WO2022024902A1 - 変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質 - Google Patents

変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質 Download PDF

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淳文 尾添
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Definitions

  • This disclosure relates to mutant insect olfactory receptor proteins and the like.
  • odor markers have low concentrations, so it is desirable to create highly active olfactory receptors.
  • amino acid sites in the olfactory receptor change the selectivity of permeating ions by being replaced.
  • the present inventor has improved the response activity to chemical substances by introducing mutations at specific sites in the insect olfactory receptor protein so as to satisfy specific conditions. I found that I could do it.
  • the present inventor has completed the invention of the present disclosure as a result of further research based on this finding. That is, the present disclosure includes the following aspects.
  • Item 1 Mutant insect olfactory receptor protein, General formula (1) in the corresponding wild-type insect olfactory receptor protein: ⁇ 7 X 1 X 2 Z 1 X 3 X 4 Z 2 Z 3 ⁇ 6 U ⁇ 5 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 2 ⁇ 1 X 5 X 6 [In the formula, X 1 to X 6 and Z 1 to Z 3 indicate amino acids derived from the amino acid sequence of the wild-type insect olfactory receptor, ⁇ 1 indicates a hydrophobic amino acid, and ⁇ 2 to ⁇ 7 are independent of each other. Indicates an uncharged polar amino acid or a hydrophobic amino acid, and U indicates an uncharged polar amino acid.
  • X 1 and X 2 are positively charged polar amino acids in the amino acid sequence A, X 1 and / or X 2 are substituted in the amino acid sequence B, and X 1 is an uncharged polar amino acid. And / or X 2 is a hydrophobic amino acid, Satisfy at least one of the conditions selected from the group consisting of Mutant insect olfactory receptor protein.
  • Item 2 The mutant insect olfactory receptor protein according to Item 1, wherein X 3 is isoleucine or leucine and / or X 4 is serine or asparagine, which satisfies the above condition 1.
  • Item 3 The mutant insect olfactory receptor protein according to Item 1 or 2, wherein the condition 2 is satisfied and X 6 is an uncharged polar amino acid.
  • Item 4. The mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 3, wherein the condition 2 is satisfied and X 6 is serine or threonine.
  • Item 5 The mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 4, wherein X 1 is serine or glutamine and / or X 2 is alanine, which satisfies the above condition 3.
  • Item 6 In condition 1, X 3 is isoleucine or leucine and / or X 4 is serine or asparagine. In condition 2, X 6 is serine or threonine, Item 6.
  • the mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 5, wherein X 1 is serine or glutamine and / or X 2 is alanine under condition 3.
  • Item 7. The following conditions 1A to 3A: (Condition 1A) In the amino acid sequence B, X 3 is a branched chain amino acid and / or X 4 is an uncharged polar amino acid. (Condition 2A) In the amino acid sequence B, X 6 is an amino acid other than a positively charged polar amino acid, and (Condition 3A) in the amino acid sequence B, X 1 is an uncharged polar amino acid and / or X 2 is. Being a hydrophobic amino acid, Satisfy at least one of the conditions selected from the group consisting of Item 4. The mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 6.
  • Item 8 The mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 7, wherein the amino acid sequence A is a sequence contained on the C-terminal side of the amino acid sequence of the wild-type insect olfactory receptor protein.
  • Item 9 The mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 8, wherein the wild-type insect olfactory receptor protein is a wild-type olfactory receptor protein of an inner winged insect.
  • Item 10 A polynucleotide comprising the coding sequence of the mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 9.
  • Item 11 A cell containing the polynucleotide according to Item 10.
  • Item 12 A non-human animal containing the cell according to item 11.
  • Item 13 A chemical substance detection element comprising the mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 9.
  • Item 13A Use of the mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 9 as a chemical substance detection element.
  • Item 13B Use of the mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 9 for manufacturing a chemical substance detection element.
  • Item 14 A chemical substance detection sensor comprising a lipid bilayer membrane including the chemical substance detection element according to Item 13, a cell, or a non-human animal containing the cell.
  • Item 14A Use as a chemical substance detection sensor for a lipid bilayer containing the mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 9, a cell, or a non-human animal containing the cell.
  • Item 14B Use for producing a chemical substance detection sensor for a lipid bilayer, a cell containing the mutant olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 9, or a non-human animal containing the cell.
  • Item 15 The term comprises contacting a chemical substance with the mutant insect olfactory receptor protein according to any one of Items 1 to 9, the chemical substance detection element according to Item 13, or the chemical substance detection sensor according to Item 14. Chemical substance detection method.
  • the measurement results of the chemical substance (pentylacetate) response activity of the Drosophila olfactory receptor 47a and its mutant are shown (Test Example 1).
  • the olfactory receptors are wild type (Comparative Example 1-1), mutant type (RX 4 S, Example 1-1), mutant type (VX 3 L-RX 4 S, Example 1-2), The order is the mutant type (VX 3 L-RX 4 S + alpha, Example 1-3).
  • ".” Indicates that the amino acid is the same as that of the wild type (mutation is not introduced).
  • the concentration of the test substance in the culture solution is shown at the top of the graph.
  • the measurement results of the chemical substance (cis jasmon) response activity of the silk moth olfactory receptor 56 and its variants are shown (Test Example 2).
  • the olfactory receptors are wild type (Comparative Example 2-1), mutant type (IX 1 Q, Example 2-1), mutant type (RX 2 A, Example 2-2), and mutant type (KX). 4 S, Example 2-3), mutant (KX 4 N, Example 2-4), mutant (IX 1 Q-RX 2 A-KX 4 S, Example 2-5) in that order.
  • mutant type MX 3 L-KX 4 S + alpha, Example 3-3 in that order.
  • amino acid sequence ".” Indicates that the amino acid is the same as that of the wild type (mutation is not introduced).
  • concentration of the test substance in the culture solution is shown at the top of the graph.
  • the measurement results of the chemical substance (skatole) response activity of Shimaka olfactory receptor 9 and its mutants are shown (Test Example 4).
  • the olfactory receptors are wild type (Comparative Example 4-1), mutant type (RX 6 T, Example 4-1), and mutant type (RX 6 T + alpha, Example 4-2) in that order. be.
  • mutant type RX 6 T, Example 4-1
  • mutant type RX 6 T + alpha, Example 4-2
  • amino acid sequence ".” Indicates that the amino acid is the same as that of the wild type (mutation is not introduced).
  • concentration of the test substance in the culture solution is shown at the top of the graph.
  • the term "identity" of an amino acid sequence refers to the degree of coincidence of two or more comparable amino acid sequences with respect to each other. Therefore, the higher the match between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity is determined, for example, using FASTA, a tool for sequence analysis, with default parameters.
  • FASTA a tool for sequence analysis, with default parameters.
  • the algorithm BLAST by Karlin and Altschul Karlin S, Altschul SF. “Methods for assessment the statistical signature of molecular sequence features by using general scoring schemes” Proc Natl Acad Sci USA.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. For example, substitution between amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution.
  • amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues having non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine and tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as treonine, valine and isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan and histidine Substitutions between amino acid residues are also conservative substitutions.
  • nucleotides such as DNA and RNA may be subjected to known chemical modifications as illustrated below.
  • Substituting the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, or phosphorodithionate to prevent degradation by hydrolases such as nucleases. Can be done.
  • the hydroxyl group at the 2-position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is converted into -OR (R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH2CH2OCH3 (2'-O-MOE), CH2CH2NHC (NH) NH2, It may be replaced with CH2CONHCH3, CH2CH2CN, etc.).
  • R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH2CH2OCH3 (2'-O-MOE), CH2CH2NHC (NH) NH2, It may be replaced with CH2CONHCH3, CH2CH2CN, etc.
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • examples thereof include those in which the phosphoric acid moiety and the hydroxyl moiety are modified with a biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • BNA LNA
  • BNA LNA or the like in which the formation of the sugar portion is fixed to N type by cross-linking the 2'oxygen and 4'carbon of the sugar part of the nucleotide can also be preferably used.
  • the olfactory receptor protein is a membrane protein having a transmembrane structure, and its amino-terminal (hereinafter, may be referred to as "N-terminal”) to carboxyl-terminal (hereinafter, may be referred to as "C-terminal”).
  • N-terminal region N-terminal region (NT), 1st transmembrane domain (TM1), 1st extracellular loop (EC1), 2nd transmembrane domain (TM2), 1st intracellular loop (IC1), 3rd Transmembrane domain (TM3), 2nd extracellular loop (EC2), 4th transmembrane domain (TM4), 2nd intracellular loop (IC2), 5th transmembrane domain (TM5), 3rd extracellular loop (EC3) ), The 6th transmembrane domain (TM6), the 3rd intracellular loop (IC3), the 7th transmembrane domain (TM7), and the C-terminal region (CT) are linked.
  • TMpred K. Hofmann, W.
  • amino acid mutations are specifically deletions, substitutions, insertions, or additions of amino acids.
  • the olfactory receptor protein may be deleted with an amino acid having little effect on the chemical response activity, and may be, for example, an olfactory receptor peptide in which a part of the amino acid other than the transmembrane region is deleted. ..
  • OR indicates an olfactory receptor (Odorant receptor)
  • Orco indicates an olfactory receptor co-receptor (Odorant receptor co-receptor)
  • Dm indicates Drosophila melanogaster
  • Bm indicates Kaikoga (Drosophila melanogaster).
  • Ag indicates Anopheles gambiae
  • Aa indicates Aedes aegypti.
  • the chemical substance response activity means that the olfactory receptor recognizes a chemical substance and the olfactory receptor complex formed by the olfactory receptor and the olfactory receptor co-receptor is activated to activate the ion channel activity.
  • the chemical substance response activity of the olfactory receptor can be measured by using the ion channel activity of the olfactory receptor complex formed by the olfactory receptor and the olfactory receptor co-receptor in contact with the chemical substance as an index.
  • olfactory receptors For example, (a) olfactory receptors, (b) olfactory receptor co-receptors, and (c) proteins that develop color or emit light by ions (calcium ions, etc.) that flow into cells when the olfactory receptors respond.
  • the cells to be treated are brought into contact with a chemical substance, and the amount of luminescence of the cells is measured. It is determined that the larger the measured amount of luminescence, the higher the response activity of the chemical substance of the olfactory receptor. Specific examples of measuring the chemical substance response activity are described in Test Example 1-2 and Test Example 1-3 described later.
  • the chemical substance (smell substance, etc.) in which each olfactory receptor has a response activity can be determined by a known or known screening method.
  • the responsive chemicals of DmOR47a contain pentylacetate
  • the responsive chemicals of BmOR56 contain cisjasmon
  • the responsive chemicals of AgOR1 contain phenol
  • Chemicals that have a responsive activity include scutol
  • chemicals that have AgOR2 responsiveness include indol.
  • the disclosure is a variant insect olfactory receptor protein in the corresponding wild-type olfactory receptor protein general formula (1): ⁇ 7 X 1 X 2 Z 1 X. 3 X 4 Z 2 Z 3 ⁇ 6 U ⁇ 5 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 2 ⁇ 1 X 5 X 6 contains an amino acid sequence B in which the amino acid sequence A is mutated, and is selected from the group consisting of conditions 1 to 3.
  • the present invention relates to a mutant olfactory receptor protein (hereinafter, also referred to as “the olfactory receptor protein of the present disclosure”), which satisfies at least one of the following conditions. This will be described below.
  • the olfactory receptor protein disclosed in the present disclosure is a mutant insect olfactory receptor protein in which amino acids in the wild-type insect olfactory receptor protein are mutated.
  • the wild-type insect olfactory receptor protein is an olfactory receptor derived from an insect, that is, an olfactory receptor that is endogenously expressed (inherently possessed) by the insect, and has a general formula (1): ⁇ 7 X 1 X 2 Z 1 X 3 X. It is not particularly limited as long as it contains the amino acid sequence A shown by 4 Z 2 Z 3 ⁇ 6 U ⁇ 5 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 2 ⁇ 1 X 5 X 6 .
  • X 1 to X 6 and Z 1 to Z 3 indicate amino acids derived from the amino acid sequence of the wild-type insect olfactory receptor.
  • the sequence corresponding to amino acid sequence A is F SSIVRTA MSYITML RS (a part of the sequence in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1)
  • the underlined amino acids are in order from the left.
  • ⁇ 1 represents a hydrophobic amino acid.
  • the hydrophobic amino acid include alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, tryptophan and the like.
  • leucine, methionine, isoleucine, valine, alanine, phenylalanine and the like are preferable, leucine, methionine, isoleucine, valine and the like are more preferable, and leucine, methionine and the like are more preferably mentioned.
  • Preferred is leucine.
  • ⁇ 2 to ⁇ 7 independently represent uncharged polar amino acids or hydrophobic amino acids.
  • uncharged polar amino acid include glycine, threonine, serine, asparagine, glutamine, tyrosine, cysteine and the like.
  • hydrophobic amino acid include alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, tryptophan and the like.
  • Examples of ⁇ 2 include hydrophobic amino acids, more preferably leucine, phenylalanine, isoleucine, valine, methionine and the like, and further preferably leucine.
  • Examples of ⁇ 3 include threonine, alanine, methionine, leucine and the like, and more preferably threonine.
  • Examples of ⁇ 4 include phenylalanine, leucine, tyrosine, isoleucine, valine and the like, and more preferably phenylalanine, leucine, tyrosine and the like.
  • Examples of ⁇ 5 include tyrosine, phenylalanine, isoleucine, cysteine, methionine and the like, and more preferably tyrosine.
  • Examples of ⁇ 6 include tyrosine, phenylalanine, glycine, tryptophan, valine, leucine, isoleucine, alanine, serine, methionine and the like, more preferably tyrosine, phenylalanine, glycine, tryptophan and the like, and further preferably tyrosine, Examples include phenylalanine.
  • Examples of ⁇ 7 include phenylalanine, tyrosine, leucine, methionine, asparagine, serine, valine, cysteine, alanine, glycine, threonine and the like, more preferably phenylalanine, tyrosine, leucine and the like, and further preferably phenylalanine, Examples include tyrosine.
  • U represents an uncharged polar amino acid.
  • the uncharged polar amino acid include glycine, threonine, serine, asparagine, glutamine, tyrosine, cysteine and the like.
  • serine, threonine, glutamine, asparagine, glycine and the like are preferable, serine, threonine, glutamine and the like are more preferable, and serine, threonine and the like are more preferable.
  • the position of amino acid sequence A in the wild-type insect olfactory receptor protein is not particularly limited.
  • the amino acid sequence A is a sequence usually contained on the C-terminal side of the amino acid sequence of the wild-type olfactory receptor protein due to its sequence characteristics.
  • the C-terminal side is, for example, from the C-terminal to the amino acid sequence of the wild-type olfactory receptor protein, for example, 70th, preferably 60th, more preferably 50th, and even more preferably 40th from the amino acid at the C-terminal. , Even more preferably up to the 35th amino acid.
  • insects from which the wild-type insect olfactory receptor protein is derived include inner winged insects, more preferably dipteran insects such as mosquitoes and Drosophila; scaly insects such as scallops; Membrane insects and the like are mentioned, more preferably dipteran insects such as mosquito family and Drosophila family, and even more preferably mosquito family insects.
  • insects of the mosquito family include Anopheles gambiae, Aedes aegypti, and Culex quinquefasciatus.
  • insects of the Drosophila family include Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura, and Drosophila virillis.
  • insects of the family Bombyx include Bombyx mori, Bombyx mandarina, and Trilocha varians.
  • honeybee family insects include honeybee (Apis mellifera), honeybee (Apis florea), honeybee (Apis dorsata), and Apis dorsata (Bombus terrestris).
  • wild-type insect olfactory receptor proteins include DmOR47a (amino acid sequence: SEQ ID NO: 1), BmOR56 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 2), AgOR1 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 3), and AaOR9 (amino acid sequence).
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure contains an amino acid sequence B in which the amino acid sequence A is mutated.
  • the mutation is preferably a substitution.
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure satisfies at least one condition selected from the group consisting of conditions 1 to 3 for the amino acid sequence B.
  • Condition 1 is that in the amino acid sequence B, X 3 and / or X 4 are substituted, X 3 is a branched chain amino acid and / or X 4 is an uncharged polar amino acid.
  • X 3 and / or X 4 is substituted means that X 3 and / or X 4 in the amino acid sequence B is substituted from X 3 and / or X 4 in the amino acid sequence A (that is,). , Being different amino acids).
  • examples of the branched chain amino acid represented by X 3 in the amino acid sequence B include valine, leucine, isoleucine and the like. Among these, isoleucine, leucine and the like are preferable.
  • examples of the uncharged polar amino acid represented by X 4 in the amino acid sequence B include glycine, threonine, serine, asparagine, glutamine, tyrosine, and cysteine. Among these, serine, asparagine and the like are preferable.
  • X 3 is a branched chain amino acid and X 4 is an uncharged polar amino acid in the amino acid sequence B.
  • Condition 2 is that when X 5 and X 6 are both positively charged polar amino acids in the amino acid sequence A, X 6 is an amino acid other than the positively charged polar amino acid in the amino acid sequence B. That is, condition 2 is a condition limited to the case where both X 5 and X 6 are positively charged polar amino acids in the amino acid sequence A.
  • examples of the positively charged polar amino acid represented by X 5 or X 6 in the amino acid sequence A include lysine, arginine, histidine and the like, and preferably lysine, arginine and the like.
  • the amino acid represented by X 6 in the amino acid sequence B is not particularly limited as long as it is an amino acid other than the positively charged polar amino acid.
  • Preferred examples of the amino acid include uncharged polar amino acids.
  • the uncharged polar amino acid include glycine, threonine, serine, asparagine, glutamine, tyrosine, cysteine and the like. Among these, serine, threonine and the like are particularly preferable.
  • Condition 3 is that when one or both of X 1 and X 2 are positively charged polar amino acids in the amino acid sequence A, X 1 and / or X 2 are substituted in the amino acid sequence B, and X 1 is uncharged. It is a polar amino acid and / or X 2 is a hydrophobic amino acid. That is, condition 3 is a condition limited to the case where one or both of X 1 and X 2 are positively charged polar amino acids in the amino acid sequence A.
  • At least X 2 of X 1 and X 2 in the amino acid sequence A is a positively charged polar amino acid, and more preferably only X 2 is a positively charged polar amino acid.
  • examples of the positively charged polar amino acid represented by X 1 or X 2 in the amino acid sequence A include lysine, arginine, histidine and the like, preferably lysine, arginine and the like, and more preferably arginine. Can be mentioned.
  • examples of the uncharged polar amino acid represented by X 1 in the amino acid sequence B include glycine, threonine, serine, asparagine, glutamine, tyrosine, and cysteine. Among these, serine, glutamine and the like are preferable.
  • examples of the hydrophobic amino acid represented by X 2 in the amino acid sequence B include alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, tryptophan and the like.
  • alanine, valine, leucine, isoleucine and the like are preferable, and alanine is more preferable.
  • X 1 is an uncharged polar amino acid and X 2 is a hydrophobic amino acid in the amino acid sequence B.
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure preferably satisfies at least one condition selected from the group consisting of conditions 1A to 3A for the amino acid sequence B.
  • Condition 1A is that in the amino acid sequence B, X 3 is a branched chain amino acid and / or X 4 is an uncharged polar amino acid.
  • Condition 1A is the same as condition 1 except that it does not matter whether X 3 and / or X 4 is substituted in the amino acid sequence B. That is, condition 1A also includes the case where X 3 and / or X 4 are not substituted from the amino acid sequence A in the amino acid sequence B.
  • Condition 2A is that X 6 is an amino acid other than the positively charged polar amino acid in the amino acid sequence B.
  • Condition 2A is the same as condition 2 except that it does not matter whether X 5 and X 6 are both positively charged polar amino acids in the amino acid sequence A. That is, condition 2A also includes the case where X 5 and / or X 6 are not substituted in the amino acid sequence B.
  • Condition 3A is that in the amino acid sequence B, X 1 is an uncharged polar amino acid and / or X 2 is a hydrophobic amino acid. Condition 3A is the same as condition 3 except that it does not matter whether one or both of X 1 and X 2 are positively charged polar amino acids in the amino acid sequence A. That is, condition 3A also includes the case where X 1 and / or X 2 is not substituted from the amino acid sequence A in the amino acid sequence B.
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure can contain amino acid mutations other than the above-mentioned mutations of conditions 1 to 3 as long as the chemical substance response activity is not significantly reduced.
  • “Not significantly reduced” means that, for example, the chemical response activity of the olfactory receptor proteins of the present disclosure, including other amino acid mutations, is higher than the chemical response activity of the corresponding wild-type olfactory receptor of wild insects, and other For example, 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, still more, with respect to 100% of the chemical response activity of the olfactory receptor protein of the present disclosure which does not contain amino acid mutations. It means that it is preferably 90% or more.
  • the amino acid sequence of the olfactory receptor protein of the present disclosure is, for example, 85% or more with respect to the amino acid sequence of the mutant insect olfactory receptor containing only the mutation under at least one condition selected from the group consisting of conditions 1 to 3. , More preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more.
  • the amino acid sequence of the olfactory receptor protein of the present disclosure is a mutation containing only a mutation in at least one condition selected from the group consisting of conditions 1 to 3. It is preferable that the amino acid sequence is such that one or more amino acids are mutated with respect to the amino acid sequence of the type insect olfactory receptor.
  • the “plurality” is, for example, 2 to 50, preferably 2 to 30, more preferably 2 to 20, still more preferably 2 to 10, and even more preferably 2 to 5.
  • amino acid mutations include, for example, substitutions, deletions, additions, insertions, etc., preferably substitutions, and more preferably conservative substitutions. Further, in the case of mutations in ⁇ 2 to ⁇ 7 in the general formula ( 1 ), substitution of uncharged polar amino acids with hydrophobic amino acids is also preferable.
  • the chemical response activity of the olfactory receptor protein of the present disclosure is higher than the chemical response activity of the corresponding wild-type insect olfactory receptor.
  • the chemical response activity of the olfactory receptor protein disclosed in the present disclosure is, for example, 1.2 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, 3 times or more, and 4 times the chemical response activity of the corresponding wild-type insect olfactory receptor. 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, 15 times or more, or 20 times or more.
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure is added with another amino acid sequence, for example, a protein or peptide such as a protein tag, a fluorescent protein, a photoprotein, a signal sequence, etc., as long as the chemical response activity is not significantly impaired. May be.
  • a protein or peptide such as a protein tag, a fluorescent protein, a photoprotein, a signal sequence, etc.
  • the protein tag include biotin, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, PA tag and the like.
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure may be chemically modified as long as the chemical substance response activity is not significantly impaired.
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure may have a C-terminal of either a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO- ) , an amide (-CONH 2 ) or an ester (-COOR).
  • R in the ester is, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; for example, phenyl. , C 6-12 aryl groups such as ⁇ -naphthyl; phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl, phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl. 14 Alalkyl group; Pivaloyloxymethyl group etc. are used.
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure may have a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the amino group of the amino acid residue at the N-terminal is a protective group (for example, a C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl such as a formyl group or an acetyl group).
  • a protective group for example, a C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl such as a formyl group or an acetyl group.
  • Protected, N-terminal glutamine residues that can be cleaved and produced in vivo are pyroglutamine-oxidized, substituents on the side chains of amino acids in the molecule (eg -OH, -SH, amino groups, etc.)
  • An imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc. are protected by a suitable protective group (eg, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group), or a sugar.
  • a suitable protective group eg, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group
  • Complex proteins such as so-called glycoproteins to which chains are bound are also included.
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure may be in the form of a salt with an acid or a base.
  • the salt is not particularly limited, and either an acidic salt or a basic salt can be adopted.
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, and apple.
  • Organic acid salts such as acid salts, citrates, methane sulfonates and paratoluene sulfonates; amino acid salts such as asparagates and glutamates can be mentioned.
  • basic salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt.
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure can be easily produced according to a known genetic engineering method. For example, it can be produced by using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, in vitro transcription / translation technology, recombinant protein production technology, and the like.
  • the present disclosure may be referred to as a polynucleotide comprising the coding sequence of the olfactory receptor protein of the present disclosure (in the present specification, "polynucleotide of the present disclosure”. ), Cells comprising the polynucleotides of the present disclosure (sometimes referred to herein as “cells of the present disclosure”), non-human animals comprising the cells of the present disclosure (in the present specification, "the present specification”. Also referred to as “disclosure non-human animals”). These will be described below.
  • the coding sequence of the olfactory receptor protein of the present disclosure is not particularly limited as long as it is a polynucleotide consisting of a base sequence encoding the olfactory receptor protein of the present disclosure.
  • the polynucleotide of the present disclosure in one embodiment, comprises an expression cassette of the olfactory receptor protein of the present disclosure.
  • the expression cassette of the olfactory receptor protein of the present disclosure is not particularly limited as long as it is a polynucleotide capable of expressing the olfactory receptor protein of the present disclosure in cells.
  • Typical examples of the expression cassette of the olfactory receptor protein of the present disclosure include a polynucleotide and a polynucleotide containing a coding sequence of the olfactory receptor protein of the present disclosure arranged under the control of the promoter.
  • the promoter contained in the expression cassette of the olfactory receptor protein of the present disclosure is not particularly limited and can be appropriately selected according to the target cell.
  • various pol II promoters can be used.
  • the polII promoter is not particularly limited, and examples thereof include a CMV promoter, an EF1 promoter, an SV40 promoter, and an MSCV promoter.
  • Other promoters include, for example, tryptophan promoters such as trc and tac, lac promoters, T7 promoters, T5 promoters, T3 promoters, SP6 promoters, arabinose-inducible promoters, cold shock promoters, tetracycline-inducible promoters and the like.
  • the expression cassettes of the olfactory receptor proteins of the present disclosure are optionally other elements (eg, multicloning sites (MCS), drug resistance genes, origins of replication, enhancer sequences, repressor sequences, insulator sequences, reporter proteins).
  • MCS multicloning sites
  • drug resistance genes e.g., drug resistance genes, origins of replication, enhancer sequences, repressor sequences, insulator sequences, reporter proteins.
  • a coding sequence, a drug resistance gene coding sequence, etc. may be included.
  • the polynucleotides of the present disclosure can be in the form of vectors.
  • An appropriate vector is selected according to the purpose of use (cloning, protein expression) and also considering the type of host cell.
  • Vectors hosting Escherichia coli include M13 phage or variants thereof, ⁇ phage or variants thereof, pBR322 or variants thereof (pB325, pAT153, pUC8, etc.), and vectors hosting yeast include pYepSec1, pMFa, pYES2. , PPIC3.5K, etc., pAc, pVL, etc. can be exemplified as a vector having an insect cell as a host, and pcDNA, pCDM8, pMT2PC, etc. can be exemplified as a vector having a mammalian cell as a host.
  • the cells of the present disclosure are not particularly limited as long as they contain the polynucleotide of the present disclosure.
  • Examples of cells include Escherichia coli K12 and other Escherichia coli, Bacillus subtilis MI114 and other Bacillus bacteria, Saccharomyces cerevisiae AH22 and other yeast, Spodoptera frugiperda-derived Sf cell lineage, and Trichoplusia ni-derived High Five cell lineage, and olfactory nerve cells.
  • Examples include animal cells such as insect cells and COS7 cells.
  • animal cells are preferably cultured cells derived from mammals, specifically, COS7 cells, CHO cells, HEK293 cells, HEK293FT cells, Hela cells, PC12 cells, N1E-115 cells, SH-SY5Y cells and the like. Be done.
  • the cells of the present disclosure preferably contain the coding sequence of the olfactory receptor co-receptor of insects from the viewpoint that they can be used as they are for the chemical substance detection applications described later.
  • the olfactory receptor co-receptor of insects is a membrane protein having a 7-transmembrane structure similar to the olfactory receptor, but it does not recognize odorants by itself and forms a heterocomplex with the olfactory receptor. Function.
  • the olfactory receptor complex which is a heterocomplex composed of olfactory receptors and olfactory receptor co-receptors, has ion channel activity that is activated by odorants, and when activated, sodium ions ( Inflow of cations such as Na + ) and calcium ion (Ca 2+ ) into the cell.
  • the cells of the present disclosure contain a coding sequence of a protein that develops color or emits light by an ion (calcium ion or the like) that flows into the cell when the olfactory receptor responds.
  • a protein that develops color or emits light by an ion (calcium ion or the like) that flows into the cell when the olfactory receptor responds.
  • proteins include aequorin, Yellow Cameleon (YC), GCaMP and the like.
  • the cells of the present disclosure preferably contain a calcium ion-dependent fluorescent dye (eg, Fura-2, Fluo-3, Fluo-4, etc.).
  • the cells of the present disclosure contain the olfactory receptor protein of the present disclosure, that is, the olfactory receptor protein of the present disclosure is expressed in the cells of the present disclosure.
  • the olfactory receptor protein of the present disclosure has a 7-transmembrane structure and is therefore placed on the cell membrane as a membrane protein.
  • the non-human animals of the present disclosure are not particularly limited as long as they contain the cells of the present disclosure.
  • the non-human animal is not particularly limited, but insects are preferable from the viewpoint of being suitable for the chemical substance detection application described later. For insects, the same as the explanation in "2. Olfactory receptor protein" above.
  • the cells of the present disclosure in the non-human animals of the present disclosure preferably contain olfactory nerve cells.
  • the olfactory receptor proteins of the present disclosure have the activity of allowing cations (sodium ion (Na + ), calcium ion (Ca 2+ ), etc.) to flow into the cell in response to chemical substances. Chemical substances can be detected by detecting the cations or by detecting behavioral changes based on the activation of olfactory nerve cells induced by the influx of the cations. Therefore, the olfactory receptor protein of the present disclosure can be used as a chemical substance detection element.
  • cations sodium ion (Na + ), calcium ion (Ca 2+ ), etc.
  • a chemical substance detection element composed of the olfactory receptor protein of the present disclosure, a cell containing the detection element of the present disclosure, a lipid double membrane (artificial cell membrane), and the like.
  • the present invention relates to a chemical substance detection sensor (detection sensor of the present disclosure) comprising a non-human animal containing the cell.
  • Chemical substance detection sensors using cells, lipid bilayers, or non-human animals are already known, and specific configurations thereof are described in, for example, Patent Document 1, Patent Document 2, Patent Document 3, and the like. Can be adopted.
  • a chemical detection sensor comprising the disclosed cells or lipid double membrane signals when it detects a chemical response (eg, light) in, for example, a container holding the disclosed cells or lipid double membrane, the cells of the present disclosure. It is provided with an output sensor and a determination device that detects a chemical substance based on the signal.
  • the chemical substance detection sensor including the non-human animal of the present disclosure includes, for example, a detection unit (for example, a moving body sensor, a vibration sensor, a sound sensor, etc.) for detecting the movement of the non-human animal of the present disclosure.
  • Test example 1 Measurement of chemical response activity of DmOR47a The response activity of olfactory receptors (wild-type DmOR47a and mutant DmOR47a) to chemical substances was measured.
  • Test Example 1-1 Preparation of expression plasmid ⁇ Comparative Example 1-1 .
  • Preparation of wild-type DmOR47a expression plasmid> Using adult Drosophila melanogaster RNA (manufactured by TAKARA) as a template, super Script III reverse transcriptase (manufactured by Invitrogen) is added, and the temperature is reversed by incubating at 55 ° C for 50 minutes and then at 75 ° C for 15 minutes. A copying reaction was performed to obtain cDNA.
  • pENTR-DmOR47a 4 ⁇ L of pENTR-DmOR47a, 1 ⁇ L of pcDNA6.2V5-DEST and 2 ⁇ L of LR cronase II (manufactured by Invitrogen) were mixed and kept at room temperature for 1 hour.
  • the obtained mixture was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA6.2-DmOR47a.
  • the base sequence of the expression plasmid pcDNA6.2-DmOR47a was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the base sequence shown by SEQ ID NO: 5.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the correspondence with a part of the amino acid sequences in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, which corresponds to the amino acid sequence, is shown.
  • Example 1-1 Preparation of mutant DmOR47a (RX 4 S) expression plasmid> Code sequence of mutant DmOR47a (RX 4 S) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 11) in which arginine, which is the 372nd amino acid residue (X 4 of general formula (1)) in the amino acid sequence of wild-type DmOR47a, is mutated to serine.
  • a plasmid (pcDNA6.2) containing base sequence: SEQ ID NO: 12) was prepared as follows.
  • PCR primer (primer F: CCTTCTCATCGATTGTTAGCACGGCGATGTCCTAC (SEQ ID NO: 13) and primer R designed to convert arginine, which is the 372nd amino acid residue (X 4 of general formula (1)) in the amino acid sequence of wild-type DmOR47a, to serine. : GTAGGACATCGCCGTGCTAACAATCGATGAGAAGG (SEQ ID NO: 14)) was synthesized. Using these primers, PCR amplification using pcDNA6.2-DmOR47a as a template was performed (reaction procedure and conditions are by a conventional method). The amplified PCR reaction solution was digested with DpnI and then transformed into Escherichia coli (DH5 ⁇ ).
  • the transformed E. coli was inoculated on a 25 cm square (ampicillin-added) plate and cultured at 37 ° C. to form colonies. Two colonies were selected and cultured again in LB liquid medium. Then, the nucleotide sequences of the plasmids they carry were determined to obtain a mutant DmOR47a (RX 4 S) expression plasmid.
  • Example 1-2 Preparation of mutant DmOR47a (VX 3 L-RX 4 S) expression plasmid>
  • arginine which is the 371st amino acid residue (X 3 in the general formula (1)
  • leucine is the 372nd amino acid residue (X 4 in the general formula (1)).
  • primer F CCTTCTCATCGATTCTTAGCACGGCGATGTCC (SEQ ID NO: 17) and primer R: GGACATCGCCGTGCTAAGAATCGATGAGAAGG (SEQ ID NO: 18) were used as PCR primers, and a mutant DmOR47a (RX 4 S) expression plasmid (Example 1) was used as a PCR template. It was prepared in the same manner as in Example 1-1 except that -1) was used.
  • Example 1-3 Preparation of mutant DmOR47a (VX 3 L-RX 4 S + alpha) expression plasmid>
  • the coding sequence (base sequence) of the mutant DmOR47a (VX 3 L-RX 4 S + alpha) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 19) to which more than one mutation was added.
  • a plasmid (pcDNA6.2) containing SEQ ID NO: 20) was prepared.
  • the mutation site is as shown in FIG.
  • a mutant DmOR47a (VX 3 L-RX 4 S) expression plasmid (Example 1-2) was used as a PCR template, and mutations were sequentially introduced using each mutation-introducing primer set. Made.
  • Dm (NT-TM4) AmORCO the amino acid sequence from the N-terminal region (NT) to the 4th transmembrane domain (TM4) (the amino acid sequence from the N-terminal amino acid residue to the 234th amino acid residue) is the same as that of Drosophila. It is derived from the receptor (Dm (NT-TM4), and the amino acid sequence from the second intracellular loop to the C-terminal region is derived from the bee co-receptor (Am (IC2-CT)).
  • Test Example 1-2 Introduction of expression plasmid into cells HEK293FT cells (purchased from Invitrogen) were seeded in a 10 cm petri dish at 3 ⁇ 10 ⁇ 6 cells / petri dish, and in DMEM medium containing 10% FBS (manufactured by Nakaraitesk) at 37 ° C., 5 The cells were cultured under% CO2 conditions for about 24 hours.
  • GAP GFP-equolin
  • Test Example 1-3 Activity measurement When GFP-aequorin (GAP) binds to calcium ions, it is activated in the presence of a substrate such as coelenterazine and emits green fluorescence. Therefore, since the increase in intracellular calcium ion concentration of GAP-expressing cells directly appears as an increase in the amount of fluorescence, whether or not the olfactory receptor complex functions as an ion channel by adding a test substance is determined. It can be measured from the change in the amount of fluorescence.
  • GAP GFP-aequorin
  • the culture solution of the transformed cells was removed and replaced with Assay buffer (Hanks-HEPES (20 mM pH 7.4) containing 0.5 ⁇ M coelenterazine h (manufactured by Promega) and 0.3% BSA), and further at room temperature for 4 hours. It was allowed to stand still. Next, using Flexstation 3 (manufactured by Molecular devices), the test substance corresponding to the olfactory receptor was added to the culture medium of the cells, and the fluorescence amount of the cells was measured.
  • Test example 2 Measurement of chemical response activity of BmOR56 The response activity of olfactory receptors (wild-type BmOR56 and mutant BmOR56) to chemical substances was measured.
  • Test Example 2-1 Preparation of expression plasmid ⁇ Comparative Example 2-1 . Preparation of wild-type BmOR56 expression plasmid> Double-stranded DNA having the base sequence shown by SEQ ID NO: 6 on either DNA strand was synthesized.
  • the PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C for 2 minutes, (2) 98 ° C for 10 seconds, (3) 63 ° C for 30 seconds, (4) 68 ° C for 1.5 minutes, and (2) to (4). The process was repeated for 35 cycles.
  • the obtained PCR product was ligated to pcDNA6.2 (manufactured by Invitrogen) digested with EcoRV using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA).
  • the ligated DNA was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA6.2-BmOR56.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the correspondence with a part of the amino acid sequences in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, which corresponds to the amino acid sequence, is shown.
  • Example 2-1 Preparation of mutant BmOR56 (IX 1 Q) expression plasmid> Code sequence of mutant BmOR56 (IX 1 Q) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 25) in which isoleucine, which is the 380th amino acid residue (X 1 of general formula (1)), is mutated to glutamine in the amino acid sequence of wild-type BmOR56.
  • a plasmid (pcDNA6.2) containing base sequence: SEQ ID NO: 26) was prepared as follows.
  • PCR primer (primer F: CGGTCGCCACTTTTCAGAGGATCCTCAAAGGAG (SEQ ID NO: 27) and primer R designed to convert isoleucine, which is the 380th amino acid residue (X 1 of the general formula (1)), to glutamine in the amino acid sequence of wild-type BmOR56. : CTCCTTTGAGGATCCTCTGAAAAGTGGCGACCG (SEQ ID NO: 28)) was synthesized. Using pcDNA6.2-BmOR56 as a template, mutation was introduced by PCR using these primers in the same manner as in the above example, and a mutant BmOR56 (IX 1 Q) expression plasmid was obtained.
  • Example 2-2 Preparation of mutant BmOR56 (RX 2 A) expression plasmid> Code sequence of mutant BmOR56 (RX 2 A) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 29) in which arginine, which is the 381st amino acid residue (X 2 of general formula (1)) in the amino acid sequence of wild-type BmOR56, is mutated to alanine.
  • a plasmid (pcDNA6.2) containing (base sequence: SEQ ID NO: 30) was prepared.
  • primer F GTCGCCACTTTTATCGCAATCCTCAAAGGAGCC (SEQ ID NO: 31) and primer R: GGCTCCTTTGAGGATTGCGATAAAAGTGGCGAC (SEQ ID NO: 32) were used as PCR primers.
  • mutant BmOR56 (KX 4 S) expression plasmid > Code sequence of mutant BmOR56 ( KX4 S) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 33) in which lysine, which is the 384th amino acid residue (X4 in general formula ( 1 )), is mutated to serine in the amino acid sequence of wild-type BmOR56.
  • a plasmid (pcDNA6.2) containing (base sequence: SEQ ID NO: 34) was prepared.
  • primer F CACTTTTATCAGGATCCTCAGCGGAGCCTATAGTTACTAC (SEQ ID NO: 35) and primer R: GTAGTAACTATAGGCTCCGCTGAGGATCCTGATAAAAGTG (SEQ ID NO: 36) were used as PCR primers.
  • a plasmid (pcDNA6.2) containing (base sequence: SEQ ID NO: 38) was prepared.
  • primer F CACTTTTATCAGGATCCTCAACGGAGCCTATAGTTACTAC (SEQ ID NO: 39) and primer R: GTAGTAACTATAGGCTCCGTTGGATCCTGATAAAAGTG (SEQ ID NO: 40) were used as PCR primers.
  • Example 2-5 Preparation of mutant BmOR56 (IX 1 Q-RX 2 A-KX 4 S) expression plasmid>
  • isoleucine which is the 380th amino acid residue (X 1 of the general formula (1))
  • is mutated to glutamine and at the 381st amino acid residue (X 2 of the general formula (1)).
  • Variant BmOR56 (IX 1 Q-RX 2 A-KX 4 S) (amino acid) in which a certain arginine was mutated to alanine and lysine, which is the 384th amino acid residue (X 4 of the general formula (1)), was mutated to serine.
  • a plasmid (pcDNA6.2) containing the coding sequence of sequence: SEQ ID NO: 41) (base sequence: SEQ ID NO: 42) was prepared. Specifically, in the same manner as in the above-mentioned Examples, each mutation-introducing primer set was used to sequentially introduce mutations.
  • Test Example 2-2 Introduction of expression plasmid into cells and activity measurement
  • the expression plasmid was introduced into cells in the same manner as in Test Example 1-2, and the activity was measured in the same manner as in Test Example 1-3.
  • cis jasmon was used as the test substance.
  • Test example 3 Measurement of chemical response activity of AgOR1 Response activity of olfactory receptors (wild-type AgOR1 and mutant AgOR1) to chemical substances was measured.
  • Test Example 3-1 Preparation of expression plasmid ⁇ Comparative Example 3-1 .
  • PCR was performed using 1 ⁇ L of KOD Plus neoDNA polymerase (manufactured by Toyobo). The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C for 2 minutes, (2) 98 ° C for 10 seconds, (3) 63 ° C for 30 seconds, (4) 68 ° C for 1.5 minutes, and (2) to (4). The process was repeated for 35 cycles.
  • the obtained PCR product was ligated to pcDNA6.2 (manufactured by Invitrogen) digested with EcoRV using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA). The ligated DNA was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA6.2-AgOR1.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence represented by the general formula (1) ⁇ 7 X 1 X 2 Z 1 X 3 X 4 Z 2 Z 3 ⁇ 6 U ⁇ 5 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 2 ⁇ 1 X 5 X 6 and the amino acid sequence thereof.
  • the correspondence with a part of the amino acid sequences in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3, which corresponds to the amino acid sequence, is shown.
  • Example 3-1 Preparation of mutant AgOR1 (MX 3 L-KX 4 S) expression plasmid>
  • methionine which is the 401st amino acid residue (X 3 in the general formula (1)
  • a plasmid (pcDNA6.2) containing the coding sequence (base sequence: SEQ ID NO: 46) of the mutant AgOR1 (MX 3 L-KX 4 S) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 45) in which lysine is mutated to serine is as follows. Made in.
  • methionine which is the 401st amino acid residue (X 3 in the general formula (1)), is converted to leucine and is the 402nd amino acid residue (X 4 in the general formula (1)).
  • Example 3-2 Preparation of mutant AgOR1 (MX 3 L-KX 4 N) expression plasmid>
  • methionine which is the 401st amino acid residue (X 3 in the general formula (1)
  • a plasmid (pcDNA6.2) containing the coding sequence (base sequence: SEQ ID NO: 52) of the mutant AgOR1 (MX 3 L-KX 4 N) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 51) in which lysine was mutated to asparagine was prepared.
  • PCR primer F CACATTTTTGCAGATTTTGAACCTATCGTACTCCTATC (SEQ ID NO: 53) and primer R: GATAGGAGTACGATAGGTTCAAAATCTGCAAAAATGTG (SEQ ID NO: 54) designed to convert to asparagine were synthesized and prepared in the same manner as in Example 3-1.
  • Example 3-3 Preparation of mutant AgOR1 (MX 3 L-KX 4 S + alpha) expression plasmid>
  • the coding sequence (base sequence) of the mutant AgOR1 (MX 3 L-KX 4 S + alpha) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 55) to which multiple mutations have been added.
  • a plasmid (pcDNA6.2) containing SEQ ID NO: 56) was prepared. The mutation site is as shown in FIG. Specifically, a mutant AgOR1 (MX 3 L-KX 4 S) expression plasmid (Example 3-1) was used as a PCR template, and mutations were sequentially introduced using each mutation-introducing primer set. Made.
  • Test Example 3-2 Introduction of expression plasmid into cells and activity measurement The expression plasmid was introduced into cells in the same manner as in Test Example 1-2, and the activity was measured in the same manner as in Test Example 1-3. In this test example, phenol was used as the test substance.
  • Test example 4 Measurement of chemical response activity of AaOR9 The response activity of olfactory receptors (wild-type AaOR9 and mutant AaOR9) to chemical substances was measured.
  • Test Example 4-1 Preparation of expression plasmid ⁇ Comparative Example 4-1 . Preparation of wild-type AaOR9 expression plasmid> Double-stranded DNA having the base sequence shown by SEQ ID NO: 8 on either DNA strand was synthesized.
  • the PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C for 2 minutes, (2) 98 ° C for 10 seconds, (3) 63 ° C for 30 seconds, (4) 68 ° C for 1.5 minutes, and (2) to (4). The process was repeated for 35 cycles.
  • the obtained PCR product was ligated to pcDNA6.2 (manufactured by Invitrogen) digested with EcoRV using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA).
  • the ligated DNA was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA6.2-AaOR9.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the correspondence with a part of the amino acid sequences in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4, which corresponds to the amino acid sequence, is shown.
  • Example 4-1 Preparation of mutant AaOR9 (RX 6 T) expression plasmid> Code sequence of mutant AaOR9 (RX 6 T) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 59) in which arginine, which is the 374th amino acid residue (X 6 of general formula (1)) in the amino acid sequence of wild-type AaOR9, is mutated to treonine.
  • a plasmid (pcDNA6.2) containing base sequence: SEQ ID NO: 60) was prepared as follows.
  • PCR primer (primer F: CTCATATTTCACTCTTTTGAAAACGGTTTATAGCTAA (SEQ ID NO: 61) and primer R designed to convert arginine, which is the 374th amino acid residue (X 6 of general formula (1)) in the amino acid sequence of wild-type AaOR9, to threonine. : TTAGCTATAAACCGTTTTCAAAAGAGTGAAATATGAG (SEQ ID NO: 62) was synthesized. Using pcDNA6.2-AaOR9 as a template, mutation was introduced by PCR using these primers in the same manner as in the above example, and a mutant AaOR9 (RX 6 T) expression plasmid was obtained.
  • Example 4-2 Preparation of mutant AaOR9 (RX 6 T + alpha) expression plasmid>
  • mutant AaOR9 (RX 6 T) a plasmid containing the coding sequence (base sequence: SEQ ID NO: 64) of mutant AaOR9 (RX 6 T + alpha) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 63) to which multiple mutations have been added.
  • PcDNA6.2 was prepared. The mutation site is as shown in FIG. Specifically, a mutant AaOR9 (RX 6 T) expression plasmid (Example 4-1) was used as a PCR template, and mutations were sequentially introduced using each mutation-introducing primer set.
  • Test Example 4-2 Introduction of expression plasmid into cells and activity measurement The expression plasmid was introduced into cells in the same manner as in Test Example 1-2, and the activity was measured in the same manner as in Test Example 1-3. In this test example, skatole was used as the test substance.
  • Test example 5 Measurement of chemical substance response activity of other insect olfactory receptors From the results of Test Examples 1 to 4, (A) Mutation so that X 3 is a branched chain amino acid and / or X 4 is an uncharged polar amino acid. (B) When X 5 and X 6 are both positively charged polar amino acids in the wild type, mutating X 6 to an amino acid other than the positively charged polar amino acid, and (C) in the wild type, X 1 and Muting so that X 1 is an uncharged polar amino acid and / or X 2 is a hydrophobic amino acid when one or both of X 2 are positively charged polar amino acids. It was found that at least one selected from the group consisting of two can improve the chemical response activity of the insect olfactory receptor.

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Abstract

嗅覚受容体の化学物質に対する応答活性を向上させる技術を提供することを課題とし、該課題を、昆虫嗅覚受容体タンパク質中の特定の部位において特定の条件を満たすように変異を導入すること、により解決する。

Description

変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質
　本開示は、変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質等に関する。
　ヒトの特定の疾患や精神状態等を特徴付ける匂い物質群が同定されており、診断マーカーとしての利用価値が高いことから、これらをターゲットとした様々な匂いセンサの開発が盛んになっている。生物の嗅覚受容体は、多様性、感度、選択性等の面で半導体等の従来の匂いセンサ素子にはない優れた特性を有することから、嗅覚受容体をセンサ素子とした新しい匂いセンサの開発が期待されている。
　一般に匂いマーカーは低濃度であるため、高活性な嗅覚受容体を作出することが望ましい。現状、嗅覚受容体において、置換されることにより、透過するイオンの選択性が変化するアミノ酸部位が報告されている。
特開2013-27376号公報 特開2018-59786号公報 特開2012-78351号公報
PLoS ONE, March 2012, Volume 7, Issue 3, e32372.
　本開示は、嗅覚受容体の化学物質に対する応答活性を向上させる技術を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、昆虫嗅覚受容体タンパク質中の特定の部位において特定の条件を満たすように変異を導入することにより、化学物質に対する応答活性を向上させることができることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本開示の発明を完成させた。即ち、本開示は、下記の態様を包含する。
　項１．　変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質であって、
対応する野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質中の一般式（1）：
φ7X1X2Z1X3X4Z2Z3φ6Uφ5φ4φ3φ2φ1X5X6
［式中、X1～X6及びZ1～Z3は野生型昆虫嗅覚受容体のアミノ酸配列に由来するアミノ酸を示し、φ1は疎水性アミノ酸を示し、φ2～φ7はそれぞれ独立して無電荷極性アミノ酸又は疎水性アミノ酸を示し、Uは無電荷極性アミノ酸を示す。］
で示されるアミノ酸配列Aが変異してなるアミノ酸配列Bを含み、
下記条件1～3：
（条件1）前記アミノ酸配列Bにおいて、X3及び／又はX4が置換しており、X3が分岐鎖アミノ酸であり且つ／或いはX4が無電荷極性アミノ酸であること、
（条件2）前記アミノ酸配列AにおいてX5及びX6が共に正電荷極性アミノ酸である場合に、前記アミノ酸配列Bにおいて、X6が正電荷極性アミノ酸以外のアミノ酸であること、及び
（条件3）前記アミノ酸配列AにおいてX1及びX2の一方又は両方が正電荷極性アミノ酸である場合に、前記アミノ酸配列Bにおいて、X1及び／又はX2が置換しており、X1が無電荷極性アミノ酸であり且つ／或いはX2が疎水性アミノ酸であること、
からなる群より選択される少なくとも1種の条件を満たす、
変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
　項２．　前記条件1を満たし、X3がイソロイシン又はロイシンであり且つ／或いはX4がセリン又はアスパラギンである、項１に記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
　項３．　前記条件2を満たし、X6が無電荷極性アミノ酸である、項１又は２に記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
　項４．　前記条件2を満たし、X6がセリン又はトレオニンである、項１～３のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
　項５．　前記条件3を満たし、X1がセリン又はグルタミンであり且つ／或いはX2がアラニンである、項１～４のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
　項６．　条件1において、X3がイソロイシン又はロイシンであり且つ／或いはX4がセリン又はアスパラギンであり、
条件2において、X6がセリン又はトレオニンであり、
条件3において、X1がセリン又はグルタミンであり且つ／或いはX2がアラニンである、項１～５のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
　項７．　下記条件1A～3A：
（条件1A）前記アミノ酸配列Bにおいて、X3が分岐鎖アミノ酸であり且つ／或いはX4が無電荷極性アミノ酸であること、
（条件2A）前記アミノ酸配列Bにおいて、X6が正電荷極性アミノ酸以外のアミノ酸であること、及び
（条件3A）前記アミノ酸配列Bにおいて、X1が無電荷極性アミノ酸であり且つ／或いはX2が疎水性アミノ酸であること、
からなる群より選択される少なくとも1種の条件を満たす、
項１～６のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
　項８．　前記アミノ酸配列Aが、前記野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質のアミノ酸配列のC末端側に含まれる配列である、項１～７のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
　項９．　前記野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質が内翅上目昆虫の野生型嗅覚受容体タンパク質である、項１～８のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
　項１０．　項１～９のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質のコード配列を含む、ポリヌクレオチド。
　項１１．　項１０に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
　項１２．　項１１に記載の細胞を含む、非ヒト動物。
　項１３．　項１～９のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質からなる、化学物質検出素子。
　項１３Ａ．項１～９のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質の、化学物質検出素子としての使用。
　項１３Ｂ．項１～９のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質の、化学物質検出素子の製造のための使用。
　項１４．　項１３に記載の化学物質検出素子を含む脂質二重膜、細胞、又は前記細胞を含む非ヒト動物を備える、化学物質検出センサ。
　項１４Ａ．項１～９のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質を含む脂質二重膜、細胞、又は前記細胞を含む非ヒト動物の、化学物質検出センサとしての使用。
　項１４Ｂ．項１～９のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質を含む脂質二重膜、細胞、又は前記細胞を含む非ヒト動物の、化学物質検出センサの製造のための使用。
　項１５．　項１～９のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質、項１３に記載の化学物質検出素子、又は項１４に記載の化学物質検出センサと、化学物質とを接触させることを含む、化学物質検出方法。
　本開示によれば、嗅覚受容体の化学物質に対する応答活性を向上させる技術を提供することができる。
ショウジョウバエ嗅覚受容体47a及びその変異体の化学物質（ペンチルアセテート）応答活性の測定結果を示す（試験例1）。横軸は蛍光量（＝活性強度）を示し、縦軸上に、嗅覚受容体及びそのアミノ酸配列を示す。嗅覚受容体は、上から、野生型（比較例1-1）、変異型（RX4S、実施例1-1）、変異型（VX3L-RX4S、実施例1-2）、変異型（VX3L-RX4S+alpha、実施例1-3）の順である。アミノ酸配列中、「・」は野生型と同じアミノ酸である（変異が導入されていない）ことを示す。グラフ上方に被検物質の培養液中の濃度を示す。 カイコガ嗅覚受容体56及びその変異体の化学物質（シスジャスモン）応答活性の測定結果を示す（試験例2）。横軸は蛍光量（＝活性強度）を示し、縦軸上に、嗅覚受容体及びそのアミノ酸配列を示す。嗅覚受容体は、上から、野生型（比較例2-1）、変異型（IX1Q、実施例2-1）、変異型（RX2A、実施例2-2）、変異型（KX4S、実施例2-3）、変異型（KX4N、実施例2-4）、変異型（IX1Q-RX2A-KX4S、実施例2-5）の順である。アミノ酸配列中、「・」は野生型と同じアミノ酸である（変異が導入されていない）ことを示す。グラフ上方に被検物質の培養液中の濃度を示す。 ハマダラカ嗅覚受容体1及びその変異体の化学物質（フェノール）応答活性の測定結果を示す（試験例3）。横軸は蛍光量（＝活性強度）を示し、縦軸上に、嗅覚受容体及びそのアミノ酸配列を示す。嗅覚受容体は、上から、野生型（比較例3-1）、変異型（MX3L-KX4S、実施例3-1）、変異型（MX3L-KX4N、実施例3-2）、変異型（MX3L-KX4S+alpha、実施例3-3）の順である。アミノ酸配列中、「・」は野生型と同じアミノ酸である（変異が導入されていない）ことを示す。グラフ上方に被検物質の培養液中の濃度を示す。 シマカ嗅覚受容体9及びその変異体の化学物質（スカトール）応答活性の測定結果を示す（試験例4）。横軸は蛍光量（＝活性強度）を示し、縦軸上に、嗅覚受容体及びそのアミノ酸配列を示す。嗅覚受容体は、上から、野生型（比較例4-1）、変異型（RX6T、実施例4-1）、変異型（RX6T+alpha、実施例4-2）の順である。アミノ酸配列中、「・」は野生型と同じアミノ酸である（変異が導入されていない）ことを示す。グラフ上方に被検物質の培養液中の濃度を示す。
　1．定義等
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　本明細書において、アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（Karlin S， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の「同一性」も上記に準じて定義される。
　本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；トレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　本明細書において、DNA、RNAなどのヌクレオチドには、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
　嗅覚受容体タンパク質は、7回膜貫通構造を有する膜タンパク質であり、そのアミノ末端（以下、「N末端」という場合もある。）からカルボキシル末端（以下、「C末端」という場合もある。）に向かって順に、N末端領域（NT）、第1膜貫通ドメイン（TM1）、第1細胞外ループ（EC1）、第2膜貫通ドメイン（TM2）、第1細胞内ループ（IC1）、第3膜貫通ドメイン（TM3）、第2細胞外ループ（EC2）、第4膜貫通ドメイン（TM4）、第2細胞内ループ（IC2）、第5膜貫通ドメイン（TM5）、第3細胞外ループ（EC3）、第6膜貫通ドメイン（TM6）、第3細胞内ループ（IC3）、第7膜貫通ドメイン（TM7）、及びC末端領域（CT）が連結されて構成される。本開示において、各領域は、TMpred（K. Hofmann, W. Stoffel, TMbase - a database of membrane spanning proteins segments, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374 (1993), p. 166、https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html）を用いた構造予測（条件はデフォルト）により決定される。
　本明細書において、アミノ酸の変異は、具体的には、アミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加である。嗅覚受容体タンパク質は、化学物質応答活性への影響が少ないアミノ酸が欠失していてもよく、例えば膜貫通領域以外のアミノ酸の一部が欠失している嗅覚受容体ペプチドであってもよい。
　本明細書において、ORは嗅覚受容体（Odorant receptor）を示し、Orcoは嗅覚受容体共受容体（Odorant recetor co-receptor）を示し、Dmはキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）を示し、Bmはカイコガ（Bombyx mori）を示し、Agはガンビエハマダラカ（Anopheles gambiae）を示し、Aaはネッタイシマカ（Aedes aegypti）を示す。
　本明細書において、化学物質応答活性とは、嗅覚受容体が化学物質を認識し、その嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とが形成した嗅覚受容体複合体が活性化されてイオンチャネル活性を示す性質をいう。嗅覚受容体の化学物質応答活性は、化学物質と接触した嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とが形成する嗅覚受容体複合体のイオンチャネル活性を指標として測定することができる。例えば、(a)嗅覚受容体、(b)嗅覚受容体共受容体、及び　(c)嗅覚受容体が応答した場合に細胞内に流入するイオン（カルシウムイオン等）により発色又は発光するタンパク質を発現する細胞と、化学物質とを接触させ、当該細胞の発光量を測定する。測定された発光量が多い程、嗅覚受容体の化学物質の応答活性が高いと判定する。後述の試験例1-2及び試験例1-3に、化学物質応答活性を測定した具体例が記載されている。
　各嗅覚受容体が応答活性を有する化学物質（匂い物質等）は、公知である、或いは公知のスクリーニング方法によって決定することができる。例えば、DmOR47aが応答活性を有する化学物質にはペンチルアセテートが含まれ、BmOR56が応答活性を有する化学物質にはシスジャスモンが含まれ、AgOR1が応答活性を有する化学物質にはフェノールが含まれ、AaOR9が応答活性を有する化学物質にはスカトールが含まれ、AgOR2が応答活性を有する化学物質にはインドールが含まれる。
　2．嗅覚受容体タンパク質
　本開示は、その一態様において、変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質であって、対応する野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質中の一般式（1）：φ7X1X2Z1X3X4Z2Z3φ6Uφ5φ4φ3φ2φ1X5X6で示されるアミノ酸配列Aが変異してなるアミノ酸配列Bを含み、条件1～3からなる群より選択される少なくとも1種の条件を満たす、変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質（本明細書において、「本開示の嗅覚受容体タンパク質」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質中のアミノ酸が変異してなる変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質である。
　野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質は、昆虫由来の、すなわち昆虫が内在的に発現する（固有に有する）嗅覚受容体であり、且つ一般式（1）：φ7X1X2Z1X3X4Z2Z3φ6Uφ5φ4φ3φ2φ1X5X6で示されるアミノ酸配列Aを含むものである限り、特に制限されない。
　一般式（1）中、X1～X6及びZ1～Z3は、野生型昆虫嗅覚受容体のアミノ酸配列に由来するアミノ酸を示す。例えば、野生型昆虫嗅覚受容体中、アミノ酸配列Aに相当する配列がFSSIVRTAMSYITMLRS（配列番号1で示されるアミノ酸配列中の一部の配列）である場合、下線部のアミノ酸の左から順に、X1、X2、Z1、X3、X4、Z2、Z3、X5、X6である。
　一般式（1）中、φ1は、疎水性アミノ酸を示す。疎水性アミノ酸としては、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン等が挙げられ、より好ましくはロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン等が挙げられ、さらに好ましくはロイシン、メチオニン等が挙げられ、よりさらに好ましくはロイシンが挙げられる。
　一般式（1）中、φ2～φ7はそれぞれ独立して無電荷極性アミノ酸又は疎水性アミノ酸を示す。無電荷極性アミノ酸としては、例えばグリシン、トレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン等が挙げられる。疎水性アミノ酸としては、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン等が挙げられる。
　φ2として、好ましくは疎水性アミノ酸が挙げられ、より好ましくはロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン、メチオニン等が挙げられ、さらに好ましくはロイシンが挙げられる。
　φ3として、好ましくはトレオニン、アラニン、メチオニン、ロイシン等が挙げられ、より好ましくはトレオニンが挙げられる。
　φ4として、好ましくはフェニルアラニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、バリン等が挙げられ、より好ましくはフェニルアラニン、ロイシン、チロシン等が挙げられる。
　φ5として、好ましくはチロシン、フェニルアラニン、イソロイシン、システイン、メチオニン等が挙げられ、より好ましくはチロシンが挙げられる。
　φ6として、好ましくはチロシン、フェニルアラニン、グリシン、トリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、セリン、メチオニン等が挙げられ、より好ましくはチロシン、フェニルアラニン、グリシン、トリプトファン等が挙げられ、さらに好ましくはチロシン、フェニルアラニン等が挙げられる。
　φ7として、好ましくはフェニルアラニン、チロシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、バリン、システイン、アラニン、グリシン、トレオニン等が挙げられ、より好ましくはフェニルアラニン、チロシン、ロイシン等が挙げられ、さらに好ましくはフェニルアラニン、チロシン等が挙げられる。
　一般式（1）中、Uは、無電荷極性アミノ酸を示す。無電荷極性アミノ酸としては、例えばグリシン、トレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはセリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン等が挙げられ、より好ましくはセリン、トレオニン、グルタミン等が挙げられ、さらに好ましくはセリン、トレオニン等が挙げられる。
　野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質中のアミノ酸配列Aの位置は、特に制限されるものではない。アミノ酸配列Aは、その配列的特徴から、通常、野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質のアミノ酸配列のC末端側に含まれる配列である。C末端側とは、例えば、野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質のアミノ酸配列のC末端から、C末端のアミノ酸から数えて例えば70番目、好ましくは60番目、より好ましくは50番目、さらに好ましくは40番目、よりさらに好ましくは35番目のアミノ酸までである。
　野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質の由来昆虫としては、好ましくは内翅上目昆虫が挙げられ、より好ましくはカ科、ショウジョウバエ科等の双翅目昆虫；カイコガ科等の鱗翅目昆虫；ミツバチ科等の膜翅目昆虫等が挙げられ、さらに好ましくはカ科、ショウジョウバエ科等の双翅目昆虫が挙げられ、よりさらに好ましくはカ科昆虫が挙げられる。カ科の昆虫としては、例えば、ガンビエハマダラカ（Anopheles gambiae）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、ネッタイイエカ（Culex quinquefasciatus）等が挙げられる。ショウジョウバエ科の昆虫としては、例えば、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ウスグロショウジョウバエ（Drosophila pseudoobscura）、クロショウジョウバエ（Drosophila virillis）等が挙げられる。カイコガ科の昆虫としては、例えば、カイコガ（Bombyx mori）、クワコ（Bombyx mandarina）、イチジクカサン（Trilocha varians）等が挙げられる。ミツバチ科の昆虫としては、例えば、セイヨウミツバチ（Apis mellifera）、ヒメミツバチ（Apis florea）、オオミツバチ（Apis dorsata）、セイヨウオオマルハナバチ（Bombus terrestris）等が挙げられる。
　野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質として、具体的には、例えば、DmOR47a（アミノ酸配列：配列番号1）、BmOR56（アミノ酸配列：配列番号2）、AgOR1（アミノ酸配列：配列番号3）、AaOR9（アミノ酸配列：配列番号4）、AgOR28（アミノ酸配列：配列番号65）、AgOR47（アミノ酸配列：配列番号66）、AgOR11（アミノ酸配列：配列番号67）、AgOR27（アミノ酸配列：配列番号68）、AaOR5（アミノ酸配列：配列番号69）、AaOR31（アミノ酸配列：配列番号70）、AaOR72（アミノ酸配列：配列番号71）、AaOR110（アミノ酸配列：配列番号72）、AgOR2（アミノ酸配列：配列番号73）、AgOR10（アミノ酸配列：配列番号74）、AaOR15（アミノ酸配列：配列番号75）等が挙げられる。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、アミノ酸配列Aが変異してなるアミノ酸配列Bを含む。変異は、好ましくは置換である。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、アミノ酸配列Bについて、条件1～3からなる群より選択される少なくとも1種の条件を満たす。
　条件1は、アミノ酸配列Bにおいて、X3及び／又はX4が置換しており、X3が分岐鎖アミノ酸であり且つ／或いはX4が無電荷極性アミノ酸であること、である。
　条件1において、「X3及び／又はX4が置換」とは、アミノ酸配列BにおけるX3及び／又はX4が、アミノ酸配列AのX3及び／又はX4から置換していること（すなわち、異なるアミノ酸であること）を示す。
　条件1において、アミノ酸配列B中のX3で示される分岐鎖アミノ酸としては、例えばバリン、ロイシン、イソロイシン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはイソロイシン、ロイシン等が挙げられる。
　条件1において、アミノ酸配列B中のX4で示される無電荷極性アミノ酸としては、例えばグリシン、トレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはセリン、アスパラギン等が挙げられる。
　条件1において、アミノ酸配列B中、X3が分岐鎖アミノ酸であり且つX4が無電荷極性アミノ酸であることが好ましい。
　条件2は、アミノ酸配列AにおいてX5及びX6が共に正電荷極性アミノ酸である場合に、アミノ酸配列Bにおいて、X6が正電荷極性アミノ酸以外のアミノ酸であること、である。すなわち、条件2は、アミノ酸配列AにおいてX5及びX6が共に正電荷極性アミノ酸である場合に限定された条件である。
　条件2において、アミノ酸配列A中のX5又はX6で示される正電荷極性アミノ酸としては、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン等が挙げられ、好ましくはリシン、アルギニン等が挙げられる。
　条件2において、アミノ酸配列B中のX6で示されるアミノ酸は、正電荷極性アミノ酸以外のアミノ酸である限り、特に制限されない。該アミノ酸としては、好ましくは無電荷極性アミノ酸が挙げられる。該無電荷極性アミノ酸としては、例えばグリシン、トレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン等が挙げられる。これらの中でも、とりわけ好ましくはセリン、トレオニン等が挙げられる。
　条件3は、アミノ酸配列AにおいてX1及びX2の一方又は両方が正電荷極性アミノ酸である場合に、アミノ酸配列Bにおいて、X1及び／又はX2が置換しており、X1が無電荷極性アミノ酸であり且つ／或いはX2が疎水性アミノ酸であること、である。すなわち、条件3は、アミノ酸配列AにおいてX1及びX2の一方又は両方が正電荷極性アミノ酸である場合に限定された条件である。
　条件3において、アミノ酸配列A中のX1及びX2の内の少なくともX2が正電荷極性アミノ酸であることが好ましく、X2のみが正電荷極性アミノ酸であることがより好ましい。
　条件3において、アミノ酸配列A中のX1又はX2で示される正電荷極性アミノ酸としては、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン等が挙げられ、好ましくはリシン、アルギニン等が挙げられ、より好ましくはアルギニンが挙げられる。
　条件3において、「X1及び／又はX2が置換」とは、アミノ酸配列BにおけるX1及び／又はX2が、アミノ酸配列AのX1及び／又はX2から置換していること（すなわち、異なるアミノ酸であること）を示す。
　条件3において、アミノ酸配列B中のX1で示される無電荷極性アミノ酸としては、例えばグリシン、トレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはセリン、グルタミン等が挙げられる。
　条件3において、アミノ酸配列B中のX2で示される疎水性アミノ酸としては、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等が挙げられ、より好ましくはアラニンが挙げられる。
　条件3において、アミノ酸配列B中、X1が無電荷極性アミノ酸であり且つX2が疎水性アミノ酸であることが好ましい。
　本開示の一態様において、本開示の嗅覚受容体タンパク質は、アミノ酸配列Bについて、条件1A～3Aからなる群より選択される少なくとも1種の条件を満たすことが好ましい。
　条件1Aは、アミノ酸配列Bにおいて、X3が分岐鎖アミノ酸であり且つ／或いはX4が無電荷極性アミノ酸であること、である。条件1Aは、アミノ酸配列BにおいてX3及び／又はX4が置換しているか否かが関係ない以外は、条件1と同様である。つまり、条件1Aは、アミノ酸配列BにおいてX3及び／又はX4がアミノ酸配列Aから置換していない場合も包含する。
　条件2Aは、アミノ酸配列Bにおいて、X6が正電荷極性アミノ酸以外のアミノ酸であること、である。条件2Aは、アミノ酸配列AにおいてX5及びX6が共に正電荷極性アミノ酸であるか否かが関係ない以外は、条件2と同様である。つまり、条件2Aは、アミノ酸配列BにおいてX5及び／又はX6が置換していない場合も包含する。
　条件3Aは、アミノ酸配列Bにおいて、X1が無電荷極性アミノ酸であり且つ／或いはX2が疎水性アミノ酸であること、である。条件3Aは、アミノ酸配列AにおいてX1及びX2の一方又は両方が正電荷極性アミノ酸であるか否かが関係ない以外は、条件3と同様である。つまり、条件3Aは、アミノ酸配列BにおいてX1及び／又はX2がアミノ酸配列Aから置換していない場合も包含する。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、化学物質応答活性が著しく低減しない限りにおいて、上記した条件1～3の変異以外の他のアミノ酸変異を含むことができる。「著しく低減しない」とは、例えば、他のアミノ酸変異を含む本開示の嗅覚受容体タンパク質の化学物質応答活性が、対応する野生型昆虫嗅覚受容体の化学物質応答活性よりも高く、且つ他のアミノ酸変異を含まない本開示の嗅覚受容体タンパク質の化学物質応答活性100％に対して、例えば50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、よりさらに好ましくは90％以上である、ことを意味する。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質のアミノ酸配列は、条件1～3からなる群より選択される少なくとも1種の条件における変異のみを含む変異型昆虫嗅覚受容体のアミノ酸配列に対して、例えば85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは97％以上の同一性を有する。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質が他のアミノ酸変異を含む場合、本開示の嗅覚受容体タンパク質のアミノ酸配列は、条件1～3からなる群より選択される少なくとも1種の条件における変異のみを含む変異型昆虫嗅覚受容体のアミノ酸配列に対して、1若しくは複数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列であることが好ましい。「複数個」とは、例えば2～50個、好ましくは2～30個、より好ましくは2～20個、さらに好ましくは2～10、よりさらに好ましくは2～5個である。
　他のアミノ酸変異は、例えば置換、欠失、付加、挿入等が挙げられ、好ましくは置換が挙げられ、中でもより好ましくは保存的置換が挙げられる。また、一般式（1）中のφ2～φ7における変異の場合、無電荷極性アミノ酸と疎水性アミノ酸との置換も好ましい。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質の化学物質応答活性は、対応する野生型昆虫嗅覚受容体の化学物質応答活性よりも高い。本開示の嗅覚受容体タンパク質の化学物質応答活性は、対応する野生型昆虫嗅覚受容体の化学物質応答活性に対して、例えば1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、又は20倍以上である。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、化学物質応答活性が著しく損なわれない限りにおいて、他のアミノ酸配列、例えばタンパク質タグ、蛍光タンパク質、発光タンパク質、シグナル配列等のタンパク質又はペプチドが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等が挙げられる。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、化学物質応答活性が著しく損なわれない限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）の何れであってもよい。
　ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
　さらに、本開示の嗅覚受容体タンパク質には、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－OH、－SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイル基などのC1－6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、酸または塩基との塩の形態であってもよい。塩は、特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；　アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；　カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に製造することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術等を利用して製造することができる。
　3．ポリヌクレオチド、細胞、非ヒト動物
　本開示は、その一態様において、本開示の嗅覚受容体タンパク質のコード配列を含む、ポリヌクレオチド（本明細書において、「本開示のポリヌクレオチド」と示すこともある。）、本開示のポリヌクレオチドを含む、細胞（本明細書において、「本開示の細胞」と示すこともある。）、本開示の細胞を含む、非ヒト動物（本明細書において、「本開示の非ヒト動物」と示すこともある。）に関する。以下に、これらについて説明する。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質のコード配列は、本開示の嗅覚受容体タンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドである限り、特に制限されない。
　本開示のポリヌクレオチドは、その一態様において、本開示の嗅覚受容体タンパク質の発現カセットを含む。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質の発現カセットは、細胞内で本開示の嗅覚受容体タンパク質を発現可能なポリヌクレオチドである限り特に制限されない。本開示の嗅覚受容体タンパク質の発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された本開示の嗅覚受容体タンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質の発現カセットに含まれるプロモーターとしては、特に制限されず、対象細胞に応じて適宜選択することができる。プロモーターとしては、例えばpol II系プロモーターを各種使用することができる。pol II系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター等が挙げられる。その他にも、プロモーターとして、例えばtrcやtac等のトリプトファンプロモーター、lacプロモーター、T7プロモーター、T5プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等が挙げられる。
　本開示の嗅覚受容体タンパク質の発現カセットは、必要に応じて、他のエレメント（例えば、マルチクローニングサイト（MCS）、薬剤耐性遺伝子、複製起点、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、レポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質等）コード配列、薬剤耐性遺伝子コード配列などが挙げられる。）を含んでいてもよい。
　本開示のポリヌクレオチドは、ベクターの形態であることができる。使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2、pPIC3.5K等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpcDNA、pCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
　本開示の細胞は、本開示のポリヌクレオチドを含む限り特に制限されない。細胞としては、例えば、Escherichia coli K12等の大腸菌、Bacillus subtilis MI114等のバチルス属細菌、Saccharomyces cerevisiae AH22等の酵母、Spodoptera frugiperda 由来の Sf細胞系もしくはTrichoplusia ni由来のHighFive細胞系、嗅神経細胞等の昆虫細胞、COS7細胞等の動物細胞等を挙げることができる。動物細胞としては、好ましくは、哺乳動物由来の培養細胞、具体的には、COS7細胞、CHO細胞、HEK293細胞、HEK293FT細胞、Hela細胞、PC12細胞、N1E-115細胞、SH-SY5Y細胞等が挙げられる。
　本開示の細胞は、後述の化学物質検出用途にそのまま使用できるという観点から、昆虫の嗅覚受容体共受容体のコード配列を含むことが好ましい。昆虫の嗅覚受容体共受容体は、嗅覚受容体と同様に7回膜貫通構造を有する膜タンパク質であるものの、それ自身は匂い物質を認識せず、嗅覚受容体とヘテロ複合体を形成して機能する。嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とから構成されるヘテロ複合体である嗅覚受容体複合体は、匂い物質で活性化されるイオンチャンネル活性が備わっており、活性化されるとナトリウムイオン（Na+）、カルシウムイオン（Ca2+）等の陽イオンを細胞内に流入させる。
　同様の観点から、本開示の細胞は、嗅覚受容体が応答した場合に細胞内に流入するイオン（カルシウムイオン等）により発色又は発光するタンパク質のコード配列を含むことが好ましい。このようなタンパク質としては、イクオリン、Yellow Cameleon（YC）、GCaMP等が挙げられる。或いは、本開示の細胞は、カルシウムイオン依存性蛍光色素（例えばFura-2、Fluo-3、Fluo-4等）を含むことが好ましい。
　同様の観点から、本開示の細胞は、本開示の嗅覚受容体タンパク質を含む、すなわち、本開示の細胞においては本開示の嗅覚受容体タンパク質が発現している。この場合、本開示の嗅覚受容体タンパク質は、7回膜貫通構造を有するので、膜タンパク質として、細胞膜上に配置される。
　本開示の非ヒト動物は、本開示の細胞を含む限り特に制限されない。非ヒト動物としては、特に制限されないが、後述の化学物質検出用途に好適であるという観点から、昆虫が好ましい。昆虫については、上記「2．嗅覚受容体タンパク質」における説明と同様である。また、同様の観点から、本開示の非ヒト動物における本開示の細胞は、嗅神経細胞を含むことが好ましい。
　4．用途
　本開示の嗅覚受容体タンパク質は、化学物質に応答して、細胞内に陽イオン（ナトリウムイオン（Na+）、カルシウムイオン（Ca2+）等）を流入させる活性を有する。この陽イオンを検出することにより、或いはこの陽イオンの流入により惹起される嗅神経細胞活性化に基づく行動変化を検知することにより、化学物質を検出することができる。このため、本開示の嗅覚受容体タンパク質は、化学物質検出素子として利用することができる。
　本開示は、その一態様において、本開示の嗅覚受容体タンパク質からなる化学物質検出素子（本開示の検出素子）、さらには本開示の検出素子を含む細胞、脂質二重膜（人工細胞膜）、又は該細胞を含む非ヒト動物を備える、化学物質検出センサ（本開示の検出センサ）、に関する。
　細胞、脂質二重膜、又は非ヒト動物を利用した化学物質検出センサは、既に公知であり、その具体的な構成は、例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３等に記載の構成を採用することができる。本開示の細胞又は脂質二重膜を備える化学物質検出センサは、例えば、本開示の細胞又は脂質二重膜を保持する容器、本開示の細胞における化学物質応答（例えば光）を検出すると信号を出力するセンサ、及び前記信号に基づいて化学物質を検出する判定器を備える。本開示の非ヒト動物を備える化学物質検出センサは、例えば、本開示の非ヒト動物の動作を検知する検知部（例えば動体センサ、振動センサ、音センサ等）を備える。
　以下に、実施例に基づいて本発明の一態様を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　以下の実施例で使用した野生型嗅覚受容体遺伝子は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　試験例1．DmOR47aの化学物質応答活性の測定
　嗅覚受容体（野生型DmOR47a及び変異型DmOR47a）の化学物質に対する応答活性を測定した。
　試験例1-1．発現プラスミドの作製
　＜比較例1-1．野生型DmOR47a発現プラスミドの作製＞
　ショウジョウバエ（Drosophila　melanogaster）成虫RNA（TAKARA社製）を鋳型に用いて、Super　Script　III逆転写酵素（インビトロジェン社製）を添加し、55℃で50分間、次いで75℃で15分間保温することにより逆転写反応を行い、cDNAを得た。得られたcDNA1μLを鋳型に用い、10μLのフォワードプライマーDmOR47a－5’（5’-caccatggacagttttctgcaagtacagaa；配列番号9）1μL、10μMのリバースプライマーDmOR47a－3’（5’-ttaggagaatgatctcagcattgtgatgta；配列番号10）1μL及びKOD　Plus　neo　DNAポリメラーゼ（東洋紡製）1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、（1）94℃、2分間、（2）98℃、10秒間、（3）68℃、1.5分間で行い、（2）～（3）の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約1.2kbのDNAを回収した。回収されたDNAをpENTR／D-TOPOベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、pENTR－DmOR47aと名付けたプラスミドを得た。4μLのpENTR－DmOR47a、1μLのpcDNA6.2V5－DEST及び2μLのLRクロナーゼII（インビトロジェン社製）を混合し室温で1時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA6.2－DmOR47aと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドpcDNA6.2－DmOR47aの塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、配列番号5で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号5で示される塩基配列は配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする。図１に、一般式（1）：φ7X1X2Z1X3X4Z2Z3φ6Uφ5φ4φ3φ2φ1X5X6で示されるアミノ酸配列と、該アミノ酸配列に相当する、配列番号1で示されるアミノ酸配列中の一部のアミノ酸配列との対応関係を示す。
　＜実施例1-1．変異型DmOR47a（RX4S）発現プラスミドの作製＞
　野生型DmOR47aのアミノ酸配列において372番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX4）であるアルギニンがセリンに変異した変異型DmOR47a（RX4S）（アミノ酸配列：配列番号11）のコード配列（塩基配列：配列番号12）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、以下のように作製した。
　野生型DmOR47aのアミノ酸配列において372番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX4）であるアルギニンがセリンに変換するように設計したPCRプライマー（プライマーF：CCTTCTCATCGATTGTTAGCACGGCGATGTCCTAC（配列番号13）及びプライマーR：GTAGGACATCGCCGTGCTAACAATCGATGAGAAGG（配列番号14））を合成した。これらのプライマーを用いて、pcDNA6.2－DmOR47aを鋳型とするPCR増幅を行った（反応手順、条件は定法による）。増幅後のPCR反応液をDpnIで消化した後に、大腸菌（DH5α）にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌を、25cm四方の（アンピシリンを添加済み）プレートに播種して、37℃で培養してコロニーを形成させた。コロニーを2つ選択し、再度LB液体培地で培養した。その後、それらが保持するプラスミドの塩基配列を決定し、変異型DmOR47a（RX4S）発現プラスミドを得た。
　＜実施例1-2．変異型DmOR47a（VX3L-RX4S）発現プラスミドの作製＞
　野生型DmOR47aのアミノ酸配列において371番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX3）であるバリンがロイシンに変異し、372番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX4）であるアルギニンがセリンに変異した変異型DmOR47a（VX3L-RX4S）（アミノ酸配列：配列番号15）のコード配列（塩基配列：配列番号16）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、作製した。具体的には、PCRプライマーとして、プライマーF：CCTTCTCATCGATTCTTAGCACGGCGATGTCC（配列番号17）及びプライマーR：GGACATCGCCGTGCTAAGAATCGATGAGAAGG（配列番号18）を使用し、PCRの鋳型として変異型DmOR47a（RX4S）発現プラスミド（実施例1-1）を使用する以外は、実施例1-1と同様にして作製した。
　＜実施例1-3．変異型DmOR47a（VX3L-RX4S+alpha）発現プラスミドの作製＞
　変異型DmOR47a（VX3L-RX4S）において、さらに複数の変異が追加された変異型DmOR47a（VX3L-RX4S+alpha）（アミノ酸配列：配列番号19）のコード配列（塩基配列：配列番号20）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、作製した。変異箇所については、図１の通りである。具体的には、PCRの鋳型として変異型DmOR47a（VX3L-RX4S）発現プラスミド（実施例1-2）を使用して、各変異導入用プライマーセットを使用して順次変異を導入して作製した。
　＜参考例1-1．キメラOrco発現プラスミドの作製＞
　既報（特開2018－50556号公報）に従って、ショウジョウバエ共受容体の一部とミツバチ共受容体の一部との融合タンパク質Dm（NT－TM4）AmORCO（アミノ酸配列：配列番号21）のコード配列（塩基配列：配列番号22）を含むプラスミド（pcDNA3.1）を、作製した。Dm（NT－TM4）AmORCOでは、N末端領域（NT）から第4膜貫通ドメイン（TM4）までのアミノ酸配列（そのN末端アミノ酸残基から234番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列）がショウジョウバエ共受容体由来（Dm（NT－TM4）であり、第2細胞内ループからC末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来（Am（IC2－CT））である。
　試験例1-2．発現プラスミドの細胞への導入
　HEK293FT細胞（Invitrogen社から購入）を10cmシャーレに3×10^6cells／シャーレで播種し、10% FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、37℃、5％CO2条件下にて約24時間培養した。作製したいずれかの嗅覚受容体発現プラスミド1.5μgと、嗅覚受容体共受容体発現プラスミド3.0μgと、GFP-イクオリン（GAP）発現プラスミド8μgとを、12.5μLのPlus試薬及び31.25μLのリポフェクトアミンLTX（Invitrogen社製）と混合し、10分間保持した。その後、この混合液を上記細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション開始4時間後に96wellプレートに9×10^4cells／wellで播種し、10％FBSを含むDMEM培地（ナカライテスク社製）中で、37℃、5％CO2条件下にて約24時間培養した。これにより、嗅覚受容体発現プラスミド、嗅覚受容体共受容体発現プラスミド、及びGAP発現プラスミドがトランジェントに導入された形質転換細胞を得た。
　試験例1-3．活性測定
　GFP-イクオリン（GAP）はカルシウムイオンと結合すると、セレンテラジン等の基質の存在下で活性化されて緑色蛍光を発する。したがって、GAPを発現する細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇は直接、蛍光量の増大として現れることになるため、被検物質の添加により嗅覚受容体複合体がイオンチャネルとして機能しているかどうかを蛍光量の変化から測定することができる。
　上記形質転換細胞の培養液を除去してAssay buffer（0.5μMセレンテラジンh（プロメガ社製）及び0.3％のBSAを含むHanks-HEPES（20 mM pH7.4））に置換し、更に4時間、室温で静置した。次いで、Flexstation 3（Molecular devices社製）を用いて、嗅覚受容体に対応する被検物質を細胞の培養液中に添加するとともに細胞の蛍光量を測定した。
　本試験例では、被検物質として、DmOR47aが認識する化学物質であるペンチルアセテートを使用した。
　結果を図１に示す。実施例1-1～1-3の変異型DmOR47aは野生型DmOR47aに比べて化学物質応答活性が高いことが分かった。
　試験例2．BmOR56の化学物質応答活性の測定
　嗅覚受容体（野生型BmOR56及び変異型BmOR56）の化学物質に対する応答活性を測定した。
　試験例2-1．発現プラスミドの作製
　＜比較例2-1．野生型BmOR56発現プラスミドの作製＞
　いずれか一方のDNA鎖に配列番号6で示される塩基配列を有する二本鎖DNAを合成した。この二本鎖DNA100ngを鋳型に用いて、10μMのフォワードプライマーBmOR56－5’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaagctcctggagaagctag；配列番号23）1μL、10μMのリバースプライマーBmOR56－3’（5’-gccactgtgctggattcatgttttattcatttgcgactgac；配列番号24）1μL及びKOD　Plus　neoDNAポリメラーゼ（東洋紡製）1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、（1）94℃、2分間、（2）98℃、10秒間、（3）63℃、30秒間、（4）68℃、1.5分間で行い、（2）～（4）の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物を、EcoRVで消化されたpcDNA6.2（インビトロジェン社製）に、In－Fusion　HD　Cloning　Kit（TAKARA社製）を使用して連結した。連結されたDNAを大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA6.2－BmOR56と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドpcDNA6.2－BmOR56の塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、配列番号6で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号6で示される塩基配列は配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードする。図２に、一般式（1）：φ7X1X2Z1X3X4Z2Z3φ6Uφ5φ4φ3φ2φ1X5X6で示されるアミノ酸配列と、該アミノ酸配列に相当する、配列番号2で示されるアミノ酸配列中の一部のアミノ酸配列との対応関係を示す。
　＜実施例2-1．変異型BmOR56（IX1Q）発現プラスミドの作製＞
　野生型BmOR56のアミノ酸配列において380番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX1）であるイソロイシンがグルタミンに変異した変異型BmOR56（IX1Q）（アミノ酸配列：配列番号25）のコード配列（塩基配列：配列番号26）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、以下のように作製した。
　野生型BmOR56のアミノ酸配列において380番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX1）であるイソロイシンがグルタミンに変換するように設計したPCRプライマー（プライマーF：CGGTCGCCACTTTTCAGAGGATCCTCAAAGGAG（配列番号27）及びプライマーR：CTCCTTTGAGGATCCTCTGAAAAGTGGCGACCG（配列番号28））を合成した。pcDNA6.2－BmOR56を鋳型として、これらのプライマーを用いたPCRにより上記実施例と同様にして変異導入を行い、変異型BmOR56（IX1Q）発現プラスミドを得た。
　＜実施例2-2．変異型BmOR56（RX2A）発現プラスミドの作製＞
　野生型BmOR56のアミノ酸配列において381番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX2）であるアルギニンがアラニンに変異した変異型BmOR56（RX2A）（アミノ酸配列：配列番号29）のコード配列（塩基配列：配列番号30）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、作製した。具体的には、PCRプライマーとして、プライマーF：GTCGCCACTTTTATCGCAATCCTCAAAGGAGCC（配列番号31）及びプライマーR：GGCTCCTTTGAGGATTGCGATAAAAGTGGCGAC（配列番号32）を使用する以外は、実施例2-1と同様にして作製した。
　＜実施例2-3．変異型BmOR56（KX4S）発現プラスミドの作製＞
　野生型BmOR56のアミノ酸配列において384番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX4）であるリシンがセリンに変異した変異型BmOR56（KX4S）（アミノ酸配列：配列番号33）のコード配列（塩基配列：配列番号34）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、作製した。具体的には、PCRプライマーとして、プライマーF：CACTTTTATCAGGATCCTCAGCGGAGCCTATAGTTACTAC（配列番号35）及びプライマーR：GTAGTAACTATAGGCTCCGCTGAGGATCCTGATAAAAGTG（配列番号36）を使用する以外は、実施例2-1と同様にして作製した。
　＜実施例2-4．変異型BmOR56（KX4N）発現プラスミドの作製＞
　野生型BmOR56のアミノ酸配列において384番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX4）であるリシンがアスパラギンに変異した変異型BmOR56（KX4N）（アミノ酸配列：配列番号37）のコード配列（塩基配列：配列番号38）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、作製した。具体的には、PCRプライマーとして、プライマーF：CACTTTTATCAGGATCCTCAACGGAGCCTATAGTTACTAC（配列番号39）及びプライマーR：GTAGTAACTATAGGCTCCGTTGAGGATCCTGATAAAAGTG（配列番号40）を使用する以外は、実施例2-1と同様にして作製した。
　＜実施例2-5．変異型BmOR56（IX1Q-RX2A-KX4S）発現プラスミドの作製＞
　野生型BmOR56のアミノ酸配列において、380番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX1）であるイソロイシンがグルタミンに変異し、381番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX2）であるアルギニンがアラニンに変異し、384番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX4）であるリシンがセリンに変異した変異型BmOR56（IX1Q-RX2A-KX4S）（アミノ酸配列：配列番号41）のコード配列（塩基配列：配列番号42）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、作製した。具体的には、上記実施例と同様にして、各変異導入用プライマーセットを使用して順次変異を導入して作製した。
　試験例2-2．発現プラスミドの細胞への導入、及び活性測定
　試験例1-2と同様にして発現プラスミドを細胞へ導入し、試験例1-3と同様にして活性測定した。本試験例では、被検物質として、シスジャスモンを使用した。
　結果を図２に示す。実施例2-1～2-5の変異型BmOR56は野生型BmOR56に比べて化学物質応答活性が高いことが分かった。
　試験例3．AgOR1の化学物質応答活性の測定
　嗅覚受容体（野生型AgOR1及び変異型AgOR1）の化学物質に対する応答活性を測定した。
　試験例3-1．発現プラスミドの作製
　＜比較例3-1．野生型AgOR1発現プラスミドの作製＞
　いずれか一方のDNA鎖に配列番号7で示される塩基配列を有する二本鎖DNAを合成した。この二本鎖DNA100ngを鋳型に用いて、10μMのフォワードプライマーAgOR1－5’（5’- tggaattctgcagatcaccatgaagctgaacaaactgaac；配列番号43）1μL、10μMのリバースプライマーAgOR1－3’（5’- gccactgtgctggatttactctgattccatgctctg；配列番号44）1μL及びKOD　Plus　neoDNAポリメラーゼ（東洋紡製）1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、（1）94℃、2分間、（2）98℃、10秒間、（3）63℃、30秒間、（4）68℃、1.5分間で行い、（2）～（4）の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物を、EcoRVで消化されたpcDNA6.2（インビトロジェン社製）に、In－Fusion　HD　Cloning　Kit（TAKARA社製）を使用して連結した。連結されたDNAを大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA6.2－AgOR1と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドpcDNA6.2－AgOR1の塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、配列番号7で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号7で示される塩基配列は配列番号3で示されるアミノ酸配列をコードする。図３に、一般式（1）：φ7X1X2Z1X3X4Z2Z3φ6Uφ5φ4φ3φ2φ1X5X6で示されるアミノ酸配列と、該アミノ酸配列に相当する、配列番号3で示されるアミノ酸配列中の一部のアミノ酸配列との対応関係を示す。
　＜実施例3-1．変異型AgOR1（MX3L-KX4S）発現プラスミドの作製＞
　野生型AgOR1のアミノ酸配列において401番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX3）であるメチオニンがロイシンに変異し、402番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX4）であるリシンがセリンに変異した変異型AgOR1（MX3L-KX4S）（アミノ酸配列：配列番号45）のコード配列（塩基配列：配列番号46）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、以下のように作製した。
　野生型AgOR1のアミノ酸配列において401番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX3）であるメチオニンがロイシンに変換し、402番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX4）であるリシンがセリンに変換するように設計したPCRプライマーF：CACATTTTTGCAGATTTTGAGCCTATCGTACTCCTATC（配列番号47及び49）及びプライマーR：GATAGGAGTACGATAGGCTCAAAATCTGCAAAAATGTG（配列番号48及び50））を合成した。pcDNA6.2－AgOR1を鋳型として、これらのプライマーを用いたPCRにより上記実施例と同様にして変異導入を順次行い、変異型AgOR1（MX3L-KX4S）発現プラスミドを得た。
　＜実施例3-2．変異型AgOR1（MX3L-KX4N）発現プラスミドの作製＞
　野生型AgOR1のアミノ酸配列において401番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX3）であるメチオニンがロイシンに変異し、402番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX4）であるリシンがアスパラギンに変異した変異型AgOR1（MX3L-KX4 N）（アミノ酸配列：配列番号51）のコード配列（塩基配列：配列番号52）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、作製した。具体的には、401番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX4）であるリシンがアスパラギンに変換し、402番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX4）であるリシンがアスパラギンに変換するように設計したPCRプライマーF：CACATTTTTGCAGATTTTGAACCTATCGTACTCCTATC（配列番号53）及びプライマーR：GATAGGAGTACGATAGGTTCAAAATCTGCAAAAATGTG（配列番号54））を合成し、実施例3-1と同様にして作製した。
　＜実施例3-3．変異型AgOR1（MX3L-KX4S+alpha）発現プラスミドの作製＞
　変異型AgOR1（MX3L-KX4S）において、さらに複数の変異が追加された変異型AgOR1（MX3L-KX4S+alpha）（アミノ酸配列：配列番号55）のコード配列（塩基配列：配列番号56）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、作製した。変異箇所については、図３の通りである。具体的には、PCRの鋳型として変異型AgOR1（MX3L-KX4S）発現プラスミド（実施例3-1）を使用して、各変異導入用プライマーセットを使用して順次変異を導入して作製した。
　試験例3-2．発現プラスミドの細胞への導入、及び活性測定
　試験例1-2と同様にして発現プラスミドを細胞へ導入し、試験例1-3と同様にして活性測定した。本試験例では、被検物質として、フェノールを使用した。
　結果を図３に示す。実施例3-1～3-3の変異型AgOR1は野生型AgOR1に比べて化学物質応答活性が高いことが分かった。
　試験例4．AaOR9の化学物質応答活性の測定
　嗅覚受容体（野生型AaOR9及び変異型AaOR9）の化学物質に対する応答活性を測定した。
　試験例4-1．発現プラスミドの作製
　＜比較例4-1．野生型AaOR9発現プラスミドの作製＞
　いずれか一方のDNA鎖に配列番号8で示される塩基配列を有する二本鎖DNAを合成した。この二本鎖DNA100ngを鋳型に用いて、10μMのフォワードプライマーAaOR9－5’（5’- tggaattctgcagatcaccatgtccgtcgagaagatcctggc；配列番号57）1μL、10μMのリバースプライマーAaOR9－3’（5’- gccactgtgctggatttagctataaacacgtttcaaaagag；配列番号58）1μL及びKOD　Plus　neoDNAポリメラーゼ（東洋紡製）1μLを用いてPCRを行った。PCR反応は、（1）94℃、2分間、（2）98℃、10秒間、（3）63℃、30秒間、（4）68℃、1.5分間で行い、（2）～（4）の工程は35サイクル繰り返し行った。得られたPCR産物を、EcoRVで消化されたpcDNA6.2（インビトロジェン社製）に、In－Fusion　HD　Cloning　Kit（TAKARA社製）を使用して連結した。連結されたDNAを大腸菌へ導入して培養することにより、pcDNA6.2－AaOR9と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドpcDNA6.2－AaOR9の塩基配列をDNAシーケンサーにより解析したところ、配列番号8で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号8で示される塩基配列は配列番号4で示されるアミノ酸配列をコードする。図４に、一般式（1）：φ7X1X2Z1X3X4Z2Z3φ6Uφ5φ4φ3φ2φ1X5X6で示されるアミノ酸配列と、該アミノ酸配列に相当する、配列番号4で示されるアミノ酸配列中の一部のアミノ酸配列との対応関係を示す。
　＜実施例4-1．変異型AaOR9（RX6T）発現プラスミドの作製＞
　野生型AaOR9のアミノ酸配列において374番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX6）であるアルギニンがトレオニンに変異した変異型AaOR9（RX6T）（アミノ酸配列：配列番号59）のコード配列（塩基配列：配列番号60）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、以下のように作製した。
　野生型AaOR9のアミノ酸配列において374番目のアミノ酸残基（一般式（1）のX6）であるアルギニンがトレオニンに変換するように設計したPCRプライマー（プライマーF：CTCATATTTCACTCTTTTGAAAACGGTTTATAGCTAA（配列番号61）及びプライマーR：TTAGCTATAAACCGTTTTCAAAAGAGTGAAATATGAG（配列番号62））を合成した。pcDNA6.2－AaOR9を鋳型として、これらのプライマーを用いたPCRにより上記実施例と同様にして変異導入を行い、変異型AaOR9（RX6T）発現プラスミドを得た。
　＜実施例4-2．変異型AaOR9（RX6T+alpha）発現プラスミドの作製＞
　変異型AaOR9（RX6T）において、さらに複数の変異が追加された変異型AaOR9（RX6T+alpha）（アミノ酸配列：配列番号63）のコード配列（塩基配列：配列番号64）を含むプラスミド（pcDNA6.2）を、作製した。変異箇所については、図４の通りである。具体的には、PCRの鋳型として変異型AaOR9（RX6T）発現プラスミド（実施例4-1）を使用して、各変異導入用プライマーセットを使用して順次変異を導入して作製した。
　試験例4-2．発現プラスミドの細胞への導入、及び活性測定
　試験例1-2と同様にして発現プラスミドを細胞へ導入し、試験例1-3と同様にして活性測定した。本試験例では、被検物質として、スカトールを使用した。
　結果を図４に示す。実施例4-1～4-2の変異型AaOR9は野生型AaOR9に比べて化学物質応答活性が高いことが分かった。
　試験例5．他の昆虫嗅覚受容体の化学物質応答活性の測定
　試験例1～4の結果より、
（A）X3が分岐鎖アミノ酸であり且つ／或いはX4が無電荷極性アミノ酸となるように変異させること、
（B）野生型においてX5及びX6が共に正電荷極性アミノ酸である場合に、X6が正電荷極性アミノ酸以外のアミノ酸になるように変異させること、並びに
（C）野生型においてX1及びX2の一方又は両方が正電荷極性アミノ酸である場合に、X1が無電荷極性アミノ酸であり且つ／或いはX2が疎水性アミノ酸になるように変異させること、
からなる群より選択される少なくとも1つにより、昆虫嗅覚受容体の化学物質応答活性を向上させることができることが分かった。
　また、多数の昆虫嗅覚受容体（一部の例として、AgOR28、AgOR47、AgOR11c、AgOR27a、AaOR5、AaOR31、AaOR72a、AaOR110等）について、野生型と変異型とで化学物質応答活性を比較する試験を試験例1～4と同様にして行ったところ、上記規則を支持する結果が得られた。

Claims (14)

  1. 変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質であって、
    対応する野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質中の一般式（1）：
    φ7X1X2Z1X3X4Z2Z3φ6Uφ5φ4φ3φ2φ1X5X6
    ［式中、X1～X6及びZ1～Z3は野生型昆虫嗅覚受容体のアミノ酸配列に由来するアミノ酸を示し、φ1は疎水性アミノ酸を示し、φ2～φ7はそれぞれ独立して無電荷極性アミノ酸又は疎水性アミノ酸を示し、Uは無電荷極性アミノ酸を示す。］
    で示されるアミノ酸配列Aが変異してなるアミノ酸配列Bを含み、
    下記条件1～3：
    （条件1）前記アミノ酸配列Bにおいて、X3及び／又はX4が置換しており、X3が分岐鎖アミノ酸であり且つ／或いはX4が無電荷極性アミノ酸であること、
    （条件2）前記アミノ酸配列AにおいてX5及びX6が共に正電荷極性アミノ酸である場合に、前記アミノ酸配列Bにおいて、X6が正電荷極性アミノ酸以外のアミノ酸であること、及び
    （条件3）前記アミノ酸配列AにおいてX1及びX2の一方又は両方が正電荷極性アミノ酸である場合に、前記アミノ酸配列Bにおいて、X1及び／又はX2が置換しており、X1が無電荷極性アミノ酸であり且つ／或いはX2が疎水性アミノ酸であること、
    からなる群より選択される少なくとも1種の条件を満たす、
    変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
  2. 前記条件1を満たし、X3がイソロイシン又はロイシンであり且つ／或いはX4がセリン又はアスパラギンである、請求項１に記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
  3. 前記条件2を満たし、X6が無電荷極性アミノ酸である、請求項１又は２に記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
  4. 前記条件2を満たし、X6がセリン又はトレオニンである、請求項１～３のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
  5. 前記条件3を満たし、X1がセリン又はグルタミンであり且つ／或いはX2がアラニンである、請求項１～４のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
  6. 条件1において、X3がイソロイシン又はロイシンであり且つ／或いはX4がセリン又はアスパラギンであり、
    条件2において、X6がセリン又はトレオニンであり、
    条件3において、X1がセリン又はグルタミンであり且つ／或いはX2がアラニンである、請求項１～５のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
  7. 下記条件1A～3A：
    （条件1A）前記アミノ酸配列Bにおいて、X3が分岐鎖アミノ酸であり且つ／或いはX4が無電荷極性アミノ酸であること、
    （条件2A）前記アミノ酸配列Bにおいて、X6が正電荷極性アミノ酸以外のアミノ酸であること、及び
    （条件3A）前記アミノ酸配列Bにおいて、X1が無電荷極性アミノ酸であり且つ／或いはX2が疎水性アミノ酸であること、
    からなる群より選択される少なくとも1種の条件を満たす、
    請求項１～６のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
  8. 前記アミノ酸配列Aが、前記野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質のアミノ酸配列のC末端側に含まれる配列である、請求項１～７のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
  9. 前記野生型昆虫嗅覚受容体タンパク質が内翅上目昆虫の野生型嗅覚受容体タンパク質である、請求項１～８のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質。
  10. 請求項１～９のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質のコード配列を含む、ポリヌクレオチド。
  11. 請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
  12. 請求項１１に記載の細胞を含む、非ヒト動物。
  13. 請求項１～９のいずれかに記載の変異型昆虫嗅覚受容体タンパク質からなる、化学物質検出素子。
  14. 請求項１３に記載の化学物質検出素子を含む脂質二重膜、細胞、又は前記細胞を含む非ヒト動物を備える、化学物質検出センサ。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2022024903A1 (ja) * 2020-07-27 2022-02-03
CN114921469A (zh) * 2022-04-12 2022-08-19 广西壮族自治区蚕业技术推广站 家蚕嗅觉受体基因BmOR56的用途
WO2024195715A1 (ja) 2023-03-17 2024-09-26 住友化学株式会社 ポリヌクレオチド
WO2024195714A1 (ja) 2023-03-17 2024-09-26 住友化学株式会社 ヒトリガ科の昆虫由来細胞
WO2024225293A1 (ja) 2023-04-28 2024-10-31 住友化学株式会社 センサタンパク質の活性測定用細胞の製造方法
WO2024241939A1 (ja) * 2023-05-19 2024-11-28 住友化学株式会社 積層体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018050556A (ja) 2016-09-29 2018-04-05 住友化学株式会社 嗅覚受容体共受容体
WO2018062201A1 (ja) * 2016-09-29 2018-04-05 住友化学株式会社 嗅覚受容体複合体及びそれを発現する細胞

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002326834A1 (en) * 2001-09-04 2003-03-18 Sentigen Corp. Anopheles gambiae odorant receptors and genes
WO2017106914A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-29 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method of screening

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018050556A (ja) 2016-09-29 2018-04-05 住友化学株式会社 嗅覚受容体共受容体
WO2018062201A1 (ja) * 2016-09-29 2018-04-05 住友化学株式会社 嗅覚受容体複合体及びそれを発現する細胞
WO2018062203A1 (ja) * 2016-09-29 2018-04-05 住友化学株式会社 嗅覚受容体共受容体

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Nucleotide 23 November 2017 (2017-11-23), "Aedes aegypti odorant receptor 9 (Or9), mRNA", XP055903941, retrieved from ncbi Database accession no. NM_001358324 *
DATABASE Protein 11 December 2019 (2019-12-11), "RecName: Full=Odorant receptor Or1; AltName: Full=AgOr1 Protein", XP055903937, retrieved from ncbi Database accession no. Q8WTE7 *
K. HOFMANNW. STOFFEL: "TMbase - a database of membrane spanning proteins segments", BIOL. CHEM. HOPPE-SEYLER, vol. 374, 1993, pages 166, Retrieved from the Internet <URL:https://embnet.vital-it.ch/software/TMPREDform.html>
KARLIN SALTSCHUL SF: "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 90, 1993, pages 5873 - 7, XP001030852, DOI: 10.1073/pnas.90.12.5873
KARLIN SALTSCHUL SF: "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scorings schemes", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 87, 1990, pages 2264 - 2268
PLOS ONE, vol. 7, March 2012 (2012-03-01), pages e32372
See also references of EP4190900A4

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2022024903A1 (ja) * 2020-07-27 2022-02-03
CN114921469A (zh) * 2022-04-12 2022-08-19 广西壮族自治区蚕业技术推广站 家蚕嗅觉受体基因BmOR56的用途
CN114921469B (zh) * 2022-04-12 2024-02-27 广西壮族自治区蚕业技术推广站 家蚕嗅觉受体基因BmOR56的用途
WO2024195715A1 (ja) 2023-03-17 2024-09-26 住友化学株式会社 ポリヌクレオチド
WO2024195714A1 (ja) 2023-03-17 2024-09-26 住友化学株式会社 ヒトリガ科の昆虫由来細胞
EP4682251A1 (en) 2023-03-17 2026-01-21 Sumitomo Chemical Company, Limited Cells derived from insect of subfamily arctiinae
EP4682257A1 (en) 2023-03-17 2026-01-21 Sumitomo Chemical Company, Limited Polynucleotide
WO2024225293A1 (ja) 2023-04-28 2024-10-31 住友化学株式会社 センサタンパク質の活性測定用細胞の製造方法
EP4703467A1 (en) 2023-04-28 2026-03-04 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing cells for measuring activity of sensor protein
WO2024241939A1 (ja) * 2023-05-19 2024-11-28 住友化学株式会社 積層体

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