WO2022071829A1 - Method for stimulating autophagy - Google Patents

Method for stimulating autophagy Download PDF

Info

Publication number
WO2022071829A1
WO2022071829A1 PCT/RU2021/000526 RU2021000526W WO2022071829A1 WO 2022071829 A1 WO2022071829 A1 WO 2022071829A1 RU 2021000526 W RU2021000526 W RU 2021000526W WO 2022071829 A1 WO2022071829 A1 WO 2022071829A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
inducer
abisil
autophagy
terpenoid
Prior art date
Application number
PCT/RU2021/000526
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Фания Иршатовна МАГАНОВА
Анастасия Валерьевна Липатова
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Инитиум-Фарм"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Инитиум-Фарм" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Инитиум-Фарм"
Priority to CN202180079913.5A priority Critical patent/CN116710113A/en
Publication of WO2022071829A1 publication Critical patent/WO2022071829A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/13—Coniferophyta (gymnosperms)
    • A61K36/15—Pinaceae (Pine family), e.g. pine or cedar
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to the field of medicine, namely, to methods for stimulating mitophagy and autophagy in a cell, involving the treatment of cells with a terpenoid-based inducer extracted from plants of the coniferous (Pinaceae) family, such as fir, pine or cedar, to methods for stimulating autophagy or mitophagy for treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction.
  • a terpenoid-based inducer to stimulate mitophagy and autophagy in a cell
  • a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy or mitophagy to treat a condition associated with mitochondrial dysfunction.
  • geroprotectors Compounds that can slow down aging, so-called geroprotectors, usually slow down the onset of aging and related diseases and reduce the risk of mortality.
  • geroprotectors that activate the process of mitophagy in cells either chemical compounds of a certain composition, obtained chemically, or multicomponent mixtures, usually of an indefinite composition and extracted from plant materials or waste products of yeasts and microorganisms, are usually used as an active ingredient (inducer).
  • a method for the prevention or treatment of a neurodegenerative disorder in a subject which involves the introduction into his body in a therapeutically effective amount of an inducer agent that increases Nix-mediated mitophagy in the cell, or rather, increases the biological activity or expression of the Nix polypeptide, its fragment, variant or an analogue and/or polypeptide of GABARAP-L1, its fragment, variant or analogue in a cell and containing the indicated components (US 2019/091291 A1).
  • a method for activating mitophagy in skin cells which consists in exposing skin cells to a cosmetic composition containing an active substance (inductor) extracted from at least one plant selected from Helianthus annuus, Ceratonia siliqua, Nigella sativa, Withania somnifera, Secale Comutum, Sesamum indicum, Ophiopogon japonicus, Alisma plantago-aquatica, Oryza sativa, Tropaeolum majus, Cichorium intybus, Prunus persica, Verbena officinalis, Panicum miliaceum, Rosa canina, Camelina sativa and Phaseolus vulgaris, or from specific algae or yeasts specific species, as well as adjuvants and excipients (WO 2013/178965).
  • an active substance extracted from at least one plant selected from Helianthus annuus, Ceratonia siliqua, Nigella sativa, Withania somnifera, Secale Comutum
  • the known method is based on the use of an active substance extracted from plants, some of which grow in tropical countries or are cultivated in small quantities as an imported plant. Since the composition and properties of the active substances contained in plants depend on the conditions of their growth, the therapeutic effect of the substances isolated from them is unstable. Many of these plants contain not one, but a whole set of biologically active substances of multidirectional action, and some of them, for example, substances contained in Secale Comutum, Alisma plantago-aquatica, have a strong toxic effect, cause addiction (Withania somnifera) or are simply not used in official medicine in Russia (Ophiopogon japonicus). For these reasons, the known method is industrially inapplicable without additional time-consuming research.
  • Stimulation of autophagy which includes mitophagy as a special case, also promotes cell health and has a positive therapeutic effect on the subject, although, unlike mitophagy, not all mechanisms of the healing action of autophagy have been fully elucidated.
  • methods for stimulating autophagy and pharmaceutical preparations for this purpose There are a number of methods for stimulating autophagy and pharmaceutical preparations for this purpose.
  • substances of chemical origin of a simple composition compared to substances of plant origin are used (WO 2019/204183, JP 2019218316, KR 20190114900, US 2019/160033, US 2019/336483).
  • WO 2019/099531 proposes the use of a synergistic combination of compounds from at least two and preferably three classes of compounds in an autophagy-stimulating inducer. Due to this, some increase in the efficiency of the method is achieved, but not the expansion of the scope of its effective application.
  • WO 2019/204183 proposes seven options for a method of treating or promoting hair growth by administering to a subject one or more autophagy-inducing agents of chemical origin. Each of the variants of this method uses its own specific combination of agents. The very abundance of the proposed options suggests that none of them is uniquely and in all cases effective.
  • autophagy-inducing substances of chemical origin used according to the above-mentioned prior art are xenobiotics for cells and organisms, additionally load their metabolizing and eliminating systems, and can cause side reactions.
  • a method for activating autophagy of skin cells in order to detoxify or prevent aging which consists in applying to the skin a cosmetic composition containing, as an active ingredient (inducer), a biological substance extracted from algae, yeast or plants selected from the group Lithothamnium calcareum, Yarrowia lipolytica, Melilotus officinalis, Citrus limonum, Candida saitoana, Lens culinaris, Averrhoa carambola, Momordica charantia, as well as adjuvants and excipients.
  • an active ingredient in order to detoxify or prevent aging
  • a cosmetic composition containing, as an active ingredient (inducer), a biological substance extracted from algae, yeast or plants selected from the group Lithothamnium calcareum, Yarrowia lipolytica, Melilotus officinalis, Citrus limonum, Candida saitoana, Lens culinaris, Averrhoa carambola, Momordica charanti
  • coumarin contained in the herb of sweet clover (Melilotus officinalis), has a depressant effect on the central nervous system and has a narcotic effect.
  • the bioactive ingredient which is derived from Candida saitoana yeast, is so toxic that it is used as a pesticide.
  • the present invention was based on the task of proposing methods for stimulating autophagy and mitophagy of cells by exposing cells to an inducer, the active principle of which is selected from a wide range of inexpensive, accessible and non-toxic terpenoids obtained from plants from the Pinaceae family common in the Russian wild nature: the genus Spruce (Picla ), the genus pine (Pinus), the genus cedar (Cedrus) and the genus fir (Abies).
  • an inducer the active principle of which is selected from a wide range of inexpensive, accessible and non-toxic terpenoids obtained from plants from the Pinaceae family common in the Russian wild nature: the genus Spruce (Picla ), the genus pine (Pinus), the genus cedar (Cedrus) and the genus fir (Abies).
  • Another object of the present invention was to develop methods for stimulating autophagy or mitophagy for the treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject using said inducer.
  • Another object of the present invention was to provide a terpenoid-based inducer suitable for use in stimulating mitophagy and autophagy in a cell and suitable for use in stimulating autophagy or mitophagy to treat a condition associated with mitochondrial dysfunction.
  • the technical result of using the solution proposed in the invention is to increase the stability and effectiveness of the effect on cells and to reduce the toxicity of herbal preparations that stimulate the process of eliminating dysfunctional cell components by autophagy and mitophagy, leading to relief and treatment of conditions associated with mitochondrial dysfunction.
  • an inductor extracted from plants of the Pinaceae family is used as such an inductor based on terpenoids, for example: spruce (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), and having the following physical constants: acid value from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ether value from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
  • the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 ⁇ g/ml, preferably 45 to 200 ⁇ g/ml.
  • the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
  • the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
  • Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art.
  • the cells when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells.
  • the inducer In carrying out the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or tissues, it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy.
  • Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
  • the preparation "Abisil”, “Abisil-1” or “Abisil-2” can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted supplement that is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
  • preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example a 3-15% by weight oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
  • oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
  • the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 ⁇ g/ml, preferably 45 to 200 ⁇ g/ml.
  • the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
  • the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
  • Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art.
  • the cells when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells.
  • the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or canals it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy.
  • the introduction of the inducer can be carried out in various ways, for example, by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary administration, administration by inhalation or by intrabronchial, oral or rectal administration.
  • Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
  • a targeted additive which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
  • preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of a saline solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
  • oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
  • a terpenoid-based inducer extracted from plants is used as such an inducer.
  • a terpenoid-based inducer extracted from plants is used as such an inducer.
  • the family Pinaceae for example: the genus spruce (Picla), the genus pine (Pinus), the genus cedar (Cedrus) and the genus fir (Abies), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, essential number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
  • the subject is a person.
  • a condition associated with mitochondrial dysfunction is selected from a condition including mutations and/or epigenetic abnormalities of the mitochondrial or nuclear genome leading to disruption of mitophagy, defects in mitochondrial morphology, and disturbances in mitochondrial membrane potential, and a condition including lysosomal storage diseases.
  • the terpenoid inducer is administered to the subject at a dose of 4 to 40 mg/kg body weight, preferably 4 to 24 mg/kg body weight.
  • the introduction of the inducer can be carried out in various ways, for example, by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary administration, administration by inhalation or by intrabronchial, oral or rectal administration.
  • Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, linseed, soybean, coconut or argan oil. and vitamin E.
  • preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
  • oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
  • This technical result is further achieved through the use of an inductor based on terpenoids to stimulate mitophagy in cells.
  • This application involves the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, which inductor is used in an effective concentration of an inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies ), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
  • the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 ⁇ g/ml, preferably 45 to 200 ⁇ g/ml.
  • the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
  • the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
  • Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art.
  • the cells when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells.
  • the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or tissues it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy.
  • the inducer can be administered in a variety of ways, for example by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhalation, or intrabronchial, oral or rectal administration.
  • Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
  • a targeted additive which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
  • preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
  • oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
  • a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy in cells.
  • This application involves the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, which inductor is used in an effective concentration of an inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies ), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
  • the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 ⁇ g/ml, preferably 45 to 200 ⁇ g/ml.
  • the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
  • the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
  • Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art.
  • it is possible to culture the cells in the presence of the inducer in the culture medium, or by adding the inducer to the cells.
  • it can, for example, be introduced into the body of the subject in ways known to the person skilled in the art, especially any of the ways that are commonly used in the field of gene therapy.
  • Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
  • Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
  • a targeted additive which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
  • preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
  • oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
  • a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy or mitophagy for the treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject.
  • Said use includes the step of administering the inductor at an effective dose to the subject.
  • a terpenoid-based inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
  • the subject is a person.
  • a condition associated with mitochondrial dysfunction is selected from a condition including mutations and/or epigenetic abnormalities of the mitochondrial or nuclear genome leading to disruption of mitophagy, defects in mitochondrial morphology, and disturbances in mitochondrial membrane potential, and a condition including lysosomal storage diseases.
  • the terpenoid inducer is administered to the subject at a dose of 4 to 40 mg/kg body weight, preferably 4 to 24 mg/kg body weight.
  • Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
  • Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, linseed, soybean, coconut or argan oil. and vitamin E.
  • preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
  • oil solution in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil
  • an active substance based on terpenoids extracted from plants of the Pinaceae family for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), stability of the process and result of activation of autophagy and mitophagy in cells with the complete exclusion of the possibility of toxic effects on the cell, which is explained by the stability of the composition and characteristics and the absence of toxicity of the original plant material extracted from these plants.
  • terpenoid-based inducer and, in particular, the preparation "Abisil”, “Abisil-1” or “Abisil-2” as such or with a target additive allows to achieve a significant activation of autophagy and mitophagy in cells without the need to use terpenoid-based inducers with others parameters that are obtained using a different technology and the effectiveness of which has yet to be tested and proved.
  • the drug "Abisil-2” and the method of its production are described in patent RU 2338547.
  • the drug “Abisil-2” is obtained on the basis of a capsular extract of plants of the Pinaceae family subjected to short-term stress, and contains the following components: sequiterpenoids 3-6 wt.%, neutral diterpenoids 11-15 wt.%, diterpenic acids 23-24 wt.%, triterpene acids 8-16 wt.%, unsaturated and saturated fatty acids 0.1-0.3 wt.%, phenolic compounds 0, 1-0, 2 wt.%, monoterpenoids the rest, while the content of bornylacetate monoterpenoid should be at least 10.0 wt.% of the total composition of terpenoids.
  • the terpenoid composition is a thick liquid with a color from yellow transparent to milky white with a specific odor and has the following physical constants: acid number 70-90, saponification number 100-130, ester number 10-60, refractive index 1.500-1.520.
  • FIG. 1 evaluation of the metabolic activity of cells treated with “Abisil” in various concentrations
  • FIG. 2 is an assessment of the decrease in mitochondrial potential induced by “Abisil” in immortalized MRC5 cells and Lech-4 lung fibroblasts
  • FIG. 3 evaluation of the effect of pre-treatment "Abisil” on the accumulation of the light chain 3 conjugate and phosphatidylethanolamine (LC3II) in transformed SV-40 embryonic lung fibroblasts (MRC5-V40) according to the results of densitometric analysis relative to internal control
  • Fig. 1 evaluation of the metabolic activity of cells treated with “Abisil” in various concentrations
  • FIG. 3 evaluation of the effect of pre-treatment "Abisil” on the accumulation of the light chain 3 conjugate and phosphatidylethanolamine (LC3II) in transformed SV-40 embryonic lung fibroblasts (MRC5-V40) according to the results of densitometric analysis relative to internal control
  • A B - control sample (DMSO, 0.5%), C - 24-hour treatment at a concentration of 25 ⁇ g/ml, D - 24-hour treatment at a concentration of 50 ⁇ g/ml, E - 72-hour treatment at a concentration of 25 ⁇ g/ml, F - 72-hour treatment at a concentration of 50 ⁇ g/ml.
  • MRC5-SV40 and Lech-4 cells were seeded in 12-well plates at 40,000 cells per well. The next day, Abisil was treated in a wide range of concentrations (25-200 ⁇ g/ml). After 16 h, the cells were stained with JuonM and 200 nM tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM, Thermofisher Scientific) for 30 min at 37°C. As a positive control, 1 kM rotenone and JuMKM oxidative phosphorylation uncoupler carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) (Sigma-Aldrich) were used.
  • TMRM nM tetramethylrhodamine methyl ester
  • DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
  • Cells were treated with Abisil at concentrations of 50 ⁇ g/ml and 25 kg/ml for 24 or 72 hours.
  • Axiovert 200 microscopes (Carl Zeiss) and a Leica confocal microscope (Leica Microsystems) were used for imaging.
  • MRC5-SV40 cells were seeded in a 96-well plate at 5,000 cells per well, cultured in 100 ⁇ l of DMEM (Dulbecco's modified nutrient medium) with 5% FBS (fetal bovine serum) at 37°C and incubated for 48 h. Next, during the day was treated with the drug "Abisil” (at a concentration of 0, 9, 11, 15, 25, 50, 93, 125, 147 and 186 ⁇ g/ml) at 37°C. The level of cell metabolism was assessed using the MTS test (CellTiter 96® kit for non-radioactive cell proliferation assay (MTT), Promega) according to the manufacturer's protocol.
  • MTS test CellTiter 96® kit for non-radioactive cell proliferation assay (MTT), Promega
  • the optical density of the colored substance proportional to the level of metabolism of viable cells, was measured at 590 nm using a tablet reader (Tesal). Then, the IC50 values were calculated by regression analysis, as well as the concentrations at which the most intensive cellular metabolism was observed.
  • Lech-4 cells were cultured on Petri dishes with a diameter of 35 mm and at a confluence of 50% treated with the drug "Abisil” in 5% DMEM with 5% FBS at 37°C overnight. After incubation, cells were washed with cold PBS (phosphate buffered saline) and lysed in 200 ⁇ l of reporter lysis buffer (Promega) containing a protease inhibitor cocktail (No. P8349, Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. The lysates were centrifuged for 15 min at 12000g and the total protein content in the protein supernatant was measured according to Bradford.
  • reporter lysis buffer Promega
  • protease inhibitor cocktail No. P8349, Sigma-Aldrich
  • Proteins were separated by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of 12% sodium dodecyl sulfate (SDS) according to Laemmli and electrotransferred to an Amersham Hybond P PVDF membrane, 0.45 ⁇ m (Amersham Biosciences, GE Healthcare) in Tovbin transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% (v/v) ethanol, pH 8.3). The membranes were blocked in 4% skimmed milk in PBS (PBS with 0.05% Tween 20) for 1 hour at room temperature. Incubation with primary antibodies was performed overnight at 4° C.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the cells were treated with the Abisil preparation in the form of resin from OOO Initium-Pharm.
  • Abisil was dissolved in DMSO.
  • Example 1 Influence of "Abisil” on the metabolic activity of cells.
  • the effect of 48-hour treatment with “Abisil” on the metabolic activity of cells was studied using the MTT test on lines of embryonic pulmonary fibroblasts (MRC5-SV40 and Lech-4).
  • "Abisil” showed a significant dose-dependence (see Fig. 1).
  • the calculated IC50 values were 149.3 ⁇ 0.67 for MRC5-SV40 and 152.6 ⁇ 0.52 ⁇ g/ml for Lech-4, respectively (Table 1).
  • both cell lines showed a significant increase in metabolic activity (p ⁇ 0.001) when treated with drugs at low concentrations (9-15 ⁇ g/ml).
  • Immortalized MRC5 cells and Lech-4 lung fibroblasts (MRC5-SV40 (A)) were incubated at a ratio of 1:4000 with Abisil-1 overnight, stained with TMRM, and dye fluorescence was measured in the PE channel.
  • the black histogram in Figure 2 represents Abisil-1 treated cells; the gray histogram represents control cells in Figure 2.
  • the assessment of autophagy was performed by assessing the number of LC3II complexes in MRC5-SV40 cells, determined by Western blotting.
  • FIG. 3 shows the results of the densitometric analysis of the LC3II complexes relative to the internal control, which are presented as the mean ⁇ standard deviation calculated from three independent experiments.
  • a decrease in the mitochondrial potential of "Abisilom” may mean that it induces mitophagy.
  • a construct was introduced encoding the GFP-mCherry-FIS 1 reporter construct in MRC5-SV40 cells, which allows detection of possible mitochondrial fragmentation and mitophagy activation.
  • FIS1 is a protein anchored to the outer mitochondrial membrane and therefore colocalized GFP and mCherry will give a yellow signal. Fluorescence GFP is quenched in lysosomes due to the low pH and therefore split mitochondria can be detected in phagolysomes by red fluorescence (see FIG. 4).

Abstract

The invention relates to medicine, more particularly to methods for stimulating mitophagy and autophagy in cells, which comprise treating cells with an inducer, and to methods for stimulating autophagy or mitophagy for treating a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject, the methods comprising a step of administering the inducer in an effective dose into the organism of the subject. The inducer used is a terpenoid-based inducer, which is isolated from plants of the family Pinaceae and has the following physical characteristics: an acid number of 70 to 90, a saponification number of 100 to 130, an ester number of 10 to 60, and a refractive index of 1.50 to 1.52. The invention makes it possible to increase the stability and effectiveness of the action on cells and to reduce the toxicity of the plant-based preparations, and to stimulate the process of elimination of dysfunctional parts of the cells by autophagy and mitophagy and results in arresting and treating conditions associated with mitochondrial dysfunction.

Description

СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ АУТОФАГИИ METHOD FOR STIMULATION OF AUTOPHAGY
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно, к способам стимуляции митофагии и аутофагии в клетке, предусматривающим обработку клеток индуктором на базе терпеноидов, извлеченным из растений семейства хвойных (Pinaceae), например пихты, сосны или кедра, к способам стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению индуктора на основе терпеноидов для стимуляции митофагии и аутофагии в клетке и к применению индуктора на основе терпеноидов для стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией. The present invention relates to the field of medicine, namely, to methods for stimulating mitophagy and autophagy in a cell, involving the treatment of cells with a terpenoid-based inducer extracted from plants of the coniferous (Pinaceae) family, such as fir, pine or cedar, to methods for stimulating autophagy or mitophagy for treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction. In addition, the present invention relates to the use of a terpenoid-based inducer to stimulate mitophagy and autophagy in a cell, and to the use of a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy or mitophagy to treat a condition associated with mitochondrial dysfunction.
Продолжительность жизни в экономически развитых странах постепенно увеличивается. Однако качество жизни людей с возрастом ухудшается, поскольку люди пожилого возраста часто страдают неизлечимыми заболеваниями. Life expectancy in economically developed countries is gradually increasing. However, the quality of life of people deteriorates with age, as older people often suffer from incurable diseases.
Изменения в образе жизни за последние десятилетия (например, переедание, малоподвижный образ жизни) привели к увеличению числа людей с избыточным весом или ожирением, часто являющимся признаками и причинами таких состояний, как диабет и болезни сердца. Lifestyle changes over the past decades (eg, overeating, sedentary lifestyle) have led to an increase in the number of people who are overweight or obese, often signs and causes of conditions such as diabetes and heart disease.
Исследованиями доказано, что если сосредоточиться не на конкретных болезнях старения, а на самих механизмах старения, можно добиться более значительного продления здорового периода жизни (Brian К. Kennedy и др., "Geroscience: Linking Aging to Chronic Disease", журнал Cell, № 159 от 6 ноября 2014, cc. 709-713, https://www.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25417146). Studies have shown that by focusing on the mechanisms of aging rather than specific diseases of aging, a greater prolongation of healthy lifespan can be achieved (Brian K. Kennedy et al., "Geroscience: Linking Aging to Chronic Disease", Cell, no. 159 November 6, 2014, pp. 709-713, https://www.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25417146).
Клеточное старение все чаще признается в качестве основной, связанной со старением причины потери здоровья и физической формы. Стареющие клетки, продолжая вырабатывать новые митохондрии, накапливают дисфункциональные и дефектные митохондрии. Митофагия, т.е. утилизация дефектных и дисфункциональных митохондрий посредством аутофагии, в стареющих клетках проходит вяло, угасает. Cellular aging is increasingly recognized as a major aging-related cause of loss of health and fitness. Aging cells, while continuing to produce new mitochondria, accumulate dysfunctional and defective mitochondria. Mitophagy, i.e. utilization of defective and dysfunctional mitochondria through autophagy, in aging cells is sluggish, fades away.
В настоящее время существует единодушное мнение, что нарушенная митофагия играет ключевую роль в развитии дегенеративных заболеваний, связанных со старением. Поэтому основное внимание в борьбе с рядом заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, деменция, застойная сердечная недостаточность, саркопения, диабет 2-го типа, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, рак, заболевания печени и поджелудочной железы, глазные заболевания, артрит, катаракта, остеопороз, гипертония и любые их комбинации, уделяется уже не симптоматическому лечению конкретного заболевания, а поиску путей активизации митофагии. Currently, there is a consensus that impaired mitophagy plays a key role in the development of degenerative diseases associated with aging. Therefore, the main focus in the fight against a number of diseases, such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, dementia, congestive heart failure, sarcopenia, type 2 diabetes, age-related macular degeneration (AMD), atherosclerosis, cardiovascular disease, cancer, liver and pancreatic disease, eye disease, arthritis, cataracts, osteoporosis, hypertension, and any combination thereof, is given to no longer symptomatic treatment a specific disease, but the search for ways to activate mitophagy.
Соединения, которые могут замедлять старение, так называемые геропротекторы, обычно замедляют наступление старения и сопутствующих заболеваний и снижают риски смертности. В геропротекторах, активирующих процесс митофагии в клетках, в качестве активного действующего вещества (индуктора) обычно используют либо химические соединения определенного состава, полученные химическим путем, либо многокомпонентные смеси, обычно не точно определенного состава и извлеченные из растительного сырья или продуктов жизнедеятельности дрожжей и микроорганизмов. Compounds that can slow down aging, so-called geroprotectors, usually slow down the onset of aging and related diseases and reduce the risk of mortality. In geroprotectors that activate the process of mitophagy in cells, either chemical compounds of a certain composition, obtained chemically, or multicomponent mixtures, usually of an indefinite composition and extracted from plant materials or waste products of yeasts and microorganisms, are usually used as an active ingredient (inducer).
Так, например, известен способ профилактики или лечения нейро дегенеративного расстройства у субъекта, предусматривающий введение в его организм в терапевтически эффективном количестве агента-индуктора, увеличивающего Nix-опосредованную митофагию в клетке, а точнее увеличивающего биологическую активность или экспрессию полипептида Nix, его фрагмента, варианта или аналога и/или полипептида GABARAP-L1, его фрагмента, варианта или аналога в клетке и содержащего указанные компоненты (US 2019/091291 А1). For example, a method is known for the prevention or treatment of a neurodegenerative disorder in a subject, which involves the introduction into his body in a therapeutically effective amount of an inducer agent that increases Nix-mediated mitophagy in the cell, or rather, increases the biological activity or expression of the Nix polypeptide, its fragment, variant or an analogue and/or polypeptide of GABARAP-L1, its fragment, variant or analogue in a cell and containing the indicated components (US 2019/091291 A1).
Недостатками известного способа являются технологическая сложность и высокая стоимость получения вещества, используемого в качестве индуктора, а также отсутствие полиактивности. Эти недостатки присущи всем другим известным способам, предусматривающим использование в качестве индуктора веществ химического происхождения, являющихся для клеток ксенобиотиками. The disadvantages of the known method are the technological complexity and the high cost of obtaining a substance used as an inductor, as well as the lack of polyactivity. These shortcomings are inherent in all other known methods involving the use of substances of chemical origin as an inductor, which are xenobiotics for cells.
Известны также приемы для улучшения здоровья людей, особенно пожилых или слабых людей, заключающиеся в активации митофагии в клетках путем перорального введения в течение определенного времени определенных доз фармацевтической композиции на основе уролитинов, являющихся метаболитами, происходящими из продуктов микрофлоры толстой кишки млекопитающих (US 2018/256538 и US 2018/256539). Недостатками такого подхода являются высокая стоимость действующего вещества, обусловленная специфическими особенностями обработки исходного сырья и технологически сложным процессом выделения из него действующего начала, а также в первую очередь нестабильность фармакологического действия, варьирующегося от вполне эффективного до токсического. Наиболее близким к предлагаемому в изобретении является способ активации митофагии в клетках кожи, заключающийся в воздействии на клетки кожи косметическим составом, содержащим активное вещество (индуктор), извлеченное из по крайней мере одного растения, выбранного из Helianthus annuus, Ceratonia siliqua, Nigella sativa, Withania somnifera, Secale Comutum, Sesamum indicum, Ophiopogon japonicus, Alisma plantago- aquatica, Oryza sativa, Tropaeolum majus, Cichorium intybus, Prunus persica, Verbena officinalis, Panicum miliaceum, Rosa canina, Camelina sativa и Phaseolus vulgaris, либо из водорослей конкретных видов или дрожжей конкретных видов, а также адъюванты и вспомогательные вещества (WO 2013/178965). There are also known methods to improve the health of people, especially the elderly or weak people, consisting in the activation of mitophagy in cells by oral administration for a certain time of certain doses of a pharmaceutical composition based on urolithins, which are metabolites derived from the products of the microflora of the colon of mammals (US 2018/256538 and US 2018/256539). The disadvantages of this approach are the high cost of the active substance, due to the specific features of the processing of the feedstock and the technologically complex process of isolating the active principle from it, as well as, first of all, the instability of the pharmacological action, ranging from quite effective to toxic. Closest to what is proposed in the invention is a method for activating mitophagy in skin cells, which consists in exposing skin cells to a cosmetic composition containing an active substance (inductor) extracted from at least one plant selected from Helianthus annuus, Ceratonia siliqua, Nigella sativa, Withania somnifera, Secale Comutum, Sesamum indicum, Ophiopogon japonicus, Alisma plantago-aquatica, Oryza sativa, Tropaeolum majus, Cichorium intybus, Prunus persica, Verbena officinalis, Panicum miliaceum, Rosa canina, Camelina sativa and Phaseolus vulgaris, or from specific algae or yeasts specific species, as well as adjuvants and excipients (WO 2013/178965).
Известный способ основан на использовании активного вещества, извлекаемого из растений, часть из которых произрастает в тропических странах либо которые культивируются в незначительных объемах как привозное растение. Поскольку состав и свойства активных веществ, содержащихся в растениях, зависят от условий их произрастания, терапевтическое действие выделенных из них веществ нестабильно. Многие из указанных растений одержат не одно, а целый набор биологически активных веществ разнонаправленного действия, причем некоторые из них, например вещества, содержащиеся в Secale Comutum, Alisma plantago-aquatica, обладают сильным токсическим действием вызывает привыкание (Withania somnifera) или просто не применяются в официальной медицине в России (Ophiopogon japonicus). По указанным причинам известный способ промышленно неприменим без проведения дополнительных трудоемких исследований. The known method is based on the use of an active substance extracted from plants, some of which grow in tropical countries or are cultivated in small quantities as an imported plant. Since the composition and properties of the active substances contained in plants depend on the conditions of their growth, the therapeutic effect of the substances isolated from them is unstable. Many of these plants contain not one, but a whole set of biologically active substances of multidirectional action, and some of them, for example, substances contained in Secale Comutum, Alisma plantago-aquatica, have a strong toxic effect, cause addiction (Withania somnifera) or are simply not used in official medicine in Russia (Ophiopogon japonicus). For these reasons, the known method is industrially inapplicable without additional time-consuming research.
Стимулирование аутофагии, охватывающей митофагию как частный случай, также способствует оздоровлению клеток и оказывает на субъекта положительный терапевтический эффект, хотя в отличие от митофагии и не все механизмы оздоравливающего действия аутофагии выяснены до конца. Известен ряд способов стимулирования аутофагии и фармацевтических препаратов для этой цели. Stimulation of autophagy, which includes mitophagy as a special case, also promotes cell health and has a positive therapeutic effect on the subject, although, unlike mitophagy, not all mechanisms of the healing action of autophagy have been fully elucidated. There are a number of methods for stimulating autophagy and pharmaceutical preparations for this purpose.
В преобладающей части препаратов в качестве активного вещества-индуктора используются вещества химического происхождения несложного по сравнению с веществами растительного происхождения состава (WO 2019/204183, JP 2019218316, KR 20190114900, US 2019/160033, US 2019/336483). In the predominant part of the preparations, as an active substance-inducer, substances of chemical origin of a simple composition compared to substances of plant origin are used (WO 2019/204183, JP 2019218316, KR 20190114900, US 2019/160033, US 2019/336483).
Соответственно, активность таких веществ является узконаправленной, а известные препараты применяются главным образом в косметических целях, когда трудно установить, является ли терапевтический эффект следствием воздействия активного вещества или целевых добавок. В WO 2019/099531 предложено использовать в составе индуктора, стимулирующего аутофагию, синергетическую комбинацию соединений, по меньшей мере, из двух, а предпочтительно трех классов соединений. Благодаря этому достигается некоторое повышение эффективности способа, но не расширение сферы его эффективного применения. Accordingly, the activity of such substances is narrowly focused, and known drugs are used mainly for cosmetic purposes, when it is difficult to establish whether the therapeutic effect is due to the action of the active substance or targeted additives. WO 2019/099531 proposes the use of a synergistic combination of compounds from at least two and preferably three classes of compounds in an autophagy-stimulating inducer. Due to this, some increase in the efficiency of the method is achieved, but not the expansion of the scope of its effective application.
Для устранения этого недостатка в WO 2019/204183 было предложено семь вариантов способа лечения или стимулирования роста волос путем введения субъекту одного или нескольких индуцирующих аутофагию агентов химического происхождения. В каждом из вариантов этого способа используется собственное определенное сочетание агентов. Само обилие предложенных вариантов говорит о том, что ни один из них не является однозначно и во всех случаях эффективным. To address this shortcoming, WO 2019/204183 proposes seven options for a method of treating or promoting hair growth by administering to a subject one or more autophagy-inducing agents of chemical origin. Each of the variants of this method uses its own specific combination of agents. The very abundance of the proposed options suggests that none of them is uniquely and in all cases effective.
Кроме того, используемые согласно вышеуказанному уровню техники индуцирующие аутофагию вещества химического происхождения являются ксенобиотиками для клеток и организмов, дополнительно нагружают их метаболизирующие и элиминирующие системы и могут стать причиной развития побочных реакций. In addition, autophagy-inducing substances of chemical origin used according to the above-mentioned prior art are xenobiotics for cells and organisms, additionally load their metabolizing and eliminating systems, and can cause side reactions.
В значительно меньшей степени указанные недостатки присущи фитопрепаратам, содержащим в качестве активного вещества растительные компоненты или продукты их переработки. To a much lesser extent, these disadvantages are inherent in phytopreparations containing plant components or products of their processing as an active substance.
Из US 8512764 известен способ активации аутофагии клеток кожи с целью ее детоксикации или предотвращения старения, заключающийся в нанесении на кожу косметической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента (индуктора) биологическую субстанцию, извлекаемую из водорослей, дрожжей или растений, выбираемых из группы Lithothamnium calcareum, Yarrowia lipolytica, Melilotus officinalis, Citrus limonum, Candida saitoana, Lens culinaris, Averrhoa carambola, Momordica charantia, a также адъюванты и вспомогательные вещества. From US 8512764, a method is known for activating autophagy of skin cells in order to detoxify or prevent aging, which consists in applying to the skin a cosmetic composition containing, as an active ingredient (inducer), a biological substance extracted from algae, yeast or plants selected from the group Lithothamnium calcareum, Yarrowia lipolytica, Melilotus officinalis, Citrus limonum, Candida saitoana, Lens culinaris, Averrhoa carambola, Momordica charantia, as well as adjuvants and excipients.
Активные вещества части вышеуказанных растений вызывают ряд нежелательных побочных эффектов. Так, в частности, кумарин, содержащийся в траве донника лекарственного (Melilotus officinalis), оказывает угнетающее действиена центральную нервную систему и обладает наркотическим действием. The active substances of a part of the above plants cause a number of undesirable side effects. So, in particular, coumarin, contained in the herb of sweet clover (Melilotus officinalis), has a depressant effect on the central nervous system and has a narcotic effect.
Биоактивный ингредиент, который получают из дрожжей вида кандида саитоана (Candida saitoana), настолько токсичен, что используется в качестве пестицида. The bioactive ingredient, which is derived from Candida saitoana yeast, is so toxic that it is used as a pesticide.
Вещества, содержащиеся в карамболе (Averrhoa carambola), токсичны для уремических пациентов. Токсичны также вещества, содержащиеся в момордике (Momordica charantia). Ввиду токсичности активных веществ сфера применения этого известного способа ограничена косметическими процедурами, относящимися к лечению кожи или уходу за ней. Substances contained in carambola (Averrhoa carambola) are toxic to uremic patients. The substances contained in momordica (Momordica charantia) are also toxic. Due to the toxicity of the active substances, the scope of this known method is limited to cosmetic procedures related to the treatment of the skin or skin care.
Наиболее близким к предлагаемому в изобретении является описанный в AU 2016101736 способ индуцирования аутофагии в клетках путем их контакта с тритерпиноидом, экстрагируемым из плюща обыкновенного (Hedera helix). Такой способ предложен для лечения нейро дегенеративных заболеваний, а именно: болезни Паркинсона или болезни Хантингтона. Closest to what is proposed in the invention is described in AU 2016101736 method of inducing autophagy in cells by contact with a triterpinoid extracted from common ivy (Hedera helix). Such a method has been proposed for the treatment of neurodegenerative diseases, namely Parkinson's disease or Huntington's disease.
Недостатком этого способа является ограниченность сферы его применения лечением вышеуказанных болезней, обусловленная, вероятно, свойствами конкретного тритерпеноида, выделяемого из плюща. К настоящему времени установлено существование в растениях около 10000 терпенов и терпеноидов, функции большинства которых еще неизвестны. Кроме того, листья и плоды плюща ядовиты, и поэтому для снижения токсичности препарата приходится прибегать к технологически сложной многоступенчатой процедуре выделения нужного тритерпеноида из листьев и плодов плюща. The disadvantage of this method is the limited scope of its application in the treatment of the above diseases, probably due to the properties of a particular triterpenoid isolated from ivy. To date, the existence of about 10,000 terpenes and terpenoids in plants has been established, the functions of most of which are still unknown. In addition, the leaves and fruits of ivy are poisonous, and therefore, in order to reduce the toxicity of the drug, one has to resort to a technologically complex multi-stage procedure for isolating the desired triterpenoid from ivy leaves and fruits.
В основу настоящего изобретения была положена задача предложить способы стимуляции аутофагии и митофагии клеток путем воздействия на клетки индуктором, активное начало которого выбрано из широкого набора недорогих, доступных и нетоксичных терпеноидов, получаемых из распространенных в дикой природе России растений из семейства Pinaceae: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies). The present invention was based on the task of proposing methods for stimulating autophagy and mitophagy of cells by exposing cells to an inducer, the active principle of which is selected from a wide range of inexpensive, accessible and non-toxic terpenoids obtained from plants from the Pinaceae family common in the Russian wild nature: the genus Spruce (Picla ), the genus pine (Pinus), the genus cedar (Cedrus) and the genus fir (Abies).
Другая задача настоящего изобретения состояла в разработке способов стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией у субъекта, с использованием указанного индуктора. Еще одна задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы предложить индуктор на основе терпеноидов, пригодный для применения для стимуляции митофагии и аутофагии в клетке и пригодный для применения для стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией. Another object of the present invention was to develop methods for stimulating autophagy or mitophagy for the treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject using said inducer. Another object of the present invention was to provide a terpenoid-based inducer suitable for use in stimulating mitophagy and autophagy in a cell and suitable for use in stimulating autophagy or mitophagy to treat a condition associated with mitochondrial dysfunction.
Технический результат от использования предлагаемого в изобретении решения состоит в повышении стабильности и эффективности воздействия на клетки и в снижении токсичности препаратов растительного происхождения, стимулирующих процесс устранения дисфункциональных компонентов клеток путем аутофагии и митофагии, приводящий к купированию и лечению состояний, ассоциированных с митохондриальной дисфункцией. The technical result of using the solution proposed in the invention is to increase the stability and effectiveness of the effect on cells and to reduce the toxicity of herbal preparations that stimulate the process of eliminating dysfunctional cell components by autophagy and mitophagy, leading to relief and treatment of conditions associated with mitochondrial dysfunction.
Указанный технический результат достигается благодаря тому, что при осуществлении способа стимуляции митофагии в клетках предлагаемым в изобретении способом, предусматривающего обработку клеток индуктором на основе терпеноидов, в качестве такого индуктора на основе терпеноидов используют в эффективной концентрации индуктор, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is achieved due to the fact that when implementing the method for stimulating mitophagy in cells according to the invention, which involves treating cells with a terpenoid-based inductor, an inductor extracted from plants of the Pinaceae family is used as such an inductor based on terpenoids, for example: spruce (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), and having the following physical constants: acid value from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ether value from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
В одном из предпочтительных вариантов индуктор на основе терпеноидов используют в концентрации от 0,05 до 200 мкг/мл, предпочтительно от 45 до 200 мкг/мл. In one preferred embodiment, the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 μg/ml, preferably 45 to 200 μg/ml.
В еще одном предпочтительном варианте длительность обработки клеток индуктором на основе терпеноидов составляет от 6 до 72 ч, предпочтительно 16 ч. In another preferred embodiment, the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
В еще одном предпочтительном варианте клетки имеют происхождение из неопухолевых тканей, содержатся в субъекте или находятся ex vivo или in vitro. In yet another preferred embodiment, the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
Обработку можно осуществлять путями и способами, известными специалистам в данной области. Так, например, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа in vitro для приведения в контакт клеток и ингибитора можно культивировать клетки в присутствии индуктора в культуральной среде или путем добавления индуктора к клеткам. Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art. For example, when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells.
При осуществлении предлагаемого в изобретении способа ex vivo для приведения индуктора в контакт с клетками или тканями его можно, например, вводить в организм субъекта путями, которые известны специалисту в данной области, прежде всего любым из путей, которые обычно применяют в области генной терапии. Введение индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного, интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. In carrying out the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or tissues, it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy. Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил- 2", как таковой или с целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In yet another preferred embodiment, the preparation "Abisil", "Abisil-1" or "Abisil-2" can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted supplement that is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массемасляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массемасляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example a 3-15% by weight oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Указанный технический результат достигается также благодаря тому, что при осуществлении способа стимуляции аутофагии в клетках, предусматривающего обработку клеток индуктором на основе терпеноидов, в качестве такого индуктора на основе терпеноидов используют в эффективной концентрации индуктор, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is also achieved due to the fact that when implementing a method for stimulating autophagy in cells, involving the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, an inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla ), genus pine (Pinus), genus cedar (Cedrus) and genus fir (Abies), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ether number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
В одном из предпочтительных вариантов индуктор на основе терпеноидов используют в концентрации от 0,05 до 200 мкг/мл, предпочтительно от 45 до 200 мкг/мл. In one preferred embodiment, the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 μg/ml, preferably 45 to 200 μg/ml.
В еще одном предпочтительном варианте длительность обработки клеток индуктором на основе терпеноидов составляет от 6 до 72 ч, предпочтительно 16 ч. In another preferred embodiment, the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
В еще одном предпочтительном варианте клетки имеют происхождение из неопухолевых тканей, содержатся в субъекте или находятся ex vivo или in vitro. In yet another preferred embodiment, the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
Обработку можно осуществлять путями и способами, известными специалистам в данной области. Так, например, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа in vitro для приведения в контакт клеток и ингибитора можно культивировать клетки в присутствии индуктора в культуральной среде или путем добавления индуктора к клеткам. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа ex vivo для приведения индуктора в контакт с клетками или канями его можно, например, вводить в организм субъекта путями, которые известны специалисту в данной области, прежде всего любым из путей, которые обычно применяют в области генной терапии. Введение индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного, интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art. For example, when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells. In carrying out the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or canals, it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy. The introduction of the inducer can be carried out in various ways, for example, by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary administration, administration by inhalation or by intrabronchial, oral or rectal administration.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил- 2", как таковой или с целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In another preferred embodiment, Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массе сляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массе масляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of a saline solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Указанный технический результат достигается также благодаря тому, что при осуществлении способа стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией у субъекта, со стадией введения индуктора в эффективной дозе в организм субъекта в качестве такого индуктора используют индуктор на основе терпеноидов, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is also achieved due to the fact that when implementing a method for stimulating autophagy or mitophagy for treating a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject, with the stage of introducing an inductor in an effective dose into the subject's body, a terpenoid-based inducer extracted from plants is used as such an inducer. of the family Pinaceae, for example: the genus spruce (Picla), the genus pine (Pinus), the genus cedar (Cedrus) and the genus fir (Abies), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, essential number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
Субъектом является человек. The subject is a person.
Состояние, ассоциированное с митохондриальной дисфункцией, выбрано из состояния, включающего мутации и/или эпигенетические нарушения митохондриального или ядерного генома, приводящие к нарушению митофагии, дефектам морфологии митохондрий и нарушениям мембранного потенциала итохондрий, и состояния, включающего лизосомные болезни накопления. A condition associated with mitochondrial dysfunction is selected from a condition including mutations and/or epigenetic abnormalities of the mitochondrial or nuclear genome leading to disruption of mitophagy, defects in mitochondrial morphology, and disturbances in mitochondrial membrane potential, and a condition including lysosomal storage diseases.
В одном из предпочтительных вариантов, индуктор на основе терпеноидов вводят в организм субъекта в дозе от 4 до 40 мг/кг веса тела, предпочтительно в дозе от 4 до 24 мг/кг веса тела. In one embodiment, the terpenoid inducer is administered to the subject at a dose of 4 to 40 mg/kg body weight, preferably 4 to 24 mg/kg body weight.
Введение индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного, интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. The introduction of the inducer can be carried out in various ways, for example, by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary administration, administration by inhalation or by intrabronchial, oral or rectal administration.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил-2" как таковой или с целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In another preferred embodiment, Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, linseed, soybean, coconut or argan oil. and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массе масляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массе масляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Указанный технический результат достигается далее благодаря применению индуктора на основе терпеноидов для стимуляции митофагии в клетках. Указанное применение предусматривает обработку клеток индуктором на основе терпеноидов, в качестве какового индуктора используют в эффективной концентрации индуктор, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is further achieved through the use of an inductor based on terpenoids to stimulate mitophagy in cells. This application involves the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, which inductor is used in an effective concentration of an inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies ), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
В одном из предпочтительных вариантов индуктор на основе терпеноидов используют в концентрации от 0,05 до 200 мкг/мл, предпочтительно от 45 до 200 мкг/мл. In one preferred embodiment, the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 μg/ml, preferably 45 to 200 μg/ml.
В еще одном предпочтительном варианте длительность обработки клеток индуктором на основе терпеноидов составляет от 6 до 72 ч, предпочтительно 16 . In another preferred embodiment, the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
В еще одном предпочтительном варианте клетки имеют происхождение из неопухолевых тканей, содержатся в субъекте или находятся ex vivo или in vitro. In yet another preferred embodiment, the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
Обработку можно осуществлять путями и способами, известными специалистам в данной области. Так, например, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа in vitro для приведения в контакт клеток и ингибитора можно культивировать клетки в присутствии индуктора в культуральной среде или путем добавления индуктора к клеткам. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа ex vivo для приведения индуктора в контакт с клетками или тканями его можно, например, вводить в организм субъекта путями, которые известны специалисту в данной области, прежде всего любым из путей, которые обычно применяют в области генной терапии. Введение индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного, интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art. For example, when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, the cells can be cultured in the presence of the inducer in the culture medium or by adding the inducer to the cells. In carrying out the ex vivo method of the invention for bringing the inducer into contact with cells or tissues, it can, for example, be introduced into the subject's body by routes known to the person skilled in the art, in particular by any of the routes that are commonly used in the field of gene therapy. Introduction The inducer can be administered in a variety of ways, for example by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhalation, or intrabronchial, oral or rectal administration.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил-2", как таковой или с целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In another preferred embodiment, Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массе масляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массе масляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Указанный технический результат достигается также благодаря применению индуктора на основе терпеноидов для стимуляции аутофагии в клетках. Указанное применение предусматривает обработку клеток индуктором на основе терпеноидов, в качестве какового индуктора используют в эффективной концентрации индуктор, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is also achieved through the use of a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy in cells. This application involves the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, which inductor is used in an effective concentration of an inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies ), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
В одном из предпочтительных вариантов индуктор на основе терпеноидов используют в концентрации от 0,05 до 200 мкг/мл, предпочтительно от 45 до 200 мкг/мл. In one preferred embodiment, the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 μg/ml, preferably 45 to 200 μg/ml.
В еще одном предпочтительном варианте длительность обработки клеток индуктором на основе терпеноидов составляет от 6 до 72 ч, предпочтительно 16 ч. In another preferred embodiment, the duration of treatment of cells with a terpenoid-based inducer is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
В еще одном предпочтительном варианте клетки имеют происхождение из неопухолевых тканей, содержатся в субъекте или находятся ex vivo или in vitro. In yet another preferred embodiment, the cells are of non-tumor tissue origin, are contained in a subject, or are found ex vivo or in vitro.
Обработку можно осуществлять путями и способами, известными специалистам в данной области. Так, например, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа in vitro для приведения в контакт клеток и ингибитора можно культивировать клетки в присутствии индуктора в культуральной среде ли путем добавления индуктора к клеткам. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа ex vivo для приведения индуктора в контакт с клетками или тканями его можно, например, вводить в организм субъекта путями, которые известны специалисту в данной области, прежде всего любым из путей, которые обычно применяют в области генной терапии. Введение индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного, интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. Processing can be carried out in ways and methods known to those skilled in the art. Thus, for example, when carrying out the in vitro method of the invention for bringing cells into contact with an inhibitor, it is possible to culture the cells in the presence of the inducer in the culture medium, or by adding the inducer to the cells. When implementing the method according to the invention ex vivo to bring of the inducer into contact with cells or tissues, it can, for example, be introduced into the body of the subject in ways known to the person skilled in the art, especially any of the ways that are commonly used in the field of gene therapy. Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил-2", как таковой или с целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In another preferred embodiment, Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer, as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массе масляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массе масляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Указанный технический результат достигается далее благодаря применению индуктора на основе терпеноидов для стимуляции аутофагии или митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией у субъекта. Указанное применение предусматривает стадию введения индуктора в эффективной дозе в организм субъекта. В качестве такого индуктора используют индуктор на основе терпеноидов, извлеченный из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. This technical result is further achieved through the use of a terpenoid-based inducer to stimulate autophagy or mitophagy for the treatment of a condition associated with mitochondrial dysfunction in a subject. Said use includes the step of administering the inductor at an effective dose to the subject. As such an inductor, a terpenoid-based inductor extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, saponification number from 100 to 130, ester number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
Субъектом является человек. The subject is a person.
Состояние, ассоциированное с митохондриальной дисфункцией, выбрано из состояния, включающего мутации и/или эпигенетические нарушения митохондриального или ядерного генома, приводящие к нарушению митофагии, дефектам морфологии митохондрий и нарушениям мембранного потенциала митохондрий, и состояния, включающего лизосомные болезни накопления. В одном из предпочтительных вариантов, индуктор на основе терпеноидов вводят в организм субъекта в дозе от 4 до 40 мг/кг веса тела, предпочтительно в дозе от 4 до 24 мг/кг веса тела. A condition associated with mitochondrial dysfunction is selected from a condition including mutations and/or epigenetic abnormalities of the mitochondrial or nuclear genome leading to disruption of mitophagy, defects in mitochondrial morphology, and disturbances in mitochondrial membrane potential, and a condition including lysosomal storage diseases. In one embodiment, the terpenoid inducer is administered to the subject at a dose of 4 to 40 mg/kg body weight, preferably 4 to 24 mg/kg body weight.
Введение индуктора можно осуществлять различными путями, например путем внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, подкожного, чрескожного, внутритрахеального, внутримышечного введения, местного применения, внутрикожного, интраназального, легочного введения, введения путем ингаляции или путем внутрибронхиального, орального или ректального введения. Administration of the inducer may be by various routes, for example, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal, pulmonary, inhaled, or intrabronchial, oral, or rectal.
В еще одном предпочтительном варианте в качестве индуктора на основе терпеноидов можно использовать препарат "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил-2" как таковой или с целевой добавкой, представляющей собой оливковое, подсолнечное, льняное, соевое, кокосовое или аргановое масло и витамин Е. In another preferred embodiment, Abisil, Abisil-1 or Abisil-2 can be used as a terpenoid-based inducer as such or with a targeted additive, which is olive, sunflower, linseed, soybean, coconut or argan oil. and vitamin E.
Указанные препараты можно вводить перорально или наружно, например в виде 3- 20%-ного по массе масляного раствора, например 3-15%-ного по массе масляного раствора, в частности 3%-ного, 4%-ного, 5%-ного или 15%-ного по массе масляного раствора (в оливковом, подсолнечном, льняном, соевом, кокосовом или аргановом масле), в виде капсул, липосом, спреев, крема и других лекарственных форм. These preparations can be administered orally or externally, for example in the form of a 3-20% by weight oil solution, for example 3-15% by weight of an oil solution, in particular 3%, 4%, 5% or 15% by weight oil solution (in olive, sunflower, flaxseed, soybean, coconut or argan oil), in the form of capsules, liposomes, sprays, creams and other dosage forms.
Благодаря использованию действующего вещества на основе терпеноидов, извлеченных из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), достигается стабильная и существенная активизации аутофагии и митофагии в клетках при полном исключении возможности токсического воздействия на клетку. Through the use of an active substance based on terpenoids extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), a stable and significant activation of autophagy and mitophagy in cells is achieved. with the complete exclusion of the possibility of toxic effects on the cell.
Благодаря использованию действующего вещества на основе терпеноидов, извлеченных из растений семейства Pinaceae, например: рода ель (Picla), рода сосна (Pinus), рода кедр (Cedrus) и рода пихта (Abies), достигается стабильность процесса и результата активизации аутофагии и митофагии в клетках при полном исключении возможности токсического воздействия на клетку, что бъясняется стабильностью состава и характеристик и отсутствием токсичности исходного растительного сырья, извлекаемого из указанных растений. Thanks to the use of an active substance based on terpenoids extracted from plants of the Pinaceae family, for example: spruce genus (Picla), pine genus (Pinus), cedar genus (Cedrus) and fir genus (Abies), stability of the process and result of activation of autophagy and mitophagy in cells with the complete exclusion of the possibility of toxic effects on the cell, which is explained by the stability of the composition and characteristics and the absence of toxicity of the original plant material extracted from these plants.
Использование указанного выше индуктора на основе терпеноидов и, в частности, препарата "Абисил", "Абисил-1" или "Абисил-2" как такового или с целевой добавкой позволяет добиться существенной активизации аутофагии и митофагии в клетках без необходимости использования индукторов на основе терпеноидов с другими параметрами, которые получены по иной технологии и эффективность действия которых еще только предстоит проверять и доказывать. The use of the aforementioned terpenoid-based inducer and, in particular, the preparation "Abisil", "Abisil-1" or "Abisil-2" as such or with a target additive allows to achieve a significant activation of autophagy and mitophagy in cells without the need to use terpenoid-based inducers with others parameters that are obtained using a different technology and the effectiveness of which has yet to be tested and proved.
Препараты "Абисил-1" и "Абисил" и способы их получения описаны в патентах RU 2054945, RU 2198653. Preparations "Abisil-1" and "Abisil" and methods for their preparation are described in patents RU 2054945, RU 2198653.
Препарат "Абисил-2" и способ его получения описаны в патенте RU 2338547. Препарат "Абисил-2" получен на основе капсульного экстракта растений семейства Pinaceae, подверженных кратковременному стрессовому воздействию, и содержит следующие компоненты: секвитерпеноиды 3-6 масс.%, нейтральные дитерпеноиды 11-15 масс.%, дитерпеновые кислоты 23-24 масс.%, тритерпеновые кислоты 8-16 масс.%, ненасыщенные и насыщенные жирные кислоты 0, 1-0,3 масс.%, фенольные соединения 0, 1-0,2 масс.%, монотерпеноиды остальное, при этом содержание монотерпеноида борнилацетата должно составлять не менее 10,0 масс.% от общего состава терпеноидов. The drug "Abisil-2" and the method of its production are described in patent RU 2338547. The drug "Abisil-2" is obtained on the basis of a capsular extract of plants of the Pinaceae family subjected to short-term stress, and contains the following components: sequiterpenoids 3-6 wt.%, neutral diterpenoids 11-15 wt.%, diterpenic acids 23-24 wt.%, triterpene acids 8-16 wt.%, unsaturated and saturated fatty acids 0.1-0.3 wt.%, phenolic compounds 0, 1-0, 2 wt.%, monoterpenoids the rest, while the content of bornylacetate monoterpenoid should be at least 10.0 wt.% of the total composition of terpenoids.
Терпеноидная композиция представляет собой густую жидкость с цветом от желтого прозрачного до молочно-белого со специфическим запахом и имеет следующие физические константы: кислотное число 70-90, число омыления 100-130, эфирное число 10-60, показатель преломления 1,500-1,520. The terpenoid composition is a thick liquid with a color from yellow transparent to milky white with a specific odor and has the following physical constants: acid number 70-90, saponification number 100-130, ester number 10-60, refractive index 1.500-1.520.
Ниже сущность изобретения поясняется со ссылкой на прилагаемые к описанию графические материалы, на которых показано: на фиг. 1- оценка метаболической активности клеток, обработанных "Абисилом" в различных концентрациях, на фиг. 2 - оценка снижения митохондриального потенциала, вызванного "Абисилом" в иммортализованных клетках MRC5 и фибробластах легких Lech-4, на фиг. 3 - оценка влияния предварительной обработки "Абисилом" на накопление конъюгата легкой цепи 3 и фосфатидилэтаноламина (LC3II) в трансформированных SV-40 эмбриональных фибробластах легкого (MRC5-V40) по результатам денситометрического анализа относительно внутреннего контроля и на фиг. 4 - оценка митофагии в клетках MRC5-SV40 при обработке препаратом в концентрациях 25 и 50 мкг/мл через 24 и 72 ч: А, В - контрольный образец (ДМСО, 0,5%), С - 24-часовая обработка в концентрации 25 мкг/мл, D - 24-часовая обработка в концентрации 50 мкг/мл, Е - 72-часовая обработка в концентрации 25 мкг/мл, F — 72- часовая обработка в концентрации 50 мкг/мл. Below, the essence of the invention is explained with reference to the accompanying drawings, which show: in Fig. 1- evaluation of the metabolic activity of cells treated with "Abisil" in various concentrations, in fig. 2 is an assessment of the decrease in mitochondrial potential induced by "Abisil" in immortalized MRC5 cells and Lech-4 lung fibroblasts, FIG. 3 - evaluation of the effect of pre-treatment "Abisil" on the accumulation of the light chain 3 conjugate and phosphatidylethanolamine (LC3II) in transformed SV-40 embryonic lung fibroblasts (MRC5-V40) according to the results of densitometric analysis relative to internal control and Fig. 4 - assessment of mitophagy in MRC5-SV40 cells when treated with the drug at concentrations of 25 and 50 μg / ml after 24 and 72 hours: A, B - control sample (DMSO, 0.5%), C - 24-hour treatment at a concentration of 25 µg/ml, D - 24-hour treatment at a concentration of 50 µg/ml, E - 72-hour treatment at a concentration of 25 µg/ml, F - 72-hour treatment at a concentration of 50 µg/ml.
Возможность осуществления изобретения может быть подтверждена следующими примерами. The possibility of carrying out the invention can be confirmed by the following examples.
Оценка митохондриального потенциала Assessment of mitochondrial potential
Клетки MRC5-SV40 и Lech-4 высевали на 12-луночные планшеты по 40000 клеток на лунку. На следующий день проводили обработку препаратом "Абисил" в широком диапазоне концентраций (25-200 мкг/мл). Через 16 ч клетки окрашивали ЮОнМ и 200нМ метиловым эфиром тетраметилродамина (TMRM) фирма Thermofisher Scientific) в течение 30 мин при 37°С. В качестве положительного контроля использовали 1 кМ ротенон и ЮмкМ разобщитель окислительного фосфорилирования, представляющий собой карбонилцианид-4-(трифторметокси)фенилгидразон (FCCP) (фирма Sigma-Aldrich). Перед измерением клетки окрашивали на жизнеспособность с помощью 4',6-диамидино-2- фенилиндола (DAPI) (фирма Sigma-Aldrich) в концентрации 1 мкг/мл. Флуоресценцию детектировали с помощью цитофлуориметра BD LSRFortessa (фирма Beckman Dickinson). Анализ проводили с помощью программы Flowing Software 2.0 (фирма Perttu Terho, Turku Centre for Biotechnology). Результаты получены на основе трех независимых экспериментов с тремя биологическими повторностями. MRC5-SV40 and Lech-4 cells were seeded in 12-well plates at 40,000 cells per well. The next day, Abisil was treated in a wide range of concentrations (25-200 μg/ml). After 16 h, the cells were stained with JuonM and 200 nM tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM, Thermofisher Scientific) for 30 min at 37°C. As a positive control, 1 kM rotenone and JuMKM oxidative phosphorylation uncoupler carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) (Sigma-Aldrich) were used. Prior to measurement, cells were stained for viability with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma-Aldrich) at a concentration of 1 μg/ml. Fluorescence was detected using a BD LSRFortessa cytometer (Beckman Dickinson). Analysis was performed using Flowing Software 2.0 (Perttu Terho, Turku Center for Biotechnology). The results are based on three independent experiments with three biological replicates.
Оценка аутофагии и митофагии Assessment of autophagy and mitophagy
Оценку аутофагии проводили на панели клеточных линий, стабильно экспрессирующих репортерную конструкцию из 2 слитых белков EGFP (зеленый флуоресцентный белок) и LC3. Обработку препаратом "Абисил" проводили в широком диапазоне концентраций (25-200 мкг/мл) в течение 16 часов. В качестве положительного контроля использовали рапамицин (R0395, фирма Sigma-Aldrich). Для оценки митофагии использовали линию клеток MRC5-SV40, стабильно экспрессирующих репортерную конструкцию EGFP-mCherry-FIS 1 , которая содержит два флуоресцентных белка и в которой тандемная метка mCherry-GFP прикреплена к сигналу локализации наружной митохондриальной мембраны, полученному из митохондриального белка FIS1 (аминокислоты 101-152). В качестве положительного контроля использовали FCCP (фирма Sigma-Aldrich). Autophagy was assessed on a panel of cell lines stably expressing a reporter construct of 2 fusion proteins EGFP (green fluorescent protein) and LC3. Treatment with the drug "Abisil" was carried out in a wide range of concentrations (25-200 µg/ml) for 16 hours. Rapamycin (R0395, Sigma-Aldrich) was used as a positive control. Mitophagy was assessed using the MRC5-SV40 cell line, which stably expresses the EGFP-mCherry-FIS 1 reporter construct, which contains two fluorescent proteins and in which the mCherry-GFP tandem tag is attached to the outer mitochondrial membrane localization signal derived from the mitochondrial FIS1 protein (amino acids 101 -152). FCCP (Sigma-Aldrich) was used as a positive control.
Клетки обрабатывали препаратом "Абисил" в концентрациях 50 мкг/мл и 25 кг/мл в течение 24 или 72 часов. Cells were treated with Abisil at concentrations of 50 μg/ml and 25 kg/ml for 24 or 72 hours.
Для детекции митофагии в клетках Lech-4 их обрабатывали препаратом Абисил" в концентрациях 25 мкг/мл и 50 мкг/мл в течение 24 или 72 часов. По окончании инкубации клетки в течение 20 минут окрашивали при 37°С 200нМ потенциал-зависимым красителем митохондрий MitoTracker Red CMXRos фирма Thermofisher Scientific), 100нМ LysoTracker Green (фирма Thermofisher cientific). To detect mitophagy in Lech-4 cells, they were treated with Abisil at concentrations of 25 μg/ml and 50 μg/ml for 24 or 72 hours. After incubation, the cells were stained for 20 minutes at 37°C with 200 nM voltage-dependent mitochondrial dye MitoTracker Red CMXRos from Thermofisher Scientific), 100nM LysoTracker Green from Thermofisher scientific.
Для получения изображений использовали микроскопы Axiovert 200 (фирма Carl Zeiss) и конфокальный микроскоп Leica (фирма Leica Microsystems). Axiovert 200 microscopes (Carl Zeiss) and a Leica confocal microscope (Leica Microsystems) were used for imaging.
МТТ-анализ MTT analysis
Клетки линии MRC5-SV40 высевали в 96-луночный планшет по 5000 клеток на лунку, культивировали в 100 мкл среды DMEM (питательная среда, модифицированная по способу Дульбекко) с 5% FBS (фетальная бычья сыворотка) при 37°С и инкубировали в течение 48 ч. Далее в течение суток обрабатывали препаратом "Абисил" (в концентрации 0, 9, 11, 15, 25, 50, 93, 125, 147 и 186 мкг/мл) при 37°С. Оценку уровня метаболизма клеток проводили с помощью MTS-теста (набор CellTiter 96® для нерадиоактивного анализа пролиферации клеток (МТТ), фирма Promega) в соответствии с протоколом производителя. Оптическую плотность окрашенного вещества, пропорциональную уровню метаболизма жизнеспособных клеток, измеряли при 590 нм с помощью планшетного ридера (фирма Тесал). Затем методом регрессионного анализа вычисляли значения IC50, а также концентрации, при которых наблюдался наиболее интенсивный клеточный метаболизм. MRC5-SV40 cells were seeded in a 96-well plate at 5,000 cells per well, cultured in 100 μl of DMEM (Dulbecco's modified nutrient medium) with 5% FBS (fetal bovine serum) at 37°C and incubated for 48 h. Next, during the day was treated with the drug "Abisil" (at a concentration of 0, 9, 11, 15, 25, 50, 93, 125, 147 and 186 µg/ml) at 37°C. The level of cell metabolism was assessed using the MTS test (CellTiter 96® kit for non-radioactive cell proliferation assay (MTT), Promega) according to the manufacturer's protocol. The optical density of the colored substance, proportional to the level of metabolism of viable cells, was measured at 590 nm using a tablet reader (Tesal). Then, the IC50 values were calculated by regression analysis, as well as the concentrations at which the most intensive cellular metabolism was observed.
Вестерн-блоттинг Western blotting
Клетки Lech-4 культивировали на чашках Петри диаметром 35 мм и при конфлюэнтности 50% проводили обработку препаратом "Абисил" в 5% DMEM с 5% FBS при 37°С в течение ночи. После инкубации клетки промывали холодным PBS (фосфатнобуферный солевой раствор) и лизировали в 200 мкл репортерного лизирующего буфера (фирма Promega), содержащего коктейль ингибиторов протеаз (№Р8349, фирма Sigma- Aldrich), согласно инструкции производителя. Лизаты центрифугировали в течение 15 мин при 12000g и измеряли общее содержание белка в супернатанте белка по Брэдфорду. Белки разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии 12% додецилсульфата натрия (SDS) по Лэммли и осуществляли электроперенос на ПВДФ- мембрану Amersham Hybond Р, 0,45 мкм (фирма Amersham Biosciences, GE Healthcare) в буфере для переноса Товбин (25мМ трис, 192мМ глицин, 20% (об/об) этанола, pH 8,3). Мембраны блокировали в 4%-ном растворе обезжиренного молока в ФСБТ (ФСБ с 0,05% Твина 20) в течение 1 часа при комнатной температуре. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение ночи при 4°С со вторичными антителами (козьи антитела к кроличьему IgG-HRP, sc-2004, фирма Santa Cruz Biotechnology) и в течение 1 часа при комнатной температуре. Для проявления использовали хемилюминесцентный субстрат типа Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (фирма Merck-Millipore, Sigma-Aldrich), определяя сигнал хемилюминесценции с помощью системы гель- документирования Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System (фирма Bio-Rad). Количественную оценку белковых полос выполняли с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH, фирма Bethesda, шт. Мэриленд, США). Lech-4 cells were cultured on Petri dishes with a diameter of 35 mm and at a confluence of 50% treated with the drug "Abisil" in 5% DMEM with 5% FBS at 37°C overnight. After incubation, cells were washed with cold PBS (phosphate buffered saline) and lysed in 200 µl of reporter lysis buffer (Promega) containing a protease inhibitor cocktail (No. P8349, Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. The lysates were centrifuged for 15 min at 12000g and the total protein content in the protein supernatant was measured according to Bradford. Proteins were separated by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of 12% sodium dodecyl sulfate (SDS) according to Laemmli and electrotransferred to an Amersham Hybond P PVDF membrane, 0.45 μm (Amersham Biosciences, GE Healthcare) in Tovbin transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% (v/v) ethanol, pH 8.3). The membranes were blocked in 4% skimmed milk in PBS (PBS with 0.05% Tween 20) for 1 hour at room temperature. Incubation with primary antibodies was performed overnight at 4° C. with secondary antibodies (goat anti-rabbit IgG-HRP, sc-2004, Santa Cruz Biotechnology) and for 1 hour at room temperature. Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Merck-Millipore, Sigma-Aldrich) was used for development, detecting the chemiluminescence signal with a Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad). Protein bands were quantified using ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA).
Список использованных первичных антител: List of primary antibodies used:
- P-actin (D6A8, #8457, фирма Cell Signaling Technology); - P-actin (D6A8, #8457, Cell Signaling Technology);
- LC3 (Dl l, #3868, фирма Cell Signaling Technology). - LC3 (Dl l, #3868, Cell Signaling Technology).
Статистический анализ Statistical analysis
Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Data are presented as mean ± standard error.
Статистический анализ выполняли с использованием t-критерия Стьюдента. Statistical analysis was performed using Student's t-test.
Считается, что р<0,05 указывает на статистически значимое различие. Анализ был выполнен с использованием программы Microsoft Excel. It is believed that p<0.05 indicates a statistically significant difference. The analysis was performed using the Microsoft Excel program.
Реагенты для обработки клеток Cell Processing Reagents
Для обработки клеток использовали препарат "Абисил" в виде живицы от ООО "Инитиум-Фарм". Для получения стока для обработки клеточных культур "Абисил" растворяли в ДМСО. The cells were treated with the Abisil preparation in the form of resin from OOO Initium-Pharm. To obtain a drain for processing cell cultures, "Abisil" was dissolved in DMSO.
Клетки выращивали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, до 50-70%-ной конфлюэнтности. Непосредственно перед обработкой сток "Абисил" разводили в бессывороточной среде DMEM, обработку проводили в среде DMEM с 5% FBS. Отрицательные контроля обрабатывали соответствующим количеством ДМСО в среде DMEM с 5% FBS. Cells were grown in DMEM containing 10% FBS to 50-70% confluence. Immediately before treatment, Abisil stock was diluted in a serum-free DMEM medium, treatment was carried out in DMEM medium with 5% FBS. Negative controls were treated with the appropriate amount of DMSO in DMEM with 5% FBS.
Пример 1: Влияние "Абисила" на метаболическую активность клеток. Влияние 48- часовой обработки "Абисилом" на метаболическую активность клеток изучали с использованием МТТ-теста на линиях эмбриональных легочных фибробластов (MRC5- SV40 и Lech-4). "Абисил" продемонстрировал значительную дозозависимость (см. фиг. 1). Рассчитанные значения IC50 составили 149,3±0,67 для MRC5-SV40 и 152,6±0,52 мкг/мл для Lech-4 соответственно (таблица 1). Кроме этого, обе клеточные линии продемонстрировали существенное повышение метаболической активности (р<0,001) при обработке препаратов в низких концентрациях (9-15 мкг/мл). Example 1: Influence of "Abisil" on the metabolic activity of cells. The effect of 48-hour treatment with "Abisil" on the metabolic activity of cells was studied using the MTT test on lines of embryonic pulmonary fibroblasts (MRC5-SV40 and Lech-4). "Abisil" showed a significant dose-dependence (see Fig. 1). The calculated IC50 values were 149.3±0.67 for MRC5-SV40 and 152.6±0.52 µg/ml for Lech-4, respectively (Table 1). In addition, both cell lines showed a significant increase in metabolic activity (p<0.001) when treated with drugs at low concentrations (9-15 µg/ml).
Таблица 1: Клеточный метаболизм с МТТ-тестом
Figure imgf000019_0001
Table 1: Cell Metabolism with MTT Test
Figure imgf000019_0001
Пример 2: Влияние "Абисила- 1" на снижение митохондриального потенциалаExample 2: Effect of "Abisil-1" on the reduction of mitochondrial potential
Иммортализованные клетки MRC5 и фибробласты легких Lech-4 (MRC5-SV40 (А)) инкубировали в соотношении 1:4000 "Абисилом- 1" в течение ночи, окрашивали TMRM и флуоресценцию красителя измеряли в канале РЕ. Черная гистограмма на фигуре 2 представляет обработанные "Абисилом- 1" клетки; серая гистограмма представляет на фигуре 2 контрольные клетки. Immortalized MRC5 cells and Lech-4 lung fibroblasts (MRC5-SV40 (A)) were incubated at a ratio of 1:4000 with Abisil-1 overnight, stained with TMRM, and dye fluorescence was measured in the PE channel. The black histogram in Figure 2 represents Abisil-1 treated cells; the gray histogram represents control cells in Figure 2.
Обработка "Абисилом- 1" вызывала приблизительно 2-кратное снижение митохондриального потенциала (р<0,05 (р<0,01)) (см. фиг. 2 и таблицу 2). Таблица 2: Митохондриальный потенциал MRC5-SV40, обработанных "Абисилом- 1" или носителем (контроль) (данные представляют собой среднюю интенсивность флуоресценции при окрашивании TMRM, нормализованную по соответствующим контрольным образцам)
Figure imgf000020_0001
Treatment with "Abisil-1" caused an approximately 2-fold decrease in mitochondrial potential (p<0.05 (p<0.01)) (see Fig. 2 and table 2). Table 2: Mitochondrial potential of MRC5-SV40 treated with Abisil-1 or vehicle (control) (data are mean TMRM staining fluorescence intensity normalized to respective controls)
Figure imgf000020_0001
Таким образом, "Абисил-1" вызывает снижение митохондриального потенциала в иммортализованных клетках MRC5 и фибробластах легких Lech-4. Thus, "Abisil-1" causes a decrease in mitochondrial potential in immortalized MRC5 cells and Lech-4 lung fibroblasts.
Пример 3: Влияние "Абисила" на интенсивность аутофагии и митофагии Example 3: Influence of "Abisil" on the intensity of autophagy and mitophagy
В данном примере оценивали влияние "Абисила" на интенсивность аутофагии и митофагии черз 24 и 72 ч. In this example, the effect of "Abisil" on the intensity of autophagy and mitophagy was evaluated after 24 and 72 hours.
Оценку аутофагии проводили путем оценки количества комплексов LC3II в клетках MRC5-SV40, определяемого Вестерн-блоттингом. На фиг. 3 приведены результаты денситометрического анализа комплексов LC3II относительно внутреннего контроля, которые представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, рассчитанного по трем независимым экспериментам. The assessment of autophagy was performed by assessing the number of LC3II complexes in MRC5-SV40 cells, determined by Western blotting. In FIG. 3 shows the results of the densitometric analysis of the LC3II complexes relative to the internal control, which are presented as the mean ± standard deviation calculated from three independent experiments.
Отмечается существенное повышение содержания комплексов LC3II (более чем в 10 раз) при обработке "Абисилом" в концентрации 50 мкг/мл, что свидетельствует об эффективной стимуляции аэрофагии в клетках. There is a significant increase in the content of LC3II complexes (more than 10 times) when treated with "Abisil" at a concentration of 50 μg/ml, which indicates an effective stimulation of aerophagia in cells.
Пример 4: Влияние "Абисила" на снижение митофагии Example 4: Effect of "Abisil" on the reduction of mitophagy
Уменьшение митохондриального потенциала "Абисилом" может означать, что он индуцирует митофагию. Для изучения этого вводили конструкцию, кодирующую репортерную конструкцию GFP-mCherry-FIS 1 в клетках MRC5-SV40, которая позволяет обнаруживать возможную фрагментацию митохондрий и активацию митофагии. FIS1 представляет собой белок, закрепленный на внешней митохондриальной мембране, и поэтому солокализованные GFP и mCherry будут давать желтый сигнал. Флуоресценция GFP гасится в лизосомах из-за низкого значения pH, и поэтому можно обнаружить расщепленные митохондрии в фаголизомах по красной флуоресценции (см. фиг. 4). A decrease in the mitochondrial potential of "Abisilom" may mean that it induces mitophagy. To study this, a construct was introduced encoding the GFP-mCherry-FIS 1 reporter construct in MRC5-SV40 cells, which allows detection of possible mitochondrial fragmentation and mitophagy activation. FIS1 is a protein anchored to the outer mitochondrial membrane and therefore colocalized GFP and mCherry will give a yellow signal. Fluorescence GFP is quenched in lysosomes due to the low pH and therefore split mitochondria can be detected in phagolysomes by red fluorescence (see FIG. 4).
Действительно, после 24-часовой обработки "Абисил" вызвал образование множественных митофагосом. Однако "Абисил" не вызывал общей фрагментации митохондрий даже после 72-часовой обработки. Indeed, after a 24-hour treatment, "Abisil" caused the formation of multiple mitophagosomes. However, "Abisil" did not cause a general fragmentation of mitochondria even after 72 hours of treatment.
Далее определяли влияние обработки препаратом "Абисил" на клетках Lech-4 и исследовали солокализацию красителей в ходе окрашивания красным красителем Mitotracker Red с зеленым красителем Lysotracker Green, который окрашивает кислотные компартменты (лизосомы) в живых клетках. Наблюдается увеличение количества фаголизосом, однако они не солокализуются с красителем Mitotracker Red, что указывает на то, что "Абисил" способствует аутофагии, но специфически не вызывает фрагментацию митохондрий в эмбриональных фибробластах. Next, the effect of Abisil treatment on Lech-4 cells was determined and dye colocalization was studied during staining with Mitotracker Red with Lysotracker Green, which stains acidic compartments (lysosomes) in living cells. An increase in the number of phagolysosomes is observed, but they do not colocalize with the Mitotracker Red dye, which indicates that Abisil promotes autophagy, but does not specifically cause mitochondrial fragmentation in embryonic fibroblasts.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ CLAIM
1. Способ стимуляции аутофагии в клетках, предусматривающий обработку клеток индуктором на основе терпеноидов, отличающийся тем, что в качестве такого индуктора на основе терпеноидов используют в эффективной концентрации индуктор, извлеченный из растений семейства Pinaceae и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52. 1. A method for stimulating autophagy in cells, involving the treatment of cells with a terpenoid-based inducer, characterized in that such an inductor based on terpenoids is used in an effective concentration of an inductor extracted from plants of the Pinaceae family and having the following physical constants: acid number from 70 to 90 , saponification number from 100 to 130, essential number from 10 to 60, refractive index from 1.50 to 1.52.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что индуктор на основе терпеноидов используют в концентрации от 0,05 до 200 мкг/мл, предпочтительно от 45 до 200 мкг/мл. 2. The method according to claim 1, characterized in that the terpenoid-based inducer is used at a concentration of 0.05 to 200 μg/ml, preferably 45 to 200 μg/ml.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что длительность обработки клеток индуктором на основе терпеноидов составляет от 6 до 72 ч, предпочтительно 16 ч. 3. The method according to p. 1, characterized in that the duration of treatment of cells with an inductor based on terpenoids is from 6 to 72 hours, preferably 16 hours.
4. Способ по п. 1 , отличающийся тем, что в качестве индуктора на основе терпеноидов используют препарат «Абисил», «Абисил-1» или «Абисил-2» с целевой добавкой. 4. The method according to p. 1, characterized in that the drug "Abisil", "Abisil-1" or "Abisil-2" with a target additive is used as an inductor based on terpenoids.
5. Способ по одному из пп. 1-4, отличающийся тем, что клетки имеют происхождение из неопухолевых тканей. 5. The method according to one of paragraphs. 1-4, characterized in that the cells originate from non-tumor tissues.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что клетки содержатся в субъекте. 6. The method of claim. 5, characterized in that the cells are contained in the subject.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что клетки находятся ex vivo или in vitro. 7. The method according to any one of paragraphs. 1-6, characterized in that the cells are ex vivo or in vitro.
8. Способ стимуляции аутофагии у субъекта, со стадией введения в организм субъекту эффективной дозы индуктора, отличающийся тем, что в качестве такого индуктора используют индуктор на основе терпеноидов, извлеченный из растений семейства Pinaceae и имеющий следующие физические константы: кислотное число от 70 до 90, число омыления от 100 до 130, эфирное число от 10 до 60, показатель преломления от 1,50 до 1,52 и стимуляция аутофагии обеспечивает лечение состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией. 8. A method for stimulating autophagy in a subject, with the step of introducing an effective dose of an inductor into the body of the subject, characterized in that such an inducer is a terpenoid-based inducer extracted from plants of the Pinaceae family and having the following physical constants: acid number from 70 to 90, a saponification number of 100 to 130, an ester number of 10 to 60, a refractive index of 1.50 to 1.52, and autophagy stimulation provide treatment for a condition associated with mitochondrial dysfunction.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что состояние, ассоциированное с митохондриальной дисфункцией, выбрано из состояния, включающего мутации и/или эпигенетические нарушения митохондриального или ядерного генома, приводящие к нарушению митофагии, дефектам морфологии митохондрий и нарушениям мембранного потенциала митохондрий, и состояния, включающего лизосомные болезни накопления. 9. The method according to claim 8, characterized in that the condition associated with mitochondrial dysfunction is selected from a condition including mutations and / or epigenetic disorders of the mitochondrial or nuclear genome, leading to a violation of mitophagy, defects in mitochondrial morphology and disturbances in the mitochondrial membrane potential, and conditions including lysosomal storage diseases.
10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что индуктор на основе терпеноидов вводят в организм субъекта в дозе от 4 до 40 мг/кг, предпочтительно от 4 до 24 мг/кг. 10. The method according to claim 8, characterized in that the terpenoid-based inducer is administered to the subject at a dose of 4 to 40 mg/kg, preferably 4 to 24 mg/kg.
11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что в качестве индуктора на основе терпеноидов используют препарат «Абисил», «Абисил-1» или «Абисил-2» с целевой добавкой. 11. The method according to p. 8, characterized in that the drug "Abisil", "Abisil-1" or "Abisil-2" with a target additive is used as an inductor based on terpenoids.
PCT/RU2021/000526 2020-09-30 2021-11-29 Method for stimulating autophagy WO2022071829A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202180079913.5A CN116710113A (en) 2020-09-30 2021-11-29 Method for stimulating autophagy

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020126675A RU2765414C1 (en) 2020-09-30 2020-09-30 Method for stimulating mitophagy and autophagy in cells, method for stimulating autophagy or mitophagy for treating a condition associated with mitochondrial dysfunction
RU2020126675 2020-09-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022071829A1 true WO2022071829A1 (en) 2022-04-07

Family

ID=80214595

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/000526 WO2022071829A1 (en) 2020-09-30 2021-11-29 Method for stimulating autophagy

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN116710113A (en)
RU (1) RU2765414C1 (en)
WO (1) WO2022071829A1 (en)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2198653C1 (en) * 2002-03-29 2003-02-20 Пинигина Нина Максимовна Polyactive rectal or vaginal suppositories based upon natural terpenes enriched with monoterpenoids for treating and/or prophylaxis of urological, proctological and gynecological diseases
RU2338547C1 (en) * 2007-02-16 2008-11-20 Людмила Анатольевна Лацерус Polyactive terpenoid substance abisil-2, pharmaceutical composition on its basis and ways of its application
WO2013178965A2 (en) * 2012-06-01 2013-12-05 Societe Industrielle Limousine D'application Biologique Active ingredients activating mitophagy in skin cells and use of same for improving skin condition
AU2016101736A4 (en) * 2016-09-29 2016-11-03 Macau University Of Science And Technology Triterpenoid obtainable from hedera helix for treatment of neurodegenerative diseases
CN111603474A (en) * 2020-02-25 2020-09-01 浙江省人民医院 Application of glaucescent fissistigma root extract C21 steroid in preparation of medicine for promoting gastric cancer cell apoptosis

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2054945C1 (en) * 1995-06-28 1996-02-27 Нина Максимовна Пинигина Agent showing antiinflammatory, antibacterial and wound-healing activities

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2198653C1 (en) * 2002-03-29 2003-02-20 Пинигина Нина Максимовна Polyactive rectal or vaginal suppositories based upon natural terpenes enriched with monoterpenoids for treating and/or prophylaxis of urological, proctological and gynecological diseases
RU2338547C1 (en) * 2007-02-16 2008-11-20 Людмила Анатольевна Лацерус Polyactive terpenoid substance abisil-2, pharmaceutical composition on its basis and ways of its application
WO2013178965A2 (en) * 2012-06-01 2013-12-05 Societe Industrielle Limousine D'application Biologique Active ingredients activating mitophagy in skin cells and use of same for improving skin condition
AU2016101736A4 (en) * 2016-09-29 2016-11-03 Macau University Of Science And Technology Triterpenoid obtainable from hedera helix for treatment of neurodegenerative diseases
CN111603474A (en) * 2020-02-25 2020-09-01 浙江省人民医院 Application of glaucescent fissistigma root extract C21 steroid in preparation of medicine for promoting gastric cancer cell apoptosis

Also Published As

Publication number Publication date
CN116710113A (en) 2023-09-05
RU2765414C1 (en) 2022-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. Schizandrin A protects against cerebral ischemia-reperfusion injury by suppressing inflammation and oxidative stress and regulating the AMPK/Nrf2 pathway regulation
Yao et al. Luteolin could improve cognitive dysfunction by inhibiting neuroinflammation
US11419890B2 (en) Compositions prepared from poultry and methods of their use
Ding et al. Soybean isoflavone alleviates β-amyloid 1-42 induced inflammatory response to improve learning and memory ability by down regulation of Toll-like receptor 4 expression and nuclear factor-κB activity in rats
Zhang et al. Selenium restores synaptic deficits by modulating NMDA receptors and selenoprotein K in an Alzheimer's disease model
US10130670B2 (en) Composition for treating or preventing inflammatory skin disease, comprising, as active ingredient, immature citrus fruit extract, or synephrine or salt thereof
Lim et al. Dicaffeoylquinic acids alleviate memory loss via reduction of oxidative stress in stress-hormone-induced depressive mice
KR20130030729A (en) Use of a ginseng gintonin as herbal medicine-derived ligand
US20230248797A1 (en) Method for preparing medicine with Chinese yam protein extract for treating erectile dysfunction
Choi et al. Antiresorptive activity of bacillus-fermented antler extracts: inhibition of osteoclast differentiation
Wang et al. Lipin1 alleviates autophagy disorder in sciatic nerve and improves diabetic peripheral neuropathy
Zhou et al. Cannabinoid receptor 2 promotes the intracellular degradation of HMGB1 via the autophagy-lysosome pathway in macrophage
Huang et al. Docosahexaenoic acid confers analgesic effects after median nerve injury via inhibition of c-Jun N-terminal kinase activation in microglia
WO2015073598A1 (en) Extracts of rosemary or hemerocallis fulva and methods of using same to promote circadian rhythm
Yao et al. Mesenchymal stem cell attenuates spinal cord injury by inhibiting mitochondrial quality control-associated neuronal ferroptosis
CN109223804A (en) For treating the arthritic quinone methyl triterpene compound of refractory rheumatoid and pharmaceutical composition
RU2765414C1 (en) Method for stimulating mitophagy and autophagy in cells, method for stimulating autophagy or mitophagy for treating a condition associated with mitochondrial dysfunction
KR101734093B1 (en) A pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory disease containing the purified bee venom which was reduced allergen, as a active ingredient
JP2020007376A (en) Lipocalin-type prostaglandin D2 synthase production promoter
WO2022210296A1 (en) Oxytocin signal enhancer and oxytocin-induced keratinocyte proliferation-promoting agent
CN110141594A (en) The drug for treating Alzheimer&#39;s disease
Kong et al. Smilax china Polyphenols Stimulate Browning via β 3-Adrenergic Receptor/AMP-Activated Protein Kinase α Signaling Pathway in 3T3-L1 Adipocytes
Chen et al. The Role of the AMPK Pathway in ZEA-induced Cell-cycle Arrest in Rat Sertoli Cells
Chen et al. Nicotine induces a dual effect on the beige-like phenotype in adipocytes
Ou et al. Spermidine ameliorates osteoarthritis via altering macrophage polarization

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21876069

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202180079913.5

Country of ref document: CN

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21876069

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1