WO2022053558A1 - Methode de detection de souches de venturia inaequalis virulentes - Google Patents

Methode de detection de souches de venturia inaequalis virulentes Download PDF

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WO2022053558A1
WO2022053558A1 PCT/EP2021/074818 EP2021074818W WO2022053558A1 WO 2022053558 A1 WO2022053558 A1 WO 2022053558A1 EP 2021074818 W EP2021074818 W EP 2021074818W WO 2022053558 A1 WO2022053558 A1 WO 2022053558A1
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nucleotide
virulence
fragment
nucleotides
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PCT/EP2021/074818
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Inventor
Bruno LE CAM
Mélanie SANNIER
Christophe Lemaire
Jérôme COLLEMARE
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Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement
Institut National Supérieur Des Sciences Agronomiques, Agroalimentaires, Horticoles Et Du Paysage.
Universite D'angers
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to the detection of virulent strains of Venturia inaequalis.
  • Apple scab is one of the major fungal diseases of apple trees.
  • the pathogen responsible for apple scab is an ascomycete fungus called Venturia inaequalis.
  • Apple scab is characterized by the appearance of circular black or brown spots on the surface of leaves, buds, fruits and/or on the wood of infected fruit trees. Fruits and leaves are particularly susceptible to Venturia inaequalis.
  • Scab is favored by a humid climate in the spring when the buds burst.
  • the period of primary contamination linked to the projection of ascospores starts in the spring.
  • Primary infections will lead to the development of sporulating symptoms on young leaves and young fruits.
  • the spores projected by the drops of water and the wind will initiate secondary contamination.
  • scab does not cause the death of the affected apple tree, but can significantly reduce the productivity of the affected tree and especially the quality of the fruits since no scab stain is tolerated on fruits in the distribution circuits.
  • growers resort to chemical control.
  • the fight against apple scab requires an average of 25 fungicide treatments per year, or even more in rainy years.
  • the inventors have succeeded in identifying and sequencing the avirulence gene AvrRviô of the fungus V. inaequalis which interacts with the resistance gene Rvi6. It is the nucleotide modifications at this locus (mutations such as substitution(s), insertion(s) and/or deletion(s)) which are responsible for the gain in virulence of the mutated strains.
  • the inventors have in fact demonstrated a genetic polymorphism at the AvrRviô locus, as well as at the level of its promoter, within 120 strains of Venturia inaequalis.
  • the inventors have developed a method for detecting the presence of virulent Venturia inaequalis strains which is based on the specific detection of the alleles and/or promoter of the A vrRvi6 gene conferring a virulent character on a strain.
  • the detection method according to the invention has the advantage of being simple to implement and rapid, with a result that can be obtained in a few days.
  • the detection method according to the invention is also sensitive and precise, in particular thanks to the use of technologies such as quantitative PCR (Polymerase Chain Reaction), in particular isothermal quantitative PCR, LAMP (Loop-Mediated Amplification) and /or Qprobe combined or not with the LAMP technique.
  • the detection method according to the invention thus represents an essential decision-making aid tool for determining whether a virulence is present at different scales (for example, within an orchard, a farm, a nursery, of a country or even a continent).
  • the method according to the invention also makes it possible to contribute greatly to the reduction in the use of fungicides, (1) by making it possible to apply treatments only in the presence of the virulent population, thus avoiding a systematic preventive treatment and (2) by encouraging growers to plant varieties carrying the Rvi6 resistance gene.
  • the detection method according to the invention can also be used to check the quality of plants and make it possible, for example, to guarantee that a plant comprising the resistance gene Rvi6 is free of any contamination by a strain of Venturia inaequalis virulent against against the Rvi6 gene.
  • a first object of the invention relates to a method for detecting the presence of a virulent Venturia inaequalis strain in a sample, comprising: a) providing a sample likely to comprise Venturia inaequalis DNA, b) determining whether the DNA present in the sample comprises at least one virulence polymorphism, c) if at least one virulence polymorphism is detected in step b), deduce therefrom that the sample provided in step a) comprises a strain of Virulent Venturia inaequalis.
  • the virulence polymorphism is preferably an allele comprising or consisting of a sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5 and SEQ ID NO: 6 and/or a promoter comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • Step a) of the process as defined above preferably comprises the following steps:
  • step (ii) extracting the DNA present in the sample provided in step (i), to obtain a sample likely to comprise DNA from Venturia inaequalis.
  • Step b) of the method as defined above preferably comprises determining whether the DNA comprises at least one virulence marker selected from the group consisting of:
  • sequence SEQ ID NO: 6 comprising nucleotide 304 of said sequence SEQ ID NO: 6, - a fragment of the sequence SEQ ID NO: 7 comprising nucleotide 189, nucleotides 304 to 316 and/or nucleotides 480 to 490 of said sequence SEQ ID NO: 7, and
  • sequence SEQ ID NO: 8 comprising nucleotide 572 of said sequence SEQ ID NO: 8, nucleotide 706 of said sequence SEQ ID NO: 8, nucleotides 548 to 557 of said sequence SEQ ID NO: 8 and / or 15 consecutive nucleotides between nucleotides 139 to 420 of said sequence SEQ ID NO: 8.
  • Another object of the invention relates to a method for the preventive and/or curative treatment of apple trees comprising the resistance gene Rvi6 making it possible to reduce the frequency and/or the quantity of phytosanitary product applied against Venturia inaequalis, comprising:
  • step a) applies a preventive and/or curative treatment if the sample provided in step a) includes a virulent strain of Venturia inaequalis.
  • Another object of the invention relates to a method for evaluating the quality of an apple tree plant, comprising the following steps: implementing steps a) to c) of the detection method as defined above, the sample provided in step a) being taken from the air around said plant and/or on all or part of said plant, if no virulence polymorphism is detected in step b), deduce therefrom that the plant is not contaminated with a virulent strain of Venturia inaequalis comprising the virulence polymorphism sought in step b).
  • Another object of the invention relates to a method for mapping the virulence of Venturia inaequalis comprising the following steps: implementing steps a) to c) of the detection method as defined above, from at at least two samples taken from different geographical areas, deduce that the geographical area from which a sample containing a virulent strain of Venturia inaequalis originates is a virulence zone and that the geographical area from which a sample does not include a strain of Venturia virulent inaequalis is a virulence-free zone.
  • Another object of the invention relates to a virulence marker comprising or consisting of: - a fragment of the sequence SEQ ID NO: 1 comprising nucleotides 155 to 165 of said sequence SEQ ID NO: 1,
  • sequence SEQ ID NO: 7 comprising nucleotide 189, nucleotides 304 to 316 and/or nucleotides 480 to 490 of said sequence SEQ ID NO: 7, or
  • sequence SEQ ID NO: 8 comprising nucleotide 572 of said sequence SEQ ID NO: 8, nucleotide 706 of said sequence SEQ ID NO: 8, nucleotides 548 to 557 of said sequence SEQ ID NO: 8 and / or 15 consecutive nucleotides between nucleotides 139 to 420 of said sequence SEQ ID NO: 8, said fragment comprising at least 15 nucleotides.
  • Another object of the invention relates to a combination of at least two virulence markers, said markers being as defined above.
  • Another object of the invention is a kit for detecting the presence of a virulent strain of Venturia inaequalis in a sample, said kit comprising means for amplifying a marker as defined above or the markers of the combination such as defined above.
  • Another object of the invention relates to the use of a virulence marker as defined above, of a combination of markers as defined above or of a kit as defined above, to detect the presence of a virulent strain of Venturia inaequalis or to determine whether a strain of Venturia inaequalis is virulent or avirulent, in particular to determine geographical areas of virulence, to assess whether fungicide treatment is necessary, to assess the quality of a apple tree plant and/or apple tree fruit and/or assess whether virulence is present in a given territory to help decide whether or not to plant apple tree varieties carrying the Rvi6 resistance gene.
  • apple scab is meant here a cryptogamic disease caused by the fungus Venturia inaequalis.
  • Apple scab affects apple trees of the genus Malus.
  • apple trees of the genus Malus comprising the resistance gene Rvi6 are resistant to the strains of Venturia inaequalis said to be avirulent avrRvi6.
  • the fungus Venturia inaequalis indeed includes an avirulence gene AvrRvi6.
  • the protein coded by the avirulence gene AvrRvi6 is recognized directly or indirectly by the protein coded by the resistance gene Rvi6 expressed by the apple tree, thus triggering a rapid defense reaction of the apple tree which prevents the further development of this pathogen.
  • the apple tree is then said to be “resistant”.
  • strain of Venturia inaequalis is meant here a single individual that can be distinguished by its genotype.
  • the strain of Venturia inaequalis can be in the form of spores or mycelium.
  • Venturia inaequalis strain is generally present on infected plants in the form of spots resulting from the presence of spores and mycelium.
  • avirulent Venturia inaequalis strain or "strain of Venturia inaequalis having an avirulent character” is meant here a strain of Venturia inaequalis comprising an avirulence gene AvrRviô encoding a protein recognized directly or indirectly by the protein encoded by the apple resistance gene Rvi6.
  • virulent strain of Venturia inaequalis or “strain of Venturia inaequalis having a virulent character”, is meant here a strain of Venturia inaequalis which is not recognized as a pathogenic agent by an apple tree comprising the resistance gene Rvi6; such a strain is therefore responsible for disease in varieties carrying the Rvi6 gene.
  • a virulent strain of Venturia inaequalis may comprise at least one mutation in the avirulence gene AvrRviô and/or in the promoter of the avirulence gene AvrRviô, thus resulting in the absence of expression of the protein and/or in a protein which is no longer recognized by the protein encoded by the resistance gene Rvi6.
  • locus is meant a fixed position of a gene or of a genetic marker on a chromosome.
  • allele here denotes a variant of a gene located at a given locus.
  • polymorphism conferring a virulent (or avirulent) character or “polymorphism of virulence (or avirulence)”, is meant here an allele and/or a promoter sequence conferring a virulent (or avirulent) character on a strain of Venturia unequalis.
  • An allele conferring a virulent character on a strain of Venturia inaequalis at the level of the A vrRviô locus comprises or consists for example of a sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • sequence SEQ ID NO: 1 comprises a substitution at nucleotide 139, in particular by the presence of nucleotide A instead of nucleotide G, and a deletion of nucleotides 155 to 309 for example compared to the sequence SEQ ID NO: 15.
  • sequence SEQ ID NO: 2 is characterized by the presence of a substitution at nucleotide 62, in particular by the presence of nucleotide C instead of nucleotide G, of a substitution at nucleotide 139, in particular by the presence of nucleotide A instead of nucleotide G, of a substitution at nucleotide 237, in particular by the presence of nucleotide C instead of nucleotide T and of a substitution at nucleotide 279, in particular by the presence of nucleotide A instead of T.
  • sequence SEQ ID NO: 3 is characterized by the presence of a substitution at nucleotide 139, in particular by the presence of nucleotide A instead of nucleotide G, of a substitution at nucleotide 160, in particular by the presence of nucleotide C instead of nucleotide T and by the presence of a substitution at nucleotide 279, in particular by the presence of nucleotide A instead of nucleotide T.
  • sequence SEQ ID NO: 4 is characterized by the presence of a substitution at nucleotide 139, in particular by the presence of nucleotide A instead of nucleotide G, of a substitution at nucleotide 192, in particular by the presence of nucleotide A instead of C, a substitution at nucleotide 219, in particular by the presence of nucleotide G instead of nucleotide A and a substitution at nucleotide 279, in particular by the presence of nucleotide A instead of nucleotide T.
  • sequence SEQ ID NO: 5 is characterized by the presence of a substitution at nucleotide 139, in particular by the presence of nucleotide A instead of nucleotide G, of a substitution at nucleotide 201, in particular by the presence of nucleotide C instead of nucleotide T and a substitution at nucleotide 279, in particular by the presence of nucleotide A instead of nucleotide T.
  • sequence SEQ ID NO: 6 is characterized by the presence of a substitution at nucleotide 304, in particular by the presence of nucleotide G instead of nucleotide T.
  • An example of an allele conferring an avirulent character on a strain of Venturia inaequalis at the level of the AvrRviô locus is an allele comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 15.
  • a promoter conferring a virulent character on a strain of Venturia inaequalis at the level of the AvrRviô locus comprises or consists for example of the sequence SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • sequence SEQ ID NO: 7 is characterized by the presence of a substitution at nucleotide 189, in particular by the presence of nucleotide A instead of nucleotide G, by the presence of three deletions of nucleotides 309 to 311, in particular by the deletion of nucleotides A, T and A and by the insertion of 5 nucleotides at position 484, in particular nucleotides G, A, A, T and A.
  • sequence SEQ ID NO: 8 is characterized by the presence of an insertion of 281 nucleotides at nucleotide 139, a deletion of nucleotides 552 to 555, a substitution at nucleotide 572, in particular by the presence of nucleotide A instead of C and a substitution of nucleotide 706, in particular by the presence of nucleotide G instead of A.
  • An example of a promoter conferring an avirulent character on a strain of Venturia inaequalis at the level of the AvrRviô locus is an allele comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 14.
  • Virulence marker marker for the presence of Venturia inaequalis, combination of markers
  • the present invention also relates to a virulence marker, a Venturia inaequalis marker and/or a combination of at least two virulence markers and, optionally, at least one marker for the presence of V. inaequalis.
  • virulence marker is meant here a polynucleotide whose sequence corresponds to a region present at the avirulence locus of a virulent Venturia inaequalis strain, but different from the avirulence locus of the avirulent Venturia inaequalis strains.
  • a virulence marker comprises, for example, at least one nucleotide mutation (substitution, addition and/or deletion) with respect to the sequence present in an avirulent Venturia inaequalis strain.
  • Table 1 indicates the single nucleotide polymorphisms (SNP or “Single Nucleotide Polymorphism”) and/or deletion present in the alleles comprising or consisting of the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6. The position of the SNP or the deletion is indicated with respect to the sequence SEQ ID NO: 15. [Table 1]
  • the subject of the present invention is thus a virulence marker comprising or consisting of:
  • sequence SEQ ID NO: 1 comprising nucleotides 155 to 165 of said sequence SEQ ID NO: 1, preferably comprising nucleotides 155 to 180 of said sequence SEQ ID NO: 1, said marker being in particular specific for the allele of sequence SEQ ID NO: 1,
  • sequence SEQ ID NO: 2 comprising nucleotide 62 of said sequence, said marker being in particular specific for the allele of sequence SEQ ID NO: 2,
  • sequence SEQ ID NO: 3 comprising nucleotide 160 of said sequence, said marker being in particular specific for the allele of sequence SEQ ID NO: 3,
  • sequence SEQ ID NO: 4 comprising nucleotide 192 of said sequence, said marker being in particular specific for the allele of sequence SEQ ID NO: 4,
  • sequence SEQ ID NO: 5 comprising nucleotide 201 of said sequence, said marker being in particular specific for the allele of sequence SEQ ID NO: 5,
  • sequence SEQ ID NO: 6 comprising nucleotide 304 of said sequence, said marker being in particular specific for the allele of sequence SEQ ID NO: 6,
  • sequence SEQ ID NO: 7 comprising nucleotides 189, nucleotides 304 to 316 and/or nucleotides 480 to 490 of said sequence SEQ ID NO: 7, said marker being in particular specific for the promoter of sequence SEQ ID NO: 7, or
  • sequence SEQ ID NO: 8 comprising nucleotide 572 of said sequence SEQ ID NO: 8, nucleotide 706 of said sequence SEQ ID NO: 8, nucleotides 548 to 557 of said sequence SEQ ID NO: 8 and / or 15 consecutive nucleotides between nucleotides 139 to 420 of said sequence SEQ ID NO: 8, said marker being in particular specific for the promoter of sequence SEQ ID NO: 8.
  • a subject of the present invention is, for example, a virulence marker as defined above comprising or consisting of:
  • sequence SEQ ID NO: 1 comprising nucleotides 155 to 165 of said sequence SEQ ID NO: 1, preferably comprising nucleotides 155 to 180 of said sequence SEQ ID NO: 1,
  • sequence SEQ ID NO: 2 comprising (i) nucleotide 62 and (ii), optionally, nucleotide 139, nucleotide 237 and/or nucleotide 279 of said sequence SEQ ID NO: 2,
  • sequence SEQ ID NO: 3 comprising (i) nucleotide 160 and (ii), optionally, nucleotide 139 and/or nucleotide 279 of said sequence SEQ ID NO: 3,
  • sequence SEQ ID NO: 4 comprising (i) nucleotide 192 and (ii), optionally, nucleotide 139, nucleotide 219 and/or nucleotide 279 of said sequence SEQ ID NO: 4,
  • sequence SEQ ID NO: 5 comprising (i) nucleotide 201 and (ii), optionally, nucleotide 139 and/or nucleotide 279 of said sequence SEQ ID NO: 5,
  • sequence SEQ ID NO: 7 comprising nucleotides 189, nucleotides 304 to 316 and/or nucleotides 480 to 490 of said sequence SEQ ID NO: 7, or
  • fragment is meant here a polynucleotide with a length of at least 5 nucleotides, preferably at least 8 nucleotides, more preferably at least 10 nucleotides, for example at least 15 or at least 20 nucleotides.
  • the fragment is preferably a fragment of size less than or equal to 50 nucleotides, preferably less than or equal to 40 nucleotides, for example less than or equal to 30 nucleotides.
  • a fragment as defined above preferably comprises at least 15 nucleotides.
  • fragment of the sequence SEQ ID NO: X is meant a fragment consisting of consecutive nucleotides of a polynucleotide of sequence SEQ ID NO: X.
  • a virulence marker comprising or consisting of:
  • polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 155 to 180 of the sequence SEQ ID NO: 1,
  • polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 52 to 72 of the sequence SEQ ID NO: 2,
  • polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 150 to 170 of the sequence of the sequence SEQ ID NO: 3,
  • polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 182 to 202 of the sequence SEQ ID NO: 4,
  • polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 191 to 211 of the sequence SEQ ID NO: 5,
  • polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 294 to 314 of the sequence SEQ ID NO: 6,
  • polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 180 to 200, nucleotides 304 to 316 and/or nucleotides 480 to 490 of the sequence SEQ ID NO: 7, or
  • polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 562 to 582, nucleotides 696 to 716, nucleotides 548 to 557 and/or 15 consecutive nucleotides between nucleotides 139 to 420 of the sequence SEQ ID NO: 8.
  • marker of the presence of V. inaequalis is meant here a polynucleotide whose sequence corresponds to a region present in all the strains of Venturia inaequalis.
  • a marker for the presence of V. inaequalis that can be used is, for example, a polynucleotide comprising all or part of the sequence coding for the actin of V. inaequalis, a polynucleotide comprising all or part of the sequence coding for a V. inaequalis elongation factor or a polynucleotide comprising all or part of the RPL4 housekeeping gene of V. inaequalis.
  • a preferred marker for the presence of V. inaequalis is a polynucleotide comprising all or part of the RPL4 housekeeping gene of V. inaequalis.
  • a subject of the present invention is thus a marker for the presence of Venturia inaequalis comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 9 or of a fragment of the sequence SEQ ID NO: 9.
  • a marker for the presence of Venturia inaequalis is, for example, the polynucleotide corresponding to nucleotides 1243 to 1419 of the sequence SEQ ID NO: 9.
  • An example of a pair of primers making it possible to amplify a marker for the presence of Venturia inaequalis, in particular the RPL4 housekeeping gene, consists of the sense primer of sequence SEQ ID NO: 10 (TTCAATCTGCTCTCCGAGGT) and the anti- sequence meaning SEQ ID NO: 11 (CTAATGCCTTTGGCTTCTCG).
  • the present invention also relates to a combination of at least two virulence markers and, optionally, at least one marker of the presence of V. inaequalis.
  • the virulence markers and/or the marker for the presence of V. inaequalis of said combination are in particular as defined above.
  • the combination of at least two virulence markers and, optionally, of at least one marker of the presence of V. inaequalis can for example comprise: at least 2 virulence markers, preferably at least 4 virulence markers, preferably at least 6 virulence markers, for example 6, 7, 8 or at least 8 virulence markers and
  • V. inaequalis optionally, one or at least one marker of the presence of V. inaequalis.
  • a preferred combination of at least two virulence markers and optionally at least one marker for the presence of V. inaequalis may include:
  • virulence markers for example: o a polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 155 to 180 of the sequence SEQ ID NO: 1, o a polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 52 to 72 of the sequence SEQ ID NO: 2 , o a polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 150 to 170 of the sequence of the sequence SEQ ID NO: 3, o a polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 182 to 202 of the sequence SEQ ID NO: 4, o a polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 191 to 211 of the sequence SEQ ID NO: 5, o a polynucleotide comprising or consisting of the nucleotides 294 to 314 of the sequence SEQ ID NO: 6, o a polynucleotide comprising or consisting of nucleotides 180 to 200
  • a marker for the presence of V. inaequalis for example a marker for the presence of Venturia inaequalis comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 9 or of a fragment of the sequence SEQ ID NO: 9 as defined above -above.
  • the present invention particularly relates to a method for detecting the presence of a virulent strain of Venturia inaequalis, in particular against an apple tree comprising a gene Rvi6 resistance, in a sample, comprising: a) providing a sample likely to comprise Venturia inaequalis DNA, b) determining whether the DNA present in the sample comprises at least one virulence polymorphism and, optionally, at at least one marker for the presence of V. inaequalis, c) if at least one virulence polymorphism is detected in step b), deducing therefrom that the sample provided in step a) comprises a virulent strain of Venturia inaequalis.
  • Step a) includes or consists of providing a sample likely to include Venturia inaequalis DNA.
  • the expression “capable of comprising DNA” means that the starting sample may not comprise a strain of Venturia inaequalis, in which case no DNA of Venturia inaequalis will be present in the sample.
  • the presence of Venturia inaequalis in the sample can be verified in step b) by determining the presence of at least one marker for the presence of V. inaequalis.
  • step a) of providing a sample likely to comprise Venturia inaequalis DNA comprises the following steps:
  • step (ii) extracting the DNA present in the sample provided in step (i), to obtain a sample likely to comprise DNA from Venturia inaequalis.
  • the sample likely to comprise at least one strain of Venturia inaequalis can be taken by any method well known to those skilled in the art.
  • the sample likely to comprise at least one strain of Venturia inaequalis can be taken from the air, for example using one or more spore traps, in particular placed next to an apple tree, for example in the center of orchard, nursery or distributed over the surface of an orchard or on the ground and/or be taken from the leaves and/or fruit of apple trees.
  • DNA can for example be extracted from tissues showing symptoms, such as fruit and/or leaf tissues.
  • the strain(s) of Venturia inaequalis are preferably present in the sample in the form of spores and/or mycelium, for example on or in plant tissues (leaves and/or fruits).
  • the sample likely to comprise at least one strain of Venturia inaequalis therefore preferably comprises spores of Venturia inaequalis and/or one or more apple tree tissues.
  • the DNA extraction is carried out by any appropriate method well known to those skilled in the art, for example using a commercial DNA extraction kit or a manual extraction method, such as the extraction of DNA with CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide).
  • CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide
  • Step b) comprises or consists of determining whether the DNA present in the sample comprises at least one virulence polymorphism and, optionally, a marker for the presence of V. inaequalis.
  • the virulence polymorphism is preferably an allele comprising or consisting of a sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5 and SEQ ID NO: 6 or a promoter comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • step b) thus comprises determining whether the DNA present in the sample comprises an allele comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 1, an allele comprising or consisting of SEQ ID NO: 2, an allele comprising or consisting of SEQ ID NO: 3, an allele comprising or consisting of SEQ ID NO: 4, an allele comprising or consisting of SEQ ID NO: 5, an allele comprising or consisting of SEQ ID NO: 6, a promoter comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 7 and/or a promoter comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 8.
  • the presence of at least one virulence polymorphism in said DNA is determined by the presence of at least one virulence marker, in particular a virulence marker as defined above or a combination of virulence markers as defined above.
  • step b) thus comprises determining whether said DNA comprises at least one virulence marker, in particular a virulence marker as defined above or a combination of virulence markers as defined above.
  • the method according to the invention thus advantageously makes it possible to specifically detect an allele or a promoter conferring a virulent character.
  • step b) comprises or consists of determining whether the DNA present in the sample comprises at least one virulence polymorphism and, optionally, a marker for the presence of V. inaequalis, the presence of at least one virulence polymorphism in said DNA being determined by the presence of at least one virulence marker as defined above, preferably selected from the group consisting of:
  • sequence SEQ ID NO: 6 comprising nucleotide 304 of said sequence SEQ ID NO: 6, - a fragment of the sequence SEQ ID NO: 7 comprising nucleotide 189, nucleotides 304 to 316 and/or nucleotides 480 to 490 of said sequence SEQ ID NO: 7, and
  • sequence SEQ ID NO: 8 comprising nucleotide 572 of said sequence SEQ ID NO: 8, nucleotide 706 of said sequence SEQ ID NO: 8, nucleotides 548 to 557 of said sequence SEQ ID NO: 8 and / or 15 consecutive nucleotides between nucleotides 139 to 420 of said sequence SEQ ID NO: 8, or by the presence of a combination of virulence markers as defined above.
  • Step b) as defined above preferably comprises a step for checking the presence of DNA from a strain of Venturia inaequalis.
  • This step of checking the presence of DNA from a strain of Venturia inaequalis includes, for example, determining whether the DNA present in the sample is DNA from Venturia inaequalis.
  • This step of checking the presence of DNA from a strain of Venturia inaequalis includes, for example, determining whether a sequence common to virulent and avirulent strains is present in the sample, for example the sequence of a housekeeping gene RPL4.
  • the marker for the presence of V. inaequalis is therefore used as a control marker in the detection method defined above.
  • the marker for the presence of V. inaequalis is for example a polynucleotide comprising all or part of the sequence of the RPL4 gene of V. inaequalis, for example comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 9.
  • any technique well known to those skilled in the art can be used, such as the sequencing of all or part of the sequence of the promoter of the gene d avirulence AvrRviô and/or the sequence of the allele present at the AvrRviô locus and/or a DNA amplification technique, preferably isothermal amplification.
  • Non-limiting examples of DNA amplification include PCR, quantitative PCR, isothermal quantitative PCR, LAMP (Loop-Mediated Amplification) and/or Qprobe combined or not with the LAMP technique, RPA (Recombinase Polymerase Amplification).
  • the LAMP method is an isothermal amplification method which has a very high level of specificity, linked to the use of 6 primers and which is generally very fast.
  • the detection of amplification by the LAMP method can be carried out by electrophoresis, turbidimetry, electrochemistry or colorimetry.
  • the RPA method is an isothermal amplification method performed at low temperature.
  • the detection of amplification by the RPA method is often carried out by fluorescence, using for example fluorescent probes or intercalating agents.
  • At least one pair of primers capable of amplifying a virulence marker as defined above and, optionally, at least one pair of primers capable of amplifying a marker for the presence of V. inaequalis as defined above, is/are used.
  • the pair of primers capable of amplifying a virulence marker makes it possible, for example, to obtain: a fragment amplified from the DNA of a virulent strain, but not from the DNA of an avirulent strain, a fragment amplified from the DNA of an avirulent strain, but not from the DNA of a virulent strain, or a fragment amplified from the DNA of a virulent strain of a size different from that amplified from the DNA of an avirulent strain.
  • the sense primer and/or the antisense primer can for example hybridize at the level of a virulence marker, in particular when the polymorphism at the level of said marker results from one or more substitutions and/or deletions and/ or nucleotide insertions.
  • the sense primer and/or the antisense primer can hybridize around a virulence marker, in particular when the polymorphism at the level of said marker results from at least one deletion and/or addition of nucleotide ( s).
  • the same pair of primers can make it possible to determine the presence of several given virulence markers, for example by amplifying fragments of different sizes.
  • step c) if at least one virulence polymorphism is detected in step b), it is deduced that the sample provided in step a) comprises a virulent strain of Venturia inaequalis.
  • step c) if a marker for the presence of V. inaequalis is detected but none of the virulence polymorphisms are detected in step b), it is deduced therefrom that the sample provided in step a) does not include a virulent Venturia inaequalis strain corresponding to the virulence polymorphisms tested.
  • the present invention also relates to a method for the preventive and/or curative treatment of apple trees comprising the resistance gene Rvi6, making it possible in particular to reduce the frequency and/or the quantity of phytosanitary product applied against Venturia inaequalis, comprising:
  • step a) the application of a preventive and/or curative treatment if the sample provided in step a) includes a virulent strain of Venturia inaequalis.
  • the method for detecting the presence of a virulent strain of Venturia inaequalis can thus serve as a decision-making aid tool to know whether the application of a preventive and/or curative treatment is necessary.
  • the preventive and/or curative treatment is preferably carried out around the sample collection area, for example in a nursery, in the orchard or on the farm around the sample collection area where other trees carrying the Rvi6 resistance gene are planted.
  • the preventive and/or curative treatment includes, for example, the application of an appropriate phytosanitary product against Venturia inaequalis, such as for example a fungicide.
  • the fungicide is for example chosen from a copper-based fungicide or a fungicide belonging to the strobilurin or anilinopyrimidine family.
  • the present invention also relates to a method for evaluating the quality of an apple tree plant, in particular an apple tree plant comprising a gene for Rvi6 resistance, in particular before its commercialization, comprising the following steps:
  • steps a) to c) of the method as defined above for detecting the presence of a virulent strain of Venturia inaequalis in a sample the sample provided in step a) being taken in the air around said plant and/or on all or part of said plant, and if no virulence polymorphism is detected in step b), deduce therefrom that the plant is not contaminated by a strain of Venturia inaequalis virulent comprising the virulence polymorphism sought in step b).
  • step a) if (i) no allele comprising or consisting of the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and no promoter comprising or consisting of the sequences SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 is detected in step a) and (ii) if DNA from a strain of Venturia inaequalis is detected in the sample, it is deduced therefrom that the plant is not contaminated by a virulent strain of Venturia inaequalis comprising the virulence polymorphism.
  • the present invention also relates to a method for mapping the virulence of Venturia inaequalis, in particular against an apple tree comprising an Rvi6 resistance gene, comprising the following steps: implementing steps a) to c) of the method as defined above for detecting the presence of a virulent strain of Venturia inaequalis in a sample, from at least two samples taken from different geographical areas, deducing therefrom that the geographical area from which the a sample comprising a virulent Venturia inaequalis strain is a virulence zone and that the geographical zone from which a sample not comprising a virulent Venturia inaequalis strain originates is a virulence-free zone.
  • the geographical area can for example be an orchard, a farm, a production basin, a region, a country, a continent and/or an island.
  • the present invention also relates to a kit for detecting the presence of a virulent strain of Venturia inaequalis, in particular against an apple tree comprising an Rvi6 resistance gene, in a sample, said kit comprising means making it possible to amplify at least one virulence marker as defined above and, optionally, at least one marker for the presence of Venturia inaequalis as defined above -above.
  • the kit can for example comprise means making it possible to amplify the markers of the combination of at least two virulence markers and, optionally, of at least one marker of the presence of V. inaequalis as defined above.
  • the means making it possible to amplify a marker comprise for example at least one pair of primers specific to said marker(s) and are for example as defined above
  • a virulence marker Use of a virulence marker, a combination of virulence markers or the kit for the detection of the presence of a virulent strain of Venturia inaequalis
  • a subject of the present invention is also the use of a virulence marker as defined above, of a combination of at least two virulence markers and, optionally, of at least one marker of the presence of V inaequalis as defined above, and/or a kit as defined above for detecting the presence of a virulent strain of Venturia inaequalis, in particular against an apple tree comprising a resistance gene Rvi6, or to determine whether a strain of Venturia inaequalis is virulent or avirulent, in particular against an apple tree comprising an Rvi6 resistance gene.
  • the use as defined above makes it possible, for example, to determine geographical zones of virulence or avirulence, to evaluate whether a fungicide treatment is necessary, to evaluate the quality of an apple tree plant and/or of the fruits of an apple tree , for example before marketing in France or for export, and/or assess whether the virulence is present in a given territory to help decide whether or not to plant apple varieties carrying the Rvi6 resistance gene.
  • sequence SEQ ID NO: 1 is the sequence of an allele conferring a virulent character, as present in strain 2199.
  • sequence SEQ ID NO: 2 is the sequence of an allele conferring a virulent character, as present in the strain NL24.
  • sequence SEQ ID NO: 3 is the sequence of an allele conferring a virulent character, as present in strain 1180.
  • sequence SEQ ID NO: 4 is the sequence of an allele conferring a virulent character, as present in strain 2476.
  • sequence SEQ ID NO: 5 is the sequence of an allele conferring a virulent character, as present in strain 1153.
  • sequence SEQ ID NO: 6 is the sequence of an allele conferring a virulent character, as present in the 08M205 strain.
  • sequence SEQ ID NO: 7 is an example of sequence of the promoter of the AvrRvi6 gene conferring a virulent character, as present in the strain 1286.
  • sequence SEQ ID NO: 8 is an example of sequence of the promoter of the AvrRvi6 gene conferring a virulent character, as present in the strain 2207.
  • sequence SEQ ID NO: 9 is the sequence of the RPL4 housekeeping gene of Venturia inaequalis.
  • sequences SEQ ID NO: 10 and 11 correspond respectively to the sequences of the sense and antisense primers of a pair of primers used for the detection of the housekeeping gene RPL4 of Venturia inaequalis.
  • sequences SEQ ID NO: 12 and 13 correspond respectively to the sequences of the sense and antisense primers of a pair of primers used for the detection of a virulent strain of Venturia inaequalis.
  • sequence SEQ ID NO: 14 is an example of sequence of the promoter of the AvrRvi6 gene conferring an avirulent character, as present in the strain EUB04.
  • sequence SEQ ID NO: 15 is the sequence of an allele conferring an avirulent character, as present in the strain EUB04.
  • Figure 1 presents the results of the quantitative PCR amplification of the genomic DNA of the avirulent strain EUB04 at the AvrRviô locus using the primers SEQ ID NO: 12 and 13. The different curves correspond to a range of dilution.
  • the signal obtained in RFU (Relative Fluorescence Units) is given as a function of the number of PCR cycles.
  • FIG 2 shows the results of quantitative PCR amplification of virulent strain 2199 DNA at the AvrRvi6 locus using primers SEQ ID NO: 12 and 13. The different curves correspond to a range of dilution.
  • the signal obtained in RFU (Relative Fluorescence Units) is given as a function of the number of PCR cycles.
  • FIG 3 shows the fusion curves of the amplicons of the AvrRviô locus in the virulent strain 2199 and the avirulent strain EUB04 using the primers SEQ ID NO: 12 and 13.
  • the signal obtained in -d(RFU)/dT is given as a function of temperature in Celsius.
  • Example 1 Polymorphism analysis at the AvrRvi6 avirulence locus
  • the avirulence gene AvrRviô which interacts with the resistance gene Rvi6 was cloned, then the allelic polymorphism at the AvrRviô locus and at the level of its promoter was analyzed on 150 strains of V. inaequalis from orchards and wild apple trees.
  • sequences SEQ ID NO: 1 to 6 are examples of alleles conferring a virulent character.
  • sequences SEQ ID NO: 7 and 8 are examples of sequence of the promoter of AvrRvi6 associated with a virulent character.
  • Example 2 Method for detecting the presence of a virulent strain of Venturia inaequalis
  • the genomic DNA of the strain to be tested is extracted from spores.
  • the extraction is carried out according to the protocol of the Nucleospin Food kit (Macherey Nagel).
  • the AvrRvi ⁇ locus is detected by quantitative PCR using the following reaction mixture for one reaction:
  • the quantitative PCR program used is as follows (using a Biorad CFX connect device):
  • Figures 1 and 2 show that the method used makes it possible to amplify the alleles respectively of the avirulent strain B04 and of the virulent strain 2199 at the AvrRviô locus.
  • FIG. 3 shows that the fusion curves of the two alleles are different, reflecting a deletion of nucleotides in the virulent strain compared with the avirulent strain.
  • the virulence allele carried by strain 2199 is in fact distinguished from the avirulence allele carried by strain B04 by a deletion of 155 base pairs.
  • the detection method according to the invention therefore makes it possible to detect the presence of a virulent strain of Venturia inaequalis.

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Abstract

La présente invention a pour objet une méthode de détection de la présence d'une souche de Venturia inaequalis virulente dans un échantillon. Cette méthode est basée sur la mise en évidence de marqueurs spécifiques associés aux souches de Venturia inaequalis virulentes. Cette méthode de détection a plusieurs applications avantageuses, telle que déterminer des zones géographiques de virulence, permettant notamment d'évaluer l'intérêt de planter dans cette zone un verger avec des variétés portant le gène de résistance correspondant, évaluer si un traitement fongicide est nécessaire au niveau d'un verger, évitant ainsi un traitement préventif systématique, ou évaluer la qualité sanitaire d'un plant de pommier comprenant le gène de résistance Rvi6.

Description

METHODE DE DETECTION DE SOUCHES DE VENTURIA INAEQUALIS VIRULENTES
Domaine technique
La présente invention concerne la détection de souches de Venturia inaequalis virulentes.
Etat de la technique
La tavelure du pommier est une des principales maladies fongiques du pommier. L’agent pathogène responsable de la tavelure du pommier est un champignon ascomycète appelé Venturia inaequalis. La tavelure du pommier est caractérisée par l’apparition de tâches de forme circulaire noires ou brunes à la surface des feuilles, des bourgeons, des fruits et/ou sur le bois des arbres fruitiers infectés. Les fruits et les feuilles sont particulièrement sensibles à Venturia inaequalis.
La tavelure est favorisée par un climat humide au printemps au moment du débourrement des bourgeons. La période des contaminations primaires liées à la projection des ascospores démarre au printemps. Les contaminations primaires conduiront au développement de symptômes sporulants sur jeunes feuilles et jeunes fruits. En périodes pluvieuses durant le printemps et l’été, les spores projetées par les gouttes d’eau et le vent initieront les contaminations secondaires.
En verger, la tavelure n’entraîne pas la mort du pommier atteint, mais peut réduire significativement la productivité de l’arbre atteint et surtout la qualité des fruits puisque aucune tâche de tavelure n’est tolérée sur fruits dans les circuits de distribution. Pour protéger leurs vergers de pommiers, les producteurs ont recours à la lutte chimique. Ainsi, que ce soit en agriculture conventionnelle ou biologique, la lutte contre la tavelure du pommier nécessite en moyenne 25 traitements fongicides par an voire plus les années pluvieuses.
A ce jour, la lutte génétique repose essentiellement sur l’utilisation d’un seul gène de résistance, le gène Rvi6 que les sélectionneurs ont introduit dans certaines variétés à partir de l’espèce ornementale Malus floribunda. Toutefois, dans certaines régions d’Europe, l’émergence de souches virulentes de Venturia inaequalis a provoqué une perte d’efficacité de cette résistance.
A ce jour, il n’existe pas de moyens de détecter la présence de souches de Venturia inaequalis virulentes vis-à-vis du gène de résistance Rvi6. De ce fait, par principe de précaution, des traitements fongicides préventifs sont systématiquement appliqués lors de la période à risque au printemps pour protéger les variétés portant le gène Rvi6. De même, certains producteurs hésitent à planter des variétés portant la résistance Rvi6 car ils n’ont pas d’information sur la présence de populations virulentes dans leur environnement.
Il existe donc un réel besoin de fournir une méthode de détection de souches de Venturia inaequalis virulentes, de préférence rapide et simple de mise en œuvre.
Description détaillée
Les Inventeurs sont parvenus à identifier et séquencer le gène d’avirulence AvrRviô du champignon V. inaequalis qui interagit avec le gène de résistance Rvi6. Ce sont les modifications nucléotidiques à ce locus (des mutations telles que substitution(s), insertion(s) et/ou délétion(s)) qui sont responsables du gain de virulence des souches mutées. Les Inventeurs ont en effet mis en évidence un polymorphisme génétique au locus AvrRviô, ainsi qu’au niveau de son promoteur, au sein de 120 souches de Venturia inaequalis. Sur la base de ce polymorphisme, les Inventeurs ont développé une méthode de détection de la présence de souches de Venturia inaequalis virulentes qui repose sur la détection spécifique des allèles et/ou promoteur du gène A vrRvi6 conférant à une souche un caractère virulent.
La méthode de détection selon l’invention présente l’avantage d’être simple de mise en œuvre et rapide, avec un résultat pouvant être obtenu en quelques jours. La méthode de détection selon l’invention est en outre sensible et précise, en particulier grâce à l’utilisation de technologies telles que la PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitative, en particulier la PCR quantitative isotherme, LAMP (Loop-Mediated Amplification) et/ou Qprobe combiné ou non à la technique LAMP.
La méthode de détection selon l’invention représente ainsi un outil d’aide à la décision essentiel pour déterminer si une virulence est présente à différentes échelles (par exemple, au sein d’un verger, d’une exploitation, d’un pépiniériste, d’un pays ou même d’un continent). La méthode selon l’invention permet également de contribuer grandement à la baisse d’utilisation des fongicides, (1 ) en permettant d’appliquer des traitements uniquement en présence de la population virulente, évitant ainsi un traitement préventif systématique et (2) en encourageant les producteurs à planter des variétés portant le gène de résistance Rvi6.
La méthode de détection selon l’invention peut également être utilisée pour vérifier la qualité de plants et permettre, par exemple, de garantir qu’un plant comprenant le gène de résistance Rvi6 est vierge de toute contamination par une souche de Venturia inaequalis virulente vis-à-vis du gène Rvi6. Un premier objet de l’invention concerne une méthode de détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente dans un échantillon, comprenant : a) fournir un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN de Venturia inaequalis, b) déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend au moins un polymorphisme de virulence, c) si au moins un polymorphisme de virulence est détecté à l’étape b), en déduire que l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche de Venturia inaequalis virulente.
Le polymorphisme de virulence est de préférence un allèle comprenant ou consistant en une séquence sélectionnée dans le groupe consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6 et/ou un promoteur comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.
L’étape a) du procédé tel défini ci-dessus comprend de préférence les étapes suivantes :
(i) fournir un échantillon susceptible de comprendre une souche de Venturia inaequalis,
(ii) extraire l’ADN présent dans l’échantillon fourni à l’étape (i), pour obtenir un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN de Venturia inaequalis.
L’étape b) du procédé tel défini ci-dessus comprend de préférence de déterminer si l’ADN comprend au moins un marqueur de virulence sélectionné dans le groupe consistant en :
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1 ,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant le nucléotide 62 de ladite séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant le nucléotide 160 de ladite séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant le nucléotide 192 de ladite séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant le nucléotide 201 de ladite séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence SEQ ID NO: 6, - un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotide 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, et
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8.
Un autre objet de l’invention concerne une méthode de traitement préventif et/ou curatif de pommiers comprenant le gène de résistance Rvi6 permettant de réduire la fréquence et/ou la quantité de produit phytosanitaire appliqué contre Venturia inaequalis, comprenant:
- mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode de détection telle que définie ci- dessus,
- appliquer un traitement préventif et/ou curatif si l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche de Venturia inaequalis virulente.
Un autre objet de l’invention concerne une méthode d’évaluation de la qualité d’un plant de pommier, comprenant les étapes suivantes : mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode de détection telle que définie ci- dessus, l’échantillon fourni à l’étape a) étant prélevé dans l’air autour dudit plant et/ou sur tout ou partie dudit plant, si aucun polymorphisme de virulence n’est détecté à l’étape b), en déduire que le plant n’est pas contaminé par une souche de Venturia inaequalis virulente comprenant le polymorphisme de virulence recherché à l’étape b).
Un autre objet de l’invention concerne une méthode de cartographie de la virulence de Venturia inaequalis comprenant les étapes suivantes : mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode de détection telle que définie ci- dessus, à partir d’au moins deux échantillons prélevés dans des zones géographiques différentes, en déduire que la zone géographique de laquelle provient un échantillon comprenant une souche de Venturia inaequalis virulente est une zone de virulence et que la zone géographique de laquelle provient un échantillon ne comprenant pas de souche de Venturia inaequalis virulente est une zone indemne de virulence.
Un autre objet de l’invention concerne un marqueur de virulence comprenant ou consistant en : - un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1 ,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant le nucléotide 62 de ladite séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant le nucléotide 160 de ladite séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant le nucléotide 192 de ladite séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant le nucléotide 201 de ladite séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence SEQ ID NO: 6,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotide 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, ou
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, ledit fragment comprenant au moins 15 nucléotides.
Un autre objet de l’invention concerne une combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence, lesdits marqueurs étant tels que définis ci-dessus.
Un autre objet de l’invention est un kit pour la détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente dans un échantillon, ledit kit comprenant des moyens pour amplifier un marqueur tel que défini ci-dessus ou les marqueurs de la combinaison telle que définie ci-dessus.
Un autre objet de l’invention concerne l’utilisation d’un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus, d’une combinaison de marqueurs telle que définie ci-dessus ou d’un kit tel que défini ci-dessus, pour détecter la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente ou pour déterminer si une souche de Venturia inaequalis est virulente ou avirulente, en particulier pour déterminer des zones géographiques de virulence, pour évaluer si un traitement fongicide est nécessaire, pour évaluer la qualité d’un plant de pommier et/ou de fruits d’un pommier et/ou évaluer si la virulence est présente sur un territoire donné pour aider à la décision de planter ou non des variétés de pommier portant le gène de résistance Rvi6. Venturia inaecmalis
Par « tavelure du pommier », on désigne ici une maladie cryptogamique causée par le champignon Venturia inaequalis.
La tavelure du pommier affecte les pommiers du genre Malus.
Toutefois, les pommiers du genre Malus comprenant le gène de résistance Rvi6 sont résistants aux souches de Venturia inaequalis dites avirulentes avrRviô.
Le champignon Venturia inaequalis comprend en effet un gène d’avirulence AvrRvi6.
Dans une souche de Venturia inaequalis avirulente, la protéine codée par le gène d’avirulence AvrRviô est reconnue directement ou indirectement par la protéine codée par le gène de résistance Rvi6 exprimée par le pommier, déclenchant ainsi une réaction rapide de défense du pommier qui empêche le développement ultérieur de cet agent pathogène. Le pommier est alors dit « résistant ».
Par « souche de Venturia inaequalis », on désigne ici un individu unique pouvant être distingué par son génotype.
La souche de Venturia inaequalis peut être sous la forme de spores ou de mycélium.
La souche de Venturia inaequalis est généralement présente sur plante infectée sous la forme de tâches résultantes de la présence de spores et de mycélium.
Par les termes « souche de Venturia inaequalis avirulente » ou « souche de Venturia inaequalis ayant un caractère avirulent », on désigne ici une souche de Venturia inaequalis comprenant un gène d’avirulence AvrRviô codant pour une protéine reconnue directement ou indirectement par la protéine codée par le gène de résistance Rvi6 du pommier.
Par les termes « souche de Venturia inaequalis virulente » ou « souche de Venturia inaequalis ayant un caractère virulent », on désigne ici une souche de Venturia inaequalis qui n’est pas reconnue comme un agent pathogène par un pommier comprenant le gène de résistance Rvi6 ; une telle souche est donc responsable de maladie sur les variétés portant le gène Rvi6.
Une souche de Venturia inaequalis virulente peut comprendre au moins une mutation dans le gène d’avirulence AvrRviô et/ou dans le promoteur du gène d’avirulence AvrRviô, résultant ainsi en l’absence d’expression de la protéine et/ou en une protéine qui n’est plus reconnue par la protéine codée par le gène de résistance Rvi6.
Par le terme « locus », on désigne une position fixe d'un gène ou d'un marqueur génétique sur un chromosome.
Par le terme « allèle », on désigne ici une variante d'un gène situé à un locus donné. Par « polymorphisme conférant un caractère virulent (ou avirulent) » ou « polymorphisme de virulence (ou d’avirulence) », on désigne ici un allèle et/ou une séquence de promoteur conférant un caractère virulent (ou avirulent) à une souche de Venturia inaequalis.
Un allèle conférant un caractère virulent à une souche de Venturia inaequalis au niveau du locus A vrRviô comprend ou consiste par exemple en une séquence sélectionnée dans le groupe consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6.
La séquence SEQ ID NO: 1 comprend une substitution au nucléotide 139, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, et une délétion des nucléotides 155 à 309 par exemple par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15.
La séquence SEQ ID NO: 2 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 62, en particulier par la présence du nucléotide C au lieu du nucléotide G, d’une substitution au nucléotide 139, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, d’une substitution au nucléotide 237, en particulier par la présence du nucléotide C au lieu du nucléotide T et d’une substitution au nucléotide 279, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu de T.
La séquence SEQ ID NO: 3 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 139, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, d’une substitution au nucléotide 160, en particulier par la présence du nucléotide C au lieu du nucléotide T et par la présence d’une substitution au nucléotide 279, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide T.
La séquence SEQ ID NO: 4 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 139, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, d’une substitution au nucléotide 192, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu de C, d’une substitution au nucléotide 219, en particulier par la présence du nucléotide G au lieu du nucléotide A et d’une substitution au nucléotide 279, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide T.
La séquence SEQ ID NO: 5 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 139, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, d’une substitution au nucléotide 201 , en particulier par la présence du nucléotide C au lieu du nucléotide T et d’une substitution au nucléotide 279, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide T.
La séquence SEQ ID NO: 6 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 304, en particulier par la présence du nucléotide G au lieu du nucléotide T. Un exemple d’allèle conférant un caractère avirulent à une souche de Venturia inaequalis au niveau du locus AvrRviô est un allèle comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 15.
Un promoteur conférant un caractère virulent à une souche de Venturia inaequalis au niveau du locus AvrRviô comprend ou consiste par exemple en la séquence SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.
La séquence SEQ ID NO: 7 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 189, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, par la présence de trois délétions des nucléotides 309 à 31 1 , en particulier par la délétion des nucléotides A, T et A et par l’insertion de 5 nucléotides en position 484, en particulier les nucléotides G, A, A, T et A.
La séquence SEQ ID NO: 8 est caractérisée par la présence d’une insertion de 281 nucléotides au nucléotide 139, une délétion des nucléotides 552 à 555, d’une substitution au nucléotide 572, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu de C et une substitution du nucléotide 706, en particulier par la présence du nucléotide G au lieu de A.
Un exemple de promoteur conférant un caractère avirulent à une souche de Venturia inaequalis au niveau du locus AvrRviô est un allèle comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 14.
Marqueur de virulence, marqueur de la présence de Venturia inaequalis, combinaison de marqueurs
La présente invention a également pour objet un marqueur de virulence, un marqueur de Venturia inaequalis et/ou une combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement, d’au moins un marqueur de la présence de V. inaequalis.
Par « marqueur de virulence », on désigne ici un polynucléotide dont la séquence correspond à une région présente au locus d’avirulence d’une souche de Venturia inaequalis virulente, mais différente du locus d’avirulence des souches de Venturia inaequalis avirulentes. Un marqueur de virulence comprend par exemple au moins une mutation d’un nucléotide (substitution, addition et/ou délétion) par rapport à la séquence présente dans une souche de Venturia inaequalis avirulente.
Le Tableau 1 indique les polymorphismes d’un seul nucléotide (SNP ou « Single Nucleotide Polymorphism ») et/ou délétion présents dans les allèles comprenant ou consistant en les séquences SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 6. La position du SNP ou de la délétion est indiquée par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15. [Tableau 1]
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La présente invention a ainsi pour objet un marqueur de virulence comprenant ou consistant en:
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1 , de préférence comprenant les nucléotides 155 à 180 de ladite séquence SEQ ID NO: 1 , ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 1,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant le nucléotide 62 de ladite séquence, ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant le nucléotide 160 de ladite séquence, ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant le nucléotide 192 de ladite séquence, ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant le nucléotide 201 de ladite séquence, ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence, ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 6,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotides 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, ledit marqueur étant notamment spécifique de du promoteur de séquence SEQ ID NO: 7, ou
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, ledit marqueur étant notamment spécifique du promoteur de séquence SEQ ID NO: 8.
La présente invention a par exemple pour objet un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus comprenant ou consistant en :
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1 , de préférence comprenant les nucléotides 155 à 180 de ladite séquence SEQ ID NO: 1 ,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant (i) le nucléotide 62 et (ii), optionnellement, le nucléotide 139, le nucléotide 237 et/ou le nucléotide 279 de ladite séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant (i) le nucléotide 160 et (ii), optionnellement, le nucléotide 139 et/ou le nucléotide 279 de ladite séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant (i) le nucléotide 192 et (ii), optionnellement, le nucléotide 139, le nucléotide 219 et/ou le nucléotide 279 de ladite séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant (i) le nucléotide 201 et (ii), optionnellement, le nucléotide 139 et/ou le nucléotide 279 de ladite séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence SEQ ID NO: 6,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotides 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, ou
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8. Par « fragment », on désigne ici un polynucléotide d’une longueur d’au moins 5 nucléotides, de préférence au moins 8 nucléotides, plus préférentiellement au moins 10 nucléotides, par exemple au moins 15 ou au moins 20 nucléotides. Le fragment est de préférence un fragment de taille inférieure ou égale à 50 nucléotides, de préférence inférieure ou égale à 40 nucléotides, par exemple inférieure ou égale à 30 nucléotides.
Un fragment tel que défini ci-dessus comprend de préférence au moins 15 nucléotides.
Par « fragment de la séquence SEQ ID NO: X », on désigne un fragment consistant en des nucléotides consécutifs d’un polynucléotide de séquence SEQ ID NO: X.
La présente invention a ainsi par exemple pour objet un marqueur de virulence comprenant ou consistant en :
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 155 à 180 de la séquence SEQ ID NO: 1 ,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 52 à 72 de la séquence SEQ ID NO: 2,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 150 à 170 de la séquence de la séquence SEQ ID NO: 3,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 182 à 202 de la séquence SEQ ID NO: 4,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 191 à 211 de la séquence SEQ ID NO: 5,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 294 à 314 de la séquence SEQ ID NO: 6,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 180 à 200, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de la séquence SEQ ID NO: 7, ou
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 562 à 582, les nucléotides 696 à 716, les nucléotides 548 à 557 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de la séquence SEQ ID NO: 8.
Par « marqueur de la présence de V. inaequalis », on désigne ici un polynucléotide dont la séquence correspond à une région présente chez l’ensemble des souches de Venturia inaequalis.
Un marqueur de la présence de V. inaequalis pouvant être utilisé est par exemple un polynucléotide comprenant tout ou une partie de la séquence codant pour l’actine de V. inaequalis, un polynucléotide comprenant tout ou une partie de la séquence codant pour un facteur d’élongation de V. inaequalis ou un polynucléotide comprenant tout ou une partie du gène de ménage RPL4 de V. inaequalis.
Un marqueur de la présence de V. inaequalis préféré est un polynucléotide comprenant tout ou une partie du gène de ménage RPL4 de V. inaequalis.
La présente invention a ainsi pour objet un marqueur de la présence de Venturia inaequalis comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 9 ou en un fragment de la séquence SEQ ID NO: 9.
Un marqueur de la présence de Venturia inaequalis est par exemple le polynucléotide correspondant aux nucléotides 1243 à 1419 de la séquence SEQ ID NO: 9.
Un exemple de couple d’amorces permettant d’amplifier un marqueur de la présence de Venturia inaequalis, en particulier le gène de ménage RPL4, consiste en l’amorce sens de séquence SEQ ID NO: 10 (TTCAATCTGCTCTCCGAGGT) et l’amorce anti-sens de séquence SEQ ID NO: 11 (CTAATGCCTTTGGCTTCTCG).
La présente invention a également pour objet une combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement, d’au moins un marqueur de la présence de V. inaequalis.
Les marqueurs de virulence et/ou le marqueur de la présence de V. inaequalis de ladite combinaison sont notamment tels que définis ci-dessus.
La combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement, d’au moins un marqueur de la présence de V. inaequalis peut par exemple comprendre : au moins 2 marqueurs de virulence, de préférence au moins 4 marqueurs de virulence, de préférence au moins 6 marqueurs de virulence, par exemple 6, 7, 8 ou au moins 8 marqueurs de virulence et
- optionnellement, un ou au moins un marqueur de la présence de V. inaequalis.
Une combinaison préférée d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement d’au moins un marqueur de la présence de V. inaequalis peut comprendre :
- 8 marqueurs de virulence, par exemple : o un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 155 à 180 de la séquence SEQ ID NO: 1 , o un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 52 à 72 de la séquence SEQ ID NO: 2, o un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 150 à 170 de la séquence de la séquence SEQ ID NO: 3, o un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 182 à 202 de la séquence SEQ ID NO: 4, o un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 191 à 211 de la séquence SEQ ID NO: 5, o un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 294 à 314 de la séquence SEQ ID NO: 6, o un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 180 à 200, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de la séquence SEQ ID NO: 7, et o un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 562 à 582, les nucléotides 696 à 716, les nucléotides 548 à 557 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de la séquence SEQ ID NO: 8, et
- optionnellement, un marqueur de la présence de V. inaequalis, par exemple un marqueur de la présence de Venturia inaequalis comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 9 ou en un fragment de la séquence SEQ ID NO: 9 telle que défini ci-dessus.
Méthode de détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente La présente invention a particulièrement pour objet une méthode de détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente, en particulier à l’encontre d’un pommier comprenant un gène de résistance Rvi6, dans un échantillon, comprenant : a) fournir un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN de Venturia inaequalis, b) déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend au moins un polymorphisme de virulence et, optionnellement, au moins un marqueur de la présence de V. inaequalis, c) si au moins un polymorphisme de virulence est détecté à l’étape b), en déduire que l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche de Venturia inaequalis virulente.
Etape a)
L’étape a) comprend ou consiste en la fourniture d’un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN de Venturia inaequalis.
L’expression « susceptible de comprendre de l’ADN» signifie que l’échantillon de départ peut ne pas comprendre de souche de Venturia inaequalis, auquel cas aucun ADN de Venturia inaequalis ne sera présent dans l’échantillon. La présence de Venturia inaequalis dans l’échantillon peut être vérifiée à l’étape b) en déterminant la présence d’au moins un marqueur de la présence de V. inaequalis.
Dans un mode de réalisation préféré, l’étape a) de fourniture d’un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN de Venturia inaequalis comprend les étapes suivantes :
(i) fournir un échantillon susceptible de comprendre au moins une souche de Venturia inaequalis,
(ii) extraire l’ADN présent dans l’échantillon fourni à l’étape (i), pour obtenir un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN de Venturia inaequalis.
L’échantillon susceptible de comprendre au moins une souche de Venturia inaequalis peut être prélevé par toute méthode bien connue de l’homme du métier.
L’échantillon susceptible de comprendre au moins une souche de Venturia inaequalis peut être prélevé dans l’air, par exemple en utilisant un ou plusieurs pièges à spores, en particulier placé(s) à côté d’un pommier, par exemple au centre d’un verger, d’une pépinière ou répartis sur la surface d’un verger ou au sol et/ou être prélevé à partir de feuilles et/ou fruits de pommiers. L’ADN peut par exemple être extrait à partir de tissus présentant des symptômes, tels que des tissus de fruits et/ou feuilles.
La ou les souches de Venturia inaequalis sont de préférence présentes dans l’échantillon sous la forme de spores et/ou de mycélium, par exemple sur ou dans des tissus de la plante (feuilles et/ou fruits).
L’échantillon susceptible de comprendre au moins une souche de Venturia inaequalis comprend donc de préférence des spores de Venturia inaequalis et/ou un ou des tissus de pommier.
L’extraction de l’ADN est effectuée par toute méthode appropriée bien connue de l’homme du métier, par exemple en utilisant un kit d’extraction d’ADN commercial ou une méthode d’extraction manuelle, telle que l’extraction d’ADN au CTAB (bromure d'hexadécyltriméthylammonium).
Etape b)
L’étape b) comprend ou consiste à déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend au moins un polymorphisme de virulence et, optionnellement, un marqueur de la présence de V. inaequalis.
Le polymorphisme de virulence est de préférence un allèle comprenant ou consistant en une séquence sélectionnée dans le groupe consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6 ou un promoteur comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.
Dans un mode de réalisation préféré, l’étape b) comprend ainsi de déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend un allèle comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 , un allèle comprenant ou consistant en SEQ ID NO: 2, un allèle comprenant ou consistant en SEQ ID NO: 3, un allèle comprenant ou consistant en SEQ ID NO: 4, un allèle comprenant ou consistant en SEQ ID NO: 5, un allèle comprenant ou consistant en SEQ ID NO: 6, un promoteur comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 7 et/ou un promoteur comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 8.
Dans un mode de réalisation préféré, la présence d’au moins un polymorphisme de virulence dans ledit ADN est déterminée par la présence d’au moins un marqueur de virulence, en particulier un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus ou une combinaison de marqueurs de virulence telle que définie ci-dessus.
De préférence, l’étape b) comprend ainsi de déterminer si ledit ADN comprend au moins un marqueur de virulence, en particulier un marqueur de virulence tel que défini ci- dessus ou une combinaison de marqueurs de virulence telle que définie ci-dessus.
La méthode selon l’invention permet ainsi avantageusement de détecter spécifiquement un allèle ou un promoteur conférant un caractère virulent.
De préférence, l’étape b) comprend ou consiste à déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend au moins un polymorphisme de virulence et, optionnellement, un marqueur de la présence de V. inaequalis, la présence d’au moins un polymorphisme de virulence dans ledit ADN étant déterminée par la présence d’au moins un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus, de préférence sélectionné dans le groupe consistant en :
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1 ,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant le nucléotide 62 de ladite séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant le nucléotide 160 de ladite séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant le nucléotide 192 de ladite séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant le nucléotide 201 de ladite séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence SEQ ID NO: 6, - un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotide 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, et
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, ou par la présence d’une combinaison de marqueurs de virulence telle que définie ci- dessus.
L’étape b) telle que définie ci-dessus comprend de préférence une étape de contrôle de la présence d’ADN d’une souche de Venturia inaequalis.
Cette étape de contrôle de la présence d’ADN d’une souche de Venturia inaequalis comprend par exemple de déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon est de l’ADN de Venturia inaequalis.
Cette étape de contrôle de la présence d’ADN d’une souche de Venturia inaequalis comprend par exemple de déterminer si une séquence commune aux souches virulentes et avirulentes est présente dans l’échantillon, par exemple la séquence d’un gène de ménage RPL4.
Le marqueur de la présence de V. inaequalis est donc utilisé comme marqueur de contrôle dans la méthode de détection définie ci-dessus.
Le marqueur de la présence de V. inaequalis est par exemple un polynucléotide comprenant tout ou partie de la séquence du gène RPL4 de V. inaequalis, par exemple comprenant tout ou une partie de la séquence SEQ ID NO: 9.
Afin de déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend au moins un polymorphisme de virulence, toute technique bien connue de l’homme du métier peut être utilisée, telle que le séquençage de tout ou partie de la séquence du promoteur du gène d’avirulence AvrRviô et/ou de la séquence de l’allèle présent au locus AvrRviô et/ou une technique d’amplification de l’ADN, de préférence une amplification isotherme.
Des exemples non limitatifs d’amplification de l’ADN incluent la PCR, la PCR quantitative, la PCR quantitative isotherme, LAMP (Loop-Mediated Amplification) et/ou Qprobe combiné ou non à la technique LAMP, RPA (Recombinase Polymerase Amplification). La méthode LAMP est une méthode d’amplification isotherme qui présente un très haut niveau de spécificité, lié à l’utilisation de 6 amorces et qui est généralement très rapide. La détection de l’amplification par la méthode LAMP peut être réalisée par électrophorèse, turbidimétrie, électrochimies ou colorimétrie.
La méthode RPA est une méthode d’amplification isotherme réalisée à basse température. La détection de l’amplification par la méthode RPA est souvent effectuée par fluorescence, en utilisant par exemples des sondes fluorescentes ou des agents intercalants.
Lorsqu’une technique d’amplification de l’ADN est utilisée, au moins un couple d’amorces capable d’amplifier un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus et, optionnellement, au moins un couple d’amorces capable d’amplifier un marqueur de la présence de V. inaequalis tel que défini ci-dessus, est/sont utilisé(s).
Le couple d’amorces capable d’amplifier un marqueur de virulence permet par exemple d’obtenir : un fragment amplifié à partir de l’ADN d’une souche virulente, mais pas à partir de l’ADN d’une souche avirulente, un fragment amplifié à partir de l’ADN d’une souche avirulente, mais pas à partir de l’ADN d’une souche virulente, ou un fragment amplifié à partir de l’ADN d’une souche virulente d’une taille différente de celui amplifié à partir de l’ADN d’une souche avirulente.
L’amorce sens et/ou l’amorce anti-sens peuvent par exemple s’hybrider au niveau d’un marqueur de virulence, en particulier lorsque le polymorphisme au niveau dudit marqueur résulte d’une ou plusieurs substitutions et/ou délétions et/ou insertions de nucléotide.
Alternativement, l’amorce sens et/ou l’amorce anti-sens peuvent s’hybrider autour d’un marqueur de virulence, en particulier lorsque le polymorphisme au niveau dudit marqueur résulte au moins d’une délétion et/ou addition de nucléotide(s).
Il est possible d’utiliser un couple d’amorces pour déterminer la présence d’un marqueur de virulence donné.
Dans un mode de réalisation avantageux, un même couple d’amorces peut permettre de déterminer la présence de plusieurs marqueurs de virulence donnés, par exemple en amplifiant des fragments de taille différente.
Les marqueurs de virulence et de la présence de V. inaequalis sont notamment tels que définis ci-dessus. Etape c)
Dans l’étape c), si au moins un polymorphisme de virulence est détecté à l’étape b), il en est déduit que l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche de Venturia inaequalis virulente.
Dans l’étape c), si un marqueur de présence de V. inaequalis est détecté mais qu’aucun des polymorphismes de virulence n’est détecté à l’étape b), il en est déduit que l’échantillon fourni à l’étape a) ne comprend pas de souche de Venturia inaequalis virulente correspondant aux polymorphismes de virulence testés.
Si aucun ADN d’une souche de Venturia inaequalis n’est détecté dans l’échantillon, alors l’échantillon de comprend pas de souche de Venturia inaequalis.
Méthode de traitement préventif et/ou curatif de pommiers
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement préventif et/ou curatif de pommiers comprenant le gène de résistance Rvi6, permettant notamment de réduire la fréquence et/ou la quantité de produit phytosanitaire appliquée contre Venturia inaequalis, comprenant :
- la mise en œuvre des étapes a) à c) de la méthode telle que définie ci-dessus de détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente dans un échantillon, et
- l’application d’un traitement préventif et/ou curatif si l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche de Venturia inaequalis virulente.
La méthode de détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente selon l’invention peut ainsi servir d’outil d’aide à la décision pour savoir si l’application d’un traitement préventif et/ou curatif est nécessaire.
Le traitement préventif et/ou curatif est de préférence effectué autour de la zone de prélèvement de l’échantillon, par exemple dans une pépinière, dans le verger ou dans l’exploitation autour de la zone de prélèvement de l’échantillon où d’autres arbres portant le gène de résistance Rvi6 sont plantés.
Le traitement préventif et/ou curatif comprend par exemple l’application d’un produit phytosanitaire approprié contre Venturia inaequalis, tel que par exemple un fongicide.
Le fongicide est par exemple choisi parmi un fongicide à base du cuivre ou un fongicide appartenant à la famille des strobilurines ou des Anilinopyrimidines.
Méthode d’évaluation de la qualité d’un plant de pommier
La présente invention a également pour objet une méthode d’évaluation de la qualité d’un plant de pommier, en particulier d’un plant de pommier comprenant un gène de résistance Rvi6, en particulier avant sa commercialisation, comprenant les étapes suivantes :
- la mise en œuvre des étapes a) à c) de la méthode telle que définie ci-dessus de détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente dans un échantillon, l’échantillon fourni à l’étape a) étant prélevé dans l’air autour dudit plant et/ou sur tout ou partie dudit plant, et si aucun polymorphisme de virulence n’est détecté à l’étape b), en déduire que le plant n’est pas contaminé par une souche de Venturia inaequalis virulente comprenant le polymorphisme de virulence recherché à l’étape b).
Dans la méthode ci-dessus, si (i) aucun allèle comprenant ou consistant en les séquences SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6, et aucun promoteur comprenant ou consistant en les séquences SEQ ID NO: 7et SEQ ID NO: 8 n’est détecté à l’étape a) et (ii) si de l’ADN d’une souche de Venturia inaequalis est détecté dans l’échantillon, il en est déduit que le plant n’est pas contaminé par une souche de Venturia inaequalis virulente comprenant le polymorphisme de virulence.
Méthode cartographie géographique de la virulence de Venturia inaequalis
La présente invention a également pour objet une méthode de cartographie de la virulence de Venturia inaequalis, en particulier à l’encontre d’un pommier comprenant un gène de résistance Rvi6, comprenant les étapes suivantes : mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode telle que définie ci-dessus de détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente dans un échantillon, à partir d’au moins deux échantillons prélevés dans des zones géographiques différentes, en déduire que la zone géographique de laquelle provient un échantillon comprenant une souche de Venturia inaequalis virulente est une zone de virulence et que la zone géographique de laquelle provient un échantillon ne comprenant pas de souche de Venturia inaequalis virulente est une zone indemne de virulence.
La zone géographique peut par exemple être un verger, une exploitation, un bassin de production, une région, un pays, un continent et/ou une île.
Kit pour la détection de la présence d’une souche de Venturia /naequafe virulente
La présente invention a également pour objet un kit pour la détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente, en particulier à l’encontre d’un pommier comprenant un gène de résistance Rvi6, dans un échantillon, ledit kit comprenant des moyens permettant d’amplifier au moins un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus et, optionnellement, au moins un marqueur de la présence de Venturia inaequalis tel que défini ci-dessus.
Le kit peut par exemple comprendre des moyens permettant d’amplifier les marqueurs de la combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement, d’au moins un marqueur de la présence de V. inaequalis telle que définie ci-dessus.
Les moyens permettant d’amplifier un marqueur comprennent par exemple au moins un couple d’amorces spécifiques dudit ou desdits marqueur(s) et sont par exemple tels que définis ci-dessus
Utilisation d’un marqueur de virulence, d’une combinaison de marqueurs de virulence ou du kit pour la détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente
La présente invention a également pour objet l’utilisation d’un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus, d’une combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement, d’au moins un marqueur de la présence de V. inaequalis telle que définie ci-dessus, et/ou d’un kit telle que défini ci-dessus pour détecter la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente, en particulier à l’encontre d’un pommier comprenant un gène de résistance Rvi6, ou pour déterminer si une souche de Venturia inaequalis est virulente ou avirulente, en particulier à l’encontre d’un pommier comprenant un gène de résistance Rvi6.
L’utilisation telle que définie ci-dessus permet par exemple de déterminer des zones géographiques de virulence ou d’avirulence, évaluer si un traitement fongicide est nécessaire, évaluer la qualité d’un plant de pommier et/ou de fruits d’un pommier, par exemple avant commercialisation en France ou à l’export, et/ou évaluer si la virulence est présente sur un territoire donné pour aider à la décision de planter ou non des variétés de pommier portant le gène de résistance Rvi6.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatif.
Listage de séquences
La séquence SEQ ID NO: 1 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 2199. La séquence SEQ ID NO: 2 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche NL24.
La séquence SEQ ID NO: 3 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 1 180.
La séquence SEQ ID NO: 4 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 2476.
La séquence SEQ ID NO: 5 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 1 153.
La séquence SEQ ID NO: 6 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 08M205.
La séquence SEQ ID NO: 7 est un exemple de séquence du promoteur du gène AvrRvi6 conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 1286.
La séquence SEQ ID NO: 8 est un exemple de séquence du promoteur du gène AvrRvi6 conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 2207.
La séquence SEQ ID NO: 9 est la séquence du gène de ménage RPL4 de Venturia inaequalis.
Les séquences SEQ ID NO: 10 et 1 1 correspondent respectivement aux séquences des amorces sens et anti-sens d’un couple d’amorces utilisé pour la détection du gène de ménage RPL4 de Venturia inaequalis.
Les séquences SEQ ID NO: 12 et 13 correspondent respectivement aux séquences des amorces sens et anti-sens d’un couple d’amorces utilisé pour la détection d’une souche de Venturia inaequalis virulente.
La séquence SEQ ID NO: 14 est un exemple de séquence du promoteur du gène AvrRvi6 conférant un caractère avirulent, tel que présent dans la souche EUB04.
La séquence SEQ ID NO: 15 est la séquence d’un allèle conférant un caractère avirulent, tel que présent dans la souche EUB04.
Figures
[Fig 1] La Figure 1 présente les résultats de l’amplification par PCR quantitative de l’ADN génomique de la souche avirulente EUB04 au locus AvrRviô en utilisant les amorces SEQ ID NO: 12 et 13. Les différentes courbes correspondent à une gamme de dilution. Le signal obtenu en RFU (Unités de fluorescence relative) est donné en fonction du nombre de cycles de PCR.
[Fig 2] La figure 2 présente les résultats de l’amplification par PCR quantitative de l’ADN de la souche virulente 2199 au locus AvrRviôen utilisant les amorces SEQ ID NO: 12 et 13. Les différentes courbes correspondent à une gamme de dilution. Le signal obtenu en RFU (Unités de fluorescence relative) est donné en fonction du nombre de cycles de PCR.
[Fig 3] La Figure 3 montre les courbes de fusion des amplicons du locus AvrRviô chez la souche virulente 2199 et la souche avirulente EUB04 en utilisant les amorces SEQ ID NO: 12 et 13. Le signal obtenu en -d(RFU)/dT est donné en fonction de la température en Celsius.
EXEMPLES
Exemple 1 : Analyse du polymorphisme au locus d’avirulence AvrRvi6
Matériel et Méthodes
Le gène d’avirulence AvrRviô qui interagit avec le gène de résistance Rvi6 a été cloné, puis le polymorphisme allélique au locus AvrRviô et au niveau de son promoteur a été analysée sur 150 souches de V. inaequalis provenant de vergers et de pommiers sauvages.
Résultats
Cette analyse a permis de mettre en évidence différents polymorphismes associés au caractère virulent et différents polymorphismes associés au caractère avirulent de Venturia inaequalis.
Les séquences SEQ ID NO: 1 à 6 sont des exemples d’allèles conférant un caractère virulent. Les séquences SEQ ID NO: 7 et 8 sont des exemples de séquence du promoteur de AvrRviô associé à un caractère virulent.
Cette analyse du polymorphisme a montré que les souches virulentes détectées dans les vergers européens présentent des allèles au locus AvrRviô partagés par les Malus présents dans les espaces non cultivés, confirmant ainsi que les pommiers sauvages sont les réservoirs de virulence responsable de ce contournement de la résistance.
Par ailleurs, l’absence d’observation de nouveaux cas de contournement dans les vergers signifie qu’il est possible de mettre au point un outil permettant de détecter spécifiquement et de manière exhaustive la virulence vis-à-vis du gène de résistance Rvi6 en vergers de pommiers à partir des allèles identifiés au sein de la population virulente présente dans le compartiment non cultivé.
Exemple 2 : Méthode de détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente
Matériel et méthodes
L’ADN génomique de la souche à tester est extrait à partir de spores. L’extraction est réalisée selon le protocole du kit Nucleospin Food (Macherey Nagel). Le locus AvrRviô est détecté par PCR quantitative en utilisant le mélange réactionnel suivant pour une réaction :
3.75 pl MesaBlue 2X (Eurogentec)
0.3 pl d’amorce sens à 10pM (soit concentration finale = 200 nM) de séquence SEQ ID NO: 12 : CGATCCTTTTCGCACAGTCT (Eurofins)
0.3 pl d’amorce anti-sens à 10pM de séquence SEQ ID NO: 13 : CTCAGTTGCATTGGCTTCGT (Eurofins)
3 pl ADN génomique dilué de Venturia inaequalis
Qsp 15pl H2O
Le programme de PCR quantitative utilisé est le suivant (en utilisant un appareil Biorad CFX connect) :
1 . 95°C 5 minutes
2. 95°C 3 secondes
3. 60°C 1 minute
+ lecture de la plaque
4. Répétition des étapes 2 à 3, 39 fois
5. Courbe de fusion de 55°C à 90°C par palier de 0,5°C/5s
+ lecture de la plaque
Résultats
Les résultats obtenus sont présentés aux figures 1 à 3.
Les figures 1 et 2 montrent que la méthode utilisée permet d’amplifier les allèles respectivement de la souche avirulente B04 et de la souche virulente 2199 au locus AvrRviô.
La figure 3 montre que les courbes de fusion des deux allèles sont différentes traduisant une délétion de nucléotides chez la souche virulente comparée à la souche avirulente. L’allèle de virulence porté par la souche 2199 se distingue en effet de l’allèle d’avirulence porté par la souche B04 par une délétion de 155 paires de bases.
La méthode de détection selon l’invention permet donc de détecter la présence d’une souche virulente de Venturia inaequalis.

Claims

24
REVENDICATIONS Méthode de détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente dans un échantillon, comprenant : a) fournir un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN de Venturia inaequalis, b) déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend au moins un polymorphisme de virulence, c) si au moins un polymorphisme de virulence est détecté à l’étape b), en déduire que l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche de Venturia inaequalis virulente. Méthode de détection selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le polymorphisme de virulence est un allèle comprenant ou consistant en une séquence sélectionnée dans le groupe consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6 ou un promoteur comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Methode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que retape b) comprend de déterminer si l’ADN comprend au moins un marqueur de virulence sélectionné dans le groupe consistant en :
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1 ,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant le nucléotide 62 de ladite séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant le nucléotide 160 de ladite séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant le nucléotide 192 de ladite séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant le nucléotide 201 de ladite séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence SEQ ID NO: 6,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotide 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence
SEQ ID NO: 7, et - un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8.
4. Méthode de traitement préventif et/ou curatif de pommiers comprenant le gène de résistance Rvi6 permettant de réduire la fréquence et/ou la quantité de produit phytosanitaire appliqué contre Venturia inaequalis, comprenant:
- mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode selon l’une des revendications 1 à 3,
- appliquer un traitement préventif et/ou curatif si l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche de Venturia inaequalis virulente.
5. Méthode d’évaluation de la qualité d’un plant de pommier, comprenant les étapes suivantes :
- mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode selon l’une des revendications 1 à 3, l’échantillon fourni à l’étape a) étant prélevé dans l’air autour dudit plant et/ou sur tout ou partie dudit plant,
- si aucun polymorphisme de virulence n’est détecté à l’étape b), en déduire que le plant n’est pas contaminé par une souche de Venturia inaequalis virulente comprenant le polymorphisme de virulence recherché à l’étape b).
6. Méthode de cartographie de la virulence de Venturia inaequalis comprenant les étapes suivantes :
- mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode selon l’une des revendications 1 à 3, à partir d’au moins deux échantillons prélevés dans des zones géographiques différentes,
- en déduire que la zone géographique de laquelle provient un échantillon comprenant une souche de Venturia inaequalis virulente est une zone de virulence et que la zone géographique de laquelle provient un échantillon ne comprenant pas de souche de Venturia inaequalis virulente est une zone indemne de virulence.
7. Marqueur de virulence comprenant ou consistant en : - un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1 ,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant le nucléotide 62 de ladite séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant le nucléotide 160 de ladite séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant le nucléotide 192 de ladite séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant le nucléotide 201 de ladite séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence SEQ ID NO: 6,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotide 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, ou
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, ledit fragment comprenant au moins 15 nucléotides.
8. Combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence, lesdits marqueurs de virulence étant tels que définis dans la revendication 7.
9. Kit pour la détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente dans un échantillon, ledit kit comprenant des moyens pour amplifier un marqueur selon la revendication 7 ou les marqueurs de la combinaison selon la revendication 8.
10. Utilisation d’un marqueur de virulence selon la revendication 7, d’une combinaison de marqueurs selon la revendication 8 ou d’un kit selon la revendication 9, pour détecter la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente ou pour déterminer si une souche de Venturia inaequalis est virulente ou avirulente, de préférence pour déterminer des zones géographiques de virulence, pour évaluer si un traitement fongicide est nécessaire, pour évaluer la qualité d’un plant de pommier et/ou de fruits d’un pommier et/ou évaluer si la virulence est présente sur un territoire donné pour aider à la décision de planter ou non des variétés de pommier portant le gène de résistance Rvi6.
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