WO2022045751A1 - 자극 반응성 및 표면 부착성을 가진 점착성 엘라스틴 및 서커린 기반 다중 블록 코폴리펩타이드, 그의 자가조립 구조체 및 주사형 하이드로겔의 생접착제 응용 - Google Patents

자극 반응성 및 표면 부착성을 가진 점착성 엘라스틴 및 서커린 기반 다중 블록 코폴리펩타이드, 그의 자가조립 구조체 및 주사형 하이드로겔의 생접착제 응용 Download PDF

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임동우
이재희
바쉬르암나
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
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    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)

Definitions

  • the present invention relates to adhesive elastin- and circaline-based multi-block copolypeptides having stimulatory responsiveness and surface adhesion, self-assembled structures thereof, and bioadhesive applications of injectable hydrogels, and the like.
  • Protein-based biomaterials containing natural and synthetic amino acids are of great interest because their amino acid sequence and molecular weight are precisely controlled at the molecular level, and have unique physicochemical properties according to various covalent and non-covalent bonds.
  • stimuli responsiveness and its sophisticated regulation are among the unique properties of protein-based biomaterials.
  • Stimuli-responsive proteins undergo significant morphological changes by stimulants such as pH, temperature, ions, and ligands, and are used as building blocks of self-assembled structures such as micelles, vesicles, and hydrogels formed by these changes. . Therefore, stimuli-responsive biomaterials can be used in various ways in the biomedical field.
  • Elastin-based polypeptides derived from mammalian elastin are stimuli-responsive biomaterials, and their physicochemical properties change with temperature.
  • LCST critical solution temperature
  • Tt transition temperature
  • the Xaa may be any amino acid except for proline (P). Since the EBP is hydrophilic, it is soluble at a temperature lower than LCST, and when the temperature rises above LCST, the EBP aggregates and changes to insoluble.
  • the physicochemical properties of EBP are precisely controlled according to the ratio and composition of amino acids and the number of repetitions of the pentapeptide as a guest residue located at the 4th position of the pentapeptide repeat unit. More specifically, the guest residue and the repeat unit of the pentapeptide affect Tt, and the third amino acid of the pentapeptide unit determines the flexibility of the EBP. For example, when the third amino acid of the pentapeptide unit is glycine (G), EBP exhibits flexibility, but in the case of alanine (A) at the same position, EBP has more rigid properties.
  • G glycine
  • A alanine
  • EBPs with intrinsic physicochemical properties and Tt can form self-assembled structures such as micelles and hydrogels upon temperature trigger, or adhere to guest residues such as adhesion or coordination with metal ions. It exhibits a new function by introducing a functional amino acid.
  • bioadhesive proteins such as mussel foot protein and squid sucker constituent protein have attracted attention as biomaterials, particularly in tissue engineering and regenerative medicine.
  • these adhesion proteins all contain 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) as the hydroxylated form of tyrosine (Y), allowing the DOPA molecule and Adhesive surface It attaches to the surface through various interactions between molecules, and increases adhesion through lysine (K) and ⁇ -cation interactions.
  • DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine
  • Y hydroxylated form of tyrosine
  • K lysine
  • suckerin a new class of protein, suckerin, has been reported in the sucker ring teeth (SRT) of squid, a module rich in glycine (Gly) and tyrosine (Tyr) (M2) and alanine (Ala) and histidine (His) rich in modules.
  • SRT sucker ring teeth
  • M1 a module rich in glycine
  • Tyr tyrosine
  • Al alanine
  • His histidine
  • a block copolymer composed of a module (M1) forms a region of a ⁇ -sheet structure in an amorphous matrix.
  • the A1H1 sequence (peptide sequence AATAVSHTTHHA of the M1 module), which is mainly found in the circaline protein family, self-assembles in an aqueous solution similar to a crystal structure, and the ⁇ -sheet distance is 4.4 and 5.4 ⁇ , forming very dense self-assembled nanocrystals. These ⁇ -sheet nanocrystals perform a physical and reversible crosslinking role through hydrogen bonding and impart dynamic mechanical properties of the material.
  • the present inventors have intensively studied to develop a biocompatible material with stimuli reactivity and adhesion to various surfaces that can be used as a bioadhesive, and as a result, self-assembly ability with adhesive elastin-based polypeptide (EBP) and ⁇ -sheet structure Design and manufacture a multi-block copolypeptide with high adhesion by self-assembly through fusion of a circaline-based polypeptide (SBP) with It was confirmed that the block copolypeptide exhibits stronger adhesion and completed the present invention.
  • EBP adhesive elastin-based polypeptide
  • SBP circaline-based polypeptide
  • the technical problem to be achieved by the present invention is to provide a multiblock copolypeptide comprising a sticky elastin-based polypeptide (EBP) and a suckerin-based polypeptide (SBP) will do
  • Another object of the present invention is to provide a gene for expression of the multi-block copolypeptide, a recombinant vector containing the gene, and a recombinant microorganism containing the vector.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the multi-block copolypeptide, in particular, to provide a method for preparing a multi-block copolypeptide in which a tyrosine residue is modified with DOPA.
  • Another object of the present invention is to provide a self-assembled nanostructure and hydrogel formed of the multi-block copolypeptide, and a method for preparing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a self-assembled nanostructure formed of the multi-block copolypeptide as a drug carrier, and to provide an adhesive composition and a biobond comprising a hydrogel formed of the multi-block copolypeptide.
  • the present invention provides a multiblock copolypeptide comprising or consisting of a suckerin-based polypeptide (SBP) and a sticky elastin-based polypeptide (EBP). copolypeptide).
  • SBP suckerin-based polypeptide
  • EBP sticky elastin-based polypeptide
  • the SBP may include tyrosine (Y), and the EBP may include tyrosine (Y) and/or lysine (K).
  • the tyrosine residue can be hydroxylated to be modified with 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA), and the multi-block copolypeptide is modified with DOPA by hydroxylating the tyrosine residue.
  • DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine
  • the multi-block copolypeptide comprises (SBP) n (EBP) m ; (EBP) m (SBP) n ; (SBP) n (EBP) m (SBP) n ; and (EBP) m (SBP) n (EBP) m , wherein n and m are integers of 1 or more, n is the number of repetitions of SBP, and m is EBP is the number of repetitions of
  • the EBP may be composed of an amino acid sequence represented by the following formula 1:
  • Equation 1 m is an integer greater than or equal to 1, and is the number of repetitions of Equation 1;
  • X is any one or more selected from the group consisting of tyrosine (Y), lysine (K), and isoleucine (I).
  • m is 6, and X of each of the repeating pentapeptides is tyrosine (Y), lysine (K) in a ratio of 2:4, or tyrosine (Y) , lysine (K) consists of a ratio of 3:3, or tyrosine (Y), lysine (K), or isoleucine (I) consists of a ratio of 2:2:2, or tyrosine (Y), lysine (K) ) may be composed of a ratio of 4:2.
  • the SBP may be a block consisting of or repeatedly including Pro-M1-Pro-M2, wherein M1 is a domain comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the M2 is a domain comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the present invention provides a gene encoding the multi-block copolypeptide, a recombinant vector comprising the gene, and a recombinant microorganism into which the gene or recombinant vector is introduced.
  • a tyrosinase gene or a recombinant vector for gene expression is additionally introduced in addition to the multi-block copolypeptide gene or a recombinant vector for expression thereof, so that the multi-block copolypeptide and the tyrosine It may be to co-express the kinase.
  • the present invention also provides a method for preparing a multi-block copolypeptide comprising the steps of:
  • the expression of the multi-block copolypeptide in step (1) can be induced by adding IPTG to the recombinant microorganism culture medium.
  • the preparation method further comprises the step of (3) contacting the purified multi-block copolypeptide with mushroom-derived tyrosinase to transform the tyrosine residue into DOPA after step (2).
  • the present invention provides a nanostructure in which the multi-block copolypeptide is self-assembled based on the ⁇ -sheet structure of SBP, and the nanostructure may have a vesicle or micelle structure.
  • the multi-block copolypeptide of the nanostructure may be modified with DOPA, and the DOPA may be oxidized.
  • the oxidation of DOPA may be a naturally occurring oxidation or induced by treatment with a chemical oxidizing agent, for example, NaIO 4 .
  • the present invention provides a drug delivery system and an adhesive composition comprising the nanostructure.
  • the present invention provides a hydrogel in which the multi-block copolypeptide is self-assembled based on the ⁇ -sheet structure of SBP, and the multi-block co-polypeptide of the hydrogel may be modified with DOPA,
  • DOPA may be oxidized DOPA.
  • the oxidized DOPA may be induced by natural oxidation or by treatment with a chemical oxidizing agent.
  • the present invention provides an adhesive composition and a bioadhesive composition comprising the hydrogel.
  • the present invention relates to a multi-block copolypeptide in which a suckerin-based polypeptide (SBP) and a sticky elastin-based polypeptide (EBP) are fused, wherein the multi-block copolypeptide comprises: It can be self-assembled based on the ⁇ -sheet structure of SBP to form nanostructures and hydrogels, and the tyrosine residue of the multi-block copolypeptide is modified with DOPA to enhance the surface adhesion of the nanostructures and hydrogel, or A method for inducing oxidation of modified DOPA is proposed.
  • SBP suckerin-based polypeptide
  • EBP sticky elastin-based polypeptide
  • the multi-block copolypeptide of the present invention can form self-assembled nanostructures and hydrogels capable of reversibly changing according to temperature and/or pH stimuli, and with strong surface adhesion even under wet conditions, drug delivery systems, bio-coating agents, bioconjugates It is expected to be usefully used in the biomedical field.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a nanostructure formation process by self-assembly of EBP and SBP single blocks with amino acid sequences (A) and hydroxylated EBP-SBP diblocks (B). Tyrosine residues to be hydroxylated in the EBP and SBP single blocks are highlighted (A). With mushroom tyrosinase or bacterial co-expression system, tyrosine residues of EBP and SBP blocks are modified with DOPA, and EBP-SBP self-assembled nanostructures into ⁇ -sheet structures of SBP blocks are chemically crosslinked by NaIO4 oxidation of DOPA residues. do.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the EBP-SBP double block copolypeptide synthesis (a), a DNA agarose gel electrophoresis image of the EnSn gene digested with XbaI and BamHI (b), and copper staining SDS of the purified EnSn double block copolypeptide -PAGE image (c).
  • (i) of Figure 2a is a schematic diagram of the process of constructing an S1 plasmid by inserting the M1 gene into the M2 plasmid, and (ii) inserting the En gene into the Sn plasmid to prepare the SBP block and EBP-SBP double block copolypeptide
  • the manufacturing process is a schematic diagram. 2b and 2c, the size of the standard marker is shown on the left and the expected size is shown on the right.
  • Figure 4 is the turbidity profile of the EBP-SBP diblock in phosphate buffer (10 mM, 5.0 pH) containing 0.5 M NaCl as a function of temperature, (B) and (C) are phosphate buffer at room temperature. Hydrodynamic radii (R h ) of EBP-SBP (B) and hydroxylated mEBP-SBP (C) measured via DLS at (10 mM, 5.0 pH).
  • Figure 5 is a TEM image to confirm the self-assembly of E6S3 (A), E6S6 (C), E6S12 (E) and hydroxylated mE6S3 (B), mE6S6 (D), and mE6S12 (E). All samples were negatively stained with PTA, dried at room temperature, and scale bars are 200 nm (A-E) and 50 nm (F).
  • E6S3 is an SEM image to confirm the self-assembly of E6S3 (A), E6S6 (C), E6S12 (E) and hydroxylated mE6S3 (B), mE6S6 (D), and mE6S12 (E). All samples were dried at room temperature, and the scale bar in each image is 5 ⁇ m.
  • FIG. 7 is a bright field image of a self-assembled nanostructure of hydroxylated mE6S3 in room temperature phosphate buffer (10 mM, pH 5.0). Surface adhesion can be confirmed in the images before (A1, A2) and after washing (B1, B2), 1 and 2 were imaged at different magnifications, and the scale bar is 20 ⁇ m in (A1) and (B1), (A2) ) and 8 ⁇ m in (B2).
  • FIG. 9 is a schematic diagram of the EBP-SBP triple block copolypeptide design, the preparation of its self-assembled construct and hydrogel and the structure thereof
  • FIG. 9 a is the amino acid sequence of the EBP and SBP single block
  • FIG. 9 c is the structure of the triple block copolypeptide of BAB type and modified with DOPA
  • Figure 9c is the structure of the triple block copolypeptide of BAB type and modified with DOPA
  • It is a schematic diagram of the preparation and structure of the self-assembled nanostructure and hydrogel of the triple block copolypeptide.
  • B block means a hydrophilic EBP block and A block means an amphiphilic SBP block.
  • the tyrosine residue of the EBP-SBP triple block copolypeptide is hydroxylated using mushroom tyrosinase or a bacterial co-expression system to form a DOPA moiety with adhesion properties.
  • the modified EBP-SBP triple block copolypeptide (mEBP-SBP triple block) is self-assembled into nanostructures under dilute conditions or chemical cross-linking of the EBP block by DOPA oxidized by NaIO 4 treatment and the ⁇ -sheet of the SBP block Formation self-assembles into hydrogels. Furthermore, oxidation of DOPA under concentrated conditions improves the mechanical properties of self-assembled hydrogels by chemical crosslinking.
  • 10a is a schematic diagram of a synthesis method of an ABA type triple block, SnEmSn, and FIG. 10b is a schematic diagram of a synthesis method of a BAB type triple block, EmSnEm.
  • 10c is an agarose gel image obtained by electrophoresis after cutting S3E6S3 and E6S3E6 genes with XbaI and BamHI
  • FIG. 10d is a copper staining SDS-PAGE image of purified S3E6S3 and E6S3E6.
  • 10e is an agarose gel image obtained by electrophoresis after cutting S6E6S6 and E6S12E6 genes with XbaI and BamHI
  • 10f is a copper staining SDS-PAGE image of purified S6E6S6 and E6S12E6.
  • the size of the standard marker is indicated on the left side of FIGS. 10c to 10f , and the expected size is indicated on the right side.
  • FIG. 11 (A) is a copper-stained SDS-PAGE image of S3E6S3 and E6S3E6 and mS3E6S3 and mE6S3E6 in which tyrosine residues of the triblock copolypeptide were hydroxylated by mushroom tyrosinase, (B) is NBT/glycinate This is the result of confirming that the tyrosine residue of the triple block was modified with DOPA through staining.
  • EBP-SBP triblock copolypeptide in (A) 10 mM PBS or (B) 10 mM PBS with 0.1M sodium chloride as a function of temperature.
  • the size distribution analysis results of (C) E6S3E6 and (D) E6S12E6 were (1) 5% acetic acid and 8 M urea for forming soluble monomers or (2) 10 mM PBS for forming self-assembled nanostructures in dialysis at room temperature. secured.
  • FIG. 13 (A) and (B) are TEM images of E6S3E6 dried at room temperature after staining with 2% PTA, (C) and (D) are TEM images of E6S12E6. Scale bars are 1 ⁇ m (A), 200 nm (B, C), and 100 nm (D), respectively.
  • FIG. 15 (A) is a time sweep test analysis result of hydroxylated mS3E6S3 and mE6S3E6 in the presence of 5 mM NaIO 4 at 4° C. (frequency 1 rad/sec, strain 0.2%).
  • FIG. 16A is a photograph of a hydroxylated mE6S3E6 hydrogel and the adhesive surface after adhesion failure of the gel.
  • Figure 16b is the bulk adhesion strength test result of the hydrogel formed as a function of mE6S3E6 concentration and NaIO 4 concentration
  • Figure 16c is the bulk adhesion strength test result of the mEBP-SBP-EBP triblock hydrogel according to the NaIO 4 concentration under wet conditions.
  • Figure 16d confirms the strong adhesion properties of the mE6S12E6 hydrogel treated with 5 mM NaIO 4 to the glass, it can support up to a load of 0.5-4 kg. All samples were dissolved in PBS (10 mM, pH 7.4).
  • amino acid refers to a natural amino acid or an artificial amino acid, and preferably refers to a natural amino acid.
  • the amino acid means glycine, alanine, serine, valine, leucine, isoleucine, methionine, glutamine, asparagine, cysteine, histidine, phenylalanine, arginine, tyrosine or tryptophan.
  • the properties of these amino acids are well known in the art. Specifically, it exhibits hydrophilicity (negative or positive charge) or hydrophobicity, and also exhibits aliphatic or aromatic properties.
  • amino acid sequence is abbreviated as follows according to the IUPAC-IUB nomenclature.
  • Arginine (Arg, R), Lysine (Lys, K), Histidine (His, H), Serine (Ser, S), Threonine (Thr, T), Glutamine (Gln, Q), Asparagine (Asp, N), Methionine (Met, M), leucine (Leu, L), isoleucine (Ile, I), valine (Val, V), phenylalanine (Phe, F), tryptophan (Trp, W), tyrosine (Tyr, Y), Alanine (Ala, A), Glycine (Gly, G), Proline (Pro, P), Cysteine (Cys, C), Aspartic Acid (Asp, D) Glutamic Acid (Glu, E), Norleucine (Nle)
  • polypeptide refers to any polymer chain of amino acids.
  • peptide and protein are used interchangeably with the term polypeptide, which also refers to a polymer chain of amino acids.
  • polypeptide includes natural or synthetic proteins, protein fragments, and polypeptide analogs of protein sequences. Polypeptides may be monomers or polymers.
  • copolypeptide refers to a polypeptide that is a copolymer.
  • phase transition refers to a change in the state of a substance, such as water changing into water vapor or ice changing into water.
  • the fusion polypeptide of the present invention basically includes elastin-based polypeptides (EBPs) and suckerin-based polypeptides (SBPs) having stimulation responsiveness, and the "elastin-based polypeptides” " is also called “ealstin-like polypeptides (ELP)". It is a term widely used in the technical field of the present invention. A detailed description of the EBP is described in detail in Korean Patent Publication No. 2017-0040748 of the present inventor.
  • the EBP undergoes a reversible phase transition at a lower critical solution temperature (LCST), also called a transition temperature (Tt). They are highly soluble in water below Tt, but become insoluble when the temperature is higher than Tt.
  • LCST critical solution temperature
  • Tt transition temperature
  • the fusion of the EBP block contributes to the thermal reactivity properties along with the adhesive properties of the multi-block copolypeptide.
  • the physicochemical properties of EBP are mainly controlled by the combination of Val-Pro-(Gly or Ala)-Xaa-Gly, which is a pentapeptide repeating unit.
  • the third amino acid of the repeat unit determines the relative mechanical properties.
  • the third amino acid, Gly determines elasticity
  • Ala determines plasticity. The elasticity or plasticity is a property that appears after transition.
  • X aa (or X) is referred to as a “guest residue”.
  • Various types of EBP according to the present invention can be prepared by introducing the X aa in various ways.
  • the hydrophobicity of the guest residue Xaa which is the fourth amino acid
  • the polymerization (multimerization) of the pentapeptide repeat unit both affect Tt.
  • EBP may exhibit hydrophilicity or hydrophobicity.
  • the EBP according to the present invention may be a polypeptide in which a pentapeptide is repeated, and the repeated polypeptide may form a polypeptide block (EBP block).
  • the SBP is a block copolymer composed of a module rich in glycine (Gly) and tyrosine (Tyr) (M2) and a module rich in alanine (Ala) and histidine (His) (M1). It forms a ⁇ -sheet structure in an aqueous solution and self-assembles.
  • the self-assembled nanostructures have a crystal-like structure due to the very tight alignment of the ⁇ -sheets.
  • the M1 domain of SBP forms a ⁇ -sheet structure that induces self-assembly and the M2 domain provides an amorphous matrix.
  • Proline (Pro) is present at the N-terminus of M1 and is involved in nano-confinement of the ⁇ -sheet.
  • SBP is composed of Pro-M1-Pro-M2
  • Pro-M1-Pro-M2 may be a repeated polypeptide
  • the repeated polypeptide may form a polypeptide block (SBP block).
  • the present invention provides a multi-block copolypeptide in which an EBP block and an SBP block are fused, and self-assembled nanostructures and hydrogels in which the copolypeptide forms a ⁇ -sheet structure of SBP.
  • the length of the SBP block affects the diameter of the nanostructures formed by self-assembly of the multi-block copolypeptide. As the length of the SBP block increases, the diameter of the nanostructure decreases, suggesting that ⁇ -sheet formation through intramolecular and intermolecular interactions increases as the length of the SBP block increases.
  • the self-assembled nanostructures and hydrogels have surface adhesion by themselves, the tyrosine residue of the multi-block copolypeptide is modified with DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) to cross-link between blocks and between molecules. linking), nanostructures and dense hydrogels with smaller diameters can be prepared, and the prepared nanostructures and hydrogels exhibit stronger surface adhesion properties. Furthermore, it is possible to induce the oxidation of DOPA in the nanostructures and hydrogels to further improve the surface adhesion strength. At this time, the oxidized form of DOPA, quinone, is known to be involved in the improvement of cohesion, unlike the nanostructures. and remarkably strengthens the adhesive force of the hydrogel.
  • DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine
  • the present invention provides a gene for production of the multi-block copolypeptide, a recombinant vector comprising the gene, and a recombinant microorganism into which the vector is introduced.
  • the preparation of the multi-block copolypeptide modified with DOPA with enhanced adhesion can be achieved by inducing hydroxylation of the tyrosine residue by reacting the multi-block co-polypeptide with mushroom-derived tyrosinase.
  • a gene encoding a tyrosinase or an expression vector containing the gene is additionally introduced into the recombinant microorganism into which the multi-block copolypeptide expression vector is introduced, and this can be achieved through a bacterial co-expression system.
  • a vector refers to a DNA preparation containing a polynucleotide encoding the target protein operably linked to a suitable regulatory sequence so that the target protein can be expressed in a suitable host cell.
  • the regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation, depending on the purpose. It can be manufactured in various ways.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible. After transformation into an appropriate host, the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in a host cell, and any vector known in the art may be used. Examples of commonly used vectors include plasmids, phagemids, cosmids, viruses and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, ⁇ MBL3, ⁇ MBL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pBR-based, pUC-based, pBluescriptII-based plasmid vectors; pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based can be used.
  • the vector usable in the present invention is not particularly limited, and a known expression vector may be used.
  • heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not found naturally in host cells.
  • An expression vector once in the host cell, can replicate independently of the host chromosomal DNA and several copies of the vector and its inserted (heterologous) DNA can be produced.
  • Expression vectors suitable for eukaryotic hosts include, for example, expression control sequences derived from SV40, bovine papillomavirus, adenovirus, adeno-associated virus, cytomegalovirus and retrovirus.
  • Expression vectors that can be used in bacterial hosts include pBluescript, pGEX2T, pUC vectors, colE1, pCR1, pBR322, pMB9 and derivatives thereof.
  • phage DNA exemplified by a wide variety of phage lambda derivatives such as ⁇ gt10 and ⁇ gt11, NM989, and other DNA phages such as M13 and filamentous single-stranded DNA phages.
  • Useful expression vectors for yeast cells are plasmids and derivatives thereof.
  • a useful vector for insect cells is pVL 941.
  • a host cell transformed or transfected with the above-described expression vector constitutes another aspect of the present invention.
  • transformation refers to the introduction of foreign DNA into a host so that the DNA becomes replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration completion.
  • transfection means that an expression vector is accepted by a host cell whether or not any coding sequence is actually expressed.
  • the host cell of the present invention is a recombinant microorganism into which a vector having a polynucleotide encoding at least one target protein is introduced, or a polynucleotide encoding at least one target protein is introduced into the microorganism so that the polynucleotide is integrated into a chromosome to express the target protein Recombinant microorganisms that have been transfected to It may be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • a host having a high DNA introduction efficiency and a high expression efficiency of the introduced DNA is usually used.
  • Well-known eukaryotic and prokaryotic hosts such as Escherichia coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungi, yeast, insect cells such as Spodoptera frugiperda (SF9), animal cells such as CHO and mouse cells, COS 1, African green monkey cells such as COS 7, BSC 1, BSC 40 and BMT 10, and tissue cultured human cells are examples of host cells that can be used.
  • COS cells since SV40 large T antigen is expressed in COS cells, the plasmid having the replication origin of SV40 is to exist as a multiple-copy episome in the cell, and is more common than usual. High expression can be expected.
  • the introduced DNA sequence may be from the same species as the host cell, may be of a different species than the host cell, or it may be a hybrid DNA sequence comprising any heterologous or homologous DNA.
  • co-expression means that two or more genes are expressed simultaneously, and in the present invention, it is expressed as “co-expression”.
  • the present invention comprises the steps of culturing a recombinant microorganism into which the vector for expression of the multi-block copolypeptide is introduced; inducing expression of a multi-block copolypeptide by treating the microorganism with IPTG; and dissolving the microorganism and purifying the multi-block co-polypeptide by performing inverse transition cycling (ITC).
  • ITC inverse transition cycling
  • the step of reacting the multi-block copolypeptide purified in the above method with mushroom-derived tyrosinase is further included, or the cultured microorganism is It can be used as a recombinant microorganism into which a vector for tyrosinase expression is additionally introduced.
  • the present invention provides a nanostructure prepared by self-assembly of the multi-block copolypeptide based on the ⁇ -sheet structure of SBP, and the nanostructure may have a vesicle structure or a micelle depending on the length of the SBP block. ) structure, and the nanostructure may be provided as a drug carrier using structural properties or may be provided for manufacturing adhesives and biobonds using strong surface adhesion.
  • the present invention provides a hydrogel prepared by self-assembly of the multi-block copolypeptide based on the ⁇ -sheet structure of SBP, and the hydrogel has strong surface adhesion and can be used for the preparation of adhesives and biobonds. .
  • the core-shell structure refers to a micelle structure
  • the micelle generally refers to a thermodynamically stable and uniform spherical structure formed by low molecular weight materials having an amphiphilic property, for example, a hydrophilic group and a hydrophobic group at the same time.
  • the non-water-soluble drug is dissolved in the compound having the micelle structure and injected, the drug is present inside the micelles, and these micelles are capable of target-directed drug release in response to changes in temperature or pH in the body. It can be seen that the application potential is very high. Therefore, the nanostructure in which the multi-block copolypeptide of the present invention is self-assembled can also be utilized as a drug delivery system.
  • the hydrogel prepared by forming a cross-link between the block polypeptides by the multi-block co-polypeptide by temperature stimulation has mechanical flexibility similar to that of an actual tissue, contains a lot of water, Since the bonding of the gel is not broken by the , it is actively applied to medical adhesives, which require adhesion to a wet biological surface containing moisture and have resistance to external moisture. Therefore, the hydrogel having excellent tissue adhesion according to the present invention can have various biomedical applications such as tissue adhesive or hemostatic agent, tissue engineering support, drug delivery carrier, tissue filler, wound treatment, or intestinal adhesion prevention.
  • the bioadhesive that is, the biobond composition of the present invention
  • the biocompatible biotissue adhesive of the present invention can replace sutures for surgery, can be used to occlude unnecessary blood vessels, and used for hemostasis and suturing of soft tissues such as facial tissues and cartilage and hard tissues such as bones and teeth It can be, and it is possible to apply it as a home over-the-counter medicine.
  • the various application fields of the biocompatible bioadhesive composition of the present invention are summarized as follows.
  • the bioadhesive agent of the present invention can be applied to the inner and outer surfaces of the human body, that is, the bioadhesive agent of the present invention is locally applied to the external surface of the human body such as the skin or the surface of internal organs exposed during surgery. can be applied as
  • the bioadhesive agent of the present invention can be used to adhere a damaged part of a tissue, seal an air/fluid leak from a tissue, adhere a medical device to a tissue, or fill a defective part of a tissue.
  • living tissue is not particularly limited, and for example, skin, bone, nerve, axon, cartilage, blood vessel, cornea, muscle, fascia, brain, prostate, breast, endometrium, lung, spleen, small intestine , liver, testis, ovaries, cervix, rectum, stomach, lymph nodes, bone marrow and kidneys, and the like.
  • the bioadhesive agent of the present invention may be used for wound healing.
  • the biocompatible bioadhesive of the present invention can be used as a dressing applied to a wound.
  • the bioadhesive agent of the present invention can be used for skin closure. That is, the bioadhesive of the present invention can be applied topically and used to close a wound, replacing a suture.
  • the bioadhesive of the present invention can be applied to hernia restoration, for example, it can be used for surface coating of a mesh used for hernia restoration.
  • the bioadhesive agent of the present invention can also be used for sealing and preventing leakage of vascular structures such as blood vessels.
  • the bioadhesive of the present invention can be used for hemostasis.
  • the bioadhesive agent of the present invention can be used as an anti-adhesion agent after surgery.
  • Adhesion is a phenomenon that occurs in all surgical sites and other tissues adhere to the wound around the surgical site. Adhesion occurs after surgery in about 97% of cases, and 5-7% of them cause serious problems. In order to prevent these adhesions, it is possible to minimize the wound during surgery or use an anti-inflammatory agent.
  • TPA tissue plasminogen activator
  • a physical barrier such as a crystalline solution, a polymer solution, or a solid membrane is used, but these methods may be toxic in vivo and may have other side effects. there is.
  • the bioadhesive agent of the present invention can be applied to tissue exposed after surgery to prevent adhesion between the tissue and surrounding tissues.
  • the present invention provides a surgical suture, a tissue engineering support, and the like comprising the hydrogel.
  • Tissue engineering technology refers to the production of a cell-support complex by culturing cells isolated from a patient's tissue on a support, and then transplanting the prepared cell-support complex back into the human body. It is applied to the regeneration of almost all organs of the human body, such as cartilage, artificial cornea, artificial blood vessels, and artificial muscles.
  • the bioadhesive hydrogel of the present invention can provide a scaffold similar to a living tissue in order to optimize the regeneration of biological tissues and organs in tissue engineering technology.
  • an artificial extracellular matrix can be conveniently implemented using the support of the present invention, and it can also be used as a medical material such as cosmetics, wound dressings, and dental matrices.
  • physiologically active substances involved in the action of promoting the growth and differentiation of cells through interaction with the cells or tissues of the human body and helping the regeneration and recovery of tissues can be easily attached to the hydrogel of the present invention.
  • the physiologically active material is also a generic term for various biomolecules that may be included to implement an artificial extracellular matrix having a structure similar to that of a natural extracellular matrix.
  • the physiologically active material includes cells, proteins, nucleic acids, sugars, enzymes, and the like, and examples thereof include cells, proteins, polypeptides, polysaccharides, monosaccharides, oligosaccharides, fatty acids, nucleic acids, and the like, preferably cells. there is.
  • the cell may be any cell including prokaryotic cells and eukaryotic cells, for example, osteoblasts, fibroblasts, hepatocytes, neurons, cancer cells, B cells, It may be immune cells and embryonic cells including white blood cells and the like.
  • the physiologically active material includes, but is not limited to, plasmid nucleic acid as a nucleic acid material, hyaluronic acid, heparin sulfate, chondroitin sulfate, algin salt as a sugar material, and hormone protein as a protein material.
  • E. coli cells were purchased from Novagen Inc. (Madison, Wis.), and top10 cells were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA). Oligonucleotides were chemically synthesized by Cosmo Gene Tech (Seoul, South Korea). Heat-sensitive alkaline phosphatase FastAP and restriction endonucleases BamHI and XbaI were purchased from Fermentas (Ontario, Canada), and BseRI and AcuI were purchased from New England Biolabs (Ipswich, MA). T4 DNA ligase was purchased from Elpis Bio-tech (Taejeon, South Korea).
  • DNA miniprep, gel extraction, and PCR purification kits were purchased from Geneall Biotechnology (Seoul, South Korea). Dyne Agarose High is manufactured by DYNE BIO, Inc. (Seongnam, South Korea). All Top10 cells were obtained from MO BIO Laboratories, Inc. (Carlsbad. CA) was cultured in TB DRY medium, and BL21 (DE3) cells were cultured in Circle Grow medium purchased from MP Biomedicals (Solon, OH).
  • Tris-HCl 2-20%) used as precast gels were purchased from Bio-Rad (Hercules, CA), PBS (Phosphate buffered saline, pH 7.4), ampicillin, polyethyleneimine (PEI) ), sodium periodate and mushroom tyrosinase were purchased from Sigma-Aldrich (St Louis, MO).
  • the SBP block gene consists of Pro-M1-Pro-M2, and the M1 and M2 block genes were independently synthesized and fused to the SBP block gene.
  • the SBP block gene in which the M1 and M2 block genes are fused is named "Sn", where n represents the number of repetitions of S1 and Pro-M1-Pro-M2.
  • the sticky EBP block, EBP[Y 2 K 4 ] n , containing the repeating unit Ile-Pro-Ala-Xaa-Gly, which is a repeating unit of a pentapeptide, is named “En”, where n is the number of 6 repeating pentapeptides , and the parenthesized capital letter means the guest residue amino acid (Xaa) at the 4th position in each pentapeptide unit, and the subscript means the ratio of the guest residues in the pentapeptide repeat.
  • the EBP6-SBPn diblock is named “E6Sn”, where n represents the number of repetitions of the SBP block.
  • the M1 and M2 expression cassettes are inserted into separate modified mpET-21a(+) vectors, respectively.
  • two oligonucleotides of each block gene were annealed, and 50 ⁇ L of T4 DNA ligase buffer containing each nucleotide at a concentration of 2 ⁇ M was heated at 95° C. for 2 minutes, and then slowly cooled at room temperature for 3 hours to obtain dsDNA cloning inserts. formed.
  • 20 pmol of annealed dsDNA and 0.1 pmol of linearized mpET-21a (+) vector were mixed in T4 DNA ligase buffer containing T4 DNA ligase and reacted at 16 ° C.
  • the modified cloning insert was inserted into the linearized mpET-21a(+) vector. After the cloning vector was chemically transformed into competent E. coli Top 10 cells, the transformed cells were transferred to an SOC plate containing 50 ⁇ g/mL ampicillin. The inserted nucleotide sequence was confirmed by DNA sequencing.
  • the plasmid containing the M2 block gene was linearized with XbaI and BseRI, the plasmid containing the M1 block gene was cut with the same restriction enzyme, and the M1 block gene was inserted into the plasmid containing the M2 block gene.
  • the S1 block gene was multiplexed in the same manner as above through RDL until the required repeating unit was obtained (Fig. 2a(i)).
  • the E6 block gene was inserted into the plasmid containing the Sn block gene to synthesize the EBP-SBP double block copolypeptide gene (FIG. 2a(ii)).
  • three types of double block copolypeptide genes, E6S3, E6S6 and E6S12 were synthesized to study the effect of SBP block length on the self-assembly of E6Sn.
  • the lengths of all block genes were confirmed by performing agarose gel electrophoresis and DNA sequencing after digestion with XbaI and BamHI, and the electrophoresis results are shown in FIG. 2B .
  • the size of the E6Sn double block gene varied from 606bp to 1650bp including the adapter sequence (66bp).
  • the DNA standard marker size in bp is shown on the left, and the expected size of the E6Sn double block gene is shown on the right of the gel image.
  • the gene sequence of sticky EBP is shown in Table 1 below, and the amino acid sequence is shown in Table 2 below.
  • Table 3 shows the amino acid sequences of the M1 and M2 blocks constituting the SBP.
  • Table 4 shows the nucleotide sequence of the double block copolypeptide and the expected molecular weight of the EBP-SBP diblock.
  • EBP[Y 2 K 4 ] ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC SEQ ID NO: 1 EBP[Y 3 K 3 ] ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC SEQ ID NO: 2 EBP[Y 2 K 2 I 2 ] ATT CCG GCC TAC GGC ATC CCG GCA AAA GGC ATT CCT GCA ATT GGC ATT CCG GCC TAC GGC ATC CCG GCA AAA GGC ATT CCT GCA ATT GGC SEQ ID NO: 3 EBP[Y 4 K 2 ] ATT CCG GCC TAC GGC ATC CCG GCA AAA GGC ATT CCT GCA ATT
  • Di-block copolypeptides Nucleotide chain length (bp) M.W (kDa) E6S3 867 26.3 E6S6 1128 35.0 E6S12 1650 52.2
  • the plasmid containing the above-described gene construct was transformed into E.Coli BL21(DE3) cells, and a single bacterial colony was inoculated into 10 mL of CG medium (1 st primary culture) containing 50 ⁇ g/mL ampicillin and 37°C. incubated overnight at 180 rpm.
  • the culture medium was inoculated with 400 mL of CG medium supplemented with 50 ⁇ g/mL ampicillin as a primary culture solution in a 2L flask and incubated at 37° C. at 200 rpm for 4 hours.
  • Cells were harvested after 12 hours by centrifugation, and the cell pellet was suspended in 5% acetic acid containing 8M urea to prevent self-assembly of the SBP block.
  • the harvested cells were then sonicated with a sample (VC-505, Sonic and materials Inc, Danbury, CT) at 60% power (10 sec on, 30 sec off) for 5 min in ice water to lysate the cell lysate ( cell lysis) was obtained.
  • the EBP-SBP double block was purified through inverse transition cycling (ITC), centrifuged at 16,000 rpm for 20 minutes at 4° C. during ITC to separate cell debris and the aqueous lysate was transferred to a new tube.
  • ITC inverse transition cycling
  • EBP-SBP diblock copolymer The purity and molecular weight of the EBP-SBP diblock copolymer were analyzed by SDS-PAGE and stained with 0.3M copper chloride solution. All block copolypeptides were successfully purified by ITC 3-4 times, and the yield of purified blocks was >300 mg per liter of culture.
  • E6Sn double block copolypeptide The tyrosine residue of the E6Sn double block copolypeptide was converted to DOPA using mushroom-derived tyrosinase (Sigma Aldrich, T3824).
  • E6Sn double block copolypeptide was suspended in 10 mM sodium phosphate buffer containing 10 mM sodium borate, and the acidity was adjusted to pH 5.0 using ascorbic acid, followed by mushroom-derived tyrosina The final concentration of the agent was added to ⁇ 20 unit/mL. The mixed solution was incubated with gentle shaking at room temperature (RT) for 3 hours.
  • the E6Sn double block copolypeptide treated with tyrosinase was subjected to phase inversion by addition of 2M NaCl, and purified by centrifugation at 40° C. for 10 minutes at 16,000 rpm to remove tyrosinase.
  • hydroxylation of tyrosine residues of the EBP-SBP double block via a bacterial co-expression system was performed during the E. coli expression process.
  • a hydroxylated mEBP-SBP double block was prepared by culturing BL21(DE3) cells containing pET21a(+) vector for EBP-SBP double block expression or pACYC duet vector for tyrosinase expression containing orf438 in a medium.
  • Aggregated mEBP-SBP block copolypeptides (mEBP-SBPs) were suspended in 5% acetic acid solution containing 8M urea and centrifuged at 16,000 rpm at 4°C for 15 minutes to remove insoluble contaminants.
  • mEBP-SBPs were dialyzed against 1% acetic acid solution and freeze-dried.
  • the hydroxylated mEBP-SBP double block copolypeptide is designated mE6Sn.
  • the DOPA-modified copolypeptide and the double block copolypeptide were identified by performing SDS-PAGE. As can be seen in Fig. 3(A), E6 and E6S3 moved larger than expected MW in SDS-PAGE after DOPA formation. Subsequently, the modification of DOPA was specifically confirmed by performing NBT/Glycinate staining by redox cycle. 3(B) shows the results of NBT/Glycinate staining, it can be seen that the hydroxylation of E6Sn stained in purple and the non-hydroxylated block copolymer as a control stained in yellow are confirmed.
  • the phase transition of the polypeptide was measured using a UV-visible spectrophotometer in a phosphate buffer (10 mM, pH 5.0) containing 0.5 M NaCl and absorbance (OD 350 ) at 350 nm in the range of 10 °C to 90 °C as a function of temperature at a heating rate of 1 °C/min. ) was measured and characterized.
  • the LCST cloud point was calculated as the temperature at which the first derivative of turbidity as a function of temperature (d(OD)/dT) is maximum.
  • the thermal properties of E6Sn can be seen in FIG. 4(A), E6S3, E6S6 and LCST of E6S12 were found to be 81 °C, 46 °C and 23 °C, respectively.
  • the average Rh of mE6S3, mE6S6, and mE6S12 in which DOPA was formed by hydroxylation of a tyrosine residue was 192.1 ⁇ 12.00 nm, 109.4 ⁇ 17.54 nm, and 100.6 ⁇ 5.18 nm, respectively, indicating that the size of mE6Sn nanostructures decreased after DOPA formation. can This is presumed to be due to the oxidation of DOPA to dopaquinone during the purification process.
  • TEM images were obtained using a JEM-2100F FE-STEM (JEOL, Germany) operated at an accelerating voltage of 80-200 kV, in which a carbon-coated TEM grid was immersed in a sample at 25 ⁇ M, dried with filter paper, and 2% phosphotungstic acid (phosphotungstic acid) was used. , PTA) was negatively stained and photographed.
  • TEM images were taken before and after modification of tyrosine residues with DOPA, and 15 randomly selected structures were measured in the TEM images to determine the average size of self-assembled nanostructures of E6Sn and hydroxylated mE6Sn.
  • the average sizes of E6S3 and hydroxylated mE6S3 nanostructures were 237.4 ⁇ 20.76 nm and 140.5 ⁇ 50.48 nm, respectively, and the average sizes of E6S6 and mE6S6 nanostructures were 260.78 ⁇ 10.59, respectively. nm and 200.26 ⁇ 15.62 nm, and the average sizes of the E6S12 and mE6S12 nanostructures were 170.32 ⁇ 5.72 nm and 70.29 ⁇ 20.40 nm, respectively, confirming that the size of the self-assembled nanostructures gradually decreased as the length of the SBP block increased.
  • the SEM image is shown in FIG. 6, and it was confirmed that the tyrosine modification of the SBP and EBP blocks in the nanostructures of E6Sn and hydroxylated mE6Sn through ⁇ -sheet-induced self-assembly of the SBP block did not affect self-assembly.
  • the mean sizes of E6Sn nanostructures according to the SBP block length were 787 ⁇ 233 nm, 649 ⁇ 120 nm, and 636 ⁇ 148 nm, respectively, and the SEM image statistics were also consistent with DLS analysis.
  • the lysine residue of the EBP block was labeled with FITC.
  • the mEBP-SBP double block was dissolved in sodium bicarbonate buffer containing 8 M urea, and FITC dissolved in dimethyl sulfoxide was added dropwise to the solution at a molar ratio of 1:1. The reaction mixture was stirred for 3 hours to react, and 3M NaCl was added to stop the reaction to induce aggregation of the mEBP-SBP diblock. Aggregated mEBP-SBP was dissolved in 5% acetic acid together with 8M urea and purified by ITC to remove free FITC.
  • Self-assembled nanostructures were prepared by dialysis of FITC-labeled mEBP-SBP double blocks in phosphate buffer (10 mM, 5.0 pH) for 1 day.
  • phosphate buffer (10 mM, 5.0 pH) 10 mM, 5.0 pH
  • CLSM confocal laser scanning microscopy
  • the mEBP-SBP double block was dropped on a slide glass, incubated for 1 hour at room temperature, and then the glass surface with the sample solution was washed with phosphate buffer (10 mM, pH 5.0) 3 washed twice.
  • FIG. 8 The fluorescence image of FITC-labeled mE6S3 is shown in FIG. 8 .
  • FITC was labeled with mE6S3 after being conjugated to lysine residues of FITC and adhesive EBP block in a molar ratio of 1:1, and as can be seen in FIG. is 0.84 ⁇ 0.13 mm, and as can be seen in FIG. 8(B) , the nanostructures remained on the slide glass surface even after washing with a phosphate buffer, showing strong adhesion. It can be seen that this is due to the adhesive EBP block exposed to the nanostructure shell.
  • EBP-SBP triblock genes Two types of EBP-SBP triblock genes, ABA and BAB, were synthesized by recursive directional ligation (RDL).
  • RDL recursive directional ligation
  • the plasmid containing the En gene was digested with XbaI and AcuI, and the Sn gene linearized by XbaI and BseRI was inserted into the plasmid encoding the plasmid containing the EnSn double block gene.
  • a plasmid containing the Sn gene cut with XbaI and AcuI was inserted into the EnSn diblock gene linearized by XbaI and BseRI to prepare a plasmid containing the SnEnSn triblock gene.
  • the Sn gene was inserted into the plasmid containing the En gene, and then the En gene was inserted into the plasmid containing the SnEn gene to prepare the EnSnEn triblock gene.
  • S3E6S3, S6E6S6, E6S3E6 and E6S12E6 were fabricated to confirm the change in the properties of the nanostructures according to the length of the SBP and EBP blocks.
  • each gene was confirmed through DNA agarose gel electrophoresis and DNA sequencing after digestion with XbaI and BamHI.
  • the electrophoresis results are shown in FIGS. 10c and 10e.
  • the lengths of the S3E6S3, S6E6S6, E6S3E6, and E6S12E6 genes are 1128, 1650, 1407, and 2190 (bp), respectively, including the adapter sequence (66 bp).
  • the DNA standard marker size in bp is displayed on the left side of FIGS. 10C and 10E , and the expected size of each block gene is displayed on the right side.
  • Table 6 shows the gene length of the triple block copolypeptide and the expected molecular weight of the EBP-SBP triple block.
  • Tri-block copolypeptides Nucleotide chain length (bp) M.W (kDa) S3E6S3 1128 34.79 S6E6S6 1650 52.15 E6S3E6 1407 43.32 E6S12E6 2190 69.39
  • Example 7 EBP-SBP triple block expression, purification and hydroxylation of tyrosine residues in EBP-SBP triple block
  • E.Coli BL21 (DE3) cells were transformed with a plasmid for EBP-SBP triple block expression,
  • Example 2 Expression induction and purification of the triple block were performed in the same manner as in , and the purity and molecular weight of the EBP-SBP triple block copolypeptide were confirmed by staining with 0.3M copper chloride solution and performing SDS-PAGE.
  • the tyrosine residue was hydroxylated using mushroom tyrosinase or a bacterial co-expression system to transform it into DOPA, and SDS-PAGE and NBT/Glycinate staining It was confirmed by performing.
  • the DOPA-modified EBP-SBP triple block using a bacterial co-expression system was obtained from BL21(DE3) cells containing a pET21a(+) vector for EBP-SBP triple block expression or a pACYC duet vector for tyrosinase expression containing orf438. It was obtained by culturing in the same medium.
  • mEBP-SBP triple block copolypeptide is termed mSnEnSn or mEnSnEn.
  • the DOPA-modified EBP block is known to migrate with a higher molecular weight than before modification, whereas the S3E6S3 and E6S3E6 triple blocks showed similar mobile phases before and after DOPA modification. This difference is expected to be dependent on molecular weight as observed for the EBP-SBP double block. Modification with DOPA was specifically confirmed by the results of NBT/Glycinate staining using redox cycle. 11(B) , it can be seen that mS3E6S3 and mE6S3E6 were stained purple, and S3E6S3 and E6S3E6 were stained yellow.
  • E6SnE6 The thermal properties of E6SnE6 are shown in FIGS. 12 (A) and (B), and as can be seen in FIG. 12 (A), the LCST of E6S3E6 was 90°C or higher, and the LCST of E6S12E6 was 55°C.
  • PBS supplemented with 0.5 M NaCl was used to reduce the LCST.
  • Figure 12(B) shows that the LCST of E6S3E6 in PBS supplemented with 0.5 M NaCl is 80 °C.
  • LCST induced by disruption of hydrophilic EBP end blocks decreased with increasing hydrophobic SBP block length.
  • the self-assembly of E6S3E6 and E6S12E6 via ⁇ -sheet formation was characterized by DLS measurements at room temperature as shown in FIGS. 12(C) and (D).
  • the hydrodynamic radii (R h ) of the E6S3E6 and E6S12E6 nanostructures were found to be 6.34 ⁇ 0.32 nm and 7.20 ⁇ 0.84 nm in 5% acetic acid supplemented with 8M urea, respectively, as indicated by the black bars.
  • TEM images were performed to characterize the nanostructures observed by DLS.
  • the average size of the E6S3E6 self-assembled nanostructures was 190.26 ⁇ 50.68 nm, and it was confirmed that they were nanoparticles of a vesicle structure with a layer stained with PTA.
  • the average diameter of the self-assembled nanostructures of E6S12E6 was 15.38 ⁇ 2.68 nm, which was confirmed as a micellar nanostructure ( FIGS. 13 (C) and (D)). From the above, it can be seen that the nanostructures exhibit different physical properties due to the difference in critical packing density as the length of the SBP block increases.
  • the lysine residues of the EBP block were labeled with FITC.
  • the mEBP-SBP triple block was dissolved in sodium bicarbonate buffer containing 8 M urea, and FITC dissolved in dimethyl sulfoxide was added dropwise to the solution at a molar ratio of 1:1. The reaction mixture was stirred for 3 hours to react, and 3M NaCl was added to stop the reaction to induce aggregation of the mEBP-SBP triple block.
  • the aggregated mEBP-SBP triple block was dissolved in 5% acetic acid together with 8M urea and purified by ITC to remove unreacted FITC.
  • Self-assembled nanostructures were prepared by dialysis of FITC-labeled mEBP-SBP triple blocks in PBS (10 mM, pH 7.4) for 1 day.
  • the swollen state of the self-assembled nanostructures of the mEBP-SBP triple block was confirmed by confocal laser scanning microscopy (CLSM) in fluorescence mode.
  • CLSM confocal laser scanning microscopy
  • the dialyzed mEBP-SBP triple block solution was dropped on a slide glass, incubated for 1 hour at room temperature, and then the glass surface with the sample solution was washed with PBS (10 mM, pH 7.4). ) was washed 3 times.
  • mE6S3E6 self-assembled with the ⁇ -sheet formation of the SBP block and the hydrated EBP block in the expanded state to form a self-assembly of the endoplasmic reticulum structure
  • mE6S3E6 formed a vesicular structure with an average size of 0.83 ⁇ 0.23 mm in the swollen state.
  • FIG. 14(B) the self-assembled nanostructures of mE6S3E6 were attached to the slide glass even after washing with PBS. It was found that adhesion is formed by the DOPA residue of the EBP block in mE6S3E6.
  • the dynamic frequency sweep test was performed within the linear viscoelasticity region at 4°C, each frequency range of 0.1 to 10 rad/sec, and the rheological behavior of chemical crosslinking was determined by the time-dependent rheology method was characterized as
  • a 5 mM NaIO 4 solution was uniformly mixed with 30 wt% mEBP-SBP triple block at 4 °C, and the mixed solution was stirred at a fixed temperature. Transfer to an equilibrated Peltier plate. Changes in elastic modulus and loss modulus corresponding to gel formation were monitored in oscillatory mode using a 40 mm cone plate spaced 58 mm apart.
  • the elastic modulus (G') and loss modulus (G") of mS3E6S3 and mE6S3E6 were measured at constant strain and frequency after NaIO 4 was added for oxidation during gelation.
  • the gelation time of mS3E6S3 using 5 mM NaIO 4 was less than 15 minutes at 4° C. (frequency 1 rad/sec, strain 0.2%).
  • mE6S3E6 exhibits a higher G' than G" and is instantaneously chemically and physically crosslinked by ⁇ -sheet formation of the SBP block and NaIO 4 induced oxidation.
  • a lap shear test was performed to measure the bulk adhesive strength of the mEBP-SBP triple block copolypeptide.
  • the aluminum fixture was selected as the adherend of the mEBP-SBP triple block, and the adhesive surface was immersed in acetone, ethanol, and deionized water for 15 minutes, respectively, and rinsed, and dried for reuse.
  • the mEBP-SBP triblock was dissolved in 10mM PBS at 30wt%, and each solution was placed directly on an aluminum adherend and mixed with various concentrations of NaIO4.
  • the adherend was covered with another adherend to form an overlapping area of 10 mm ⁇ 10 mm, a weight of 60 g was added, cured in room temperature air for 30 minutes, and then washed by immersion in PBS at 25°C.
  • Each sample was subjected to a lap shear test using a universal tester (INSTON 3365; Norwood, MA) at a cross-head speed of 5 mm/min and under normal conditions.
  • the wet adhesive strength of the mEBP-SBP triple block was calculated from the measured maximum value of the distance versus force plot just before failure.
  • 15(B) shows the adhesive strength of mS3E6S3 and mE6S3E6 according to the concentration of NaIO 4 as a chemical crosslinking agent, and shows the relationship between the degree of crosslinking and bulk adhesive strength in each hydrogel.
  • DOPA imparts surface adhesion through hydrogen bonding and coordination with the aluminum surface
  • the oxidized form of DOPA, quinone is known to induce intramolecular and intermolecular crosslinking for cohesion.
  • mS3E6S3 and mE6S3E6 hydrogels were expected to increase cohesion rather than adhesion by chemical crosslinking of NaIO4, but the bulk adhesive strength of mS3E6S3 significantly increased from 0.10 MPa to 0.96 MPa as the NaIO 4 concentration increased in the 0-10 mM range. , suggesting increased intramolecular and intermolecular crosslinking induced by quinones, the oxidized form of DOPA. Likewise, the bulk adhesive strength of mE6S3E6 also significantly increased from 1.04 MPa to 4.17 MPa with the increase in NaIO 4 treatment concentration.
  • Figure 16a is a photograph of loading a mEBP-SBP triple block solution dissolved in 10 mM PBS on an aluminum plate to control the bulk adhesive strength. NaIO 4 The self-assembled mEBP-SBP triple block hydrogel was loaded onto the adherend. Each adherend has a brown color on the surface, indicating that the hydrogel adheres to the surface while the hydrogel is broken leading to failure of its adhesion.
  • the adhesive strength test results of the mEBP-SBP triple block hydrogel show that increasing the concentration of the mEBP-SBP triple block significantly enhances the adhesive properties. This appears to be due to increased DOPA residue concentration and chemical crosslinking of DOPA through NaIO 4 oxidation.
  • a loading test of the mEBP-SBP triple block copolymer was performed using a glass surface as an adhesive.
  • the mEBP-SBP triple block copolypeptide solution was dropped on a glass surface and attached to a counter glass with different weights ranging from 0.5 kg to 4.0 kg.
  • images of lifting glass with mEBP-SBP triple block copolypeptide hydrogel were photographed.
  • the mEBP-SBP triple block hydrogel of the optimized block length showed controlled adhesion properties in the range of 0.5 to 6.0 MPa, resulting in a load bearing capacity of 0.5 kg to 4.0 kg. From the above, it is suggested that the ⁇ -sheet formation of the SBP block and the chemical crosslinking of DOPA through NaIO4 oxidation improve the mechanical properties as well as the adhesive properties of the self-assembled hydrogel.
  • the multi-block copolypeptide of the present invention can be used as a drug carrier due to its temperature- and pH-dependent phase change properties and self-assembly properties, and can be used as an adhesive, particularly a bioadhesive, due to its strong surface adhesion.

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Abstract

본 발명은 자극 반응성 및 표면 부착성을 가진 점착성 엘라스틴 및 서커린 기반 다중 블록 코폴리펩타이드, 그의 자가조립 구조체 및 주사형 하이드로겔의 생접착제 응용에 대한 것이다.

Description

자극 반응성 및 표면 부착성을 가진 점착성 엘라스틴 및 서커린 기반 다중 블록 코폴리펩타이드, 그의 자가조립 구조체 및 주사형 하이드로겔의 생접착제 응용
본 발명은 자극 반응성 및 표면 부착성을 가진 점착성 엘라스틴 및 서커린 기반 다중 블록 코폴리펩타이드, 그의 자가조립 구조체 및 주사형 하이드로겔의 생접착제 응용 등에 관한 것이다.
천연 및 합성 아미노산을 포함하는 단백질-기반 생체재료는 이들의 아미노산 서열과 분자량이 분자 수준에서 정확하게 조절되고, 다양한 공유결합 및 비공유결합에 따른 독특한 물리화학적 특성을 가지기 때문에 큰 관심을 받고 있다. 특히, 자극 반응성 및 이의 정교한 조절은 단백질-기반 생체재료의 독특한 특성 중 하나이다. 자극 반응성을 가진 단백질은 pH, 온도, 이온, 및 리간드와 같은 자극제에 의해 상당한 형태학적 변화를 하고, 그 변화에 의해 형성된 마이셀, 베시클, 및 하이드로겔과 같은 자가조립 구조의 빌딩 블록으로 사용된다. 따라서, 자극 반응성 생체재료는 바이오메디칼 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
포유류의 엘라스틴에서 유래한 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(Elastin-based polypeptides, EBPs)는 자극 반응성 생체재료로, 이의 물리화학적 특성은 온도에 따라 변화한다. 다중 펜타펩타이드 반복 유닛 Val/Ile-Pro-Gly/Ala-Xaa-Gly은 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature, LCST), 즉 전이 온도(transition temperature, Tt)에서 가역적인 역상전이를 겪으며, 이 때 상기 Xaa는 프롤린(P)를 제외한 모든 아미노산이 될 수 있다. 상기 EBP는 친수성이기 때문에 LCST보다 낮은 온도에서는 가용성이며, 온도가 LCST 이상으로 상승하면, EBP가 응집되어 불용성으로 변화한다. 일반적으로 EBP의 물리화학적 성질은 펜타펩타이드 반복 유닛의 4번째에 위치한 게스트 잔기(guest residue)로서 아미노산의 비율과 조성, 펜타펩타이드의 반복 횟수에 따라 정확하게 조절된다. 보다 구체적으로, 게스트 잔기와 펜타펩타이드의 반복 유닛은 Tt에 영향을 미치고, 펜타펩타이드 유닛의 세번째 아미노산은 EBP의 유연성을 결정한다. 예를 들어, 펜타펩타이드 유닛의 세번째 아미노산이 글리신(G)인 경우 EBP는 유연성을 나타내나, 동일한 위치에서 알라닌(A)의 경우 EBP가 좀 더 단단한 성질을 가진다. 펜타펩타이드 반복의 독특한 조합에 따라, 본래의 물리화학적 성질 및 Tt를 가진 EBP는 온도 트리거에 따라 마이셀, 하이드로겔과 같은 자가조립 구조체를 형성하거나, 부착성 또는 금속 이온과의 배위와 같이 게스트 잔기에 기능적인 아미노산을 도입함으로써 새로운 기능을 나타낸다.
최근, 홍합 족사 단백질, 오징어 빨판 구성 단백질과 같은 생체 접착 단백질이 생체 재료로서 특히, 조직 공학 및 재생 의학 분야에서 관심을 받고 있다. 가혹하고 습한 조건에서 홍합의 접착에서 영감을 받은 이러한 접착 단백질은 티로신(Y) 의 수산화 형태로서 모두 3,4-디하이드록시페닐아민(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)를 가지고 있어, DOPA 분자와 접착 표면 분자 간 다양한 상호작용을 통해 표면에 부착하고, 리신(K)과 π-양이온 상호작용을 통해 접착력을 증가시킨다.
최근 새로운 종류의 단백질인 서커린(suckerin)은 오징어의 sucker ring teeth (SRT)에서 보고되었으며, 글리신(Gly) 및 티로신(Tyr)이 풍부한 모듈(M2)과 알라닌(Ala) 및 히스티딘(His) 풍부한 모듈(M1)로 구성된 블록 공중합체로 비정질 매트릭스 내에서 β-시트 구조의 영역을 형성한다. 서커린 단백질 패밀리에서 주로 발견되는 A1H1 서열(M1 모듈의 펩타이드 서열 AATAVSHTTHHA)은 수용액 상에서 결정 구조와 유사하게 자가조립되며, β-시트 간 거리는 4.4 및 5.4 Å으로 매우 촘촘하게 자가조립 나노결정체를 형성한다. 이러한 β-시트 나노결정은 수소 결합을 통해 물리적 및 가역적 가교 역할을 수행하며 재료의 동적 기계적 특성을 부여한다.
본 발명자들은 생접착제로 활용될 수 있는 자극반응성과 다양한 표면에 부착성을 가진 생체 적합성 재료를 개발하기 위하여 예의 연구한 결과, 점착성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(EBP)와 β-시트 구조로 자가조립능을 가진 서커린 기반 폴리펩타이드(SBP)의 융합을 통해 자가조립되어 높은 부착능을 갖는 다중 블록 코폴리펩타이드를 설계 및 제작하고 상기 다중 블록 코폴리펩타이드의 티로신 잔기를 하이드록실화하여 DOPA로 개질된 다중 블록 코폴리펩타이드는 보다 강력한 접착능을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 점착성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(sticky elastin-based polypeptide, EBP)와 서커린 기반 폴리펩타이드(suckerin-based polypeptide, SBP)를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드(multiblock copolypeptide)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드 발현용 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 벡터가 포함된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드의 제조방법을 제공하는 것으로서, 특히 티로신 잔기가 DOPA로 개질된 다중 블록 코폴리펩타이드의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드로 형성된 자가조립 나노구조체 및 하이드로겔과 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드로 형성된 자가조립 나노구조체를 약물 전달체로 제공하고, 상기 다중 블록 코폴리펩타이드로 형성된 하이드로겔을 포함하는 접착용 조성물 및 생체 본드를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서커린 기반 폴리펩타이드 (suckerin-based polypeptide, SBP) 및 점착성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 (sticky elastin-based polypeptide, EBP)를 포함하거나 이로 이루어진 다중 블록 코폴리펩타이드 (multiblock copolypeptide)을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 SBP는 티로신(Y)을 포함하고, 상기 EBP는 티로신(Y) 및/또는 리신(K)을 포함할 수 있다. 상기 티로신 잔기는 하이드록실화되어 3,4-디하이드록시페닐아민(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)으로 변형될 수 있으며, 상기 다중 블록 코폴리펩타이드는 티로신 잔기가 하이드록실화되어 DOPA로 개질된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 다중 블록 코폴리펩타이드는 (SBP)n(EBP)m; (EBP)m(SBP)n; (SBP)n(EBP)m(SBP)n; 및 (EBP)m(SBP)n(EBP)m으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배열로 구성될 수 있으며, 상기 n 및 m은 1 이상의 정수이고, n은 SBP의 반복 횟수이며, m은 EBP의 반복 횟수이다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 EBP는 하기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다:
[식 1]
[IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG]m
상기 식 1에서, 상기 m은 1 이상의 정수이고, 상기 식 1의 반복 횟수이고;
상기 X는 티로신(Y), 리신(K), 및 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상임.
본 발명이 또 다른 구현예로서, 상기 식 1에서 m은 6이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는 티로신(Y), 리신(K)이 2:4의 비율로 이루어지거나, 티로신(Y), 리신(K)이 3:3의 비율로 이루어지거나, 티로신(Y), 리신(K), 이소루신(I)이 2:2:2의 비율로 이루어지거나, 티로신(Y), 리신(K)이 4:2의 비율로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 SBP는 Pro-M1-Pro-M2로 이루어지거나 이를 반복적으로 포함하는 블록일 수 있으며, 상기 M1은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 도메인이고, 상기 M2는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 도메인이다.
또한, 본 발명은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드를 암호화하는 유전자와 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 재조합 미생물은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드 유전자 또는 이의 발현용 재조합 벡터 외에 티로시나아제 유전자 또는 상기 유전자 발현용 재조합 벡터가 추가로 도입되어 상기 다중 블록 코폴리펩타이드와 티로시나아제를 공동 발현하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다:
(1) 상기 재조합 미생물을 배양하여 다중 블록 코폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및
(2) 상기 재조합 미생물을 용해하고 ITC(inverse transition cycling)을 통해 상기 다중 블록 코폴리펩타이드를 정제하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (1) 단계의 다중 블록 코폴리펩타이드의 발현은 재조합 미생물 배양 배지에 IPTG를 첨가하여 유도될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 제조방법은 (2) 단계 이후에 (3) 정제된 다중 블록 코폴리펩타이드를 버섯 유래 티로시나아제와 접촉시켜 티로신 잔기를 DOPA로 변형시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드가 SBP의 β-시트 구조 기반으로 자가조립되어 형성되는 나노구조체를 제공하며, 상기 나노구조체는 소포(vesicle) 또는 마이셀(micelle) 구조일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 나노구조체의 다중 블록 코폴리펩타이드는 DOPA로 개질된 것일 수 있으며, 상기 DOPA는 산화된 것일 수 있다. 상기 DOPA의 산화는 자연적으로 발생하는 산화이거나 화학적 산화제, 예를 들어 NaIO4의 처리로 유도된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노구조체를 포함하는 약물 전달체 및 접착제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드가 SBP의 β-시트 구조 기반으로 자가조립되어 형성되는 하이드로겔을 제공하며, 상기 하이드로겔의 다중 블록 코폴리펩타이드는 DOPA로 개질된 것일 수 있고, 상기 DOPA는 산화된 DOPA일 수 있다. 상기 산화된 DOPA는 자연적 산화에 의한 것이거나 화학적 산화제의 처리로 유도된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔을 포함하는 접착용 조성물 및 생체 접착제 조성물을 제공한다.
본 발명은 서커린 기반 폴리펩타이드(suckerin-based polypeptide, SBP) 및 점착성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(sticky elastin-based polypeptide, EBP)가 융합된 다중 블록 코폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 다중 블록 코폴리펩타이드는 SBP의 β-시트 구조 기반으로 자가조립되어 나노구조체 및 하이드로겔을 형성할 수 있으며, 상기 나노구조체 및 하이드로겔의 표면 부착력을 강화하기 위하여 상기 다중 블록 코폴리펩타이드의 티로신 잔기를 DOPA로 개질하거나, 개질된 DOPA의 산화를 유도하는 방법을 제안한다. 본 발명의 다중 블록 코폴리펩타이드는 온도 및/또는 pH 자극에 따라 가역적으로 변화하 가능한 자가조립 나노구조체 및 하이드로겔을 형성할 수 있고 습윤 조건 하에서도 강한 표면 부착력으로 약물전달체, 생체 코팅제, 생접합제 등 바이오메디칼 분야에서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 EBP 및 SBP 단일 블록의 아미노산 서열(A)과 하이드록실화된 EBP-SBP 이중블록의 자가조립에 의한 나노구조체 형성 과정의 모식도이다(B). EBP 및 SBP 단일 블록에서 하이드록실화 대상인 티로신 잔기는 강조로 표시하였다(A). 버섯의 티로시나아제 또는 박테리아 공동 발현 시스템으로 EBP 및 SBP 블록의 티로신 잔기는 DOPA로 변형되고 SBP 블록의 β-시트 구조로 EBP-SBP 자가조립된 나노구조체는 DOPA 잔기의 NaIO4 산화에 의해 화학적으로 가교된다.
도 2는 EBP-SBP 이중 블록 코폴리펩타이드 합성의 모식도(a)와 XbaI 및 BamHI 로 절단된 EnSn 유전자의 DNA 아가로스 겔 전기영동 이미지(b) 및 정제된 EnSn 이중 블록 코폴리펩타이드의 구리 염색 SDS-PAGE 이미지(c)이다. 도 2a의 (i)은 M2 플라스미드에 M1 유전자를 삽입하여 S1 플라스미드를 제작하는 과정의 모식도이고, (ii)는 Sn 플라스미드에 En 유전자를 삽입하여 SBP 블록 및 EBP-SBP 이중 블록 코폴리펩타이드 제조용 플라스미드 제작 과정이 모식도이다. 도 2b 및 2c에서 표준 마커의 크기는 왼쪽에 표시하였고 예상 크기는 오른쪽에 표시하였다.
도 3은 EBP-SBP 이중 블록 및 하이드록실화된 mEBP-SBP 이중 블록의 구리 염색 SDS-PAGE 이미지 (A)와 NBT/glycinate 염색을 통해 각 블록에서 티로신 잔기의 DOPA로 변형을 확인한 결과이다(B).
도 4의 (A)는 온도 함수로 0.5M NaCl을 포함하는 인산염 버퍼(10mM, 5.0 pH)에서 EBP-SBP 이중블록의 탁도(Turbidity) 프로파일이고, (B) 및 (C)는 실온에서 인산염 버퍼(10mM, 5.0 pH)에서 DLS를 통해 측정한 EBP-SBP (B) 및 하이드록실화된 mEBP-SBP (C)의 유체역학적 반경(Rh)이다.
도 5는 E6S3 (A), E6S6 (C), E6S12 (E) 및 하이드록실화된 mE6S3 (B), mE6S6 (D), mE6S12 (E)의 자가 조립을 확인하기 위한 TEM 이미지 이다. 모든 샘플은 PTA로 음성 염색하였으며, 실온에서 건조되었으며, 스케일 바는 200nm(A-E) 및 50nm(F) 이다
도 6은 E6S3 (A), E6S6 (C), E6S12 (E) 및 하이드록실화된 mE6S3 (B), mE6S6 (D), mE6S12 (E)의 자가 조립을 확인하기 위한 SEM 이미지 이다. 모든 샘플은 실온에서 건조되었으며, 각 이미지에서 스케일 바는 5μm이다.
도 7은 실온 인산염 버퍼(10mM, pH 5.0)에서 하이드록실화된 mE6S3의 자가 조립 나노구조체의 명시야(Bright field) 이미지 이다. 세척 전(A1, A2)과 세척 후(B1, B2) 이미지에서 표면 접착성을 확인할 수 있으며, 1, 2는 다른 확장 배율로 이미지화 했으며 스케일 바는 (A1), (B1)에서 20μm, (A2), (B2)에서 8μm이다.
도 8은 실온 인산염 버퍼(10mM, pH 5.0)에서 mE6S3의 형광 이미지이다. 세척 전(A) 및 세척 후(B) FITC 표지한 하이드록실화된 mE6S3의 표면 접착성을 확인한 것으로서, 스케일 바는 (A) 및 (B)에서 8 μm이다.
도 9는 EBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩타이드 설계, 이의 자가 조립 구조체 및 하이드로겔의 제조 및 그 구조의 모식도로서, 도 9a는 EBP 및 SBP 단일 블록의 아미노산 서열이고, 도 9b는 ABA type의 삼중 블록 코폴리펩타이드의 구조 및 DOPA로 개질된 상기 삼중 블록 코폴리펩타이드의 자가조립된 나노구조체 및 하이드로겔의 제조 및 구조의 모식도이고, 도 9c는 BAB type의 삼중 블록 코폴리펩타이드의 구조 및 DOPA로 개질된 상기 삼중 블록 코폴리펩타이드의 자가조립된 나노구조체 및 하이드로겔의 제조 및 구조의 모식도이다. 두 종류의 삼중 블록 코폴리펩타이드(ABA type 및 BAB type)에서 B 블록은 친수성 EBP 블록을 의미하고 A블록은 양친매성 SBP 블록을 의미한다. EBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩타이드의 티로신 잔기는 버섯의 티로시나아제 또는 박테리아 공동 발현 시스템을 이용하여 하이드록실화되어 부착특성을 갖는 DOPA 모이어티(moiety)를 형성한다. 이렇게 변형된 EBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩타이드(mEBP-SBP 삼중 블록)은 희석된 조건에서 나노구조체로 자가조립되거나 NaIO4 처리로 산화된 DOPA에 의한 EBP 블록의 화학적 가교와 SBP 블록의 β-시트 형성으로 하이드로겔로 자가조립된다. 나아가, 농축된 조건하에서 DOPA의 산화는 화학적 가교에 의해 자가조립된 하이드로겔의 기계적 특성을 향상시킨다.
도 10a는 ABA type 삼중 블록, SnEmSn의 합성 방법 모식도 이고, 도 10b는 BAB type 삼중 블록, EmSnEm의 합성 방법의 모식도이다. 도 10c는 S3E6S3 및 E6S3E6 유전자를 XbaI 및 BamHI로 절단 후 전기영동한 아가로오스 겔 이미지 이고, 도 10d는 정제된 S3E6S3 및 E6S3E6의 구리 염색 SDS-PAGE 이미지 이다. 도 10e는 S6E6S6 및 E6S12E6 유전자를 XbaI 및 BamHI로 절단 후 전기영동한 아가로오스 겔 이미지 이고, 도 10f는 정제된 S6E6S6 및 E6S12E6의 구리 염색 SDS-PAGE 이미지 이다. 도 10c 내지 10f의 왼쪽에는 표준 마커의 사이즈를 표시하였고, 오른쪽은 예상 사이즈를 표시하였다.
도 11에 (A)는 S3E6S3와 E6S3E6 및 상기 삼중블록 코폴리펩타이드의 티로신 잔기를 버섯 티로시나아제에 의해 하이드록실화된 mS3E6S3와 mE6S3E6의 구리 염색 SDS-PAGE 이미지 이고, (B)는 NBT/glycinate 염색을 통해 상기 삼중 블록의 티로신 잔기가 DOPA로 변형된 것을 확인한 결과이다.
도 12는 온도 함수로서 (A) 10 mM PBS 또는 (B) 0.1M 염화나트륨이 포함된 10mM PBS에서 EBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩타이드의 열 의존적 EBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩타이드의 흡광도 프로파일이다. 그리고, (C) E6S3E6 및 (D) E6S12E6의 크기 분포 분석결과는 (1) 용해성 단량체를 형성을 위한 5% 아세트산 및 8M 요소 또는 (2) 자가조립 나노구조체 형성을 위한 10mM PBS의 실온에서 투석에서 확보하였다.
도 13에 (A) 및 (B)는 2% PTA로 염색 후 실온에서 건조된 E6S3E6의 TEM 이미지 이고, (C) 및 (D)는 E6S12E6의 TEM 이미지 이다. 스케일 바는 각각 1 μm (A), 200 nm (B, C), 및 100 nm (D) 이다.
도 14은 실온 PBS (10mM, pH 7.4)에서 하이드록실화된 mE6S3E6의 형광 이미지이다. 세척 전(A) 및 세척 후(B) FITC 표지한 mE6S3E6의 표면 접착성을 확인한 것으로서, 스케일 바는 (A) 및 (B)에서 20 μm이다.
도 15에 (A)는 4℃에서 5mM NaIO4 존재 하에서 하이드록실화된 mS3E6S3 및 mE6S3E6의 시간스윕(time sweep test) 분석 결과이다(frequency 1 rad/sec, strain 0.2%). (B)는 실온의 습한 조건에서 NaIO4 농도의 함수로서 mS3E6S3 및 mE6S3E6의 벌크 접착 강도 테스트 결과로, 모든 샘플은 인산염 버퍼(10mM, pH 5.0)에 용해하였다.
도 16a는 하이드록실화된 mE6S3E6 하이드로겔과 상기 겔의 접착 실패 후 접착 표면의 사진이다. 도 16b는 mE6S3E6 농도 및 NaIO4 농도 함수로서 형성된 하이드로겔의 벌크 접착 강도 테스트 결과이고, 도 16c는 습윤 조건하에서 NaIO4 농도에 따른 mEBP-SBP-EBP 삼중블록 하이드로겔의 벌크 접착 강도 테스트 결과이다. 도 16d는 5 mM NaIO4로 처리한 mE6S12E6 하이드로겔의 유리에 대한 강력한 부착 특성을 확인한 것으로서, 0.5-4kg 하중까지 지지할 수 있다. 모든 샘플은 PBS(10mM, pH 7.4)에 용해하였다.
본 발명에서 용어 "아미노산"은 천연 아미노산 또는 인공 아미노산을 의미하며, 바람직하게는 천연 아미노산을 의미한다. 예컨대 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 글루타민, 아스파라진, 시스테인, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 타이로신 또는 트립토판 등을 의미한다. 상기 아미노산의 성질은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다. 구체적으로 친수성(음전하성 또는 양전하성)을 나타내거나 소수성을 나타내고, 지방족 또는 방향족의 성질도 나타낸다.
본 발명에서는 아미노산 서열을 IUPAC-IUB 명명법에 따라 아래와 같이 약어로 기재하였다.
아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K), 히스티딘(His, H), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 글루타민(Gln, Q), 아스파라진(Asp, N), 메티오닌(Met, M), 루신(Leu, L), 이소루신(Ile, I), 발린(Val, V), 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 시스테인(Cys, C), 아스파르트산(Asp, D) 글루탐산(Glu, E), 노르루신(Nle)
본 발명에서 용어 "폴리펩타이드"란 아미노산의 임의의 중합체 체인을 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 체인을 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "코폴리펩타이드(copolypeptide)"란 공중합체(copolymer)인 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명에서 용어 "상 전이(phase transition)"이란, 물이 수증기로 변하거나 얼음이 물로 변하는 것과 같이, 물질의 상태가 변하는 것을 의미한다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 기본적으로 자극 반응성을 가지는 엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides: EBPs)와 서커린 기반의 폴리펩타이드(suckerin-based polypeptides: SBPs)를 포함하며, 상기 "엘라스틴계 폴리펩타이드"는 "엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ealstin-like polypeptieds: ELP)"라고도 불린다. 본 발명의 기술분야에서 널리 사용되는 용어이다. 상기 EBP에 대한 자세한 설명은 본 발명자의 한국특허공개번호 제2017-0040748호에 자세히 기재되어 있다.
상기 EBP는 전이 온도(transition temperature: Tt)라고도 칭하는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature: LCST)에서 가역 상 전이를 거친다. 이들은, Tt 미만에서 수용성이 크지만, 온도가 Tt보다 높으면 불용성으로 된다. 본 발명에서 EBP 블록의 융합은 다중 블록 코폴리펩타이드의 접착 특성과 함께 열 반응성 특성에 기여한다.
본 발명에서 EBP의 물리화학적 특성들은 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly의 조합에 의해 주로 제어된다. 구체적으로, 그 반복 단위의 3번째 아미노산은 상대적 기계적 특성을 결정한다. 예를 들어, 본 발명에서, 3번째 아미노산인 Gly는 탄력성(elasticity)을, 또는 Ala는 가소성(plasticity) 결정한다. 상기 탄성 또는 가소성은 전이 이후에 나타나는 성질이다.
본 발명에서 상기 Xaa(또는 X)는 "게스트 잔기"라고 칭한다. 상기 Xaa를 다양하게 도입하여 본 발명에 따른 다양한 종류의 EBP를 제조할 수 있다. 한편, 4번째 아미노산인 게스트 잔기 Xaa의 소수성과 펜타펩타이드 반복 단위의 중합화(multimerization)는, 모두, Tt에 영향을 끼친다. 상기 Tt에 따라 EBP는 친수성 또는 소수성을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 EBP는 펜타펩타이드가 반복된 폴리펩타이드일 수 있고, 상기 반복된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 블록(EBP 블록)을 형성할 수 있다.
상기 SBP는 글리신(Gly) 및 티로신(Tyr)이 풍부한 모듈(M2)과 알라닌(Ala) 및 히스티딘(His) 풍부한 모듈(M1)로 구성된 블록 공중합체로 수용액 상에서 β-시트 구조를 형성하여 자가조립되는 특성을 가지며, β-시트의 매우 촘촘한 정렬로 자가조립 나노구조체는 결정 유사 구조를 갖는다. SBP의 M1 도메인은 자가 조립를 유도하는 β-시트 구조를 형성하고 M2 도메인은 비정질 매트릭스를 제공한다. 프롤린(Pro)은 M1의 N 말단에 존재하여 β-시트의 nano-confinement에 관여한다.
본 발명에서 SBP는 Pro-M1-Pro-M2으로 구성되며, Pro-M1-Pro-M2가 반복된 폴리펩타이드일 수 있고, 상기 반복된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 블록(SBP 블록)을 형성할 수 있다.
본 발명은 EBP 블록과 SBP 블록이 융합된 다중 블록 코폴리펩타이드를 제공하며, 상기 코폴리펩타이드가 SBP의 β-시트 구조 형성에 따라 자가 조립된 나노구조체 및 하이드로겔을 제공한다.
본 발명의 다중 블록 코폴리펩타이드에서 SBP 블록의 길이는 다중 블록 코폴리펩타이드의 자가조립으로 형성되는 나노구조체의 직경에 영향을 미친다. SBP 블록의 길이가 길수록 나노 구조체의 직경이 감소하며, 이는 SBP 블록의 길이 증가에 따라 분자내 및 분자간 상호작용을 통한 β-시트 형성이 증가함을 시사한다.
상기 자가 조립된 나노구조체 및 하이드로겔은 그 자체로 표면 부착력을 가지지만, 상기 다중 블록 코폴리펩타이드의 티로신 잔기를 DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine)로 개질하여 각 블록 간 및 분자 간 가교(cross-linking)로 보다 작은 직경의 나노구조체 및 촘촘한 하이드로겔을 제조할 수 있으며, 제조된 나노구조체 및 하이드로겔은 보다 강력한 표면 접착 특성을 나타낸다. 나아가 표면 접착 강도를 보다 향상시키기 위하여 상기 나노구조체 및 하이드로겔에서 DOPA의 산화를 유도할 수 있으며, 이때, DOPA의 산화된 형태인 퀴논(quinone)은 응집력 향상에 관여하는 것으로 알려진 것과 달리 상기 나노구조체 및 하이드로겔의 접착력을 현격하게 강화한다.
본 발명은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드의 제조를 위한 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.
한편, 상술한 바와 같이 접착력이 강화된 DOPA로 개질된 다중 블록 코폴리펩타이드의 제조는 상기 다중 블록 코폴리펩타이드와 버섯 유래의 티로시나아제를 반응시켜 티로신 잔기의 하이드록실화를 유도하여 달성될 수 있으며, 상기 다중 블록 코폴리펩타이드 발현용 벡터가 도입된 재조합 미생물에 티로시나제(tyrosinase)를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 발현벡터가 추가로 도입하여 박테리아 공동 발현 시스템을 통해 달성될 수 있다.
본 발명에서 벡터는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성 일 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환 된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
본 발명의 다중 블록 코폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, colE1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본 발명에서 용어 "형질전환"은 외래 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
본 발명의 숙주 세포는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터가 도입된 재조합 미생물이거나, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 미생물에 도입되어 폴리뉴클레오타이드가 염색체에 통합되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 재조합 미생물을 의미한다. 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 수도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T 안티젠(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
본 발명에서, "co-expression"은 두 개 이상의 유전자가 동시에 발현되는 것을 의미하며, 본 발명에서는 "공동 발현"이라고 표현한다.
또한, 본 발명은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드 발현용 벡터가 도입된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 상기 미생물에 IPTG를 처리하여 다중 블록 코폴리펩타이드의 발현을 유도하는 단계; 및 상기 미생물를 용해하고 ITC(inverse transition cycling)을 수행하여 다중 블록 코폴리펩타이드를 정제하는 단계;를 포함하는 EBP-SBP 다중 블록 코폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다.
또한, DOPA로 개질된 EBP-SBP 다중 블록 코폴리펩타이드의 제조를 위하여 상기 제조방법에서 정제된 다중 블록 코폴리펩타이드와 버섯 유래 티로시나아제를 반응시키는 단계를 추가로 포함시키거나, 상기 배양 미생물을 티로시나아제 발현용 벡터가 추가로 도입된 재조합 미생물로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 SBP의 β-시트 구조 기반으로 상기 다중 블록 코폴리펩타이드의 자가조립으로 제조되는 나노구조체를 제공하며, 상기 나노구조체는 SBP 블록의 길이에 따라 소포(vesicle) 구조 또는 마이셀(micelle) 구조일 수 있고, 상기 나노구조체는 구조적 특성을 이용하여 약물 전달체로 제공되거나 강력한 표면 부착력을 이용하여 접착제 및 생체 본드 제조에 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 SBP의 β-시트 구조 기반으로 상기 다중 블록 코폴리펩타이드의 자가조립으로 제조되는 하이드로겔을 제공하며, 상기 하이드로겔은 강력한 표면 부착력으로 접착제 및 생체 본드의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명에서 코어-쉘 구조는 마이셀 구조를 의미하며, 마이셀은 일반적으로 양친성, 예컨대 친수성기와 소수성기를 동시에 갖는 저분자량의 물질들이 이루는 열역학적으로 안정하고 균일한 구형의 구조를 지칭하는 것이다. 상기 마이셀 구조를 갖는 화합물에 비수용성 약물을 녹여 투입하는 경우 약물은 마이셀 내부에 존재하게 되며, 이러한 마이셀은 체내에서 온도나 pH 변화에 반응하여 표적 지향적 약물방출을 할 수 있으므로, 약물전달용 캐리어로서의 응용 가능성이 대단히 높다고 볼 수 있다. 따라서, 본 발명의 다중 블록 코폴리펩타이드가 자가조립된 나노구조체도 약물전달체로 활용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 다중 블록 코폴리펩타이드가 온도 자극에 의해 블록 폴리펩타이드 간 가교 결합을 형성하여 제조되는 하이드로겔은 실제 조직과 비슷한 기계적 유연함을 가지고 있고, 물을 많이 함유하되, 물에 의해 겔의 결합이 끊어지지 않기 때문에, 수분을 포함하는 젖은 생체 표면과의 접착을 필요로 하고 외부 수분에도 저항성을 가지고 있어야 하는 의료용 접착제 등으로의 응용이 활발하게 이루어지고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 우수한 조직 접착성을 갖는 하이드로겔은 조직 접착제 또는 지혈제, 조직공학용 지지체, 약물 전달 담체, 조직충진제, 상처 치료, 또는 장유착 방지 등의 다양한 생의학적 응용이 가능하다.
본 발명의 생체접착제, 즉 생체 본드 조성물은 현재 시중에서 주로 이용되고 있는 시아노아크릴계 접착제 또는 피브린계 접착제 등을 대체하여, 피부, 혈관, 소화기, 뇌신경, 성형외과, 정형외과 등의 여러 영역에서 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 생체적합성 생체조직접착제는 외과 수술용 봉합사를 대체할 수 있고, 불필요한 혈관을 폐색하는 데 사용될 수 있으며, 안면조직, 연골 등의 연조직과 뼈, 치아 등의 경조직 지혈 및 봉합에 이용될 수 있고, 가정 상비약으로 적용하는 것이 가능하다. 본 발명의 생체적합성 생체접착제 조성물의 다양한 응용 분야를 정리하면 다음과 같다.
일 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 인체의 내부 및 외부 표면에 적용될 수 있으며, 즉 본 발명의 생체접착제는 피부와 같은 인체의 외부 표면 또는 외과수술 과정에서 노출되는 내부기관의 표면 등에 국소적으로 적용될수 있다. 또한, 본 발명의 생체접착제는 조직의 손상된 부분을 접착시키거나 조직에서 공기/유체가 누출되는 것을 봉합하거나, 의료기구를 조직에 접착시키거나 또는 조직의 결함부분을 채우는데 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "생체 조직"은 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 피부, 뼈, 신경, 액손, 연골, 혈관, 각막, 근육, 근막, 뇌, 전립선, 유방, 자궁내막, 폐, 비장, 소장, 간, 정소, 난소, 경부, 직장, 위, 림프절, 골수 및 신장 등을 포함한다.
다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 상처치유(wound healing)에 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생체적합성 생체접착제는 상처에 적용되는 드레싱으로 이용될 수 있다.
또 다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 피부 봉합에 이용될 수 있다. 즉, 본 발명의 생체접착제는 국소적으로 적용되어 상처를 봉합하는 데 이용되어, 봉합사를 대체할 수 있다. 또한, 본 발명의 생체접착제는 탈장 복원에도 적용될 수 있으며, 예를 들어 탈장복원에 이용되는 메쉬의 표면 코팅에 이용될 수 있다.
또 다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 혈관과 같은 관 구조의 봉합 및 누출을 방지하는 데에도 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 생체접착제는 지혈에도 이용될 수 있다.
또 다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 수술 후의 유착방지제로 이용될 수 있다. 유착이란 모든 수술 부위에서 발생하는 것으로 수술 부위의 주변에서 다른 조직들이 상처 주위에 달라붙는 현상이다. 유착은 수술 후 97% 정도 발생을 하며, 특히 그 중에서 5-7%가 심각한 문제를 야기한다. 이러한 유착을 방지하기 위해서 수술시 상처를 최소화 한다거나 소염제를 사용하기도 한다. 또한 섬유소의 형성을 방지하기 위하여 TPA(tissue plasminogen activator)를 활성화하거나 결정성 용액, 고분자 용액, 고체 막 등의 물리적 장벽을 사용하고 있지만 이러한 방법들은 생체 내에서 독성을 나타낼 수 있으며 다른 부작용을 나타낼 수 있다. 본 발명의 생체접착제는 수술 후에 노출된 조직에 적용되어 그 조직과 주위의 조직 사이에 발생되는 유착을 방지하는 데 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 하이드로겔을 포함하는 수술용 봉합사, 조직공학용 지지체 등을 제공한다.
조직공학 기술이란 환자의 조직으로부터 분리된 세포를 지지체에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 인체 내에 이식하는 것을 말하며, 조직공학 기술은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관, 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기의 재생에 적용되고 있다. 본 발명의 생체접착성 하이드로겔은 조직공학 기술에서 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위하여 생체조직과 유사한 지지체(scaffold)를 제공할 수 있다. 또한 본 발명의 지지체를 이용하여 간편하게 인공 세포외 기질을 구현할 수 있으며, 화장품, 상처피복재, 치과용 매트릭스 등의 의료용 소재로도 활용될 수 있다.
본 발명의 하이드로겔에는 인체의 세포나 조직과 상호작용을 통하여 세포의 성장과 분화를 촉진시키고 아울러 조직의 재생과 회복을 도와주는 작용에 관여하는 각종 생리활성물질들이 쉽게 부착될 수 있다. 또한, 상기 생리활성물질은 천연 세포외 기질과 유사하게 유사한 구조의 인공 세포외 기질을 구현하기 위하여 포함될 수 있는 각종 생체분자들을 총칭하기도 한다. 생리활성물질은 세포, 단백질, 핵산, 당, 효소 등을 포함하며, 일 예로 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 단당류, 올리고당류, 지방산, 핵산 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 세포를 들 수 있다. 상기 세포는 원핵세포 및 진핵세포를 포함한 모든 세포일 수 있고, 일 예로 조골세포(osteoblast), 섬유세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neurons), 암세포(cancer cell), B cell, 백혈구세포(white blood cell) 등을 포함한 면역세포 및 배아세포 등일 수 있다. 이 외에도, 생리활성물질은 핵산 물질로서 플라스미드 핵산, 당 물질로서 히아루론산, 헤파린 황산염, 콘드로이틴 황산염, 알진염, 단백질 물질로서 호르몬 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[재료]
pET-21a(+) 벡터 및 BL21(DE3) E. coli 세포는 Novagen Inc.(Madison, Wi)에서 구입하였고, top10 세포는 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하였다. 올리고뉴클레오타이드는 Cosmo Gene Tech (Seoul, South Korea)에서 화학적으로 합성하였다. 열민감성 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)인 FastAP, 제한효소(restriction endonucleases)인 BamHI 및 XbaI는 Fermentas (Ontario, Canada)에서 구입하였고, BseRI 및 AcuI는 New England Biolabs (Ipswich, MA)에서 구입하였다. T4 DNA ligase는 Elpis Bio-tech (Taejeon, South Korea) 구입하였다. DNA miniprep, gel extraction, 및 PCR purification kits는 Geneall Biotechnology (Seoul, South Korea)에서 구입하였다. Dyne Agarose High는 DYNE BIO, Inc. (Seongnam, South Korea)에서 구입하였다. 모든 Top10 세포는 MO BIO Laboratories, Inc. (Carlsbad. CA)에서 구입한 TB DRY 배지에서 배양하였고, BL21 (DE3) 세포는 MP Biomedicals (Solon, OH)에서 구입한 Circle Grow 배지에서 배양하였다. precast gels로 이용된 ready gels (Tris-HCl 2-20%)은 Bio-Rad (Hercules, CA)에서 구입하였고, PBS (Phosphate buffered saline, pH 7.4), 암피실린(ampicillin), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI), 과아이오딘산나트륨(sodium periodate) 및 버섯의 티로시나아제(mushroom tyrosinase)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO)에서 구입하였다.
[실시예]
실시예1. EBP 및 SBP의 단일블록 및 이중 블록 제조를 위한 유전자 구조체 제조
SBP 블록 유전자는 Pro-M1-Pro-M2로 구성되어 있으며, M1 및 M2 블록 유전자를 각각 독립적으로 합성되어 SBP 블록 유전자에 융합 되도록 하였다. M1 및 M2 블록 유전자가 융합된 SBP 블록 유전자를 "Sn"으로 명명하고, 여기서 n은 S1과 Pro-M1-Pro-M2의 반복 횟수를 나타낸다. 펜타펩타이드의 반복 단위인 Ile-Pro-Ala-Xaa-Gly를 포함하는 점착성 EBP 블록, EBP[Y2K4]n, 은 "En"으로 명명하고, 여기서 n은 반복되는 6개의 펜타펩타이드의 수를 의미하고 괄호로 묶인 대문자는 각 펜타펩타이드 유닛에서 4번째 위치에 게스트 잔기 아미노산(Xaa)을 의미하며, 아래 첨자는 펜타펩타이드 반복에서 게스트 잔기의 비율을 의미한다. EBP6-SBPn 이중블록은 "E6Sn"으로 명명하고, 여기서 n은 SBP 블록의 반복 횟수를 나타낸다.
먼저, M1 및 M2 발현 카세트를 각각 별도의 변형된 mpET-21a(+) vector에 삽입한다. 구체적으로 각 블록 유전자의 2개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, 각 뉴클레오티드를 2μM 농도로 포함하는 T4 DNA 리가아제 버퍼 50μL를 95℃에서 2분 동안 가열한 다음 3시간 동안 실온에서 천천히 냉각하여 dsDNA 클로닝 삽입물을 형성시켰다. 이어서, T4 DNA ligase가 포함된 T4 DNA 리가아제 버퍼에 20pmol의 어닐링된 dsDNA과 0.1pmol의 선형화된 mpET-21a(+) 벡터를 혼합하고 16℃에서 30분 동안 반응시켜 BseRI 및 AcuI sticky end를 갖는 변형된 클로닝 삽입물을 선형화된 mpET-21a(+) 벡터에 삽입하였다. 상기 클로닝 벡터를 화학적으로 competent E.Coli Top 10 세포에 형질전환시킨 후, 형질전환 세포를 50 μg/mL의 암피실린이 포함된 SOC 플레이트에 옮겼다. 삽입된 염기서열은 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
이어서, S1 블록 유전자 합성을 위하여, M2 블록 유전자를 포함하는 플라스미드를 XbaI 및 BseRI로 선형화하고 동일한 제한효소로 M1 블록 유전자를 포함하는 플라스미드를 절단하여 M2 블록 유전자를 포함하는 플라스미드에 M1 블록 유전자를 삽입하였다(도 2a). S1 블록 유전자는 필요한 반복 단위가 획득될때까지 RDL을 통해 위와 같은 방법으로 다중화하였다(도 2a(i)). 그리고, E6 블록 유전자를 Sn 블록 유전자를 포함하는 플라스미드에 삽입하여 EBP-SBP 이중 블록 코폴리펩타이드 유전자를 합성하였다(도 2a(ii)). 구체적으로, E6Sn의 자가 조립에 대한 SBP 블록 길이의 영향을 연구하기 위해 세 가지 유형의 이중 블록 코폴리펩티드 유전자, E6S3, E6S6 및 E6S12를 합성하였다.
모든 블록 유전자의 길이는 XbaI 및 BamHI으로 절단 후 아가로스 겔 전기영동 및 DNA 시퀀싱을 수행하여 확인하였으며, 전기영동 결과는 도 2b에 나타내었다. E6Sn 이중 블록 유전자의 크기는 어댑터 서열(66bp)을 포함하여 606bp에서 1650bp까지 다양하게 나타났다. bp 단위의 DNA 표준 마커 크기는 왼쪽에 표시하였으며, E6Sn 이중 블록 유전자의 예상 크기는 겔 이미지의 오른쪽에 표시하였다.
sticky EBP의 유전자 서열은 하기 표 1에 나타내었고, 아미노산 서열은 하기 표 2에 나타내었다. 표 3은 SBP를 구성하는 M1 및 M2 블록의 아미노산 서열이다. 표 4는 이중 블록 코폴리펩타이드의 염기 서열과 EBP-SBP 이중블록의 예상 분자량이다.
EBP[Y2K4] ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC 서열번호 1
EBP[Y3K3]　 ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC 서열번호 2
EBP[Y2K2I2]
　		 ATT CCG GCC TAC GGC ATC CCG GCA AAA GGC ATT CCT GCA ATT GGC ATT CCG GCC TAC GGC ATC CCG GCA AAA GGC ATT CCT GCA ATT GGC 서열번호 3
EBP[Y4K2]
　		 ATT CCG GCC TAC GGC ATC CCG GCA AAA GGC ATT CCG GCC TAC GGC ATT CCG GCC TAC GGC ATC CCG GCA AAA GGC ATT CCG GCC TAC GGC 서열번호 4
EBP[Y2K4] IPAKG IPAYG IPAKG IPAKG IPAYG IPAKG 서열번호 5
EBP[Y3K3] IPAYG IPAKG IPAYG IPAKG IPAYG IPAKG 서열번호 6
EBP[Y2K2I2] IPAYG IPAKG IPAIG IPAYG IPAKG IPAIG 서열번호 7
EBP[Y4K2] IPAYG IPAKG IPAYG IPAYG IPAKG IPAYG 서열번호 8
M1 PGAATVSHTTHHA 서열번호 9
M2 PGYGYGGLLGGLGLHY 서열번호 10
Di-block copolypeptides Nucleotide chain length (bp) M.W (kDa)
E6S3 867 26.3
E6S6 1128 35.0
E6S12 1650 52.2
실시예 2. EBP-SBP 이중 블록 발현 및 정제
상술한 유전자 구조체를 포함하는 플라스미드를 E.Coli BL21(DE3) 세포에 형질전환시키고, 단일 박테리아 콜로니를 50 μg/mL 암피실린이 포함된 10 mL의 CG 배지(1st primary culture)에 접종하고 37℃에서 180 rpm으로 밤새 배양하였다. 상기 배양액을 50㎍/mL 암피실린이 첨가된 CG 배지 400mL를 2L 플라스크에 1차 배양액으로 접종하고 37℃에서 200rpm으로 4시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 배양액 15mL를 50㎍/mL 암피실린이 첨가된 CG 배지 500mL를 2L 플라스크에 2차 배양액으로 접종하고 3시간 동안 배양 후 최종 농도가 1mM이 되도록 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다.
세포는 원심분리를 통해 12시간 후에 수확하고, SBP 블록의 자가 조립을 예방하기 위하여 8M의 요소(urea)가 포함된 5% 아세트산(acetic acid)에 세포 펠렛(pellet)을 현탁하였다. 이어서, 상기 수확된 세포를 얼음 물 속에서 샘플(VC-505, Sonic and materials Inc, Danbury, CT)을 5분 동아 60% 파워(10 sec on, 30 sec off)로 초음파 처리하여 세포 용해물(cell lysis)을 획득하였다. EBP-SBP 이중 블록은 ITC(inverse transition cycling)을 통해 정제되었으며, ITC 수행 중 4℃에서 20분 동안 16,000rpm으로 원심분리하여 세포 파편(cell debris)을 분리하고 수용성 용해물을 새 튜브로 옮겼다. 최종 농도가 2M이 되도록 NaCl을 첨가하여 상전이(phase transition)을 촉발시키고, 응집된 EBP-SBP 이중 블록은 40℃에서 20분 동안 16,000rpm에서 원심분리하여 분리하였다. 정제된 시료는 요소 및 염을 제거하기 위하여 1% 아세트산에 투석하고 동결건조 하였다.
EBP-SBP 이중블록 코폴리펩티드의 순도 및 분자량을 SDS-PAGE로 분석하고, 0.3M 염화구리(copper chloride) 용액으로 염색하였다. 모든 블록 코폴리펩티드는 3-4회 ITC에 의해 성공적으로 정제되었으며, 정제된 블록의 수율은 배양 리터당 > 300mg 이다.
E6 및 E6Sn의 구리 염색 SDS-PAGE 겔 이미지는 도 2c에 나타내었다. 도 2c에 나타난 바와 같이, E6Sn은 예상 분자량(MW)에 따라 이동한 반면 E6은 예상 MW보다 높게 이동함을 확인할 수 있었다. 이는 EBP가 SDS-PAGE에서 예상 MW보다 ~20% 더 크게 실행되기 때문으로 파악된다. 도 2c에서 단백질 표준 크기 마커의 MW는 왼쪽에 표시하였고, 각 블록의 예상 분자량은 오른쪽에 표시하였다.
실시예 3. EBP-SBP 이중 블록에서 티로신 잔기의 하이드록실화
3-1. 버섯 티로시나아제(mushroom tyrosinase)를 이용한 하이드록실화
E6Sn 이중 블록 코폴리펩타이드의 티로신 잔기를 버섯 유래의 티로시나아제(Sigma Aldrich, T3824)를 이용하여 DOPA로 전환하였다. E6Sn 이중 블록 코폴리펩타이드를 10mM 붕산나트륨(sodium borate)을 포함하는 10mM 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼에 현탁하고, 아스코르브산(ascorbic acid)을 이용하여 산도를 pH 5.0으로 조정한 후 버섯 유래 티로시나아제의 최종 농도가 ~20unit/mL가 되도록 첨가하였다. 상기 혼합 용액은 실온(RT)에서 3시간 동안 부드럽게 흔들어 인큐베이션되었다. 티로시나아제가 처리된 E6Sn 이중 블록 코폴리펩타이드는 2M의 NaCl을 첨가하여 상전이 되었고, 티로시나아제 제거를 위해 40℃에서 10분 동안 16,000rpm으로 원심분리하여 정제하였다.
3-2. 박테리아 공동 발현 시스템(bacterial co-expression system)을 이용한 하이드록실화
E. coli 발현 과정에서 박테리아 공동 발현 시스템을 통한 EBP-SBP 이중 블록의 티로신 잔기의 하이드록실화를 수행하였다. EBP-SBP 이중 블록 발현용 pET21a(+) 벡터 또는 orf438을 포함하는 티로시나아제 발현용 pACYC duet vector를 포함하는 BL21(DE3) 세포를 배지에서 배양하여 하이드록실화된 mEBP-SBP 이중 블록을 제조하였다. 응집된 mEBP-SBP 블록 코폴리펩타이드(mEBP-SBPs)를 8M 요소를 포함하는 5% 아세트산 용액에 현탁시키고 4℃에서 15분 동안 16,000rpm으로 원심분리하여 불용성 오염물을 제거하였다. DOPA의 산화를 방지하기 위하여 mEBP-SBPs를 1% 아세트산 용액에 투석하고 동결건조하였다.
하이드록실화된 mEBP-SBP 이중 블록 코폴리펩티드는 mE6Sn으로 명명한다.
3-3. SDS-PAGE 및 NBT/Glycinate 염색 수행
DOPA로 개질된 코폴리펩타이드 및 이중 블록 코폴리펩타이드를 SDS-PAGE를 수행하여 확인하였다. 도 3(A)에서 확인할 수 있는 바와 같이 E6과 E6S3은 DOPA 형성 후 SDS-PAGE에서 예상 MW보다 크게 이동하였다. 이어서, DOPA의 변형은 산화환원 순환에 의한 NBT/Glycinate 염색을 수행하여 구체적으로 확인하였다. 도 3(B)는 NBT/Glycinate 염색 결과로, 보라색으로 염색된 E6Sn의 하이드록실화와 노란색으로 염색된 대조군으로 수산화되지 않은 블록 코폴리펩티드를 확인할 수 있다.
실시예 4. EBP-SBP 이중 블록 코폴리펩타이드의 특성 확인
폴리펩타이드의 상전이는 0.5M NaCl이 포함된 인산염 버퍼(10mM, pH 5.0)에서 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 1℃/min 가열 속도에서 온도 함수로 10℃에서 90℃ 범위에서 350nm에서 흡광도(OD350)를 측정하여 특성화하였다. LCST cloud point는 온도(d(OD)/dT)의 함수로서 turbidity의 1차 도함수가 최대인 온도로 계산하였다. 그 결과, E6Sn의 열적 특성은 도 4(A)에서 확인할 수 있는 바와 같이, E6S3, E6S6 및 E6S12의 LCST는 각각 81℃, 46℃ 및 23℃임을 알 수 있었다.
이어서, 실온에서 DLS(dynamic light scattering)을 이용하여 인산염 버퍼(10 mM, pH 5.0)에 포함된 25 μM 농도의 E6Sn 및 하이드록실화된 mE6Sn 이중 블록의 유체역학적 반경(Hydrodynamic radius, Rh)을 측정하여 이중 블록 코폴리펩타이드의 자가 조립을 확인하였으며, E6Sn 시리즈의 티로신 잔기 변형 전/후의 이중블록으로 자가조립된 구조체에서 측정된 Rh값을 하기 표 5에 정리하였다.
Figure PCTKR2021011329-appb-img-000001
그 결과, E6S3, E6S6 및 E6S12 나노구조체의 유체역학적 반경(Rh)은 각각 266.7 ± 47.97 nm, 238.5 ± 41.72 nm 및 140.8 ± 14.14 nm이고, 각 나노구조체의 크기는 SBP 블록 길이가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있다(도 4(B)). 이는 SBP 블록의 길이가 증가함에 따라 분자 내 및 분자간 상호작용을 통해 SBP 블록의 β-시트 형성이 잠재적으로 증가할 수 있음을 시사한다. 한편, 티로신 잔기의 하이드록실화로 DOPA가 형성된 mE6S3, mE6S6 및 mE6S12의 평균 Rh는 각각 192.1 ± 12.00 nm, 109.4 ± 17.54 nm 및 100.6 ± 5.18 nm로 DOPA 형성 후 mE6Sn 나노구조체의 크기가 감소함을 알 수 있다. 이는 정제과정에서 DOPA가 도파퀴논(dopaquinone)으로 산화됨에 의한 것으로 추정된다.
샘플은 광산란 측정 전에 10분 동안 평형화되도록 유지하였으며, 각 온도에서 11번 측정하였다.
이어서, DLS를 통해 관찰된 나노구조체를 확인하기 위하여 투과 전자 현미경(transmission electron microcopy, TEM) 및 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy, SEM) 분석을 수행하여 자가 조립을 통해 형성된 나노 구조체를 이미지화하였다. TEM 이미지는 80~200kV의 가속 전압에서 작동되는 JEM-2100F FE-STEM(JEOL, Germany)을 사용하여 탄소 코팅된 TEM 그리드를 25μM의 샘플에 담그고 여과지로 건조하고 2% 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid, PTA)으로 음성 염색하고 촬영하였다. TEM 이미지는 티로신 잔기를 DOPA로 변형하기 전/후로 촬영하였으며, TEM 이미지에서 무작위로 선택된 15개의 구조체를 측정하여 E6Sn 및 하이드록실화된 mE6Sn의 자기조립된 나노구조체의 평균 크기를 결정하였다.
그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, E6S3 및 하이드록실화된 mE6S3 나노구조체의 평균 크기는 각각 237.4 ± 20.76 nm 및 140.5 ± 50.48 nm이고, E6S6 및 mE6S6 나노구조체의 평균 크기는 각각 260.78 ± 10.59 nm 및 200.26 ± 15.62 nm이고, E6S12 및 mE6S12 나노구조체의 평균 크기는 각각 170.32 ± 5.72 nm 및 70.29 ± 20.40 nm으로, SBP 블록의 길이가 증가할수록 자가조립된 나노구조체의 크기가 점진적으로 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 SBP 블록을 구성하는 β 시트의 높은 밀도의 패킹에 의한 것으로 파악된다. 또한, 티로신 잔기의 도파민으로 변형은 파이-양이온 분자 상호작용(pi-cation molecular interactions) 강화를 유도하여 자가조립 나노구조체의 크기를 감소시켰으며, 이는 DLS 분석과 일치하는 결과이다. 모든 이미지는 PTA로 염색된 흰색 소포층을 명확하게 보여준다.
SEM(VEGA-SB3; TESCAN, Czech Republic)으로 특성화를 위하여, 3μL의 샘플을 실리콘 웨이퍼에 떨어뜨리고 실온에서 건조시켰다. SEM 이미지는 0.5-30 kV에서 집중된 빔으로 촬영되었으며 샘플은 K575X Turbo Sputter Coater(Emitech Ltd, Ashford, UK)를 사용하여 얇은 전도성 백금 층으로 코팅되었다.
SEM 이미지는 도 6에 나타내었으며, SBP 블록의 β 시트 유도 자기 조립을 통한 E6Sn 및 하이드록실화된 mE6Sn의 나노구조체에서 SBP 및 EBP 블록의 티로신 변형은 자가 조립에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다. SBP 블록 길이에 따른 E6Sn 나노구조체의 평균 크기는 각각 787 ± 233 nm, 649 ± 120 nm, 및 636 ± 148 nm로, SEM 이미지 통계도 DLS 분석과 일치하였다.
SEM 및 TEM 이미지는 상온에서 티로신 잔기를 DOPA로 변형하기 전/후의 EBP-SBP 이중 블록 나노구조체들에 대해 촬영되었습니다. TEM 및 SEM 이미지를 무작위로 선택하여 나노 구조체의 평균 크기를 분석하였다.
실시예 5. 하이드록실화된 mEBP-SBP 이중블록 나노구조체의 표면 부착력 확인
하이드록실화된 mEBP-SBP 이중 블록의 부착성을 시각화하기 위해 EBP 블록의 라이신 잔기를 FITC로 표지하였다. mEBP-SBP 이중 블록을 8 M 요소가 포함된 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 완충액에 용해시키고 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 용해된 FITC를 1:1 몰 농도 비율로 용액에 적가 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하여 반응시키고, 3M NaCl을 첨가하여 반응을 중단시켜 mEBP-SBP 이중블록의 응집을 유도하였다. 응집된 mEBP-SBP를 8M 요소와 함께 5% 아세트산에 용해시킨 다음 ITC로 정제하여 유리 FITC를 제거하였다. FITC로 표지된 mEBP-SBP 이중 블록을 인산염 버퍼(10mM, 5.0 pH)에 1일 동안 투석하여 자가 조립된 나노구조체를 제조하였다. EBP-SBP 이중 블록의 자가 조립된 나노구조체의 팽창된 상태(swollen state)는 명시야 및 형광 모드에서 공초점 레이저 스캐닝 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM)에 의해 확인되었다. mEBP-SBP 이중 블록의 표면 접착력을 확인하기 위해, 투석 후 mEBP-SBP 이중 블록을 슬라이드 글라스에 떨어뜨리고 실온에서 1시간 배양한 다음 샘플 용액이 있는 유리 표면을 인산염 버퍼(10mM, pH 5.0)로 3회 세척하였다.
CLSM을 이용한 명시야 이미지(도 7(A1, A2))에서 확인할 수 있는 바와 같이, SBP 블록의 β-시트 형성과 팽창된 상태의 수화된 EBP 블록으로 하이드록실화된 mE6Sn은 자가조립하여 소포체 구조의 자가조립체를 형성하였고, mE6S3는 팽윤 상태에서 평균 1.02 ± 0.21 mm 크기의 소포 구조를 형성하였다. 또한 도 7(B1, B2)에서 확인할 수 있는 바와 같이, mE6S3의 자가조립 나노구조체는 인산염 버퍼로 세척한 후에도 슬라이드 글라스에 부착되었는 바, mE6S3에서 EBP 블록의 DOPA 잔기에 의해 표면 접착성이 증가됨을 알 수 있었다.
FITC가 표지된 mE6S3의 형광 이미지는 도 8에 나타내었다. FITC는 1:1 몰비의 FITC와 점착성 EBP 블록의 라이신 잔기에 접합되어 mE6S3에 표지되었으며, 도 8(A)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 팽윤 상태에서 FITC가 화학적으로 표지된 mE6S3 나노구조체의 평균 직경은 0.84 ± 0.13 mm이고, 도 8(B)에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 나노구조체는 인산염 버퍼로 세척한 후에도 슬라이드 글라스 표면에 남아 있어 강한 부착력을 가짐을 알 수 있었다. 이는 나노구조체 쉘에 노출된 점착성 EBP 블록에 의한 것임을 알 수 있다.
실시예 6. EBP-SBP 삼중 블록 유전자 구조체 제조
ABA 및 BAB의 두 가지 유형의 EBP-SBP 삼중블록 유전자를 RDL(recursive directional ligation)으로 합성하였다. 각각의 경우 SnEnSn 및 EnSnEn 삼중 블록 유전자는 도 10a 및 도 10b 방법으로 EBP-SBP 이중 블록 유전자를 먼저 합성한 다음 EBP-SBP 삼중 블록 유전자를 준비하였다.
구체적으로, ABA-type tri-block 합성에서 En 유전자를 포함하는 플라스미드를 XbaI 및 AcuI으로 절단하였고, XbaI 및 BseRI에 의해 선형화된 Sn 유전자가 인코딩된 플라스미드에 삽입하여 EnSn 이중 블록 유전자를 포함하는 플라스미드를 형성하고, XbaI 및 AcuI로 절단된 Sn 유전자를 포함하는 플라스미드를 XbaI 및 BseRI에 의해 선형화된 EnSn 이중블록 유전자에 삽입하여 SnEnSn 삼중블록 유전자를 포함하는 플라스미드를 제작하였다. 마찬가지로, BAB tri-block 합성에서도 En 유전자를 포함하는 플라스미드에 Sn 유전자를 삽입한 후, SnEn 유전자를 포함하는 플라스미드에 En 유전자를 삽입하여 EnSnEn 삼중블록 유전자를 제조하였다. EBP-SBP 이중 블록과 마찬가지로, SBP 및 EBP 블록 길이에 따른 나노구조체의 특성 변화를 확인하기 위하여 S3E6S3, S6E6S6, E6S3E6 및 E6S12E6을 제작하였다.
각 유전자의 크기는 XbaI 및 BamHI로 절단 후 DNA 아가로스 겔 전기영동 및 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다. 전기영동 결과는 도 10c 및 도 10e에 나타내었다. S3E6S3, S6E6S6, E6S3E6, 및 E6S12E6 유전자의 길이는 어댑터 서열(66bp)를 포함하여 각각 1128, 1650, 1407, 및 2190 (bp)이다. 도 10c 및 도 10e의 왼쪽에는 bp 단위의 DNA 표준 마커 크기를 표시하였으며, 오른쪽에는 각 블록 유전자의 예상 크기를 표시하였다. 하기 표 6은 삼중 블록 코폴리펩타이드의 유전자 길이와 EBP-SBP 삼중 블록의 예상 분자량이다.
Tri-block copolypeptides Nucleotide chain length (bp) M.W (kDa)
S3E6S3 1128 34.79
S6E6S6 1650 52.15
E6S3E6 1407 43.32
E6S12E6 2190 69.39
실시예 7. EBP-SBP 삼중 블록 발현, 정제 및 EBP-SBP 삼중 블록에서 티로신 잔기의 하이드록실화EBP-SBP 삼중 블록 발현용 플라스미드를 E.Coli BL21(DE3) 세포에 형질전환시키고, 실시예 2와 동일하게 삼중 블록의 발현 유도 및 정제를 수행하였고, EBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩타이드의 순도와 분자량은 0.3M 염화구리(copper chloride) 용액으로 염색하고 SDS-PAGE를 수행하여 확인하였다.
모든 삼중 블록 코폴리펩티드는 3-4회 ITC에 의해 성공적으로 정제되었으며, 정제된 블록의 수율은 배양 리터당 > 170mg 이다.
S3E6S3, S6E6S6, E6S3E6, 및 E6S12E6의 구리 염색 SDS-PAGE 겔 이미지는 도 10d 및 도 10f에 나타내었으며, 각 SDS-PAGE 겔 이미지의 왼쪽에는 단백질 표준 크기 마커의 MW를 표시하였고, 오른쪽은 각 블록의 예상 분자량을 표시하였다. 모든 삼중 블록은 예상 분자량(MW)과 일치하는 이동상을 나타내었다.
또한, 실시예 3과 동일한 방법으로 정제된 EBP-SBP 삼중 블록에서 티로신 잔기를 버섯 티로시나아제 또는 박테리아 공동 발현 시스템을 이용하여 하이드록실화하여 DOPA로 변형하고, SDS-PAGE 및 NBT/Glycinate 염색을 수행하여 확인하였다. 박테리아 공동 발현 시스템을 이용한 DOPA로 개질된 EBP-SBP 삼중 블록은 EBP-SBP 삼중 블록 발현용 pET21a(+) 벡터 또는 orf438을 포함하는 티로시나아제 발현용 pACYC duet vector를 포함하는 BL21(DE3) 세포를 동일 배지에서 배양하여 수득하였다.
mEBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩티드는 mSnEnSn 또는 mEnSnEn으로 명명한다.
도 11(A)에서 확인할 수 있는 바와 같이, DOPA 개질된 EBP 블록이 개질 전보다 더 큰 분자량으로 이동하는 것으로 알려져 있는 것과 달리, S3E6S3 및 E6S3E6 삼중 블록은 DOPA 개질 전후 모두 유사한 이동상을 보여주었다. 이러한 차이는 EBP-SBP 이중 블록에서 관찰된 바와 같이 분자량에 따른 것으로 예상된다. DOPA로의 개질은 산화환원 순환을 이용한 NBT/Glycinate 염색 결과에 의해 구체적으로 확인되었다. 도 11(B)에서 mS3E6S3 및 mE6S3E6는 보라색으로 염색되었으며, S3E6S3 및 E6S3E6은 노란색으로 염색된 것을 확인할 수 있다.
실시예 8. EBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩타이드의 특성 확인
실시예 4와 동일하게 EBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩타이드의 상전이 열적 특성과 유체역학적 반경을 측정하고, TEM 및 SEM 촬영을 통해 구조적 특성을 확인하였다.
E6SnE6의 열적 특성은 도 12 (A) 및 (B)에 나타내었으며, 도 12(A)에서 확인할 수 있는바와 같이 E6S3E6의 LCST는 90℃ 이상이고 E6S12E6의 LCST는 55 ℃로 나타났다. E6S3E6의 LCST를 특성화하기 위해 0.5M NaCl이 보충된 PBS를 사용하여 LCST를 감소시켰다. 도 12(B)는 0.5M NaCl이 보충된 PBS에서 E6S3E6의 LCST가 80℃임을 보여준다. 친수성 EBP 말단 블록의 붕괴에 의해 유도된 LCST는 소수성 SBP 블록 길이가 증가함에 따라 감소하였다.
β-시트 형성을 통한 E6S3E6 및 E6S12E6의 자가 조립은 도 12 (C) 및 (D)와 같이 실온에서 DLS 측정을 통해 특성화하였다. E6S3E6 및 E6S12E6 나노구조물의 유체역학적 반경(Rh)은 검은색 막대로 표시된 것처럼 8M 요소가 보충된 5% 아세트산에서 각각 6.34 ± 0.32 nm 및 7.20 ± 0.84 nm로 확인되었다. 한편, PBS(10mM, pH 7.4)으로 투석한 경우 E6S3E6과 E6S12E6의 SBP 중간 블록의 β 시트 형성을 통해 평균 Rh가 125.45 ± 15.26 및 17.65 ± 1.78 nm인 자기조립 나노구조체를 명확하게 나타내었으며, 이는 도면에서 빨간색 막대로 표시하였다. 상기 결과를 통해 E6SnE6 나노구조체의 크기는 SBP 블록 길이가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있었으며, 이는 SBP 길이가 증가하면 분자내 및 분자간 상호작용을 통해 SBP 블록의 β-시트 형성이 잠재적으로 증가할 수 있음을 시사한다.
TEM 이미지는 DLS에 의해 관찰된 나노구조체를 특성화하기 수행되었다. 도 13 (A) 및 (B)에 TEM 이미지로 확인되는 바와 같이 E6S3E6 자가조립 나노구조체의 평균 크기는 190.26 ± 50.68 nm이고 PTA로 염색된 층이 있는 소포 구조의 나노입자임을 확인할 수 있었다. 대조적으로 E6S12E6의 자가조립 나노구조체의 평균 직경은 15.38 ± 2.68 nm으로 마이셀구조(micellar nanostructure)로 확인되었다(도 13 (C) 및 (D)). 상기로부터 SBP 블록 길이의 증가에 따라 임계 패킹 밀도(critical packing density) 차이에 의하여 나노구조체는 상이한 물리적 특성을 나타냄을 알 수 있다.
실시예 9. 하이드록실화된 mEBP-SBP 삼중 블록 나노구조체의 표면 부착력 확인
mEBP-SBP 삼중 블록의 부착성을 시각화하기 위해 EBP 블록의 라이신 잔기를 FITC로 표지하였다. mEBP-SBP 삼중 블록을 8 M 요소가 포함된 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 완충액에 용해시키고 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 용해된 FITC를 1:1 몰 농도 비율로 용액에 적가 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하여 반응시키고, 3M NaCl을 첨가하여 반응을 중단시켜 mEBP-SBP 삼중 블록의 응집을 유도하였다. 응집된 mEBP-SBP 삼중 블록을 8M 요소와 함께 5% 아세트산에 용해시킨 다음 ITC로 정제하여 반응하지 않은 FITC를 제거하였다. FITC로 표지된 mEBP-SBP 삼중 블록을 PBS(10mM, pH 7.4)에 1일 동안 투석하여 자가 조립된 나노구조체를 제조하였다. mEBP-SBP 삼중 블록의 자가 조립된 나노구조체의 팽창된 상태(swollen state)는 형광 모드에서 공초점 레이저 스캐닝 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM)에 의해 확인되었다. mEBP-SBP 삼중 블록의 표면 접착력을 확인하기 위해, 투석(dialysis)한 mEBP-SBP 삼중 블록 용액을 슬라이드 글라스에 떨어뜨리고 실온에서 1시간 배양한 다음 샘플 용액이 있는 유리 표면을 PBS(10mM, pH 7.4)로 3회 세척하였다.
CLSM을 이용한 형광 이미지(도 14(A))에서 확인할 수 있는 바와 같이, SBP 블록의 β-시트 형성과 팽창된 상태의 수화된 EBP 블록으로 mE6S3E6은 자가조립하여 소포체 구조의 자가조립체를 형성하였고, mE6S3E6는 팽윤 상태에서 평균 0.83 ± 0.23 mm 크기의 소포 구조를 형성하였다. 또한 도 14(B)에서 확인할 수 있는 바와 같이, mE6S3E6의 자가조립 나노구조체는 PBS로 세척한 후에도 슬라이드 글라스에 부착 되었는바, mE6S3E6에서 EBP 블록의 DOPA 잔기에 의해 접착성이 형성됨을 알 수 있었다.
실시예 10. 벌크 스케일에서 하이드록실화된 mEBP-SBP 삼중 블록 나노구조체의 표면 부착력 확인
동적 진동수 변화 시험(Dynamic frequency sweep test)은 4℃, 각 주파수 범위 0.1 ~ 10 rad/sec에서 선형 점탄성 (Viscoelasticity) 영역 내에서 수행되었으며, 화학적 가교의 유변학적 거동은 시간 종속 유변학적 (Rheology) 방법으로 특성화하였다. PBS (10 mM, pH 7.4)에서 가교 역학(cross-linking kinetics)을 측정하기 위해 5mM NaIO4 용액을 30wt%의 mEBP-SBP 삼중 블록과 함께 4℃에서 균일하게 혼합하고, 혼합 용액을 고정 온도에서 평형을 이룬 펠티에 플레이트(peltier plate)로 옮겼다. 겔 형성에 대응하는 탄성(elastic modulus) 및 손실 계수(loss modulus)의 변화는 58 mm 간격의 40 mm 콘 플레이트(cone plate)를 이용하여 진동 모드(oscillatory mode)에서 모니터링 하였다. mS3E6S3 및 mE6S3E6의 탄성 계수 (G') 및 손실 계수 (G")는 겔화 동안 산화를 위하여 NaIO4를 첨가한 후 일정한 변형률 및 주파수에서 측정하였다.
도 15 (A)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 5mM NaIO4를 사용한 mS3E6S3의 겔화 시간은 4℃에서 15분 미만이었다(frequency 1 rad/sec, strain 0.2%). 반면, mE6S3E6는 G" 보다 높은 G'을 나타내어 SBP 블록의 β-시트 형성과 NaIO4 유도의 산화에 의하여 순간적으로 화학적 및 물리적으로 가교된다.
이어서, mEBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩타이드의 벌크 접착 강도 측정을 위하여 Lap shear test를 수행하였다. 구체적으로, 알루미늄 고정물을 mEBP-SBP 삼중 블록의 피착체로 선택하고 접착 표면을 아세톤, 에탄올 및 탈이온수에 각각 15분 동안 담구어 헹구었으며, 재사용을 위하여 건조하였다. mEBP-SBP 삼중블록은 10mM PBS에 30wt%로 용해시키고, 각 용액을 알루미늄 피착체에 직접 올려 다양한 농도의 NaIO4와 혼합하였다. 피착체를 다른 피착체로 덮어 10mm × 10mm의 중첩 영역을 형성하고 60g 중량을 가하여 실온 공기 중에서 30분 동안 경화시킨 후 25℃ PBS에 침지시켜 세척하였다. 각 샘플은 범용 시험기(INSTON 3365; Norwood, MA)을 이용하여 cross-head 속도 5mm/min 및 통상적인 조건하에서 Lap shear test 되었다. mEBP-SBP 삼중 블록의 습윤 접착 강도(wet adhesive strength)는 파손 직전의 거리 대 힘 플롯의 측정된 최대 값으로부터 계산되었다.
도 15(B)는 화학적 가교제인 NaIO4의 농도에 따른 mS3E6S3와 mE6S3E6의 접착강도를 나타낸 것으로 각각의 하이드로겔에서 가교도와 벌크 접착 강도 사이의 관계를 보여준다. DOPA는 수소 결합 및 알루미늄 표면과의 배위 결합을 통해 표면 접착력을 부여하는 반면, DOPA의 산화된 형태인 퀴논(quinone)은 응집력을 위한 분자 내 및 분자간 가교를 유도하는 것으로 알려져 있다. mS3E6S3 및 mE6S3E6 하이드로겔 모두 NaIO4의 화학적 가교에 의하여 접착력 보다는 응집력이 증가될 것으로 예상되었으나, mS3E6S3의 벌크 접착 강도는 NaIO4의 농도가 0-10mM 범위에서 증가함에 따라 0.10 MPa에서 0.96 MPa로 크게 증가했으며, 이는 DOPA의 산화된 형태인 퀴논에 의해 유도된 분자 내 및 분자간 가교 결합이 증가했음을 시사한다. 마찬가지로 mE6S3E6의 벌크 접착 강도 또한 NaIO4의 처리 농도 증가에 따라 1.04 MPa에서 4.17 MPa로 크게 증가하였다.
도 16a는 벌크 접착 강도를 제어하기 위해 10mM PBS에 용해된 mEBP-SBP 삼중 블록 용액을 알루미늄판 위에 로드한 사진으로 NaIO4 처리로 자가조립된 mEBP-SBP 삼중 블록 하이드로겔을 피착체에 로드하였다. 각 피착제는 표면에 갈색을 띠는데 이는 하이드로겔이 표면에 부착되는 반면 그 부착 실패를 유도하는 하이드로겔의 깨짐을 나타낸다.
도 16b 및 도 16c에서 확인할 수 있는 바와 같이, mEBP-SBP 삼중 블록 하이드로겔의 접착 강도 테스트 결과는 mEBP-SBP 삼중 블록의 농도 증가가 접착 특성을 크게 강화시킴을 보여준다. 이는 DOPA 잔기 농도 증가와 NaIO4 산화를 통한 DOPA의 화학적 가교에 의한 것으로 보인다.
이어서, mEBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩티드의 로딩 테스트는 유리 표면을 접착물로 사용하여 수행되었다. mEBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩티드 용액을 유리 표면에 떨어뜨리고 0.5kg에서 4.0kg 범위의 다른 무게를 가진 카운터 유리로 부착하였다. 하중 지지 능력을 테스트하기 위해 mEBP-SBP 삼중 블록 코폴리펩티드 하이드로겔이 있는 유리를 들어올리고 있는 이미지를 사진으로 촬영하였다.
도 16d 에서 확인할 수 있는 바와 같이, 최적화된 블록 길이의 mEBP-SBP 삼중 블록 하이드로겔은 0.5~6.0MPa 범위의 제어된 접착 특성을 보여 0.5kg~4.0kg의 하중 지지력을 나타내었다. 상기로부터, SBP 블록의 β-시트 형성과 NaIO4 산화를 통한 DOPA의 화학적 가교가 자가조립된 하이드로겔의 접착 특성 뿐만 아니라 기계적 특성도 향상시킴을 시사한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 다중 블록 코폴리펩타이드는 온도 및 pH 의존성 상변이 특성과 자가조립 특성으로 약물전달체로 이용될 수 있으며, 강력한 표면 부착력으로 접착제, 특히 생체 접착제로 이용될 수 있다.

Claims (20)

  1. 서커린 기반 폴리펩타이드 (suckerin-based polypeptide, SBP); 및
    점착성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 (sticky elastin-based polypeptide, EBP)를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드 (multiblock copolypeptide)로서,
    상기 SBP는 티로신(Y)을 포함하고,
    상기 EBP는 티로신(Y) 및/또는 리신(K)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 티로신(Y)은 3,4-디하이드록시페닐아민(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)으로 변형된 것을 특징으로 하는, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 다중 블록 코폴리펩타이드는 (SBP)n(EBP)m; (EBP)m(SBP)n; (SBP)n(EBP)m(SBP)n; 및 (EBP)m(SBP)n(EBP)m으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배열로 구성되며,
    상기 n 및 m은 1 이상의 정수이고, n은 SBP의 반복 횟수이며, m은 EBP의 반복 횟수인, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 EBP는 하기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 다중 블록 코폴리펩타이드.
    [식 1]
    [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG]m
    상기 식 1에서,
    상기 m은 1 이상의 정수이고, 상기 식 1의 반복 횟수이고;
    상기 X는 티로신(Y), 리신(K), 및 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상임.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 식 1에서 m은 6이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는,
    티로신(Y), 리신(K)이 2:4의 비율로 이루어지거나,
    티로신(Y), 리신(K)이 3:3의 비율로 이루어지거나,
    티로신(Y), 리신(K), 이소루신(I)이 2:2:2의 비율로 이루어지거나,
    티로신(Y), 리신(K)이 4:2의 비율로 이루어진 것을 특징으로 하는, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 SBP는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  7. 제1항의 다중 블록 코폴리펩타이드를 암호화하는 유전자.
  8. 제6항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  9. 제6항의 유전자 또는 제7항의 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 티로시나제(tyrosinase)를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 발현벡터가 추가로 도입되어 공동 발현되는 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  11. (1) 제9항 또는 제10항의 재조합 미생물을 배양하여 다중 블록 코폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및
    (2) 상기 재조합 미생물을 용해하고 ITC(inverse transition cycling)을 통해 상기 다중 블록 코폴리펩타이드를 정제하는 단계;를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 제조방법은 (2) 단계 이후에 (3) 정제된 다중 블록 코폴리펩타이드를 버섯 유래 티로시나아제와 접촉시켜 티로신 잔기를 3,4-디하이드록시페닐아민(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 변형시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 블록 코폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 다중 블록 코폴리펩타이드가 서커린 기반 폴리펩타이드 (suckerin-based polypeptide, SBP)의 β-시트 구조 기반으로 자가조립되어 형성되는 나노구조체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 나노 구조체는 소포 구조 또는 마이셀 구조인 것을 특징으로 하는, 나노 구조체.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 나노 구조체는 NaIO4 유도의 산화로 블록 폴리펩타이드간 가교 결합이 형성된 것을 특징으로 하는, 나노 구조체.
  16. 제13항의 나노 구조체를 포함하는 약물 전달체.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 다중 블록 코폴리펩타이드가 서커린 기반 폴리펩타이드 (suckerin-based polypeptide, SBP)의 β-시트 구조 기반으로 자가조립되어 형성되는 하이드로겔.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 NaIO4 유도의 산화로 블록 폴리펩타이드간 가교 결합이 형성되어 표면 접착력이 강화된 것을 특징으로 하는, 하이드로겔.
  19. 제18항의 하이드로겔을 포함하는 접착용 조성물.
  20. 제17항의 하이드로겔을 포함하는 생체 접착제 조성물.
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