification number 100-130, ester number 10-60, refractive index 1.500-1.520.
- FIG. 1 evaluation of the metabolic activity of cells treated with “Abisil” in various concentrations
- FIG. 2 is an assessment of the decrease in mitochondrial potential induced by “Abisil” in immortalized MRC5 cells and Lech-4 lung fibroblasts
- FIG. 3 evaluation of the effect of pre-treatment "Abisil” on the accumulation of the light chain 3 conjugate and phosphatidylethanolamine (LC3II) in transformed SV-40 embryonic lung fibroblasts (MRC5-V40) according to the results of densitometric analysis relative to internal control
- Fig. 1 evaluation of the metabolic activity of cells treated with “Abisil” in various concentrations
- FIG. 3 evaluation of the effect of pre-treatment "Abisil” on the accumulation of the light chain 3 conjugate and phosphatidylethanolamine (LC3II) in transformed SV-40 embryonic lung fibroblasts (MRC5-V40) according to the results of densitometric analysis relative to internal control
- A B - control sample (DMSO, 0.5%), C - 24-hour treatment at a concentration of 25 ⁇ g/ml, D - 24-hour treatment at a concentration of 50 ⁇ g/ml, E - 72-hour treatment at a concentration of 25 ⁇ g/ml, F - 72-hour treatment at a concentration of 50 ⁇ g/ml.
- MRC5-SV40 and Lech-4 cells were seeded in 12-well plates at 40,000 cells per well. The next day, Abisil was treated in a wide range of concentrations (25-200 ⁇ g/ml). After 16 h, the cells were stained with JuonM and 200 nM tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM, Thermofisher Scientific) for 30 min at 37°C. As a positive control, 1 kM rotenone and JuMKM oxidative phosphorylation uncoupler carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) (Sigma-Aldrich) were used.
- TMRM nM tetramethylrhodamine methyl ester
- DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
- Cells were treated with Abisil at concentrations of 50 ⁇ g/ml and 25 kg/ml for 24 or 72 hours.
- Axiovert 200 microscopes (Carl Zeiss) and a Leica confocal microscope (Leica Microsystems) were used for imaging.
- MRC5-SV40 cells were seeded in a 96-well plate at 5,000 cells per well, cultured in 100 ⁇ l of DMEM (Dulbecco's modified nutrient medium) with 5% FBS (fetal bovine serum) at 37°C and incubated for 48 h. Next, during the day was treated with the drug "Abisil” (at a concentration of 0, 9, 11, 15, 25, 50, 93, 125, 147 and 186 ⁇ g/ml) at 37°C. The level of cell metabolism was assessed using the MTS test (CellTiter 96® kit for non-radioactive cell proliferation assay (MTT), Promega) according to the manufacturer's protocol.
- MTS test CellTiter 96® kit for non-radioactive cell proliferation assay (MTT), Promega
- the optical density of the colored substance proportional to the level of metabolism of viable cells, was measured at 590 nm using a tablet reader (Tesal). Then, the IC50 values were calculated by regression analysis, as well as the concentrations at which the most intensive cellular metabolism was observed.
- Lech-4 cells were cultured on Petri dishes with a diameter of 35 mm and at a confluence of 50% treated with the drug "Abisil” in 5% DMEM with 5% FBS at 37°C overnight. After incubation, cells were washed with cold PBS (phosphate buffered saline) and lysed in 200 ⁇ l of reporter lysis buffer (Promega) containing a protease inhibitor cocktail (No. P8349, Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. The lysates were centrifuged for 15 min at 12000g and the total protein content in the protein supernatant was measured according to Bradford.
- reporter lysis buffer Promega
- protease inhibitor cocktail No. P8349, Sigma-Aldrich
- Proteins were separated by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of 12% sodium dodecyl sulfate (SDS) according to Laemmli and electrotransferred to an Amersham Hybond P PVDF membrane, 0.45 ⁇ m (Amersham Biosciences, GE Healthcare) in Tovbin transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% (v/v) ethanol, pH 8.3). The membranes were blocked in 4% skimmed milk in PBS (PBS with 0.05% Tween 20) for 1 hour at room temperature. Incubation with primary antibodies was performed overnight at 4° C.
- SDS sodium dodecyl sulfate
- the cells were treated with the Abisil preparation in the form of resin from OOO Initium-Pharm.
- Abisil was dissolved in DMSO.
- Example 1 Influence of "Abisil” on the metabolic activity of cells.
- the effect of 48-hour treatment with “Abisil” on the metabolic activity of cells was studied using the MTT test on lines of embryonic pulmonary fibroblasts (MRC5-SV40 and Lech-4).
- "Abisil” showed a significant dose-dependence (see Fig. 1).
- the calculated IC50 values were 149.3 ⁇ 0.67 for MRC5-SV40 and 152.6 ⁇ 0.52 ⁇ g/ml for Lech-4, respectively (Table 1).
- both cell lines showed a significant increase in metabolic activity (p ⁇ 0.001) when treated with drugs at low concentrations (9-15 ⁇ g/ml).
- Immortalized MRC5 cells and Lech-4 lung fibroblasts (MRC5-SV40 (A)) were incubated at a ratio of 1:4000 with Abisil-1 overnight, stained with TMRM, and dye fluorescence was measured in the PE channel.
- the black histogram in Figure 2 represents Abisil-1 treated cells; the gray histogram represents control cells in Figure 2.
- the assessment of autophagy was performed by assessing the number of LC3II complexes in MRC5-SV40 cells, determined by Western blotting.
- FIG. 3 shows the results of the densitometric analysis of the LC3II complexes relative to the internal control, which are presented as the mean ⁇ standard deviation calculated from three independent experiments.
- a decrease in the mitochondrial potential of "Abisilom” may mean that it induces mitophagy.
- a construct was introduced encoding the GFP-mCherry-FIS 1 reporter construct in MRC5-SV40 cells, which allows detection of possible mitochondrial fragmentation and mitophagy activation.
- FIS1 is a protein anchored to the outer mitochondrial membrane and therefore colocalized GFP and mCherry will give a yellow signal. Fluorescence GFP is quenched in lysosomes due to the low pH and therefore split mitochondria can be detected in phagolysomes by red fluorescence (see FIG. 4).
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Botany (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
The invention relates to medicine, more particularly to methods for stimulating mitophagy and autophagy in cells, which comprise treating cells with an inducer, and to methods for stimulating autophagy or mitophagy for treating a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject, the methods comprising a step of administering the inducer in an effective dose into the organism of the subject. The inducer used is a terpenoid-based inducer, which is isolated from plants of the family Pinaceae and has the following physical characteristics: an acid number of 70 to 90, a saponification number of 100 to 130, an ester number of 10 to 60, and a refractive index of 1.50 to 1.52. The invention makes it possible to increase the stability and effectiveness of the action on cells and to reduce the toxicity of the plant-based preparations, and to stimulate the process of elimination of dysfunctional parts of the cells by autophagy and mitophagy and results in arresting and treating conditions associated with mitochondrial dysfunction.
Description
СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ АУТОФАГИИ METHOD FOR STIMULATION OF AUTOPHAGY
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно, к способам стимуляции митофагии и аутофагии в клетке, предусматривающим обработку клеток индуктором на базе терпеноидов, извлеченным из растений семейства хвойных (Pinaceae), например пихты, сосны или кедра, к способам стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению индуктора на основе терпеноидов для стимуляции митофагии и аутофагии в клетке и к применению индуктора на основе терпеноидов для стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией. The present invention relates to the field of medicine, namely, to methods for stimulating mitophagy and autophagy in a cell, involving the treatment of cells with a terpenoid-based inducer extracted from plants of the coniferous (Pinaceae) family, such as fir, pine or cedar, to methods for stimulating autophagy or mitophagy for treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction. In addition, the present invention relates to the use of a terpenoid-based inducer to stimulate mitophagy and autophagy in a cell, and to the use of a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy or mitophagy to treat a condition associated with mitochondrial dysfunction.
Продолжительность жизни в экономически развитых странах постепенно увеличивается. Однако качество жизни людей с возрастом ухудшается, поскольку люди пожилого возраста часто страдают неизлечимыми заболеваниями. Life expectancy in economically developed countries is gradually increasing. However, the quality of life of people deteriorates with age, as older people often suffer from incurable diseases.
Изменения в образе жизни за последние десятилетия (например, переедание, малоподвижный образ жизни) привели к увеличению числа людей с избыточным весом или ожирением, часто являющимся признаками и причинами таких состояний, как диабет и болезни сердца. Lifestyle changes over the past decades (eg, overeating, sedentary lifestyle) have led to an increase in the number of people who are overweight or obese, often signs and causes of conditions such as diabetes and heart disease.
Исследованиями доказано, что если сосредоточиться не на конкретных болезнях старения, а на самих механизмах старения, можно добиться более значительного продления здорового периода жизни (Brian К. Kennedy и др., "Geroscience: Linking Aging to Chronic Disease", журнал Cell, № 159 от 6 ноября 2014, cc. 709-713, https://www.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25417146). Studies have shown that by focusing on the mechanisms of aging rather than specific diseases of aging, a greater prolongation of healthy lifespan can be achieved (Brian K. Kennedy et al., "Geroscience: Linking Aging to Chronic Disease", Cell, no. 159 November 6, 2014, pp. 709-713, https://www.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25417146).
Клеточное старение все чаще признается в качестве основной, связанной со старением причины потери здоровья и физической формы. Стареющие клетки, продолжая вырабатывать новые митохондрии, накапливают дисфункциональные и дефектные митохондрии. Митофагия, т.е. утилизация дефектных и дисфункциональных митохондрий посредством аутофагии, в стареющих клетках проходит вяло, угасает. Cellular aging is increasingly recognized as a major aging-related cause of loss of health and fitness. Aging cells, while continuing to produce new mitochondria, accumulate dysfunctional and defective mitochondria. Mitophagy, i.e. utilization of defective and dysfunctional mitochondria through autophagy, in aging cells is sluggish, fades away.
В настоящее время существует единодушное мнение, что нарушенная митофагия играет ключевую роль в развитии дегенеративных заболеваний, связанных со старением. Поэтому основное внимание в борьбе с рядом заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, деменция, застойная сердечная недостаточность,
саркопения, диабет 2-го типа, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, рак, заболевания печени и поджелудочной железы, глазные заболевания, артрит, катаракта, остеопороз, гипертония и любые их комбинации, уделяется уже не симптоматическому лечению конкретного заболевания, а поиску путей активизации митофагии. Currently, there is a consensus that impaired mitophagy plays a key role in the development of degenerative diseases associated with aging. Therefore, the main focus in the fight against a number of diseases, such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, dementia, congestive heart failure, sarcopenia, type 2 diabetes, age-related macular degeneration (AMD), atherosclerosis, cardiovascular disease, cancer, liver and pancreatic disease, eye disease, arthritis, cataracts, osteoporosis, hypertension, and any combination thereof, is given to no longer symptomatic treatment a specific disease, but the search for ways to activate mitophagy.
Соединения, которые могут замедлять старение, так называемые геропротекторы, обычно замедляют наступление старения и сопутствующих заболеваний и снижают риски смертности. В геропротекторах, активирующих процесс митофагии в клетках, в качестве активного действующего вещества (индуктора) обычно используют либо химические соединения определенного состава, полученные химическим путем, либо многокомпонентные смеси, обычно не точно определенного состава и извлеченные из растительного сырья или продуктов жизнедеятельности дрожжей и микроорганизмов. Compounds that can slow down aging, so-called geroprotectors, usually slow down the onset of aging and related diseases and reduce the risk of mortality. In geroprotectors that activate the process of mitophagy in cells, either chemical compounds of a certain composition, obtained chemically, or multicomponent mixtures, usually of an indefinite composition and extracted from plant materials or waste products of yeasts and microorganisms, are usually used as an active ingredient (inducer).
Так, например, известен способ профилактики или лечения нейро дегенеративного расстройства у субъекта, предусматривающий введение в его организм в терапевтически эффективном количестве агента-индуктора, увеличивающего Nix-опосредованную митофагию в клетке, а точнее увеличивающего биологическую активность или экспрессию полипептида Nix, его фрагмента, варианта или аналога и/или полипептида GABARAP-L1, его фрагмента, варианта или аналога в клетке и содержащего указанные компоненты (US 2019/091291 А1). For example, a method is known for the prevention or treatment of a neurodegenerative disorder in a subject, which involves the introduction into his body in a therapeutically effective amount of an inducer agent that increases Nix-mediated mitophagy in the cell, or rather, increases the biological activity or expression of the Nix polypeptide, its fragment, variant or an analogue and/or polypeptide of GABARAP-L1, its fragment, variant or analogue in a cell and containing the indicated components (US 2019/091291 A1).
Недостатками известного способа являются технологическая сложность и высокая стоимость получения вещества, используемого в качестве индуктора, а также отсутствие полиактивности. Эти недостатки присущи всем другим известным способам, предусматривающим использование в качестве индуктора веществ химического происхождения, являющихся для клеток ксенобиотиками. The disadvantages of the known method are the technological complexity and the high cost of obtaining a substance used as an inductor, as well as the lack of polyactivity. These shortcomings are inherent in all other known methods involving the use of substances of chemical origin as an inductor, which are xenobiotics for cells.
Известны также приемы для улучшения здоровья людей, особенно пожилых или слабых людей, заключающиеся в активации митофагии в клетках путем перорального введения в течение определенного времени определенных доз фармацевтической композиции на основе уролитинов, являющихся метаболитами, происходящими из продуктов микрофлоры толстой кишки млекопитающих (US 2018/256538 и US 2018/256539). Недостатками такого подхода являются высокая стоимость действующего вещества, обусловленная специфическими особенностями обработки исходного сырья и технологически сложным процессом выделения из него действующего начала, а также в первую очередь нестабильность фармакологического действия, варьирующегося от вполне эффективного до токсического.
Наиболее близким к предлагаемому в изобретении является способ активации митофагии в клетках кожи, заключающийся в воздействии на клетки кожи косметическим составом, содержащим активное вещество (индуктор), извлеченное из по крайней мере одного растения, выбранного из Helianthus annuus, Ceratonia siliqua, Nigella sativa, Withania somnifera, Secale Comutum, Sesamum indicum, Ophiopogon japonicus, Alisma plantago- aquatica, Oryza sativa, Tropaeolum majus, Cichorium intybus, Prunus persica, Verbena officinalis, Panicum miliaceum, Rosa canina, Camelina sativa и Phaseolus vulgaris, либо из водорослей конкретных видов или дрожжей конкретных видов, а также адъюванты и вспомогательные вещества (WO 2013/178965). There are also known methods to improve the health of people, especially the elderly or weak people, consisting in the activation of mitophagy in cells by oral administration for a certain time of certain doses of a pharmaceutical composition based on urolithins, which are metabolites derived from the products of the microflora of the colon of mammals (US 2018/256538 and US 2018/256539). The disadvantages of this approach are the high cost of the active substance, due to the specific features of the processing of the feedstock and the technologically complex process of isolating the active principle from it, as well as, first of all, the instability of the pharmacological action, ranging from quite effective to toxic. Closest to what is proposed in the invention is a method for activating mitophagy in skin cells, which consists in exposing skin cells to a cosmetic composition containing an active substance (inductor) extracted from at least one plant selected from Helianthus annuus, Ceratonia siliqua, Nigella sativa, Withania somnifera, Secale Comutum, Sesamum indicum, Ophiopogon japonicus, Alisma plantago-aquatica, Oryza sativa, Tropaeolum majus, Cichorium intybus, Prunus persica, Verbena officinalis, Panicum miliaceum, Rosa canina, Camelina sativa and Phaseolus vulgaris, or from specific algae or yeasts specific species, as well as adjuvants and excipients (WO 2013/178965).
Известный способ основан на использовании активного вещества, извлекаемого из растений, часть из которых произрастает в тропических странах либо которые культивируются в незначительных объемах как привозное растение. Поскольку состав и свойства активных веществ, содержащихся в растениях, зависят от условий их произрастания, терапевтическое действие выделенных из них веществ нестабильно. Многие из указанных растений одержат не одно, а целый набор биологически активных веществ разнонаправленного действия, причем некоторые из них, например вещества, содержащиеся в Secale Comutum, Alisma plantago-aquatica, обладают сильным токсическим действием вызывает привыкание (Withania somnifera) или просто не применяются в официальной медицине в России (Ophiopogon japonicus). По указанным причинам известный способ промышленно неприменим без проведения дополнительных трудоемких исследований. The known method is based on the use of an active substance extracted from plants, some of which grow in tropical countries or are cultivated in small quantities as an imported plant. Since the composition and properties of the active substances contained in plants depend on the conditions of their growth, the therapeutic effect of the substances isolated from them is unstable. Many of these plants contain not one, but a whole set of biologically active substances of multidirectional action, and some of them, for example, substances contained in Secale Comutum, Alisma plantago-aquatica, have a strong toxic effect, cause addiction (Withania somnifera) or are simply not used in official medicine in Russia (Ophiopogon japonicus). For these reasons, the known method is industrially inapplicable without additional time-consuming research.
Стимулирование аутофагии, охватывающей митофагию как частный случай, также способствует оздоровлению клеток и оказывает на субъекта положительный терапевтический эффект, хотя в отличие от митофагии и не все механизмы оздоравливающего действия аутофагии выяснены до конца. Известен ряд способов стимулирования аутофагии и фармацевтических препаратов для этой цели. Stimulation of autophagy, which includes mitophagy as a special case, also promotes cell health and has a positive therapeutic effect on the subject, although, unlike mitophagy, not all mechanisms of the healing action of autophagy have been fully elucidated. There are a number of methods for stimulating autophagy and pharmaceutical preparations for this purpose.
В преобладающей части препаратов в качестве активного вещества-индуктора используются вещества химического происхождения несложного по сравнению с веществами растительного происхождения состава (WO 2019/204183, JP 2019218316, KR 20190114900, US 2019/160033, US 2019/336483). In the predominant part of the preparations, as an active substance-inducer, substances of chemical origin of a simple composition compared to substances of plant origin are used (WO 2019/204183, JP 2019218316, KR 20190114900, US 2019/160033, US 2019/336483).
Соответственно, активность таких веществ является узконаправленной, а известные препараты применяются главным образом в косметических целях, когда трудно установить, является ли терапевтический эффект следствием воздействия активного вещества или целевых добавок.
В WO 2019/099531 предложено использовать в составе индуктора, стимулирующего аутофагию, синергетическую комбинацию соединений, по меньшей мере, из двух, а предпочтительно трех классов соединений. Благодаря этому достигается некоторое повышение эффективности способа, но не расширение сферы его эффективного применения. Accordingly, the activity of such substances is narrowly focused, and known drugs are used mainly for cosmetic purposes, when it is difficult to establish whether the therapeutic effect is due to the action of the active substance or targeted additives. WO 2019/099531 proposes the use of a synergistic combination of compounds from at least two and preferably three classes of compounds in an autophagy-stimulating inducer. Due to this, some increase in the efficiency of the method is achieved, but not the expansion of the scope of its effective application.
Для устранения этого недостатка в WO 2019/204183 было предложено семь вариантов способа лечения или стимулирования роста волос путем введения субъекту одного или нескольких индуцирующих аутофагию агентов химического происхождения. В каждом из вариантов этого способа используется собственное определенное сочетание агентов. Само обилие предложенных вариантов говорит о том, что ни один из них не является однозначно и во всех случаях эффективным. To address this shortcoming, WO 2019/204183 proposes seven options for a method of treating or promoting hair growth by administering to a subject one or more autophagy-inducing agents of chemical origin. Each of the variants of this method uses its own specific combination of agents. The very abundance of the proposed options suggests that none of them is uniquely and in all cases effective.
Кроме того, используемые согласно вышеуказанному уровню техники индуцирующие аутофагию вещества химического происхождения являются ксенобиотиками для клеток и организмов, дополнительно нагружают их метаболизирующие и элиминирующие системы и могут стать причиной развития побочных реакций. In addition, autophagy-inducing substances of chemical origin used according to the above-mentioned prior art are xenobiotics for cells and organisms, additionally load their metabolizing and eliminating systems, and can cause side reactions.
В значительно меньшей степени указанные недостатки присущи фитопрепаратам, содержащим в качестве активного вещества растительные компоненты или продукты их переработки. To a much lesser extent, these disadvantages are inherent in phytopreparations containing plant components or products of their processing as an active substance.
Из US 8512764 известен способ активации аутофагии клеток кожи с целью ее детоксикации или предотвращения старения, заключающийся в нанесении на кожу косметической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента (индуктора) биологическую субстанцию, извлекаемую из водорослей, дрожжей или растений, выбираемых из группы Lithothamnium calcareum, Yarrowia lipolytica, Melilotus officinalis, Citrus limonum, Candida saitoana, Lens culinaris, Averrhoa carambola, Momordica charantia, a также адъюванты и вспомогательные вещества. From US 8512764, a method is known for activating autophagy of skin cells in order to detoxify or prevent aging, which consists in applying to the skin a cosmetic composition containing, as an active ingredient (inducer), a biological substance extracted from algae, yeast or plants selected from the group Lithothamnium calcareum, Yarrowia lipolytica, Melilotus officinalis, Citrus limonum, Candida saitoana, Lens culinaris, Averrhoa carambola, Momordica charantia, as well as adjuvants and excipients.
Активные вещества части вышеуказанных растений вызывают ряд нежелательных побочных эффектов. Так, в частности, кумарин, содержащийся в траве донника лекарственного (Melilotus officinalis), оказывает угнетающее действиена центральную нервную систему и обладает наркотическим действием. The active substances of a part of the above plants cause a number of undesirable side effects. So, in particular, coumarin, contained in the herb of sweet clover (Melilotus officinalis), has a depressant effect on the central nervous system and has a narcotic effect.
Биоактивный ингредиент, который получают из дрожжей вида кандида саитоана (Candida saitoana), настолько токсичен, что используется в качестве пестицида. The bioactive ingredient, which is derived from Candida saitoana yeast, is so toxic that it is used as a pesticide.
Вещества, содержащиеся в карамболе (Averrhoa carambola), токсичны для уремических пациентов. Токсичны также вещества, содержащиеся в момордике (Momordica charantia).
Ввиду токсичности активных веществ сфера применения этого известного способа ограничена косметическими процедурами, относящимися к лечению кожи или уходу за ней. Substances contained in carambola (Averrhoa carambola) are toxic to uremic patients. The substances contained in momordica (Momordica charantia) are also toxic. Due to the toxicity of the active substances, the scope of this known method is limited to cosmetic procedures related to the treatment of the skin or skin care.
Наиболее близким к предлагаемому в изобретении является описанный в AU 2016101736 способ индуцирования аутофагии в клетках путем их контакта с тритерпиноидом, экстрагируемым из плюща обыкновенного (Hedera helix). Такой способ предложен для лечения нейро дегенеративных заболеваний, а именно: болезни Паркинсона или болезни Хантингтона. Closest to what is proposed in the invention is described in AU 2016101736 method of inducing autophagy in cells by contact with a triterpinoid extracted from common ivy (Hedera helix). Such a method has been proposed for the treatment of neurodegenerative diseases, namely Parkinson's disease or Huntington's disease.
Недостатком этого способа является ограниченность сферы его применения лечением вышеуказанных болезней, обусловленная, вероятно, свойствами конкретного тритерпеноида, выделяемого из плюща. К настоящему времени установлено существование в растениях около 10000 терпенов и терпеноидов, функции большинства которых еще неизвестны. Кроме того, листья и плоды плюща ядовиты, и поэтому для снижения токсичности препарата приходится прибегать к технологически сложной многоступенчатой процедуре выделения нужного тритерпеноида из листьев и плодов плюща. The disadvantage of this method is the limited scope of its application in the treatment of the above diseases, probably due to the properties of a particular triterpenoid isolated from ivy. To date, the existence of about 10,000 terpenes and terpenoids in plants has been established, the functions of most of which are still unknown. In addition, the leaves and fruits of ivy are poisonous, and therefore, in order to reduce the toxicity of the drug, one has to resort to a technologically complex multi-stage procedure for isolating the desired triterpenoid from ivy leaves and fruits.
В основу настоящего изобретения была положена задача предложить способы стимуляции аутофагии и митофагии клеток путем воздействия на клетки индуктором, активное начало которого выбрано из широкого набора недорогих, доступных и нетоксичных терпеноидов, получаемых из распространенных в дикой природе России растений из семейства Pinaceae: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies). The present invention was based on the task of proposing methods for stimulating autophagy and mitophagy of cells by exposing cells to an inducer, the active principle of which is selected from a wide range of inexpensive, accessible and non-toxic terpenoids obtained from plants from the Pinaceae family common in the Russian wild nature: the genus Spruce (Picla ), the genus pine (Pinus), the genus cedar (Cedrus) and the genus fir (Abies).
Другая задача настоящего изобретения состояла в разработке способов стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией у субъекта, с использованием указанного индуктора. Еще одна задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы предложить индуктор на основе терпеноидов, пригодный для применения для стимуляции митофагии и аутофагии в клетке и пригодный для применения для стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией. Another object of the present invention was to develop methods for stimulating autophagy or mitophagy for the treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject using said inducer. Another object of the present invention was to provide a terpenoid-based inducer suitable for use in stimulating mitophagy and autophagy in a cell and suitable for use in stimulating autophagy or mitophagy to treat a condition associated with mitochondrial dysfunction.
Технический результат от использования предлагаемого в изобретении решения состоит в повышении стабильности и эффективности воздействия на клетки и в снижении токсичности препаратов растительного происхождения, стимулирующих процесс устранения дисфункциональных компонентов клеток путем аутофагии и митофагии,
приводящий к купированию и лечению состояний, ассоциированных с митохондриальной дисфункцией. The technical result of using the solution proposed in the invention is to increase the stability and effectiveness of the effect on cells and to reduce the toxicity of herbal preparations that stimulate the process of eliminating dysfunctional cell components by autophagy and mitophagy, leading to relief and treatment of conditions associated with mitochondrial dysfunction.
Указанный технический результат достигается благодаря тому, что при осуществлении способа стимуляции митофагии в клетках предлагаемым в изобретении способом, предусматривающего обработку клеток индуктором на основе терпеноидов, в качестве такого индуктора на основе терпеноидов используют в эффективной концентрации индуктор, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is achieved due to the fact that when implementing the method for stimulating mitophagy in cells according to the invention, which involves treating cells with a terpenoid-based inductor, an inductor extracted from plants of the Pinaceae family is used as such an inductor based on terpenoids, for example: spruce (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), and having the following physical constants: acid value from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ether value from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
В одном из предпочтительных вариантов индуктор на основе терпеноидов используют в концентрации от 0,05 до 200 мкг/мл, предпочтительно от 45 до 200 мкг/мл. In one preferred embodiment, the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 μg/ml, preferably 45 to 200 μg/ml.
В еще одном предпочтительном варианте длительность обработки клеток индуктором на основе терпеноидов составляет от 6 до 72 ч, предпочтительно 16 ч. In another preferred embodiment, the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
В еще одном предпочтительном варианте клетки имеют происхождение из неопухолевых тканей, содержатся в субъекте или находятся ex vivo или in vitro. In yet another preferred embodiment, the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
Обработку можно осуществлять путями и способами, известными специалистам в данной области. Так, например, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа in vitro для приведения в контакт клеток и ингибитора можно культивировать клетки в присутствии индуктора в культуральной среде или путем добавления индуктора к клеткам. Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art. For example, when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells.
При осуществлении предлагаемого в изобретении способа ex vivo для приведения индуктора в контакт с клетками или тканями его можно, например, вводить в организм субъекта путями, которые известны специалисту в данной области, прежде всего любым из путей, которые обычно применяют в области генной терапии. Введение индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного, интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. In carrying out the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or tissues, it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy. Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил- 2", как таковой или с
целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In yet another preferred embodiment, the preparation "Abisil", "Abisil-1" or "Abisil-2" can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted supplement that is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массемасляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массемасляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example a 3-15% by weight oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Указанный технический результат достигается также благодаря тому, что при осуществлении способа стимуляции аутофагии в клетках, предусматривающего обработку клеток индуктором на основе терпеноидов, в качестве такого индуктора на основе терпеноидов используют в эффективной концентрации индуктор, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is also achieved due to the fact that when implementing a method for stimulating autophagy in cells, involving the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, an inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla ), genus pine (Pinus), genus cedar (Cedrus) and genus fir (Abies), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ether number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
В одном из предпочтительных вариантов индуктор на основе терпеноидов используют в концентрации от 0,05 до 200 мкг/мл, предпочтительно от 45 до 200 мкг/мл. In one preferred embodiment, the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 μg/ml, preferably 45 to 200 μg/ml.
В еще одном предпочтительном варианте длительность обработки клеток индуктором на основе терпеноидов составляет от 6 до 72 ч, предпочтительно 16 ч. In another preferred embodiment, the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
В еще одном предпочтительном варианте клетки имеют происхождение из неопухолевых тканей, содержатся в субъекте или находятся ex vivo или in vitro. In yet another preferred embodiment, the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
Обработку можно осуществлять путями и способами, известными специалистам в данной области. Так, например, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа in vitro для приведения в контакт клеток и ингибитора можно культивировать клетки в присутствии индуктора в культуральной среде или путем добавления индуктора к клеткам. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа ex vivo для приведения индуктора в контакт с клетками или канями его можно, например, вводить в организм субъекта путями, которые известны специалисту в данной области, прежде всего любым из путей, которые обычно применяют в области генной терапии. Введение индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного,
интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art. For example, when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells. In carrying out the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or canals, it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy. The introduction of the inducer can be carried out in various ways, for example, by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary administration, administration by inhalation or by intrabronchial, oral or rectal administration.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил- 2", как таковой или с целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In another preferred embodiment, Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массе сляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массе масляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of a saline solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Указанный технический результат достигается также благодаря тому, что при осуществлении способа стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией у субъекта, со стадией введения индуктора в эффективной дозе в организм субъекта в качестве такого индуктора используют индуктор на основе терпеноидов, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is also achieved due to the fact that when implementing a method for stimulating autophagy or mitophagy for treating a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject, with the stage of introducing an inductor in an effective dose into the subject's body, a terpenoid-based inducer extracted from plants is used as such an inducer. of the family Pinaceae, for example: the genus spruce (Picla), the genus pine (Pinus), the genus cedar (Cedrus) and the genus fir (Abies), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, essential number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
Субъектом является человек. The subject is a person.
Состояние, ассоциированное с митохондриальной дисфункцией, выбрано из состояния, включающего мутации и/или эпигенетические нарушения митохондриального или ядерного генома, приводящие к нарушению митофагии, дефектам морфологии митохондрий и нарушениям мембранного потенциала итохондрий, и состояния, включающего лизосомные болезни накопления. A condition associated with mitochondrial dysfunction is selected from a condition including mutations and/or epigenetic abnormalities of the mitochondrial or nuclear genome leading to disruption of mitophagy, defects in mitochondrial morphology, and disturbances in mitochondrial membrane potential, and a condition including lysosomal storage diseases.
В одном из предпочтительных вариантов, индуктор на основе терпеноидов вводят в организм субъекта в дозе от 4 до 40 мг/кг веса тела, предпочтительно в дозе от 4 до 24 мг/кг веса тела. In one embodiment, the terpenoid inducer is administered to the subject at a dose of 4 to 40 mg/kg body weight, preferably 4 to 24 mg/kg body weight.
Введение индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного,
интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. The introduction of the inducer can be carried out in various ways, for example, by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary administration, administration by inhalation or by intrabronchial, oral or rectal administration.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил-2" как таковой или с целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In another preferred embodiment, Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, linseed, soybean, coconut or argan oil. and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массе масляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массе масляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Указанный технический результат достигается далее благодаря применению индуктора на основе терпеноидов для стимуляции митофагии в клетках. Указанное применение предусматривает обработку клеток индуктором на основе терпеноидов, в качестве какового индуктора используют в эффективной концентрации индуктор, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is further achieved through the use of an inductor based on terpenoids to stimulate mitophagy in cells. This application involves the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, which inductor is used in an effective concentration of an inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies ), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
В одном из предпочтительных вариантов индуктор на основе терпеноидов используют в концентрации от 0,05 до 200 мкг/мл, предпочтительно от 45 до 200 мкг/мл. In one preferred embodiment, the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 μg/ml, preferably 45 to 200 μg/ml.
В еще одном предпочтительном варианте длительность обработки клеток индуктором на основе терпеноидов составляет от 6 до 72 ч, предпочтительно 16 . In another preferred embodiment, the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
В еще одном предпочтительном варианте клетки имеют происхождение из неопухолевых тканей, содержатся в субъекте или находятся ex vivo или in vitro. In yet another preferred embodiment, the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
Обработку можно осуществлять путями и способами, известными специалистам в данной области. Так, например, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа in vitro для приведения в контакт клеток и ингибитора можно культивировать клетки в присутствии индуктора в культуральной среде или путем добавления индуктора к клеткам. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа ex vivo для приведения индуктора в контакт с клетками или тканями его можно, например, вводить в организм субъекта путями, которые известны специалисту в данной области, прежде всего любым из путей, которые обычно применяют в области генной терапии. Введение
индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного, интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art. For example, when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells. In carrying out the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or tissues, it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy. Introduction The inducer can be administered in a variety of ways, for example by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhalation, or intrabronchial, oral or rectal administration.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил-2", как таковой или с целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In another preferred embodiment, Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массе масляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массе масляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Указанный технический результат достигается также благодаря применению индуктора на основе терпеноидов для стимуляции аутофагии в клетках. Указанное применение предусматривает обработку клеток индуктором на основе терпеноидов, в качестве какового индуктора используют в эффективной концентрации индуктор, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is also achieved through the use of a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy in cells. This application involves the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, which inductor is used in an effective concentration of an inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies ), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
В одном из предпочтительных вариантов индуктор на основе терпеноидов используют в концентрации от 0,05 до 200 мкг/мл, предпочтительно от 45 до 200 мкг/мл. In one preferred embodiment, the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 μg/ml, preferably 45 to 200 μg/ml.
В еще одном предпочтительном варианте длительность обработки клеток индуктором на основе терпеноидов составляет от 6 до 72 ч, предпочтительно 16 ч. In another preferred embodiment, the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
В еще одном предпочтительном варианте клетки имеют происхождение из неопухолевых тканей, содержатся в субъекте или находятся ex vivo или in vitro. In yet another preferred embodiment, the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
Обработку можно осуществлять путями и способами, известными специалистам в данной области. Так, например, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа in vitro для приведения в контакт клеток и ингибитора можно культивировать клетки в присутствии индуктора в культуральной среде ли путем добавления индуктора к клеткам. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа ex vivo для приведения
индуктора в контакт с клетками или тканями его можно, например, вводить в организм субъекта путями, которые известны специалисту в данной области, прежде всего любым из путей, которые обычно применяют в области генной терапии. Введение индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного, интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art. Thus, for example, when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, it is possible to culture the cells in the presence of the inducer in the culture medium, or by adding the inducer to the cells. When implementing the method according to the invention ex vivo to bring of the inducer into contact with cells or tissues, it can, for example, be introduced into the body of the subject in ways known to the person skilled in the art, especially any of the ways that are commonly used in the field of gene therapy. Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил-2", как таковой или с целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In another preferred embodiment, Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массе масляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массе масляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Указанный технический результат достигается далее благодаря применению индуктора на основе терпеноидов для стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией у субъекта. Указанное применение предусматривает стадию введения индуктора в эффективной дозе в организм субъекта. В качестве такого индуктора используют индуктор на основе терпеноидов, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is further achieved through the use of a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy or mitophagy for the treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject. Said use includes the step of administering the inductor at an effective dose to the subject. As such an inductor, a terpenoid-based inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
Субъектом является человек. The subject is a person.
Состояние, ассоциированное с митохондриальной дисфункцией, выбрано из состояния, включающего мутации и/или эпигенетические нарушения митохондриального или ядерного генома, приводящие к нарушению митофагии, дефектам морфологии митохондрий и нарушениям мембранного потенциала митохондрий, и состояния, включающего лизосомные болезни накопления.
В одном из предпочтительных вариантов, индуктор на основе терпеноидов вводят в организм субъекта в дозе от 4 до 40 мг/кг веса тела, предпочтительно в дозе от 4 до 24 мг/кг веса тела. A condition associated with mitochondrial dysfunction is selected from a condition including mutations and/or epigenetic abnormalities of the mitochondrial or nuclear genome leading to disruption of mitophagy, defects in mitochondrial morphology, and disturbances in mitochondrial membrane potential, and a condition including lysosomal storage diseases. In one embodiment, the terpenoid inducer is administered to the subject at a dose of 4 to 40 mg/kg body weight, preferably 4 to 24 mg/kg body weight.
Введение индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного, интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил-2" как таковой или с целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In another preferred embodiment, Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, linseed, soybean, coconut or argan oil. and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массе масляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массе масляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Благодаря использованию действующего вещества на основе терпеноидов, извлеченных из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), достигается стабильная и существенная активизации аутофагии и митофагии в клетках при полном исключении возможности токсического воздействия на клетку. Through the use of an active substance based on terpenoids extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), a stable and significant activation of autophagy and mitophagy in cells is achieved. with the complete exclusion of the possibility of toxic effects on the cell.
Благодаря использованию действующего вещества на основе терпеноидов, извлеченных из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), достигается стабильность процесса и результата активизации аутофагии и митофагии в клетках при полном исключении возможности токсического воздействия на клетку, что бъясняется стабильностью состава и характеристик и отсутствием токсичности исходного растительного сырья, извлекаемого из указанных растений. Thanks to the use of an active substance based on terpenoids extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), stability of the process and result of activation of autophagy and mitophagy in cells with the complete exclusion of the possibility of toxic effects on the cell, which is explained by the stability of the composition and characteristics and the absence of toxicity of the original plant material extracted from these plants.
Использование указанного выше индуктора на основе терпеноидов и, в частности, препарата "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил-2" как такового или с целевой добавкой позволяет добиться существенной активизации аутофагии и митофагии в клетках без необходимости использования индукторов на основе терпеноидов с другими
параметрами, которые получены по иной технологии и эффективность действия которых еще только предстоит проверять и доказывать. The use of the aforementioned terpenoid-based inducer and, in particular, the preparation "Abisil", "Abisil-1" or "Abisil-2" as such or with a target additive allows to achieve a significant activation of autophagy and mitophagy in cells without the need to use terpenoid-based inducers with others parameters that are obtained using a different technology and the effectiveness of which has yet to be tested and proved.
Препараты "Абисил-1" и "Абисил" и способы их получения описаны в патентах RU 2054945, RU 2198653. Preparations "Abisil-1" and "Abisil" and methods for their preparation are described in patents RU 2054945, RU 2198653.
Препарат "Абисил-2" и способ его получения описаны в патенте RU 2338547. Препарат "Абисил-2" получен на основе капсульного экстракта растений семейства Pinaceae, подверженных кратковременному стрессовому воздействию, и содержит следующие компоненты: секвитерпеноиды 3-6 масс.%, нейтральные дитерпеноиды 11-15 масс.%, дитерпеновые кислоты 23-24 масс.%, тритерпеновые кислоты 8-16 масс.%, ненасыщенные и насыщенные жирные кислоты 0, 1-0,3 масс.%, фенольные соединения 0, 1-0,2 масс.%, монотерпеноиды остальное, при этом содержание монотерпеноида борнилацетата должно составлять не менее 10,0 масс.% от общего состава терпеноидов. The drug "Abisil-2" and the method of its production are described in patent RU 2338547. The drug "Abisil-2" is obtained on the basis of a capsular extract of plants of the Pinaceae family subjected to short-term stress, and contains the following components: sequiterpenoids 3-6 wt.%, neutral diterpenoids 11-15 wt.%, diterpenic acids 23-24 wt.%, triterpene acids 8-16 wt.%, unsaturated and saturated fatty acids 0.1-0.3 wt.%, phenolic compounds 0, 1-0, 2 wt.%, monoterpenoids the rest, while the content of bornylacetate monoterpenoid should be at least 10.0 wt.% of the total composition of terpenoids.
Терпеноидная композиция представляет собой густую жидкость с цветом от желтого прозрачного до молочно-белого со специфическим запахом и имеет следующие физические константы: кислотное число 70-90, число омыления 100-130, эфирное число 10-60, показатель преломления 1,500-1,520. The terpenoid composition is a thick liquid with a color from yellow transparent to milky white with a specific odor and has the following physical constants: acid number 70-90, saponification number 100-130, ester number 10-60, refractive index 1.500-1.520.
Ниже сущность изобретения поясняется со ссылкой на прилагаемые к описанию графические материалы, на которых показано: на фиг. 1- оценка метаболической активности клеток, обработанных "Абисилом" в различных концентрациях,
на фиг. 2 - оценка снижения митохондриального потенциала, вызванного "Абисилом" в иммортализованных клетках MRC5 и фибробластах легких Lech-4, на фиг. 3 - оценка влияния предварительной обработки "Абисилом" на накопление конъюгата легкой цепи 3 и фосфатидилэтаноламина (LC3II) в трансформированных SV-40 эмбриональных фибробластах легкого (MRC5-V40) по результатам денситометрического анализа относительно внутреннего контроля и на фиг. 4 - оценка митофагии в клетках MRC5-SV40 при обработке препаратом в концентрациях 25 и 50 мкг/мл через 24 и 72 ч: А, В - контрольный образец (ДМСО, 0,5%), С - 24-часовая обработка в концентрации 25 мкг/мл, D - 24-часовая обработка в концентрации 50 мкг/мл, Е - 72-часовая обработка в концентрации 25 мкг/мл, F — 72- часовая обработка в концентрации 50 мкг/мл. Below, the essence of the invention is explained with reference to the accompanying drawings, which show: in Fig. 1- evaluation of the metabolic activity of cells treated with "Abisil" in various concentrations, in fig. 2 is an assessment of the decrease in mitochondrial potential induced by "Abisil" in immortalized MRC5 cells and Lech-4 lung fibroblasts, FIG. 3 - evaluation of the effect of pre-treatment "Abisil" on the accumulation of the light chain 3 conjugate and phosphatidylethanolamine (LC3II) in transformed SV-40 embryonic lung fibroblasts (MRC5-V40) according to the results of densitometric analysis relative to internal control and Fig. 4 - assessment of mitophagy in MRC5-SV40 cells when treated with the drug at concentrations of 25 and 50 μg / ml after 24 and 72 hours: A, B - control sample (DMSO, 0.5%), C - 24-hour treatment at a concentration of 25 µg/ml, D - 24-hour treatment at a concentration of 50 µg/ml, E - 72-hour treatment at a concentration of 25 µg/ml, F - 72-hour treatment at a concentration of 50 µg/ml.
Возможность осуществления изобретения может быть подтверждена следующими примерами. The possibility of carrying out the invention can be confirmed by the following examples.
Оценка митохондриального потенциала Assessment of mitochondrial potential
Клетки MRC5-SV40 и Lech-4 высевали на 12-луночные планшеты по 40000 клеток на лунку. На следующий день проводили обработку препаратом "Абисил" в широком диапазоне концентраций (25-200 мкг/мл). Через 16 ч клетки окрашивали ЮОнМ и 200нМ метиловым эфиром тетраметилродамина (TMRM) фирма Thermofisher Scientific) в течение 30 мин при 37°С. В качестве положительного контроля использовали 1 кМ ротенон и ЮмкМ разобщитель окислительного фосфорилирования, представляющий собой карбонилцианид-4-(трифторметокси)фенилгидразон (FCCP) (фирма Sigma-Aldrich). Перед измерением клетки окрашивали на жизнеспособность с помощью 4',6-диамидино-2- фенилиндола (DAPI) (фирма Sigma-Aldrich) в концентрации 1 мкг/мл. Флуоресценцию детектировали с помощью цитофлуориметра BD LSRFortessa (фирма Beckman Dickinson). Анализ проводили с помощью программы Flowing Software 2.0 (фирма Perttu Terho, Turku Centre for Biotechnology). Результаты получены на основе трех независимых экспериментов с тремя биологическими повторностями. MRC5-SV40 and Lech-4 cells were seeded in 12-well plates at 40,000 cells per well. The next day, Abisil was treated in a wide range of concentrations (25-200 μg/ml). After 16 h, the cells were stained with JuonM and 200 nM tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM, Thermofisher Scientific) for 30 min at 37°C. As a positive control, 1 kM rotenone and JuMKM oxidative phosphorylation uncoupler carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) (Sigma-Aldrich) were used. Prior to measurement, cells were stained for viability with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma-Aldrich) at a concentration of 1 μg/ml. Fluorescence was detected using a BD LSRFortessa cytometer (Beckman Dickinson). Analysis was performed using Flowing Software 2.0 (Perttu Terho, Turku Center for Biotechnology). The results are based on three independent experiments with three biological replicates.
Оценка аутофагии и митофагии Assessment of autophagy and mitophagy
Оценку аутофагии проводили на панели клеточных линий, стабильно экспрессирующих репортерную конструкцию из 2 слитых белков EGFP (зеленый флуоресцентный белок) и LC3. Обработку препаратом "Абисил" проводили в широком диапазоне концентраций (25-200 мкг/мл) в течение 16 часов. В качестве положительного контроля использовали рапамицин (R0395, фирма Sigma-Aldrich).
Для оценки митофагии использовали линию клеток MRC5-SV40, стабильно экспрессирующих репортерную конструкцию EGFP-mCherry-FIS 1 , которая содержит два флуоресцентных белка и в которой тандемная метка mCherry-GFP прикреплена к сигналу локализации наружной митохондриальной мембраны, полученному из митохондриального белка FIS1 (аминокислоты 101-152). В качестве положительного контроля использовали FCCP (фирма Sigma-Aldrich). Autophagy was assessed on a panel of cell lines stably expressing a reporter construct of 2 fusion proteins EGFP (green fluorescent protein) and LC3. Treatment with the drug "Abisil" was carried out in a wide range of concentrations (25-200 µg/ml) for 16 hours. Rapamycin (R0395, Sigma-Aldrich) was used as a positive control. Mitophagy was assessed using the MRC5-SV40 cell line, which stably expresses the EGFP-mCherry-FIS 1 reporter construct, which contains two fluorescent proteins and in which the mCherry-GFP tandem tag is attached to the outer mitochondrial membrane localization signal derived from the mitochondrial FIS1 protein (amino acids 101 -152). FCCP (Sigma-Aldrich) was used as a positive control.
Клетки обрабатывали препаратом "Абисил" в концентрациях 50 мкг/мл и 25 кг/мл в течение 24 или 72 часов. Cells were treated with Abisil at concentrations of 50 μg/ml and 25 kg/ml for 24 or 72 hours.
Для детекции митофагии в клетках Lech-4 их обрабатывали препаратом Абисил" в концентрациях 25 мкг/мл и 50 мкг/мл в течение 24 или 72 часов. По окончании инкубации клетки в течение 20 минут окрашивали при 37°С 200нМ потенциал-зависимым красителем митохондрий MitoTracker Red CMXRos фирма Thermofisher Scientific), 100нМ LysoTracker Green (фирма Thermofisher cientific). To detect mitophagy in Lech-4 cells, they were treated with Abisil at concentrations of 25 μg/ml and 50 μg/ml for 24 or 72 hours. After incubation, the cells were stained for 20 minutes at 37°C with 200 nM voltage-dependent mitochondrial dye MitoTracker Red CMXRos from Thermofisher Scientific), 100nM LysoTracker Green from Thermofisher scientific.
Для получения изображений использовали микроскопы Axiovert 200 (фирма Carl Zeiss) и конфокальный микроскоп Leica (фирма Leica Microsystems). Axiovert 200 microscopes (Carl Zeiss) and a Leica confocal microscope (Leica Microsystems) were used for imaging.
МТТ-анализ MTT analysis
Клетки линии MRC5-SV40 высевали в 96-луночный планшет по 5000 клеток на лунку, культивировали в 100 мкл среды DMEM (питательная среда, модифицированная по способу Дульбекко) с 5% FBS (фетальная бычья сыворотка) при 37°С и инкубировали в течение 48 ч. Далее в течение суток обрабатывали препаратом "Абисил" (в концентрации 0, 9, 11, 15, 25, 50, 93, 125, 147 и 186 мкг/мл) при 37°С. Оценку уровня метаболизма клеток проводили с помощью MTS-теста (набор CellTiter 96® для нерадиоактивного анализа пролиферации клеток (МТТ), фирма Promega) в соответствии с протоколом производителя. Оптическую плотность окрашенного вещества, пропорциональную уровню метаболизма жизнеспособных клеток, измеряли при 590 нм с помощью планшетного ридера (фирма Тесал). Затем методом регрессионного анализа вычисляли значения IC50, а также концентрации, при которых наблюдался наиболее интенсивный клеточный метаболизм. MRC5-SV40 cells were seeded in a 96-well plate at 5,000 cells per well, cultured in 100 μl of DMEM (Dulbecco's modified nutrient medium) with 5% FBS (fetal bovine serum) at 37°C and incubated for 48 h. Next, during the day was treated with the drug "Abisil" (at a concentration of 0, 9, 11, 15, 25, 50, 93, 125, 147 and 186 µg/ml) at 37°C. The level of cell metabolism was assessed using the MTS test (CellTiter 96® kit for non-radioactive cell proliferation assay (MTT), Promega) according to the manufacturer's protocol. The optical density of the colored substance, proportional to the level of metabolism of viable cells, was measured at 590 nm using a tablet reader (Tesal). Then, the IC50 values were calculated by regression analysis, as well as the concentrations at which the most intensive cellular metabolism was observed.
Вестерн-блоттинг Western blotting
Клетки Lech-4 культивировали на чашках Петри диаметром 35 мм и при конфлюэнтности 50% проводили обработку препаратом "Абисил" в 5% DMEM с 5% FBS при 37°С в течение ночи. После инкубации клетки промывали холодным PBS (фосфатнобуферный солевой раствор) и лизировали в 200 мкл репортерного лизирующего буфера
(фирма Promega), содержащего коктейль ингибиторов протеаз (№Р8349, фирма Sigma- Aldrich), согласно инструкции производителя. Лизаты центрифугировали в течение 15 мин при 12000g и измеряли общее содержание белка в супернатанте белка по Брэдфорду. Белки разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии 12% додецилсульфата натрия (SDS) по Лэммли и осуществляли электроперенос на ПВДФ- мембрану Amersham Hybond Р, 0,45 мкм (фирма Amersham Biosciences, GE Healthcare) в буфере для переноса Товбин (25мМ трис, 192мМ глицин, 20% (об/об) этанола, pH 8,3). Мембраны блокировали в 4%-ном растворе обезжиренного молока в ФСБТ (ФСБ с 0,05% Твина 20) в течение 1 часа при комнатной температуре. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение ночи при 4°С со вторичными антителами (козьи антитела к кроличьему IgG-HRP, sc-2004, фирма Santa Cruz Biotechnology) и в течение 1 часа при комнатной температуре. Для проявления использовали хемилюминесцентный субстрат типа Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (фирма Merck-Millipore, Sigma-Aldrich), определяя сигнал хемилюминесценции с помощью системы гель- документирования Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System (фирма Bio-Rad). Количественную оценку белковых полос выполняли с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH, фирма Bethesda, шт. Мэриленд, США). Lech-4 cells were cultured on Petri dishes with a diameter of 35 mm and at a confluence of 50% treated with the drug "Abisil" in 5% DMEM with 5% FBS at 37°C overnight. After incubation, cells were washed with cold PBS (phosphate buffered saline) and lysed in 200 µl of reporter lysis buffer (Promega) containing a protease inhibitor cocktail (No. P8349, Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. The lysates were centrifuged for 15 min at 12000g and the total protein content in the protein supernatant was measured according to Bradford. Proteins were separated by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of 12% sodium dodecyl sulfate (SDS) according to Laemmli and electrotransferred to an Amersham Hybond P PVDF membrane, 0.45 μm (Amersham Biosciences, GE Healthcare) in Tovbin transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% (v/v) ethanol, pH 8.3). The membranes were blocked in 4% skimmed milk in PBS (PBS with 0.05% Tween 20) for 1 hour at room temperature. Incubation with primary antibodies was performed overnight at 4° C. with secondary antibodies (goat anti-rabbit IgG-HRP, sc-2004, Santa Cruz Biotechnology) and for 1 hour at room temperature. Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Merck-Millipore, Sigma-Aldrich) was used for development, detecting the chemiluminescence signal with a Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad). Protein bands were quantified using ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA).
Список использованных первичных антител: List of primary antibodies used:
- P-actin (D6A8, #8457, фирма Cell Signaling Technology); - P-actin (D6A8, #8457, Cell Signaling Technology);
- LC3 (Dl l, #3868, фирма Cell Signaling Technology). - LC3 (Dl l, #3868, Cell Signaling Technology).
Статистический анализ Statistical analysis
Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Data are presented as mean ± standard error.
Статистический анализ выполняли с использованием t-критерия Стьюдента. Statistical analysis was performed using Student's t-test.
Считается, что р<0,05 указывает на статистически значимое различие. Анализ был выполнен с использованием программы Microsoft Excel. It is believed that p<0.05 indicates a statistically significant difference. The analysis was performed using the Microsoft Excel program.
Реагенты для обработки клеток Cell Processing Reagents
Для обработки клеток использовали препарат "Абисил" в виде живицы от ООО "Инитиум-Фарм". Для получения стока для обработки клеточных культур "Абисил" растворяли в ДМСО. The cells were treated with the Abisil preparation in the form of resin from OOO Initium-Pharm. To obtain a drain for processing cell cultures, "Abisil" was dissolved in DMSO.
Клетки выращивали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, до 50-70%-ной конфлюэнтности. Непосредственно перед обработкой сток "Абисил" разводили в бессывороточной среде DMEM, обработку проводили в среде DMEM с 5% FBS.
Отрицательные контроля обрабатывали соответствующим количеством ДМСО в среде DMEM с 5% FBS. Cells were grown in DMEM containing 10% FBS to 50-70% confluence. Immediately before treatment, Abisil stock was diluted in a serum-free DMEM medium, treatment was carried out in DMEM medium with 5% FBS. Negative controls were treated with the appropriate amount of DMSO in DMEM with 5% FBS.
Пример 1: Влияние "Абисила" на метаболическую активность клеток. Влияние 48- часовой обработки "Абисилом" на метаболическую активность клеток изучали с использованием МТТ-теста на линиях эмбриональных легочных фибробластов (MRC5- SV40 и Lech-4). "Абисил" продемонстрировал значительную дозозависимость (см. фиг. 1). Рассчитанные значения IC50 составили 149,3±0,67 для MRC5-SV40 и 152,6±0,52 мкг/мл для Lech-4 соответственно (таблица 1). Кроме этого, обе клеточные линии продемонстрировали существенное повышение метаболической активности (р<0,001) при обработке препаратов в низких концентрациях (9-15 мкг/мл). Example 1: Influence of "Abisil" on the metabolic activity of cells. The effect of 48-hour treatment with "Abisil" on the metabolic activity of cells was studied using the MTT test on lines of embryonic pulmonary fibroblasts (MRC5-SV40 and Lech-4). "Abisil" showed a significant dose-dependence (see Fig. 1). The calculated IC50 values were 149.3±0.67 for MRC5-SV40 and 152.6±0.52 µg/ml for Lech-4, respectively (Table 1). In addition, both cell lines showed a significant increase in metabolic activity (p<0.001) when treated with drugs at low concentrations (9-15 µg/ml).
Пример 2: Влияние "Абисила- 1" на снижение митохондриального потенциалаExample 2: Effect of "Abisil-1" on the reduction of mitochondrial potential
Иммортализованные клетки MRC5 и фибробласты легких Lech-4 (MRC5-SV40 (А)) инкубировали в соотношении 1:4000 "Абисилом- 1" в течение ночи, окрашивали TMRM и флуоресценцию красителя измеряли в канале РЕ. Черная гистограмма на фигуре 2 представляет обработанные "Абисилом- 1" клетки; серая гистограмма представляет на фигуре 2 контрольные клетки. Immortalized MRC5 cells and Lech-4 lung fibroblasts (MRC5-SV40 (A)) were incubated at a ratio of 1:4000 with Abisil-1 overnight, stained with TMRM, and dye fluorescence was measured in the PE channel. The black histogram in Figure 2 represents Abisil-1 treated cells; the gray histogram represents control cells in Figure 2.
Обработка "Абисилом- 1" вызывала приблизительно 2-кратное снижение митохондриального потенциала (р<0,05 (р<0,01)) (см. фиг. 2 и таблицу 2).
Таблица 2: Митохондриальный потенциал MRC5-SV40, обработанных "Абисилом- 1" или носителем (контроль) (данные представляют собой среднюю интенсивность флуоресценции при окрашивании TMRM, нормализованную по соответствующим контрольным образцам)
Treatment with "Abisil-1" caused an approximately 2-fold decrease in mitochondrial potential (p<0.05 (p<0.01)) (see Fig. 2 and table 2). Table 2: Mitochondrial potential of MRC5-SV40 treated with Abisil-1 or vehicle (control) (data are mean TMRM staining fluorescence intensity normalized to respective controls)
Таким образом, "Абисил-1" вызывает снижение митохондриального потенциала в иммортализованных клетках MRC5 и фибробластах легких Lech-4. Thus, "Abisil-1" causes a decrease in mitochondrial potential in immortalized MRC5 cells and Lech-4 lung fibroblasts.
Пример 3: Влияние "Абисила" на интенсивность аутофагии и митофагии Example 3: Influence of "Abisil" on the intensity of autophagy and mitophagy
В данном примере оценивали влияние "Абисила" на интенсивность аутофагии и митофагии черз 24 и 72 ч. In this example, the effect of "Abisil" on the intensity of autophagy and mitophagy was evaluated after 24 and 72 hours.
Оценку аутофагии проводили путем оценки количества комплексов LC3II в клетках MRC5-SV40, определяемого Вестерн-блоттингом. На фиг. 3 приведены результаты денситометрического анализа комплексов LC3II относительно внутреннего контроля, которые представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, рассчитанного по трем независимым экспериментам. The assessment of autophagy was performed by assessing the number of LC3II complexes in MRC5-SV40 cells, determined by Western blotting. In FIG. 3 shows the results of the densitometric analysis of the LC3II complexes relative to the internal control, which are presented as the mean ± standard deviation calculated from three independent experiments.
Отмечается существенное повышение содержания комплексов LC3II (более чем в 10 раз) при обработке "Абисилом" в концентрации 50 мкг/мл, что свидетельствует об эффективной стимуляции аэрофагии в клетках. There is a significant increase in the content of LC3II complexes (more than 10 times) when treated with "Abisil" at a concentration of 50 μg/ml, which indicates an effective stimulation of aerophagia in cells.
Пример 4: Влияние "Абисила" на снижение митофагии Example 4: Effect of "Abisil" on the reduction of mitophagy
Уменьшение митохондриального потенциала "Абисилом" может означать, что он индуцирует митофагию. Для изучения этого вводили конструкцию, кодирующую репортерную конструкцию GFP-mCherry-FIS 1 в клетках MRC5-SV40, которая позволяет обнаруживать возможную фрагментацию митохондрий и активацию митофагии. FIS1 представляет собой белок, закрепленный на внешней митохондриальной мембране, и поэтому солокализованные GFP и mCherry будут давать желтый сигнал. Флуоресценция
GFP гасится в лизосомах из-за низкого значения pH, и поэтому можно обнаружить расщепленные митохондрии в фаголизомах по красной флуоресценции (см. фиг. 4). A decrease in the mitochondrial potential of "Abisilom" may mean that it induces mitophagy. To study this, a construct was introduced encoding the GFP-mCherry-FIS 1 reporter construct in MRC5-SV40 cells, which allows detection of possible mitochondrial fragmentation and mitophagy activation. FIS1 is a protein anchored to the outer mitochondrial membrane and therefore colocalized GFP and mCherry will give a yellow signal. Fluorescence GFP is quenched in lysosomes due to the low pH and therefore split mitochondria can be detected in phagolysomes by red fluorescence (see FIG. 4).
Действительно, после 24-часовой обработки "Абисил" вызвал образование множественных митофагосом. Однако "Абисил" не вызывал общей фрагментации митохондрий даже после 72-часовой обработки. Indeed, after a 24-hour treatment, "Abisil" caused the formation of multiple mitophagosomes. However, "Abisil" did not cause a general fragmentation of mitochondria even after 72 hours of treatment.
Далее определяли влияние обработки препаратом "Абисил" на клетках Lech-4 и исследовали солокализацию красителей в ходе окрашивания красным красителем Mitotracker Red с зеленым красителем Lysotracker Green, который окрашивает кислотные компартменты (лизосомы) в живых клетках. Наблюдается увеличение количества фаголизосом, однако они не солокализуются с красителем Mitotracker Red, что указывает на то, что "Абисил" способствует аутофагии, но специфически не вызывает фрагментацию митохондрий в эмбриональных фибробластах.
Next, the effect of Abisil treatment on Lech-4 cells was determined and dye colocalization was studied during staining with Mitotracker Red with Lysotracker Green, which stains acidic compartments (lysosomes) in living cells. An increase in the number of phagolysosomes is observed, but they do not colocalize with the Mitotracker Red dye, which indicates that Abisil promotes autophagy, but does not specifically cause mitochondrial fragmentation in embryonic fibroblasts.
Claims
1. Способ стимуляции аутофагии в клетках, предусматривающий обработку клеток индуктором на основе терпеноидов, отличающийся тем, что в качестве такого индуктора на основе терпеноидов используют в эффективной концентрации индуктор, извлеченный из растений семейства Pinaceae и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. 1. A method for stimulating autophagy in cells, involving the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, characterized in that such an inductor based on terpenoids is used in an effective concentration of an inductor extracted from plants of the Pinaceae family and having the following physical constants: acid number from 70 to 90 , saponification number from 100 to 130, essential number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что индуктор на основе терпеноидов используют в концентрации от 0,05 до 200 мкг/мл, предпочтительно от 45 до 200 мкг/мл. 2. The method according to claim 1, characterized in that the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 μg/ml, preferably 45 to 200 μg/ml.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что длительность обработки клеток индуктором на основе терпеноидов составляет от 6 до 72 ч, предпочтительно 16 ч. 3. The method according to p. 1, characterized in that the duration of treatment of cells with an inductor based on terpenoids is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
4. Способ по п. 1 , отличающийся тем, что в качестве индуктора на основе терпеноидов используют препарат «Абисил», «Абисил-1» или «Абисил-2» с целевой добавкой. 4. The method according to p. 1, characterized in that the drug "Abisil", "Abisil-1" or "Abisil-2" with a target additive is used as an inductor based on terpenoids.
5. Способ по одному из пп. 1-4, отличающийся тем, что клетки имеют происхождение из неопухолевых тканей. 5. The method according to one of paragraphs. 1-4, characterized in that the cells originate from non-tumor tissues.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что клетки содержатся в субъекте. 6. The method of claim. 5, characterized in that the cells are contained in the subject.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что клетки находятся ex vivo или in vitro. 7. The method according to any one of paragraphs. 1-6, characterized in that the cells are ex vivo or in vitro.
8. Способ стимуляции аутофагии у субъекта, со стадией введения в организм субъекту эффективной дозы индуктора, отличающийся тем, что в качестве такого индуктора используют индуктор на основе терпеноидов, извлеченный из растений семейства Pinaceae и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52 и стимуляция аутофагии обеспечивает лечение состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией. 8. A method for stimulating autophagy in a subject, with the step of introducing an effective dose of an inductor into the body of the subject, characterized in that such an inducer is a terpenoid-based inducer extracted from plants of the Pinaceae family and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, a saponification number of 100 to 130, an ester number of 10 to 60, a refractive index of 1.50 to 1.52, and autophagy stimulation provide treatment for a condition associated with mitochondrial dysfunction.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что состояние, ассоциированное с митохондриальной дисфункцией, выбрано из состояния, включающего мутации и/или эпигенетические нарушения митохондриального или ядерного генома, приводящие к нарушению митофагии, дефектам морфологии митохондрий и нарушениям мембранного потенциала митохондрий, и состояния, включающего лизосомные болезни накопления.
9. The method according to claim 8, characterized in that the condition associated with mitochondrial dysfunction is selected from a condition including mutations and / or epigenetic disorders of the mitochondrial or nuclear genome, leading to a violation of mitophagy, defects in mitochondrial morphology and disturbances in the mitochondrial membrane potential, and conditions including lysosomal storage diseases.
10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что индуктор на основе терпеноидов вводят в организм субъекта в дозе от 4 до 40 мг/кг, предпочтительно от 4 до 24 мг/кг. 10. The method according to claim 8, characterized in that the terpenoid-based inducer is administered to the subject at a dose of 4 to 40 mg/kg, preferably 4 to 24 mg/kg.
11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что в качестве индуктора на основе терпеноидов используют препарат «Абисил», «Абисил-1» или «Абисил-2» с целевой добавкой.
11. The method according to p. 8, characterized in that the drug "Abisil", "Abisil-1" or "Abisil-2" with a target additive is used as an inductor based on terpenoids.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202180079913.5A CN116710113A (en) | 2020-09-30 | 2021-11-29 | Method for stimulating autophagy |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020126675A RU2765414C1 (en) | 2020-09-30 | 2020-09-30 | Method for stimulating mitophagy and autophagy in cells, method for stimulating autophagy or mitophagy for treating a condition associated with mitochondrial dysfunction |
RU2020126675 | 2020-09-30 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2022071829A1 true WO2022071829A1 (en) | 2022-04-07 |
Family
ID=80214595
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/RU2021/000526 WO2022071829A1 (en) | 2020-09-30 | 2021-11-29 | Method for stimulating autophagy |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116710113A (en) |
RU (1) | RU2765414C1 (en) |
WO (1) | WO2022071829A1 (en) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2198653C1 (en) * | 2002-03-29 | 2003-02-20 | Пинигина Нина Максимовна | Polyactive rectal or vaginal suppositories based upon natural terpenes enriched with monoterpenoids for treating and/or prophylaxis of urological, proctological and gynecological diseases |
RU2338547C1 (en) * | 2007-02-16 | 2008-11-20 | Людмила Анатольевна Лацерус | Polyactive terpenoid substance abisil-2, pharmaceutical composition on its basis and ways of its application |
WO2013178965A2 (en) * | 2012-06-01 | 2013-12-05 | Societe Industrielle Limousine D'application Biologique | Active ingredients activating mitophagy in skin cells and use of same for improving skin condition |
AU2016101736A4 (en) * | 2016-09-29 | 2016-11-03 | Macau University Of Science And Technology | Triterpenoid obtainable from hedera helix for treatment of neurodegenerative diseases |
CN111603474A (en) * | 2020-02-25 | 2020-09-01 | 浙江省人民医院 | Application of glaucescent fissistigma root extract C21 steroid in preparation of medicine for promoting gastric cancer cell apoptosis |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2054945C1 (en) * | 1995-06-28 | 1996-02-27 | Нина Максимовна Пинигина | Agent showing antiinflammatory, antibacterial and wound-healing activities |
-
2020
- 2020-09-30 RU RU2020126675A patent/RU2765414C1/en active
-
2021
- 2021-11-29 WO PCT/RU2021/000526 patent/WO2022071829A1/en active Application Filing
- 2021-11-29 CN CN202180079913.5A patent/CN116710113A/en active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2198653C1 (en) * | 2002-03-29 | 2003-02-20 | Пинигина Нина Максимовна | Polyactive rectal or vaginal suppositories based upon natural terpenes enriched with monoterpenoids for treating and/or prophylaxis of urological, proctological and gynecological diseases |
RU2338547C1 (en) * | 2007-02-16 | 2008-11-20 | Людмила Анатольевна Лацерус | Polyactive terpenoid substance abisil-2, pharmaceutical composition on its basis and ways of its application |
WO2013178965A2 (en) * | 2012-06-01 | 2013-12-05 | Societe Industrielle Limousine D'application Biologique | Active ingredients activating mitophagy in skin cells and use of same for improving skin condition |
AU2016101736A4 (en) * | 2016-09-29 | 2016-11-03 | Macau University Of Science And Technology | Triterpenoid obtainable from hedera helix for treatment of neurodegenerative diseases |
CN111603474A (en) * | 2020-02-25 | 2020-09-01 | 浙江省人民医院 | Application of glaucescent fissistigma root extract C21 steroid in preparation of medicine for promoting gastric cancer cell apoptosis |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2765414C1 (en) | 2022-01-31 |
CN116710113A (en) | 2023-09-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhou et al. | Schizandrin A protects against cerebral ischemia-reperfusion injury by suppressing inflammation and oxidative stress and regulating the AMPK/Nrf2 pathway regulation | |
Yao et al. | Luteolin could improve cognitive dysfunction by inhibiting neuroinflammation | |
US11419890B2 (en) | Compositions prepared from poultry and methods of their use | |
Chen Shang et al. | Erythropoietin and Wnt1 govern pathways of mTOR, Apaf-1, and XIAP in inflammatory microglia | |
Lim et al. | Dicaffeoylquinic acids alleviate memory loss via reduction of oxidative stress in stress-hormone-induced depressive mice | |
JP2014532048A (en) | Use of glycolipoprotein gintonin isolated and identified from carrot as a natural medicinal plant-derived ligand | |
Ferrini et al. | Effect of ginger, Paullinia cupana, muira puama and l-citrulline, singly or in combination, on modulation of the inducible nitric oxide-NO-cGMP pathway in rat penile smooth muscle cells | |
US20230248797A1 (en) | Method for preparing medicine with Chinese yam protein extract for treating erectile dysfunction | |
Wang et al. | Lipin1 alleviates autophagy disorder in sciatic nerve and improves diabetic peripheral neuropathy | |
Yao et al. | Mesenchymal stem cell attenuates spinal cord injury by inhibiting mitochondrial quality control-associated neuronal ferroptosis | |
Zhou et al. | Cannabinoid receptor 2 promotes the intracellular degradation of HMGB1 via the autophagy-lysosome pathway in macrophage | |
WO2015073598A1 (en) | Extracts of rosemary or hemerocallis fulva and methods of using same to promote circadian rhythm | |
RU2765414C1 (en) | Method for stimulating mitophagy and autophagy in cells, method for stimulating autophagy or mitophagy for treating a condition associated with mitochondrial dysfunction | |
KR101734093B1 (en) | A pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory disease containing the purified bee venom which was reduced allergen, as a active ingredient | |
JP6607655B1 (en) | Lipocalin-type prostaglandin D2 synthase production promoter | |
EA046526B1 (en) | METHOD FOR STIMULATING AUTOPHAGY | |
Ou et al. | Spermidine ameliorates osteoarthritis via altering macrophage polarization | |
Li et al. | Alkaloid from Angelicae dahuricae inhibits HeLa cell growth by inducing apoptosis and increasing caspase-3 activity | |
WO2022210296A1 (en) | Oxytocin signal enhancer and oxytocin-induced keratinocyte proliferation-promoting agent | |
CN110141594A (en) | The drug for treating Alzheimer's disease | |
Kong et al. | Smilax china Polyphenols Stimulate Browning via β 3-Adrenergic Receptor/AMP-Activated Protein Kinase α Signaling Pathway in 3T3-L1 Adipocytes | |
Chen et al. | The Role of the AMPK Pathway in ZEA-induced Cell-cycle Arrest in Rat Sertoli Cells | |
Chen et al. | Nicotine induces a dual effect on the beige-like phenotype in adipocytes | |
TW201733573A (en) | Use of Antrodia camphorata compound for manufacturing medicament in treating and preventing neurodegenerative diseases having the compound represented by formula I with R1 being hydrogen or an acetyl group | |
윤담지 | The effects of skin-derived oxytocin or serotonin on brain function and skin aging in mice |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 21876069 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 202180079913.5 Country of ref document: CN |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 21876069 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |