WO2022059302A1 - 顕微鏡標本の作製方法、顕微鏡標本、押圧治具、および顕微鏡標本の観察方法 - Google Patents

顕微鏡標本の作製方法、顕微鏡標本、押圧治具、および顕微鏡標本の観察方法 Download PDF

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WO2022059302A1
WO2022059302A1 PCT/JP2021/025487 JP2021025487W WO2022059302A1 WO 2022059302 A1 WO2022059302 A1 WO 2022059302A1 JP 2021025487 W JP2021025487 W JP 2021025487W WO 2022059302 A1 WO2022059302 A1 WO 2022059302A1
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plane
pressing
protective layer
pressing member
sample
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PCT/JP2021/025487
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French (fr)
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佳祐 山口
淳弥 若原
光太郎 門田
紘明 剣持
敦 長谷川
Original Assignee
コニカミノルタ株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a microscope specimen, a microscope specimen, a pressing jig, and a method for observing the microscope specimen.
  • the cover glass used for preparing microscope specimens has a large thickness tolerance. Therefore, when observing a plurality of places (observation area) of a sample in order to acquire a whole slide image (WSI) obtained by taking a whole or a wide range of the sample using a lens with a high magnification and a high numerical aperture, the observation field of view
  • the encapsulation thickness (sum of the thickness of the filler and the cover glass) varies from one to another.
  • the optical path length is different for each observation field of view, the influence of spherical aberration becomes large, which causes a problem that a clear observation image cannot be obtained and a problem that the appearance is different when the observation field of view is changed.
  • Patent Document 1 describes a sample in which a cover glass is placed on a slide glass via a sample and an encapsulant. According to Patent Document 1, a microscope specimen having a thin and uniform encapsulation layer can be obtained by pressure-bonding the magnetic material under the slide glass and the magnet on the cover glass by the magnetic force, and the observation image is clearer than before. It is said that it was obtained.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is a method for preparing a microscope specimen capable of making the encapsulation thickness substantially uniform, a microscope specimen having a substantially uniform encapsulation pressure, and making the encapsulation thickness substantially uniform. It is an object of the present invention to provide a pressing jig capable of capable. It is also an object of the present invention to provide a method for observing a microscope specimen, which can accurately detect an object to be observed.
  • a method for preparing a microscopic specimen according to an embodiment of the present invention for solving the above problems is a substrate, a sample arranged on the substrate, a packing layer for covering the sample, the sample, and the filling.
  • the process of installing the body and the second plane of the second pressing member having the second plane are arranged in parallel with the first plane, and are installed on the first plane in the second plane. It has a step of pressing the laminated body in the normal direction of the first plane.
  • the microscope specimen according to the embodiment of the present invention for solving the above-mentioned problems includes a substrate, a sample placed on the substrate, a packed layer covering the sample, and the sample and the packed layer. It has a protective layer to be coated, and the range of variation in the distance between the substrate and the upper surface of the protective layer is ⁇ 30 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less.
  • the pressing jig according to the embodiment of the present invention for solving the above-mentioned problems includes a substrate, a sample arranged on the substrate, a packing layer for covering the sample, and the sample and the filling layer.
  • the first pressing member or the second pressing member is such that the distance between the first pressing member and the second pressing member changes while maintaining a state in which the first plane and the second plane are parallel to each other. It is possible to move in the direction of the normal of the plane.
  • a method for observing a microscope specimen for solving the above-mentioned problems is a substrate, a specimen arranged on the substrate, a packed bed covering the specimen, and the specimen.
  • a step of determining whether or not is -30 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, and a plurality of observation areas in a microscope specimen determined to have a range of variation of -30 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less are photographed to obtain a plurality of observation images. It has a process to be performed.
  • the present invention it is possible to provide a microscope specimen having a substantially uniform encapsulation thickness. Further, according to the present invention, it is possible to accurately detect an observation object using a microscope.
  • FIG. 1 is a flowchart of a method for preparing a microscope specimen according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view showing the configuration of the pressing jig according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a schematic view showing the configuration of the pressing jig according to the second embodiment.
  • FIG. 4 is a flowchart of a method for observing a microscope specimen according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the amount of deviation of the correction ring and the normalized fluorescence intensity integrated value.
  • FIG. 1 is a flowchart of a method for preparing a microscope specimen according to an embodiment of the present invention.
  • the method for producing a microscope specimen includes (1) a step of installing a laminate on a first plane of a first pressing member (step S110) and (2) a second. It has a step (step S120) of pressing the laminated body installed on the first plane on the second plane of the pressing member.
  • step S110 a step of installing a laminate on a first plane of a first pressing member
  • step S120 a step of pressing the laminated body installed on the first plane on the second plane of the pressing member.
  • Step S110 a laminate of a substrate, a sample, a packed layer, and a protective layer is installed on the first plane of the first pressing member.
  • the substrate is a plate that supports the specimen, packed bed, and protective layer in the microscope specimen.
  • the shape and material of the substrate are not particularly limited as long as they can exhibit the above functions.
  • a transparent plate is used as the substrate.
  • the substrate is, for example, a slide glass.
  • the sample is an object that can be observed with a microscope.
  • the type of sample is not particularly limited. Examples of specimens include cells, tissue sections and the like. These may be dyed with a fluorescent dye, a dye or the like.
  • a substance for example, an antibody
  • the substance for example, an antibody
  • the substance that specifically binds to a specific substance in the sample may be labeled with particles containing a plurality of fluorescent dyes.
  • the staining method of the sample is not particularly limited, and can be appropriately selected from known staining methods.
  • the type of fluorescent dye is not particularly limited, and can be appropriately selected from known fluorescent dyes used for dyeing specimens.
  • fluorescent dyes include fluorescein dyes, rhodamine dyes, AlexaFluor (registered trademark, Invitrogen) dyes, BODIPY (registered trademark, Invitrogen) dyes, Cascade (registered trademark, Invitrogen) dyes. , Cmarin-based dyes, NBD (registered trademark) -based dyes, pyrene-based dyes, cyanine-based (Cy-based) dyes, perylene-based dyes, oxadin-based dyes, and the like.
  • fluorescent dyes include 5-carboxy-fluorescein, 6-carboxy-fluorescein, 5,6-dicarboxy-fluorescein, 6-carboxy-2', 4,4', 5', 7,7'. -Hexachlorofluorescein, 6-carboxy-2', 4,7,7'-tetrachlorofluorescein, 6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxyfluorescein, naphthofluorescein (above fluorescein dyes) ); 5-Rhodamine, 6-Rhodamine, 5,6-dicarboxy-Rhodamine, Rhodamine 6G, Tetramethyl Rhodamine, X-Rhodamine, Sulfoldamine 101, Sulfoldamine 101 Acid Chloride (Texas Red®) ) (Rhodamine-based dyes); Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488
  • any kind may be used alone or a plurality of kinds may be used in combination.
  • rhodamine-based dyes such as sulfordamine 101 and its hydrochloride, Texas Red (registered trademark), and perylene-based dyes such as perylene diimide and its derivatives are preferable because they have relatively high light resistance.
  • the type of dye other than the fluorescent dye is not particularly limited, and can be appropriately selected from known dyes used for dyeing a sample.
  • Examples of pigments include hematoxylin, eosin and the like.
  • the packed layer in the present invention is a layer that covers the sample and is filled between the sample and the protective layer.
  • the packed bed is generally a layer formed of a filler (also referred to as an encapsulant).
  • the type of filler is not particularly limited and may be appropriately selected from known fillers.
  • the filler may be a liquid having a low viscosity such as physiological saline, but the effect of the present invention is particularly exhibited when a liquid having a certain viscosity is used as the filler.
  • Examples of fillers include solutions in which the resin is dissolved in a solvent.
  • the filler a commercially available one may be used, or one prepared by oneself may be used. When preparing in-house, the filler may be prepared by mixing the resin and the solvent.
  • Examples of commercially available fillers include Enteran (registered trademark) New (Merck Co., Ltd., main component: acrylic resin, solvent: xylene (about 60%)), Paramaun (registered trademark) N (manufactured by Pharma Co., Ltd., Main component: acrylic resin, solvent: aliphatic hydrocarbon (non-xylene, non-toluene), Mount Quick (manufactured by Daido Sangyo Co., Ltd., main component: acrylic resin), ProLong (registered trademark) (manufactured by Life Technologies Japan Co., Ltd.) Main component: acrylic resin), marinol (manufactured by Muto Chemical Co., Ltd., main component: acrylic resin), etc. are included.
  • the resin contained in the filler is preferably a resin having a refractive index close to that of glass such as styrene resin, acrylic resin, and Canada balsam. These resins are colorless and transparent, and are also preferable from the viewpoint that they do not absorb fluorescence from the fluorescent dye or emit autofluorescence during fluorescence observation.
  • the resin contained in the filler is particularly preferably an acrylic resin.
  • the solvent contained in the filler is preferably an organic solvent from the viewpoint of reducing the difference in the refractive index from the glass.
  • organic solvents include aromatic hydrocarbons, compounds containing unsaturated hydrocarbon carbonyls (ketones), esters, ethers, alcohols and the like.
  • aromatic hydrocarbons include benzene, ruene, xylene and the like.
  • unsaturated hydrocarbons include limonene, pinene and the like.
  • ketone include shikuguchi hexanone, methyl ethyl ketone and the like.
  • ester include butyl acetate and the like.
  • ether include anisole, 1,4-di (2-hidoguchi xiethoxy) benzene, ethylene glycol monophenyl ether and the like.
  • alcohols include butanol, pentanol, hexanol and the like.
  • the filler may further contain an antioxidant (antioxidant, ultraviolet absorber), if necessary.
  • an antioxidant antioxidant, ultraviolet absorber
  • As the anti-fading agent for example, among phenol-based, amine-based, phosphorus-based, sulfur-based, and unsaturated hydrocarbon-based anti-fading agents, those that do not interfere with the solubility of the solvent blended in the filler. Can be selected and used as one type or two or more types.
  • the protective layer covers the sample and the packed bed. Normally, the protective layer has light transmission.
  • the shape and material of the protective layer are not particularly limited as long as they can exhibit the above functions and suppress the influence of spherical aberration.
  • the protective layer is, for example, a cover glass, a resin film, a thin solidified resin, or the like.
  • the protective layer preferably contains borosilicate glass from the viewpoint of reducing the difference in refractive index between the packed layer and the protective layer. From the viewpoint of suppressing the variation in the encapsulation thickness (the sum of the thickness of the filler and the protective layer) of the microscope specimen, it is preferable that the variation in the thickness of the protective layer is small. However, as will be described later, in the method for preparing a microscope specimen according to the present embodiment, even if the thickness of the protective layer varies to some extent, the encapsulation thickness of the microscope specimen can be made substantially uniform.
  • the first pressing member has a first plane on which the substrate, the sample, the packed layer, and the laminated body of the protective layer are placed.
  • the shapes of the first pressing member and the first plane are not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • the portion constituting the first plane of the first pressing member preferably contains a material having high rigidity from the viewpoint of evenly pressing the protective layer of the laminated body in the pressing step (step S120) described later, for example, a metal. , Glass or wood is preferred.
  • the first flat surface of the first pressing member is coated with a poorly adhesive material.
  • the filler protruding from the edge of the protective layer adheres to the first plane at the time of pressing, thereby suppressing the adhesion between the first pressing member and the substrate.
  • the poorly adhesive material is not particularly limited, and examples thereof include Teflon (registered trademark, The Chemours Company).
  • the area of the first plane is preferably larger than the area of the protective layer from the viewpoint of making the encapsulation thickness uniform, and more preferably larger than the area of the substrate from the viewpoint of stably supporting the substrate.
  • the substrate When installing the laminate on the first plane, it is preferable to install the substrate so that it is located on the first plane side.
  • the first plane is preferably arranged horizontally, but may be arranged diagonally as long as the laminated body can be appropriately installed. Further, in this step, the laminate may be prepared in advance and then installed on the first plane, or the laminate may be prepared on the first plane.
  • step S120 Step of pressing the laminated body (step S120)
  • the laminated body installed on the first plane in a state where the second plane is arranged in parallel with the first plane is mounted on the first plane. Press in the normal direction.
  • the second pressing member has a second plane that presses the laminated body.
  • the shapes of the second pressing member and the second plane are not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • the first pressing member and the second pressing member press the protective layer toward the substrate side by sandwiching the laminated body between the first plane and the second plane.
  • the first pressing member or the second pressing member can move so that the distance between the first plane and the second plane changes while maintaining a state in which the first plane and the second plane are parallel to each other. It is preferable to have.
  • Specific examples include a method of pressing using a parallel guide for moving the first pressing member or the second pressing member while maintaining a state in which the first plane and the second plane are parallel to each other. ..
  • the pressure When pressing the protective layer of the laminated body, the pressure may be applied from either the first pressing member or the second pressing member, or both may be pressed.
  • the method of pressurizing is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the second pressing member contacts the protective layer with the second plane so that the center of gravity of the second plane and the center of gravity of the upper surface of the protective layer overlap. It is preferable to let it.
  • the first pressing member is positioned to position the laminated body at a position where the second plane can be brought into contact with the protective layer so that the center of gravity of the second plane and the center of gravity of the upper surface of the protective layer overlap. It is preferable to have a portion.
  • the pressing force for pressing the protective layer of the laminated body is preferably 4.5 kPa or more.
  • the warp of the protective layer can be corrected and the variation in the encapsulation thickness can be reduced.
  • the protective layer can be pressed without breaking.
  • the protective layer is a cover glass containing borosilicate glass
  • the pressing force is preferably less than 25 MPa. If it is less than 25 MPa, the cover glass will not be broken.
  • the pressing force may be controlled by using an elastic member.
  • the pressing force is controlled by attaching an elastic member to the surface opposite to the second plane of the second pressing member and pressurizing the surface on the opposite side via the elastic member. Thereby, the pressing force can be controlled based on Hooke's law.
  • the type of elastic member is not particularly limited and may be appropriately selected from known ones. Examples of elastic members include rubber, springs and the like.
  • the second flat surface of the second pressing member is coated with a poorly adhesive material.
  • the filler protruding from the edge of the protective layer adheres to the second plane at the time of pressing, thereby suppressing the adhesion between the second pressing member and the protective layer. can do.
  • the poorly adhesive material is not particularly limited, and examples thereof include Teflon (registered trademark, The Chemours Company).
  • the second plane is preferably smaller than the upper surface of the protective layer, and the second plane is the protective layer. It is preferably placed inside the edge of the. As a result, even when the filler protrudes from the edge of the protective layer and wraps around the upper surface of the protective layer and flows, the filler is less likely to adhere to the second plane.
  • the second pressing member has a plurality of second planes, and one protective layer of the laminated body may be pressed by the plurality of second planes.
  • the contact area with the protective layer per second plane becomes smaller, so that the probability that the filler that has flowed around the upper surface of the protective layer adheres to the second plane is one second plane. Is lower than when pressing one protective layer with.
  • the second pressing member has a plurality of second planes, even if the filler adheres to the second plane, the contact area with the filler per second plane becomes small. Therefore, it becomes easier to remove the filler from the second plane than when pressing one protective layer on one second plane.
  • the portion of the second pressing member including the second plane contains an elastic body.
  • the elastic body is, for example, rubber. Since the portion including the second plane contains an elastic body, even if the protective layer is warped, it can be pressed following the shape of the protective layer.
  • the second pressing member contains a material having high rigidity.
  • highly rigid materials include rocks such as marble, ceramics, inorganic crystalline substances such as diamond, sapphire, and ruby, thermosetting resins such as epoxy resins, vinyl ester resins, phenolic resins, and silicon resins, and glass.
  • thermosetting resins such as epoxy resins, vinyl ester resins, phenolic resins, and silicon resins, and glass.
  • fiber reinforced plastics carbon fiber reinforced plastics, highly rigid resins such as FRP (fiber reinforced plastics), metals, glass, wood and the like.
  • the second pressing member may contain other materials having the same degree of rigidity as these.
  • the range of variation in the encapsulation thickness is -30 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less.
  • the pressing jig according to the present embodiment is a laminate having a substrate, a sample placed on the substrate, a packed layer covering the sample, and a protective layer covering the sample and the packed layer. It is a pressing jig for pressing.
  • the pressing jig according to the present embodiment has a first pressing member including a first plane and a second pressing member including a second plane. In the first pressing member or the second pressing member, the distance between the first pressing member and the second pressing member is changed while maintaining a state in which the first plane and the second plane are parallel to each other. It is movable in the normal direction of the first plane.
  • examples of the two pressing jigs will be described.
  • FIG. 2 is a schematic view showing the configuration of the pressing jig 100 according to the first embodiment.
  • the pressing jig 100 has a first pressing member 110, a second pressing member 120, an elastic member 130, a pressure plate 140, and a parallel guide 150.
  • the first pressing member 110 and the second pressing member 120 press the laminated body 104 having the substrate 101, the packed layer 102, and the protective layer 103.
  • the first pressing member 110 is a member for pressing the laminated body 104 together with the second pressing member 120.
  • the first pressing member 110 has a first plane 111 on a surface facing the second pressing member 120.
  • the laminated body 104 is installed on the first plane 111 so that the substrate 101 is located on the first plane 111 side.
  • the first pressing member 110 has a positioning portion 112 for positioning the laminated body 104.
  • the shape of the positioning portion 112 is not particularly limited.
  • the positioning portion 112 may be a protrusion that surrounds at least a part of the edge of the substrate 101, as shown in FIG. Further, the positioning portion 112 may be a recess having a shape corresponding to the substrate 101 provided on the first pressing member 110.
  • the first pressing member 110 preferably contains a highly rigid material such as metal, glass or wood from the viewpoint of evenly pressing the laminated body 104.
  • the second pressing member 120 is a member for pressing the laminated body 104 together with the first pressing member 110.
  • the second pressing member 120 has a second plane 121 on a surface facing the first pressing member 110.
  • the second pressing member 120 preferably contains metal, glass or wood from the viewpoint of evenly pressing the laminated body 104. Further, the portion of the second pressing member 120 including the second plane 121 preferably contains an elastic body from the viewpoint of suppressing damage to the protective layer during pressing.
  • At least one of the first plane 111 and the second plane 121 is coated with a poorly adhesive material.
  • the filler protruding from the edge of the protective layer 103 adheres to the first flat surface 111 at the time of pressing, so that the first pressing member 110 and the substrate 101 Adhesion can be suppressed.
  • the second flat surface 121 is coated with a poorly adhesive material, the filler protruding from the edge of the protective layer 103 adheres to the second flat surface 121 at the time of pressing, so that the second pressing member 120 and the protective layer 103 Adhesion with can be suppressed.
  • the poorly adhesive material is not particularly limited, and examples thereof include Teflon (registered trademark, The Chemours Company).
  • the second plane 121 is arranged so as to be smaller than the upper surface of the protective layer 103 and to be located inside the edge of the upper surface of the protective layer 103 when pressed. As a result, even when the filler protrudes from the edge of the protective layer 103 and wraps around the upper surface of the protective layer 103 and flows, the filler is less likely to adhere to the second plane 121.
  • the pressing jig 100 has an elastic member 130.
  • the elastic member 130 is a member for controlling the pressing force of the pressing jig 100.
  • the elastic member 130 is installed between the second pressing member 120 and the pressure plate 140, and the laminated body 104 is a second pressing member 120 to which a force is applied from the pressure plate 140 via the elastic member 130. Press. Thereby, the pressing force can be controlled based on Hooke's law.
  • Known elastic members 130 may be used, and examples thereof include rubber and springs.
  • the pressing jig 100 has a parallel guide 150.
  • the parallel guide 150 is for moving the first pressing member 110 or the second pressing member 120 in the normal direction of the first plane 111 while maintaining the state in which the first plane 111 and the second plane 121 are parallel to each other. It is a member.
  • the parallel guide 150 is a cylindrical shaft, and the parallel guide 150 is fixed to the first pressing member 110.
  • the pressure plate 140 is provided with a cylindrical through hole corresponding to the parallel guide 150 (shaft), and the parallel guide 150 is inserted into the through hole.
  • the pressing jig 100 may have a stopper 160.
  • the stopper 160 is installed on the first plane, and when the pressure plate 140 hits the stopper 160 at the time of pressing, it cannot be pressed any more and the pressing force can be controlled.
  • the height of the stopper 160 is adjusted so that the pressing force does not exceed the breaking stress of the protective layer 103.
  • the laminated body 104 is pressed by moving the second pressing member 120, but the laminated body 104 may be pressed by moving the first pressing member 110.
  • FIG. 3 is a schematic view showing the configuration of the pressing jig 200 according to the second embodiment.
  • the same components as those of the pressing jig 100 according to the first embodiment are designated by the same reference numerals, and the description thereof will be omitted.
  • the pressing jig 200 according to the second embodiment is different from the pressing jig 100 in that it has a plurality of second pressing members 120. By pressing with a plurality of second pressing members, the filler that has flowed around the upper surface of the protective layer is less likely to adhere to the second plane.
  • the pressing jig 200 may have an elastic member between the second pressing member 120 and the pressure plate 140.
  • first embodiment and the second embodiment are merely examples of the embodiment of the present invention, respectively, and the technical scope of the present invention should be construed in a limited manner. It is something that does not become. That is, the present invention can be implemented in various forms without departing from its gist or its main features.
  • the method for observing a microscope specimen according to an embodiment of the present invention is a substrate, a specimen placed on the substrate, a packing layer covering the specimen, the specimen, and the packing layer. This is a method of observing a microscope specimen in which a microscope specimen including a protective layer covering the above is photographed using a microscope, and the range of variation in the distance between the substrate and the upper surface of the protective layer in the microscope specimen is -30 ⁇ m or more.
  • FIG. 4 is a flowchart of a method for observing a microscope specimen according to an embodiment of the present invention.
  • the method for observing a microscope specimen includes (1) a step of determining variation in the distance between the substrate of the microscope specimen and the upper surface of the protective layer (step S210). (2) It has a step of acquiring an observation image (step S220). Further, as shown in FIG. 4, the method for observing a microscope specimen may further include a step of synthesizing an image (step S230).
  • step S210 it is determined whether or not the variation in the distance between the substrate of the microscope specimen and the upper surface of the protective layer is -30 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less.
  • the method for determining whether or not the variation between the substrate of the microscope specimen and the upper surface of the protective layer and the spacing is -30 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less is not particularly limited.
  • the determination is made by measuring using a high-precision shape measuring system (KS-1100, manufactured by KEYENCE).
  • Step S220 Step of acquiring an observation image.
  • a plurality of observation areas in a microscope sample determined to have a range of the variation of ⁇ 30 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less are photographed to obtain a plurality of observation images.
  • the influence of spherical aberration due to the variation in the encapsulation thickness of the microscope specimen can be suppressed, and the observation object can be accurately measured. Can be detected.
  • the range of multiple observation areas in the microscope specimen is arbitrarily set.
  • the range of the plurality of observation regions may be set so that the entire image of the sample is included when the plurality of observation regions are combined.
  • the observation image in the observation area can be obtained by taking a picture with a known optical microscope equipped with a camera.
  • Step S230 Step of synthesizing images
  • the obtained plurality of the above-mentioned observation images are combined into one composite image.
  • one composite image for example, a whole slide image
  • the entire image of the sample may be synthesized from the plurality of observation images.
  • composition of the plurality of observation images into one composite image can be performed using, for example, image processing software.
  • the pressing jig 100 of the first embodiment is used.
  • a cover glass (dimensions: 50 mm ⁇ 24 mm) containing borosilicate glass and a laminate made of borosilicate glass were installed so that the slide glass was located on the first flat surface 111 side.
  • the pressure plate 140 was translated downward, and the laminate was pressed by the second pressing member 120 to prepare a microscope specimen.
  • a measurement area of 48 mm ⁇ 20 mm is provided in the area covered with the cover glass in the microscope sample, and the thickness of the microscope sample is measured every 2 mm in the measurement area with a laser displacement meter (CL-P01, manufactured by KEYENCE).
  • CL-P01 laser displacement meter
  • 256 points were measured using a high-precision shape measuring system (KS-1100, manufactured by KEYENCE).
  • KS-1100 high-precision shape measuring system
  • the variation of the measured values was calculated by 3 ⁇ .
  • the thickness tolerance of the cover glass is ⁇ 25 ⁇ m and the variation in the encapsulation thickness and the thickness tolerance of the cover glass are independent, the thickness tolerance of the cover glass and the square root of the sum of squares of 3 ⁇ are taken to obtain the encapsulation thickness.
  • the variability ( ⁇ ) was calculated.
  • the variation in the encapsulation thickness ( ⁇ ) was ⁇ 28.3 ⁇ m at the maximum, and the variation in the encapsulation thickness could be kept within the range of ⁇ 30 ⁇ m.
  • the corrected ring value at which the obtained fluorescence intensity integrated value is maximized by integrating the pixel values of all the obtained fluorescence images is confirmed, and the deviation amount of the correction ring based on the above corrected ring value and the normalized fluorescence intensity are confirmed.
  • the relationship between the integrated values is shown in FIG.
  • the corrected ring value is a value that minimizes the influence of spherical aberration due to the encapsulation thickness of the sample, the deviation of the correction ring corresponds to the variation in the encapsulation thickness.
  • the noise signal of the camera sensor is used from the captured image in the range of -20 ⁇ m to -40 ⁇ m in the correction ring deviation amount in which the fluorescence intensity is 70% or less of the maximum value and the image processing software is used.
  • the maximum value of (hereinafter referred to as a noise signal) and the maximum value of the fluorescence signal were calculated from the pixel values, and the feasibility of detecting fluorescence was evaluated according to the following criteria.
  • the maximum value of the fluorescent signal was obtained by sampling 10 fluorescent particles and averaging the peak values of the signals of each particle. Table 2 shows the calculated values and the evaluation results.
  • ⁇ Maximum value of noise signal
  • ⁇ Maximum value of fluorescent particle signal ⁇
  • Maximum value of noise signal ⁇ Maximum value of fluorescent particle signal
  • the maximum value of the noise signal was lower than the maximum value of the fluorescent signal. Therefore, if the processing for cutting off the noise signal is performed, the fluorescent signal remains, so that the fluorescent particles can be detected as bright spots.
  • the maximum value of the noise signal is equal to or greater than the maximum value of the fluorescent signal, so that the fluorescent signal is also removed when the noise signal is cut off. Therefore, fluorescent particles cannot be detected accurately.
  • the fluorescent particles can be detected when the variation in the encapsulation thickness in the microscope specimen is in the range of ⁇ 30 ⁇ m.
  • the present invention it is possible to provide a microscope specimen having a substantially uniform encapsulation thickness. Further, according to the present invention, it is possible to accurately detect an observation object using a microscope. For example, the present invention is useful for pathological diagnosis and the like.

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Abstract

本発明は、封入厚を略均一にすることができる顕微鏡標本の作製方法に関する。上記顕微鏡標本は、基板と、前記基板上に配置されている検体と、前記検体を被覆する充填層と、前記検体および前記充填層を被覆する保護層とを有する。第１平面を有する第１押圧部材の前記第１平面上に、前記基板、前記検体、前記充填層および前記保護層の積層体を設置する。また、第２平面を有する第２押圧部材の前記第２平面が、前記第１平面に平行に配置された状態で、前記第２平面で、前記第１平面上に設置された前記積層体を、前記第１平面の法線方向に押圧する。

Description

顕微鏡標本の作製方法、顕微鏡標本、押圧治具、および顕微鏡標本の観察方法
　本発明は、顕微鏡標本の作製方法、顕微鏡標本、押圧治具、および顕微鏡標本の観察方法、に関する。
　病理診断において、組織切片の微細構造や標的タンパク質の発現位置など、組織の微小環境を解明するため、高倍率、高開口数のレンズを有する顕微鏡による、正確な観察、撮影が求められている。
　従来、顕微鏡標本の作製に用いられるカバーガラスは厚み公差が大きい。そのため、高倍率、高開口数のレンズを用いて、例えば標本を全体又は広範囲で撮影したホールスライドイメージ（ＷＳＩ）を取得するために、標本の複数箇所（観察領域）を観察する際、観察視野ごとの封入厚（充填剤とカバーガラスの厚さの和）がばらついてしまう。その結果、観察視野ごとの光路長が異なるため、球面収差の影響が大きくなり、鮮明な観察像が得られないという問題や、観察視野を変えると見え方が異なるという問題が生じる。
　球面収差の影響を抑える手段として、厚み公差が小さいカバーガラスを用いて標本を作製する方法や、顕微鏡での観察の際に補正環調整をする方法がある。しかしながら、厚み公差が小さいカバーガラスを用いた場合でも、カバーガラスに反りが生じるため、観察視野ごとの封入厚のばらつきを解消しきることは困難であった。また、補正環調整をする方法は、観察者が実際に観察像を見ながら調整するため、時間がかかる上に、観察者ごとに撮影画像の解像度が異なるといった問題がある。
　このため、顕微鏡標本における封入厚の均一化が求められており、例えば、特許文献１のような顕微鏡標本が報告されている。
　特許文献１には、スライドガラス上に検体と封入剤を介してカバーガラスを載置した標本が記載されている。特許文献１によれば、スライドガラス下の磁性体と、カバーガラス上の磁石との磁力により圧着することで、封入層を薄厚かつ均一化した顕微鏡標本が得られ、従来よりも鮮明な観察像を得られた、とされている。
実開平７－６７４７号公報
　しかしながら、本発明者らの知見によると、特許文献１に記載の方法では、磁石の置き方やカバーガラスの形状などの要因によって、磁性体のスライドガラスを載置している面に対して垂直な方向に押圧力を安定して加えることができない。その結果、カバーガラス全面を均等な力で押圧できず、カバーガラスの形状を矯正できないため、封入厚が均一になりきらなかった。このため、特許文献１に記載の方法で作製された標本を顕微鏡で観察しても、封入厚のばらつきが原因で、観察対象物を検知しきれない問題もあった。
　本発明は、上記の事情に鑑みて成されたものであり、封入厚を略均一にすることができる顕微鏡標本の作製方法、封入圧が略均一な顕微鏡標本、ならびに封入厚を略均一にすることができる押圧治具を提供することを目的とする。また、本発明は、観察対象物を正確に検知できる、顕微鏡標本の観察方法を提供することも目的とする。
　上記課題を解決するための本発明の一実施の形態に関する顕微鏡標本の作製方法は、基板と、前記基板上に配置されている検体と、前記検体を被覆する充填層と、前記検体および前記充填層を被覆する保護層とを有する顕微鏡標本の作製方法であって、第１平面を有する第１押圧部材の前記第１平面上に、前記基板、前記検体、前記充填層および前記保護層の積層体を設置する工程と、第２平面を有する第２押圧部材の前記第２平面が、前記第１平面に平行に配置された状態で、前記第２平面で、前記第１平面上に設置された前記積層体を、前記第１平面の法線方向に押圧する工程と、を有する。
　また、上記課題を解決するための本発明の一実施の形態に関する顕微鏡標本は、基板と、前記基板上に配置される検体と、前記検体を被覆する充填層と、前記検体および前記充填層を被覆する保護層とを有し、前記基板と前記保護層の上面との間隔のばらつきの範囲が、－３０μｍ以上３０μｍ以下である。
　また、上記課題を解決するための本発明の一実施の形態に関する押圧治具は、基板と、前記基板上に配置された検体と、前記検体を被覆する充填層と、前記検体および前記充填層を被覆する保護層とを有する積層体を押圧するための押圧治具であって、第１平面を含む第１押圧部材と、第２平面を含む第２押圧部材と、を有し、前記第１押圧部材または前記第２押圧部材は、前記第１平面と前記第２平面とが平行な状態を維持しつつ前記第１押圧部材と前記第２押圧部材との間隔が変わるように前記第１の面の法線方向に移動可能である。
　また、上記課題を解決するための本発明の一実施の形態に関する顕微鏡標本の観察方法は、基板と、前記基板の上に配置されている検体と、前記検体を被覆する充填層と、前記検体および前記充填層を被覆する保護層とを含む顕微鏡標本を、顕微鏡を用いて撮影する顕微鏡標本の観察方法であって、前記顕微鏡標本における前記基板と前記保護層の上面との間隔のばらつきの範囲が－３０μｍ以上３０μｍ以下であるか否かを判定する工程と、前記ばらつきの範囲が－３０μｍ以上３０μｍ以下であると判定された顕微鏡標本における複数の観察領域を撮影して複数の観察像を取得する工程と、を有する。
　本発明により、封入厚が略均一な顕微鏡標本を提供することができる。また、本発明により、顕微鏡を用いて観察対象物を正確に検知することもできる。
図１は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡標本の作製方法のフローチャートである。 図２は、実施の形態１に係る押圧治具の構成を示す模式図である。 図３は、実施の形態２に係る押圧治具の構成を示す模式図である。 図４は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡標本の観察方法のフローチャートである。 図５は、補正環のズレ量と正規化した蛍光強度積算値の関係図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の形態に限定されるものではない。
　１．顕微鏡標本の作製方法
　図１は、本発明の一実施の形態に係る、顕微鏡標本の作製方法のフローチャートである。
　図１に示すように、本実施の形態に係る顕微鏡標本の作製方法は、（１）第１押圧部材の第１平面上に積層体を設置する工程（工程Ｓ１１０）と、（２）第２押圧部材の第２平面で、前記第１平面上に設置された前記積層体を押圧する工程（工程Ｓ１２０）と、を有する。以下、各工程について説明する。
　（１）積層体を設置する工程（工程Ｓ１１０）
　本工程では、第１押圧部材の第１平面上に、基板、検体、充填層および保護層の積層体を設置する。
　基板は、顕微鏡標本において、検体、充填層および保護層を支持する板である。基板の形状および材料は、上記機能を発揮することができれば特に限定されない。光を透過させて顕微鏡標本を観察する場合は、基板として透光性を有する板を使用する。基板は、例えばスライドガラスである。
　検体は、顕微鏡により観察される対象物である。検体の種類は、特に限定されない。検体の例には、細胞や組織切片などが含まれる。これらは、蛍光色素や色素などで染色されていてもよい。検体を蛍光色素で染色する場合は、蛍光色素で標識された、検体中の特定の物質に特異的に結合する物質（例えば抗体）を用いてもよい。この場合、検体中の特定の物質に特異的に結合する物質（例えば抗体）は、複数の蛍光色素を含む粒子により標識されていてもよい。検体の染色方法は、特に限定されず、公知の染色方法から適宜選択されうる。
　蛍光色素の種類は、特に限定されず、検体の染色に用いられる公知の蛍光色素から適宜選択されうる。蛍光色素の例には、フルオレセイン系色素、ローダミン系色素、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、カスケード（登録商標、インビトロジェン社）系色素、クマリン系色素、ＮＢＤ（登録商標）系色素、ピレン系色素、シアニン系（Ｃｙ系）色素、ペリレン系色素、オキサジン系色素などが含まれる。
　蛍光色素の具体的な例としては、５－カルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－フルオレセイン、５，６－ジカルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－２'，４，４'，５'，７，７'－ヘキサクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－２'，４，７，７'－テトラクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－４'，５'－ジクロロ－２'，７'－ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン（以上フルオレセイン系色素）；５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１酸クロリド（テキサスレッド（登録商標））（以上ローダミン系色素）；Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　３５０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４０５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４３０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５１４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６１０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３３、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６６０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６８０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７５０（以上Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ系色素）；ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ　４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ　５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ　５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ　５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ　５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ　５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ　６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ　６５０／６６５（以上ＢＯＤＩＰＹ系色素）；メトキシクマリン（クマリン系色素）；エオジン、Ｎ　Ｂ　Ｄ（Ｎ　Ｂ　Ｄ系色素）；ピレン（ピレン系色素）；ペリレンジイミド（ペリレン系色素）；Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ｃｙ系色素）などを挙げることができる。このような蛍光色素は、何れかの種類を単独で用いても、複数の種類を組みあわせて用いてもよい。中でも、スルホローダミン１０１およびその塩酸塩であるＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ（登録商標）などのローダミン系色素や、ペリレンジイミドおよびその誘導体などのペリレン系色素は、比較的耐光性が高いため好ましい。
　蛍光色素以外の色素の種類も、特に限定されず、検体の染色に用いられる公知の色素から適宜選択されうる。色素の例には、ヘマトキシリン、エオジンなどが含まれる。
　本発明における充填層は、上記検体を被覆し、上記検体と保護層との間に充填される層である。上記充填層は、一般的には、充填剤（封入剤とも言われる）で形成される層である。
　充填剤の種類は、特に限定されず、公知の充填剤から適宜選択されうる。充填剤は、生理食塩水などの粘度が低い液体であってもよいが、充填剤としてある程度の粘度を有する液体を用いる場合に、本発明の効果が特に発揮される。充填剤の例には、樹脂を溶媒に溶解させた溶液が含まれる。充填剤は、市販されているものを用いてもよいし、自分で調製したものを用いてもよい。自家で調製する場合は、樹脂と溶媒とを混合して充填剤を調製すればよい。
　市販の充填剤の例には、エンテラン（登録商標）ニュー（メルク株式会社製、主成分：アクリル樹脂、溶媒：キシレン（約６０％））、パラマウン卜（登録商標）Ｎ（株式会社ファルマ製、主成分：アクリル樹脂、溶媒：脂肪族炭化水素（ノンキシレン，ノントルエン））、マウントクイック（大道産業株式会社製、主成分：アクリル樹脂）、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製、主成分：アクリル樹脂）、マリノール（武藤化学株式会社製、主成分：アクリル樹脂）、などが含まれる。
　基板および／または保護層がガラス板である場合、充填剤に含まれる樹脂は、スチレン樹脂、アクリル樹脂、カナダバルサムなどのガラスに近い屈折率を有する樹脂であることが好ましい。これらの樹脂は、無色透明であり、かつ蛍光観察の際に蛍光色素からの蛍光を吸収したり、自家蛍光を発したりしないという観点からも好ましい。これらの中でも、充填剤に含まれる樹脂は、アクリル樹脂であることが特に好ましい。
　基板および／または保護層がガラス板である場合、充填剤に含まれる溶媒は、ガラスとの屈折率の差を小さくする観点から、有機溶媒であることが好ましい。有機溶媒の例には、芳香族炭化水素、不飽和炭化水素カルボニルを含む化合物（ケトン）、エステル、エーテル、アルコールなどが含まれる。
　芳香族炭化水素の具体例には、ベンゼン、卜ルエン、キシレンなどが含まれる。不飽和炭化水素の具体例には、リモネン、ピネンなどが含まれる。ケトンの具体例には、シク口ヘキサノン、メチルエチルケトンなどが含まれる。エステルの具体例には、酢酸ブチルなどが含まれる。エーテルの具体例には、アニソール、１，４－ジ（２－ヒド口キシエトキシ）ベンゼン、エチレングリコールモノフェニルエーテルなどが含まれる。アルコールの具体例には、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノールなどが含まれる。
　なお、充填剤は、必要に応じて、褪色防止剤（酸化防止剤、紫外線吸収剤）をさらに含んでいてもよい。褪色防止剤としては、例えば、フェノール系、アミン系、リン系、硫黄系、および、不飽和炭化水素系の褪色防止剤の中から、充填剤に配合した溶媒の溶解性に支障をきたさないものを、１種または２種以上選択して用いることができる。
　保護層は、上記検体および充填層を被覆する。通常、保護層は、光透過性を有する。保護層の形状および材料は、上記機能を発揮し、球面収差の影響を抑えることができれば特に限定されない。保護層は、例えばカバーガラスや樹脂フィルム、樹脂の薄い固化物などである。保護層は、充填層と保護層との屈折率の差を小さくする観点から、硼珪酸ガラスを含むことが好ましい。顕微鏡標本の封入厚（充填剤と保護層の厚さの和）のばらつきを抑制する観点からは、保護層の厚みのばらつきは小さいことが好ましい。ただし、この後説明するように、本実施の形態に係る顕微鏡標本の作製方法では、保護層の厚みがある程度ばらついていても、顕微鏡標本の封入厚を略均一にすることができる。
　第１押圧部材は、上記基板、上記検体、上記充填層および上記保護層の積層体が設置される、第１平面を有する。第１押圧部材および第１平面の形状は、本発明の効果を奏する範囲においては、特に限定されない。第１押圧部材の第１平面を構成する部分は、後述する押圧する工程（工程Ｓ１２０）において上記積層体の保護層を均等に押圧する観点から、剛性が高い材料を含むことが好ましく、例えば金属、ガラスまたは木材を含むことが好ましい。
　第１押圧部材の第１平面は、難接着性の材料でコーティングされていることが好ましい。第１平面が難接着性の材料でコーティングされていると、押圧時に、保護層の縁からはみ出た充填剤が第１平面に付着することによる、第１押圧部材と基板との接着を抑制することができる。難接着性の材料は特に限定されないが、例として、テフロン（登録商標、ケマーズ社）などが挙げられる。
　第１平面の面積は、封入厚を均一にする観点から、保護層の面積よりも大きいことが好ましく、基板を安定して支持するという観点から、基板の面積よりも大きいことがより好ましい。
　第１平面に上記積層体を設置する際は、基板が第１平面側に位置するように設置することが好ましい。第１平面は、水平に配置されていることが好ましいが、上記積層体を適切に設置することができれば斜めに配置されていてもよい。また、本工程では、上記積層体をあらかじめ作製してから第１平面に設置してもよいし、第１平面上で上記積層体を作製してもよい。
　（２）積層体を押圧する工程（工程Ｓ１２０）
　本工程では、第２押圧部材の第２平面で、第２平面が上記第１平面に平行に配置された状態で、上記第１平面上に設置された上記積層体を、上記第１平面の法線方向に押圧する。
　第２押圧部材は、上記積層体を押圧する第２平面を有する。第２押圧部材および第２平面の形状は、本発明の効果を奏する範囲においては、特に限定されない。
　第１押圧部材および第２押圧部材は、第１平面と第２平面とで、上記積層体を挟むことにより、保護層を基板側に向けて押圧する。このとき、第１押圧部材または第２押圧部材は、第１平面と第２平面とが平行な状態を維持しつつ、上記第１平面と上記第２平面との間隔が変わるように移動可能であることが好ましい。具体的な例としては、第１平面と第２平面とが平行な状態を維持しつつ、第１押圧部材または第２押圧部材を移動させるための平行ガイドを用いて押圧する方法などが挙げられる。
　上記積層体の保護層を押圧するとき、第１押圧部材または第２押圧部材のどちらか一方から加圧してもよく、両方から加圧してもよい。加圧する方法は、本発明の効果を奏する範囲においては特に限定されない。
　上記積層体の保護層に均等な圧力を加えて押圧する観点から、第２押圧部材は、第２平面の重心と保護層の上面の重心とが重なるように、第２平面を保護層に接触させることが好ましい。このとき、第１押圧部材は、第２平面の重心と保護層の上面の重心が重なるように、第２平面を保護層に接触させることができる位置に、上記積層体を位置決めするための位置決め部を有することが好ましい。
　上記積層体の保護層を押圧する押圧力は、４．５ｋＰａ以上であることが好ましい。４．５ｋＰａ以上であると、保護層の反りを矯正し、かつ、封入厚のばらつきを低減することができる。このとき、上記押圧力が、用いる保護層の破断応力に達しない範囲にあることで、保護層を破断せずに押圧することができる。例えば、保護層が硼珪酸ガラスを含むカバーガラスである場合、上記押圧力は２５ＭＰａ未満であることが好ましい。２５ＭＰａ未満であることで、カバーガラスが破断されない。
　上記押圧力は弾性部材を用いて制御してもよい。例えば、第２押圧部材の第２平面に対して反対側の面に弾性部材を取り付け、弾性部材を介して上記反対側の面に加圧することで押圧力を制御する。これにより、フックの法則に基づいて、押圧力を制御することができる。弾性部材の種類は、特に制限されず、公知のものから適宜選択されうる。弾性部材の例には、ゴムやバネなどが含まれる。
　第２押圧部材の第２平面は、難接着性の材料でコーティングされていることが好ましい。第２平面が難接着性の材料でコーティングされていると、押圧時に、保護層の縁からはみ出た充填剤が第２平面に付着することによる、第２押圧部材と保護層との接着を抑制することができる。難接着性の材料は特に限定されないが、例として、テフロン（登録商標、ケマーズ社）などが挙げられる。
　また、押圧時に、保護層の縁からはみ出た充填剤が、第２平面に付着することを避ける観点から、第２平面は、保護層の上面よりも小さいことが好ましく、第２平面が保護層の縁の内側に配置されることが好ましい。これにより、充填剤が保護層の縁からはみ出し、保護層の上面に回り込んで流動してきた場合でも、第２平面に充填剤が付着しにくくなる。
　また、第２押圧部材は、複数の第２平面を有し、上記複数の第２平面で上記積層体の１つの保護層を押圧してもよい。これにより、第２平面１つあたりの、保護層との接触面積が小さくなるため、保護層の上面に回り込んで流動してきた充填剤が第２平面に付着する確率が、１つの第２平面で１つの保護層を押圧するときよりも低くなる。また、第２押圧部材が複数の第２平面を有する場合、仮に充填剤が第２平面に付着したときでも、第２平面１つあたりの充填剤との接触面積が小さくなる。そのため、１つの第２平面で１つの保護層を押圧するときよりも、充填剤を第２平面から剥がしやすくなる。
　押圧時に、保護層の損傷を抑制する観点から、第２押圧部材の第２平面を含む部分は、弾性体を含むことが好ましい。弾性体は例えばゴムである。上記第２平面を含む部分が弾性体を含むことで、保護層に反りが生じた場合でも、保護層の形状に追従して押圧することができる。
　また、上記積層体の保護層を、均等に押圧する観点から、第２押圧部材は、剛性が高い材料を含むことが好ましい。剛性の高い材料の例には、大理石などの岩石、セラミックス、ダイヤモンドやサファイア、ルビーなどの無機質結晶質物質、エポキシ樹脂、ビニルエステル樹脂、フェノール系樹脂、ケイ素系樹脂などの熱硬化性樹脂、ガラス繊維強化プラスチック、カーボン繊維強化プラスチック、ＦＲＰ（繊維強化プラスチック）などの剛性の高い樹脂、金属、ガラス、木材などが含まれる。第２押圧部材は、これらと同程度の剛性を持つその他の材料を含んでいてもよい。
　以上の工程により、封入厚（基板と保護層の上面との間隔）のばらつきの範囲が、－３０μｍ以上３０μｍ以下である、顕微鏡標本を作製することができる。
　２．押圧治具
　上記顕微鏡標本の作製方法を実施するときに用いることができる、本発明の実施の形態に係る押圧治具について説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではない。
　本実施の形態に係る押圧治具は、基板と、前記基板上に配置された検体と、前記検体を被覆する充填層と、前記検体および前記充填層を被覆する保護層とを有する積層体を押圧するための押圧治具である。本実施の形態に係る押圧治具は、第１平面を含む第１押圧部材と、第２平面を含む第２押圧部材と、を有する。前記第１押圧部材または前記第２押圧部材は、前記第１平面と前記第２平面とが平行な状態を維持しつつ前記第１押圧部材と前記第２押圧部材との間隔が変わるように前記第１の面の法線方向に移動可能である。以下、２つの押圧治具の例について説明する。
　（実施の形態１）
　図２は、実施の形態１に係る押圧治具１００の構成を示す模式図である。
　押圧治具１００は、図２に示すように、第１押圧部材１１０と、第２押圧部材１２０と、弾性部材１３０と、加圧板１４０と、平行ガイド１５０とを有している。第１押圧部材１１０および第２押圧部材１２０は、基板１０１、充填層１０２、保護層１０３を有する積層体１０４を押圧する。
　第１押圧部材１１０は、第２押圧部材１２０と共に積層体１０４を押圧するための部材である。第１押圧部材１１０は、第２押圧部材１２０と対向する面に第１平面１１１を有する。積層体１０４は、第１平面１１１に、基板１０１が第１平面１１１側に位置するように設置される。また、本実施の形態では、第１押圧部材１１０は、積層体１０４を位置決めするための位置決め部１１２を有する。これにより、第２押圧部材１２０が有する第２平面１２１の重心と、保護層１０３の重心とが重なるように積層体１０４の位置を決め、押圧することができる。位置決め部１１２の形状は、特に限定されない。例えば、位置決め部１１２は、図２に示されるように、基板１０１の縁の少なくとも一部を囲う突起であってもよい。また、位置決め部１１２は、第１押圧部材１１０に設けられた基板１０１に対応する形状の凹部であってもよい。第１押圧部材１１０は、積層体１０４を均等に押圧する観点から、金属、ガラスまたは木材などの、剛性が高い材料を含むことが好ましい。
　第２押圧部材１２０は、第１押圧部材１１０と共に積層体１０４を第１押圧部材押圧するための部材である。第２押圧部材１２０は、第１押圧部材１１０と対向する面に第２平面１２１を有する。第２押圧部材１２０は、積層体１０４を均等に押圧する観点から、金属、ガラスまたは木材を含むことが好ましい。また、第２押圧部材１２０の第２平面１２１を含む部分は、押圧時に、保護層の損傷を抑制する観点から、弾性体を含むことが好ましい。
　第１平面１１１および第２平面１２１の少なくとも一方は、難接着性の材料でコーティングされていることが好ましい。第１平面１１１が難接着性の材料でコーティングされていると、押圧時に、保護層１０３の縁からはみ出た充填剤が第１平面１１１に付着することによる、第１押圧部材１１０と基板１０１との接着を抑制することができる。第２平面１２１が難接着性の材料でコーティングされていると、押圧時に、保護層１０３の縁からはみ出た充填剤が第２平面１２１に付着することによる、第２押圧部材１２０と保護層１０３との接着を抑制できる。難接着性の材料は特に限定されないが、例として、テフロン（登録商標、ケマーズ社）などが挙げられる。本実施の形態では、第２平面１２１は、保護層１０３の上面よりも小さく、かつ押圧時に保護層１０３の上面の縁の内側に位置するように配置されている。これにより、充填剤が保護層１０３の縁からはみ出し、保護層１０３の上面に回り込んで流動してきた場合でも、第２平面１２１に充填剤が付着しにくくなる。
　本実施の形態では、押圧治具１００は弾性部材１３０を有する。弾性部材１３０は、押圧治具１００の押圧力を制御するための部材である。本実施の形態では、弾性部材１３０は第２押圧部材１２０と加圧板１４０との間に設置され、加圧板１４０から弾性部材１３０を介して力が加えられた第２押圧部材１２０で積層体１０４を押圧する。これにより、フックの法則に基づいて、押圧力を制御することができる。弾性部材１３０は公知のものを用いてよく、例として、ゴムやバネなどが挙げられる。
　本実施の形態では、押圧治具１００は平行ガイド１５０を有する。平行ガイド１５０は、第１平面１１１と第２平面１２１とが平行な状態を維持しつつ、第１押圧部材１１０または第２押圧部材１２０を、第１平面１１１の法線方向に移動させるための部材である。本実施の形態では、平行ガイド１５０は円柱形状のシャフトであり、平行ガイド１５０が第１押圧部材１１０に固定されている。また、加圧板１４０に平行ガイド１５０（シャフト）に対応した、円柱形状の貫通孔が設けられており、上記貫通孔に平行ガイド１５０が挿入されている。
　なお、押圧治具１００はストッパー１６０を有していてもよい。本実施の形態では、ストッパー１６０は第１平面上に設置され、押圧時に加圧板１４０がストッパー１６０に当たると、これ以上押圧することができなくなり、押圧力を制御することができる。押圧力が保護層１０３の破断応力を超えないように、ストッパー１６０の高さは調節される。
　また、本実施の形態では、第２押圧部材１２０を移動させることで積層体１０４を押圧しているが、第１押圧部材１１０を移動させることで積層体１０４を押圧してもよい。
　（実施の形態２）
　図３は、実施の形態２に係る押圧治具２００の構成を示す模式図である。実施の形態１に係る押圧治具１００と同じ構成要素については、同じ符号を付して説明を省略する。
　実施の形態２に係る押圧治具２００は、第２押圧部材１２０を複数有している点で、押圧治具１００と相違する。複数の第２押圧部材で押圧することで、保護層の上面に回り込んで流動してきた充填剤が第２平面に付着しにくくなる。
　なお、押圧治具２００は、第２押圧部材１２０と加圧板１４０と間に、弾性部材を有していてもよい。
　なお、上記実施の形態１および実施の形態２は、それぞれ本発明を実施するにあたっての具体化の一例を示したものに過ぎず、これによって本発明の技術的範囲が限定的に解釈されてはならないものである。すなわち、本発明はその要旨、またはその主要な特徴から逸脱することなく、様々な形態で実施することができる。
　３．顕微鏡標本の観察方法
　本発明の一実施の形態に関する顕微鏡標本の観察方法は、基板と、前記基板の上に配置されている検体と、前記検体を被覆する充填層と、前記検体および前記充填層を被覆する保護層とを含む顕微鏡標本を、顕微鏡を用いて撮影する顕微鏡標本の観察方法であって、前記顕微鏡標本における前記基板と前記保護層の上面との間隔のばらつきの範囲が－３０μｍ以上３０μｍ以下であるか否かを判定する工程と、前記ばらつきの範囲が－３０μｍ以上３０μｍ以下であると判定された顕微鏡標本における複数の観察領域を撮影して複数の観察像を取得する工程と、を有する。
　図４は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡標本の観察方法のフローチャートである。
　図４に示すように、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡標本の観察方法は、（１）顕微鏡標本の基板と保護層の上面との間隔のばらつきを判定する工程（工程Ｓ２１０）と、（２）観察像を取得する工程（工程Ｓ２２０）、とを有する。また、図４に示すように、上記顕微鏡標本の観察方法は、画像を合成する工程（工程Ｓ２３０）をさらに有していてもよい。
　（１）判定する工程（工程Ｓ２１０）
　本工程では、顕微鏡標本の基板と保護層の上面との間隔のばらつきが－３０μｍ以上３０μｍ以下であるか否かを判定する。
　顕微鏡標本は、上記顕微鏡標本の作製方法で述べたものと同様であるため、詳しい説明は省略する。
　顕微鏡標本の基板と保護層の上面と間隔のばらつきが－３０μｍ以上３０μｍ以下であるか否かを判定する方法は、特に限定されないが、例えば、上記間隔を、レーザー変位計（ＣＬ―Ｐ０１、ＫＥＹＥＮＣＥ社製）と、高精度形状測定システム（ＫＳ－１１００、ＫＥＹＥＮＣＥ社製）とを用いて測定することで、判定する。
　（２）観察像を取得する工程（工程Ｓ２２０）
　本工程では、上記ばらつきの範囲が－３０μｍ以上３０μｍ以下であると判定された顕微鏡標本における複数の観察領域を撮影して複数の観察像を取得する。
　上記ばらつきの範囲が、－３０μｍ以上３０μｍ以下であると判定された顕微鏡標本を観察することで、顕微鏡標本の封入厚がばらつくことによる球面収差の影響を抑制することができ、観察対象物を正確に検知することができる。
　顕微鏡標本における複数の観察領域の範囲は、任意に設定される。たとえば、複数の観察領域を合わせると検体の全体像が含まれるように、複数の観察領域の範囲を設定してもよい。
　上記観察領域の観察像は、公知のカメラ付き光学顕微鏡で撮影するなどして取得することができる。
　（３）画像を合成する工程（工程Ｓ２３０）
　本工程では、取得された複数の上記観察像を１枚の合成画像に合成する。このとき、複数の観察像から、検体の全体像を含む１枚の合成画像（例えば、ホールスライドイメージ）を合成してもよい。
　上記複数の観察像から１枚の合成画像への合成は、例えば、画像処理ソフト等を用いて行うことができる。
　以下において、実施例を参照して本発明をより詳細に説明するが、これらの記載によって本発明の範囲は限定して解釈されない。
　（顕微鏡標本の作製）
　本実施例では、実施の形態１の押圧治具１００を使用した。押圧治具１００の第１平面１１１に、スライドガラス（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ）と、複数の蛍光色素を含む蛍光粒子を用いて染色された培養細胞株と、充填剤（マリノール５５０ｃｐｓ、武藤化学社製）および硼珪酸ガラスを含むカバーガラス（寸法：５０ｍｍ×２４ｍｍ）と、からなる積層体を、スライドガラスが第１平面１１１側に位置するように設置した。次いで、加圧板１４０を下方向に平行移動させ、第２押圧部材１２０で、上記積層体を押圧して顕微鏡標本を作製した。
　上記顕微鏡標本においてカバーガラスで被覆されている領域内に、４８ｍｍ×２０ｍｍの測定領域を設け、測定領域内において２ｍｍおきに顕微鏡標本の厚さをレーザー変位計（ＣＬ―Ｐ０１、ＫＥＹＥＮＣＥ社製）と、高精度形状測定システム（ＫＳ－１１００、ＫＥＹＥＮＣＥ社製）とを用いて２５６点測定した。得られた標本の厚さと、あらかじめ同じ測定点で測定したスライドガラスの厚さとの差分を取ることで、顕微鏡標本の封入厚（スライドガラスとカバーガラスの上面との間隔）を算出し、各測定点における封入厚の値をもとに標準偏差（σ）を算出した。そして、各測定点における封入厚が正規分布すると仮定し、測定値のばらつきを３σで算出した。また、カバーガラスの厚み公差が±２５μｍであり、封入厚のばらつきとカバーガラスの厚み公差が独立であることを考慮して、カバーガラスの厚み公差と３σの二乗和平方根をとり、封入厚のばらつき（Σ）を算出した。
　上記の操作を顕微鏡標本１０枚について行い、結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記結果から、封入厚のばらつき（Σ）は最大でも±２８．３μｍとなり、封入厚のばらつきを±３０μｍの範囲に納めることができた。
　（顕微鏡標本の撮像性能評価）
　顕微鏡用カメラ（ＤＰ８０、オリンパス社製）を備えた蛍光顕微鏡（ＢＸ６３、オリンパス社製）を用いて、上記の方法で作製した顕微鏡標本を、倍率４０倍、開口数０．９５の条件で撮影した。このとき、対物レンズに備えられた補正環によって、球面収差を補正し、補正環の目盛り（以下、補正環値と称する。）を７０μｍの範囲内で５μｍごとに変えながら蛍光撮影した。得られた蛍光画像すべての画素値を積算して得られた蛍光強度積算値が最大となる補正環値を確認し、上記補正環値を基準にした補正環のズレ量と正規化した蛍光強度積算値の関係を図５に示した。
　なお、補正環値は、標本の封入厚による球面収差の影響を最小に抑える値であるため、補正環のズレは封入厚のばらつきに対応している。
　次いで、図５において、蛍光強度が最大値の７０％以下となる、補正環のズレ量が－２０μｍから－４０μｍの範囲で、撮影した画像から、画像処理ソフトを用いて、カメラセンサーのノイズ信号（以下、ノイズ信号と称する。）の最大値と、蛍光信号の最大値とを、画素値から算出し、以下の基準に沿って蛍光の検出可否を評価した。なお、蛍光信号の最大値は、蛍光粒子を１０個サンプリングして各粒子の信号のピーク値を平均して求めた。算出された値と評価の結果を表２に示した。
　○：ノイズ信号の最大値＜蛍光粒子の信号の最大値
　×：ノイズ信号の最大値≧蛍光粒子の信号の最大値
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　補正環のズレ量が－２０μｍ、－２５μｍ、－３０μｍのとき、ノイズ信号の最大値が、蛍光信号の最大値を下回った。このため、ノイズ信号をカットオフする処理を行えば、蛍光信号が残るため、蛍光粒子を輝点として検出可能となる。
　一方、補正環のズレ量が－３５μｍ、－４０μｍのとき、ノイズ信号の最大値が、蛍光信号の最大値と同じかそれ以上であるため、ノイズ信号をカットオフする際に、蛍光信号も除去されてしまうため、蛍光粒子を正確に検出できない。
　補正環のズレ量が封入厚のばらつきに対応していることを考慮すると、顕微鏡標本における、封入厚のばらつきが±３０μｍの範囲であると、蛍光粒子の検出が可能であることがわかった。
　本出願は、２０２０年９月１７日出願の特願２０２０-１５６２４３に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、全て本願明細書に援用される。
　本発明によれば、封入厚が略均一である顕微鏡標本を提供することが可能である。また、本発明によれば、顕微鏡を用いて観察対象物を正確に検知することもできる。たとえば、本発明は、病理診断などに有用である。
　１００、２００　押圧治具
　１０１　基板
　１０２　充填層
　１０３　保護層
　１０４　積層体
　１１０　第１押圧部材
　１１１　第１平面
　１１２　位置決め部
　１２０　第２押圧部材
　１２１　第２平面
　１３０　弾性部材
　１４０　加圧板
　１５０　平行ガイド
　１６０　ストッパー

Claims (27)

  1. 　基板と、前記基板上に配置されている検体と、前記検体を被覆する充填層と、前記検体および前記充填層を被覆する保護層とを有する顕微鏡標本の作製方法であって、
    　第１平面を有する第１押圧部材の前記第１平面上に、前記基板、前記検体、前記充填層および前記保護層の積層体を設置する工程と、
    　第２平面を有する第２押圧部材の前記第２平面が、前記第１平面に平行に配置された状態で、前記第２平面で、前記第１平面上に設置された前記積層体を、前記第１平面の法線方向に押圧する工程と
    　を有する、顕微鏡標本の作製方法。
  2. 　前記押圧する工程では、前記第１平面と前記第２平面とで前記積層体を挟むことにより、前記保護層を押圧し、
    　前記第１押圧部材または前記第２押圧部材は、前記第１平面と前記第２平面とが平行な状態を維持しつつ前記第１押圧部材と前記第２押圧部材との間隔が変わるように移動可能である、
    　請求項１に記載の顕微鏡標本の作製方法。
  3. 　前記押圧する工程では、前記第２平面の重心と前記保護層の上面の重心とが重なるように、前記第２平面を前記保護層に接触させる、請求項１または２に記載の顕微鏡標本の作製方法。
  4. 　前記第１押圧部材は、前記第２平面の重心と前記保護層の上面の重心とが重なるように前記第２平面を前記保護層に接触させることができる位置に、前記積層体を位置決めするための位置決め部を有する、請求項３に記載の顕微鏡標本の作製方法。
  5. 　前記押圧する工程では、押圧力を弾性部材で制御する、請求項１～４のいずれか一項に記載の顕微鏡標本の作製方法。
  6. 　前記第１平面および前記第２平面の少なくとも一方は、難接着性の材料でコーティングされている、請求項１～５のいずれか一項に記載の顕微鏡標本の作製方法。
  7. 　前記第２押圧部材の前記第２平面を含む部分は、弾性体を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の顕微鏡標本の作製方法。
  8. 　前記第２押圧部材は、剛性が高い材料を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の顕微鏡標本の作製方法。
  9. 　前記第２平面は、前記保護層の上面よりも小さく、
    　前記押圧する工程では、前記第２平面は、前記保護層の上面の縁の内側に配置される、
    　請求項１～８のいずれか一項に記載の顕微鏡標本の作製方法。
  10. 　前記第２押圧部材は、複数の前記第２平面を有し、
    　前記押圧する工程では、前記複数の第２平面で前記保護層を押圧する、
    　請求項１～９のいずれか一項に記載の顕微鏡標本の作製方法。
  11. 　基板と、前記基板上に配置される検体と、前記検体を被覆する充填層と、前記検体および前記充填層を被覆する保護層とを有し、
    　前記基板と前記保護層の上面との間隔のばらつきの範囲が、－３０μｍ以上３０μｍ以下である、
    　顕微鏡標本。
  12. 　前記基板は、スライドガラスである、請求項１１に記載の顕微鏡標本。
  13. 　前記充填層は、アクリル樹脂を含む、請求項１１または１２に記載の顕微鏡標本。
  14. 　前記保護層は、硼珪酸ガラスを含むカバーガラスである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の顕微鏡標本。
  15. 　前記検体は、蛍光色素で染色された組織切片である、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の顕微鏡標本。
  16. 　基板と、前記基板上に配置された検体と、前記検体を被覆する充填層と、前記検体および前記充填層を被覆する保護層とを有する積層体を押圧するための押圧治具であって、
    　第１平面を含む第１押圧部材と、
    　第２平面を含む第２押圧部材と、を有し、
    　前記第１押圧部材または前記第２押圧部材は、前記第１平面と前記第２平面とが平行な状態を維持しつつ前記第１押圧部材と前記第２押圧部材との間隔が変わるように前記第１平面の法線方向に移動可能である、
    　押圧治具。
  17. 　前記第１平面と前記第２平面とが平行な状態を維持しつつ前記第１押圧部材または前記第２押圧部材を移動させるための平行ガイドをさらに有する、請求項１６に記載の押圧治具。
  18. 　前記第１押圧部材は、前記第２平面の重心と前記保護層の上面の重心とが重なるように前記第２平面を前記保護層に接触させることができる位置に、前記積層体を位置決めするための位置決め部を有する、請求項１６または１７に記載の押圧治具。
  19. 　押圧力を制御するための弾性部材をさらに有する、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の押圧治具。
  20. 　前記第１平面および前記第２平面の少なくとも一方は、難接着性の材料でコーティングされている、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の押圧治具。
  21. 　前記第２押圧部材の前記第２平面を含む部分は、弾性体を含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の押圧治具。
  22. 　前記第２押圧部材は、剛性が高い材料を含む、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の押圧治具。
  23. 　前記第２平面は、前記保護層の上面よりも小さく、かつ押圧時に前記保護層の上面の縁の内側に位置するように配置されている、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の押圧治具。
  24. 　前記第２押圧部材は、複数の前記第２平面を含む、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の押圧治具。
  25. 　基板と、前記基板の上に配置されている検体と、前記検体を被覆する充填層と、前記検体および前記充填層を被覆する保護層とを含む顕微鏡標本を、顕微鏡を用いて撮影する顕微鏡標本の観察方法であって、
    　前記顕微鏡標本における前記基板と前記保護層の上面との間隔のばらつきの範囲が－３０μｍ以上３０μｍ以下であるか否かを判定する工程と、
    　前記ばらつきの範囲が－３０μｍ以上３０μｍ以下であると判定された顕微鏡標本における複数の観察領域を撮影して複数の観察像を取得する工程と、
    　を有する、顕微鏡標本の観察方法。
  26. 　前記複数の観察像を取得する工程で取得された前記複数の観察像を１枚の合成画像に合成する工程をさらに有する、
    　請求項２５に記載の顕微鏡標本の観察方法。
  27. 　前記複数の観察像を取得する工程では、前記検体の全体像が包含されるように観察像を取得し、
    　前記１枚の合成画像に合成する工程では、前記複数の観察像から、前記検体の全体像を含む前記１枚の合成画像を合成する、
    　請求項２６に記載の顕微鏡標本の観察方法。
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