FR3113910A1 - Methode de detection de souches de venturia inaequalis virulentes - Google Patents
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Abstract
METHODE DE DETECTION DE SOUCHES DE VENTURIA INAEQUALIS VIRULENTES La présente invention a pour objet une méthode de détection de la présence d’une souche de Venturia inaequalis virulente dans un échantillon. Cette méthode est basée sur la mise en évidence de marqueurs spécifiques associés aux souches de Venturia inaequalis virulentes. Cette méthode de détection a plusieurs applications avantageuses, telle que déterminer des zones géographiques de virulence, permettant notamment d’évaluer l’intérêt de planter dans cette zone un verger avec des variétés portant le gène de résistance correspondant, évaluer si un traitement fongicide est nécessaire au niveau d’un verger, évitant ainsi un traitement préventif systématique, ou évaluer la qualité sanitaire d’un plant de pommier comprenant le gène de résistance Rvi6. Figure pour l'abrégé : néant
Description
La présente invention concerne la détection de souches deVenturia inaequalisvirulentes.
Etat de la technique
La tavelure du pommier est une des principales maladies fongiques du pommier. L’agent pathogène responsable de la tavelure du pommier est un champignon ascomycète appeléVenturia inaequalis. La tavelure du pommier est caractérisée par l’apparition de tâches de forme circulaire noires ou brunes à la surface des feuilles, des bourgeons, des fruits et/ou sur le bois des arbres fruitiers infectés. Les fruits et les feuilles sont particulièrement sensibles àVenturia inaequalis.
La tavelure est favorisée par un climat humide au printemps au moment du débourrement des bourgeons. La période des contaminations primaires liées à la projection des ascospores démarre au printemps. Les contaminations primaires conduiront au développement de symptômes sporulants sur jeunes feuilles et jeunes fruits. En périodes pluvieuses durant le printemps et l’été, les spores projetées par les gouttes d’eau et le vent initieront les contaminations secondaires.
En verger, la tavelure n’entraîne pas la mort du pommier atteint, mais peut réduire significativement la productivité de l’arbre atteint et surtout la qualité des fruits puisque aucune tâche de tavelure n’est tolérée sur fruits dans les circuits de distribution. Pour protéger leurs vergers de pommiers, les producteurs ont recours à la lutte chimique. Ainsi, que ce soit en agriculture conventionnelle ou biologique, la lutte contre la tavelure du pommier nécessite en moyenne 25 traitements fongicides par an voire plus les années pluvieuses.
A ce jour, la lutte génétique repose essentiellement sur l’utilisation d’un seul gène de résistance, le gèneRvi6que les sélectionneurs ont introduit dans certaines variétés à partir de l’espèce ornementaleM alus floribunda. Toutefois, dans certaines régions d’Europe, l’émergence de souches virulentes deVenturia inaequalisa provoqué une perte d’efficacité de cette résistance.
A ce jour, il n’existe pas de moyens de détecter la présence de souches deVenturia inaequalisvirulentes vis-à-vis du gène de résistanceRvi6. De ce fait, par principe de précaution, des traitements fongicides préventifs sont systématiquement appliqués lors de la période à risque au printemps pour protéger les variétés portant le gèneRvi6. De même, certains producteurs hésitent à planter des variétés portant la résistanceRvi6car ils n’ont pas d’information sur la présence de populations virulentes dans leur environnement.
Il existe donc un réel besoin de fournir une méthode de détection de souches deVenturia inaequalisvirulentes, de préférence rapide et simple de mise en œuvre.
Description détaillée
Les Inventeurs sont parvenus à identifier et séquencer le gène d’avirulenceAvrRvi6du champignonV. inaequalisqui interagit avec le gène de résistanceRvi6. Ce sont les modifications nucléotidiques à ce locus (des mutations telles que substitution(s), insertion(s) et/ou délétion(s)) qui sont responsables du gain de virulence des souches mutées. Les Inventeurs ont en effet mis en évidence un polymorphisme génétique au locusAvrRvi6, ainsi qu’au niveau de son promoteur, au sein de 120 souches deVenturia inaequalis. Sur la base de ce polymorphisme, les Inventeurs ont développé une méthode de détection de la présence de souches deVenturia inaequalisvirulentes qui repose sur la détection spécifique des allèles et/ou promoteur du gèneAvrRvi6conférant à une souche un caractère virulent.
La méthode de détection selon l’invention présente l’avantage d’être simple de mise en œuvre et rapide, avec un résultat pouvant être obtenu en quelques jours. La méthode de détection selon l’invention est en outre sensible et précise, en particulier grâce à l’utilisation de technologies telles que la PCR (P olymerase Chain Reaction) quantitative, en particulier la PCR quantitative isotherme, LAMP (L oop-Mediated Amplification)et/ou Qprobe combiné ou non à la technique LAMP.
La méthode de détection selon l’invention représente ainsi un outil d’aide à la décision essentiel pour déterminer si une virulence est présente à différentes échelles (par exemple, au sein d’un verger, d’une exploitation, d’un pépiniériste, d’un pays ou même d’un continent). La méthode selon l’invention permet également de contribuer grandement à la baisse d’utilisation des fongicides, (1) en permettant d’appliquer des traitements uniquement en présence de la population virulente, évitant ainsi un traitement préventif systématique et (2) en encourageant les producteurs à planter des variétés portant le gène de résistanceRvi6.
La méthode de détection selon l’invention peut également être utilisée pour vérifier la qualité de plants et permettre, par exemple, de garantir qu’un plant comprenant le gène de résistanceRvi6est vierge de toute contamination par une souche deVenturia inaequalisvirulente vis-à-vis du gèneRvi6.
Un premier objet de l’invention concerne une méthode de détection de la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente dans un échantillon, comprenant :
- fournir un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN deVenturia inaequalis,
- déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend au moins un polymorphisme de virulence,
- si au moins un polymorphisme de virulence est détecté à l’étape b), en déduire que l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche deVenturia inaequalisvirulente.
Le polymorphisme de virulence est de préférence un allèle comprenant ou consistant en une séquence sélectionnée dans le groupe consistant en la séquence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6 et/ou un promoteur comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.
L’étape a) du procédé tel défini ci-dessus comprend de préférence les étapes suivantes :
- fournir un échantillon susceptible de comprendre une souche deVenturia inaequalis,
- extraire l’ADN présent dans l’échantillon fourni à l’étape (i), pour obtenir un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN deVenturia inaequalis.
L’étape b) du procédé tel défini ci-dessus comprend de préférence de déterminer si l’ADN comprend au moins un marqueur de virulence sélectionné dans le groupe consistant en :
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant le nucléotide 62 de ladite séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant le nucléotide 160 de ladite séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant le nucléotide 192 de ladite séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant le nucléotide 201 de ladite séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence SEQ ID NO: 6,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotide 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, et
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8.
Un autre objet de l’invention concerne une méthode de traitement préventif et/ou curatif de pommiers comprenant le gène de résistanceRvi6permettant de réduire la fréquence et/ou la quantité de produit phytosanitaire appliqué contreVenturia inaequalis, comprenant:
- mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode de détection telle que définie ci-dessus,
- appliquer un traitement préventif et/ou curatif si l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche deVenturia inaequalisvirulente.
Un autre objet de l’invention concerne une méthode d’évaluation de la qualité d’un plant de pommier, comprenant les étapes suivantes :
- mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode de détection telle que définie ci-dessus, l’échantillon fourni à l’étape a) étant prélevé dans l’air autour dudit plant et/ou sur tout ou partie dudit plant,
- si aucun polymorphisme de virulence n’est détecté à l’étape b), en déduire que le plant n’est pas contaminé par une souche deVenturia inaequalisvirulente comprenant le polymorphisme de virulence recherché à l’étape b).
Un autre objet de l’invention concerne une méthode de cartographie de la virulence deVenturia inaequaliscomprenant les étapes suivantes :
- mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode de détection telle que définie ci-dessus, à partir d’au moins deux échantillons prélevés dans des zones géographiques différentes,
- en déduire que la zone géographique de laquelle provient un échantillon comprenant une souche deVenturia inaequalisvirulente est une zone de virulence et que la zone géographique de laquelle provient un échantillon ne comprenant pas de souche deVenturia inaequalisvirulente est une zone indemne de virulence.
Un autre objet de l’invention concerne un marqueur de virulence comprenant ou consistant en :
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant le nucléotide 62 de ladite séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant le nucléotide 160 de ladite séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant le nucléotide 192 de ladite séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant le nucléotide 201 de ladite séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence SEQ ID NO: 6,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotide 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, ou
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8,
ledit fragment comprenant au moins 15 nucléotides.
Un autre objet de l’invention concerne une combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence, lesdits marqueurs étant tels que définis ci-dessus.
Un autre objet de l’invention est un kit pour la détection de la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente dans un échantillon, ledit kit comprenant des moyens pour amplifier un marqueur tel que défini ci-dessus ou les marqueurs de la combinaison telle que définie ci-dessus.
Un autre objet de l’invention concerne l’utilisation d’un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus, d’une combinaison de marqueurs telle que définie ci-dessus ou d’un kit tel que défini ci-dessus, pour détecter la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente ou pour déterminer si une souche deVenturia inaequalisest virulente ou avirulente, en particulier pour déterminer des zones géographiques de virulence, pour évaluer si un traitement fongicide est nécessaire, pour évaluer la qualité d’un plant de pommier et/ou de fruits d’un pommier et/ou évaluer si la virulence est présente sur un territoire donné pour aider à la décision de planter ou non des variétés de pommier portant le gène de résistanceRvi6 .
Venturia inaequalis
Par « tavelure du pommier », on désigne ici une maladie cryptogamique causée par le champignonVenturia inaequalis.
La tavelure du pommier affecte les pommiers du genreMalus.
Toutefois, les pommiers du genreMaluscomprenant le gène de résistanceRvi6sont résistants aux souches deVenturia inaequalisdites avirulentesavrRvi6.
Le champignonVenturia inaequaliscomprend en effet un gène d’avirulenceAvrRvi6.
Dans une souche deVenturia inaequalisavirulente, la protéine codée par le gène d’avirulenceAvrRvi6est reconnue directement ou indirectement par la protéine codée par le gène de résistanceRvi6exprimée par le pommier, déclenchant ainsi une réaction rapide de défense du pommier qui empêche le développement ultérieur de cet agent pathogène. Le pommier est alors dit « résistant ».
Par « souche deVenturia inaequalis», on désigne ici un individu unique pouvant être distingué par son génotype.
La souche deV enturia inaequalispeut être sous la forme de spores ou de mycélium.
La souche deV enturia inaequalisest généralement présente sur plante infectée sous la forme de tâches résultantes de la présence de spores et de mycélium.
Par les termes « souche deVenturia inaequalisavirulente » ou « souche deVenturia inaequalisayant un caractère avirulent », on désigne ici une souche deVenturia inaequaliscomprenant un gène d’avirulenceAvrRvi6codant pour une protéine reconnue directement ou indirectement par la protéine codée par le gène de résistanceRvi6du pommier.
Par les termes « souche deVenturia inaequalisvirulente » ou « souche deVenturia inaequalisayant un caractère virulent », on désigne ici une souche deVenturia inaequalisqui n’est pas reconnue comme un agent pathogène par un pommier comprenant le gène de résistanceRvi6; une telle souche est donc responsable de maladie sur les variétés portant le gèneRvi6.
Une souche deVenturia inaequalisvirulente peut comprendre au moins une mutation dans le gène d’avirulenceAvrRvi6et/ou dans le promoteur du gène d’avirulenceAvrRvi6, résultant ainsi en l’absence d’expression de la protéine et/ou en une protéine qui n’est plus reconnue par la protéine codée par le gène de résistanceRvi6.
Par le terme « locus », on désigne une position fixe d'un gène ou d'un marqueur génétique sur un chromosome.
Par le terme « allèle », on désigne ici une variante d'un gène situé à un locus donné.
Par « polymorphisme conférant un caractère virulent (ou avirulent) » ou « polymorphisme de virulence (ou d’avirulence) », on désigne ici un allèle et/ou une séquence de promoteur conférant un caractère virulent (ou avirulent) à une souche deVenturia inaequalis.
Un allèle conférant un caractère virulent à une souche deVenturia inaequalisau niveau du locusAvrRvi6comprend ou consiste par exemple en une séquence sélectionnée dans le groupe consistant en la séquence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6.
La séquence SEQ ID NO: 1 comprend une substitution au nucléotide 139, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, et une délétion des nucléotides 155 à 309 par exemple par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15.
La séquence SEQ ID NO: 2 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 62, en particulier par la présence du nucléotide C au lieu du nucléotide G, d’une substitution au nucléotide 139, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, d’une substitution au nucléotide 237, en particulier par la présence du nucléotide C au lieu du nucléotide T et d’une substitution au nucléotide 279, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu de T.
La séquence SEQ ID NO: 3 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 139, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, d’une substitution au nucléotide 160, en particulier par la présence du nucléotide C au lieu du nucléotide T et par la présence d’une substitution au nucléotide 279, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide T.
La séquence SEQ ID NO: 4 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 139, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, d’une substitution au nucléotide 192, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu de C, d’une substitution au nucléotide 219, en particulier par la présence du nucléotide G au lieu du nucléotide A et d’une substitution au nucléotide 279, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide T.
La séquence SEQ ID NO: 5 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 139, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, d’une substitution au nucléotide 201, en particulier par la présence du nucléotide C au lieu du nucléotide T et d’une substitution au nucléotide 279, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide T.
La séquence SEQ ID NO: 6 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 304, en particulier par la présence du nucléotide G au lieu du nucléotide T.
Un exemple d’allèle conférant un caractère avirulent à une souche deVenturia inaequalisau niveau du locusAvrRvi6est un allèle comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 15.
Un promoteur conférant un caractère virulent à une souche deVenturia inaequalisau niveau du locusAvrRvi6comprend ou consiste par exemple en la séquence SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.
La séquence SEQ ID NO: 7 est caractérisée par la présence d’une substitution au nucléotide 189, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu du nucléotide G, par la présence de trois délétions des nucléotides 309 à 311, en particulier par la délétion des nucléotides A, T et A et par l’insertion de 5 nucléotides en position 484, en particulier les nucléotides G, A, A, T et A.
La séquence SEQ ID NO: 8 est caractérisée par la présence d’une insertion de 281 nucléotides au nucléotide 139, une délétion des nucléotides 552 à 555, d’une substitution au nucléotide 572, en particulier par la présence du nucléotide A au lieu de C et une substitution du nucléotide 706, en particulier par la présence du nucléotide G au lieu de A.
Un exemple de promoteur conférant un caractère avirulent à une souche deVenturia inaequalisau niveau du locusAvrRvi6est un allèle comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 14.
Marqueur de virulence, marqueur d
e la présence de
Venturia inaequalis
, combinaison de marqueurs
La présente invention a également pour objet un marqueur de virulence, un marqueur deVenturia inaequaliset/ou une combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement, d’au moins un marqueur de la présence deV. inaequalis.
Par « marqueur de virulence », on désigne ici un polynucléotide dont la séquence correspond à une région présente au locus d’avirulence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente, mais différente du locus d’avirulence des souches deVenturia inaequalisavirulentes. Un marqueur de virulence comprend par exemple au moins une mutation d’un nucléotide (substitution, addition et/ou délétion) par rapport à la séquence présente dans une souche deVenturia inaequalisavirulente.
Le Tableau 1 indique les polymorphismes d’un seul nucléotide (SNP ou «Single Nucleotide Polymorphism») et/ou délétion présents dans les allèles comprenant ou consistant en les séquences SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 6. La position du SNP ou de la délétion est indiquée par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15.
| Allèle (Séquence SEQ ID NO :) |
SNP 62 C |
SNP 139 A |
SNP 160 C |
SNP 192 A |
SNP 201 C |
SNP 219 G |
SNP 237 C |
SNP 279 A |
SNP 304 G |
Délétion 155-309 |
| 1 | x | x | ||||||||
| 2 | x | x | x | x | ||||||
| 3 | x | x | x | |||||||
| 4 | x | x | x | x | ||||||
| 5 | x | x | x | |||||||
| 6 | x |
La présente invention a ainsi pour objet un marqueur de virulence comprenant ou consistant en:
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1, de préférence comprenant les nucléotides 155 à 180 de ladite séquence SEQ ID NO: 1, ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 1,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant le nucléotide 62 de ladite séquence, ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant le nucléotide 160 de ladite séquence, ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant le nucléotide 192 de ladite séquence, ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant le nucléotide 201 de ladite séquence, ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence, ledit marqueur étant notamment spécifique de l’allèle de séquence SEQ ID NO: 6,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotides 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, ledit marqueur étant notamment spécifique de du promoteur de séquence SEQ ID NO: 7, ou
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, ledit marqueur étant notamment spécifique du promoteur de séquence SEQ ID NO: 8.
La présente invention a par exemple pour objet un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus comprenant ou consistant en :
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1, de préférence comprenant les nucléotides 155 à 180 de ladite séquence SEQ ID NO: 1,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant (i) le nucléotide 62 et (ii), optionnellement, le nucléotide 139, le nucléotide 237 et/ou le nucléotide 279 de ladite séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant (i) le nucléotide 160 et (ii), optionnellement, le nucléotide 139 et/ou le nucléotide 279 de ladite séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant (i) le nucléotide 192 et (ii), optionnellement, le nucléotide 139, le nucléotide 219 et/ou le nucléotide 279 de ladite séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant (i) le nucléotide 201 et (ii), optionnellement, le nucléotide 139 et/ou le nucléotide 279 de ladite séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence SEQ ID NO: 6,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotides 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, ou
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8.
Par « fragment », on désigne ici un polynucléotide d’une longueur d’au moins 5 nucléotides, de préférence au moins 8 nucléotides, plus préférentiellement au moins 10 nucléotides, par exemple au moins 15 ou au moins 20 nucléotides. Le fragment est de préférence un fragment de taille inférieure ou égale à 50 nucléotides, de préférence inférieure ou égale à 40 nucléotides, par exemple inférieure ou égale à 30 nucléotides.
Un fragment tel que défini ci-dessus comprend de préférence au moins 15 nucléotides.
Par « fragment de la séquence SEQ ID NO: X », on désigne un fragment consistant en des nucléotides consécutifs d’un polynucléotide de séquence SEQ ID NO: X.
La présente invention a ainsi par exemple pour objet un marqueur de virulence comprenant ou consistant en :
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 155 à 180 de la séquence SEQ ID NO: 1,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 52 à 72 de la séquence SEQ ID NO: 2,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 150 à 170 de la séquence de la séquence SEQ ID NO: 3,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 182 à 202 de la séquence SEQ ID NO: 4,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 191 à 211 de la séquence SEQ ID NO: 5,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 294 à 314 de la séquence SEQ ID NO: 6,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 180 à 200, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de la séquence SEQ ID NO: 7, ou
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 562 à 582, les nucléotides 696 à 716, les nucléotides 548 à 557 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de la séquence SEQ ID NO: 8.
Par « marqueur de la présence deV. inaequalis », on désigne ici un polynucléotide dont la séquence correspond à une région présente chez l’ensemble des souches deVenturia inaequalis.
Un marqueur de la présence deV. inaequalispouvant être utilisé est par exemple un polynucléotide comprenant tout ou une partie de la séquence codant pour l’actine deV. inaequalis, un polynucléotide comprenant tout ou une partie de la séquence codant pour un facteur d’élongation deV. inaequalisou un polynucléotide comprenant tout ou une partie du gène de ménage RPL4 deV. inaequalis.
Un marqueur de la présence deV. inaequalispréféré est un polynucléotide comprenant tout ou une partie du gène de ménage RPL4 deV. inaequali s.
La présente invention a ainsi pour objet un marqueur de la présence deVenturia inaequaliscomprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 9 ou en un fragment de la séquence SEQ ID NO: 9.
Un marqueur de la présence deVenturia inaequalisest par exemple le polynucléotide correspondant aux nucléotides 1243 à 1419 de la séquence SEQ ID NO: 9.
Un exemple de couple d’amorces permettant d’amplifier un marqueur de la présence deVenturia inaequalis, en particulier le gène de ménage RPL4, consiste en l’amorce sens de séquence SEQ ID NO: 10 (TTCAATCTGCTCTCCGAGGT) et l’amorce anti-sens de séquence SEQ ID NO: 11 (CTAATGCCTTTGGCTTCTCG).
La présente invention a également pour objet une combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement, d’au moins un marqueur de la présence deV. inaequalis.
Les marqueurs de virulence et/ou le marqueur de la présence deV. inaequalisde ladite combinaison sont notamment tels que définis ci-dessus.
La combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement, d’au moins un marqueur de la présence deV. inaequalispeut par exemple comprendre :
- au moins 2 marqueurs de virulence, de préférence au moins 4 marqueurs de virulence, de préférence au moins 6 marqueurs de virulence, par exemple 6, 7, 8 ou au moins 8 marqueurs de virulence et
- optionnellement, un ou au moins un marqueur de la présence deV. inaequalis.
Une combinaison préférée d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement d’au moins un marqueur de la présence deV. inaequalispeut comprendre :
- 8 marqueurs de virulence, par exemple :
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 155 à 180 de la séquence SEQ ID NO: 1,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 52 à 72 de la séquence SEQ ID NO: 2,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 150 à 170 de la séquence de la séquence SEQ ID NO: 3,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 182 à 202 de la séquence SEQ ID NO: 4,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 191 à 211 de la séquence SEQ ID NO: 5,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 294 à 314 de la séquence SEQ ID NO: 6,
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 180 à 200, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de la séquence SEQ ID NO: 7, et
- un polynucléotide comprenant ou consistant en les nucléotides 562 à 582, les nucléotides 696 à 716, les nucléotides 548 à 557 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de la séquence SEQ ID NO: 8, et
- optionnellement, un marqueur de la présence deV. inaequalis, par exemple un marqueur de la présence deVenturia inaequaliscomprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 9 ou en un fragment de la séquence SEQ ID NO: 9 telle que défini ci-dessus.
Méthode de détection
de la présence d’une souche de
Venturia
inaequalis
virulente
La présente invention a particulièrement pour objet une méthode de détection de la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente dans un échantillon, comprenant :
a) fournir un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN deVenturia inaequalis,
b) déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend au moins un polymorphisme de virulence et, optionnellement, au moins un marqueur de la présence deV. inaequalis,
c) si au moins un polymorphisme de virulence est détecté à l’étape b), en déduire que l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche deVenturia inaequalisvirulente.
Etape a)
L’étape a) comprend ou consiste en la fourniture d’un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN deVenturia inaequalis.
L’expression « susceptible de comprendre de l’ADN» signifie que l’échantillon de départ peut ne pas comprendre de souche deVenturia inaequalis, auquel cas aucun ADN deVenturia inaequalisne sera présent dans l’échantillon.
La présence deVenturia inaequalisdans l’échantillon peut être vérifiée à l’étape b) en déterminant la présence d’au moins un marqueur de la présence deV. i naequalis.
Dans un mode de réalisation préféré, l’étape a) de fourniture d’un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN deVenturia inaequaliscomprend les étapes suivantes :
(i) fournir un échantillon susceptible de comprendre au moins une souche deVenturia inaequalis,
(ii) extraire l’ADN présent dans l’échantillon fourni à l’étape (i), pour obtenir un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN deVenturia inaequalis.
L’échantillon susceptible de comprendre au moins une souche deVenturia inaequalispeut être prélevé par toute méthode bien connue de l’homme du métier.
L’échantillon susceptible de comprendre au moins une souche deVenturia inaequalispeut être prélevé dans l’air, par exemple en utilisant un ou plusieurs pièges à spores, en particulier placé(s) à côté d’un pommier, par exemple au centre d’un verger, d’une pépinière ou répartis sur la surface d’un verger ou au sol et/ou être prélevé à partir de feuilles et/ou fruits de pommiers. L’ADN peut par exemple être extrait à partir de tissus présentant des symptômes, tels que des tissus de fruits et/ou feuilles.
La ou les souches deVenturia inaequalissont de préférence présentes dans l’échantillon sous la forme de spores et/ou de mycélium, par exemple sur ou dans des tissus de la plante (feuilles et/ou fruits).
L’échantillon susceptible de comprendre au moins une souche deVenturia inaequaliscomprend donc de préférence des spores deVenturia inaequaliset/ou un ou des tissus de pommier.
L’extraction de l’ADN est effectuée par toute méthode appropriée bien connue de l’homme du métier, par exemple en utilisant un kit d’extraction d’ADN commercial ou une méthode d’extraction manuelle, telle que l’extraction d’ADN au CTAB (bromure d'hexadécyltriméthylammonium).
Etape b)
L’étape b) comprend ou consiste à déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend au moins un polymorphisme de virulence et, optionnellement, un marqueur de la présence deV. inaequalis.
Le polymorphisme de virulence est de préférence un allèle comprenant ou consistant en une séquence sélectionnée dans le groupe consistant en la séquence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6 ou un promoteur comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.
Dans un mode de réalisation préféré, l’étape b) comprend ainsi de déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend un allèle comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 1, un allèle comprenant ou consistant en SEQ ID NO: 2, un allèle comprenant ou consistant en SEQ ID NO: 3, un allèle comprenant ou consistant en SEQ ID NO: 4, un allèle comprenant ou consistant en SEQ ID NO: 5, un allèle comprenant ou consistant en SEQ ID NO: 6, un promoteur comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 7 et/ou un promoteur comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO: 8.
Dans un mode de réalisation préféré, la présence d’au moins un polymorphisme de virulence dans ledit ADN est déterminée par la présence d’au moins un marqueur de virulence, en particulier un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus ou une combinaison de marqueurs de virulence telle que définie ci-dessus.
De préférence, l’étape b) comprend ainsi de déterminer si ledit ADN comprend au moins un marqueur de virulence, en particulier un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus ou une combinaison de marqueurs de virulence telle que définie ci-dessus.
La méthode selon l’invention permet ainsi avantageusement de détecter spécifiquement un allèle ou un promoteur conférant un caractère virulent.
L’étape b) telle que définie ci-dessus comprend de préférence une étape de contrôle de la présence d’ADN d’une souche deVenturia inaequalis.
Cette étape de contrôle de la présence d’ADN d’une souche deVenturia inaequaliscomprend par exemple de déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon est de l’ADN deVenturia inaequalis.
Cette étape de contrôle de la présence d’ADN d’une souche deVenturia inaequaliscomprend par exemple de déterminer si une séquence commune aux souches virulentes et avirulentes est présente dans l’échantillon, par exemple la séquence d’un gène de ménage RPL4.
Le marqueur de la présence deV. inaequalisest donc utilisé comme marqueur de contrôle dans la méthode de détection définie ci-dessus.
Le marqueur de la présence deV. inaequalisest par exemple un polynucléotide comprenant tout ou partie de la séquence du gène RPL4 deV. inaequalis, par exemple comprenant tout ou une partie de la séquence SEQ ID NO: 9.
Afin de déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend au moins un polymorphisme de virulence, toute technique bien connue de l’homme du métier peut être utilisée, telle que le séquençage de tout ou partie de la séquence du promoteur du gène d’avirulenceAvrRvi6et/ou de la séquence de l’allèle présent au locusAvrRvi6et/ou une technique d’amplification de l’ADN, de préférence une amplification isotherme.
Des exemples non limitatifs d’amplification de l’ADN incluent la PCR, la PCR quantitative, la PCR quantitative isotherme, LAMP (L oop-Mediated Amplification)et/ou Qprobe combiné ou non à la technique LAMP, RPA (Recombinase Polymerase Amplification).
La méthode LAMP est une méthode d’amplification isotherme qui présente un très haut niveau de spécificité, lié à l’utilisation de 6 amorces et qui est généralement très rapide. La détection de l’amplification par la méthode LAMP peut être réalisée par électrophorèse, turbidimétrie, électrochimies ou colorimétrie.
La méthode RPA est une méthode d’amplification isotherme réalisée à basse température. La détection de l’amplification par la méthode RPA est souvent effectuée par fluorescence, en utilisant par exemples des sondes fluorescentes ou des agents intercalants.
Lorsqu’une technique d’amplification de l’ADN est utilisée, au moins un couple d’amorces capable d’amplifier un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus et, optionnellement, au moins un couple d’amorces capable d’amplifier un marqueur de la présence deV. inaequalistel que défini ci-dessus, est/sont utilisé(s).
Le couple d’amorces capable d’amplifier un marqueur de virulence permet par exemple d’obtenir :
- un fragment amplifié à partir de l’ADN d’une souche virulente, mais pas à partir de l’ADN d’une souche avirulente,
- un fragment amplifié à partir de l’ADN d’une souche avirulente, mais pas à partir de l’ADN d’une souche virulente, ou
- un fragment amplifié à partir de l’ADN d’une souche virulente d’une taille différente de celui amplifié à partir de l’ADN d’une souche avirulente.
L’amorce sens et/ou l’amorce anti-sens peuvent par exemple s’hybrider au niveau d’un marqueur de virulence, en particulier lorsque le polymorphisme au niveau dudit marqueur résulte d’une ou plusieurs substitutions et/ou délétions et/ou insertions de nucléotide.
Alternativement, l’amorce sens et/ou l’amorce anti-sens peuvent s’hybrider autour d’un marqueur de virulence, en particulier lorsque le polymorphisme au niveau dudit marqueur résulte au moins d’une délétion et/ou addition de nucléotide(s).
Il est possible d’utiliser un couple d’amorces pour déterminer la présence d’un marqueur de virulence donné.
Dans un mode de réalisation avantageux, un même couple d’amorces peut permettre de déterminer la présence de plusieurs marqueurs de virulence donnés, par exemple en amplifiant des fragments de taille différente.
Les marqueurs de virulence et de la présence deV. inaequalissont notamment tels que définis ci-dessus.
Etape c)
Dans l’étape c), si au moins un polymorphisme de virulence est détecté à l’étape b), il en est déduit que l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche deVenturia inaequalisvirulente.
Dans l’étape c), si un marqueur de présence deV. inaequalisest détecté mais qu’aucun des polymorphismes de virulence n’est détecté à l’étape b), il en est déduit que l’échantillon fourni à l’étape a) ne comprend pas de souche deVenturia inaequalisvirulente correspondant aux polymorphismes de virulence testés.
Si aucun ADN d’une souche deVenturia inaequalisn’est détecté dans l’échantillon, alors l’échantillon de comprend pas de souche deVenturia inaequalis.
Méthode de traitement préventif et/ou curatif de pommiers
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement préventif et/ou curatif de pommiers comprenant le gène de résistanceRvi6, permettant notamment de réduire la fréquence et/ou la quantité de produit phytosanitaire appliquée contreVenturia inaequalis, comprenant :
- la mise en œuvre des étapes a) à c) de la méthode telle que définie ci-dessus de détection de la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente dans un échantillon, et
- l’application d’un traitement préventif et/ou curatif si l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche deVenturia inaequalisvirulente.
La méthode de détection de la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente selon l’invention peut ainsi servir d’outil d’aide à la décision pour savoir si l’application d’un traitement préventif et/ou curatif est nécessaire.
Le traitement préventif et/ou curatif est de préférence effectué autour de la zone de prélèvement de l’échantillon, par exemple dans une pépinière, dans le verger ou dans l’exploitation autour de la zone de prélèvement de l’échantillon où d’autres arbres portant le gène de résistance Rvi6 sont plantés.
Le traitement préventif et/ou curatif comprend par exemple l’application d’un produit phytosanitaire approprié contreVenturia inaequalis, tel que par exemple un fongicide.
Le fongicide est par exemple choisi parmi un fongicide à base du cuivre ou un fongicide appartenant à la famille des strobilurines ou des Anilinopyrimidines.
Méthode d’évaluation de la qualité d’un plant de pommier
La présente invention a également pour objet une méthode d’évaluation de la qualité d’un plant de pommier, en particulier avant sa commercialisation, comprenant les étapes suivantes :
- la mise en œuvre des étapes a) à c) de la méthode telle que définie ci-dessus de détection de la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente dans un échantillon, l’échantillon fourni à l’étape a) étant prélevé dans l’air autour dudit plant et/ou sur tout ou partie dudit plant, et
- si aucun polymorphisme de virulence n’est détecté à l’étape b), en déduire que le plant n’est pas contaminé par une souche deVenturia inaequalisvirulente comprenant le polymorphisme de virulence recherché à l’étape b).
Dans la méthode ci-dessus, si (i) aucun allèle comprenant ou consistant en les séquences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6, et aucun promoteur comprenant ou consistant en les séquences SEQ ID NO: 7et SEQ ID NO: 8 n’est détecté à l’étape a) et (ii) si de l’ADN d’une souche deVenturia inaequalisest détecté dans l’échantillon, il en est déduit que le plant n’est pas contaminé par une souche deVenturia inaequalisvirulente comprenant le polymorphisme de virulence.
Méthode cartographie
géographique
de la virulence de
Venturia
inaequalis
La présente invention a également pour objet une méthode de cartographie de la virulence deVenturia inaequaliscomprenant les étapes suivantes :
- mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode telle que définie ci-dessus de détection de la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente dans un échantillon, à partir d’au moins deux échantillons prélevés dans des zones géographiques différentes,
- en déduire que la zone géographique de laquelle provient un échantillon comprenant une souche deVenturia inaequalisvirulente est une zone de virulence et que la zone géographique de laquelle provient un échantillon ne comprenant pas de souche deVenturia inaequalisvirulente est une zone indemne de virulence.
La zone géographique peut par exemple être un verger, une exploitation, un bassin de production, une région, un pays, un continent et/ou une île.
Kit pour la détection de la présence d’une souche de
Venturia
inaequalis
virulente
La présente invention a également pour objet un kit pour la détection de la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente dans un échantillon, ledit kit comprenant des moyens permettant d’amplifier au moins un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus et, optionnellement, au moins un marqueur de la présence deVenturia inaequalistel que défini ci-dessus.
Le kit peut par exemple comprendre des moyens permettant d’amplifier les marqueurs de la combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement, d’au moins un marqueur de la présence deV. inaequalistelle que définie ci-dessus.
Les moyens permettant d’amplifier un marqueur comprennent par exemple au moins un couple d’amorces spécifiques dudit ou desdits marqueur(s) et sont par exemple tels que définis ci-dessus
Utilisation d’un marqueur de virulence
,
d’une combinaison de marqueurs de virulence
ou du kit
pour la détection de la présence d’une souche de
Venturia
inaequalis
virulente
La présente invention a également pour objet l’utilisation d’un marqueur de virulence tel que défini ci-dessus, d’une combinaison d’au moins deux marqueurs de virulence et, optionnellement, d’au moins un marqueur de la présence deV. inaequalistelle que définie ci-dessus, et/ou d’un kit telle que défini ci-dessus pour détecter la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente ou pour déterminer si une souche deVenturia inaequalisest virulente ou avirulente.
L’utilisation telle que définie ci-dessus permet par exemple de déterminer des zones géographiques de virulence ou d’avirulence, évaluer si un traitement fongicide est nécessaire, évaluer la qualité d’un plant de pommier et/ou de fruits d’un pommier, par exemple avant commercialisation en France ou à l’export, et/ou évaluer si la virulence est présente sur un territoire donné pour aider à la décision de planter ou non des variétés de pommier portant le gène de résistanceRvi6.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatif.
Listage de séquences
La séquence SEQ ID NO: 1 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 2199.
La séquence SEQ ID NO: 2 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche NL24.
La séquence SEQ ID NO: 3 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 1180.
La séquence SEQ ID NO: 4 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 2476.
La séquence SEQ ID NO: 5 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 1153.
La séquence SEQ ID NO: 6 est la séquence d’un allèle conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 08M205.
La séquence SEQ ID NO: 7 est un exemple de séquence du promoteur du gène AvrRvi6 conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 1286.
La séquence SEQ ID NO: 8 est un exemple de séquence du promoteur du gène AvrRvi6 conférant un caractère virulent, tel que présent dans la souche 2207.
La séquence SEQ ID NO: 9 est la séquence du gène de ménage RPL4 deVenturia inaequalis.
Les séquences SEQ ID NO: 10 et 11 correspondent respectivement aux séquences des amorces sens et anti-sens d’un couple d’amorces utilisé pour la détection du gène de ménage RPL4 deVenturia inaequalis.
Les séquences SEQ ID NO: 12 et 13 correspondent respectivement aux séquences des amorces sens et anti-sens d’un couple d’amorces utilisé pour la détection d’une souchede Venturia inaequalisvirulente.
La séquence SEQ ID NO: 14 est un exemple de séquence du promoteur du gène AvrRvi6 conférant un caractère avirulent, tel que présent dans la souche EUB04.
La séquence SEQ ID NO: 15 est la séquence d’un allèle conférant un caractère avirulent, tel que présent dans la souche EUB04.
Figures
EXEMPLES
Exemple 1
: Analyse du polymorphisme au locus d’avirulence
AvrRvi6
Matériel et Méthodes
Le gène d’avirulenceAvrRvi6qui interagit avec le gène de résistance Rvi6 a été cloné, puis le polymorphisme allélique au locusAvrRvi6et au niveau de son promoteur a été analysée sur 150 souches deV. inaequalisprovenant de vergers et de pommiers sauvages.
Résultats
Cette analyse a permis de mettre en évidence différents polymorphismes associés au caractère virulent et différents polymorphismes associés au caractère avirulent deVenturia inaequalis.
Les séquences SEQ ID NO: 1 à 6 sont des exemples d’allèles conférant un caractère virulent. Les séquences SEQ ID NO: 7 et 8 sont des exemples de séquence du promoteur deAvrRvi6associé à un caractère virulent.
Cette analyse du polymorphisme a montré que les souches virulentes détectées dans les vergers européens présentent des allèles au locus AvrRvi6 partagés par lesMalusprésents dans les espaces non cultivés, confirmant ainsi que les pommiers sauvages sont les réservoirs de virulence responsable de ce contournement de la résistance.
Par ailleurs, l’absence d’observation de nouveaux cas de contournement dans les vergers signifie qu’il est possible de mettre au point un outil permettant de détecter spécifiquement et de manière exhaustive la virulence vis-à-vis du gène de résistance Rvi6 en vergers de pommiers à partir des allèles identifiés au sein de la population virulente présente dans le compartiment non cultivé.
Exemple
2
:
Méthode de détection
de la présence
d’une souche
de
Vent
uri
a inaequalis
virulente
Matériel et méthodes
L’ADN génomique de la souche à tester est extrait à partir de spores. L’extraction est réalisée selon le protocole du kit Nucleospin Food (Macherey Nagel).
Le locusA vrRvi6est détecté par PCR quantitative en utilisant le mélange réactionnel suivant pour une réaction :
3.75 µl MesaBlue 2X (Eurogentec)
0.3 µl d’amorce sens à 10µM (soit concentration finale = 200 nM) de séquence SEQ ID NO: 12 : CGATCCTTTTCGCACAGTCT (Eurofins)
0.3 µl d’amorce anti-sens à 10µM de séquence SEQ ID NO: 13 : CTCAGTTGCATTGGCTTCGT (Eurofins)
3 µl ADN génomique dilué deVenturia inaequalis
Qsp 15µl H2O
Le programme de PCR quantitative utilisé est le suivant (en utilisant un appareil Biorad CFX connect) :
1. 95°C 5 minutes
2. 95°C 3 secondes
3. 60°C 1 minute
+ lecture de la plaque
4. Répétition des étapes 2 à 3, 39 fois
5. Courbe de fusion de 55°C à 90°C par palier de 0,5°C/5s
+ lecture de la plaque
Résultats
Les résultats obtenus sont présentés aux figures 1 à 3.
Les figures 1 et 2 montrent que la méthode utilisée permet d’amplifier les allèles respectivement de la souche avirulente B04 et de la souche virulente 2199 au locus AvrRvi6.
La montre que les courbes de fusion des deux allèles sont différentes traduisant une délétion de nucléotides chez la souche virulente comparée à la souche avirulente. L’allèle de virulence porté par la souche 2199 se distingue en effet de l’allèle d’avirulence porté par la souche B04 par une délétion de 155 paires de bases.
La méthode de détection selon l’invention permet donc de détecter la présence d’une souche virulente deVenturia inaequalis.
Claims (7)
- Méthode de détection de la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente dans un échantillon, comprenant :
- fournir un échantillon susceptible de comprendre de l’ADN deVenturia inaequalis,
- déterminer si l’ADN présent dans l’échantillon comprend au moins un polymorphisme de virulence,
- si au moins un polymorphisme de virulence est détecté à l’étape b), en déduire que l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche deVenturia inaequalisvirulente,
- Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l’étape b) comprend de déterminer si l’ADN comprend au moins un marqueur de virulence sélectionné dans le groupe consistant en :
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant le nucléotide 62 de ladite séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant le nucléotide 160 de ladite séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant le nucléotide 192 de ladite séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant le nucléotide 201 de ladite séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence SEQ ID NO: 6,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotide 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, et
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8.
- Méthode de traitement préventif et/ou curatif de pommiers comprenant le gène de résistanceRvi6permettant de réduire la fréquence et/ou la quantité de produit phytosanitaire appliqué contreVenturia inaequalis, comprenant:
- mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode selon la revendication 1 ou 2,
- appliquer un produit phytosanitaire approprié contreVenturia inaequalissi l’échantillon fourni à l’étape a) comprend une souche deVenturia inaequalisvirulente.
- Méthode d’évaluation de la qualité d’un plant de pommier, comprenant les étapes suivantes :
- mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode selon la revendication 1 ou 2, l’échantillon fourni à l’étape a) étant prélevé dans l’air autour dudit plant et/ou sur tout ou partie dudit plant,
- si aucun polymorphisme de virulence n’est détecté à l’étape b), en déduire que le plant n’est pas contaminé par une souche deVenturia inaequalisvirulente comprenant le polymorphisme de virulence recherché à l’étape b).
- Méthode de cartographie de la virulence deVenturia inaequaliscomprenant les étapes suivantes :
- mettre en œuvre les étapes a) à c) de la méthode selon la revendication 1 ou 2, à partir d’au moins deux échantillons prélevés dans des zones géographiques différentes,
- en déduire que la zone géographique de laquelle provient un échantillon comprenant une souche deVenturia inaequalisvirulente est une zone de virulence et que la zone géographique de laquelle provient un échantillon ne comprenant pas de souche deVenturia inaequalisvirulente est une zone indemne de virulence.
- Kit pour la détection de la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente dans un échantillon, ledit kit comprenant des moyens pour amplifier au moins un marqueur de virulence,
ledit marqueur de virulence comprenant ou consistant en :- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 1 comprenant les nucléotides 155 à 165 de ladite séquence SEQ ID NO: 1,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant le nucléotide 62 de ladite séquence SEQ ID NO: 2,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 3 comprenant le nucléotide 160 de ladite séquence SEQ ID NO: 3,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 4 comprenant le nucléotide 192 de ladite séquence SEQ ID NO: 4,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 5 comprenant le nucléotide 201 de ladite séquence SEQ ID NO: 5,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 comprenant le nucléotide 304 de ladite séquence SEQ ID NO: 6,
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 7 comprenant le nucléotide 189, les nucléotides 304 à 316 et/ou les nucléotides 480 à 490 de ladite séquence SEQ ID NO: 7, ou
- un fragment de la séquence SEQ ID NO: 8 comprenant le nucléotide 572 de ladite séquence SEQ ID NO: 8, le nucléotide 706, les nucléotides 548 à 557 de ladite séquence SEQ ID NO: 8 et/ou 15 nucléotides consécutifs compris entre les nucléotides 139 à 420 de ladite séquence SEQ ID NO: 8,
lesdits moyens pour amplifier un marqueur de virulence comprenant au moins un couple d’amorces spécifiques dudit marqueur.
. - Utilisation d’un kit selon la revendication 6, pour détecter la présence d’une souche deVenturia inaequalisvirulente ou pour déterminer si une souche deVenturia inaequalisest virulente ou avirulente, de préférence pour déterminer des zones géographiques de virulence, pour évaluer si un traitement fongicide est nécessaire, pour évaluer la qualité d’un plant de pommier et/ou de fruits d’un pommier et/ou évaluer si la virulence est présente sur un territoire donné pour aider à la décision de planter ou non des variétés de pommier portant le gène de résistanceRvi6 .
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