WO2022014620A1 - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン - Google Patents

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正之 福村
順平 大塚
哲哉 野阪
良一 小埜
義裕 河岡
正樹 今井
誠也 山吉
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Mie University NUC
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Biocomo Inc
Mie University NUC
University of Tokyo NUC
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    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine against the new coronavirus (SARS-CoV-2).
  • the new coronavirus (SARS-CoV-2) is an enveloped virus that has a positive-strand single-stranded RNA as a genome, has a 5'end cap structure, and has a 3'end poly A sequence, and is extremely long as a virus, about 30 kb. Has a genome. Although the virus has a repair function in its own RNA polymerase, mutation of the genome is unavoidable.
  • the genome consists of 14 ORFs and encodes 27 proteins.
  • the protein consists of four types of structural proteins: Membrane (M), Envelope (E), Spike (S), and Nucleocapid protein (N).
  • the Spike protein is mainly used as an antigen for vaccines.
  • the Peplomer protein consists of an S1 region containing a receptor binding domain (RBD) and an S2 region required for viral membrane fusion with the host cell membrane.
  • Infection of the host cell by SARS-CoV-2 begins with the binding of RBD to the host cell's human angiotensin converting enzyme 2 (hACE2).
  • RBD has two states, up and down, and can be combined with hACE2 in the up state. This binding exposes S2'cleaved by a transmembrane serine protease 2 (TMPRSS2) protease, resulting in cell-virus fusion.
  • TMPRSS2 transmembrane serine protease 2
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • ACE2 a receptor for SARS-CoV-2, is expressed on the surface of airway epithelial cells including type II alveolar epithelium and infects airway epithelial cells via RBD of SARS-CoV-2. Diffuse alveolar injury due to ARDS is characteristic of SARS-CoV-2 infected pneumonia.
  • the histology of diffuse alveolar disorders generally changes from the exudative phase to the organizing phase and then to the fibrotic phase over time, but in SARS-CoV-2 infection, these In many cases, lesions of different stages of the disease progress simultaneously in the lung lobes of the same individual and become severe.
  • the neutralizing antibody action of the vaccine is to inhibit the binding between RBD and hACE2.
  • the following mutations in the Spike protein have been reported so far, and it is expected that they will affect the neutralizing antibody induced by the vaccine.
  • a British type (alpha): N501Y / D614G mutation, a South African type (beta): E484K / N501Y / D614G, and a Japanese type: E484K have been reported.
  • the N501Y mutation is an amino acid mutation in a region mainly involved in the binding between RBD and hACE2, and the mutual binding between the tyrosine (Y) side chain of RBD and the amino acids Y41 and K353 of hACE2 is formed. It is said that the binding affinity is increased 7 times as compared with the Wuhan type.
  • mRNA vaccine recombinant virus vector vaccine, whole particle inactivation vaccine, protein component vaccine, etc. against the wild strain new coronavirus (SARS-CoV-2) using Spike protein as an antigen.
  • SARS-CoV-2 wild strain new coronavirus
  • the mRNA vaccines of Pfizer and Moderna have been reported to be more than 90% effective (see Non-Patent Document 1).
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a new modality, SARS-CoV-2 vaccine.
  • the neutralizing antibody consisting of the sequence containing any one of the following amino acid sequences (a) to (c) and induced is the receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 and human angiotensin.
  • a vaccine comprising a viral vector as an active ingredient, which presents a protein that inhibits the binding of converting enzyme 2 (hACE2) on a virus particle envelope.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • B An amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, inserted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • C An amino acid sequence having 80% or more identity in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has at least one mutation selected from the group consisting of K417N, L452R or L452Q, T478K, E484K, E484Q, F490S, and N501Y, [1] or [2].
  • the protein is any one of [1] to [3], wherein the transmembrane (TM) sequence and the cytoplasmic tail (CT) sequence are replaced with the TM and CT sequences of human parainfluenza type 2 virus. Vaccines listed in one.
  • a new modality the SARS-CoV-2 vaccine, can be provided.
  • the gene encoding these proteins is cleaved with NotI (upstream region of the gene encoding the NP protein) or MluI (region between the gene encoding the M and HN protein) limiting enzyme of the hPIV2 construction plasmid lacking the F gene.
  • the desired gene was introduced into the site. It is a figure which investigated the fusion of the cell which transfected the plasmid which encodes the Spike protein of Wuhan type SARS-CoV-2 which introduced 2P substitution. It is a figure which confirmed the protein in the infected cell and the virus particle of BC-PIV carrying the Spike gene of four kinds of Wuhan type SARS-CoV-2 by Western blotting.
  • FIG. 14 is a diagram confirming each protein in infected cells and virus particles of BC-PIV carrying the Spike gene of the mutant strains of SARS-CoV-2 (UK strain, South Africa strain, Japanese strain, India strain) by Western blot. Is.
  • FIG. 14 is a diagram confirming each protein in infected cells and virus particles of BC-PIV carrying the Spike gene of the mutant strains of SARS-CoV-2 (UK strain, South Africa strain, Japanese strain, India strain) by Western blot. Is.
  • FIG. 14 is a diagram confirming each protein in infected cells and virus particles of BC-PIV carrying the Spike gene of the mutant strains of SARS-CoV-2 (UK strain, South Africa strain, Japanese strain, India strain) by Western blot. Is.
  • FIG. 14 is a diagram confirming each protein in infected cells and virus particles of BC-PIV carrying the Spike gene of the mutant strains of SARS-CoV-2 (UK strain, South Africa strain, Japanese strain, India strain)
  • the present invention comprises a sequence comprising any one of the following amino acid sequences (a) to (c), and the induced neutralizing antibody is the receptor binding domain of SARS-CoV-2.
  • a vaccine containing a viral vector as an active ingredient, which presents a protein that inhibits the binding between (RBD) and human angiotensin converting enzyme 2 (hACE2) on a viral particle envelope.
  • RBD human angiotensin converting enzyme 2
  • hACE2 human angiotensin converting enzyme 2
  • A Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • B An amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, inserted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • C An amino acid sequence having 80% or more identity in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the Spike protein of Wuhan type SARS-CoV-2, and has a mutation of K986P / V987P.
  • Wuhan-type SARS-CoV-2 is also referred to as Wuhan-type SARS-CoV-2 into which 2P substitution has been introduced.
  • substitution mutation in an amino acid sequence when expressed, it may be expressed by the one-letter notation of the original amino acid, followed by the position number by a 1- to 4-digit number, and then the one-letter notation of the substituted amino acid.
  • K lysine
  • P proline
  • the number of deleted, inserted, substituted or added amino acids is preferably 1 to 190, more preferably 1 to 120, more preferably 1 to 50, and more preferably 1 to 25. It is preferable, 1 to 10 pieces are more preferable, and 1 to 5 pieces are most preferable.
  • the identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more.
  • the protein as an antigen used in the vaccine of the present embodiment is not limited to the Spike protein of Wuhan type SARS-CoV-2, and is also applied to proteins having the same or higher identity as defined in (b) and (c). .. That is, the proteins used in the vaccine of this embodiment are British type (alpha): N501Y or N501Y / D614G, South African type (beta): E484K / N501Y or E484K / N501Y / D614G, Japanese type: E484K or E484K / D614G.
  • D614G mutation in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and in addition to the D614G mutation / or independently of the D614G mutation, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, K417N, L452R or L452Q. , T478K, E484K, E484Q, F490S and N501Y are more preferably having at least one mutation selected from the group.
  • the protein used in the vaccine of the present embodiment is also applied to a mutant type expected in the future as a combination of these mutations.
  • the induced neutralizing antibody inhibits the binding of the receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 to human angiotensin converting enzyme 2 (hACE2)
  • RBD receptor binding domain
  • hACE2 human angiotensin converting enzyme 2
  • the vaccine of the present invention has neutralizing activity against all mutant SARS-CoV-2.
  • the virus vector contained in the vaccine of the present embodiment is not limited as long as it presents an antigen protein on an envelope, and examples thereof include Sendai virus and human parainfluenza virus, preferably human parainfluenza virus, and human parainfluenza. Type 2 virus is more preferred.
  • the present inventors have a membrane fusion (F membrane) protein (F membrane) of human paramyxoviridae type 2 virus (hereinafter referred to as hPIV2) belonging to the genus Rubulavirinae of the paramyxoviridae family, which is a minus single-stranded RNA virus.
  • the F gene encoding protein or F protein
  • the BC-PIV vector prepared as described above was constructed.
  • BC-PIV is characterized by antigen introduction. Its characteristic is that it can coexist with hPIV2 HN membrane protein and F membrane protein on the BC-PIV envelope while maintaining the three-dimensional structure of large antigen proteins such as foreign virus outer membranes as well as antigen genes. It can be used as an efficient vaccine vector.
  • BC-PIV in which an antigen is introduced onto the envelope can be used as a vector even if the genome is inactivated (VLP. BC-PIV). Since it is a non-proliferative vector at the time of inactivation, it can be treated with a drug having a much lower concentration than the usual virus inactivating treatment, and the immunogenicity of the introduced antigen can be maintained.
  • BC-PIV provides a vaccine against SARS-CoV-2, which is a gene encoding the Spike protein of Wuhan-type SARS-CoV-2 and its mutant virus with 2P substitution introduced.
  • SARS-CoV-2 which is a gene encoding the Spike protein of Wuhan-type SARS-CoV-2 and its mutant virus with 2P substitution introduced.
  • the mutation (TM) and cytoplasmic tile (CT) sequences (base sequence shown in SEQ ID NO: 13) of the intracellular region of the protein are transferred to the TM / CT sequence of hPIV2 F (base sequence shown in SEQ ID NO: 14). It carries the gene-PIV2 FTM / CT gene encoding the Spike protein of the substituted Wuhan SARS-CoV-2 and its mutant virus. This includes methods of nasal administration and intramuscular administration of the vector.
  • the gene encoding the Spike protein of Wuhan-type SARS-CoV-2 and its mutant virus-PIV2 FTM / CT gene is incorporated into BC-PIV or VLP.
  • BC-PIV not only in gene form but also in protein form. Is done.
  • the protein is recognized by innate immune cells and acquired immune cells at the time of administration, and then interacts with the protein produced by transcription and replication of genes to produce a stronger vaccine effect.
  • One preferred form is an enveloped virus in which the Spike protein of Wuhan-type SARS-CoV-2 and its mutant virus containing an extramembrane region is loaded on the virus envelope.
  • BC-PIV or Wuhan SARS-CoV-2 and its mutant virus Spike-PIV2F which retains Wuhan-type SARS-CoV-2 and its mutant virus Spike in a genetic and protein form.
  • the vaccine of this embodiment may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier those usually used for preparations can be used without particular limitation, and for example, solvents such as sterile water and physiological saline; binders such as gelatin, cornstarch, tragant gum and gum arabic, and the like. Excipients such as crystalline cellulose; swelling agents such as alginic acid and the like can be mentioned.
  • the vaccine of this embodiment may contain an additive.
  • Additives include lubricants such as magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, and saccharin; flavoring agents such as peppermint and red mono oil; stabilizers such as benzyl alcohol and phenol; phosphates, sodium acetate and the like. Buffering agents; solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; antioxidants; preservatives; surfactants; emulsifiers and the like.
  • intramuscular administration or nasal administration is preferable.
  • spray administration into the nasal cavity is more preferable.
  • the solvent for administration include isotonic solutions containing adjuvants such as physiological saline, glucose, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride.
  • the solvent for the injection may contain an alcohol such as ethanol; a polyalcohol such as propylene glycol and polyethylene glycol; a nonionic surfactant such as Polysorbate 80 TM and HCO-50.
  • the preparation of the vaccine for nasal administration may be a spray.
  • the dose of the vaccine of this embodiment is usually considered to be about 10 ng to 1000 ⁇ g of the active ingredient per day for an adult (assuming a body weight of 60 kg). If necessary, administer multiple doses at intervals of 2-12 weeks.
  • the invention provides a method of treating severe acute respiratory syndrome, comprising administering the vaccine described above to a patient in need of treatment.
  • FIG. 1 Figure of four modified Spike proteins to be introduced into BC-PIV
  • the SARS-CoV-2 Spike gene (SinoBiological Inc. Cat.) With optimized codons of the SARS-CoV-2 Spike gene (Gene Bank. MN908947).
  • VG40591-UT and VG40590-UT / Gene Bank. QHD4346.1 See FIG. 1). Specifically, (1): S1 region protein, (2): protein fused with TM and CT regions of S1 region and hPIV2 F protein, (3): Wuhan type Spike protein (2P substitution introduction), and (4).
  • a protein (named BC-PIV / S2PM) in which the TM and CT regions of the Wuhan-type Spike protein of (3) were replaced with the TM and CT regions of the hPIV2 F protein was used to construct a gene encoding these proteins.
  • the full-length Spike protein introduces a 2P mutation (K986P / V987P (AAGGTG ⁇ ccccc)) in the S2 region in order to eliminate the autonomous proliferation ability of the Spike protein to stabilize the protein structure. The cell fusion ability was lost.
  • a plasmid was constructed by adding the restriction enzyme cleavage sequence and the BC-PIV introduction tag sequence to the NotI cleavage site of BC-PIV.
  • the number of bases in the total length of the BC-PIV gene including the transgene was adjusted to be a multiple of 6 (rule of 6).
  • BC-PIV can be mounted on the envelope while maintaining the three-dimensional structure of the antigen of the multimer of the heterologous virus.
  • the antigen is other than a membrane protein such as a foreign virus, the membrane region (transmembrane domain (TM) sequence) and intracellular region (cytoplasmic tile (CT) sequence) of the hPIV2 F membrane protein are added to the antigen.
  • the antigen is incorporated into the BC-PIV envelope.
  • the membrane anchoring signal of the introduced antigen is taken into the BC-PIV envelope as it is, and the membrane anchoring signal is that of hPIV2. If it is not replaced, it may not be incorporated into the BC-PIV envelope, which was examined in the construction of (3) and (4).
  • Example 2 Confirmation of loss of fusion ability of modified protein having 2P mutation Cell by introducing the mutation in the Spike protein that suppresses cell fusion reported in MERS-CoV into the Spike protein of SARS-CoV-2. It was investigated whether fusion was suppressed.
  • SARS-CoV-2 Spike gene with an optimized codon of the SARS-CoV-2 Spike gene (Gene Bank. MN908947) as a template, a 2P mutation (K986P / V987P) in the S2 region of the SARS-CoV-2 Spike protein (K986P / V987P).
  • the structure-stable Spike gene (SARS-CoV-2 S2P) into which AAGGTG ⁇ cccccc)) was introduced and the Wuhan-type Spike gene (SARS-CoV-2 S) were introduced into the plasmid pcDNA.
  • Each plasmid was translocated into Vero cells, fixed with 4% Paraformaldehide (PFA) after 3 days, and after permeabilization, an anti-SARS-CoV S1 antibody (SinoBiological Inc.) that cross-reactives with the SARS-CoV-2 S1 protein.
  • the cells were stained with Cat. 40150-T62-COV2) and DAPI (Nacalai protein Cat. 19174-31) to confirm the presence or absence of cell fusion (see FIG.
  • Example 3 Confirmation of modified Spike protein by Western blotting of BC-PIV having each of four types of modified Spike genes Using a BC-PIV construction plasmid into which the four types of modified Spike genes of FIG. 1 were introduced, minus BC-PIV virus was recovered by the reverse genetics method commonly used for single-stranded virus production. Since all viruses could be recovered, protein expression and BC-PIV vector uptake were examined.
  • (1) is "BC-PIV / S1”
  • (2) is "BC-PIV / S1M”
  • (3) is "BC-PIV” for the four types described in Example 1.
  • / S2P ”and (4) are referred to as“ BC-PIV / S2PM ”.
  • Each BC-PIV infected cell and virus after several passages were subjected to Western blotting.
  • the culture supernatant was centrifuged to remove cell residues, and the supernatant passed through a 0.8 ⁇ m filter was ultracentrifuged (141,000 g, 4 ° C., 30 min) and concentrated.
  • Anti-SARS-CoV S1 antibody (SinoBiological Inc. Cat. 40150-T62-COV2)
  • anti-GAPDH-HRP binding antibody and anti-PIV2 NP (20A), or anti-PIV2 P (211A) were used.
  • the virus was subjected to Western blot 10 6 particles respectively.
  • the expression of S1 protein was confirmed in all BC-PIVs, and the expression of S0 protein before cleavage was also confirmed in BC-PIV / S2P and BC-PIV / S2PM (see FIG. 3, left). Further, in the uptake into the virus particles shown on the right side of FIG. 3, the S1 protein was confirmed in BC-PIV / S1M, BC-PIV / S2P, and BC-PIV / S2PM, and it was confirmed that the protein was present on the particles. ..
  • BC-PIV / S2P and BC-PIV / S2PM the S0 protein before cleavage was also present on the particles, but in BC-PIV / S2P, it was incorporated into vector particles as compared with BC-PIV / S2PM. It was found that there were few particles (see the right side of Fig. 3). In BC-PIV / S1, no S1 protein was observed on the particles, suggesting that the S1 protein was expressed and secreted extracellularly in the infected cells.
  • each BC-PIV is Vero. Three days after infecting the cells, 4% PFA was fixed and permeabilized, and anti-SARS-CoV S1 antibody (SinoBiological Inc. Cat. 40150-T62-COV2), DAPI (Nacalai protein Cat. 19174-3), and anti-PIV2. Staining with NP antibody (20A), SARS-CoV-2 S1 with Alexa-568 (red), PIV2 NP with Alexa-488 (green) and nuclei detected with DAPI (blue).
  • the BC-PIV / S2PM-derived Spike protein does not have cell fusion ability unlike the Wuhan-type Spike protein.
  • the modified Spike gene is introduced into the PIV2 F gene-deficient BC-PIV, the modified Spike protein does not have autonomous proliferation ability in PIV2 F protein non-expressing cells, so that it does not produce secondary infectious particles.
  • Example 5 Confirmation of binding of recovered virus to hACE2 It was confirmed whether a protein was present on each BC-PIV particle and could bind to the hACE2 protein, which is a receptor for Peplomer protein.
  • Each BC-PIV of 1 ⁇ 10 6 TCID 50 / well was fixed to a 96-well ELISA plate.
  • Human ACE2 (hACE2) -Fc tag (Acro Bosystems. Cat. AC2-H5257) 5 ng, 10 ng, 25 ng, 50 ng, 75 ng, 100 ng, 150 ng, 200 ng was added, and HRP-Protein A (Biolegend Cat. 6892) was added.
  • the absorbance of BC-PIV / S2PM, BC-PIV / S2P, and BC-PIV / S1M increased depending on the addition concentration, but no binding was observed for BC-PIV / S1 and BC-PIV (Fig.). See 5A.), It was confirmed that the S1 protein was not present on the BC-PIV / S1 particles.
  • the binding ability of BC-PIV / S2P and BC-PIV / S1M was almost the same, but that of BC-PIV / S2PM showed a higher binding value than that of BC-PIV / S2PM.
  • FIG. 5B shows VLPs inactivated with 0.05% ⁇ -propiolactone. It is a figure which confirmed the binding between BC-PIV and hACE2 protein. Inactivated VLP. BC-PIV / S1M, VLP. BC-PIV / S2P, VLP. The amount of binding to the hACE2 protein was large in the order of BC-PIV / S2PM, and the result was similar to that of BC-PIV, and the inactivated VLP. It was suggested that the use of BC-PIV could also be a SARS-CoV-2 vaccine.
  • Example 6 Virus morphology and hemagglutination activity The morphology of BC-PIV / S2PM was confirmed by an electron microscope. In normal electron microscopy, BC-PIV / S2PM or BC-PIV infected cells were fixed with 4% PFA + 2.5% Glutaraldehyde (GA), further fixed with 1% OsO4, dehydrated with alcohol, and embedded with epoxy resin. .. Ultra-thin sections were prepared and observed with an electron microscope. In the immunoelectron microscope, infected cells BC-PIV / S2PM or BC-PIV infected cells were fixed with a 2% PFA + 0.1% GA mixed solution, and further fixed with 4% PFA.
  • G Glutaraldehyde
  • BC-PIV erythrocyte aggregation activity
  • a BC-PIV or BC-PIV / S2PM virus solution having the same number of particles was diluted 2-fold with cold PBS and mixed with 2% guinea pig erythrocytes in an equal amount in 96-well U bottom plate to examine the hemagglutination activity.
  • BC-PIV showed a hemagglutination value of at least 64 HAU, but BC-PIV / S2PM did not show hemagglutination activity.
  • BC-PIV has hemagglutination activity due to HN membrane protein, and it is usually difficult to eliminate this property, but it is a surprising result that this BC-PIV / S2PM virus lost the hemagglutination activity property. Met. It was speculated that the loss of this property was due to the fact that the HN protein on the BC-PIV particles was covered with the bulky Spike protein with a larger molecular weight, and the erythrocytes could not aggregate on the HN protein. It supports the result of FIG. 5 that BC-PIV / S2PM, which retains a bulkier Spike protein than BC-PIV / S1M, has a higher amount of binding to hACE2.
  • the BC-PIV / S2PM HN protein is considered to coexist with the bulky Spike protein, but a 2P mutation has been introduced into the Spike protein, and as shown in FIGS. 2 and 4, the Spike protein is introduced. Since no dependent cell fusion was observed, cell infection depends on BC-PIV-derived HN protein and F protein, and the functions of both proteins are maintained.
  • Example 8 Confirmation of administration method (nasal or muscle) in mice
  • the antibody induced by nasal administration or intramuscular administration was evaluated.
  • 5-7 week old BALB / c mice were administered 2 ⁇ 10 7 TCID 50 BC-PIV / S2PM or BC-PIV once nasally or intramuscularly.
  • Blood was collected from mice on the 33rd day after administration, and after centrifugation, serum was collected and deactivated, and the antibody titer was confirmed by ELISA.
  • RBD protein (SinoBiological Inc. Cat.
  • Example 9 Antibody induction against S1 and RBD After nasal administration of the four BC-PIV vaccines (1) to (4) to mice, serum IgG antibody titers against S1 and RBD were evaluated. 2 ⁇ 10 7 TCID 50 (1): BC-PIV / S1, (2): BC-PIV / S1M, (3): BC-PIV / S2P, (4) in 5-7 week old BALB / c mice. : BC-PIV / S2PM, BC-PIV, or PBS was administered nasally. On the 33rd day after the first administration, blood was collected from mice, centrifuged, serum was collected and deactivated, and the antibody titer was confirmed by ELISA. S1 protein (SinoBiological Inc. Cat.
  • BC-PIV is known to have low transcription / translation efficiency because it is a power-permissive in mice, but secretory BC-PIV / S1 is opposed to membrane-retaining BC-PIV / S1M and S1 protein.
  • the antibody titer was almost the same as that of the RBD protein, and the antibody titer was slightly higher than that of the RBD protein.
  • Using the full-length Spike protein as the antigen was more effective in inducing the antibody than the protein in the S1 region. It was confirmed that BC-PIV / S2PM carrying the full-length Spike protein was most suitable for the vaccine.
  • Example 10 Evaluation of IgG / IgA antibody induction against Spike / RBD protein in mouse serum IgG in serum for S1 and RBD in mice treated with BC-PIV / S2PM vaccine once or twice nasally.
  • the antibody titer and the IgA antibody titer in the nasal cavity were evaluated.
  • 5-7 week old BALB / c mice were nasally administered with 2 ⁇ 10 7 TCID 50 BC-PIV / S2PM or BC-PIV. The two doses were given 4 weeks later.
  • the IgG antibody titers against S1 and RBD of the serum were increased in the single-dose group, but the antibody titers were further increased in the double-dose group (see FIG. 10).
  • the IgA antibody titer against S1 and RBD of the nasal cavity lavage fluid was increased in the single-dose group.
  • a higher IgA antibody titer was observed 1 week after the double-dose administration.
  • the half-life of IgA is known to be short, the presence of Spike protein-specific IgA for S1 or RBD was confirmed in the nasal cavity even after 5 weeks of single administration (see FIG. 10).
  • cPass kit SARS-CoV-2 Surrogate Virus Neutralization Test Kit
  • Each serum was diluted 20, 60, 180, 540, 1620, 4860 times and kept warm with HRP-bound RBD protein at 37 ° C for 30 minutes, and the mixture was placed in a plate on which hACE2 protein was immobilized and kept warm at 37 ° C for 15 minutes. After washing, the light was emitted by TMB, the absorbance at 450 nm was measured, and the inhibition rate (1- (sample OD / negative control OD)) ⁇ 100% was calculated from the obtained values. (Note: Negative control is the value at 20-fold dilution of the non-specific antibody attached to the kit.) According to the manual, when the inhibition rate is 20% or more, it has neutralizing antibody activity.
  • BC-PIV / S2PM group In the BC-PIV / S2PM group, 540-fold dilution exceeded 20% in all individuals, and 1620-fold dilution also exceeded 20% inhibition rate (see FIG. 11). However, in the BC-PIV group, no neutralizing antibody could be confirmed because the inhibition rate was 20% or less in all individuals even when diluted 20-fold. Two nasal doses of BC-PIV / S2PM were able to induce high neutralizing antibodies.
  • Example 12 Confirmation of infection protection test using hamsters
  • vaccine effects were examined using hamsters susceptible to BC-PIV and SARS-CoV-2.
  • a 4-week-old Syrian hamster received a single nasal dose of BC-PIV or BC-PIV / S2PM.
  • the evaluation of the neutralizing antibody was carried out in the same manner as in Example 11 except that the dilution ratio was increased to 30 times.
  • a high inhibition rate equivalent to that of the positive control (Note: the value at 20-fold dilution of the anti-RBD-specific positive antibody attached to the kit) was obtained in both the single administration and the double administration (Fig.). See 12.).
  • the inhibition rate was 20% or less, so that the presence of neutralizing antibody could not be confirmed.
  • Example 13 Mutant SARS-CoV-2 (British type (alpha): N501Y or N501Y / D614G, South African type (beta): E484K / N501Y or E484K / N501Y / D614G, Japanese type: E484K or E484K / D614G, Construction of BC-PIV vaccine against Indian type (kappa): L452R / E484Q or L452R / E484Q / D614G.
  • mutant strains (British type (alpha): N501Y or N501Y / D614G, South African type (beta): E484K / N501Y or E484K / N501Y / D614G, Japanese type: E484K or E484K / D614G, Indian type (kappa): L452R / A BC-PIV was prepared by introducing a Spike gene that carries a 2P mutation corresponding to E484Q or L452R / E484Q / D614G).
  • the nucleotide sequence of the British type (alpha) N501Y / D614G Spike gene is shown in SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence of the South African type (beta) E484K / N501Y / D614G is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence of the Spike gene is shown in SEQ ID NO: 5
  • the nucleotide sequence of the Indian type (kappa) L452R / E484Q / D614G is shown in SEQ ID NO: 6.
  • Each mutation site is shown in FIG.
  • the viruses were recovered by the same reverse genetex method as in Example 3.
  • Western blots performed in the same manner as in Example 3 using the recovered virus particles are shown in FIGS. 15A and 15B.
  • Spike protein was expressed in all virus-infected cells, and mutant Spike protein was found on BC-PIV.
  • BC-PIV against the mutant virus is considered to have an effect against the mutant strain because of the high vaccine effect of BC-PIV against Wuhan-type SARS-CoV-2 so far.
  • L452Q / F490S BC-PIVs were prepared with a Spike gene carrying a 2P mutation corresponding to (CTC / TTT ⁇ cgg / tct) or L452Q / F490S / D614G (CTC / TTT / GAT ⁇ cag / tct / ggt).
  • the nucleotide sequence of the Indian type (delta) L452R / T478K / D614G Spike gene is shown in SEQ ID NO: 7, and the nucleotide sequence of the Indian type (delta plus) K417N / L452R / T478K / D614G is shown in SEQ ID NO: 8, South American type (Delta plus).
  • the nucleotide sequence of the British type + Indian type (alpha + kappa) L452R / E484Q / N501Y / D614G Spike gene is shown in SEQ ID NO: 9, and the nucleotide sequence of the British type + Indian type (alpha + delta) L452R / T478K / N501Y / D614G is shown in SEQ ID NO: 9.
  • the nucleotide sequence of the Spike gene of British type + Indian type (alpha + delta plus) K417N / L452R / T478K / N501Y / D614G is shown in SEQ ID NO: 10.
  • Each mutation site is shown in FIG.
  • the virus was prepared using the reverse genetics method of Example 3. BC-PIV against mutant virus expected in the future is expected to be effective against mutant strains expected to appear in the future due to the high vaccine effect of BC-PIV against Wuhan type SARS-CoV-2 so far. Conceivable.
  • a new modality the SARS-CoV-2 vaccine, can be provided.

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Abstract

以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ誘導される中和抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）の結合を阻害するタンパク質をウイルス粒子エンベロープ上に提示するウイルスベクターを有効成分として含有する、ワクチン。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列

Description

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン
　本発明は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対するワクチンに関する。
　新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、プラス鎖一本鎖ＲＮＡをゲノムとして持つエンベロープウイルスであり、５'末端キャップ構造、３'末端ポリＡ配列を持ち、ウイルスとしては極めて長い約 ３０ｋｂのゲノムを持つ。当該ウイルスは、自前のＲＮＡポリメラーゼに修復機能があるが、ゲノムの変異は避けられない。ゲノムは、１４のＯＲＦよりなり、２７のタンパク質をコードしている。当該タンパク質は、Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍ）、Ｅｎｖｅｌｏｐｅ（Ｅ）、Ｓｐｉｋｅ（Ｓ）、及びＮｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｎ）の４種類の構造タンパク質よりなる。Ｓｐｉｋｅタンパク質は、主にワクチン用抗原として用いられる。Ｓｐｉｋｅタンパク質は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むＳ１領域と宿主の細胞膜とウイルスの膜融合に必要なＳ２領域よりなる。
　ＳＡＲＳ-ＣｏＶ－２による宿主細胞への感染は、ＲＢＤと宿主細胞のヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）の結合により始まる。ＲＢＤは、ｕｐとｄｏｗｎの２状態があり、ｕｐ状態のときｈＡＣＥ２と結合することができる。この結合によりｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｅｒｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　２　（ＴＭＰＲＳＳ２）プロテアーゼによって切断されたＳ２’が露出され、細胞とウイルスの融合が生じる。また、後期エンドソーム・カテプシン経路による別の感染ルートがあるが、前者の方がウイルスの細胞侵入速度は速いとされる。
　ＳＡＲＳ-ＣｏＶ－２感染が、重症化を引き起こす病態として、急性呼吸窮迫症候群（ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓｔｒｅｓｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＲＤＳ）を呈する肺炎に最も留意すべきである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体であるＡＣＥ２は、ＩＩ型肺胞上皮をはじめとする気道上皮細胞の表面に発現しており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤを介して気道上皮細胞に感染する。ＳＡＲＳ-ＣｏＶ－２感染肺炎では、ＡＲＤＳによるびまん性肺胞障害が特徴的である 。一般的にびまん性肺胞障害の組織像は、時間経過とともに、滲出期から器質化期、更に線維化期へと変化していくのが一般的であるが、ＳＡＲＳ-ＣｏＶ－２感染ではこれらの病期の異なる病変が、同一個体の肺葉内に同時に進行し、重篤化する場合も多い。
　ワクチンの中和抗体作用は、ＲＢＤとｈＡＣＥ２の結合を阻害することである。これまで以下のようなＳｐｉｋｅタンパク質の変異が報告され、ワクチンが誘導する中和抗体に影響を与えるものと予想される。当該変異は、イギリス型（ａｌｐｈａ）:Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ変異、南アフリカ型（ｂｅｔａ）:Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ、日本型：Ｅ４８４Ｋが報告されてきた。
　さらにＷＨＯより直近でＶａｒｉａｎｔ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　（ＶＯＩ）　ｏｒ　Ｖａｒｉａｎｔ　ｏｆ　Ｃｏｎｃｅｒｎ　（ＶＯＣ）に認定されたにインド型（ｋａｐｐａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｄ６１４Ｇ、インド型（ｄｅｌｔａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｄ６１４Ｇ、インド型（ｄｅｌｔａ　ｐｌｕｓ）Ｋ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｄ６１４Ｇが報告されている。
　例えば、Ｎ５０１Ｙ変異は、ＲＢＤとｈＡＣＥ２ との結合に主に関与する領域のアミノ酸変異で、ＲＢＤのチロシン（Ｙ）側鎖とｈＡＣＥ２のアミノ酸のＹ４１とＫ３５３との相互結合が形成されることにより、結合親和性がＷｕｈａｎ型と比較して７倍上昇するとされる。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体作用が最も強いと評価される抗体（ＩＣ５０が２ｎｇ／ｍＬ）において、Ｓｐｉｋｅタンパク質との結合の分子レベルの解析により、当該抗体の重鎖及び軽鎖中のアミノ酸がＳｐｉｋｅタンパク質のＥ４８４と相互作用をしていることが明らかにされている。つまり、Ｅ４８４Ｋ変異では、Ｅ４８４でみられた当該抗体との相互作用がＫ４８４では低くなり、Ｗｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン接種で誘導される中和作用の最も高い抗体が、Ｅ４８４Ｋ変異では中和抗体として機能不全に陥る可能性が考えられる。
　野生株新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対し、Ｓｐｉｋｅタンパク質を抗原として、ｍＲＮＡワクチン、組換えウイルスベクターワクチン、全粒子不活化ワクチン、タンパク質コンポーネントワクチン等の多様なモダリティのワクチンがあり、中でもファイザー社及びモデルナ社のｍＲＮＡワクチンは９０％以上の有効性が報告されている（非特許文献１参照）。
The Advisory Committee on Immunization Practices' Interim Recommendation for Use of Pfizer-BioNTech COVID-19 Vaccine - United States, December 2020. Oliver SE, Gargano JW, Marin M, Wallace M, Curran KG, Chamberland M, McClung N, Campos-Outcalt D, Morgan RL, Mbaeyi S, Romero JR, Talbot HK, Lee GM, Bell BP, Dooling K. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2020 Dec 18;69(50):1922-1924.
　これらのワクチンはすべて筋肉内投与である。一方、ワクチン投与によるアナフィラキシー及び血栓、心筋症等の副反応が報告されており、ｍＲＮＡワクチンは２回目の投与後により強い副反応が知られている。副反応等を理由にワクチン接種拒否者も多く、集団免疫の獲得が難しくなることが推測される。今後新型コロナワクチンには、筋肉内投与以外の投与法、副反応の低減、複数回投与が可能である多様なモダリティが必要である。
　本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、新しいモダリティであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン提供することを目的とする。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ誘導される中和抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）の結合を阻害するタンパク質をウイルス粒子エンベロープ上に提示するウイルスベクターを有効成分として含有する、ワクチン。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｄ６１４Ｇ変異を有する、［１］に記載のワクチン。
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ又はＬ４５２Ｑ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｆ４９０Ｓ、及びＮ５０１Ｙからなる群から選ばれる少なくとも１つの変異を有する、［１］又は［２］に記載のワクチン。
［４］前記タンパク質は、そのｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ（ＴＭ）配列及びｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列が、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＴＭ及びＣＴ配列に置換されている、［１］～［３］のいずれか一つに記載のワクチン。
［５］前記ウイルスベクターは、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスである、［１］～［４］のいずれか一つに記載のワクチン。
［６］ウイルスベクターとしての前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムよりＦ遺伝子を欠失した非増殖型である、［５］に記載のワクチン。
［７］ウイルスベクターとしての前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムが不活化している、［５］又は［６］に記載のワクチン。
［８］経鼻噴霧投与用である［１］～［７］のいずれか一つに記載のワクチン。
　本発明によれば、新しいモダリティであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン提供することができる。
ＢＣ－ＰＩＶに導入する４種類の改変Ｗｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅタンパク質の説明図である。具体的には、（１）：Ｓ１領域タンパク質、（２）：Ｓ１領域とｈＰＩＶ２　Ｆタンパク質のＴＭ及びＣＴ領域を融合したタンパク質、（３）：Ｗｕｈａｎ型Ｓｐｉｋｅタンパク質（２か所に変異導入、以下、２Ｐ置換導入ともいう。）、及び（４）：（３）のＷｕｈａｎ型Ｓｐｉｋｅタンパク質のＴＭ及びＣＴ領域をｈＰＩＶ２　Ｆタンパク質のＴＭ及びＣＴ領域に置換したタンパク質（ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭと命名）である。これらタンパク質をコードする遺伝子を、Ｆ遺伝子を欠失したｈＰＩＶ２構築用プラスミドのＮｏｔＩ(ＮＰタンパク質をコードする遺伝子の上流領域)又はＭｌｕＩ（ＭとＨＮタンパク質をコードする遺伝子の間の領域）制限酵素切断部位に所望遺伝子を導入した。 ２Ｐ置換を導入したＷｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅ タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクションした細胞の融合を調べた図である。 ４種類のＷｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅ遺伝子を保持するＢＣ－ＰＩＶの感染細胞及びウイルス粒子でのそれぞれのタンパク質をウエスタンブロットにより確認した図である。 ４種類の改変Ｗｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅ遺伝子／タンパク質を保持するＢＣ－ＰＩＶを感染させた細胞において、細胞融合が喪失していることを示す図である。 ４種類の各ウイルスをプレートに吸着し、ｈＡＣＥ－２＋Ｆｃ ｔａｇとの結合程度を調べた図である。 ３種類の各不活化ウイルスをプレートに吸着し、ｈＡＣＥ－２＋Ｆｃ ｔａｇとの結合程度を調べた図である。 ＢＣ－ＰＩＶとＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭの通常電顕と抗Ｓ１抗体を用いた免疫電顕の図である。 ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭの赤血球凝集活性を調べた図である。 ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭをマウスに経鼻又は筋肉内投与を行い、回収した血清を用いて、ＲＢＤタンパク質に結合するＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡで比較した図である。 ２Ｐ置換を導入した４種類の改変Ｗｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅ遺伝子を保持するＢＣ－ＰＩＶを経鼻感染させたマウスより回収した血清のＳ１又はＲＢＤに対するＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡで比較した図である。 単回又は２回ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭを経鼻投与したマウスの血清のＳ１又はＲＢＤに対するＩｇＧ抗体価及び鼻腔洗浄液のＳ１又はＲＢＤに対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡにより調べた図である。 ２回投与マウスの血清を、ｃＰaｓｓキットを用いてＲＢＤとｈＡＣＥ－２との結合阻害により中和抗体価の評価を示した図である。 ハムスターでＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰワクチンによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害効果を調べる前にｃＰaｓｓキットにより中和抗体の誘導を確認した図である。 １回又は２回ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２Ｐワクチンを経鼻投与したハムスターにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた後、回収した各組織を用いてプラークアッセイによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を調べた図である。 ＢＣ－ＰＩＶに導入する変異株（イギリス株、南アフリカ株、日本株、インド株）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅタンパク質の説明図である。 図１４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株（イギリス株、南アフリカ株、日本株、インド株）Ｓｐｉｋｅ遺伝子を保持するＢＣ－ＰＩＶの感染細胞及びウイルス粒子でのそれぞれのタンパク質をウエスタンブロットにより確認した図である。 図１４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株（イギリス株、南アフリカ株、日本株、インド株）Ｓｐｉｋｅ遺伝子を保持するＢＣ－ＰＩＶの感染細胞及びウイルス粒子でのそれぞれのタンパク質をウエスタンブロットにより確認した図である。 ＢＣ－ＰＩＶに導入する変異株（インド株（ｄｅｌｔａ、　ｄｅｌｔａ　ｐｌｕｓ　）、南米株（ｌａｍｂｄａ））ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅタンパク質の説明図である。 ＢＣ－ＰＩＶに導入する今後予想される変異株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅタンパク質の説明図である。
≪ワクチン≫
　１実施形態において、本発明は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ誘導される中和抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）の結合を阻害するタンパク質をウイルス粒子エンベロープ上に提示するウイルスベクターを有効成分として含有する、ワクチンを提供する。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
　（ａ）において、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、Ｗｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅタンパク質のアミノ酸配列であり、Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐの変異を有している。本明細書において、Ｗｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、２Ｐ置換を導入したＷｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ともいう。
　本明細書において、アミノ酸配列における置換変異を表す場合、元のアミノ酸の一文字表記、続いて１～４桁の数字による位置番号、次に置換されたアミノ酸の一文字表記により表現することがある。例えば、アミノ酸番号９８６位においてリジン（Ｋ）がプロリン（Ｐ）に置換される変異が生じている場合、「Ｋ９８６Ｐ」と表され、これは、「アミノ酸番号９８６位のＬｙｓのＰｒｏの置換」と同義である。
　（ｂ）において、欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸の数としては、１～１９０個が好ましく、１～１２０個がより好ましく、１～５０個がより好ましく、１～２５個がより好ましく、１～１０個が更に好ましく、１～５個が最も好ましい。
　（ｃ）において、同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。
　本実施形態のワクチンに用いられる抗原としてのタンパク質は、Ｗｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅタンパク質に限定されず、（ｂ）及び（ｃ）に規定される同一性以上のタンパク質にも適用される。
　即ち、本実施形態のワクチンに用いられるタンパク質は、イギリス型（ａｌｐｈａ）：Ｎ５０１Ｙ又はＮ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ、南アフリカ型（ｂｅｔａ）：Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ又はＥ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ、日本型：Ｅ４８４Ｋ又はＥ４８４Ｋ／Ｄ６１４Ｇ、インド型（ｋａｐｐａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ又はＬ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｄ６１４Ｇ、インド型（ｄｅｌｔａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ又はＬ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｄ６１４Ｇ、インド型（ｄｅｌｔａ　ｐｌｕｓ）：Ｋ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ又はＫ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｄ６１４Ｇ、南米型(ｌａｍｂｄａ)：Ｌ４５２Ｑ／Ｆ４９０Ｓ又は、Ｌ４５２Ｑ／Ｆ４９０Ｓ／Ｄ６１４Ｇ、にも適用される。
　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｄ６１４Ｇ変異を有することが好ましく、Ｄ６１４Ｇ変異に加えて／又はＤ６１４Ｇ変異とは独立して、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ又はＬ４５２Ｑ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｆ４９０Ｓ及びＮ５０１Ｙからなる群から選ばれる少なくとも１つの変異を有することがより好ましい。
　本実施形態のワクチンに用いられるタンパク質は、これら変異の組み合わせとして、今後予想される変異型にも適用される。今後予想される変異としては、イギリス型＋インド型（ａｌｐｈａ＋ｋａｐｐａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｎ５０１Ｙ（ＣＴＣ／ＧＡＧ／ＡＡＴ→ｃｇｇ／ｃａｇ／ｔａｔ）又はＬ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ（ＣＴＣ／ＧＡＧ／ＡＡＴ／ＧＡＴ→ｃｇｇ／ｃａｇ／ｔａｔ／ｇｇｔ）、イギリス型＋インド型（ａｌｐｈａ＋ｄｅｌｔａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１　（ＣＴＣ／ＡＣＡ／ＡＡＴ→ｃｇｇ／ａａａ／ｔａｔ）又はＬ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１／Ｄ６１４Ｇ（ＣＴＣ／ＡＣＡ／ＡＡＴ／ＧＡＴ→ｃｇｇ／ａａａ／ｔａｔ／ｇｇｔ）、イギリス型＋インド型（ａｌｐｈａ＋ｄｅｌｔａ　ｐｌｕｓ）：Ｋ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ（ＡＡＧ／ＣＴＣ／ＡＣＡ／ＡＡＴ→ａａｃ／ｃｇｇ／ａａａ／ｔａｔ）又はＫ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ（ＡＡＧ／ＣＴＣ／ＡＣＡ／ＡＡＴ／ＧＡＴ→ａａｃ／ｃｇｇ／ａａａ／ｔａｔ／ｇｇｔ））が挙げられる。
　本発明において、「誘導される中和抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）の結合を阻害する」とは、ワクチンを投与されたヒト体内で誘導される中和抗体が、ＲＢＤに結合することにより、ＲＢＤとｈＡＣＥ２との結合を阻害することを意味する。
　実施例で後述するように、本発明のワクチンは、あらゆる変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して中和活性を有する。
　本実施形態のワクチンが含有するウイルスベクターとしては、抗原タンパク質をエンベロープ上に提示するものであれば限定されず、センダイウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルスが挙げられ、ヒトパラインフルエンザウイルスが好ましく、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスがより好ましい。
［ＢＣ－ＰＩＶベクター及びＶＬＰ. ＢＣ－ＰＩＶベクター］
　本発明者らは、マイナス一本鎖ＲＮＡウイルスであるパラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科ルブラウイルス属に属するヒトパラインフルエンザ２型ウイルス(以後ｈＰＩＶ２という。) の膜融合（Ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質（Ｆ膜タンパク質又はＦタンパク質）をコードするＦ遺伝子を機能しないように欠失させ、当該Ｆ遺伝子が恒常的に発現するように組込まれたＶｅｒｏ細胞を樹立し、当該細胞で２次感染性粒子が産生しないよう作製されたＢＣ－ＰＩＶベクターを構築した。
　当該ベクターでは、感染宿主で２次感染性粒子が産生されないため高い安全性が担保される。当該ベクターは外来遺伝子を導入することができ、ＲＮＡベクターの特性を活かし、感染細胞で高い外来遺伝子発現が認められる。
　更に、ＢＣ－ＰＩＶは、抗原導入に特徴をもつ。その特徴は、抗原遺伝子だけでなく、外来のウイルス外膜等の大型抗原タンパク質の立体構造を維持した状態で、ＢＣ－ＰＩＶエンベロープ上に、ｈＰＩＶ２のＨＮ膜タンパク質及びＦ膜タンパク質と共存させることができ、効率的なワクチン用ベクターとして利用できる。
　エボラウイルスワクチン等の中和抗体誘導に立体構造が必須とされる、当該ウイルス以外のウイルスの高分子量膜タンパク質を当該ベクターに導入し、中和抗体の誘導に成功している。また、抗原をエンベロープ上に導入したＢＣ－ＰＩＶはゲノムを不活化してもベクターとしての利用が可能である（ＶＬＰ. ＢＣ－ＰＩＶ）。不活化の際、非増殖型ベクターであるために、通常のウイルス不活化処理より遥かに低濃度の薬剤で処理することが可能で、導入抗原の免疫原性を維持することができる。
　好ましい実施形態では、ＢＣ－ＰＩＶは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを提供し、当該ワクチンは、２Ｐ置換を導入したＷｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその変異型ウイルスのＳｐｉｋｅタンパク質をコードする遺伝子又は当該タンパク質の細胞内領域のｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ（ＴＭ）及びｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列（塩基配列を配列番号１３に示す。）を、ｈＰＩＶ２　ＦのＴＭ／ＣＴ配列（塩基配列を配列番号１４に示す。）に置換したＷｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその変異ウイルスのＳｐｉｋｅタンパク質をコードする遺伝子－ＰＩＶ２ Ｆ　ＴＭ／ＣＴ遺伝子を保持する。
　これには、当該ベクターを経鼻投与及び筋肉内投与する方法も含む。Ｗｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその変異型ウイルスのＳｐｉｋｅタンパク質をコードする遺伝子－ＰＩＶ２ Ｆ　ＴＭ／ＣＴ遺伝子は、遺伝子形式だけでなく、タンパク質形式でもＢＣ－ＰＩＶ又はＶＬＰ. ＢＣ－ＰＩＶ上に取込まれる。当該タンパク質は、自然免疫細胞や獲得免疫細胞により投与時点で認識され、その後遺伝子の転写・複製により産生される当該タンパク質と相互作用し、より強いワクチン効果を生じる。
　一つの好ましい形態では膜外領域を含むＷｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその変異ウイルスのＳｐｉｋｅタンパク質をウイルスエンベロープ上に搭載するエンベロープ型ウイルスである。より好ましい形態では、Ｗｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその変異型ウイルスのＳｐｉｋｅを、遺伝子形式かつタンパク質形式で保持するＢＣ－ＰＩＶ又はＷｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその変異型ウイルスのＳｐｉｋｅ－ＰＩＶ２　Ｆ　ＴＭ／ＣＴをタンパク質形式で保持するＢＣ－ＰＩＶである。
［担体・添加剤］
　本実施形態のワクチンは、薬学的に許容される担体を含有していてもよい。薬学的に許容される担体としては、通常製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができ、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
　本実施形態のワクチンは、添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤等が挙げられる。
　本実施形態のワクチンの投与形態としては、筋肉内投与又は経鼻投与が好ましい。経鼻投与は、鼻腔内へ噴霧投与がより好ましい。
　投与における溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
　また、経鼻投与におけるワクチンの製剤は、スプレーでもよい。
　本実施形態のワクチンの１回あたりの投与量は、通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約１０ｎｇ～１０００μｇの有効成分を投与することが考えられる。必要な場合には、２～１２週間の間隔で複数回投与される。
＜治療方法＞
　１実施形態において、本発明は、上述したワクチンを、治療を必要とする患者に投与することを含む、重症急性呼吸器症候群の治療方法を提供する。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ＢＣ－ＰＩＶに導入する４種類の改変Ｓｐｉｋｅタンパク質図
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ遺伝子(Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ．　ＭＮ９０８９４７)のコドンを最適化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ遺伝子(ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．ＶＧ４０５９１－ＵＴ、ＶＧ４０５９０－ＵＴ／　Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ．ＱＨＤ４３４１６．１　配列番号２)を鋳型にし、ＢＣ－ＰＩＶに導入する４種類の改変Ｗｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅタンパク質をコードする遺伝子を構築した（図１参照。）。具体的には、（１）：Ｓ１領域タンパク質、（２）：Ｓ１領域とｈＰＩＶ２　Ｆタンパク質のＴＭ及びＣＴ領域を融合したタンパク質、（３）：Ｗｕｈａｎ型Ｓｐｉｋｅタンパク質（２Ｐ置換導入）、及び（４）：（３）のＷｕｈａｎ型Ｓｐｉｋｅタンパク質のＴＭ及びＣＴ領域をｈＰＩＶ２　Ｆタンパク質のＴＭ及びＣＴ領域に置換したタンパク質（ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭと命名）で、これらタンパク質をコードする遺伝子を構築した。（３）と（４）において、全長Ｓｐｉｋｅタンパク質はＳｐｉｋｅタンパク質の持つ自律増殖能をなくすために、Ｓ２領域内に２Ｐ変異（Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ（ＡＡＧＧＴＧ→ｃｃｃｃｃｃ)）を導入しタンパク質の構造を安定化させ細胞融合能をなくした。４種類の改変遺伝子は、ＢＣ－ＰＩＶのＮｏｔＩ切断部位に当該制限酵素切断配列とＢＣ－ＰＩＶ導入用ｔａｇ配列を付加したプラスミドを構築した。この際、導入遺伝子を含めたＢＣ－ＰＩＶの遺伝子全長の塩基数を６の倍数（ルール・オブ・６）になるように調整した。ＢＣ－ＰＩＶは、エンベロープ上に異種ウイルスの多量体の抗原の立体構造を維持した状態で搭載できることが可能である。抗原が外来ウイルス等の膜タンパク質以外の場合は、当該抗原にｈＰＩＶ２ Ｆ膜タンパク質の膜領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ (ＴＭ)配列）及び細胞内領域（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列）を付加することにより、当該抗原はＢＣ－ＰＩＶエンベロープに取込まれる。
　一方、ＢＣ－ＰＩＶへの導入抗原が、ウイルス膜タンパク質又は膜結合タンパク質の場合、導入抗原の膜アンカーリングシグナルはそのままでもＢＣ－ＰＩＶエンベロープに取込まれる場合と、膜アンカーリングシグナルをｈＰＩＶ２のそれと置換しないとＢＣ－ＰＩＶエンベロープに取込まれない場合があり、（３）と（４）の構築で検討した。
［実施例２］２Ｐ変異をもつ改変タンパク質の融合能喪失の確認
　ＭＥＲＳ－ＣｏＶで報告された、細胞融合を抑制するＳｐｉｋｅタンパク質における変異を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅタンパク質へ導入することにより細胞融合が抑制されるか調べた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ遺伝子（Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ．　ＭＮ９０８９４７）のコドンが最適化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋe遺伝子を鋳型に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅタンパク質のＳ２領域内に２Ｐ変異（Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ（ＡＡＧＧＴＧ→ｃｃｃｃｃｃ））を導入した構造安定型Ｓｐｉｋｅ遺伝子（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ２Ｐ）とＷｕｈａｎ型Ｓｐｉｋｅ遺伝子（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ）をプラスミド　ｐｃＤＮＡに導入した。各プラスミドをＶｅｒｏ細胞にトランスフェクッションし、３日後、４％Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）で固定し、透過処理後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ１タンパク質にも交差反応する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ　Ｓ１抗体（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．４０１５０－Ｔ６２－ＣＯＶ２）とＤＡＰＩ（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　Ｃａｔ．１９１７４－３１）で細胞染色し細胞融合の有無を確認した（図２参照。）。Ｗｕｈａｎ型Ｓｐｉｋｅタンパク質は、細胞融合に特徴的な多核巨細胞が観察され細胞融合が誘導されたが、変異導入Ｓｐｉｋｅタンパク質ではタンパク質発現を確認できたが、多核巨細胞は認められず、細胞融合は起こらなかった。
［実施例３］各４種類の改変Ｓｐｉｋｅ遺伝子を有するＢＣ－ＰＩＶ のウエスタンブロットによる改変型Ｓｐｉｋｅタンパク質の確認
　図１の４種類の改変Ｓｐｉｋｅ遺伝子を導入したＢＣ－ＰＩＶ構築用プラスミドを用いて、マイナス一本鎖ウイルス作製に常用されるリバースジェネティックス法によりＢＣ－ＰＩＶウイルスの回収を行った。すべてのウイルスを回収することができたので、タンパク質の発現及びＢＣ－ＰＩＶベクター取込みを調べた。
　以後、特に断りが無ければ、実施例１に記載した４種類について、（１）を 「ＢＣ―ＰＩＶ／Ｓ１」、（２）を「ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１Ｍ」、（３）を「ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２Ｐ」、（４）を「ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ」と表記する。数継代後の各ＢＣ－ＰＩＶ感染細胞とウイルスをウエスタンブロットに供した。ウイルスは、培養上清を遠心し、細胞残渣を取り除き、さらに０．８μｍフィルターを通した上清を超遠心（１４１，０００ｇ，４℃，３０ｍｉｎ）し、濃縮した。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ　Ｓ１抗体（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．４０１５０－Ｔ６２－ＣＯＶ２）、抗ＧＡＰＤＨ－ＨＲＰ結合抗体、及び抗ＰＩＶ２　ＮＰ（２０Ａ）、又は抗ＰＩＶ２ Ｐ（２１１Ａ）を用いた。なお、ウイルスは、それぞれ１０６粒子をウエスタンブロットに供した。感染細胞では、全てのＢＣ－ＰＩＶでＳ１タンパク質の発現が確認でき、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２Ｐ、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭでは開裂前のＳ０タンパク質の発現も確認された（図３左参照。）。また、図３右に示したウイルス粒子への取込みでは、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１Ｍ、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２Ｐ、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭでは、Ｓ１タンパク質が確認でき、粒子上に存在することが確認された。また、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２Ｐ、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭでは、開裂前のＳ０タンパク質も粒子上に存在していたが、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２Ｐでは、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭに比べ、ベクター粒子への取込みが少ないことが分った（図３右参照。）。ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１では、粒子上にＳ１タンパク質は認められなかったことから、感染した細胞で、Ｓ１タンパク質が発現し細胞外へ分泌されていると考えられた。
［実施例４］回収ウイルスの非Ｆ発現細胞での融合能喪失の確認
　各ＢＣ－ＰＩＶに導入したＳｐｉｋｅタンパク質による細胞への感染・細胞融合能の動態を観察するため、各ＢＣ－ＰＩＶをＶｅｒｏ細胞に感染させ３日後に４％ＰＦＡ固定し透過処理を行い、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ　Ｓ１抗体（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．４０１５０－Ｔ６２－ＣＯＶ２）、ＤＡＰＩ（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　Ｃａｔ．１９１７４－３）、及び抗ＰＩＶ２　ＮＰ抗体（２０Ａ）で染色し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ１をＡｌｅｘａ－５６８（赤色）で染色し、ＰＩＶ２　ＮＰをＡｌｅｘａ－４８８（緑色）で染色し、核をＤＡＰＩ（青色）で検出した。ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ感染細胞は、いずれも細胞融合を誘導せず、多核巨細胞を形成しないことから、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ由来Ｓｐｉｋｅタンパク質は、Ｗｕｈａｎ型Ｓｐｉｋｅタンパク質と異なり細胞融合能を有しないことが確認された。
　ＰＩＶ２　Ｆ遺伝子欠損ＢＣ－ＰＩＶに改変Ｓｐｉｋｅ遺伝子を導入しても、ＰＩＶ２　Ｆタンパク質非発現細胞では、改変Ｓｐｉｋｅタンパク質に自律増殖能力はないため、２次感染性粒子を産生することは無い。
［実施例５］回収ウイルスのｈＡＣＥ２との結合確認
　各ＢＣ－ＰＩＶ粒子上にタンパク質が存在し、Ｓｐｉｋｅタンパク質のレセプターであるｈＡＣＥ２タンパク質と結合できるかを確認した。１×１０６　ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌの各ＢＣ－ＰＩＶを、９６ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅに固定した。Ｈｕｍａｎ　ＡＣＥ２（ｈＡＣＥ２）－Ｆｃ　ｔａｇ（Ａｃｒｏ　Ｂｏｓｙｓｔｅｍｓ．　Ｃａｔ．ＡＣ２－Ｈ５２５７）５ｎｇ、１０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、７５ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、２００ｎｇを添加し、ＨＲＰ－ＰｒｏｔｅｉｎＡ　（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ　Ｃａｔ．６８９２０２）とインキュベート後、ＴＭＢ試薬で反応させ、４５０ｎｍの吸光度を計測した。なお試験は、各ｎ＝３で実施した。
　ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２Ｐ、及びＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１Ｍは、添加濃度依存的に、吸光度が上昇したが、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１及びＢＣ－ＰＩＶは、結合が認められず（図５Ａ参照。）、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１粒子上にＳ１タンパク質が存在していないことが確認された。
　結合能力は、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰとＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１Ｍでは、ほぼ同等の結合力を持っていたが、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭは、それらよりも高い結合価を示し、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭより多くのＳｐｉｋｅタンパク質が取込まれていると考えられる。これは、Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ＴａｉｌをＰＩＶ２Ｆ　ＴＭ／ＣＴに置換することにより、ＢＣ－ＰＩＶ粒子にＳｐｉｋｅタンパク質がより多く取込まれるためと推察された。この結果は、図３の粒子ウエスタンブロット（ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰとＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ）の結果と符合する。
　図５Ｂは、０．０５％のβ―プロピオラクトンで不活化したＶＬＰ．ＢＣ－ＰＩＶとｈＡＣＥ２タンパク質との結合を確認した図である。不活化したＶＬＰ．ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１Ｍ、ＶＬＰ．ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２Ｐ、ＶＬＰ．ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭの順にｈＡＣＥ２タンパク質との結合量は多く、ＢＣ－ＰＩＶと同様の結果となり、不活化したＶＬＰ．ＢＣ－ＰＩＶを利用しても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンになり得る可能性が示唆された。
［実施例６］ウイルスの形態と赤血球凝集活性
　電子顕微鏡によりＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭの形態を確認した。
　通常電顕では、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭまたはＢＣ－ＰＩＶ感染細胞を４％ＰＦＡ＋２．５％　Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ（ＧＡ）で固定し、更に１％ＯｓＯ４で固定後、アルコールで脱水し、エポキシ樹脂で包埋した。超薄切片を作製して、電子顕微鏡で観察を行った。また、免疫電顕は、感染細胞ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ、又はＢＣ－ＰＩＶ感染細胞を、２％ＰＦＡ＋０．１％ＧＡ混合液で固定し、更に４％ＰＦＡで固定を行った。
　その後、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ１　ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．４０５９１－Ｔ６２）と抗ウサギビオチン化抗体（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色後、ＤＡＢ反応を行い１％ＯｓＯ４で後固定した。アルコールで脱水し、エポキシ樹脂で包埋した。超薄切片を作製して電子顕微鏡で観察を行った。
　通常電顕像では、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭのエンベロープ外側にＳｐｉｋｅタンパク質（図６上段 右 矢印参照。）と想定される大きな突起が認められたが、ＢＣ－ＰＩＶではそのような突起は認められなかった（図６上段 左参照。）。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ１抗体を用いた免疫電顕では、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭに抗Ｓ１抗体の陽性像（図６下段 右 矢印参照。）が認められ、エンベロープはＳｐｉｋｅタンパク質に覆われていることが視覚的に確認できた。
　次にＳｐｉｋｅタンパク質によるＢＣ－ＰＩＶの特性変化の有無を確認するため、特性の１つである「赤血球凝集活性」を調べた。同じ粒子数のＢＣ－ＰＩＶ又はＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭウイルス溶液を、冷ＰＢＳで２倍段階希釈液し、９６ｗｅｌｌ　Ｕ　ｂｏｔｔｏｍ　ｐｌａｔｅに、２％モルモット赤血球と等量混ぜ赤血球凝集活性を調べた。試験はｎ＝２で実施した。ＢＣ－ＰＩＶでは、少なくとも６４ＨＡＵの赤血球凝集値が認められたが、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭでは、赤血球凝集活性が認められなかった。ＢＣ－ＰＩＶは、ＨＮ膜タンパク質による赤血球凝集活性を持ち、通常当該特性を無くすことは困難であるところ、今回のＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭウイルスが、赤血球凝集活性特性を喪失したことは、驚くべき結果であった。当該特性の喪失は、ＢＣ－ＰＩＶ粒子上のＨＮタンパク質がより大きな分子量で嵩高なＳｐｉｋｅタンパク質に覆われ、ＨＮタンパク質上で赤血球が凝集を起こせなかったことによるものと推察された。ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１Ｍに比べてより嵩高なＳｐｉｋｅタンパク質を保持するＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭの方がｈＡＣＥ２との結合量が多くなるという図５の結果を支持するものである。なお、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭのＨＮタンパク質は、嵩高なＳｐｉｋｅタンパク質と共存していると考えられるが、Ｓｐｉｋｅタンパク質には２Ｐ変異が導入されており、図２と図４で示すように、Ｓｐｉｋｅタンパク質依存的な細胞融合は認められていないことから、細胞への感染はＢＣ－ＰＩＶ由来のＨＮタンパク質とＦタンパク質に依存しており両タンパク質の機能は維持されている。
［実施例８］マウスでの投与法(経鼻又は筋肉)の確認
　ワクチン投与経路により誘導される抗体の抗体価の差異を調べるため、マウスに経鼻投与又は筋肉内投与し、誘導される抗体の抗体価を評価した。５－７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２×１０７　ＴＣＩＤ５０のＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ又はＢＣ－ＰＩＶを１回経鼻又は筋肉内に投与した。試験はｎ＝３で実施した。投与後３３日目にマウスから血液を採取し、遠心分離後、血清を回収し非働化処理を行い、ＥＬＩＳＡで抗体価を確認した。９６ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅにＲＢＤタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．４０５９２－Ｖ０２Ｈ）を一晩４℃で固相化し、ブロッキング処理後、希釈した血清と反応させ、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ　Ｃａｔ．４０５３０６）で処理し、ＴＭＢ試薬と反応させて４５０ｎｍの吸光度を計測した。
　経鼻投与、筋肉内投与の場合でも、ＢＣ－ＰＩＶよりＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭは共にＲＢＤタンパク質に対するＩｇＧの抗体価が高かった。また、経鼻投与、筋肉内投与による吸光度はほぼ同等値となったことから、投与経路による抗体誘導価に差異はなかった（図８参照。）。これらのことから、ＢＣ－ＰＩＶを用いたワクチンは、経鼻投与でも筋肉内投与と遜色なく、十分な抗体価を有する抗体を誘導することが示された。
 [実施例９] Ｓ１及びＲＢＤに対する抗体誘導
　マウスに（１）～（４）の４種類のＢＣ－ＰＩＶワクチンを経鼻投与した後、Ｓ１及びＲＢＤに対する血清中のＩｇＧ抗体価を評価した。５－７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに２×１０７　ＴＣＩＤ５０の（１）：ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１、（２）：ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１Ｍ、（３）：ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２Ｐ、（４）：ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ、ＢＣ－ＰＩＶ、又はＰＢＳを経鼻投与した。初回投与後３３日目にマウスから血液を採取し遠心分離後、血清を回収し非働化処理を行い、ＥＬＩＳＡで抗体価を確認した。９６ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅにＳ１タンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．４０５９１－Ｖ０２Ｈ）又はＲＢＤタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．４０５９２－Ｖ０２Ｈ）を固相化し、ブロッキング後、希釈した血清と反応させ、さらにＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ　Ｃａｔ．４０５３０６）処理し、ＴＭＢ試薬と反応させて４５０ｎｍの吸光度を計測した。この試験はｎ＝６で実施した。
　全てのワクチン投与群でＳ１タンパク質及びＲＢＤタンパク質に対する高い抗体誘導を認めた（図９参照）。ＢＣ－ＰＩＶは、マウスでｐｏｏｒ－ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅであるため、転写・翻訳効率が低いことが知られているが、分泌型ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１は、膜停留型ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ１ＭとＳ1タンパク質に対してほぼ同等の抗体価の誘導を示し、ＲＢＤタンパク質に対して若干高い抗体価の誘導を示したが、全長Ｓｐｉｋｅタンパク質のワクチン群には抗体価は及ばなかったことから、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチン抗原として、Ｓ１領域のタンパク質よりも全長のＳｐｉｋｅタンパク質を用いた方が抗体誘導には効果があった。全長Ｓｐｉｋｅタンパク質を搭載したＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭが、ワクチンに最も適していることが確認された。
［実施例１０］マウス血清でのＳｐｉｋｅ／ＲＢＤタンパク質に対するＩｇＧ・ＩｇＡ抗体誘導評価
マウスにＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭワクチンを、１回又は２回経鼻投与したマウスでのＳ１及びＲＢＤに対する血清中のＩｇＧ抗体価と鼻腔内のＩｇＡ抗体価を評価した。５－７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに２×１０７　ＴＣＩＤ５０のＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ又はＢＣ－ＰＩＶを経鼻投与した。２回の投与は４週間後に行った。初回投与後３５日目に、マウスから血液を採取し遠心分離後、血清を回収し非働化処理を行い、また鼻腔洗浄液は、ＰＢＳで回収し、ＥＬＩＳＡで抗体価を確認した。９６ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅに、Ｓ１タンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．４０５９１－Ｖ０２Ｈ）、又はＲＢＤタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．　Ｃａｔ．４０５９２－Ｖ０２Ｈ）を固相化し、ブロッキング後、希釈した血清又は希釈した鼻腔洗浄液を反応させ、さらにＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ　Ｃａｔ．４０５３０６）又はＨＲＰ結合抗マウスＩｇＡ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｃａｔ．１０４０－０５）で処理し、ＴＭＢ試薬と反応させて４５０ｎｍの吸光度を計測した。この試験はｎ＝５－６で実施した。
　血清のＳ１及びＲＢＤに対するＩｇＧ抗体価は、１回投与群で上昇していたが、２回投与群で更に抗体価が上昇した（図１０参照。）。鼻腔洗浄液のＳ１及びＲＢＤに対するＩｇＡ抗体価は1回投与群で上昇していた。２回投与群では、２回投与１週間後に更に高いＩｇＡの抗体価を認められた。ＩｇＡの半減期は短いことが知られているが１回投与の５週間後も鼻腔内にＳ１またはＲＢＤに対するＳｐｉｋｅタンパク質特異的なＩｇＡの存在が確認できた（図１０参照。）。
［実施例１１］中和抗体の確認
　マウスに２回のワクチン投与を行い、中和抗体の誘導を市販のキット用いて調べた。
　 ５－７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ又はＢＣ－ＰＩＶを２×１０７ ＴＣＩＤ５０を４週間間隔で２回経鼻投与した。この試験はｎ＝４で実施した。最終投与後７日目、マウスから血液を採取し遠心分離後、血清を回収し非働化処理後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ　Ｖｉｒｕｓ　Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｅｓｔ　Ｋｉｔ （ｃＰａｓｓ　ｋｉｔ）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ　Ｃａｔ．Ｌ００８４７）を用いて、中和抗体を計測した。各血清を２０、６０、１８０、５４０、１６２０、４８６０倍希釈し、ＨＲＰ結合ＲＢＤタンパク質と３７℃ ３０分間保温し、ｈＡＣＥ２タンパク質を固相化したプレートに混合液を入れ、３７℃ １５分間保温し、洗浄後、ＴＭＢで発光させて４５０ｎｍの吸光度を計測し、得られた数値より阻害率(１－（サンプルＯＤ／ネガティブコントロールＯＤ)）×１００％）を計算した。（注：ネガティブコントロールは、ｋｉｔに付属している非特異的抗体の２０倍希釈での値である。）マニュアルによれば、２０％ 阻害率以上の場合、中和抗体活性を有するとしており、ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ群では、５４０倍希釈ですべての個体で２０％を超えており、また１６２０倍希釈でも、２０％阻害率を超えている個体が確認できた（図１１参照）。しかし、ＢＣ－ＰＩＶ群では、２０倍希釈でも全ての個体で阻害率２０％以下のため中和抗体が確認できなかった。ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭの２回経鼻投与は、高い中和抗体を誘導することが可能であった。
［実施例１２］ハムスターを用いた感染防御試験の確認
　動物での感染防御試験を行うため、ＢＣ－ＰＩＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感受性を有するハムスターを用いて、ワクチン効果の検討を行った。
　４週齢シリアンハムスターに、ＢＣ－ＰＩＶ又はＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭを、1回経鼻投与した。さらにＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭを、９週間間隔で２回経鼻投与した群を作製した。１回目投与より、それぞれ１０週（１回投与群）、９週（２回投与群）の尻尾より採血した血清を用いて、ｃＰａｓｓ　ｋｉｔにより中和抗体が誘導されていることを確認した。試験はｎ＝４で実施した。
　中和抗体の評価は、希釈倍率を３０倍にした以外は、全て実施例１１と同じ方法で行った。ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ投与群では１回投与、２回投与共にポジティブコントロール（注：ｋｉｔ付属の抗ＲＢＤ特異的陽性抗体の２０倍希釈での値）と同等の高い阻害率が得られた（図１２参照。）。一方、ＢＣ－ＰＩＶ投与群では、阻害率が２０％以下だったため、中和抗体の存在は確認できなかった。
　中和抗体評価を行った同一のハムスターを用い、１回目ワクチン投与１１週間後に、１０３ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を経鼻経由で感染させ、３日後に肺組織及び鼻甲介組織を回収した。組織１ｇ当たりのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス数を、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子組換えＶｅｒｏＥ６細胞を用いたプラークアッセイ法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２数を評価した。肺組織（ｇ当たり）ＢＣ－ＰＩＶ投与群では、１０８以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子が認められたが、１回及び２回ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ投与群では、全くＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子が認められなかった。ＢＣ－ＰＩＶ／Ｓ２ＰＭ投与により、高い中和抗体が誘導され、ウイルス増殖が強く阻害された（図１３参照。）。
　また、鼻甲介組織（ｇ当たり）ＢＣ－ＰＩＶ投与群では、１０８個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子が認められたが、１回投与群では、１０６－１０７にウイルス数が減少しており、また２回投与群では、２匹はウイルスが認められず、残りの２匹でもウイルス数が激減していた（図１３参照。）。これらの結果より、肺でのウイルス増殖阻害効果は、１回投与でも長期にわたって持続する。鼻甲介では、ＩｇＡが主体と考えられる感染防御効果が確認できたが、ＩｇＡの特性によりＩｇＧ抗体と比べて長期間の感染防御を持続できないことも明らかになった（図１３参照。）。
［実施例１３］変異株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（イギリス型（ａｌｐｈａ）：Ｎ５０１Ｙ又はＮ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ、南アフリカ型（ｂｅｔａ）：Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ又はＥ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ、日本型：Ｅ４８４Ｋ又はＥ４８４Ｋ／Ｄ６１４Ｇ、インド型（ｋａｐｐａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ又はＬ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｄ６１４Ｇ、に対するＢＣ－ＰＩＶワクチンの構築
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｗｕｈａｎ株が世界中に広がり、その後、多数の変異株が報告されている。変異株に対して、Ｗｕｈａｎ株由来Ｓｐｉｋｅタンパク質を用いたワクチンによる効果の低下が予想される。
　そのため、変異株（イギリス型（ａｌｐｈａ）：Ｎ５０１Ｙ又はＮ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ、南アフリカ型（ｂｅｔａ）：Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ又はＥ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ、日本型：Ｅ４８４Ｋ又はＥ４８４Ｋ／Ｄ６１４Ｇ、インド型（ｋａｐｐａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ又はＬ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｄ６１４Ｇ）に対応し２Ｐ変異を保持するＳｐｉｋｅ遺伝子を導入したＢＣ－ＰＩＶを作製した。
　イギリス型（ａｌｐｈａ）Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４ＧのＳｐｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号３に示し、南アフリカ型（ｂｅｔａ）Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４ＧのＳｐｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号４に示し、日本型Ｅ４８４Ｋ／Ｄ６１４ＧのＳｐｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号５に示し、インド型（ｋａｐｐａ）Ｌ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｄ６１４ＧのＳｐｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号６に示す。
　各変異部位を図１４に示した。これらウイルスを、実施例３と同様のリバースジェネテクス法によりウイルスを回収した。回収したウイルス粒子を用いて、実施例３と同様の方法で行ったウエスタンブロットを図１５Ａ及びＢに示す。すべてのウイルスの感染細胞でＳｐｉｋｅタンパク質は発現しており、またＢＣ－ＰＩＶ上に変異型Ｓｐｉｋｅタンパク質が認められた。
　当該変異型ウイルスに対するＢＣ－ＰＩＶは、これまでのＷｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＢＣ－ＰＩＶの高いワクチン効果から、変異株にも対しても効果を有するものと考えられる。
［実施例１４］変異株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（インド型（ｄｅｌｔａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ又はＬ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｄ６１４Ｇ、インド型（ｄｅｌｔａ　ｐｌｕｓ）：Ｋ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ又はＫ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｄ６１４Ｇ、南米型（ｌａｍｂｄａ）：Ｌ４５２Ｑ／Ｆ４９０Ｓ又はＬ４５２Ｑ／Ｆ４９０Ｓ／Ｄ６１４Ｇ）、に対するＢＣ－ＰＩＶワクチンの構築
　更に変異株（インド型（ｄｅｌｔａ）Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ（ＣＴＣ／ＡＣＡ→ｃｇｇ／ａａａ）又はＬ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｄ６１４Ｇ（ＣＴＣ／ＡＣＡ／ＧＡＴ→ｃｇｇ／ａａａ／ｇｇｔ）、インド型（ｄｅｌｔａ　ｐｌｕｓ）Ｋ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ（ＡＡＧ／ＣＴＣ／ＡＣＡ→ａａｃ／ｃｇｇ／ａａａ）又はＫ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｄ６１４Ｇ（ＡＡＧ／ＣＴＣ／ＡＣＡ／ＧＡＴ→ａａｃ／ｃｇｇ／ａａａ／ｇｇｔ）、南米型（ｌａｍｂｄａ）：Ｌ４５２Ｑ／Ｆ４９０Ｓ（ＣＴＣ／ＴＴＴ→ｃａｇ／ｔｃｔ）又はＬ４５２Ｑ／Ｆ４９０Ｓ／Ｄ６１４Ｇ（ＣＴＣ／ＴＴＴ／ＧＡＴ→ｃａｇ／ｔｃｔ／ｇｇｔ））に対応した２Ｐ変異を保持するＳｐｉｋｅ遺伝子を導入したＢＣ－ＰＩＶを作製した。
　インド型（ｄｅｌｔａ）Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｄ６１４ＧのＳｐｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号７に示し、インド型（ｄｅｌｔａ　ｐｌｕｓ）Ｋ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｄ６１４ＧのＳｐｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号８、南米型（ｌａｍｂｄａ）：Ｌ４５２Ｑ／Ｆ４９０Ｓ／Ｄ６１４ＧのＳｐｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号１２に示す。
　各変異部位を図１６に示した。インド型変異型ウイルスに対するＢＣ－ＰＩＶは、これまでのＷｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＢＣ－ＰＩＶの高いワクチン効果から、今後出現が予想される変異株にも対しても効果を有するものと考えられる。
［実施例１５］ 今後予想される変異株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（イギリス型＋インド型（ａｌｐｈａ＋ｋａｐｐａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｎ５０１Ｙ又はＬ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ、イギリス型+インド型（ａｌｐｈａ＋ｄｅｌｔａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ又はＬ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ、イギリス型＋インド型（ａｌｐｈａ＋ｄｅｌｔａ　ｐｌｕｓ）：Ｋ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ又はＫ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ、に対するＢＣ－ＰＩＶワクチンの構築
　更に今後予想される変異株（イギリス型+インド型（ａｌｐｈａ＋ｋａｐｐａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｎ５０１Ｙ（ＣＴＣ／ＧＡＧ／ＡＡＴ→ｃｇｇ／ｃａｇ／ｔａｔ）又はＬ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ（ＣＴＣ／ＧＡＧ／ＡＡＴ／ＧＡＴ→ｃｇｇ／ｃａｇ／ｔａｔ／ｇｇｔ）、イギリス型＋インド型（ａｌｐｈａ＋ｄｅｌｔａ）：Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ（ＣＴＣ／ＡＣＡ／ＡＡＴ→ｃｇｇ／ａａａ／ｔａｔ）又はＬ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ（ＣＴＣ／ＡＣＡ／ＡＡＴ／ＧＡT→ｃｇｇ／ａａａ／ｔａｔ／ｇｇｔ）、イギリス型＋インド型（ａｌｐｈａ＋ｄｅｌｔａ　ｐｌｕｓ）：Ｋ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ（ＡＡＧ／ＣＴＣ／ＡＣＡ／ＡＡＴ→ａａｃ／ｃｇｇ／ａａａ／ｔａｔ）又はＫ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ（ＡＡＧ／ＣＴＣ／ＡＣＡ／ＡＡＴ／ＧＡＴ→ａａｃ／ｃｇｇ／ａａａ／ｔａｔ／ｇｇｔ））に対応した２Ｐ変異を保持するＳｐｉｋｅ遺伝子を導入したＢＣ－ＰＩＶを作製した。
　イギリス型+インド型（ａｌｐｈａ＋ｋａｐｐａ）Ｌ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４ＧのＳｐｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号９に示し、イギリス型＋インド型（ａｌｐｈａ＋ｄｅｌｔａ）Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４ＧのＳｐｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号１０に示し、イギリス型＋インド型（ａｌｐｈａ＋ｄｅｌｔａ　ｐｌｕｓ）Ｋ４１７Ｎ／Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ／Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４ＧのＳｐｉｋｅ遺伝子の塩基配列を配列番号１１に示す。
　各変異部位を図１７に示した。ウイルスは実施例３のリバースジェネティックス法を用いて作製した。今後予想される変異型ウイルスに対するＢＣ－ＰＩＶはこれまでのＷｕｈａｎ型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＢＣ－ＰＩＶの高いワクチン効果から、今後出現が予想される変異株にも対しても効果を有するものと考えられる。
　本発明によれば、新しいモダリティであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン提供することができる。

Claims (8)

  1. 　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ誘導される中和抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）の結合を阻害するタンパク質をウイルス粒子エンベロープ上に提示するウイルスベクターを有効成分として含有する、ワクチン。
    （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
  2. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｄ６１４Ｇ変異を有する、請求項１に記載のワクチン。
  3. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ４５２Ｒ又はＬ４５２Ｑ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｆ４９０Ｓ、及びＮ５０１Ｙからなる群から選ばれる少なくとも１つの変異を有する、請求項１又は２に記載のワクチン。
  4. 　前記タンパク質は、そのｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ（ＴＭ）配列及びｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列が、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＴＭ及びＣＴ配列に置換されている、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン。
  5. 　前記ウイルスベクターは、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスである、請求項１～４のいずれか一項に記載のワクチン。
  6. 　ウイルスベクターとしての前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムよりＦ遺伝子を欠失した非増殖型である、請求項５に記載のワクチン。
  7. 　ウイルスベクターとしての前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムが不活化している、請求項５又は６に記載のワクチン。
  8. 　経鼻噴霧投与用である、請求項１～７のいずれか一項に記載のワクチン。
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