WO2022059885A1 - 진단을 위한 개선된 건조체액의 안정화 조성물 및 이의 응용방법 - Google Patents

진단을 위한 개선된 건조체액의 안정화 조성물 및 이의 응용방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2022059885A1
WO2022059885A1 PCT/KR2021/006888 KR2021006888W WO2022059885A1 WO 2022059885 A1 WO2022059885 A1 WO 2022059885A1 KR 2021006888 W KR2021006888 W KR 2021006888W WO 2022059885 A1 WO2022059885 A1 WO 2022059885A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
composition
present
silk fibroin
weight
concentration
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/006888
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
장혜란
우종권
스트로직카타르지나
Original Assignee
장혜란
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 장혜란 filed Critical 장혜란
Publication of WO2022059885A1 publication Critical patent/WO2022059885A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43586—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from silkworms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q

Definitions

  • the present invention relates to dried humoral spots improved to improve the accuracy and reliability of remote diagnosis. Specifically, by spotting a small amount of bodily fluid using a silk fibroin protein composition to dry bodily fluid spots, under various conditions It shows excellent stability and can be used as a stable medium for telemedicine diagnosis.
  • the current blood sample collection method has a problem in that there are not enough medical staff on site when a large-scale examination is required, or a patient's blood sample cannot be easily obtained due to general objection to surgical sampling methods such as venipuncture. this existed.
  • human whole blood and blood components can be very unstable depending on the conditions. Therefore, in order to accurately analyze and evaluate these unstable samples, special handling of the samples is required.
  • a common method for storing and handling blood or blood fractions (plasma, serum, etc.) currently used clinically and pathologically is by freezing (-20°C).
  • freezing 20°C
  • cryogenic temperatures -80° C.
  • the minimum infrastructure to support continuous refrigeration is often not in place, limiting the range of precision diagnostics that can be performed.
  • secondary infection of the disease can be caused by face-to-face contact between medical staff and patients.
  • DBS Dry Blood Spot
  • cellulose matrices sometimes contain enzyme inhibitors, in part for the stability of blood specimens.
  • the specimen dried using the cellulose matrix is separated from the sheet in the form of a small disk using a punch in the analysis room, and eluted on a microtiter plate in a buffer solution at 4° C. for a sufficient time.
  • the plate containing the eluted material is formed in a dilutable state for subsequent testing.
  • the cellulose-based format is not suitable to cover all analytes as potential analytes, and some markers chemically react with the cellulose matrix, making it difficult to obtain sufficient recovery for analysis.
  • the present invention provides a recombinant fibroin protein, characterized in that whole blood and specific blood components can be stabilized over a certain period of time and a storage temperature of a certain range, and sufficient recovery of the active ingredient for analysis is possible.
  • the composition of the present invention absorbs a small amount of body fluid in a sheet state, and then enters a stabilization phase. And it is air-dried as a mixed complex in a thin film.
  • the coagulation technology of the reconstituted mixed solution containing a small amount of unstable nucleic acid can be actively utilized for more stable pharmacokinetic screening by combining the freeze-drying technology.
  • the protein composition of the present invention can be used to replace the on-paper device, and is expected to present a new paradigm that does not depend on the existing method that relies on cold chain storage.
  • the present invention may find application in the diagnostic utility of another form of sample collection from urine, saliva and other bodily fluids or cells.
  • An object of the present invention for solving the above problems is to provide a composition of a specimen for the stable preservation of a biological sample.
  • the present invention is a more stable protein by controlling the content of a unit polypeptide that has the potential to form a ⁇ structure among proteins extracted from the cocoon of Bombyx mori , thereby delaying the transfer to the Silk II structure as much as possible.
  • the purpose is to prepare a composition.
  • the present invention reduces the spontaneous transition to the ⁇ structure by controlling the content of the unit polypeptide as described above. At the same time, even in a monomolecular state upon contact with a biological sample, it promotes the formation of a ⁇ structure with a biological sample and affects the interaction between molecular chains to transform it into a more stable and robust ⁇ structure, enabling more stable preservation of biological samples Do.
  • Another object of the present invention is to provide a kit comprising a biological sample collection device comprising the fibroin protein composition.
  • the present invention relates to a silk fibroin protein composition having excellent re-solubility, wherein the content of glycine is 40 to 50% by weight and the content of alanine is 25 to 35% by weight relative to the total amino acid content of the silk fibroin protein composition, and the silk fibroin protein composition It provides a silk fibroin protein composition that has an average molecular weight of 32 kDa to 340 kDa.
  • the glycine is composed of glycine ( ⁇ ) and glycine ( ⁇ ), and the ratio of glycine ( ⁇ ) to glycine ( ⁇ ) may be 0.1: 99.9 to 10: 90, but is not limited thereto.
  • the alanine is composed of alanine ( ⁇ ) and alanine ( ⁇ ), and the ratio of the alanine ( ⁇ ) to alanine ( ⁇ ) may be 0.1: 99.9 to 10: 90, but is not limited thereto.
  • the composition includes a heavy chain and a light chain, and the weight ratio of the heavy chain and the light chain is 0.1: 99.9 to 10: 90, It is not limited thereto.
  • the composition may be prepared within the range of pH 1 to 13, may be prepared within the range of 0.1 atm to 2.0 atm, may be prepared within the G-Force range of 3000RCF to 20000RCF, 60 minutes It may be prepared within a reaction time range of from to 240 minutes, but is not limited thereto.
  • the composition may be in the form of a solid or liquid, or the composition may be in the form of a frozen and freeze-dried specimen applied to a cellulose base or a plastic stick.
  • composition itself may be in the form of a frozen and freeze-dried specimen or in the form of dried powder particles, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention is characterized in that the fibroin protein is stably maintained for 3 to 14 days, and the composition of the present invention is characterized in that the storage stability is maintained at 22 °C to 38 °C for 30 days.
  • composition of the present invention may add 20 to 90% by weight of glycerol as an additional additive based on the total weight, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention is characterized in that it is re-solubilized in water to form a silk fibroin solution without fibroin aggregates.
  • it is possible to recover a detectable amount of a biological sample and an active ingredient contained in the sample after re-solubilization. do.
  • Conditions under which a detectable amount of a biological sample can be recovered after re-solubilization of the composition may be a time of 24 hours to 14 days and a temperature condition of 43° C. or less, and the biological sample is cells, tissues, blood (for example, whole blood, plasma, serum, platelets, etc.), lactation products, amniotic fluid, sputum, urine, saliva, mucus, bronchial aspirate, or a fraction thereof or a combination thereof, or a combination thereof, may be one containing these, the active ingredient silver peptides, proteins, antibodies, enzymes, amino acids, hexanes, DNA and fractions thereof, RNA and fractions thereof, antisense oligonucleotides, metabolites, lipids, sugars, glycoproteins, peptidoglycans, microorganisms, cells and their It may be one or more selected from the group consisting of any combination, but is not limited thereto.
  • the ratio of the fibroin protein composition to the biological sample may be about 1: 100 to 100: 1, but is not limited thereto.
  • kits comprising a biological sample collection device comprising the fibroin protein composition.
  • the kit may further include a container containing a solubilizing agent.
  • the solubilizing agent may include water, a buffer solution, or a combination thereof.
  • the kit may include a container containing a stabilizer, and the stabilizer may be to stabilize the biological sample sample.
  • the stabilizer may be selected from the group consisting of antioxidants, gelatin and derivatives thereof, albumin (human and bovine serum), amino acids, cationic and anionic surfactants, sugar alcohols, or any combination thereof. More specifically, the stabilizing agent may be a nuclease or proteinase inhibitor, and most specifically, the stabilizing agent may be an RNase inhibitor, but is not limited thereto.
  • the kit may be configured to include one or more selected from the group consisting of a nucleic acid amplifying agent, a component purification agent, an immune detection agent, or any combination thereof.
  • the bodily fluid sample is added to the composition of Dried Humoral Spot (DHS), which has improved stability compared to the conventional Dried Blood Spot (DHS), and then it is much more stable to the analysis room can be transferred to DHS.
  • DHS Dried Humoral Spot
  • DHS Dried Blood Spot
  • DHS Dried Humoral Spot
  • the protein composition of the present invention and a method for storing a biological sample using the same have the following advantages.
  • FIG. 1 shows an SEM photograph of fibroin dried through a refining process in the range presented in the present invention during the fibroin extraction process from Bombyx mori silkworm (A: range presented in the present invention, B: temperature, pressure, and time respectively 10% When increasing, C: when temperature, pressure, and time are increased by 20% each).
  • FIG. 2 shows the molecular weight and chromatogram measurement data of the dry body fluid stabilization composition of the present invention
  • A molecular weight distribution diagram of DHS
  • B chromatogram in pH 2.5 aqueous solution
  • C chromatogram in pH 3.0 aqueous solution
  • D Chromatogram at pH 3.5 aqueous solution
  • Figure 3 shows the data of measuring the stability according to the pH of the composition of the present invention.
  • FIG. 4 shows data measured through Raman analysis of the change process according to the pH of FIG. 3 .
  • FIG 5 shows the SEM measurement data of the composition of the present invention (A: SEM data of the composition of the present invention, B: SEM data of plasma applied to the composition of the present invention).
  • the white block is DHS (plasma)
  • the black block is DHS (blood)
  • the gray block is a gray block.
  • A serum amyloid P component (SAP)
  • B soluble cell adhesion molecule (sVCAM-1)
  • C C-reactive protein (CRP)).
  • Figure 8 shows the total PSA measurements of LP (Liquid Plasma), DBS (Dried Blood Spot (cellulose sheet)), and DHS (Dried Humoral Spot (silk sheet)) immediately after and 2 weeks after the experiment (A: immediately after the experiment, B: after 2 weeks at 22 degrees and 43 degrees).
  • LP Liquid Plasma
  • DBS Dried Blood Spot (cellulose sheet)
  • DHS Dried Humoral Spot (silk sheet)
  • LP Liquid Plasma
  • DBS Dried Blood Spot (cellulose sheet)
  • DHS Dried Humoral Spot (silk sheet)
  • FIG. 11 shows data measured by chromatographic analysis of the amino acid content of different silk fibroin varieties (7 varieties) (A (Baekok jam), B (Geumgwang ju), C (Hansang II), D (Hong bak) ), E (Imbakgal won), F (N74), G (SK), H (Won jam 125), I (Won won 126)).
  • first, second, etc. may be used to describe various elements, but the elements should not be limited by the terms. The above terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another. For example, without departing from the scope of the present invention, a first component may be referred to as a second component, and similarly, a second component may also be referred to as a first component.
  • the singular expression includes the plural expression unless the context clearly dictates otherwise.
  • the terms used are intended to designate that there is a feature, number, step, element, or a combination thereof described in the specification, and one or more other features or number, step, element or a combination thereof It should be understood that it does not preclude the possibility of the existence or addition of one.
  • this includes not only the case where it is “immediately on” another part, but also the case where there is another part in the middle.
  • another part is said to be “under”, this includes not only the case where the other part is “directly under”, but also the case where there is another part in the middle.
  • the refining method during the process of extracting fibroin from the Bombyx mori used in the present invention may be prepared by several methods, including known methods known to those skilled in the art.
  • fibroin refers to an insoluble protein contained in silk produced by other moth genus, such as house silkworm larvae.
  • the term “silk” may refer to fibroin and silk itself extracted from silkworms collectively called Bombyx mori silkworm ( Bombyx mori silkworm, silkworm) or Tussah, Giant silkworm, and, in the present invention, although the composition of the present invention was prepared using Gajamgyeon, also called, it is not limited thereto.
  • silkworms used in the present invention are not limited to Gajamgyeon or Nojamgyeon.
  • the ratio of glycine (Glycin) 42 to 47 weight percentage, alanine (Alanine) 27 to 32 weight percentage, and serine (Serine) 10 to 14 weight percentage is kept constant, so the ratio of each component is predicted and adjustable, which is advantageous for use.
  • Silk fibroin a protein extracted from silkworms, is mostly composed of a heavy chain having repeated hydrophobic and hydrophilic regions and a light chain composed of hydrophilic amino acids.
  • the scouring process of silkworms can be performed using several methods.
  • the heavy chain portion having a hydrophobic region is increased as shown in FIG. 1 .
  • This increased heavy chain forms a beta-sheet linkage covalent bond, which can affect stabilization, the object of the present invention.
  • the present invention provides a process for refining and extracting Bombyx mori for preparing a fibroin composition for stabilizing body fluids.
  • the refining was performed under conditions of 60 minutes to 120 minutes, a temperature of 100 to 120 degrees, and a pressure of 0.1 to 2.0 mbar.
  • the silk fibroin extracted from the Bombyx mori may be dissolved in an aqueous salt solution.
  • the aqueous solution for achieving the above object may use lithium bromide, lithium thiocyanate, calcium nitrate, calcium chloride mixture or other chemicals capable of dissolving the extract.
  • silk fibroin was dissolved using 8 to 12 moles of lithium bromide, which is a conventional method, but is not limited thereto.
  • a membrane may be used as a conventional method, but is not limited thereto.
  • the addition ratio of fibroin to the aqueous solution may be 1:5 to 1:100.
  • the temperature may be between 50 degrees and 160 degrees C, but is not limited thereto.
  • the time may be, for example, between at least 60 minutes and 240 minutes.
  • the pressure may be between 0.1 and 2.0 atm. for example at least 0.1 atm, at least 0.2 atm, at least 0.3 atm, at least 0.4 atm, at least 0.5 atm, at least 0.6 atm, at least 0.7 atm, at least 0.8 atm, at least 0.9 atm, at least 1.0 atm, at least 1.1 atm, at least 1.2 atm , at least 1.3 atm, at least 1.4 atm, at least 1.5 atm, at least 1.6 atm, at least 1.7 atm, at least 1.8 atm, at least 1.9 atm, at least 2.0 atm.
  • gravity can be between 3000 and 20000 RCF.
  • double fibroin which is composed of heavy chain, light chain and p25 protein, has 11 domains forming a repeating crystalline region of glycine, alanine and serine, a middle portion and a C-terminal N-terminal amorphous made up of areas
  • the weight ratio of the heavy chain and the light chain within the temperature, time, pressure, and gravity ranges of the ranges suggested in the above conditions is 0.1: 99.9 to 10.0: 90.0.
  • the ratio of Gly( ⁇ ) to Gly( ⁇ ) is 0.1 : 99.9 to 10.0 : can be set to 90.0.
  • the ratio of Gly( ⁇ ) to Gly( ⁇ ) is 0.1:99.9, at least 0.2:99.8, at least 0.3:99.7, at least 0.4:99.6, at least 0.5:99.5, at least 0.6:99.4, at least 0.7:99.3, at least 0.8:99.2, at least 0.9:99.1, at least 1.0:99.0, at least 1.1:98.9, at least 1.2:98.8, at least 1.3:98.7, at least 1.4:98.6, at least 1.5:98.5, at least 1.6:98.4, at least 1.7:98.3, at least 1.8:98.2, at least 1.9:98.1, at least 2.0:98.0, at least 2.1:97.9, at least 2.2:97.8, at least 2.3:97.7, at least 2.4:97.6, at least 2.5:97.5, at least 2.6:97.4, at least 2.7:97.3, at least 2.8:97.2, at least 2.9:97.1, at least 3.
  • the ratio of Gly( ⁇ ) to Gly( ⁇ ) is at least 0.1 : 99.9 to You can make it 10.0 : 90.0.
  • the ratio of Gly( ⁇ ) to Gly( ⁇ ) is 0.1:99.9, at least 0.2:99.8, at least 0.3:99.7, at least 0.4:99.6, at least 0.5:99.5, at least 0.6:99.4, at least 0.7:99.3, at least 0.8:99.2, at least 0.9:99.1, at least 1.0:99.0, at least 1.1:98.9, at least 1.2:98.8, at least 1.3:98.7, at least 1.4:98.6, at least 1.5:98.5, at least 1.6:98.4, at least 1.7:98.3, at least 1.8:98.2, at least 1.9:98.1, at least 2.0:98.0, at least 2.1:97.9, at least 2.2:97.8, at least 2.3:97.7, at least 2.4:97.6, at least 2.5:97.5, at least 2.6:97.4, at least 2.7:97.3, at least 2.8:97.2, at least 2.9:97.1, at least 3.
  • the weight ratio of Gly when the weight ratio of Gly is 50% within the temperature, time, pressure, and gravity ranges indicated in the above conditions, at least the ratio of Gly( ⁇ ) to Gly( ⁇ ) is 0.1 : 99.9 to You can make it 10.0 : 90.0.
  • the ratio of Gly( ⁇ ) to Gly( ⁇ ) is 0.1:99.9, at least 0.2:99.8, at least 0.3:99.7, at least 0.4:99.6, at least 0.5:99.5, at least 0.6:99.4, at least 0.7:99.3, at least 0.8:99.2, at least 0.9:99.1, at least 1.0:99.0, at least 1.1:98.9, at least 1.2:98.8, at least 1.3:98.7, at least 1.4:98.6, at least 1.5:98.5, at least 1.6:98.4, at least 1.7:98.3, at least 1.8:98.2, at least 1.9:98.1, at least 2.0:98.0, at least 2.1:97.9, at least 2.2:97.8, at least 2.3:97.7, at least 2.4:97.6, at least 2.5:97.5, at least 2.6:97.4, at least 2.7:97.3, at least 2.8:97.2, at least 2.9:97.1, at least 3.
  • the weight ratio of Ala when the weight ratio of Ala is 25% within the temperature, time, pressure, and gravity ranges indicated in the above conditions, at least the ratio of Ala( ⁇ ) to Ala( ⁇ ) is 0.1 : 99.9 to You can make it 10.0 : 90.0.
  • the ratio of Ala( ⁇ ) to Ala( ⁇ ) is 0.1 : 99.9, at least 0.2 : 99.8, at least 0.3 : 99.7, at least 0.4 : 99.6, at least 0.5 : 99.5, at least 0.6 : 99.4, at least 0.7 : 99.3, at least 0.8:99.2, at least 0.9:99.1, at least 1.0:99.0, at least 1.1:98.9, at least 1.2:98.8, at least 1.3:98.7, at least 1.4:98.6, at least 1.5:98.5, at least 1.6:98.4, at least 1.7:98.3, at least 1.8:98.2, at least 1.9:98.1, at least 2.0:98.0, at least 2.1:97.9, at least 2.2:97.8, at least 2.3:97.7, at least 2.4:97.6, at least 2.5:97.5, at least 2.6:97.4, at least 2.7:97.3, at least 2.8:97.2, at least 2.9
  • the weight ratio of Ala when the weight ratio of Ala is 30% within the temperature, time, pressure, and gravity ranges indicated in the above conditions, at least the ratio of Ala( ⁇ ) to Ala( ⁇ ) is 0.1 : 99.9 to You can make it 10.0 : 90.0.
  • the ratio of Ala( ⁇ ) to Ala( ⁇ ) is 0.1 : 99.9, at least 0.2 : 99.8, at least 0.3 : 99.7, at least 0.4 : 99.6, at least 0.5 : 99.5, at least 0.6 : 99.4, at least 0.7 : 99.3, at least 0.8:99.2, at least 0.9:99.1, at least 1.0:99.0, at least 1.1:98.9, at least 1.2:98.8, at least 1.3:98.7, at least 1.4:98.6, at least 1.5:98.5, at least 1.6:98.4, at least 1.7:98.3, at least 1.8:98.2, at least 1.9:98.1, at least 2.0:98.0, at least 2.1:97.9, at least 2.2:97.8, at least 2.3:97.7, at least 2.4:97.6, at least 2.5:97.5, at least 2.6:97.4, at least 2.7:97.3, at least 2.8:97.2, at least 2.9
  • the weight ratio of Ala when the weight ratio of Ala is 35% within the temperature, time, pressure, and gravity ranges indicated in the above conditions, at least the ratio of Ala( ⁇ ) to Ala( ⁇ ) is 0.1 : 99.9 to You can make it 10.0 : 90.0.
  • the mutual binding time between molecular chains may vary according to a change in the pH of the aqueous solution of the present composition.
  • the ⁇ -sheet structure is formed by the increase or decrease of hydrophobic bonds, hydrogen bonds, ionic bonds, etc. between macromolecular chains and develops into a network structure, which affects the formation of gels.
  • the pH when the pH is at least 1 or less, the mutual repulsive force between molecular chains acts and no gel is formed.
  • the pH was 1 to 13
  • the mutual repulsion between molecular chains decreased and the gel formation time was reduced.
  • the mutual repulsion between molecular chains was minimal, and as the pH increased, the mutual repulsion between molecular chains increased and the gel formation time increased.
  • the mutual binding time between molecular chains according to the pH change may vary depending on the concentration of the composition, and the concentration may be 0.1 to 60 weight fractions.
  • the concentration can be at least when the concentration of the composition is 0.1 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 1 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 2 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 3 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 3 weight fractions, at least the concentration of the composition is 4 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 5 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 6 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 7 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 8 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 8 weight fractions.
  • the concentration of the composition is 9 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 10 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 11 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 12 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 13 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 13 weight fractions. is 14 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 15 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 16 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 17 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 18 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 18 weight fractions.
  • the concentration of the composition is 19 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 20 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 21 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 22 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 23 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 23 weight fractions.
  • When is 24 weight fractions at least when the concentration of the composition is 25 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 26 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 27 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 28 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 28 weight fractions.
  • the concentration of the composition is 29 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 30 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 31 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 32 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 33 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 33 weight fractions.
  • the concentration of the composition is 34 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 35 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 36 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 37 weight fraction, at least when the concentration is 38 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 39 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 40 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 41 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 42 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 42 weight fractions.
  • the concentration is 43 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 44 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 45 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 46 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 47 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 47 weight fractions.
  • the concentration is 48 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 49 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 50 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 51 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 52 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 52 weight fractions.
  • the concentration when the concentration is 53 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 54 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 55 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 56 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 57 weight fractions, at least when the concentration of the composition is 57 weight fractions.
  • the concentration is 58 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 59 weight fraction, and at least when the concentration of the composition is 60 weight fraction, the above properties for pH are expressed.
  • glycerol may be added as an additional additive in order to add stability to the composition of the present invention prepared in the whole process above.
  • the amount of glycerol added is at least 20 weight percent, at least 25 weight percent, at least 30 weight percent, at least 35 weight percent, at least 40 weight percent, at least 45 weight percent, at least 50 weight percent, at least 55 weight percent, relative to the aqueous composition of the present invention. percentage, at least 60 weight percent, at least 65 weight percent, at least 70 weight percent, at least 75 weight percent, at least 80 weight percent, at least 85 weight percent, at least 90 weight percent.
  • the gelation time is gradually decreased as the glycerol content increases. This is because the strong hydrophilic action of glycerol increases the hydrophobicity of the protein by excluding water from the protein domain, thereby forming a structure affecting hydrophobic bonding and stabilizing it.
  • composition of the present invention prepared in the above process may be in the form of a frozen and freeze-dried specimen by applying it to a cellulose base.
  • composition of the present invention prepared in the above process may itself be in the form of a frozen and freeze-dried specimen.
  • composition of the present invention prepared in the above process may be in the form of dried powder particles.
  • composition of the present invention prepared in the above whole process may be in the form of a specimen frozen and freeze-dried by applying it to a plastic or similar stick.
  • composition of the present invention prepared in the above whole process may be a specimen in an aqueous solution state.
  • the ratio of fibroin and soluble salt was fixed at 1 to 40, G-Force was fixed at 3000 RCF, and the difference in the contents of Ser, Gly, and Ala among the primary amino acids was confirmed by changing the temperature, time, pressure and pH. .
  • Experiment 1 was prepared at a temperature of 50°C
  • Experiment 2 was prepared at a temperature of 140°C
  • the time was 60 minutes
  • the pressure was 0.1 atm
  • the measurement was performed at pH 2.5.
  • Experiment 3 was prepared at time 60 minutes
  • Experiment 4 was prepared at time 240 minutes
  • the temperature was 50 degrees
  • the pressure was 0.1 atm
  • pH 2.5 was prepared and measured.
  • Experiment 5 was prepared at a pressure of 0.1 atm
  • Experiment 6 was prepared at a pressure of 2.0 atm
  • the temperature was 50 degrees
  • the time was 60 minutes
  • pH 2.5 was prepared and measured.
  • Experiment 7 was prepared at pH 2.5
  • Experiment 8 was pH 3.0
  • Experiment 9 was prepared at pH 3.5
  • the temperature was 50 degrees
  • the time was 60 minutes
  • the pressure was measured at 0.1 atm.
  • Experiment 1 Experiment 2
  • Experiment 3 Experiment 4
  • Experiment 5 Experiment 6
  • Experiment 7 Experiment 8
  • FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
  • the fibroin sample in the aqueous solution state had a sharp peak at 10 min corresponding to the upper fractionation limit of molecular weight in the chromatogram and a broad peak in a wide range from 15 min to 30 min. peak) was shown.
  • fibroin in an aqueous solution has a wide range of molecular weight distribution from a heavy chain peptide of about 350 kDa to 30 kDa or less, which is the fractionation limit of the column.
  • the peak appearing at 10 min partially confirmed that the heavy chain, light chain, and random coil form a gel by forming a ⁇ -sheet between molecular chains over time.
  • the fibroin composition of the present invention seems to inhibit the molecular chains from aggregating with each other to form a protein colloid.
  • a more stabilized composition could be prepared by inhibiting the formation of a semi-solid gel in the dispersion system that forms a three-dimensional network structure connected to each other at the same time.
  • the recovery efficiency was measured by accurately converting the levels of proteins recovered from the blood and plasma specimens into concentrations found in plasma consistent with the donor.
  • the mass normalization of solid plasma was multiplied by the plasma concentration (mg/mL) in the 40 mg specimen and normalized to the mass of the total solid plasma in the volume (about 1.02 ⁇ 0.05 mL) suspended in 960ul of 1X PBS, as shown in Calculations 3 and 4.
  • Theoretical plasma fraction (mg/mL) in a 40 mg living specimen solid plasma per weight of plasma specimen (mg/mg) X specimen 40 mg X (plasma concentration (mg/mL)/(solid plasma weight fraction (mg/mL)) X PBS Suspension volume (mL))
  • Theoretical blood fraction (mg/mL) in a 40 mg biological specimen solid plasma per weight of blood specimen (mg/mg) X specimen 40 mg X (plasma concentration (mg/mL)/(solid plasma weight fraction (mg/mL)) X PBS Suspension volume (mL))
  • C-reactive protein was used as an analyte used as a marker, and it was confirmed that a statistically significant level was reached as a result of the measurement.
  • the content of C-reactive protein was measured using an immunoassay in a sample obtained by simple blood sampling.
  • particle immunoassay As a commonly used immunoassay, particle immunoassay, enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay, fluorescence immunoassay, chemiluminescence immunoassay, etc. may be used.
  • EIA enzyme immunoassay
  • radioimmunoassay fluorescence immunoassay
  • chemiluminescence immunoassay etc.
  • the C-reactive protein was quantified using an enzyme immunoassay (EIA), but the present invention is not limited thereto.
  • An enzyme was pre-attached to the antibody binding to the two samples that had undergone the pre-treatment process, and an antigen-antibody reaction was induced. Thereafter, an enzyme reaction was induced by adding a substrate reacting to the bound enzyme.
  • the enzyme used in this case can be measured using any one of alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, and metagalactosidase ( ⁇ -galactosidase). And after the enzymatic reaction, the concentration of C-reactive protein was derived using a spectrophotometer.
  • the average value of the plasma sample was 0.7 ⁇ 0.2 (mg/dL), and it was confirmed that the value measured in the present composition was 0.7 ⁇ 0.23 (mg/dL).
  • three markers were measured in separate donor blood samples after samples were stored for 30 days in constant temperature incubators at 22° C. and 38° C. to simulate the storage state and sample transport time frame of the present composition.
  • SAP serum amyloid P component
  • sVCAM-1 soluble cell adhesion molecule
  • CRP C-reactive protein
  • plasma and blood treated with the present composition showed a similar level of recovery to plasma frozen at -20°C in sVCAM-1, CRP, and SAP, confirming that it had excellent stability.
  • prolactin prolactin, fetal cancer antigen (CEA), leptin, TNF-related apoptosis inducing ligand (tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL) and The recovery and stability tests according to temperature and time were performed for total prostate specific antigen (total PSA), and the results are shown in Table 5 below.
  • LP denotes liquid plasma
  • DHS denotes dry bodily fluid spots based on the composition sheet of the present invention
  • DBS denotes dry bodily fluid spots based on cellulose sheet.
  • composition of the present invention exhibits excellent storage stability at room temperature and high temperature, and exhibits a significantly improved effect compared to the existing technology, cellulose sheet-based technology.
  • Description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive. For example, each component described as a single type may be implemented in a dispersed form, and likewise components described as distributed may be implemented in a combined form.
  • the scope of the present invention is defined in the claims to be described later. All changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be construed as being included in the scope of the present invention.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Fire-Detection Mechanisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Stringed Musical Instruments (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 기존의 건조혈반(Dried Blood Spots, DBS) 시스템보다 개선된 건조체액반점(Dried Humoral Spot, DHS) 시스템에 관한 것으로서, 생물학적 시료의 보관 안정성 및 용해성을 갖는 개선된 단백질 조성물 및 이를 활용한 응용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 콜드체인(cold chain) 저장, 동결건조, 공유 고정화(covalent immobilization) 및 셀룰로오스 기반 기술의 문제점을 보완함으로써 보다 광범위하기 주문형(on demand) 또는 현장형(point of care) 적용에서 넓은 선택의 범위를 제공할 수 있다. 또한, 광범위하게는 본 발명에서 제조된 조성물을 이용하여 생물학적 샘플(혈액, 소변, 타액 및 다른 체액 또는 세포로부터의 샘플 수집 등)을 채취한 시편을 이용하여 치료, 진단, 검출 및 분석을 위해 안정화된 물질의 회수를 가능하게 하는 보다 개선된 조성물 및 그의 응용방법이다.

Description

진단을 위한 개선된 건조체액의 안정화 조성물 및 이의 응용방법
본 발명은 원거리 진단의 정확성 및 신뢰성을 향상시키기 위해 개선된 건조체액 반점(Dried Humoral Spot)에 관한 것으로서, 구체적으로는 소량의 체액을 실크피브로인 단백질 조성물을 이용하여 건조체액반점화 함으로써, 다양한 조건 하에서 우수한 안정성을 보여 원격의료 진단을 위한 안정적인 매개체로서 사용할 수 있다.
현재 사용되는 혈액 샘플 채취방법은 대규모의 검사 등이 요구되는 경우에 현장에 충분한 의료진이 없거나, 정맥 천자와 같은 외과적인 샘플 채취 방법에 대한 일반적인 거부감 등으로 인해 환자의 혈액 샘플을 쉽게 얻을 수 없다는 문제점이 존재하였다. 또한, 인간의 전혈 및 혈액 성분은 조건에 따라 매우 불안정할 수 있다. 때문에 이러한 불안정한 샘플을 정확하게 분석 및 평가하기 위해서는 샘플의 특별한 취급이 필요하다.
현재 임상병리학적으로 사용되어지는 혈액 또는 혈액의 분획(혈장, 혈청 등)을 저장하고 취급하는 통상적인 방법은 동결(-20℃)에 의한 것이다. 특히, 매우 불안정한 RNA의 경우에는 샘플의 안전성을 보존하기 위해 초저온(-80℃)에서의 보관 및 운송해야 하는 등 큰 제약이 있다. 즉 샘플을 스티로폼 박스 또는 드라이아이스 등을 사용하여 이송하기 때문에 운송과정에서 고가의 운송요금을 추가로 부담하는 경우가 발생한다.
일부 개발도상국 또는 원거리 필드 조건에서는 연속적인 냉장보관을 지원하는 최소한의 기반시설이 제대로 갖춰지지 않은 경우가 많아, 수행 가능한 정밀 진단의 범위가 제한된다.
따라서, 약동학(PK) 스크리닝을 위해 치료 효능을 모니터하고 2차 요법으로 적절한 전환을 안내하기 위한 저렴하고 안정적인 저장 포맷(format)의 필요성이 절실하다.
특히 세계적인 팬더믹(Pandemic)이 발생하였을 경우 의료진 및 환자의 대면 접촉으로 인한 질병의 2차 감염이 유발될 수 있다.
이러한 2차 감염을 방지하기 위해 앞으로의 의료 진단방향은 대면 접촉을 최소화하고, 원거리 진단을 통한 새로운 선별검사(Screening Test) 적용이 보편화될 것으로 전망된다.
혈액 또는 혈장 등을 저장하고 보존하는 다른 방법으로는 셀룰로오스 매트릭스 기반의 기술이 혈액 시편 보존의 시장 점유율을 장악해오고 있다. 이는 손가락, 발뒤꿈치 등으로부터 란셋(Lancet)를 이용하여 소량의 혈액을 취한 후, 셀룰로오스 매트릭스가 포함된 시트지 상에 적용함으로써 건조된 혈액 반점(Dried Blood Spot, DBS, 이하 건조 혈반이라 칭함) 시편을 수득한다. 이러한 셀룰로오스 매트릭스는 부분적으로 혈액 시편의 안정성을 위해 효소 억제제를 포함시키는 경우도 있다.
셀룰로오스 매트릭스를 이용해 건조된 시편은, 분석실에서 펀치를 이용하여 작은 디스크 형태로 시트로부터 분리하고, 4℃의 완충 용액에서 마이크로타이터 플레이트 상에 충분한 시간을 두고 용리시킨다.
또한, 용리된 물질을 함유하는 플레이트는 후속 시험을 위해 희석이 가능한 상태로 형성시킨다.
이와 같이 방식은 1960년대 이후로 개별적 진단법으로 사용되어지고 있다. 또한 셀룰로오스 기반 기술은 20-30년간 꾸준히 연구되고 있으며, 현재 미국 질병통제센터에서는 혈액 반점을 위한 독립적인 품질 관리 프로그램을 유지하고 있다.
30년 이상 동안, 연구원들은 여러 질병 바이오마커를 대상으로 DBS 샘플의 온도 및 시편의 안정성에 대하여 연구해 왔고, 특히 소형화 및 원거리진단을 위한 스크리닝 분야에 사용이 용이하도록 많은 연구가 이루어졌다.
현재까지 셀룰로오스 기반의 포맷은 잠재적 분석 대상인 모든 분석물을 커버하기에는 적합하지 않으며, 일부 마커는 셀룰로오스 매트릭스와 화학적으로 반응하여 이를 분석하기 위한 충분한 회수 과정이 어렵다는 것을 발견하였다.
이들 셀룰로오스 매트릭스 기반의 혈액 및 혈장 안정화 시스템의 몇몇 결점 또한, 수년간 지속된 광범위한 세트의 임상적 평가를 통해 밝혀져 왔다.
이러한 결점은 건조 혈반 시편이 달성할 수 있는 검출 하한치(Lower Limit of Detection, LLD) 및 적정한 정량적 식별이 되는 동적 범위에 한계로 작용하여, 건조 혈반 시편의 완전성을 보장할 수 없고, RNA 바이러스에 대한 분자 시험을 위한 수송 수단으로 사용될 수 없다는 한계점으로 작용할 수 있다.
따라서, 생물학적 샘플 및 성분을 충분히 안정화 할 수 있고, 검출 및 분석용의 안정화된 샘플로부터 다양한 분석을 수행하기 충분한 양의 샘플을 회수 할 수 있는 개선된 안정화 기술 및 제품의 개발 필요성이 시급하다.
본 발명에서는 일정 시간 및 일정 범위의 저장 온도에 걸쳐 전혈 및 특정 혈액 성분을 안정화시킬 수 있고, 분석을 위한 유효성분의 충분한 회수가 가능한 것을 특징으로 하는, 재조합된 피브로인 단백질을 제공한다.
본 발명의 조성물은 시트 상태에서 소량의 체액을 흡수하고, 이어서 안정화 단계로 진입한다. 그리고 박막 내의 혼합 착물로 공기 건조된다. 또한 불안정한 소량의 핵산을 함유하는 재구성된 혼합용액 응고기술을 동결 건조 기술과 접목하여 보다 안정적인 약동학 스크리닝에 적극 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
현재 혈액의 건식 저장을 위해 사용되는 유일한 기술은 셀룰로오스기반 기술이지만, 이 기술은 콜드 체인 성능 매트릭스와 매치할 수 없기 때문에 널리 채택되지 못하고 있다. 본 발명의 단백질 조성물은 온 페이퍼 장치를 대신하도록 사용 가능하며, 콜드 체인 저장에 의존하는 기존 방식에 의존하지 않는 보다 새로운 패러다임을 제시해줄 것으로 기대된다.
또한, 본 발명은 소변, 타액 및 다른 체액 또는 세포로부터의 샘플 수집의 또 다른 형태의 진단 유용성을 적용시킬 수 있을 것으로 기대된다.
상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 생체 시료의 안정적인 보존을 위한 시편의 조성물을 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명은 집누에나방(Bombyx mori)의 고치로부터 추출한 단백질 중, β 구조를 형성할 수 있는 가능성이 있는 단위 폴리펩티드의 함량을 조절함으로써, Silk Ⅱ 구조로 전이되는 것을 최대한 지연시켜 보다 안정적인 단백질 조성물을 제조하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같이 단위 폴리펩티드의 함량을 조절함으로써 자발적인 β 구조로의 전이를 감소시킨다. 이와 동시에, 생체 시료의 접촉시 단분자 상태에서도 생체 시료와의 β 구조 형성을 촉진하고, 분자 사슬 간의 상호작용에 영향을 주어 더욱 안정되고 견고한 β 구조로 변환됨으로써, 보다 안정적인 생체 시료의 보존이 가능하다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 피브로인 단백질 조성물을 포함하는 생물학적 샘플 수집 장치를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 재용해도가 뛰어난 실크피브로인 단백질 조성물에 있어서, 상기 실크피브로인 단백질 조성물의 전체 아미노산 함량대비 글리신의 함량이 40 내지 50 중량%, 알라닌의 함량이 25 내지 35 중량%이며, 상기 실크피브로인 단백질 조성물의 평균 분자량이 32 kDa 내지 340 kDa를 가지는 것인, 실크피브로인 단백질 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 글리신은 글리신(β)와 글리신(α)로 구성되고, 상기 글리신(β)와 글리신(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10 : 90인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 알라닌은 알라닌(β)와 알라닌(α)로 구성되고, 상기 알라닌(β)와 알라닌(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10 : 90인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 구체적으로 상기 조성물은 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)를 포함하고, 상기 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)의 중량 비율이 0.1 : 99.9 내지 10 : 90인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 pH 1 내지 13의 범위내에서 제조된 것일 수 있고, 0.1atm 내지 2.0atm의 범위내에서 제조된 것일 수 있으며, 3000RCF 내지 20000RCF의 G-Force 범위내에서 제조된 것일 수 있고, 60분 내지 240분의 반응 시간 범위내에서 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 조성물은 고체 또는 액체 형태이거나, 상기 조성물은 셀룰로오스 베이스 또는 플라스틱 스틱에 도포되어 동결 및 동결 건조된 시편 형태일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 그 자체로 동결 및 동결 건조된 시편 형태이거나, 건조된 분말 입자 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 피브로인 단백질이 3 내지 14일 동안 안정하게 유지되는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 조성물은 22℃ 내지 38℃에서 30일동안 보관 안정성이 유지되는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 조성물은 부가적인 첨가제로서 글리세롤을 전체 중량의 20 내지 90중량% 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 물에 재가용화되어 피브로인 응집체가 없는 실크피브로인 용액을 형성하는 것을 특징으로 하며, 특히 재가용화 후 검출 가능한 양의 생물학적 시료 및 시료에 포함된 활성성분을 회수할 수 있는 것을 특징으로 한다.
상기 조성물을 재가용화 후 검출 가능한 양의 생물학적 시료를 회수할 수 있는 조건은 24시간 내지 14일의 시간, 43℃이하의 온도 조건에서 회수가 가능할 수 있고, 상기 생물학적 시료는 세포, 조직, 혈액 (예를 들어 전혈, 혈장, 혈청, 혈소판 등), 수유 생성물, 양수, 객담, 소변, 타액, 점액, 기관지 흡인물 또는 이들의 분획 또는 이들의 조합이거나, 또는 이들을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 활성성분은 펩티드, 단백질, 항체, 효소, 아미노산, 헥산, DNA 및 이들의 분획, RNA 및 이들의 분획, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 대사물, 지질, 당, 당단백질, 펩티도글리칸, 미생물, 세포 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 하나이상 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 피브로인 단백질 조성물과 생물학적 샘플의 비율이 약 1 : 100 내지 100 : 1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 피브로인 단백질 조성물을 포함하는 생물학적 샘플 수집 장치를 포함하는 키트를 제공한다.
구체적으로, 상기 키트는 가용화제를 함유하는 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 가용화제는 물, 완충용액, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
또한, 구체적으로 상기 키트는 안정화제를 함유하는 용기를 포함할 수 있으며, 상기 안정화제는 생물학적 시료 샘플을 안정화하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 안정화제는 항산화제, 젤라틴 및 그 유도체, 알부민(인간 및 소 혈청), 아미노산, 양이온 및 음이온 계면활성제, 당 알코올 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 안정화제는 뉴클레아제 또는 프로테이나제 억제제일 수 있고, 가장 구체적으로는 안정화제가 RNase 억제제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 구체적으로 상기 키트는 핵산 증폭제, 성분 정제제, 면역 검출제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하여 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물을 이용하면, 기존의 건조 혈반(Dried Blood Spot, DBS)보다 안정성이 개선된 건조 체액 반점DHS(Dried Humoral Spot, DHS)의 조성물에 상기 체액 샘플을 투입한 후, 분석실까지 훨씬 안정적으로 이송할 수 있다.
이러한 DHS(Dried Humoral Spot)는 기존 셀룰로오스 기반의 제품의 단점인 특정 온도 및 습도에 영향을 받는다는 한계점을 극복하였으며, 이송 과정 중 혈액 샘플에서 단백질 무결성을 확보하여 보다 더 정확한 진단이 가능하다.
구체적으로, 본 발명의 단백질 조성물 및 이를 활용한 생물학적 시료의 보관 방법은 다음과 같은 장점을 갖는다.
첫째, 필드 및 소규모 병원에서 샘플 수집이 가능하다.
둘째, 비 숙련된 인원의 샘플 수집이 가능하다.
셋째, 침습적 방법을 최소한도로 이용하여 샘플 수집이 가능하다.
넷째, 안정성이 높아 운송 과정의 편리성이 높다.
다섯째, 외부 환경 요인에 대한 생물학적 시편의 안정성이 높다.
여섯째, 광범위한 생체 시편(혈액, 타액, 소변 등)의 샘플링이 가능하다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 Bombyx mori누에에서 피브로인추출 과정 중 본 발명에서 제시된 범위에서 정련과정을 거쳐 건조된 피브로인의 SEM 사진을 나타낸 것이다(A: 본 발명의 제시된 범위, B: 온도, 압력, 시간을 각각 10% 증가시킨 경우, C: 온도, 압력, 시간을 각각 20%씩 증가시킨 경우).
도 2는 본 발명 조성물인 건조체액 안정화 조성물의 분자량 및 크로마토그램 측정 자료를 나타내었다(A: DHS의 분자량 분포도, B: pH 2.5 수용액 상태에서 크로마토그램, C: pH 3.0 수용액 상태에서 크로마토그램, D: pH 3.5 수용액 상태에서 크로마토그램).
도 3은 본 발명 조성물의 pH에 따른 안정성을 측정한 자료를 나타내었다.
도 4는 도 3의 pH에 따른 변화과정을 Raman 분석을 통해 측정한 자료를 나타내었다.
도 5는 본 발명 조성물의 SEM 측정자료를 나타내었다(A: 본 발명 조성물의 SEM 자료, B: 본 발명 조성물에 플라즈마를 적용한 SEM 자료).
도 6은 본 발명 조성물의 XRD 측정 자료를 나타내었다(A: 실험 직후, B: 14일 경과 후).
도 7은 Luminex 면역 검정 시스템을 이용하여 38℃ 또는 22℃에서 30일동안 샘플을 보관 후 각 바이오 마커를 측정한 자료로서, 백색 블록은 DHS(혈장), 검정 블록은 DHS (혈액), 회색 블록은 액체 플라즈마를 나타내었다(A: SAP(serum amyloid P component), B: sVCAM-1(soluble cell adhesion molecule), C: CRP(C-reactive protein)).
도 8은 실험 직후 및 2주 후의 LP(Liquid Plasma), DBS(Dried Blood Spot (cellulose sheet)), DHS(Dried Humoral Spot (silk sheet))의 총 PSA 측정값을 나타내었다(A: 실험 직후, B: 22도 및 43도에서 2주 경과 후).
도 9는 실험 직후 및 2주 후의 LP(Liquid Plasma), DBS(Dried Blood Spot (cellulose sheet)), DHS(Dried Humoral Spot (silk sheet))의 렙틴 측정값을 나타내었다(A: 실험 직후, B: 22도 및 43도에서 2주 경과 후).
도 10은 실험 직후 및 2주 후의 LP(Liquid Plasma), DBS(Dried Blood Spot (cellulose sheet)), DHS(Dried Humoral Spot (silk sheet))의 프로락틴 측정값을 나타내었다(A: 실험 직후, B: 22도 및 43도에서 2주 경과 후).
도 11은 서로 다른 실크 피브로인 품종별(7 품종) 아미노산 함량을 크로마토그래픽으로 분석하여 측정한 자료를 나타내었다(A (Baekok jam), B (Geumgwang ju), C (Hansang Ⅱ), D (Hong bak), E (Imbakgal won), F (N74), G (SK), H (Won jam 125), I (Won won 126)).
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 또 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 본 발명의 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 기술적으로 구현되는 의도가 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
각각의 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 수치는 본 발명의 명확성을 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다. 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 발명에서, 사용되어지는 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 구성요소 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 다른 부분 "상에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 다른 부분 "하부에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 아래에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다.
본 발명에 사용되는 집누에나방(Bombyx mori)에서 피브로인을 추출하는 과정 중 정련 방법은 통상의 기술자에게 알려진 공지된 방법을 포함해 여러 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 “피브로인(Fibroin)”은 집누에나방 유충 등의 다른 나방 속에 의해 생산되는 실크에 포함된 불용성 단백질을 의미한다.
본 발명에서 용어 “실크”는 가잠견(Bombyx mori silkworm, 집누에) 또는 야잠견(Tussah, Giant silkworm, 들누에)을 통칭하여 누에로부터 추출한 피브로인 및 실크 그 자체를 의미할 수 있으며, 본 발명에서는 집누에라고도 불리는 가잠견을 사용하여 본 발명의 조성물을 제조하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
통상적으로 본 발명에 사용되는 누에는 가잠견 또는 야잠견에 국한되지 아니한다. 하지만, 가잠견의 경우 글리신(Glycin) 42 내지 47 중량 백분율, 알라닌(Alanine) 27 내지 32 중량 백분율, 세린(Serine) 10 내지 14 중량 백분율의 비율을 일정하게 유지하고 있어, 각 구성 성분의 비율 예측 및 조정 가능해 사용하기 유리하다.
누에에서 추출되는 단백질인 실크 피브로인은 대부분 반복된 소수성 부위와 친수성 부위를 가지는 중쇄(heavy chain)와 친수성 아미노산으로 구성된 경쇄(light chain)로 구성되어있다.
전술한 바와 같이 누에의 정련 과정은 여러 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 다만, 종래의 방법으로 초기 정련과정을 진행하는 경우, 도 1과 같이 소수성 부위를 가지는 중쇄(heavy chain)부분이 증가된다. 이렇게 증가된 중쇄가 베타 시트(β-sheet) 연결 공유결합을 형성시켜 본 발명의 목적인 안정화에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명은 체액의 안정화를 위한 피브로인 조성물을 제조하기 위한 Bombyx mori의 정련 및 추출 프로세스를 제공한다.
구체적으로, Na2CO3를 사용하여 시간은 60분 내지 120분, 온도는 100도 내지 120도, 압력은 0.1 내지 2.0mbar인 조건에서 정련을 시행하였다.
상기의 조건을 초과하여 정련을 실행하는 경우, Bombyx mori가 비등(boiling)되어 가수분해된 피브로인이 부분적으로 생성되므로, 본 발명의 목적성에 부합하지 않는다.
상기 Bombyx mori로부터 추출된 실크피브로인은 수성 염 용액에 용해될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 수성 용액은 브로민화리튬, 리튬 티오시아네이트, 질산칼슘, 칼슘클로라이드 혼합물 또는 추출물을 용해할 수 있는 다른 화학물질을 사용할 수 있다.
일반적으로 브로민화리튬 용액을 이용하는 경우 분자량의 저하가 발생되지 않지만 예를 들어 CaCl2가 함유된 혼합용액을 사용하는 경우에는 분자량 저하가 발생한다.
본 발명에서는 통상적인 방법인 8 내지 12몰의 브로민화리튬을 사용하여 실크피브로인을 용해하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후 염 용액을 제거하는 과정에서는 통상적인 방법으로서 멤브레인을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 피브로인과 수성용액의 첨가 비는 1:5 내지 1:100일 수 있다. 예를 들어 적어도 1:5, 적어도 1:10, 적어도 1:15, 적어도 1:20, 적어도 1:25, 적어도1:30, 적어도 1:40, 적어도 1:45, 적어도 1:50, 적어도 1:55, 적어도 1:60, 적어도 1:65, 적어도 1:70, 적어도 1:75, 적어도 1:80, 적어도 1:85, 적어도 1:90, 적어도 1:95, 적어도 1:100 이다.
일부 실시양태에서, 온도는 50도 내지 160℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 시간은 예를 들어 적어도 60분 내지 240분일 수 있다. 예를 들어, 적어도 60분, 적어도 70분, 적어도 80분, 적어도 90분, 적어도 100분, 적어도 110분, 적어도 120분, 적어도 130분, 적어도 140분, 적어도 150분, 적어도 160분, 적어도 170분, 적어도 180분, 적어도 190분, 적어도 200분, 적어도 210분, 적어도 220분, 적어도 230분, 적어도 240분이다.
일부 실시양태에서는, 압력은 0.1 내지 2.0 atm일 수 있다. 예를 들어 적어도 0.1atm, 적어도 0.2 atm, 적어도 0.3 atm, 적어도 0.4 atm, 적어도 0.5 atm, 적어도 0.6 atm, 적어도 0.7 atm, 적어도 0.8 atm, 적어도 0.9 atm, 적어도 1.0 atm, 적어도 1.1 atm, 적어도 1.2 atm, 적어도 1.3 atm, 적어도 1.4 atm, 적어도 1.5 atm, 적어도 1.6 atm, 적어도 1.7 atm, 적어도 1.8 atm, 적어도 1.9 atm, 적어도 2.0 atm이다.
일부 실시양태에서는, 중력은 3000 내지 20000RCF일 수 있다. 예를 들어 적어도 3000 RCF, 적어도 4000 RCF, 적어도 5000 RCF, 적어도 6000 RCF, 적어도 7000 RCF, 적어도 8000 RCF, 적어도 9000 RCF, 적어도 10000 RCF, 적어도 11000 RCF, 적어도 12000 RCF, 적어도 13000 RCF, 적어도 14000 RCF, 적어도 15000 RCF, 적어도 16000 RCF, 적어도 17000 RCF, 적어도 18000 RCF, 적어도 19000 RCF, 적어도 20000 RCF이다.
일부 실시양태에서는, heavy chain, light chain 및 p25 단백질로 구성되어 있는 이중 피브로인은 글리신, 알라닌 및 세린이 반복되는 결정성 영역을 형성하는 11개의 도메인, 중간부분 그리고 C-말단 N-말단의 비결정성 영역으로 구성되어있다.
상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 heavy chain과 light chain의 중량 비율은 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.
예를 들어 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.
일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Gly의 중량 비율이 40%일 때, Gly(β)와 Gly(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.
예를 들어, Gly(β)와 Gly(α)의 비율은 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.
일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Gly의 중량 비율이 45%일 때, 적어도 Gly(β)와 Gly(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.
예를 들어, Gly(β)와 Gly(α)의 비율은 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.
일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Gly의 중량 비율이 50%일 때, 적어도 Gly(β)와 Gly(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.
예를 들어, Gly(β)와 Gly(α)의 비율은 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.
일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Ala의 중량 비율이 25%일 때, 적어도 Ala(β)와 Ala(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.
예를 들어, Ala(β)와 Ala(α)의 비율은 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.
일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Ala의 중량 비율이 30%일 때, 적어도 Ala(β)와 Ala(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.
예를 들어, Ala(β)와 Ala(α)의 비율은 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.
일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Ala의 중량 비율이 35%일 때, 적어도 Ala(β)와 Ala(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.
예를 들어, 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.
일부 실시양태에서, 본 조성물의 수용액의 pH 변화에 따라 분자쇄(chain) 간의 상호 결합 시간이 달라질 수 있다.
즉, 이론적으로는 피브로인을 포함한 단백질은 등전점(isoelectronic point) 부근에서 중쇄(heavy chain), 경쇄(light chain) 및 랜덤 코일(random coil) 분자쇄들이 양쪽성 이온(zwitter ion)을 형성하여 상호간의 이온 반발력이 최소화하게 된다. 이에 따라 거대 분자쇄들 사이에 소수성결합, 수소결합, 이온결합 등의 증가 또는 감소에 의해 β-sheet 구조가 형성되고, 망상구조로 발달하게 되어 겔의 형성에 영향을 준다.
본 발명에 생성된 조성물에서 적어도 pH 1 이하일때, 분자쇄간 상호 반발력이 작용하여 겔이 생성되지 않았다. pH 1 내지 13일 때는 분자쇄간 상호 반발력이 감소하여 겔 형성 시간이 감소되었다. pH 3 일 때 분자쇄간 상호 반발력이 최소이며, pH가 증가할수록 분자쇄간 상호 반발력이 증가하여 겔 형성 시간이 증가되었다.
적어도 pH 13 이상에서는 분자쇄간의 음전하 또는 양전하가 우세하게 되며, 이에 따라 발생하는 분자간의 강한 이온 반발력으로 인하여 분자쇄들 사이에 응집이 이루어지지 않음을 실시예를 통해서 확인하였다.
일부 실시양태에서, 상기의 pH변화에 따른 분자쇄간의 상호 결합시간은 조성물의 농도에 따라 달라질 수 있으며, 농도는 0.1 중량 분율 내지 60 중량 분율일 수 있다.
예를 들어, 농도는 적어도 조성물의 농도가 0.1 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 1 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 2 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 3 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 4 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 5 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 6 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 7 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 8 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 9 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 10 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 11 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 12 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 13 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 14 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 15 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 16 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 17 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 18 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 19 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 20 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 21 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 22 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 23 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 24 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 25 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 26 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 27 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 28 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 29 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 30 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 31 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 32 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 33 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 34 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 35 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 36 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 37 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 38 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 39 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 40 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 41 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 42 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 43 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 44 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 45 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 46 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 47 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 48 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 49 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 50 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 51 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 52 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 53 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 54 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 55 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 56 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 57 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 58 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 59 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 60 중량 분율 일때, 상기의 pH에 대한 특성이 발현된다.
일부 실시양태에서, 상기 전체의 과정에서 제조된 본 발명의 조성물의 안정성을 추가하기 위해 추가적인 첨가물로써 글리세롤을 첨가할 수도 있다.
글리세롤의 첨가 함량은 본 발명의 수용액상 조성물 대비 적어도 20 중량 백분율, 적어도 25 중량 백분율, 적어도 30 중량 백분율, 적어도 35 중량 백분율, 적어도 40 중량 백분율, 적어도 45 중량 백분율, 적어도 50 중량 백분율, 적어도 55 중량 백분율, 적어도 60 중량 백분율, 적어도 65 중량 백분율, 적어도 70 중량 백분율, 적어도 75 중량 백분율, 적어도 80 중량 백분율, 적어도 85 중량 백분율, 적어도 90 중량 백분율 이다.
상기의 범위 이상이면 글리세롤 함량이 증가함에 따라 겔화 시간이 서서히 감소한다. 이는 글리세롤의 강한 친수성 작용으로 단백질영역 내에서 물을 배제시켜 단백질의 소수성을 증가시킴으로써 소수성결합에 영향을 미치는 구조로 되어 안정화되기 때문이다.
일부 실시양태에서, 상기 과정에서 제조된 본 발명의 조성물은 셀룰로오스 베이스에 도포를 하여 동결 및 동결 건조된 시편 형태일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 과정에서 제조된 본 발명의 조성물은 그 자체로 동결 및 동결 건조된 시편 형태일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 과정에서 제조된 본 발명의 조성물은 건조된 분말 입자 형태일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 전체의 과정에서 제조된 본 발명의 조성물은 플라스틱 및 그와 유사한 스틱에 도포하여 동결 및 동결 건조한 시편 형태일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 전체의 과정에서 제조된 본 발명의 조성물은 수용액 상태의 시편일수도 있다.
이하, 바람직한 실시예가 본 발명에 상세하게 묘사되고 기술되었지만, 관련 기술의 숙련자는 다양한 변형, 추가, 대체 등이 본 발명의 취지를 벗어남 없이 이루어질 수 있고 이것이 청구항에 정의된 본 발명의 범위 내에서 고려될 수 있음을 명확히 한다. 본 발명에 기술되고 설명된 다양한 실시 예 중 어느 하나가 본 발명에 개시된 다른 임의의 실시예에서 보여지는 특징을 도입하여 추가로 변형될 수 있다는 것이 통상의 관련 기술자에 의해 이해될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 고체 시편의 Ser, Gly, Ala 함량 분석
본 발명의 고체 시편의 아미노산 조성을 확인하기 위하여, 세린(Ser), 글라이신(Gly) 및 알라닌(Ala)의 함량을 아미노산 분석기(L-8900, hitachi)를 사용하여 분석하였다.
구체적으로, 본 발명 조성물에 6N 염산 10mL을 가한 후, 내부를 질소 가스로 치환 및 밀봉하여 110℃ 온도에서 24시간 가열하여 가수분해한 후 아미노산을 측정하였다.
이때, 피브로인과 가용성 염의 비율은 1 대 40으로 고정하였고, G-Force는 3000 RCF로 고정하였으며, 온도, 시간, 압력 및 pH를 달리하여 1차 아미노산 중 Ser, Gly, Ala의 함량 차이를 확인하였다.
실험 1은 온도 50도, 실험 2는 온도 140도에서 제조하였고, 시간은 60분, 압력은 0.1atm, pH 2.5에서 제조하여 측정하였다.
실험 3는 시간 60분, 실험 4는 시간 240분에서 제조하였고, 온도 50도, 압력은 0.1atm, pH 2.5에서 제조하여 측정하였다.
실험 5는 압력 0.1atm, 실험 6은 압력 2.0atm에서 제조하였고, 온도 50도, 시간은 60분, pH 2.5에서 제조하여 측정하였다.
실험 7은 pH 2.5, 실험 8은 pH 3.0, 실험 9는 pH 3.5에서 제조하였고, 온도 50도, 시간은 60분, 압력은 0.1atm에서 제조하여 측정하였다.
실험 1 실험 2 실험 3 실험 4 실험 5 실험 6 실험 7 실험 8 실험 9
Ser 2.5 4.0 1.8 1.3 3.6 3.2 3.9 3.2 3.5
Gly 40.4 40.6 41.0 46.5 40.8 40.2 40.6 40.4 46.4
Ala 30.4 28.3 28.3 30.7 28.4 29.8 27.9 28.2 27.1
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 실험을 통해 본 발명에서 제시한 범위에서 제조한 실크 피브로인 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열 중 글리신 및 알라닌 함량은 증가되는 반면, 상대적으로 세린의 함량은 감소하여 본 발명의 조성물이 수용액상에서의 안정성을 확보할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 건조체액반점(DHS)의 분자량 분포 측정
분자량 분포를 측정하기 위해 동결 건조된 시편을 요소에 첨가하여 4M의 실크 수용액을 제조한 후 Fast Protein Liquid Chromatography(FPLC)(AKTA Purifier, Amersham Biosciences)로 측정하였다. 칼럼은 superdex 200 10/300GL를 사용하였고, 유량속도는 0.5ml/min으로 하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 수용액 상태의 피브로인 시료는 크로마토그램에서는 분자량의 상한분획한계에 해당하는 10 min 지점에서 날카로운 피크(sharp peak)와 15 min에서 30 min까지 넓은 영역에서 넓은 피크(broad peak)를 나타내었다.
즉, 수용액 상태의 피브로인은 약 350kDa의 heavy chain의 펩타이드로부터 칼럼의 분획한계인 30 kDa 이하까지 넓은 범위의 분자량 분포를 가지는 것을 확인하였다.
10 min에 나타나는 peak는 부분적으로 중쇄(heavy chain), 경쇄(light chain), 랜덤 코일(random coil)이 시간의 경과에 따라 분자쇄 간의 β-sheet를 형성함으로써 겔을 형성하는 것을 확인하였다.
유전자 염기서열에 기반하여 계산한 중쇄(heavy chain)의 분자량은 340kDa이므로, 상기 실험 결과를 보면 본 발명의 피브로인 조성물은 분자쇄가 서로 뭉쳐서 단백질 콜로이드를 형성하는 것을 억제하는 것으로 보인다.
또한, 이와 동시에 서로 연결되는 3차원적 망상구조를 형성하는 분산계의 반고형 겔 형성을 억제함으로써, 보다 안정화된 조성물을 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 건조체액반점(DHS)의 13C NMR 구조 분석
실크 피브로인에 대한 구조적 유사성을 확인하기 위하여, 13C NMR 분석을 실시하였다.
본 발명을 통해 제조한 실크 단백질 조성물을 물로 결정화시킨 시료에서는 분광 분석 결과 Gly(Cα) 44.6ppm, Gly(C=O) 169.5ppm, Ala(Cα)49.8ppm, Ala(Cβ) 21.4ppm, Ala(C=O) 173.0 ppm에서 peak가 관측되었다.
메탄올을 이용하여 결정화시킨 조성물에서는 각각 Gly(Cα) 45.6ppm, Gly (C=O) 170.4ppm, Ala(Cα) 50.7ppm, Ala(Cβ) 22.1 ppm, Ala(C=O) 173.9 ppm에서 peak가 관측되었다.
그리고 메탄올과 물의 혼합 용액에(80:20)의해 결정화된 조성물은 Gly(Cα) 44.5 ppm, Gly(C=O) 169.4ppm, Ala(Cα) 49.7ppm, Ala(Cβ) 20.7 ppm, Ala(C=O) 172.0 ppm에서 peak가 관측이 되었다.
silk Ⅱ의 구조에서 특징적으로 나타나는 Ala β 탄소 Ala(Cβ)에 의한 peak가 20 ppm 부근에서 나타나는 것으로 보아, 본 발명에서 제조된 조성물은 모두 피브로인과 유사한 구조적인 특성을 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 4. 생물학적 시편으로부터의 혈액 회수
본 발명에서 사용되는 생체 시편의 혈장 및 혈액의 회수율을 계산하기 위하여, 혈액 및 혈장 시편으로부터 회수된 단백질의 수치를 공여자와 일치된 혈장에서 발견된 농도로 정확하게 변환하여 회수율 효율을 측정하였다.
혈액 및 혈장의 물리적 측정을 위해 흄 후드(Fume Hood)에서 24시간 동안 전혈 또는 전체 혈장을 건조시키고 잔류물을 측정함으로써, 혈액 또는 혈장의 무게/부피 분율(중량%; 단위 부피(ml)당 혈액 또는 건조된 혈장(g))을 측정하였다. 그리고 혈액 중 혈장 부피를 기존 문헌에 따라 55%로 가정하여 혈액 부피 당 혈장 고체의 중량 분율을 추정하였으며, 이를 하기 계산식 1 및 2에 나타내었다.
[계산식 1]
혈액 중 고체 혈장 중량 fraction(g/mL) = 혈장 중량 fraction(g/mL) Ⅹ 0.55 (혈장 부피 mL/전체 혈액 부피 mL)
[계산식 2]
생체 시편의 중량 당 고체혈장 fraction(g/g) = 혈액 중의 건조된 혈장 중량 fraction(g/mL) Ⅹ 0.02 mL 혈액
고체 혈장의 질량 표준화는 40mg 시편 중 혈장 농도(mg/mL)와 곱하고 이것을 960ul의 1ⅩPBS에 현탁한 부피(약 1.02±0.05 mL) 중 총 고체 혈장의 질량을 표준화하여 계산식 3 및 4에 나타내었다.
[계산식 3]
40mg 생체 시편 중 이론적 혈장 fraction (mg/mL) = 혈장 시편의 중량 당 고체 혈장(mg/mg) Ⅹ 시편 40mg Ⅹ (혈장 농도(mg/mL)/(고체 혈장 중량 fraction(mg/mL) Ⅹ PBS 현탁부피(mL))
[계산식 4]
40mg 생체 시편 중 이론적 혈액 fraction (mg/mL) = 혈액 시편의 중량 당 고체 혈장(mg/mg) Ⅹ 시편 40mg Ⅹ (혈장 농도(mg/mL)/(고체 혈장 중량 fraction(mg/mL) Ⅹ PBS 현탁부피(mL))
상기한 방법 및 계산식을 이용하여 5명의 혈액을 1ml씩 추출하고, 이들의 측정 평균치를 하기 표 2에 나타내었다.
혈액 중량 fraction 혈장 중량 fraction 고체 혈장 중량 fraction 혈액 중량 당
고체 혈장		 혈장 중량 당
고체 혈장
0.22 0.10 0.06 0.04 0.07
상기의 결과로부터, 본 발명의 조성물을 이용하면 혈액 및 혈장의 회수율이 통계학적으로 유의한 수준에 도달할 수 있음을 확인하였다.따라서, 본 발명의 조성물을 사용하면 혈액 및 혈장의 종류에 관계없이, 생체 시편으로부터 분석물을 효과적으로 회수할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. C-반응성단백질의 회수율
본 발명의 조성물을 이용하는 경우의 분석물 회수율을 측정하였다. 마커로 사용된 분석물로서 C-반응성단백질을 사용하였고, 측정 결과 통계학적으로 유의한 수준에 도달한 것을 확인하였다.
구체적으로, 본 실험방법은 간단한 채혈로 얻은 검체를 면역 검사(immunoassay)를 이용하여 C-반응성 단백질의 함량을 측정하였다.
일반적으로 사용하는 면역 검사 방법(immunoassay)으로는 응집법(particle immunoassay), 효소 면역 측정법(enzyme immunoassay, EIA), 방사 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 화학 발광 면역 측정법 등을 사용할 수 있다. 본 실시예 에서는 효소 면역 측정법(enzyme immunoassay, EIA)을 이용하여 C-반응성단백질을 수치화 하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전 처리과정을 거친 두 종의 샘플에 결합하는 항체에 효소를 미리 부착시켜 놓고 항원 항체반응을 유도하였다. 그 후 결합한 효소에 반응하는 기질을 첨가하여 효소 반응을 유도하였다.
이때 사용되는 효소는 알카리성 인산분해효소(alkaline phosphatase), 당근과산화효소(horseradish peroxidase), 메타갈라토시다제(β-galactosidase) 중 어느 하나를 사용하여 측정 가능하다. 그리고 효소 반응 후 분광광도계(spectrophotometer)을 사용하여 C-반응성 단백질의 농도를 도출하였다.
건강한 성인 남성 10명을 대상으로 측정한 결과 플라즈마 샘플에서는 평균 수치는 0.7±0.2(mg/dL)을 나타내었으며, 본 조성물에서 측정한 수치는 0.7±0.23(mg/dL)로 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 6. 액체 혈장대비 매트릭스의 안정화 검증 실험
본 실시예는 Luminex Assays 프로토콜을 이용하여 액체 혈장대비 매트릭스의 안정화를 비교하는 실험을 실시하였다.
구체적으로, 본 조성물의 저장 상태 및 샘플운송 시간 프레임을 시뮬레이션하기 위해 22℃ 및 38℃의 항온 인큐베이터에서 30일 동안 샘플을 보관한 후, 별도의 공여자 혈액 샘플에서 3개의 마커를 측정하였다.
상기 3개의 마커는 SAP(혈청 아밀로이드 P 성분, serum amyloid P component), sVCAM-1(수용성 세포 부착 분자, soluble cell adhesion molecule) 및 CRP(C-반응성 단백질, C-reactive protein)를 사용하였다.
22℃에서의 보관 안정성은 표 3에, 38℃에서의 보관 안정성은 표 4에 나타내었다. 이때, 건조체액시편(DHS)에 혈장을 처리한 것은 DHS(혈장), 혈액을 처리한 것은 DHS(혈액)으로 표시하였다. 또한, 혈장은 -20℃에서 동결 보관 및 해동 후에 검측하였다.
DHS (혈장) DHS (혈액) 혈장
CRP % recovery 85 75 95
SAP % recovery 95 110 95
sVCAM-1 % recovery 97 105 80
DHS (혈장) DHS (혈액) 혈장
CRP % recovery 80 75 95
SAP % recovery 110 110 110
sVCAM-1 % recovery 95 105 40
상기 결과에 나타난 바와 같이, 본 조성물을 이용해 처리한 혈장 및 혈액은 sVCAM-1, CRP, SAP에서 -20℃에서 동결된 혈장과 비슷한 수준의 회복 정도를 보여, 우수한 안정성을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 7. 보존 온도 및 시간에 따른 바이오 마커의 회수 및 안정성 실험
상기 실시예 6에서 확인한 3종의 바이오마커 외에 프로락틴(prolactin), 태아성암항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 렙틴(leptin), TNF 관련 세포사멸 유도 리간드(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL) 및 총 전립선 특이 항원(total prostate specific antigen, total PSA)을 대상으로 온도 및 시간에 따른 회수 및 안정성 실험을 실시하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
이때, 하기 표 5에서 LP는 액체 혈장(Liquid Plasma), DHS는 본 발명 조성물 시트 기반의 건조체액반점, DBS는 셀룰로오스 시트 기반의 건조체액 반점을 나타내었다.
0 일(DAY) 2주 후
LP DHS DBS LP DHS DBS
보존온도 (℃) -80℃ 22℃ 22℃ 22℃ 22℃ 43℃ 22℃ 43℃ 22℃ 43℃

마
커 		PROLACTIN ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ○ ○
CEA ● ● ● ○ ● ○ ● ● ● ○
LEPTIN ● ● ● ○ ● ○ ◎ ● ○ ○
TRAIL ● ● ● ● ○ ● ● ● ● ○
TOTAL PSA ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ○ ○
- ● : 유의한 차이가 없음
- ◎ : 유의하게 낮은 수준
- ○ : 안정성 문제 발생
상기 실험 결과에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물인 DHS는 상온 및 높은 온도에서 우수한 저장안정성을 보이며, 기존 기술인 셀룰로오스 시트 기반의 기술 대비 현저히 개선된 효과를 나타내는 것을 확인하였다.전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 재용해도가 뛰어난 실크피브로인 단백질 조성물에 있어서,
    상기 실크피브로인 단백질 조성물의 전체 아미노산 함량대비 글리신의 함량이 40 내지 50 중량%, 알라닌의 함량이 25 내지 35 중량%이며,
    상기 실크피브로인 단백질 조성물의 평균 분자량이 32 kDa 내지 340 kDa를 가지는 것인, 실크피브로인 단백질 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 글리신은 글리신(β)와 글리신(α)로 구성되고,
    상기 글리신(β)와 글리신(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10 : 90이며,
    상기 알라닌은 알라닌(β)와 알라닌(α)로 구성되고,
    상기 알라닌(β)와 알라닌(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10 : 90이며,
    상기 조성물은 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)를 포함하고,
    상기 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)의 중량 비율이 0.1 : 99.9 내지 10 : 90인 것인, 실크피브로인 단백질 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 pH 1 내지 13, 기압 0.1atm 내지 2.0atm, 중력 가속도 3000RCF 내지 20000RCF 및 반응 시간 60분 내지 240분의 범위내에서 제조된 것을 특징으로 하는, 실크피브로인 단백질 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 고체 또는 액체 형태인, 실크피브로인 단백질 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 셀룰로오스 베이스 또는 플라스틱 스틱에 도포되어 동결 및 동결 건조된 시편 형태인 것을 특징으로 하는, 실크피브로인 단백질 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 그 자체로 동결 및 동결 건조된 시편 형태인 것을 특징으로 하는, 실크피브로인 단백질 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 건조된 분말 입자 형태인 것을 특징으로 하는, 실크피브로인 단백질 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 피브로인 단백질이 3 내지 14일 동안 안정하게 유지되는 것을 특징으로 하는, 실크피브로인 단백질 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 22℃ 내지 38℃에서 30일동안 보관 안정성이 유지되는 것을 특징으로 하는, 실크피브로인 단백질 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 물에 재가용화되어 피브로인 응집체가 없는 실크피브로인 용액을 형성하는 것을 특징으로 하는, 실크피브로인 단백질 조성물.
PCT/KR2021/006888 2020-09-16 2021-06-02 진단을 위한 개선된 건조체액의 안정화 조성물 및 이의 응용방법 WO2022059885A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200118984A KR102194995B1 (ko) 2020-09-16 2020-09-16 진단을 위한 개선된 건조체액의 안정화 조성물 및 이의 응용방법
KR10-2020-0118984 2020-09-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022059885A1 true WO2022059885A1 (ko) 2022-03-24

Family

ID=74087097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/006888 WO2022059885A1 (ko) 2020-09-16 2021-06-02 진단을 위한 개선된 건조체액의 안정화 조성물 및 이의 응용방법

Country Status (2)

Country Link
KR (4) KR102194995B1 (ko)
WO (1) WO2022059885A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102194995B1 (ko) * 2020-09-16 2020-12-28 장혜란 진단을 위한 개선된 건조체액의 안정화 조성물 및 이의 응용방법
KR20240022709A (ko) 2022-08-12 2024-02-20 주식회사 어큐진 건조혈반용 혈액수집 카드

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150131329A (ko) * 2013-03-15 2015-11-24 트러스티즈 오브 터프츠 칼리지 저분자량 실크 조성물 및 안정화 실크 조성물
KR20170041275A (ko) * 2014-08-20 2017-04-14 실크 테크놀로지스 리미티드 피브로인 유래 단백질 조성물
KR20180062244A (ko) * 2016-11-30 2018-06-08 서울대학교산학협력단 광가교된 실크 피브로인을 제조하는 방법 및 그에 의해 제조된 광가교된 실크 피브로인
KR20190042608A (ko) * 2016-08-12 2019-04-24 실크 테크놀로지스 리미티드 염증 치료용 실크 유래 단백질
KR101981790B1 (ko) * 2017-04-07 2019-05-27 주식회사 종근당바이오 실크 피브로인으로 코팅되어 장내 정착성이 향상된 유산균을 포함하는 조성물
KR102194995B1 (ko) * 2020-09-16 2020-12-28 장혜란 진단을 위한 개선된 건조체액의 안정화 조성물 및 이의 응용방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ628481A (en) 2012-01-11 2016-11-25 Adelaide Res & Innovation Pty Stabilising and analysing fatty acids in a biological sample stored on solid media

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150131329A (ko) * 2013-03-15 2015-11-24 트러스티즈 오브 터프츠 칼리지 저분자량 실크 조성물 및 안정화 실크 조성물
KR20170041275A (ko) * 2014-08-20 2017-04-14 실크 테크놀로지스 리미티드 피브로인 유래 단백질 조성물
KR20190042608A (ko) * 2016-08-12 2019-04-24 실크 테크놀로지스 리미티드 염증 치료용 실크 유래 단백질
KR20180062244A (ko) * 2016-11-30 2018-06-08 서울대학교산학협력단 광가교된 실크 피브로인을 제조하는 방법 및 그에 의해 제조된 광가교된 실크 피브로인
KR101981790B1 (ko) * 2017-04-07 2019-05-27 주식회사 종근당바이오 실크 피브로인으로 코팅되어 장내 정착성이 향상된 유산균을 포함하는 조성물
KR102194995B1 (ko) * 2020-09-16 2020-12-28 장혜란 진단을 위한 개선된 건조체액의 안정화 조성물 및 이의 응용방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220036821A (ko) 2022-03-23
KR20220036820A (ko) 2022-03-23
KR102439101B1 (ko) 2022-09-01
KR102194995B1 (ko) 2020-12-28
KR102386879B1 (ko) 2022-04-15
KR102386874B1 (ko) 2022-04-15
KR20220036822A (ko) 2022-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2022059885A1 (ko) 진단을 위한 개선된 건조체액의 안정화 조성물 및 이의 응용방법
Albert et al. The 87-kDa protein, a major specific substrate for protein kinase C: purification from bovine brain and characterization.
AU2004260961B2 (en) Analytical method for pancreatin and comparable compositions
Bollenbacher et al. Insect prothoracicotropic hormone: evidence for two molecular forms
Liu et al. Hydrolysis of proteins with p-toluenesulfonic acid: Determination of tryptophan
Weinshilboum et al. Serum dopamine-beta-hydroxylase activity
Jackson et al. A comparison of the major apolipoprotein from pig and human high density lipoproteins
Kanda et al. Intestinal fatty acid-binding protein as a sensitive marker of intestinal ischemia
Fekete et al. Hyaluronidase in the fertilization of mammalian ova
Kawiak et al. Non-pancreatic proteases of the chymotrypsin family I. A chymotrypsin-like protease from rat mast cells
Chakraborty et al. Isolation of fibronectin type III like peptide from human placental extract used as wound healer
Sulakhe et al. Calcium ion stimulated endogenous protein kinase catalyzed phosphorylation of basic proteins in myelin subfractions and myelin-like membrane fraction from rat brain
Toyama et al. Ca2+-calmodulin mediated modulation of the electrical coupling of ventricular myocytes isolated from guinea pig heart
Gribskov et al. Evidence for unmasking of rat brown-adipose-tissue mitochondrial GDP-binding sites in response to acute cold exposure. Effects of washing with albumin on GDP binding
Tsuboi et al. Sugar hydrolases and their arrangement on the rat intestinal microvillus membrane
Georges et al. Chemical modification of charged amino acid moieties alters the electrophoretic mobilities of neurofilament subunits on SDS/polyacrylamide gels
Mill et al. Enzyme-like Globulins from Serum Reproducing the Vascular Phenomena of Inflammation: VI. Isolation and Properties of Permeability Factor and its Inhibitor in Human Plasma
Kwa Studies on the sparganum of Spirometra erinacei—II. Proteolytic enzyme (s) in the scolex
Shepherd A polypeptide sperm activator from male saturniid moths
Kurl et al. Identification and immunohistochemical localization of a tryptophan binding protein in nuclear envelopes of rat liver
Hoffman et al. ATP‐stimulated transmitter release and cyclic amp synthesis in isolated chromaffin granules
Pohorecky et al. Purification and properties of rat adrenal phenylethanolamine-N-methyl transferase
EP0339531B1 (en) Physiological active liquid allergenic composition from biological raw materials
Ahmad et al. In-gel detection of esterase-like albumin activity: Characterization of esterase-free sera albumin and its putative role as non-invasive biomarker of hepatic fibrosis
Srivastava et al. Inhibition of the fertilizing capacity of rabbit spermatozoa by sialoproteins

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21869509

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 07/08/2023)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21869509

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1