WO2021259397A2 - Composiciones vacunales basadas en nano-particulas inorganicas para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Composiciones vacunales basadas en nano-particulas inorganicas para el tratamiento del cáncer Download PDF

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WO2021259397A2
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Gustavo GONZÁLEZ RUIZ
David Alejandro GONZÁLEZ MARTÍNEZ
Fernando BORDALLO LEÓN
Belinda SÁNCHEZ RAMÍREZ
Kalet LEÓN MONZÓN
Yerandy ECHEVERRÍA LUNA
Maria Del Carmen Luzardo Lorenzo
Mabel CRUZ RODRÍGUEZ
Adys GONZÁLEZ PALOMO
Julio Felipe SANTO TOMÁS POMPA
Judey Aymed GARCÍA ARTALEJO
Elaine RUIZ CASTRO
Lien LÓPEZ MATILLA
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Centro De Inmunología Molecular
Universidad De La Habana
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    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]

Definitions

  • the present invention relates to biotechnology, specifically the field of human health.
  • it describes new vaccine formulations that contain nano-particulate systems with an immune response against epidermal growth factor, useful for use in cancer therapies.
  • EGF epidermal growth factor
  • the formulation referred to in patent US 5,894,018, claims the composition of a vaccine to produce an immune response against autologous EGF. It comprises autologous EGF conjugated to a carrier protein (cholera toxin B, tetanus toxoid, a monoclonal antibody, or a Neisseria meningitidis outer membrane protein), administered together with the aluminum hydroxide adjuvant.
  • a carrier protein cholera toxin B, tetanus toxoid, a monoclonal antibody, or a Neisseria meningitidis outer membrane protein
  • the invention US 8,778,879 describes a vaccine composition for therapeutic use in cancer patients whose active principle is the chemical conjugate between recombinant human EGF (rhEGF) and recombinant protein P64k. It refers to a procedure for the purification of the chemical conjugate that provides it with greater purity and an increase in its immunogenic activity.
  • Said composition contains an adjuvant that can be aluminum
  • Immunological adjuvants arose from the need to increase the immunogenicity of vaccines developed from recombinant proteins.
  • the first adjuvant used was double aluminum sulfate, in 1926.
  • various inorganic adjuvants have been evaluated from aluminum, calcium, magnesium, iron, zinc, zirconium, frown, beryllium and silicon.
  • aluminum and calcium salts have been approved for use in humans (Paneque-Quevedo A., Applied Biotechnology (2013) 30: 243-249).
  • inorganic adjuvants were used in combination with heterologous antigens.
  • Aluminum hydroxide and aluminum phosphate are not very appropriate adjuvants to be used in chronic treatments, because aluminum is toxic and poorly metabolized by the human body.
  • the impact of aluminum accumulation on human health, specifically on the central nervous, musculoskeletal, respiratory, cardiovascular, endocrine, urinary and reproductive systems has been widely documented (Nayak P., Environmental Research Section A (2002), 89: 101-115; Verstraeten SA et al., Arch Toxicol (2008) 82: 789-802; Flaten TP, Brain Research Bulletin (2001) 2: 187-196).
  • CaP calcium phosphates
  • US 2,967,802 the mixture of an erysipelas antigen with a hydrated CaP gel is claimed.
  • prophylactic vaccines were developed against infections of various pathogenic microorganisms and allergens adsorbed on CaP (US 3,608,071, US 4016252; US 4350686; US 20120121714; Coursaget, P. et al., Infect Immun (1986) 51 (3) : 784-787).
  • CaP adjuvants base their immunological effect on the formation of a deposit of antigen that is slowly released, thereby Which allow it to be presented to the immune system for a long time and to generate a response against the inoculated antigen.
  • Patent US 8,333,996 claims the development of immune systems formed by the adsorption of antigens such as: Bordetella pertussis, allergens, inactivated human immunodeficiency virus (HIV-2), KLH, vaccines against diphtheria, tetanus toxoid, streptococci, viruses or bacteria Attenuated polio and hepatitis A and B. It also includes DNA adsorption and cytokines, such as granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF).
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • Patent US 6,355,271 claims a method to prepare CaP particles with diameters between 300 and 4000 nm, it is based on the aqueous mixture of calcium chloride, sodium phosphate and sodium citrate for the adsorption of HSV-1 viruses, HSV-2 and EBV, DNA, as well as ovalbumin and Mycobacterium tuberculosis antigens.
  • HAp particulate hydroxyapatite systems
  • This substance is the main inorganic component of bone tissue, which guarantees its biocompatibility.
  • HAp amorphous or with low crystallinity biodegrade in contact with the biological medium.
  • the reduction of the size of the particles and the selected material give it superior properties as an adjuvant, with respect to aluminum hydroxide, since they produce a more balanced Th1 / Th2 response and lower generation of IgE-type antibodies (Qing, H. et al.
  • a system comprising: a CaP nano-particle core, a biologically active macromolecule encapsulated in the core particle and a surface modifying agent.
  • the active biological macromolecule can be a protein, a polypeptide, a polysaccharide, a nucleic acid, a polynucleotide, a lipid or a carbohydrate.
  • the invention WO 2003051394 shows a nano-particulate HAp with different types of coatings in a single formulation to be used as an adjuvant.
  • nanoparticles are used as carriers of native or recombinant antigens or other pharmacological agents, for their application on the surfaces of the mucosa.
  • CaP particles specifically HAp
  • rhEGF or one of its peptides and another protein or carrier peptide capable of generating immune responses against EGF are dispensed in a single vial so they do not require additional procedures such as mixtures or emulsions at the time of use.
  • the present invention relates to vaccine compositions to induce an immune response against EGF, characterized in that it comprises as an active principle a system that contains rhEGF or its peptides and a carrier protein or peptide linked to a nucleus made up of nano- biodegradable inorganic particles that can be salts, oxides or hydroxides of calcium, iron, zinc, magnesium, zirconium, cerium, beryllium, silicon, or a mixture of two or more of them.
  • the inorganic core is made of CaP and more particularly of the HAp type. This HAp is preferably amorphous or of low crystallinity and is partially or totally covered by an organic ligand, particularly sodium citrate.
  • the carrier protein or peptide is selected from the group comprising: cholera toxin B, tetanus toxoid, KLH, and Neisseria meningitides P64k.
  • the active principle of the vaccine compositions of the present invention is found on the surface of the HAp nano-particles, bound by one of the following methods: Covalent binding of the chemical conjugate of rhEGF or peptides thereof and of the carrier protein or peptide with the HAp nano-particle (HAp-rhEGF-rP64k).
  • Covalent binding of rhEGF or peptides thereof and of the protein or carrier peptide with the FIAp nano-particle independently (HAp-PI). Successive covalent binding of rhEGF or peptides thereof and of the carrier protein or peptide to the FIAp nano-particle.
  • adjuvants that are selected from the groups that include: Freund's incomplete adjuvants, squalene-based adjuvants, adjuvants of synthetic origin, adjuvants of mineral origin, adjuvants of plant origin, adjuvants. of animal origin, particulate protein adjuvants and liposomes.
  • the use of the vaccine compositions described herein for the chronic treatment of cancer is the object of the present invention.
  • the object of the present invention is a method of treating a subject in need, which comprises the administration of a therapeutically effective amount of the described vaccine compositions and particularly, with a stage of maintenance of the induction of immune response produced by another EGF vaccine composition.
  • the present invention encompasses the synthesis of biodegradable inorganic nanoparticles, coated with organic ligands, chemical activation, as well as covalent binding or by electrostatic interactions with an antigen that induces specific immune response against EGF and its construction on the surface of said particle.
  • the present invention comprises the formation of biodegradable inorganic particles, with dimensions in the nanometric, submicron or micrometric scale. These particles are coated with an organic ligand, preferably sodium citrate and are obtained by precipitation, although the present invention is not restricted to said method.
  • Biodegradable particles have an inorganic core formed by salts, oxides or hydroxides of calcium, iron, zinc, magnesium, zirconium, cerium, beryllium, silicon, or a mixture of two or more of them. They are preferably formed by CaP, more preferably amorphous HAp, or amorphous HAp with isomorphic substitutions of one or more metals.
  • carrier sources of calcium and phosphate ions are used, as well as an organic ligand that gives it a surface charge and a functional group that allows chemical conjugation with biomolecules.
  • Consist of biodegradable inorganic particles that can have isomorphic substitutions of metal ions or of another nature.
  • Be preferably coated with an organic ligand that gives it a surface charge and functional groups for the conjugation of antigens.
  • the inorganic particles obtained under the conditions described above partially or totally coated with an organic ligand containing carboxylate groups, preferably sodium citrate, are activated by adding a binding reagent from the carbodiimide family or another that fulfills similar functions.
  • a binding reagent from the carbodiimide family or another that fulfills similar functions.
  • reagent / particle mass ratios of 1 to 6 mg / mg are used, with 2 to 5 mg / mg being more recommended.
  • the suspension is kept stirred at room temperature (20 ⁇ 5 ° C) for 1-4 h, more recommended 0.5-3 h.
  • the activated particles are purified, preferably by means of centrifugation or filtration processes.
  • predominantly particles with sizes £ 200 nm, with their surface activated, capable of binding to proteins having exposed functional groups are obtained. This makes them superior to previous developments using inorganic particles for the encapsulation or physical adsorption of active principles.
  • the previously activated particles are mixed with the chemical conjugate of the recombinant proteins rhEGF and rP64k, at a mass ratio of rhEGF-rP64k / HAp 1-10 mg / mg, with 2-7 mg / mg being more recommended.
  • the above-described reaction produces an amide-type covalent bond between the amino groups (NH 2 ) of the conjugate and the carboxylate groups (COO) on the surface of the particle. Electrostatic interactions also occur between the remaining calcium groups on the surface of HAp and the rhEGF-rP64k conjugate, which is negatively charged and has exposed COO- groups.
  • the colloidal suspension is dispersed, preferably with EDTA and finally its pH is regulated to values between 6.7 and 7.3.
  • the chemical conjugate of the recombinant rhEGF and rP64k proteins is replaced by the conjugate of rP64k or another carrier protein with one or more rhEGF peptides.
  • the system obtained by the covalent binding between the antigen and the inorganic particles is stable and can be stored for long periods, as required by a parenteral formulation. This quality makes it superior to immunotherapeutic systems or drug release systems previously developed from inorganic particles, by the methods of encapsulation or adsorption of active principles.
  • the present invention contemplates other options for the construction of systems for the induction of immune response against EGF, through covalent bonds and electrostatic interactions between its components, which are detailed below: Binding of rhEGF or its peptides and of a carrier protein or its peptides to inorganic nanoparticles.
  • the HAp / rP64k and HAp / rhEGF mass ratios used are between 1-6 mg / mg, preferably between 2-5 mg / mg.
  • the suspension is kept under stirring at room temperature for 1-4 h, 2-3 h more recommended.
  • the recombinant rP64k protein is replaced by tetanus toxoid, KLH or another carrier protein.
  • the present invention also comprises the replacement of the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
  • rhEGF is replaced by one or more peptides that are part of rhEGF.
  • the suspension is kept under stirring at room temperature for 1-4 h, preferably between 2-3 h.
  • the excess rP64k protein is eliminated, it is activated preferably with EDC, then the excess EDC is eliminated and mixed with rhEGF in a proportion of 1-10 mol of rhEGF per mol of rP64k, preferably 2-6 mol of rhEGF per mol of rP64k.
  • the recombinant rP64k protein is replaced by tetanus toxoid, KLH or another carrier protein.
  • the present invention also encompasses the substitution of the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
  • rhEGF is replaced by one or more peptides that are part of rhEGF.
  • This procedure generates a system where the carrier protein is bound chemically and by electrostatic interactions with biodegradable inorganic nanoparticles and also with rhEGF.
  • This method produces a two-layered rhEGF-rP64k conjugate with high purity, without the presence of free rhEGF or rP64k. It is superior to the conjugate rhEGF-rP64k derived from the inventions US 5,894,018 and US 8,778,879, in which more than 40% of rhEGF is obtained in the free state, without biological relevance. In addition, it reduces the risks associated with the toxicity of the glutaraldehyde used in these inventions.
  • a molar ratio of rhEGF / rP64k of 3-9 mol / mol should be used, being more recommended between 4-8 mol / mol.
  • the particle / rP64k and particle / rhEGF mass ratios used are between 1-6 mg / mg, being more recommended between 2-5 mg / mg. They are kept stirring at room temperature for 1-4 h, 2-3 h more recommended.
  • the recombinant rP64k protein is replaced by tetanus toxoid, KLH or another carrier protein.
  • the present invention also comprises the replacement of the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
  • rhEGF is replaced by one or more peptides that are part of rhEGF.
  • a complex matrix of conjugates rhEGF-rP64k is generated and of these with the ligand that covers the inorganic nano-particle. Like the previous systems, it generates an immune response of anti-EGF antibodies. It also reduces by up to 40% the amount of rhEGF necessary for the conformation of the system and reduces the risks associated with the toxicity of the glutaraldehyde used in the inventions US 5,894,018 and US 8,778,879. Formation of systems for the induction of response against EGF by encapsulation or adsorption on the inorganic particle
  • the present invention provides methods for synthesizing immunogens that possess an inorganic nucleus and conjugate rhEGF-rP64k or rhEGF and rP64k or their peptides, inside or adsorbed on the surface of the particle.
  • Carrier sources of calcium and phosphate ions are mixed in aqueous solution, ensuring to maintain a cation / anion molar ratio of 1.4-3.5.
  • the rhEGF-P64k conjugate is added, at a mass ratio of rhEGF-rP64k / inorganic nano-particle of 1-10 mg / mg, with 2-7 mg / mg being more recommended.
  • ammonium hydroxide or sodium hydroxide is added until pH 8-10 is obtained and the reaction is kept under stirring for 1-4 h at room temperature. After completion of the reaction, it is preferably washed with purified water and filtered off.
  • This procedure generates nano and microparticles that contain within and on the surface conjugates rhEGF-rP64k bound by interactions between the positively charged groups of the particle and the COOs of the conjugate and between the negatively charged groups in the particle and the amines of the conjugate.
  • the recombinant rP64k protein is replaced by tetanus toxoid, KLH or another carrier protein.
  • the present invention also comprises the replacement of the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
  • rhEGF is replaced by one or more peptides that are part of rhEGF.
  • This procedure generates nano and micro-particles that contain within and on the surface conjugates rhEGF-rP64k bound by Electrostatic interactions between the positively charged groups on the particle and the COOs of the conjugate and between the negatively charged groups on the particle and the amines of the conjugate.
  • the recombinant rP64k protein is replaced by tetanus toxoid, KLH or another carrier protein.
  • the present invention also comprises the replacement of the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
  • rhEGF is replaced by one or more peptides that are part of rhEGF.
  • the recombinant rP64k protein is replaced by tetanus toxoid, KLH or another carrier protein.
  • the present invention also comprises the replacement of the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
  • the procedure generates nano and microparticles that contain on the surface rhEGF and rP64k molecules linked by interactions between the positively charged groups on the particle and the COO- of the proteins and between the negatively charged groups on the particle and the amino groups on the proteins.
  • the recombinant rP64k protein is replaced by tetanus toxoid, KLH or another carrier protein.
  • the present invention also comprises the replacement of the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
  • the combinations described above favor the chronic treatment of cancer in tissues of epithelial origin, since they avoid the accumulation of substances foreign to the organism at the injection sites and their associated toxicity.
  • the anti-EGF systems encompassed in the present invention use suitable pharmaceutical excipients. These include, but are not limited to: water for injections, sodium chloride, phosphorous and potassium salts, calcium chloride, sodium citrate and hydroxide, and EDTA. They can be inoculated to patients with cancer of epithelial origin in parenteral formulations of protein concentrations of 0.5 to 5 mg / mL and doses between 20-70 pL / kg or 20-70 pg of total proteins per kilogram or up to 5 mg of total proteins, being more recommended 30-60 pg / kg.
  • the dose to be applied of the inorganic component defined in the present invention will be 2-4.5 mg / kg, being more recommended 3-4 mg / kg, as long as it is kept within the limits of the approved doses for its use in humans, intramuscularly or subcutaneously.
  • FIG. 1 X-Ray Diffraction Pattern: A) Amorphous HAp particles, obtained in the present invention. B) HAp JCPDS reference standard: PDF Ref. 09-0432.
  • Figure 3 Size of the amorphous HAp particles obtained in the present invention, determined by transmission electron microscopy. A) Image of the particles with 25000 X magnification. B) Image of the particles with 500000 X magnification. C) Particle size distribution.
  • Figure 6 Characterization of the HAp-rhEGF-rP64k system by: A) SDS-PAGE electrophoresis: 1 -Molecular mass pattern, 2-Positive control of rhEGF-rP64k conjugate prepared according to the invention US 8,778,879, 3- HAp-rhEGF- system rP64k. B) Western Blot profile: 1 - RhEGF-rP64k conjugate positive control, 2- HAp-rhEGF-rP64k system.
  • Figure 7. Anti-EGF antibody response in C57BL / 6 mice immunized with the covalently linked HAp-rhEGF-rP64k system and with the control group (Montanide-rhEGF-rP64k).
  • Figure 8 Relationship of antibody subclasses (lgG2b + lgG2c) / lgG1, contained in sera from C57BL / 6 mice immunized with the HAp-rhEGF-rP64k systems and with the control group (Montanide-rhEGF-rP64k).
  • Figure 9 Photograph of the effect of the HAp-rhEGF-rP64k and Montanide-rhEGF-rP64k systems on the injection sites in BALB / c mice.
  • Figure 11 Relationship of antibody subclasses (lgG2a + lgG2b) / lgG1, contained in sera from C57BL / 6 mice immunized with the HAp-rhEGF-rP64k system combined with VSSP and with rhEGF-rP64k encapsulated in DRV's liposomes.
  • Figure 14 Characterization of the HAp-PI system by: A) SDS-PAGE electrophoresis: 1- Molecular mass pattern, 2-Positive control of rP64k 3- Positive control of rhEGF 4- HAp-PI system covalently linked and B) Western Blot Profile: 1 - rP64k positive control, 2- HAp-PI system.
  • Figure 16 Characterization of the HAp-CM system by: A) SDS-PAGE electrophoresis 1 - Molecular mass standard, 2-Positive control of rhEGF-rP64k conjugate prepared according to the invention US 8,778,879, 3- Covalently linked HAp-CM system and B) Western Blot Profile 1 - RhEGF-rP64k conjugate positive control, 2- HAp-CM system.
  • Figure 18 Relationship of antibody subclasses (lgG2b + lgG2c) / lgG1, contained in sera from C57BL / 6 mice immunized with the HAp-rhEGF-rP64k, HAp-PI and HAp-CM systems and with the Montanide-rhEGF-rP64k control. .
  • amorphous HAp nanoparticles coated with sodium citrate were obtained.
  • a solution A was prepared, made up of CaCh 0.05 mol / L and sodium citrate, with a molar ratio: sodium / calcium citrate of 4: 1.
  • the Fourier transform infrared (FT-IR) spectra of the nanoparticles (A) and the sodium citrate used as control (B) are shown in Figure 2.
  • the bands observed in 1090, 1030, 962, 604, 561 and 472 cnr 1 in the spectrum of nanoparticles confirmed the presence of the phosphate groups corresponding to HAp.
  • at 3400 cnr 1 there is a broad band attributed to wastewater and OH- groups. Bands of citrate carboxylate groups at 1610 and 1413 cnr 1 were also observed in both spectra, confirming the presence of this ligand on the surface.
  • the nanoparticles showed a spherical morphology ( Figures 3A and 3B), with an average size of 62 ⁇ 13 nm ( Figure 3C), determined by transmission electron microscopy.
  • Figure 4 a 6.2% loss of mass was found at temperatures greater than 200 ° C ( Figure 4), which is related to the presence of sodium citrate on the surface of the nanoparticles.
  • the temperature range analyzed was between 25 ° C and 1000 ° C with a heating rate of 20 K / min, using an argon flow of 60 mL / min.
  • the amorphous HAp nanoparticles were treated with a sterile EDC solution maintaining an EDC / HAp mass ratio of 2: 1 for one hour, under controlled environmental conditions. The suspension was then centrifuged at 6708 gravities and excess EDC was removed.
  • Example 2 Obtaining the HAp-rhEGF-rP64k system by covalently binding amorphous HAp nanoparticles to the rhEGF-rP64k conjugate
  • amorphous HAp nanoparticles obtained and activated according to Example 1 were mixed under controlled environmental conditions, with a sterile solution of phosphate buffer (PBS) of pH 7 ⁇ 0.3, which contained the chemical conjugate rhEGF-rP64k obtained according to methodology described in the invention US 8,778,879, at a mass ratio of rhEGF-rP64k / HAp of 1:
  • PBS phosphate buffer
  • the HAp-rhEGF-rP64k system was obtained, which was dispersed with EDTA, the medium conditions were adjusted to pH 7 ⁇ 0.3 and protein concentration to 1 ⁇ 0.2 mg / mL, with sterile solutions of PBS and hydroxide of sodium.
  • the DLS test indicated the presence of nano-particles of medium hydrodynamic diameter
  • the nano-particulate system obtained by the procedure explained above, was characterized by SDS-PAGE electrophoresis and Western Blot ( Figure 6). Electrophoresis showed a band pattern similar to the positive control of the rhEGF-rP64k conjugate (predominant bands with molecular mass equal to or greater than 66 kDa), indicating its presence in the system. In the Western Blot assay, a band similar to the free rhEGF-rP64k conjugate control was observed, determining the existence of rhEGF in conjugates with a molecular mass greater than 200 kDa. With this analysis it was shown that the rhEGF-rP64k conjugate bound to the nanoparticles maintained its structural and functional integrity as it continues to be recognized by anti-EGF antibodies.
  • Example 3 The HAp-rhEGF-rP64k system generates a humoral response against EGF with no visible adverse effects at injection sites.
  • a four-dose immunization schedule was applied (days: 0, 14, 28 and 42). Two days before starting the immunization protocol and on days 35 and 56, both groups of mice had their total IgG antibody titers against EGF determined by ELISA.
  • the EGF-specific (IgG2b + IgG2c) / IgG1 ratio was also determined in immune sera at 56 days.
  • Statistical analysis was performed using the Kruskal-Wallis mean comparison test, unequal letters indicate statistically significant differences (p ⁇ 0.05).
  • the FIAp-rhEGF-rP64k system generated anti-EGF antibodies, which were determined in the immune serum at a dilution of 1 / 10,000 at 56 days (Figure 7).
  • This result demonstrates that the binding of the rhEGF-rP64k conjugate to the particle does not affect its integrity, and that HAp enhances an anti-EGF humoral response despite being significantly lower than the control group.
  • the ratio (lgG2b + lgG2c) / lgG1 showed that there are no statistically significant differences between the response produced by the HAp-rhEGF-rP64k system and the control (Montanide-rhEGF-rP64k) (Figure 8).
  • humoral responses prevail (Th2), which makes them very appropriate for EGF depletion, as part of the treatment of cancer of epithelial origin.
  • mice were treated with the anti-EGF system obtained in Example 2 (HaP-rhEGF-rP64k) and the same number of mice with the Montanide-rhEGF-rP64k control.
  • the vaccination schedule was similar to that described above.
  • photographic images were taken of the injection sites in the mice of the two treated groups.
  • Figure 9A it can be seen that the mice of the control group presented accumulations of mineral oil at the injection sites, coming from the Montanide.
  • Example 4 The combination of the HAp-rhEGF-rP64k system with particulate adjuvants generates an anti-EGF IgG antibody response and induces a Th1-type response pattern.
  • Group 1 63 pg of proteins of the vaccine composition described in US 8,778,879 (Montanide-rhEGF-rhP64k) (Positive control).
  • Group 2 63 pg of proteins from the HAp-rhEGF-rP64k system with 100 pg of proteins from the nano-particulate adjuvant VSSP.
  • Group 3 31, 5 pg protein Hap-rhEGF-rP64K and 31, 5 pg of conjugate rhEGF- rP64K system, encapsulated in liposomal vesicles (DRV 's) derived by dehydration-rehydration (Kirby and Gregoriadis, Biotechnology methodology, (1984) 2: 979-984).
  • DBV 's liposomal vesicles
  • Immunizations were performed on days 0, 14, 28 and 42. Blood was drawn two days before starting the protocol and on days 35 and 56 and with the serum obtained, the titers of total anti-IgG antibodies were determined by ELISA. EGF. The relationship (IgG2b + IgG2c) / IgG1 specific to EGF in the sera was also determined on day 56. Statistical analysis was performed using the Kruskal-Wallis mean comparison test, unequal letters indicate statistically significant differences (p ⁇ 0, 05).
  • Example 5 Maintenance of anti-EGF IgG antibody response by the HAp-rhEGF-rP64k system, previously induced with Montanide-rhEGF-rP64k
  • mice were immunized with 63 pg of proteins contained in the system described in the invention US 8,778,879 (Montanide-rhEGF-rhP64k).
  • Group 2 Mice were immunized on day 0 with 63 pg of proteins contained in the Montanide-rhEGF-rhP64k system and the rest of the immunizations with the same amount of proteins contained in the HAp-rhEGF-rP64k system.
  • Group 3 Mice were immunized on days 0 and 14 with 63 pg of proteins contained in the Montanide-rhEGF-rhP64k system and the rest of the immunizations with the same amount of proteins contained in the HAp-rhEGF-rP64k system. Two days prior to the first immunization, the preimmune serum was extracted and after 35, 56 and 84 days the immune sera were extracted and the anti-EGF IgG antibody titers were quantified by ELISA.
  • Anti-EGF antibody titers were observed at the three times studied, without statistical differences between the three groups, being observed in the dilution of 1/50000 on day 35 and 1/100000 on days 56 and 84 ( Figure 12).
  • the inoculation of the FIAp-rhEGF-rP64k system maintained the response of anti-EGF antibodies of the IgG type induced by Montanide-rhEGF-rP64k, during the entire period of time studied. This supports the feasibility of substituting Montanide for HAp as an adjuvant of the rhEGF-rP64k conjugate in the maintenance phase of the anti-EGF immune response and its application in the chronic treatment of cancer of epithelial origin.
  • Example 6 Construction of the HAp-PI system by covalently binding the rhEGF and rP64k proteins on the surface of the amorphous HAp nanoparticles
  • Figure 13 shows the particle size profile measured by DLS.
  • the mean diameter was 111.2 nm, with a polydispersity index of 0.347.
  • the system obtained was similar to that generated in Example 2 in terms of its size, polydispersity and DLS profiles. This indicates that the binding of rhEGF and rP64k to HAp nanoparticles without being bound to each other, produced a dispersion similar to that obtained with the conjugate rhEGF-rP64k.
  • Example 7 Construction of the HAp-CM system on the surface of amorphous HAp nanoparticles by multiple conjugation of the rhEGF and rP64k proteins
  • Example 8 The new systems built on HAp nanoparticles generate anti-EGF IgG antibody responses producing fewer epidermal lesions at the injection site.
  • mice Three groups of five C57BL / 6 mice each were immunized with 63 pg of proteins, contained in the following systems:
  • Immunizations were performed on days 0, 14, 28 and 42. Blood was drawn two days before starting the protocol and on days 35 and 56 and with the serum obtained, the titers of total anti-IgG antibodies were determined by ELISA. EGF. The EGF-specific (IgG2b + IgG2c) / IgG1 ratio was also determined in the sera on day 56. Statistical analysis was performed using the Kruskal-Wallis mean comparison test, unequal letters indicate statistically significant differences (p ⁇ 0.05).
  • the HAp-rP64k and HAp-CM systems generated anti-EGF antibodies that were determined in the immune serum up to a dilution of 1/10000 and in the HAp-PI system up to a dilution of 1/8000 on days 35 and 56 ( Figure 17 ).
  • the results obtained by SDS-PAGE and Western Blot were confirmed (Examples 6 and 7) and it was shown that the systems built on HAp nanoparticles are immunogenic, despite the fact that rhEGF is in the context of a covalent bond. with the rhP64k and the HAp particle. This development constitutes evidence that it is feasible to produce systems that generate an anti-EGF immune response without requiring to chemically bind rhEGF with a carrier protein.
  • Figures 19B and C show longitudinal (B) and transverse (C) fibers of muscle tissue adjacent to the site of inoculation with invasion of a fibroblast repair tissue reaction.
  • Figures 19D-F belonging to mice treated with the new systems object of the present invention, normal structure of the inoculation site and its adjacent muscle tissue is observed.
  • D HAp-rhEGF- rP64k.
  • E HAp-CM.
  • F HAp-PI.

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Abstract

La presente invención se relaciona con la biotecnología y específicamente con el campo de la salud humana. Proporciona nuevas composiciones vacunales que comprende como principio activo un sistema que contiene al EGF humano recombinante, o péptidos de este y una proteína o péptido transportador, unidas a un núcleo constituido por nano-partículas inorgánicas, con dimensiones en escala nano o submicrométrica. Estas composiciones vacunales son útiles para el tratamiento crónico del cáncer y tienen como ventaja que no tienen efectos adversos en el sitio de la inyección y no se acumulan en el organismo.

Description

COMPOSICIONES VACUNALES BASADAS EN NANO-PARTICULAS INORGANICAS PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER
CAMPO DE LA TÉCNICA
La presente invención se relaciona con la biotecnología, específicamente con el campo de la salud humana. Particularmente describe nuevas formulaciones vacunales que contienen sistemas nano-particulados con respuesta inmunológica contra el factor de crecimiento epidérmico, útiles para su uso en terapias contra el cáncer.
ANTECEDENTES
Los tumores en tejidos de origen epitelial generalmente sobre-expresan en su superficie el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF). La unión del EGF autólogo con su receptor (EGFR), activa mecanismos en el tumor que conducen a su crecimiento y al escape de la protección que confiere el sistema inmunológico. A partir de ese conocimiento, desde la década de 1990 se identificó al EGF como un blanco terapéutico para el tratamiento del cáncer de pulmón y otros de origen epitelial, en los que resulta relevante la unión del EGF con su receptor.
La inmunoterapia pasiva usando anticuerpos cuyo blanco es el EGFR ha sido objeto de muchas investigaciones. Previamente se demostró que el reconocimiento específico del receptor por anticuerpos de origen murino inhibe la estimulación mitogénica de las células malignas (Sato J.D. y cois., Methods in Enzymology (1987) 146:63-81). En otro estudio publicado en la patente US 5,891 ,996, se describen anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados que pueden jugar un rol diagnosticador o terapéutico para combatir tumores de alta expresión del EGFR.
En los últimos años se ha extendido el uso de las inmunoterapias activas, estas abren nuevas esperanzas en la lucha contra el cáncer y de transformar esta enfermedad en crónica. A diferencia del tratamiento pasivo, basan su funcionamiento en la activación del sistema inmunológico para que actúe contra el tumor u otros elementos que intervienen en su desarrollo. Entre otras ventajas, reducen la toxicidad pues requieren de la dosificación de pequeñas cantidades de principios activos.
La formulación referida en la patente US 5,894,018, reivindica la composición de una vacuna para producir respuesta inmune contra el EGF autólogo. Comprende al EGF autólogo conjugado a una proteína transportadora (toxina B del cólera, toxoide tetánico, un anticuerpo monoclonal o una proteína de la membrana externa de Neisseria meningitidis), administrada junto al adyuvante hidróxido de aluminio. Por su parte, en la invención US 8,778,879 se describe una composición vacunal para su uso terapéutico en pacientes de cáncer que tiene como principio activo al conjugado químico entre el EGF humano recombinante (rhEGF) y la proteína recombinante P64k. Se refiere a un procedimiento para la purificación del conjugado químico que le aporta mayor pureza e incremento en su actividad inmunogénica. Dicha composición contiene un adyuvante que puede ser hidróxido de aluminio o Montanide.
En estudios clínicos posteriores se evidenció que la vacuna terapéutica derivada de las invenciones mencionadas anteriormente, es segura y eficaz en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC por sus siglas en inglés), en estadios avanzados de la enfermedad (Rodríguez P. C. y cois., Clinical Cáncer Research (2016), 22 (15): 3782- 3790). Sin embargo, los enfermos que logran alta supervivencia (cinco años o más), sufren afectaciones en los músculos de los sitios de inyección (deltoides y glúteos), por la acumulación del aceite mineral que contiene el adyuvante; lo que provoca que algunos pacientes tengan que interrumpir el tratamiento o inocular el producto en músculos más alejados de los órganos linfoides.
Los adyuvantes inmunológicos surgieron por la necesidad de incrementar la inmunogenicidad de las vacunas desarrolladas a partir de proteínas recombinantes. El primer adyuvante utilizado fue el sulfato doble de aluminio, en 1926. Posteriormente se han evaluado diversos adyuvantes inorgánicos a partir de aluminio, calcio, magnesio, hierro, cinc, circonio, ceño, berilio y silicio. Sin embargo, solo se ha aprobado el uso en humanos de sales de aluminio y de calcio (Paneque-Quevedo A., Biotecnología Aplicada (2013) 30: 243-249). En todos los estudios anteriores, se utilizaron adyuvantes inorgánicos en combinación con antígenos heterólogos.
El hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio son adyuvantes poco apropiados para utilizarse en tratamientos crónicos, debido a que el aluminio es tóxico y poco metabolizable por el organismo humano. Se ha documentado ampliamente el impacto de la acumulación de aluminio sobre la salud humana, específicamente sobre los sistemas: nervioso central, músculo-esquelético, respiratorio, cardiovascular, endocrino, urinario y reproductivo (Nayak P., Environmental Research Section A (2002), 89: 101 -115; Verstraeten S. A. y cois., Arch Toxicol (2008) 82: 789-802; Flaten T. P., Brain Research Bulletin (2001) 2: 187-196).
Por otra parte, los fosfatos de calcio (en lo adelante CaP) son sustancias inorgánicas que han demostrado su utilidad como adyuvantes inmunológicos. En la patente de invención US 2,967,802; se reivindica la mezcla de un antígeno de la erisipela con un gel de CaP hidratado. En estudios y patentes posteriores se desarrollaron vacunas profilácticas contra infecciones de varios microorganismos patogénicos y alérgenos adsorbidos en CaP (US 3,608,071 , US 4016252; US 4350686; US 20120121714; Coursaget, P. y cois., Infect Immun (1986) 51 (3): 784-787).
Al igual que el hidróxido y el fosfato de aluminio, los adyuvantes de CaP basan su efecto inmunológico en la formación de un depósito del antígeno que se libera lentamente, con lo cual permiten que se presente al sistema inmunológico durante un tiempo prolongado y se genere una respuesta contra el antígeno inoculado. La patente US 8,333,996 reivindica el desarrollo de sistemas inmunológicos formados por la adsorción de antígenos tales como: Bordetella pertusis, alérgenos, virus inactivados de inmunodeficiencia humana (HIV-2), KLH, vacunas contra la difteria, toxoide tetánico, estreptococos, virus o bacterias atenuadas, polio y hepatitis A y B. También incluye la adsorción de ADN y citoquinas, tales como el factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).
En la patente US 6,355,271 se reclama un método para preparar partículas de CaP con diámetros entre 300 y 4000 nm, se basa en la mezcla acuosa de cloruro de calcio, fosfato de sodio y citrato de sodio para la adsorción de los virus HSV-1 , HSV-2 y EBV, ADN, así como los antígenos ovalbúmina y de Mycobacterium tuberculosis.
En estudios recientes se ha evaluado el uso de CaP como adyuvante de vacunas o para la liberación de diversos fármacos. Se destaca en ellos el desarrollo de sistemas particulados de hidroxiapatita, (Caio(P04)6(OH)2, en lo adelante HAp), preferentemente en forma de nano- partículas. Esta sustancia es el principal componente inorgánico del tejido óseo, lo cual garantiza su biocompatibilidad. Además, las HAp amorfas o con baja cristalinidad se biodegradan en contacto con el medio biológico. La reducción del tamaño de las partículas y el material seleccionado, le confieren propiedades superiores como adyuvante, con respecto al hidróxido de aluminio pues producen una respuesta Th1/Th2 más equilibrada y menor generación de anticuerpos de tipo IgE (Qing, H. y cois. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology (2000) 7(6): 899-903; Jones, S. y cois., Vaccine (2014) 32: 4234- 4242; Lin, Y. y cois., Expert Review of Vaccines (2017), 16(9): 895-906. Además, reduce los efectos adversos en el sitio de la inyección debido a que esta sustancia es biocompatible y en su forma amorfa resulta biodegradable.
En la invención WO 2005084637 se reivindica un sistema que comprende: un núcleo de nano-partícula de CaP, una macromolécula biológicamente activa encapsulada en la partícula del núcleo y un agente modificador de la superficie. La macromolécula biológica activa puede ser una proteína, un polipéptido, un polisacárido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un lípido o un carbohidrato.
Por otra parte, en la invención WO 2003051394 se muestra una HAp nano-particulada con diferentes tipos de recubrimientos en una única formulación para usarla como adyuvante. En ella se emplean nano-partículas como transportadores de antígenos nativos o recombinantes u otros agentes farmacológicos, para su aplicación en las superficies de las mucosas.
En otros estudios, se reivindican desarrollos y aplicaciones del CaP en general y específicamente las nano-partículas de HAp como adyuvantes inmunológicos o para el transporte de sustancias activas, para el tratamiento de enfermedades infecciosas o del sistema inmune, incluido el cáncer (US 5,443,832; US 6,355,271 ; US 6,767,550; US 20020068090; US 7,776,600; WO 2017025359).
Ninguno de los reportes anteriores describe composiciones vacunales que induzcan respuesta inmune específica contra el EGF u otra proteína autóloga, construidas sobre la superficie de partículas de CaP, a partir de su unión química con moléculas de rhEGF y una proteína transportadora de forma independiente, o por la conjugación de ambas. En una de las variantes desarrolladas en la presente invención, se produce respuesta inmunológica anti-EGF sin que se requiera unir químicamente al rhEGF con una proteína transportadora. La novedad de esta invención consiste en proporcionar nuevas composiciones vacunales para el tratamiento crónico del cáncer, formadas por un núcleo de nano-partículas inorgánicas biodegradables, unidas químicamente a antígenos autólogos. Mediante la combinación de partículas de CaP, específicamente HAp, con dimensiones en escala nano o submicrométrica, con rhEGF o uno de sus péptidos y otra proteína o péptido transportador capaces de generar respuestas inmunológicas contra el EGF. Estas nuevas composiciones superan las ya existentes para producir una respuesta contra el EGF, en cuanto a no tener efectos adversos en el sitio de la inyección y no acumularse en el organismo. Además, se dispensan en un único vial por lo que no requieren de procedimientos adicionales tales como mezclas o emulsiones en el momento de su utilización.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En una realización, la presente invención se relaciona con composiciones vacunales para inducir respuesta inmune contra el EGF, caracterizada porque comprende como principio activo un sistema que contiene al rhEGF o péptidos de este y una proteína o péptido transportador unidos a un núcleo constituido por nano-partículas inorgánicas biodegradables que pueden ser sales, óxidos u hidróxidos de calcio, hierro, cinc, magnesio, circonio, cerio, berilio, silicio, o la mezcla de dos o más de ellos. Preferentemente, el núcleo inorgánico es de CaP y más particularmente de tipo HAp. Esta HAp es preferiblemente amorfa o de baja cristalinidad y está recubierta parcial o totalmente por un ligando orgánico, particularmente citrato de sodio.
Adicionalmente, la proteína o péptido transportador se selecciona del grupo que comprende: la toxina B del cólera, toxoide tetánico, KLH y la P64k de Neisseria meningitides.
Además, el principio activo de las composiciones vacunales de la presente invención se encuentra sobre la superficie de las nano-partículas de HAp, enlazado mediante uno de los siguientes métodos: Unión covalente del conjugado químico del rhEGF o péptidos del mismo y de la proteína o péptido transportador con la nano-partícula de HAp (HAp-rhEGF- rP64k).
Unión covalente del rhEGF o péptidos de mismo y de la proteína o péptido transportador con la nano-partícula de FIAp de modo independiente (HAp-PI). Unión covalente sucesiva del rhEGF o péptidos de mismo y de la proteína o péptido transportador a la nano-partícula de FIAp.
- Conjugación múltiple del rhEGF o péptidos de mismo y de la proteína o péptido transportador sobre la superficie de la FIAp (FIAp-CM).
Encapsulación o unión física del rhEGF y de la proteína o péptido transportador sobre la superficie de la FIAp.
Otro aspecto, contempla la combinación de las composiciones vacunales aquí descritas con adyuvantes que se seleccionan de los grupos que comprenden: adyuvantes incompletos de Freund, adyuvantes a base de escualeno, adyuvantes de origen sintético, adyuvantes de origen mineral, adyuvantes de origen vegetal, adyuvantes de origen animal, adyuvantes proteicos particulados y liposomas.
En una realización adicional, es objeto de la presente invención el uso de las composiciones vacunales aquí descritas para el tratamiento crónico del cáncer.
En otro aspecto, es objeto de la presente invención, un método de tratamiento a un sujeto que lo necesite, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones vacunales descritas y particularmente, con una etapa de mantenimiento de la inducción de respuesta inmunológica producida por otra composición vacunal contra el EGF.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención abarca la síntesis de nano-partículas inorgánicas biodegradables, recubiertas con ligandos orgánicos, la activación química, así como la unión covalente o por interacciones electrostáticas con un antígeno que induce respuesta inmune específica contra el EGF y su construcción sobre la superficie de dicha partícula.
Obtención y activación de nano-partículas inorgánicas biodegradables
La presente invención comprende la formación de partículas inorgánicas biodegradables, con dimensiones en escala nanométrica, submicrométrica o micrométrica. Estas partículas se recubren con un ligando orgánico, preferentemente citrato de sodio y se obtienen por precipitación, aunque la presente invención no se restringe a dicho método.
Las partículas biodegradables poseen un núcleo inorgánico formado por sales, óxidos u hidróxidos de calcio, hierro, cinc, magnesio, circonio, cerio, berilio, silicio, o la mezcla de dos o más de ellos. Preferentemente están formadas por CaP, más preferentemente de HAp amorfa, o HAp amorfa con sustituciones isomórficas de uno o más metales.
Para la formación de las partículas inorgánicas, se utilizan fuentes portadoras de iones calcio y fosfato, además un ligando orgánico que le confiera carga superficial y un grupo funcional que permita la conjugación química con biomoléculas.
Las partículas empleadas en los sistemas inmunoterapéuticos descritos en la presente invención se caracterizan por al menos una de las siguientes propiedades:
Estar constituidas por partículas inorgánicas biodegradables que pueden tener sustituciones isomórficas de iones metálicos o de otra naturaleza.
Estar sintetizadas preferentemente mediante vía húmeda, de preferencia por precipitación, aunque la presente invención no se restringe a este método. Dimensiones micrométricas, submicrométricas, nanométricas o combinaciones de estas.
- Morfología esférica, cilindrica, de placas o combinaciones de estas, aunque el alcance de la presente invención no se restringe a dichas morfologías.
Estar preferentemente recubiertas con un ligando orgánico que le confiera carga superficial y grupos funcionales para la conjugación de antígenos.
Para la obtención de las partículas inorgánicas comprendidas en esta invención se requiere preferentemente:
Mantener la relación molar de catión/anión en 1 -4.
- Adicionar citrato de sodio u otro ligando orgánico de efecto similar a los reactantes en proporción molar de 3-5 en relación al contenido de iones calcio.
- Ajustar el pH a 7-13, mediante la adición de un álcali, preferiblemente hidróxido de amonio o hidróxido de sodio.
Realizar la reacción durante 1 -4 h, preferentemente a temperatura ambiente (20±5°C).
Efectuar el proceso de secado a vacío o temperatura ambiente.
Las partículas inorgánicas obtenidas en las condiciones descritas anteriormente parcial o totalmente recubiertas con un ligando orgánico que contiene grupos carboxilatos, preferentemente citrato de sodio se activan mediante la adición de un reactivo enlazador de la familia de las carbodiimidas u otro que cumpla similares funciones. En dicho proceso se utilizan relaciones másicas reactivo/partícula de 1 a 6 mg/mg, siendo más recomendable 2 a 5 mg/mg. La suspensión se mantiene en agitación a temperatura ambiente (20±5°C) durante 1-4 h, más recomendable 0,5-3 h. Posteriormente, las partículas activadas se purifican, preferentemente mediante procesos de centrifugación o filtración. Mediante el procedimiento descrito anteriormente, se obtienen predominantemente partículas con tamaños £ 200 nm, con su superficie activada, aptas para enlazarse con proteínas que tengan grupos funcionales expuestos. Lo anterior las hace superiores a los desarrollos previos a partir de partículas inorgánicas para la encapsulación o adsorción física de principios activos.
Obtención del sistema nano-particulado para la inducción de respuesta contra el EGF
Las partículas previamente activadas, se mezclan con el conjugado químico de las proteínas recombinantes rhEGF y rP64k, a razón másica de rhEGF-rP64k/HAp 1-10 mg/mg, siendo más recomendable 2-7 mg/mg. La reacción anteriormente descrita produce un enlace covalente de tipo amida entre los grupos aminos (NH2) del conjugado y los grupos carboxilatos (COO ) en la superficie de la partícula. También se producen interacciones electrostáticas entre los grupos calcio remanentes de la superficie de la HAp y el conjugado rhEGF-rP64k que se encuentra cargado negativamente y posee grupos COO- expuestos. Luego la suspensión coloidal se dispersa, preferentemente con EDTA y por último se regula su pH a valores entre 6,7 y 7,3.
En otra variante de realización, se sustituye el conjugado químico de las proteínas recombinantes rhEGF y rP64k por el conjugado de la rP64k u otra proteína transportadora con uno o varios péptidos del rhEGF.
La unión de los conjugados descritos en la presente invención con la superficie de las partículas inorgánicas mediante el procedimiento especificado anteriormente, constituye el primer sistema de este tipo para el tratamiento del cáncer, con una composición sustancialmente diferente a las formulaciones vacunales descritas en las patentes US 5,894,018 y US 8,778,879. Al ser inoculado, produce una respuesta inmune que incluye la generación de anticuerpos anti-EGF capaces de capturar al EGF circulante e impedir que este se una a su receptor en la superficie del tumor.
El sistema obtenido por la unión covalente entre el antígeno y las partículas inorgánicas es estable y puede almacenarse durante tiempos prolongados, como es requerido por una formulación parenteral. Esta cualidad, lo hace superior a sistemas inmunoterapéuticos o de liberación de medicamentos desarrollados previamente a partir de las partículas inorgánicas, por los métodos de encapsulación o adsorción de principios activos.
Conformación de conjugados sobre las partículas inorgánicas mediante uniones covalentes e interacciones electrostáticas, para la inducción de respuesta contra el EGF
La presente invención contempla otras opciones para la construcción de sistemas para la inducción de respuesta inmune contra el EGF, mediante uniones covalentes e interacciones electrostáticas entre sus componentes, las cuales se detallan a continuación: Unión del rhEGF o péptidos de éste y de una proteína transportadora o sus péptidos a las nano-partículas inorgánicas.
Las partículas obtenidas según las metodologías descritas anteriormente, previamente activadas con una carbodiimida, preferentemente con 1 -etil-3-(3-dimetiaminopropil) carbodiimida (EDC), se mezclan con una disolución de PBS de pH 7±0,3 que contiene rhEGF y rP64k en proporción molar de rhEGF/rP64k de 3 a 9 mol/mol, preferentemente entre 4 y 8 mol/mol. Además, las relaciones másicas HAp/rP64k y HAp/rhEGF utilizadas se encuentran entre 1 -6 mg/mg, preferentemente entre 2-5 mg/mg. Posteriormente, se mantiene la suspensión en agitación a temperatura ambiente durante 1 -4 h, más recomendable 2-3 h. En otras variantes de realización la proteína recombinante rP64k se sustituye por toxoide tetánico, KLH u otra proteína transportadora. La presente invención también comprende la sustitución de la proteína rP64k por uno o varios péptidos inmunogénicos de origen natural o sintético.
En otra variante de realización se sustituye el rhEGF por uno o varios péptidos que forman parte del rhEGF.
Con este método, se obtiene un sistema en el que las proteínas rhEGF y rP64k se unen químicamente y por interacciones electrostáticas con las nano-partículas, sin estar unidas entre ellas. La partícula constituye el elemento enlazador que asegura la inmunogenicidad del sistema. En este desarrollo se evidencia que es posible producir sistemas que generan respuesta inmunológica anti-EGF sin que requiera unir químicamente al rhEGF con una proteína transportadora. Además, reduce hasta en 40% la cantidad de rhEGF necesaria para la conformación del sistema y reduce los riesgos asociados a la toxicidad del glutaraldehído empleado en las invenciones US 5,894,018 y US 8,778,879.
Conjugación del rhEGF o péptidos de éste y de una proteína transportadora o sus péptidos, mediante dos pasos de reacción.
Las nano-partículas obtenidas según las metodologías descritas anteriormente, previamente activadas con una carbodiimida, preferentemente EDC, se mezclan con una disolución de PBS de pH 7±0,3 que contiene rP64k en proporción másica de 1 -6 mg/mg, preferentemente entre 2-5 mg/mg. La suspensión se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante 1 -4 h, preferentemente entre 2-3 h. Posteriormente se elimina el exceso de proteína rP64k, se activa preferentemente con EDC, luego se elimina el exceso de EDC y se mezcla con rhEGF en proporción de 1 -10 mol de rhEGF por mol de rP64k, preferiblemente 2-6 mol de rhEGF por mol de rP64k.
En otras variantes de realización la proteína recombinante rP64k se sustituye por toxoide tetánico, KLH u otra proteína transportadora. La presente invención también comprende la sustitución de la proteína rP64k por uno o varios péptidos inmunogénicos de origen natural o sintético.
En otra variante de realización se sustituye el rhEGF por uno o varios péptidos que forman parte del rhEGF.
Este procedimiento genera un sistema donde la proteína transportadora se une químicamente y por interacciones electrostáticas con las nano-partículas inorgánicas biodegradables y también con el rhEGF. Este método produce un conjugado rhEGF-rP64k formado por dos capas de proteínas con alta pureza, sin la presencia de rhEGF o rP64k libres. Es superior al conjugado rhEGF-rP64k derivado de las invenciones US 5,894,018 y US 8,778,879, en los cuales se obtiene más de 40% de rhEGF en estado libre, sin relevancia biológica. Además, reduce los riesgos asociados a la toxicidad del glutaraldehido empleado en esas invenciones.
Conjugación múltiple del rhEGF o péptidos de éste y de una proteína transportadora o sus péptidos sobre la superficie de la partícula inorgánica.
Las partículas obtenidas según las metodologías descritas anteriormente, previamente activadas con una carbodiimida, preferentemente EDC, se mezclan con una disolución de PBS de pH 7±0,3 que contiene rhEGF y rP64k. Ambas proteínas reaccionan con las partículas activadas y con el exceso de EDC que se mantiene en disolución luego de la activación, uniendo las proteínas entre sí y con la superficie de la partícula. Para ello debe emplearse una relación molar de rhEGF/rP64k de 3-9 mol/mol, siendo más recomendable entre 4-8 mol/mol. Además, las relaciones másicas partícula/rP64k y partícula/rhEGF utilizadas se encuentran entre 1-6 mg/mg, siendo más recomendable entre 2-5 mg/mg. Se mantienen en agitación a temperatura ambiente durante 1 -4 h, más recomendable 2-3 h.
En otras variantes de realización la proteína recombinante rP64k se sustituye por toxoide tetánico, KLH u otra proteína transportadora. La presente invención también comprende la sustitución de la proteína rP64k por uno o varios péptidos inmunogénicos de origen natural o sintético.
En otra variante de realización se sustituye el rhEGF por uno o varios péptidos que forman parte del rhEGF.
Se genera una matriz compleja de conjugados rhEGF-rP64k y de estos con el ligando que recubre la nano-partícula inorgánica. Al igual que los sistemas anteriores, genera respuesta inmunológica de anticuerpos anti-EGF. También reduce hasta en 40% la cantidad de rhEGF necesaria para la conformación del sistema y reduce los riesgos asociados a la toxicidad del glutaraldehido empleado en las invenciones US 5,894,018 y US 8,778,879. Conformación de sistemas para la inducción de respuesta contra el EGF mediante encapsulación o adsorción sobre la partícula inorgánica
Si bien, los sistemas unidos químicamente y obtenidos por los procedimientos anteriores son más estables y apropiados para las formulaciones vacunales, la encapsulación y adsorción del antígeno también son útiles. Para ello, la presente invención aporta los procedimientos para sintetizar inmunógenos que poseen un núcleo inorgánico y conjugado rhEGF-rP64k o rhEGF y rP64k o sus péptidos, en su interior o adsorbidos sobre la superficie de la partícula.
Encapsulación del conjugado de rhEGF o péptidos de éste y de una proteína transportadora o sus péptidos a la partícula inorgánica·.
Fuentes portadoras de iones calcio y fosfato se mezclan en disolución acuosa, asegurando mantener una relación molar de catión/anión de 1 ,4-3,5. Se le adiciona el conjugado rhEGF- P64k, a razón másica rhEGF-rP64k/nano-partícula inorgánica de 1-10 mg/mg, siendo más recomendable 2-7 mg/mg. Posteriormente, se añade hidróxido de amonio o hidróxido de sodio hasta obtener un pH 8-10 y se mantiene la reacción en agitación durante 1 -4 h a temperatura ambiente. Una vez finalizada la reacción, preferentemente se lava con agua purificada y se separa por filtración. Este procedimiento genera nano y micropartículas que contienen en su interior y sobre la superficie conjugados rhEGF-rP64k unidos por interacciones entre los grupos cargados positivamente de la partícula y los COO del conjugado y entre los grupos cargados negativamente en la partícula y los aminos del conjugado.
En otras variantes de realización la proteína recombinante rP64k se sustituye por toxoide tetánico, KLH u otra proteína transportadora. La presente invención también comprende la sustitución de la proteína rP64k por uno o varios péptidos inmunogénicos de origen natural o sintético.
En otra variante de realización se sustituye el rhEGF por uno o varios péptidos que forman parte del rhEGF.
Encapsulación del rhEGF o péptidos de éste y de una proteína transportadora o sus péptidos a la partícula inorgánica:
Procedimiento similar al descrito anteriormente, difiriendo en que se añade a la disolución rhEGF y rP64k en lugar de conjugado rhEGF-rP64k, en proporción de 1 -10 mg/mg de proteínas totales, siendo más recomendable 2-7 mg/mg. Se mantiene en este proceso una relación de 1 -10 mol de rhEGF por mol de rP64k, siendo más recomendable 2-5 mol de rhEGF por mol de rP64k. Una vez finalizada la reacción, preferentemente se lava con agua purificada y separa por filtración. Este procedimiento genera nano y micro-partículas que contienen en su interior y sobre la superficie conjugados rhEGF-rP64k unidos por interacciones electrostáticas entre los grupos cargados positivamente en la partícula y los COO del conjugado y entre los grupos cargados negativamente en la partícula y los aminos del conjugado.
En otras variantes de realización la proteína recombinante rP64k se sustituye por toxoide tetánico, KLH u otra proteína transportadora. La presente invención también comprende la sustitución de la proteína rP64k por uno o varios péptidos inmunogénicos de origen natural o sintético.
En otra variante de realización se sustituye el rhEGF por uno o varios péptidos que forman parte del rhEGF. Adsorción del conjugado de rhEGF o péptidos de éste y de una proteína transportadora o sus péptidos sobre la partícula inorgánica:
Se parte de partículas previamente recubiertas con citrato de sodio, descritas anteriormente. Se mezclan con una disolución de PBS de pH 7±0,3 que contiene conjugado rhEGF-rP64k en proporción másica de 1-10 mg/mg, siendo más recomendable 2-7 mg/mg. Se mantienen en agitación a temperatura ambiente durante 1 -4 h, más recomendable 2-3 h. El sistema resultante de este procedimiento es predominantemente nano-particulado con tamaños menores de 200 nm. El conjugado rhEGF-rP64k se une por interacciones electrostáticas entre los grupos cargados positivamente en la superficie de la nano-partícula y los COO- del conjugado y entre los grupos COO- del citrato y los grupos amino del conjugado.
En otras variantes de realización la proteína recombinante rP64k se sustituye por toxoide tetánico, KLH u otra proteína transportadora. La presente invención también comprende la sustitución de la proteína rP64k por uno o varios péptidos inmunogénicos de origen natural o sintético.
En otra variante de realización se sustituye el rhEGF por uno o varios péptidos que forman parte del rhEGF. Adsorción del rhEGF o péptidos de éste y de una proteína transportadora o sus péptidos a la partícula inorgánica:
Se realiza un procedimiento similar al descrito en la variante anterior, difiriendo en que se añade a la disolución rhEGF y rP64k, en lugar de conjugado rhEGF-rP64k, en proporciones
1 -10 mg/mg de proteínas totales, siendo más recomendable 2-7 mg/mg. Este proceso requiere de una relación de 1 -10 mol de rhEGF por mol de rP64k, siendo más recomendable
2-5 mol de rhEGF por mol de rP64k. El procedimiento genera nano y micropartículas que contienen sobre la superficie moléculas de rhEGF y rP64k unidas por interacciones entre los grupos cargados positivamente en la partícula y los COO- de las proteínas y entre los grupos cargados negativamente en la partícula y los grupos amino de las proteínas. En otras variantes de realización la proteína recombinante rP64k se sustituye por toxoide tetánico, KLH u otra proteína transportadora. La presente invención también comprende la sustitución de la proteína rP64k por uno o varios péptidos inmunogénicos de origen natural o sintético.
En otra variante de realización se sustituye el rhEGF por uno o varios péptidos que forman parte del rhEGF.
Los novedosos sistemas particulados descritos anteriormente están formados sobre un núcleo inorgánico biodegradable. Este se encuentra unidos a antígenos autólogos, preferentemente conjugados químicos de las proteínas recombinantes rhEGF y rP64k o a dichas proteínas o sus péptidos por separado. Se sustentan por enlaces covalentes de tipo amida, encapsulación o adsorción sobre la superficie de la nano-partícula. Constituyen la base de formulaciones vacunales para el tratamiento del cáncer, administradas por vía parenteral luego de dispersarse con EDTA y ajustarse apropiadamente a pH 7±0,3.
Composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento
Las formulaciones farmacéuticas derivadas de la presente invención son útiles para el tratamiento del cáncer en tejidos de origen epitelial, ejemplo de ellos son el cáncer de células epiteliales escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no-pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer hepatocelular, gástrico, gastrointestinal, páncreas, glioblastoma, cervical, ovario, hígado, vejiga, mama, colon, recto, cáncer colorectal, cabeza y cuello, útero, carcinoma de glándulas salivales, riñón, próstata, vulva, tiroides, carcinoma anal y carcinoma del pene.
Pueden utilizarse de modo independiente o en combinación con adyuvantes, lo que potencia o complementa su respuesta de anticuerpos anti-EGF.
Particularmente, es objeto de esta invención la combinación de sistemas nano-particulados inorgánicos biodegradables ligados a las proteínas rhEGF-rP64k, con adyuvantes oleosos tales como los incompletos de Freund o a base de escualeno, de origen sintético, mineral, vegetal o animal, así como proteicos particulados, liposomas u otros adyuvantes o sistemas capaces de generar o potenciar respuestas de tipo humoral o celular, o la combinación de estos. Los sistemas descritos anteriormente son eficaces en el mantenimiento de la respuesta inmunológica anti-EGF, con previa inducción de anticuerpos generados por el sistema descrito en la invención US 8,778,879, o con otro sistema que proporcione resultados similares.
Las combinaciones descritas anteriormente favorecen el tratamiento crónico del cáncer en tejidos de origen epitelial, ya que evitan la acumulación de sustancias ajenas al organismo en los sitios de inyección y su toxicidad asociada. Los sistemas anti-EGF comprendidos en la presente invención utilizan excipientes farmacéuticos adecuados. Entre ellos incluyen, aunque no se limitan a: agua para inyección, cloruro de sodio, sales de fósforo y potasio, cloruro de calcio, citrato e hidróxido de sodio y EDTA. Pueden inocularse a pacientes con cáncer de origen epitelial en formulaciones parenterales de concentraciones de proteínas de 0,5 a 5 mg/mL y dosis comprendidas entre 20-70 pL/kg o 20-70 pg de proteínas totales por kilogramo o hasta 5 mg de proteínas totales, siendo más recomendable 30-60 pg/kg. La dosis a aplicar del componente inorgánico definido en la presente invención, será de 2-4,5 mg/kg, siendo más recomendado de 3-4 mg/kg, siempre que esta se mantenga dentro de los límites de las dosis aprobadas para su uso en humanos, por vía intramuscular o subcutánea.
La presente invención queda aún más elaborada con los siguientes ejemplos y dibujos. Sin embargo, estos ejemplos no deberían ser interpretados como una limitación del ámbito de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Patrón de Difracción de Rayos X: A) Partículas de HAp amorfas, obtenidas en la presente invención. B) Patrón de referencia de HAp JCPDS: PDF Ref. 09-0432.
Figura 2. Espectro FT-IR: A) Partículas de HAp amorfas, obtenidas en la presente invención. B) citrato de sodio.
Figura 3. Tamaño de las partículas de HAp amorfas obtenidas en la presente invención, determinado por microscopía electrónica de transmisión. A) Imagen de las partículas con magnificación de 25000 X. B) Imagen de las partículas con magnificación de 500000 X. C) Distribución de tamaño de las partículas.
Figura 4.Termograma de las nano-partículas de HAp amorfas, obtenidas en la presente invención.
Figura 5. Distribución de tamaño del sistema HAp-rhEGF-rP64k enlazados de forma covalente, determinado por el método de dispersión de la luz dinámica (DLS).
Figura 6. Caracterización del sistema HAp-rhEGF-rP64k mediante: A) electroforesis SDS- PAGE: 1 -Patrón de masas moleculares, 2-Control positivo de conjugado rhEGF-rP64k elaborado según la invención US 8,778,879, 3- Sistema HAp-rhEGF-rP64k. B) Perfil de Western Blot: 1 - Control positivo de conjugado rhEGF-rP64k, 2- Sistema HAp-rhEGF-rP64k. Figura 7. Respuesta de anticuerpos anti-EGF en ratones C57BL/6 inmunizados con el sistema HAp-rhEGF-rP64k enlazados de forma covalente y con el grupo de control (Montanide-rhEGF-rP64k). Figura 8. Relación de subclases de anticuerpos (lgG2b + lgG2c)/lgG1 , contenidos en sueros de ratones C57BL/6 inmunizados con los sistemas HAp-rhEGF-rP64k y con el grupo de control (Montanide-rhEGF-rP64k).
Figura 9. Fotografía del efecto de los sistemas HAp-rhEGF-rP64k y del Montanide-rhEGF- rP64k sobre los sitios de inyección en ratones BALB/c. A) Efecto del sistema Montanide- rhEGF-rP64k. B) Efecto del sistema HAp-rhEGF-rP64k.
Figura 10. Respuesta de anticuerpos anti-EGF en ratones C57BL/6 inmunizados con el sistema HAp-rhEGF-rP64k combinado con VSSP y con rhEGF-rP64k encapsulado en liposomas DRV's.
Figura 11. Relación de subclases de anticuerpos (lgG2a + lgG2b)/lgG1 , contenidos en sueros de ratones C57BL/6 inmunizados con el sistema HAp-rhEGF-rP64k combinado con VSSP y con rhEGF-rP64k encapsulado en liposomas DRV's.
Figura 12. Mantenimiento de la respuesta de anticuerpos anti-EGF por el sistema HAp- rhEGF-rP64k, con previa inducción de una o dos dosis con el sistema Montanide-rhEGF- rP64k.
Figura 13. Distribución de tamaño del sistema HAp-PI construido sobre la partícula, determinado por DLS.
Figura 14. Caracterización del sistema HAp-PI mediante: A) electroforesis SDS-PAGE: 1- Patrón de masas moleculares, 2-Control positivo de rP64k 3- Control positivo de rhEGF 4- Sistema HAp-PI enlazados de forma covalente y B) Perfil de Western Blot: 1 - Control positivo de rP64k, 2- Sistema HAp-PI.
Figura 15. Distribución de tamaño del sistema HAp-CM.
Figura 16. Caracterización del sistema HAp-CM mediante: A) electroforesis SDS-PAGE 1 - Patrón de masas moleculares, 2-Control positivo de conjugado rhEGF-rP64k elaborado según la invención US 8,778,879, 3- Sistema HAp-CM enlazados de forma covalente y B) Perfil de Western Blot 1 - Control positivo de conjugado rhEGF-rP64k, 2- Sistema HAp-CM. Figura 17. Respuesta de anticuerpos anti-EGF en ratones C57BL/6 inmunizados con los sistemas HAp-rhEGF-rP64k, HAp-PI y HAp-CM.
Figura 18. Relación de subclases de anticuerpos (lgG2b + lgG2c)/lgG1 , contenidos en sueros de ratones C57BL/6 inmunizados con los sistemas HAp-rhEGF-rP64k, HAp-PI y HAp- CM y con el control Montanide-rhEGF-rP64k.
Figura 19. Imágenes fotográficas de los cortes histológicos de tejido muscular extraídos del sitio de inoculación y tejido muscular adyacente de los ratones C57BL/6, con magnificación 10X. Se representa con " al tejido de reparación fibroblástica. Los ratones fueron tratados con: A-C: Montanide-rhEGF-rP64k, D: HAp-rhEGF-rP64k, E: HAp-CM, F: HAp-PI. Figura 20. Número de lesiones observadas en los tejidos de los sitios de inyección de ratones C57BL/6 inmunizados con los sistemas HAp-rhEGF-rP64k, HAp-PI y HAp-CM y con el control Montanide-rhEGF-rP64k.
EJEMPLOS
Ejemplo No. 1. Síntesis, caracterización y activación de nano-partículas de HAp
Siguiendo una variante modificada del procedimiento descrito por Koroleva M.y cois. Rusian Journal of inorganic chemistry (2016), 61 (6): 674-680), se obtuvo nano-partículas de HAp amorfas recubiertas con citrato de sodio. Bajo condiciones ambientales controladas se preparó una disolución A, formada por CaCh 0,05 mol/L y citrato de sodio, con relación molar: citrato de sodio/calcio de 4:1. A continuación, se adicionó una disolución B estéril, formada por NaH2P04 0,06 mol/L a flujo de 1 mL/min, manteniendo una relación molar Ca/P=1 ,67. Posteriormente, se ajustó a pH 10 con una disolución de hidróxido de sodio y se mantuvo la reacción en agitación durante tres horas a temperatura ambiente. Una vez concluida la reacción se lavó con agua purificada y separó por filtración en Amicon utilizando membrana de polietersulfona de tamaño de poro 10 kDa. El sólido obtenido se secó al vacío y temperatura ambiente. Antes de su utilización, fueron esterilizadas con vapor puro a 120°C durante 30 min y secadas al vacío.
Mediante un ensayo de Difracción de Rayos X se comprobó que se generaron nano- partículas de HAp amorfa (Figura 1 ), con grado de cristalinidad de 9.3% y tamaño de cristalita de 16,5 nm. En dicho ensayo se empleó radiación de cobre (Cu Ka) con un tubo de 45 kV y 40 mA. El rango fue de 10° a 90° con pasos de 0,013° en intervalos de nueve segundos.
Los espectros infrarrojo de transformada de Fourier (FT-IR por sus siglas en idioma ingles) de las nano-partículas (A) y del citrato de sodio utilizado como control (B) se muestra en la Figura 2. Las bandas observadas en 1090, 1030, 962, 604, 561 y 472 cnr1 en el espectro de las nano-partículas confirmaron la presencia de los grupos fosfatos correspondientes a la HAp. Además en 3400 cnr1 se encuentra una banda ancha atribuida a agua residual y a los grupos OH-. También se observaron las bandas de los grupos carboxilatos del citrato en 1610 y 1413 cnr1 en ambos espectros, lo que confirma la presencia de este ligando sobre la superficie.
Las nano-partículas mostraron una morfología esférica (Figuras 3A y 3B), con un tamaño promedio de 62±13 nm (Figura 3C), determinado por Microscopía electrónica de trasmisión. En el termograma se encontró la pérdida de 6,2% de la masa a temperaturas mayores de 200°C (Figura 4), lo que se encuentra relacionado con la presencia de citrato de sodio sobre la superficie de las nano-partículas. El rango de temperaturas analizado fue entre 25°C y 1000°C con una velocidad de calentamiento de 20 K/min, empleando un flujo de argón de 60 mL/min.
Las nano-partículas de HAp amorfa se trataron con una disolución estéril de EDC manteniendo una relación másica EDC/HAp de 2:1 durante una hora, bajo condiciones ambientales controladas. Luego se centrifugó la suspensión a 6708 gravedades y se eliminó el exceso de EDC.
Ejemplo 2. Obtención del sistema HAp-rhEGF-rP64k por unión covalente de las nano- partículas de HAp amorfa al conjugado rhEGF-rP64k
Las nano-partículas de HAp amorfas obtenidas y activadas según el Ejemplo 1 se mezclaron bajo condiciones ambientales controladas, con una disolución estéril de tampón fosfato (PBS) de pH 7±0,3, que contenía el conjugado químico rhEGF-rP64k obtenido según la metodología descrita en la invención US 8,778,879, a razón másica rhEGF-rP64k/HAp de 1 :
2.5 La suspensión formada se mantuvo en agitación en zaranda a 140 ciclos por minuto, durante 2 h a temperatura ambiente.
Se obtuvo el sistema HAp-rhEGF-rP64k que se dispersó con EDTA, se ajustaron las condiciones del medio a pH a 7±0,3 y concentración de proteínas a 1±0,2 mg/mL, con disoluciones estériles de PBS e hidróxido de sodio.
El ensayo de DLS indicó la presencia de nano-partículas de diámetro hidrodinámico medio
97.5 nm, con índice de polidispersión de 0,36. El sistema obtenido fue polidisperso con diámetro de partículas de 9 a 366 nm, medidos por intensidad (Figura 5).
El sistema nano-particulado, obtenido mediante el procedimiento explicado anteriormente, fue caracterizado por electroforesis SDS-PAGE y Western Blot (Figura 6). La electroforesis mostró un patrón de bandas similar al control positivo del conjugado rhEGF-rP64k (bandas predominantes con masa molecular igual o superior a 66 kDa), lo que indica su presencia en el sistema. En el ensayo de Western Blot se observó una banda similar al control de conjugado rhEGF-rP64k libre, determinándose la existencia de rhEGF en conjugados de masa molecular mayor de 200 kDa. Con este análisis se demostró que el conjugado rhEGF- rP64k unido a las nano-partículas mantuvo su integridad estructural y funcional pues continúa siendo reconocido por los anticuerpos anti-EGF.
Ejemplo 3. El sistema HAp-rhEGF-rP64k genera respuesta de tipo humoral contra el EGF sin efectos adversos visibles en los sitios de inyección
Se inmunizaron ratones C57BL/6 (n=5) con 63 pg de proteínas, contenido en el sistema descrito en el Ejemplo 2. Como control positivo del ensayo se usó un lote de producto obtenido según la metodología descrita en la invención US 8,778,879 (Montanide-rhEGF- rP64k). Se aplicó un esquema de inmunización de cuatro dosis (días: 0, 14, 28 y 42). Dos días antes de iniciar el protocolo de inmunización y en los días 35 y 56, a ambos grupos de ratones se les determinaron los títulos de anticuerpos de tipo IgG total contra el EGF mediante ELISA. Se determinó además la relación (lgG2b + lgG2c)/lgG1 específicas al EGF en sueros inmunes a los 56 días. El análisis estadístico se realizó empleando la prueba de comparación de medias de Kruskal-Wallis, letras desiguales indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).
El sistema FIAp-rhEGF-rP64k generó anticuerpos anti-EGF, que fueron determinados en el suero inmune en dilución de 1 /10000 a los 56 días (Figura 7). Este resultado demuestra que la unión del conjugado rhEGF-rP64k a la partícula no afecta su integridad, y que el HAp potencia una respuesta humoral anti-EGF a pesar de ser significativamente menor que el grupo control. Por su parte, la relación (lgG2b + lgG2c)/lgG1 mostró que no existen diferencias estadísticamente significativas entre la respuesta producida por el sistema HAp- rhEGF-rP64k y el control (Montanide-rhEGF-rP64k) (Figura 8). En ambos sistemas prevalecen respuestas de tipo humoral (Th2), lo que los hace muy apropiadas para la depleción del EGF, como parte del tratamiento del cáncer de origen epitelial.
Se determinó el efecto del sistema HAp-rhEGF-rP64k sobre el sitio de inyección. Para ello se trataron cinco ratones BALB/c con el sistema anti-EGF obtenido en el Ejemplo 2 (HaP- rhEGF-rP64k) e igual cantidad de ratones con el control Montanide-rhEGF-rP64k. El esquema de vacunación fue similar al descrito anteriormente. Al concluir el experimento, se tomaron imágenes fotográficas a los sitios de inyección en los ratones de los dos grupos tratados. En la Figura 9A se aprecia que los ratones del grupo de control, presentaron acumulaciones del aceite mineral en los sitios de inyección, provenientes del Montanide. Sin embargo, en los ratones tratados con el sistema HAp-rhEGF-rP64k producido según el Ejemplo 2 (Figura 9B), no se apreciaron afectaciones en los sitios de inyección. Estos resultados indican que el nuevo sistema desarrollado en la presente invención reduce sustancialmente el efecto sobre el sitio de inyección, y su potencialidad de utilizarlo en el tratamiento crónico del cáncer, mediante su inoculación periódica durante varios años.
Ejemplo 4. La combinación del sistema HAp-rhEGF-rP64k con adyuvantes particulados genera respuesta de anticuerpos IgG anti-EGF e induce un patrón de respuesta de tipo Th1
Se emplearon ratones C57BL/6 que se dividieron en tres grupos de cinco animales cada uno y se inmunizaron de la siguiente manera:
Grupo 1 : 63 pg de proteínas de la composición vacunal descrita en US 8,778,879 (Montanide-rhEGF-rhP64k) (Control positivo). Grupo 2: 63 pg de proteínas del sistema HAp-rhEGF-rP64k con 100 pg de proteínas del adyuvante nano-particulado VSSP.
Grupo 3: 31 ,5 pg de proteínas del sistema HAp-rhEGF-rP64k y 31 ,5 pg de conjugado rhEGF- rP64k, encapsulado en vesículas liposomales (DRV's) obtenidas por la metodología deshidratación-rehidratación (Kirby y Gregoriadis, Biotechnology, (1984) 2: 979-984).
Las inmunizaciones se realizaron los días 0, 14, 28 y 42. Se realizó extracción de sangre dos días antes de iniciar el protocolo y en los días 35 y 56 y con el suero obtenido se determinó mediante ELISA los títulos de anticuerpos IgG totales anti-EGF. Se determinó además la relación (lgG2b + lgG2c)/lgG1 específicas al EGF en los sueros el día 56. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de comparación de medias de Kruskal- Wallis, letras desiguales indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).
Se evidenció generación de anticuerpos anti-EGF en los tres grupos estudiados. Las combinaciones del sistema HAp-rhEGF-rP64k con VSSP y con liposomas DFÍV's produjeron anticuerpos que fueron determinados en el suero inmune hasta una dilución de 1/10000 y resultaron similares durante las dos extracciones (Figura 10). Se demostró la existencia de diferencias estadísticamente significativas de la combinación, con respecto al control.
El análisis de la relación (lgG2b + lgG2c)/lgG1 a los 56 días, mostró respuestas similares de ambas combinaciones de adyuvantes, siendo estadísticamente superiores al control (Figura 11). Estos resultados evidencian que la combinación de formulaciones a base de HAp con otros adyuvantes particulados, potencia una respuesta inmune específica al EGF que induce un patrón de respuesta Th1 superior, siendo este patrón el más favorable para los tratamientos dirigidos contra el cáncer.
Ejemplo 5. Mantenimiento de respuesta de anticuerpos IgG anti-EGF por el sistema HAp-rhEGF-rP64k, previamente inducida con Montanide-rhEGF-rP64k
Se emplearon tres grupos de ratones C57BL/6 (n=5) a los que se les inmunizó los días: 0, 14, 28, 42 y 70, siguiendo los siguientes esquemas de inmunización:
Grupo 1 (Control): Se inmunizó a los ratones con 63 pg de proteínas contenidas en el sistema descrito en la invención US 8,778,879 (Montanide-rhEGF-rhP64k).
Grupo 2: Se inmunizó a los ratones el día 0 con 63 pg de proteínas contenidas en el sistema Montanide-rhEGF-rhP64k y el resto de las inmunizaciones con igual cantidad de proteínas contenidas en el sistema HAp-rhEGF-rP64k.
Grupo 3: Se inmunizó a los ratones los días 0 y 14 con 63 pg de proteínas contenidas en el sistema Montanide-rhEGF-rhP64k y el resto de las inmunizaciones con igual cantidad de proteínas contenidas en el sistema HAp-rhEGF-rP64k. Dos días previos a la primera inmunización se extrajo el suero preinmune y a los 35, 56 y 84 días se realizaron extracciones de los sueros inmunes y se cuantificó los títulos de anticuerpos IgG anti-EGF mediante ELISA.
Se observaron títulos de anticuerpos anti-EGF a los tres tiempos estudiados, sin diferencias estadísticas entre los tres grupos, observándose en la dilución de 1/50000 el día 35 y 1 /100000 los días 56 y 84 (Figura 12). La inoculación del sistema FIAp-rhEGF-rP64k mantuvo la respuesta de anticuerpos anti-EGF de tipo IgG inducida por el Montanide-rhEGF-rP64k, durante todo el período de tiempo estudiado. Ello sustenta la factibilidad de sustituir el Montanide por HAp como adyuvante del conjugado rhEGF-rP64k en la fase de mantenimiento de la respuesta inmune anti-EGF y su aplicación en el tratamiento crónico del cáncer de origen epitelial.
Ejemplo 6. Construcción del sistema HAp-PI mediante unión covalente de las proteínas rhEGF y rP64k sobre la superficie de las nano-partículas de HAp amorfa
Las nano-partículas de HAp previamente recubiertas con citrato de sodio y activadas con EDC, obtenidas según la metodología descrita en el Ejemplo 1 se mezclaron bajo condiciones ambientales controladas con una disolución estéril de PBS de pH 7±0,3 que contenía rhEGF y rP64k en proporción de 6 mol de rhEGF por mol de rP64k y razón másica proteínas/HAp de 1 : 2,5. Se mantuvo la suspensión en agitación a 140 ciclos por minuto y temperatura ambiente durante 2 h. Mediante este procedimiento se obtuvo un sistema rhEGF-HAp-rP64k que se distingue por estar unidas las proteínas a la nano-partícula de HAp pero no entre sí. Dicho sistema fue dispersado con EDTA, ajustado el pH a 7±0,3 y su concentración de proteínas a 1±0,2 mg/mL.
En la Figura 13 se aprecia el perfil de tamaño de partículas medido por DLS. El diámetro medio fue de 111 ,2 nm, con un índice de polidispersión de 0,347. El sistema obtenido fue similar al generado en el Ejemplo 2 en cuanto a su tamaño, polidispersión y perfiles DLS. Lo anterior indica que la unión del rhEGF y la rP64k a las nano-partículas de HAp sin estar ligadas entre sí, produjeron una dispersión similar a la obtenida con el conjugado rhEGF- rP64k.
En la Figura 14A del ensayo de SDS-PAGE se observa que en el carril correspondiente al sistema HAp-PI aparece una banda principal a la altura de 66 kDa, característica de la proteína rP64k y otra banda a similar altura de corrida que el control de rhEGF (6 kDa). Estos resultados demostraron que ambas proteínas recombinantes se encontraban unidas a la nano-partícula de HAp y que al ser reducidas mantuvieron su masa molecular característica debido a que no están unidas entre sí. La Figura 14B evidenció la presencia de una banda aproximadamente a la altura de 66 kDa en los carriles 1 y 2, lo que indica la existencia de la proteína rP64k en el sistema HAp-PI y que esta mantuvo su integridad cuando se une a las nano-partículas de HAp.
Ejemplo 7. Construcción del sistema HAp-CM sobre la superficie de las nano- partículas de HAp amorfa mediante conjugación múltiple de las proteínas rhEGF y rP64k
Las nano-partículas de HAp amorfa obtenidas en el Ejemplo 1 se trataron bajo condiciones ambientales controladas durante 1 h con una solución de EDC estéril, manteniendo una relación másica EDC/HAp=2,7. A continuación se añadió una solución estéril de PBS de pH 7±0,3 que contenía rhEGF y rP64k en proporción de 6 mol de rhEGF por mol de rP64k y razón másica proteínas/HAp de 1 : 2,5. Se mantuvo la suspensión en agitación a 140 ciclos por minuto y temperatura ambiente durante 2 h.
Como resultado de este procedimiento, se obtuvo un sistema formado por nano-partículas de HAp recubiertas por ambas proteínas recombinantes unidas entre sí y con las nano- partículas. Dicho sistema fue dispersado con EDTA y ajustado el pH a 7±0,3. Posteriormente se diluyó con tampón PBS hasta la concentración de proteínas de 1±0,2 mg/mL.
Mediante la conjugación múltiple descrita anteriormente se obtuvo un sistema complejo HAp- rhEGF-rP64k con tamaño promedio de 90,2 nm medido por DLS, con índice de polidispersión de 0,337 (Figura 15).
Las caracterizaciones por electroforesis SDS-PAGE y Western Blot mostraron la conjugación de las proteínas, obteniéndose un producto similar al control positivo de rhEGF- rP64k, que reconoce los anticuerpos anti-EGF (Figura 16).
Ejemplo 8. Los nuevos sistemas construidos sobre las nano-partículas de HAp generan respuestas de anticuerpos IgG anti-EGF produciendo menor cantidad de lesiones epidérmicas en el sitio de inyección
Se inmunizaron tres grupos de cinco ratones C57BL/6 cada uno, con 63 pg de proteínas, contenidas en los siguientes sistemas:
Grupo 1 : Sistema HAp-rhEGF-rhP64k, obtenido según la metodología del Ejemplo 2.
Grupo 2: Sistema HAp-PI, obtenido según la metodología del Ejemplo 6.
Grupo 3: Sistema HAp-CM, obtenido según la metodología del Ejemplo 7.
Las inmunizaciones se realizaron los días 0, 14, 28 y 42. Se realizó extracción de sangre dos días antes de iniciar el protocolo y en los días 35 y 56 y con el suero obtenido se determinó mediante ELISA los títulos de anticuerpos IgG totales anti-EGF. Se determinó además la relación (lgG2b+lgG2c)/lgG1 específicas al EGF en los sueros el día 56. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de comparación de medias de Kruskal- Wallis, letras desiguales indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).
Los sistemas HAp-rP64k y HAp-CM generaron anticuerpos anti-EGF que fueron determinados en el suero inmune hasta una dilución de 1/10000 y en el sistema HAp-PI hasta dilución de 1/8000 en los días 35 y 56 (Figura 17). Se confirmaron los resultados obtenidos por SDS-PAGE y Western Blot, (Ejemplos 6 y 7) y se demostró que los sistemas construidos sobre las nano-partículas de HAp son inmunogénicos, a pesar de que el rhEGF está en el contexto de una unión covalente con la rhP64k y la partícula de HAp. Este desarrollo, constituye una evidencia de que es factible producir sistemas que generen respuesta inmune anti-EGF sin que se requiera unir químicamente al rhEGF con una proteína transportadora.
El análisis de la relación (lgG2b+lgG2c)/lgG1 mostró que no existen diferencias estadísticamente significativas entre la respuesta producida por ellos, prevaleciendo respuestas de tipo humoral (Th2), lo que los hace apropiados para la depleción del EGF, como parte del tratamiento del cáncer de origen epitelial (Figura 18).
Pasados 120 días de iniciado el experimento, se sacrificaron los ratones C57BL/6 y se extrajeron muestras de tejido de los sitios de inyección para análisis anatomopatológico, con previa tinción con hematoxilina-eosina. Los fragmentos de tejidos se fijaron en formol neutro tamponado y se procesaron por el método de inclusión en parafina. En la Figura 19A-C, correspondientes al grupo de control (Montanide-rhEGF-rP64k) se apreció pérdida de la estructura normal del tejido muscular en el sitio de inoculación. La zona A está caracterizada por infiltrado inflamatorio y vasos sanguíneos dilatados con discontinuidad del tejido muscular adyacente. Las Figuras 19B y C, presentan fibras longitudinales (B) y transversales (C) de tejido muscular adyacentes al sitio de inoculación con invasión de una reacción de tejido de reparación fibroblástica. Sin embargo, en las Figuras 19D-F, pertenecientes a ratones tratados con los nuevos sistemas objeto de la presente invención, se observa estructura normal del sitio de inoculación y de su tejido muscular adyacente. D: HAp-rhEGF- rP64k. E: HAp-CM. F: HAp-PI.
A cada ratón de los cuatro grupos anteriores, se evaluó la presencia o no de las siguientes lesiones:
• Discontinuidad de la epidermis e infiltrado linfocitario en la dermis.
• Infiltrado inflamatorio.
• Invasión del tejido muscular.
• Degeneración vacuolar en células epiteliales.
• Vasos sanguíneos dilatados. Por cada lesión se asignó un punto, se sumaron los valores de cada ratón en los grupos y se gráfico el resultado.
El estudio evidenció que en los grupos correspondientes a los sistemas desarrollados en la presente invención se manifestaron muy limitadas cantidades de lesiones, contrario a lo observado en el grupo de control inoculado con el sistema Montanide-rhEGF-rP64k (Figura 20). Este resultado confirma las observaciones visuales del Ejemplo 3.
Estos resultados corroboran la baja toxicidad de los sistemas anti-EGF basados en nano- partículas de HAp y los efectos adversos que produce el aceite mineral contenido en el sistema Montanide-rhEGF-rP64k.

Claims

COMPOSICIONES VACUNALES BASADAS EN NANO-PARTICULAS INORGANICAS PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER REIVINDICACIONES
1. Una composición vacunal para inducir respuesta inmune contra el factor de crecimiento epidérmico (EGF), caracterizada porque comprende como principio activo un sistema que contiene al EGF humano recombinante (rhEGF), o péptidos de este y una proteína transportadora, unidas a un núcleo constituido por nano- partículas inorgánicas.
2. La composición vacunal de la reivindicación 1 , caracterizada porque el núcleo inorgánico está formado por sales, óxidos u hidróxidos que se seleccionan del grupo que comprende: calcio, hierro, cinc, magnesio, circonio, cerio, berilio, silicio, o la mezcla de dos o más de ellos.
3. La composición vacunal de la reivindicación 1 , caracterizada porque el núcleo inorgánico es de fosfato de calcio.
4. La composición vacunal de la reivindicación 1 , caracterizada porque el fosfato de calcio es hidroxiapatita (FIAp).
5. La composición vacunal de la reivindicación 1 , caracterizada porque la FIAp es de tipo amorfa.
6. La composición vacunal de la reivindicación 1 , caracterizada porque la FIAp tiene baja cristalinidad.
7. La composición vacunal de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la hidroxiapatita está recubierta parcialmente por un ligando orgánico.
8. La composición vacunal de la reivindicación 7, caracterizada porque el ligando orgánico es citrato de sodio.
9. La composición vacunal de la reivindicación 1 caracterizada porque la proteína transportadora se selecciona del grupo que comprende:
- toxina B del cólera,
- toxoide tetánico,
- KLH y
P64k de Neisseria meningitidis.
10. La composición vacunal de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9 caracterizada porque el principio activo se encuentra sobre la superficie de una nano-partícula de FIAp.
11. La composición vacunal de la reivindicación 8, caracterizada porque el principio activo se enlaza a la nano-partícula de HAp mediante una de los siguientes métodos:
Unión covalente del conjugado químico del rhEGF o péptidos del mismo y de la proteína o péptido transportador con la nano-partícula de HAp.
Unión covalente del rhEGF o péptidos de mismo y de la proteína o péptido transportador con la nano-partícula de HAp de modo independiente.
Unión covalente sucesiva del rhEGF o péptidos de mismo y de la proteína o péptido transportador a la nano-partícula de HAp.
- Conjugación múltiple del rhEGF o péptidos de mismo y de la proteína o péptido transportador sobre la superficie de la HAp.
Encapsulación o unión física del rhEGF y de la proteína o péptido transportador sobre la superficie de la HAp.
12. La composición vacunal de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9 en combinación con otros adyuvantes que se seleccionan del grupo que comprenden:
- adyuvante incompleto de Freund.
- adyuvantes a base de escualeno.
- adyuvantes de origen sintético.
- adyuvantes de origen mineral.
- adyuvantes de origen vegetal.
- adyuvantes de origen animal.
- adyuvantes proteicos particulados y
- liposomas.
13. Uso de la composición vacunal de cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, para el tratamiento crónico del cáncer.
14. Un método de tratamiento a un sujeto que lo necesite que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición vacunal de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9.
15. El método de la reivindicación 12, donde se realiza una etapa de inducción previa de respuesta inmunológica producida por otra composición vacunal contra el EGF.
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