WO2021250291A1 - Matriz tridimensional porosa comestible y esterilizable y usos de la misma - Google Patents

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WO2021250291A1
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matrix
matrices
meat
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PCT/ES2020/070386
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Mercedes VILA
Diego CORTIZO
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Biotech Foods S.L.
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    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/72—Chitin, chitosan

Definitions

  • the invention relates to an edible and sterilizable macroporous three-dimensional (3D) matrix of tissue engineering that preferably comprises a natural polymer. Furthermore, the matrix of the invention additionally comprises additives and living cells that adhere and proliferate, colonizing the entire surface of the matrix and giving rise to a raw material for the subsequent formation of in vitro designed tissues, also known in the art. such as cultured meat, cell-based meat, cell meat and / or clean meat that can be subsequently processed into a food for animal or human consumption without requiring modification or removal of cells from the matrix. Also described herein is a method of using the matrices and / or tissues to be processed as food, including the matrix.
  • tissue engineering is the discipline of biomedicine that, by combining cells, materials and design tools, attempts to design functional biological structures to repair, replace or regenerate damaged tissues.
  • the progress made in this field is mainly based on the use of three-dimensional matrices / structures for tissue growth in a wide variety of biomedical applications such as the regeneration of bone tissue, heart tissue, liver tissue, etc.
  • WO1999031222 A1 discloses the industrial production of meat by in vitro cultivation of muscle cells of animal origin seeded in traditional two-dimensional matrices, such as, for example, collagen.
  • US patent US7270829B2 discloses a meat product obtained by means of non-human tissue engineering and a method for producing said meat product.
  • Said meat product comprises ex vivo cultured muscle cells and is used for food consumption. Muscle cells can grow and become attached to a supporting structure and can be derived from any non-human cell.
  • the meat product can also comprise other cells, such as fat cells, cartilage cells, or both, that are cultured ex vivo together with muscle cells. This document is silent on support for cell growth.
  • Patent application US 2006/0121006 A1 related to the use of cultured animal cells for the production of nutritional or therapeutic products in which said cells are derived from rare or endangered species. Also included are edible products containing meat, suitable for human or non-human consumption, either as food or as a dietary supplement.
  • the invention also relates to the use of large-scale culture methods for the proliferation of cells before being added to said products.
  • the invention encompasses the methods for manufacturing the products, the products themselves, and the methods and uses thereof. Preference is shown for the culture of cells anchored to supports, in particular for supports in the form of microstructures (microspheres, fibers, etc.) of different materials, such as collagen, chitin, polystyrene, polyester or polypropylene, the choice of which will depend on the end use.
  • Cell growth supports include microspheres and microsponges, called microcarriers, suitable for use in a bioreactor for cell cultures, which can be used to form a designed edible meat product, are also described in patent application US 2015/0079238 A1.
  • the edible supports disclosed include: (i) porous microvalves that can be used exclusively for culturing cells (eg, smooth muscle cells); (ii) arrays with fixed cells that can be included in the final meat product, without requiring modification or removal of the cells from them.
  • the edible matrices can be formed by cross-linked pectin, such as thiopropionylamides (PTP) and polypeptides containing RGD sequences, such as thiolated cardosin A.
  • PTP thiopropionylamides
  • RGD sequences such as thiolated cardosin A.
  • said patent application also describes methods of synthesis of such edible matrices to manufacture meat in an artificial state. It is interesting to note that these inventors, in US application US 2013/0029008 A1, described different methods for making engineered edible meat using cultured cells. Thus, the final meat product was formed from multiple partially fused layers and wherein each layer contains fused multicellular bodies (non-human myocytes).
  • Matrices based on natural polymers have shown great potential for medical and pharmaceutical applications.
  • the matrices formed by these biopolymers some with the ability to behave like a hydrogel, offer a series of advantages in terms of biocompatibility and biodegradability compared to matrices formed from synthetic polymers. Thanks to their inherent properties, such as their great ability to absorb water (bulking / hydration), biopolymers have the ability to encapsulate and effectively release a wide variety of hydrophobic and hydrophilic therapeutic molecules in a controlled manner, including nucleic acids. , proteins, antibodies, etc. (M. Efentakis, Adv. Polym. Tech. 2011, 30, 110-121).
  • the present invention provides an edible and sterilizable macroporous three-dimensional (3D) matrix of tissue engineering, hereinafter the matrix of the invention, comprising at least one biocompatible polymer.
  • the matrix of the invention is mainly composed of biocompatible polymers of natural or synthetic origin to which cells, preferably mammalian cells, provided that they are non-human cells, can adhere and proliferate adequately, until colonizing the entire useful surface of the matrix, where the cells are preferably adherent cells.
  • the matrix of the invention has the surprising advantage of being It will preferably be sterilized by hot steam, since the biocompatible polymers selected for its composition are capable of resisting high pressures of water vapor at high temperatures without degradation or / or denaturation. It is important to note that the matrix of the invention maintains its composition and structure intact after being subjected to a sterilization process, preferably by hot steam, allowing proper cell adhesion and tissue formation. Furthermore, the sterilization process of the matrix of the invention not only does not change the applicability of the materials due to possible degradation and / or denaturation, but also improves the mechanical properties to support cell proliferation. Therefore, the matrix of the invention could be sterilizable by any method known to those skilled in the art, preferably by hot steam, without losing its properties as a matrix for cell proliferation, facilitating its incorporation into industrial processes that require low cost. and a high volume production.
  • the present invention discloses an edible and sterilizable macroporous three-dimensional tissue matrix, preferably by hot steam, where the macropores are interconnected and where the matrix comprises at least one biocompatible polymer, proposed as a support material for growth, the proliferation and differentiation of mammalian cells, preferably non-human cells, non-human adherent cells, which can be used to obtain cultured meat.
  • the present invention proposes, for the first time, the use of sterilizable edible three-dimensional macroporous microstructures comprising a biocompatible polymer, preferably of natural origin, as matrices for the proliferation of cultured meat following the guidelines defined for tissue engineering, and adaptable to processes of large-scale manufacturing.
  • the present invention relates to an edible and sterilizable macroporous three-dimensional matrix, preferably by hot steam, of tissue engineering that comprises a biocompatible polymer and interconnected macropores, preferably where the macropores and the matrix comprise living cells.
  • ible refers to materials, preferably food material designed for oral contact or consumption by ingestion.
  • the edible matrices described herein are suitable for the biofabrication of engineered tissues, also referred to or known to the skilled person as cultured meat, cell-based meat, cell meat and / or clean meat, which are suitable for human consumption.
  • engineered tissues also referred to or known to the skilled person as cultured meat, cell-based meat, cell meat and / or clean meat, which are suitable for human consumption.
  • cultured meat cell-based meat, cell meat and / or clean meat
  • macroporous three-dimensional matrices of tissue engineering for use in the formation of a high nutrient content tissue and / or a cultured meat product.
  • the matrices and synthesis methods and uses thereof described herein are primarily directed to cultured edible meat products, such a matrix may also find application in cell therapy for animals, including mammals and humans, where it is wants to perform cell expansion in the absence of animal derived products.
  • the terms “sterilizable” or “sterilize” refer to a method of killing all microorganisms, preferably a pathogenic microorganism, in or on a given environment or material, to prevent the spread of infection. This is usually done using heat, radiation, or chemical agents. In a preferred embodiment, the sterilization process is carried out by hot steam.
  • matrix or “support”, used interchangeably throughout this disclosure, refer to a three-dimensional matrix or material that allows cell attachment and proliferation, or other. compounds such as additives, or the like, according to the present invention.
  • fixation refer to cells that adhere directly or indirectly to the matrix, as well as cells that adhere to other cells.
  • biocompatible polymer refers to a natural or synthetic material / polymer that is, for example, non-toxic to biological systems and / or consistent with biological processes.
  • biocompatibility of polymeric materials denotes a minimal, insignificant or zero risk of immune rejection, injury, damage and / or toxicity to cells, tissues, organs and / or living biological systems.
  • the biocompatible polymer is a natural polymer.
  • the natural polymer is any one that can resist a sterilization process at elevated pressures and temperatures without degradation and / or denaturation. Therefore, the natural polymer or any derivative thereof is, for example, without limitation, polypeptides, polynucleotides, natural resins, rubbers, natural polyesters and polysaccharides.
  • the natural polymer is selected from the list consisting of: alginate, chitosan, starch, dextran, pullulan, heparin, heparin sulfate, cellulose, hemicellulose, glucomannan, agar, xanthan, guar gum, chondroitin sulfate , gelatin, chitin, a polysaccharide, a glycosaminoglycan, or any combination thereof.
  • the natural polymer is selected from chitosan and / or alginate.
  • gelatin as a natural polymer, it is not sterilizable by hot steam and high pressure since it is partially hydrolyzed and denatured if subjected to these procedures.
  • this natural polymer is found inside the matrix as small traces mixed with another biopolymer such as chitosan, the modification of the properties of the matrix is minimal, still maintaining its adhesive properties.
  • the term "derivative" is a similar compound obtained by chemically changing a part of a compound but having the same or even better properties as the parent compound. Therefore, the derivatives of the natural polymers of the present invention refer to chemical modifications that include the incorporation of different groups such as amino groups, aldehyde groups, carboxylic acid groups, amide groups, ketone groups, ester groups, alkoxy groups. , sulfate groups, phosphate groups, or the like.
  • the matrix of the invention comprises the natural polymer mentioned above, which has the advantage of being composed of natural biopolymers authorized for food use by competent institutions, such as, for example, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) and the European Food Safety Authority (EFSA).
  • FDA U.S. Food and Drug Administration
  • EFSA European Food Safety Authority
  • the edible and biocompatible polymers used in the matrix of the invention are designed so that the matrix is edible and does not have to be extracted from the final product; that is, to avoid the collection process.
  • a Natural polymer selected from the list consisting of collagen, albumin (all types and forms), caseins, hyaluronic acid, fibrin, fibronectin and elastin, among others, as they are not suitable for a hot steam sterilization process.
  • the biocompatible polymer is a synthetic polymer or any variant thereof.
  • synthetic polymers include, without limitation, synthetic polypeptides of microorganisms or prepared by chemical synthesis techniques, biosters, obtained from the extraction of microorganisms or prepared by chemical synthesis from their monomers, such as polylactic acid, polyglycolic acid, poly (lactic-co-glycolic), polyhydroxyalkanoates, or any other synthetic polymer prepared from generally recognized natural monomers, such as monosaccharides (such as glucose, fructose, mannose, galactose or any derivative or variant, such as glucosamines, amino sugars,. .. or the like), amino acids or any derivatives, nucleotides or any derivatives, fatty acids or any derivatives, or the like in any combination.
  • the molecular weight (Mw) of the biocompatible polymers, or any derivative thereof ranges from 1000 Da to 5000000 Da, preferably from 10000 to 1000000 Da, more preferably from 100000 to 500000 Da.
  • the matrix of the invention has macropores, preferably interconnected hierarchical macropores, having an average pore size in the range of 1 pm to 10,000 pm.
  • the average pore size ranges between 50 and 1000 pm, preferably between 50 and 100 pm, more preferably between 100 and 1000 pm, or even more preferably between 100 and 500 pm.
  • a specific mold can be used in the method for the production of the matrix of the invention that makes it possible to obtain transverse or longitudinal pores throughout the matrix having the aforementioned average pore size. In this sense, the arrangement of pores obtained through the formation of water crystals (solvent), together with the transverse macropores, allows the obtaining of biopolymeric matrices with interconnected and hierarchical porous structures.
  • the final pore size of the matrix of the invention is influenced by the concentration of the polymer used in its formation. Furthermore, hydrogels with a high polymer concentration give rise to smaller pore sizes.
  • the macroporous matrix production process Three-dimensional gives a pore size range between 50 ⁇ m and 10,000 ⁇ m, preferably 100 ⁇ m to 1000 ⁇ m, more preferably between 100 and 500 ⁇ m.
  • the weight / volume percentage of the biocompatible polymers mentioned herein or any combination thereof, dissolved in an aqueous solution, organic solvents, cultured media or in any combination thereof in which they are dissolved ranges from 0.5% to 16%.
  • the percentage by weight / volume ranges between 1% and 8%, more preferably it ranges between 1.5% and 4%, more preferably still it is 1.5% or, alternatively, in any of the relative ratios possible when there is more than one biocompatible polymer in the final matrix.
  • the matrix of the invention further comprises living cells, preferably living non-human cells, and, more preferably, adherent living non-human cells, which are homogeneously distributed throughout the matrix.
  • living cells preferably living non-human cells, and, more preferably, adherent living non-human cells, which are homogeneously distributed throughout the matrix.
  • Many types of self-adhering cells can be used to form the cultured meat products described herein.
  • the cultured meat products are designed to resemble traditional meat products and the cell types chosen to approximate those found in traditional meat products.
  • cells used for culturing throughout the matrix of the invention to provide the highly nutritious cultured meat or tissues described herein may include, for example, without limitation, muscle cells.
  • progenitor muscle cells preferably skeletal muscle cells; smooth muscle cells, stromal cells, satellite cells, fibroblast cells, myoblast cells, endothelial cells, adipose cells, such as progenitor cells of adipocytes, hepatocytes, cardiomyocytes, etc. Thanks to its structure, the matrix of the invention allows the proliferation and differentiation of various types of cells such as, among others, myoblasts / myotubes / fibroblasts (muscle cells), endothelial cells, adipocytes (fat cells), producing suitable cultured meat for human consumption with the desired protein-fat content by the final consumer as the final product.
  • myoblasts / myotubes / fibroblasts muscle cells
  • endothelial cells adipocytes (fat cells)
  • the matrix of the invention allows the proliferation and differentiation of a wide range of cell lines, so that a different culture of a single type of cell - for example, a culture of myoblasts - that differentiate into myotubes to form meat muscle tissue (protein).
  • a different culture of a single type of cell - for example, a culture of myoblasts - that differentiate into myotubes to form meat muscle tissue (protein).
  • the The final product is free of fat, unless co-cultures of myoblasts with adipocytes are carried out, a process that would also be possible if desired. In this way, it is possible to influence the final characteristics of the product in order to make it more attractive to the consumer and adapt it to the consumer's needs.
  • the matrix-wide live cell line cultures of the present invention could be obtained from various animal sources, such as, without limitation, mammals such as porcine, bovine, ovine, horse, dog, cat; avian; reptile; fish; amphibians; crustaceans or the like. This opens the doors to a huge market, since it offers a very diverse offer to end consumers.
  • a matrix with improved characteristics it can be formed and / or combined with other molecules / substances / biomolecules selected from an additive, bioactive molecules and / or a cross-linking agent, or any combination thereof, that have a high nutritional value or that provide an improved texture or add aroma to the final matrix.
  • These compounds or substances can also improve the adhesion properties and proliferation of future cells that can be seeded and cultured with the matrix.
  • the matrix of the present invention further comprises bioactive ligands.
  • Bioactive ligands specifically interact with one or more biomolecules of cells or bind biomolecules that interact with biomolecules of cells that are distributed within the matrix or that proliferate within the matrix, or migrate into it. Such interactions are effective in directing cell fate or inducing cells to form tissue. These compounds or substances can also improve the adhesion properties and proliferation of future cells that can be seeded and cultured with the matrix.
  • bioactive ligands will depend on the identity of the target cells, and some examples of suitable bioactive ligands include: carboxyl, amine, phenol, guanidine, thiol, indole, imidazole, hydroxyl, sulfate, norbornene, maleimide, laminin, fibrinogen, peptide sequences, adhesion molecules such as the immunoglobulin superfamily, cadherins (E-, N-, P-, ...), selectins (P-, E-, L-, ...) or integrins: fibronectins , poly-L-ornithine, collagen, vitronectins, lectin, poly-ornithine, poly-L-lysine, poly-D-lysine, cyclic peptides, RGD-containing peptides (Arg-Gly-Asp), RGDS-containing peptides (Arg -Gly-Asp-Ser), or any other compound
  • the bioactive molecules of the present disclosure refer to those substances that resist the sterilization process without significantly affecting their ability to promote cell adhesion.
  • the bioactive molecule is poly-L-lysine, more preferably poly-s-lysine.
  • Ro ⁇ -e-lysine (e-poly-L-lysine, EPL) is a naturally occurring antibacterial cationic peptide, a homopolymer of L-lysine, which is water soluble, edible, biodegradable and non-toxic to human beings. humans and the environment.
  • Poly-s-lysine is commonly used as a natural food preservative, emulsifying agent, just like in the cosmeceutical and pharmaceutical industry.
  • ro ⁇ -e-lysine is commonly used in food applications such as boiled rice, cooked vegetables, soups, noodles, sliced fish (sushi), and meat.
  • ro ⁇ -e-lysine has been used as a bioactive molecule, preferably as a bioactive ligand to improve cell adhesion in in vitro cell cultures.
  • ro ⁇ -e-lysine is not only found on the surface of the matrix of the invention, but also inside it, being part of the overall three-dimensional structure of the matrix, allowing and improving, for hence, cell adhesion on it.
  • due to the natural antimicrobial activity of roN-e-lysine against yeast, fungi and bacteria it helps to inhibit the growth of such pathogenic microorganisms in the matrix of the invention.
  • roN-e-lysine is already available in large quantities and at an economical price for the food industry, allowing its industrialized use in the production of cultured meat. Therefore, this property together with the surprising advantage of the matrix of the invention, characterized in that they are sterilizable, preferably by hot steam, without degradation or / or denaturation of the biocompatible polymers selected for their composition, make them suitable for a production in large-scale industrial reactors, which require, as mentioned above, a very low cost of production.
  • Additives include, without limitation, molecules / substances with a high nutritional value or that provide an improved texture or add aroma to the final product according to the present invention and are, furthermore, those substances that resist the sterilization process without significantly affecting the his capacity to promote cell adhesion.
  • the additive is selected from the list consisting of: a flavor, a flavor enhancer, a colorant, a color enhancer, salts, acidity regulators, thickeners, emulsifiers, stabilizers, a nutritional enhancer, such as vitamins, amino acids, fiber; fructooligosaccharides; inulins; beta carotene, omega fatty acids; spirulinas; probiotics, prebiotics, saponins; antioxidants; essential fatty acids; minerals; and the like, or any combination thereof.
  • the additives selected for the matrix of the present invention are preferably of natural origin or source. Additionally, the term "additive" also encompasses compounds that improve the adhesion properties and proliferation of future cells that can be seeded into the matrix.
  • crosslinking groups examples include hydroxyl groups, carbonyl groups, aldehyde groups, carboxylate group, carbonate group, carboxyl groups or derivatives, carboxamide groups, imine groups, imide groups, thiol groups and / or any other group, polyelectrolytes, inorganic ions or any combination thereof.
  • the matrix of the invention could be in the form of a hydrogel.
  • the matrix of the invention in the form of a hydrogel is useful to support the proliferation of cells while tissue is forming and, in addition, it can be used as a stabilizer, texturizer and / or carrier of nutrients, giving meat cultivated great added value.
  • the matrix of the invention in the form of a hydrogel is useful as a reservoir for the delivery of specific molecules. The introduction of a hydrogel matrix core for meat culture provides a reservoir to encapsulate molecules for cell proliferation and differentiation during the production process, while improving the visual and nutritional content of the final tissue or meat product cultivated.
  • the matrix of the present invention is saturated with a cell culture medium.
  • the arrays are saturated with a medium that facilitates cell proliferation or survival; that is, a cell culture medium.
  • the cell culture medium is selected from any commercially available classical medium, such as Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, MEM) and its variants, or known culture media specifically defined for each type of cell used. by the person skilled in the art.
  • the matrix may be impregnated with a biomolecule or other material intended for administration to food, preferably meat.
  • the structure of the matrix of the present invention is shaped according to want.
  • the shape of the die of the present invention can be regular (eg, cylindrical, spherical, rounded, rectangular, square, etc.) or irregular.
  • most of the sample polymers mentioned serve to give added value to products that would otherwise be completely discarded.
  • Fig. 1 illustrates variations of dies having cylindrical shapes. Any of these forms can be porous.
  • the matrix of the present invention is easily sterilizable within large bioreactors, and its size makes it suitable for large-scale production, and has the advantage of being a structure prepared with edible materials.
  • the matrix of the invention has the surprising advantage of being sterilizable, since the biocompatible polymers selected for its composition are capable of resisting high water vapor pressures at elevated temperatures without degradation or / or denaturation. It is important to note that the matrix of the invention maintains its composition and structure after being subjected to a sterilization process, allowing proper cell adhesion and tissue formation.
  • the sterilization process of the matrix of the invention not only does not change the applicability of the materials due to possible degradation and / or denaturation, but also improves the mechanical properties to support cell proliferation. Therefore, the matrix of the invention could be sterilizable by any method known to those skilled in the art, preferably by hot steam, without losing its properties as a matrix for cell proliferation, facilitating its incorporation into industrial processes that require low cost. and high volume production.
  • the sterilization of the matrix of the present disclosure is carried out by a physical or chemical sterilization, preferably a physical sterilization process, which is selected from the list consisting of: hot steam, dry heat, tindalization and ionizing or non-ionizing radiation, preferably hot steam.
  • the sterilization process is carried out by hot steam in an autoclave or bioreactor at temperatures ranging from 121 ° C to 134 ° C, and at a pressure ranging from 50 to 105 kPa (0.5 to 1.05 bar), for a time ranging from 10 to 60 min; More preferably, hot steam sterilization is carried out for 20 min at a temperature of at least 121 ° C and a pressure of 105 kPa (1.05 bar).
  • the matrix of the invention distributes the cells in the entire three-dimensional space.
  • these matrices have never been contemplated for this purpose, since the technique of large-scale production of cultured meat is in its infancy.
  • the concept of this matrix to produce cultured meat is novel and the application of the materials used to obtain the matrix, in this highly porous, edible and sterilizable matrix form, is also novel.
  • biocompatible polymers used in the matrix of the present invention as mentioned above and, consequently, the matrix of the invention that comprises them, have the following advantages:
  • the biocompatible polymer could be a biopolymer with hydrogel properties, the matrix in which the cells are grown can also act as a viscosifier and gelling agent, providing a texture that is pleasant to the palate and to the touch;
  • (v) also acts as a selective delivery system for recognized health-beneficial components in foods and / or free amino acids, thereby opening up a wide range of possibilities to use these edible structures as potential carriers for vitamins, minerals , nucleic acids or other biomolecules.
  • the matrix of the invention satisfies fundamental requirements of tissue engineering, including: highly interconnected macropores that promote the diffusion of nutrients and facilitate proliferation, diffusion, cell migration and communication between cells.
  • the large internal surface area produces a large capacity for cell proliferation; distributes cells three-dimensionally; facilitates the transport of nutrients; supports cell migration and proliferation; and facilitates mechanical support for new tissue production.
  • the matrices of the present invention are suitable for a variety of applications, further including regenerative medicine and tissue engineering.
  • Matrices are particularly useful as tissue engineering. Therefore, they can be used to facilitate cell proliferation and tissue formation. Macroporosity is adequate to allow cell migration, intracellular matrix formation, nutrient delivery, angiogenesis, and the like.
  • a further advantage of the matrix of the present invention for use in regenerative medicine and tissue engineering is that it is biocompatible.
  • the matrix of the invention is compatible with various types of reactors or bioreactors, even those in which electrical currents will be applied to stimulate cell proliferation, due to which said matrices are electrically conductive.
  • the invention relates to a method for obtaining the matrix of the present invention, the method comprising: a) preparing a solution of at least one biocompatible polymer according to the present invention and a suitable solvent, preferably a culture medium , b) adding the solution from step a) in molds, to give it the desired shape and dimensions, and freezing it; preferably at a temperature below the freezing temperature of the solution, c) lyophilizing the frozen matrix obtained in step b), d) curing the lyophilized matrix of step c), and e) sterilizing the matrix, preferably by hot steam.
  • the selected biocompatible polymer preferably a natural polymer mentioned above, is dissolved at the required concentration in a solvent selected from the list consisting of: aqueous solutions, organic solvents, culture media or any combination thereof, in step a).
  • a solvent selected from the list consisting of: aqueous solutions, organic solvents, culture media or any combination thereof, in step a).
  • the organic solvents are selected from the list consisting of: ethanol, dioxane, acetone, acetic acid, isopropyl alcohol, acetonitrile, dimethylsulfoxide, trifluoroacetic acid or any other, pure or as a cosolvent in aqueous solutions in any ratio appropriate.
  • the culture media refers to a solution containing nutrients to support cell survival under conditions in which the selected cells can be cultured.
  • suitable culture media are selected from classic commercially available media, such as Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, MEM) or any variant thereof. In this sense, the expert knows that the specific culture medium is suitable for each type of cell used.
  • the concentration of the biocompatible polymer of the invention, or any combination thereof ranges from 0.5% to 16% (w / w), preferably between 1% and 8%, more preferably between 1.5%. and 4% or, alternatively, in any of the possible relative relationships when there is more than one biocompatible polymer in the final matrix.
  • the pH of the solution comprising the solvent and the biocompatible polymer can be neutral or it can be a pH that can vary from 1 to 14, preferably from 2 to 10, to improve the solubility of the polymer depending on the polymer used.
  • the temperature of step a) can be increased from room temperature to 180 ° C. In a preferred embodiment, the temperature ranges from 22 ° C to 70 ° C, more preferably from 30 to 70 ° C, more preferably still, from 35 ° C to 65 ° C.
  • the matrix of step b) is formed by molding the solution by extrusion directly.
  • the freezing temperature of step b) ranges from -15 ° C to -80 ° C.
  • the lyophilization of step c) is carried out for at least a period ranging between 16 h and 96 h, preferably between 24 and 72 h, more preferably between 18 and 24 h, at a condensation temperature that varies from 25 ° C to -100 ° C, preferably from 25 ° C to -100 ° C, more preferably from 20 ° C to -50 ° C, and more preferably from -15 ° C to -45 ° C, and at a pressure 0.01 to 0.026 Pa (1 to 2.6 x 10 4 mbar), more preferably 100 to 40 Pa (1 to 0.4 mbar), more preferably 20 to 40 Pa (0.2 to 0.4 mbar).
  • lyophilized shelves can be heated up to 20 ° C. A temperature difference of 15 ° C to 20 ° C is recommended between the sample and the condenser.
  • the lyophilized matrices are then cross-linked with a suitable cross-linker and / or a surface coating treatment, this treatment being carried out with substances or biomolecules that enhance cell adhesion and proliferation.
  • the parameters used in the lyophilization process such as duration, temperature and pressure, are selected in such a way that the matrices lose at least 98% of the initial water. See Fig. 3, where the phase diagram of water indicates the triple point when lyophilization occurs.
  • the curing process of step d) is preferably a thermal curing process carried out at a temperature ranging from 30 ° C to 180 ° C for a period of time ranging from 1 min to 48 h.
  • the method of the invention optionally further comprises, in step a) and / or in a further step between steps c) and d), the addition of at least one additive, at least one adhesion molecule, at least one crosslinking agent and / or any combination thereof, as disclosed throughout this disclosure.
  • excess crosslinkers and / or surface coating molecules are washed away and the matrices can be used immediately or frozen and lyophilized again for storage.
  • the sterilization of step e) is carried out by physical or chemical sterilization, preferably a physical sterilization process, which is selected from the list consisting of: hot steam, dry heat, tindalization and ionizing radiation or non-ionizing, preferably hot steam.
  • the sterilization process is carried out by hot steam in an autoclave for at least 20 min at a temperature of at least 121 ° C at a pressure of 105 kPa (1.05 bar).
  • the present invention relates to a matrix obtained by the method disclosed above.
  • the matrix of the present invention can act as a carrier for a wide variety of food supplements, such as, for example, fiber, vitamins, amino acids or the like, and is suitable for sterilization processes without losing the creation properties of tissue engineering matrices. Therefore, in another aspect, the present invention relates to the in vitro use of the matrix of the present invention as a carrier.
  • the present invention relates to the use of the matrix of the present invention for the in vitro production of tissues with high nutritional content and / or cultured meat products.
  • the present invention relates to a method of obtaining a tissue with high nutritional content and / or cultured meat, the method comprising culturing a plurality of (multiple) living non-human adherent cells with a plurality of matrices of the invention, in the presence of a suitable nutrient medium, wherein the culture takes place in a suitable bioreactor so that the initial population of cells can expand and grow to form a volume of tissue and / or cultured meat.
  • the resulting cultures can be grown to a desired level and used directly to form tissue and / or cultured meat (for example, by fusing the matrices of the invention), without the need to separate the matrices or remove them from another way.
  • cells suitable for obtaining cultured tissue and / or meat have been disclosed previously.
  • cells can be cultured with any of the edible and sterilizable matrices described herein in suspension, including in a bioreactor.
  • cells can be seeded into the medium together with the sterilizable edible matrices and allowed to contact, adhere and grow in the appropriate sterilizable edible matrix.
  • the culture comprises cultivating a plurality of muscle cells on edible matrices, sterilizable and free of products of animal origin, the edible matrices, sterilizable and free of products of animal origin, comprising a flavor, a flavor enhancer, a colorant, a color enhancer and a nutritional enhancer.
  • the matrices of the invention with cultured cells can be formed directly into the cultured meat product after incubation in the bioreactor for an appropriate time to allow the cells to fixate and proliferate (eg, 12 hours, 24 hours, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, etc.).
  • the colonized matrices can be placed and can be allowed to fuse to form the cultured meat product.
  • a colonized matrix is covered (for example, more than 50% covered, more than 60% covered, more than 70% covered, more than 80% covered, more than 90% covered, more than 90% covered, confluence) with cells.
  • the cells used can be of one or more types, including in particular muscle cells.
  • Matrices covered to the appropriate degree with cells e.g.,> 5%,> 10%,> 20%,> 30%,> 40%,> 50%,> 60%,> 70%,> 80%,> 90%, etc.
  • the colonized matrices can then be used to form an aggregate from which cultured meat is formed.
  • an aggregate of the colonized matrices can be formed by placing colonized matrices immediately adjacent to each other.
  • the colonized matrices can be brought into contact with each other so that cells from adjacent colonized matrices (immediately adjacent) can contact each other and fuse to form the volume of highly nutritious tissue and / or cultured meat.
  • engineered meat Once engineered meat is formed, it must be kept sterile (free from bacterial or other contamination) without the use of antibiotics, drugs, or the like, as these can have an impact on the final meat product later on.
  • the volume of high nutrient tissue and / or cultured meat can be frozen after it is formed.
  • the present invention provides cultured meat products obtained by the method disclosed above.
  • tissue-engineered cultured meat comprising a plurality of matrices according to the present invention and a plurality of living non-human cells, preferably muscle cells and, optionally, further comprising a plurality of satellite cells , stromal cells, myoblast cells, fibroblast cells, endothelial cells, adipose cells, hepatocytes, hepatocytes, cardiomyocytes, or any combination thereof.
  • these cultured meat products may include an edible body having a volume made up of multiple colonized matrices, each colonized matrix including an edible and sterilizable matrix according to the present invention, the colonized matrices being at least partially fused together.
  • these edible matrices can comprise an additive, a biocompatible molecule, a crosslinking agent and any combination thereof.
  • the cultured meat further comprises at least one additive selected from the group consisting of a flavor, a flavor enhancer, a colorant, a color enhancer, a nutritional enhancer, or any combination thereof.
  • the cultured meat products are fresh. In other embodiments, the cultured meat products are preserved. In additional embodiments, the meat is preserved, for example, by cooking, drying, smoking, canning, pickling, salting, or freezing.
  • the cultured meat products are substantially free of pathogenic microorganisms.
  • controlled and substantially sterile methods of cell preparation, cell culture, matrix preparation, and cultured meat preparation result in a product substantially free of pathogenic microorganisms.
  • a further advantage of such a product is its increased utility and safety.
  • cultured meat formed by the methods described herein may or may not have blood vessels.
  • the cultured meats described herein may have or may lack any nerve components (eg, axons, dendrites, nerve cell bodies), as they can be made to grow with or without such components.
  • the cultured meat products disclosed herein are edible and intended for consumption by humans, non-human animals, or both.
  • the cultured meat products are human food products.
  • the cultured meat products are animal feed, such as livestock feed, aquaculture feed, or domestic pet feed. Therefore, in light of the disclosure provided herein, those of skill in the art will recognize that non-human cells from a plethora of sources are suitable for use in the production of such products and with the methods disclosed herein.
  • the cultured meat products and matrices comprise non-human cells derived, by way of non-limiting examples, from mammals, birds, reptiles, fish, crustaceans, cephalopods, insects, non-arthropod invertebrates, and combinations thereof.
  • the invention is not limited to the specific embodiment (s) described herein, but also encompasses any variation that may be considered by any person skilled in the art (for example, regarding the choice of of materials, dimensions, components, configuration, etc.), within the general scope of the invention, as defined in the claims.
  • Figure 2 Schematic description of an extrusion on a frozen surface.
  • the inset shows the final microgranules that can be produced by this method.
  • FIG. 4 Scanning electron microscopy (SEM) images of porous matrices of Example 1 (4a), Example 2 (4b) and Example 3 (4c) before cell seeding. Tissue proliferation on matrices of Example 1 (4d), Example 2 (4e) and Example 3 (4f).
  • Figure 7 Mercury (Hg) porosimetry studies before (A) and after (B) of the matrix sterilization process disclosed in Example 3. Total porosity and total surface area data.
  • Figure 8. FTIR spectra (Fourier transform infrared spectroscopy) of samples before (upper line) and after (lower line) of the sterilization procedure corresponding to matrices of Examples 1 (8A), 2 (8B) and 3 (8C ), respectively.
  • Figure 9 The figure shows the glucose consumption (expressed as g / l) at different test times (expressed as days) by the mammalian cells seeded in the matrix obtained in Examples 1 to 3 of the invention (Example 1, Example 2 and Example 3, in the legend) compared to the initial glucose (initial, in the legend) and the culture controls in the absence of the matrices of the invention (control, in the legend).
  • Example 1 Synthesis of the matrix, by the method of the present invention, comprising chitosan as a biocompatible polymer
  • the matrices were removed from the molds and placed inside the oven at 135 ° C for 1 hour without ventilation (curing begins by preheating the oven to 45 ° C; as soon as the oven reaches 135 ° C the time begins; after For 1 hour, the matrices are allowed to reach room temperature inside the oven; approximately 1 h 30 minutes. At this stage, the matrices were washed with milliQ water (3x100 ml for 15 minutes), NaHCC> 3 0.1 M (3x100 ml for 15 minutes) and water (3x100 ml for 15 minutes).
  • the matrix of the invention comprising MEM powder (0%) loses its consistency when immersed in water. Therefore, it appears that the crosslinking temperature and time were not sufficient to obtain a matrix with the desired properties in terms of mechanical strength and appearance. However, the results show that the remaining matrices comprising different concentrations of MEM (1%, 8%, 16%, 33%, 133%, 200%, more preferably 8%) present good consistency and do not lose their shape. These data indicate that MEM components also act as cross-linkers, providing consistency to the matrices, otherwise frangible.
  • the matrices were sterilized with a MEM concentration of 8% in an autoclave at 121 ° C, at 105 kPa (1.05 bar), for 20 minutes and were subjected to testing.
  • the matrices are stable, and some degree of crosslinking has occurred because the matrices do not swell excessively; that is, crosslinking reduces bulking.
  • the macroporosity of these matrices of the invention having a weight / volume percentage of the chitosan polymer (1.5%), could be controlled and shows a high porous volume and a total porosity of 90% giving rise to foam-like samples.
  • the optimized matrix exhibits a high volume and size of interconnected macroporosity in the 1-500 pm range as can be seen by digital imaging (Fig. 1a) and SEM (Fig. 4a).
  • Fig. 5 the intrusion porosity analysis of Hg (mercury) of the matrix obtained in the present example is shown.
  • This technique is used to analyze total connected porosity, pore volume, pore size distribution, and surface area of solid and powder materials.
  • the instrument known as a porosimeter, uses a pressure chamber to force mercury into voids in a porous substrate. As pressure is applied, the mercury fills the largest pores first. As pressure increases, filling continues into smaller and smaller pores. Both interparticle pores (between individual particles) and intraparticle pores (within the particle itself) can be characterized using this technique.
  • the volume of mercury that has entered the sample is monitored by a change in capacitance in a capillary analytical cell lined with a layer of metal called a penetrometer.
  • the sample is kept in a penetrometric cell section, which is available in a variety of volumes to accommodate intact solid chunks or powder.
  • the size of the sample is limited to dimensions of approximately 2.5 cm in length by 1.5 cm in width.
  • This powerful technique was used to analyze the change in the porous nature of the matrix before (Fig. 5A) and after (Fig. 5B) sterilization of the pieces.
  • the results show a slight reduction in total pore volume and total surface area due to shrinkage relative to the sterilization step.
  • the values after sterilization are more than adequate for the application showing the correct pore volume range and high surface area available for cell colonization.
  • FTIR Transformed Infrared Spectroscopy
  • Fourier FTIR is an analytical technique for identifying organic (and, in some cases, inorganic) materials. This technique measures the absorption of infrared radiation by the sample material as a function of wavelength. Infrared absorption bands identify molecular components and structures. As can be seen in Fig. 8A, there are no changes in the shape or position of the band spectrum before and after the sterilization process, demonstrating the suitability of the chemical identity of the matrices.
  • Example 2 Synthesis of the matrix, by the method of the invention, comprising alginate as a biocompatible polymer and coated with roN-e-lysine
  • Alginic acid sodium salt (Sigma-Aldrich) was slowly added to water (200 ml) at a concentration of 2.0 g with vigorous stirring. The mixture was stirred at 50 ° C for 3 hours until a clear, homogeneous solution was obtained. The solution was allowed to reach room temperature.
  • the lyophilized matrices obtained were removed from the molds and immersed in an aqueous solution of calcium chloride at 2% (4 g, 200 ml) (any other aqueous solution can be used, such as calcium sulfate, calcium carbonate, calcium gluconate, citrate calcium) in milliQ water (200 ml) for 15 minutes to cause crosslinking of the polymer.
  • milliQ water 200 ml
  • the alginate matrices gelled immediately and were washed thoroughly with milliQ water to remove unbound calcium ions.
  • the matrices were then immersed in a 0.2% poly-epsilon-lysine solution (1.0 g in 500 ml) for 16 hours, and then thoroughly washed with milliQ water.
  • the matrices were re-frozen at -20 ° C for 24 hours and were lyophilized at -40 ° C for 72 hours and at a pressure of 26.3 Pa (0.263 mbar), and subsequently stored
  • the freeze-dried matrices were subsequently heated in an oven at 115 ° C for 1 hour without ventilation (curing begins by preheating the oven to 45 ° C; as soon as the oven reaches 115 ° C, the time begins; after 1 hour the matrices to reach room temperature inside the oven; it takes about 1 hr 30 minutes).
  • the matrices were sterilized in an autoclave at 121 ° C for 20 minutes at 105 kPa (1.05 bar).
  • the optimized matrix exhibits a high volume and size of interconnected macroporosity in the range of 1-500 pm, as can be seen by digital imaging (Fig. 1b) and SEM (Fig. 4b).
  • Hg (mercury) intrusion porosity analysis shows a slight reduction in total pore volume and of the total surface area.
  • the values after sterilization are well suited for the application showing the correct pore volume range and high surface area available for cell colonization.
  • Example 3 Synthesis of the matrix, by the method of the invention, comprising chitosan as a biocompatible polymer and coated with roN-e-lysine
  • Chitosan (9.0 g) of food grade was mixed with acetic acid (0.1 M, 600 ml) with gentle stirring at 40 ° C until the chitosan dissolved.
  • Poly-sL-lysine 360 mg powder; M w : 1000-300000 was added portionwise to the above solution with vigorous stirring and the mixture was heated to 65 ° C for 2 hours and 30 minutes to obtain a homogeneous solution and transparent.
  • the above solution was allowed to reach room temperature and was poured into the molds to give the matrices the desired shape and size (Fig. 1c).
  • the solution was frozen inside the molds at -20 ° C for 24 hours and was lyophilized at -40 ° C for 72 hours and at a pressure of 26.3 Pa (0.263 mbar).
  • the cured matrices were subjected to a heat treatment by introducing them inside an oven at 110 ° C for 1 hour without ventilation (curing begins by preheating the oven to 45 ° C; as soon as the oven reaches 110 ° C the time begins; afterwards The matrices are allowed to reach room temperature in the oven for 1 hour; it takes approximately 1 h 30 minutes). The matrices were then sterilized in an autoclave at 121 ° C for 20 minutes at 105 kPa (1.05 bar). The optimized matrix exhibits a high volume and size of interconnected macroporosity in the 1-500 pm range as can be seen by digital imaging (Fig. 1c) and SEM (Fig. 4c).
  • Hg (mercury) intrusion porosity analysis shows a slight reduction in the total pore volume and of the total surface area.
  • the values after sterilization are very suitable for the application, showing the correct pore volume range and high surface area available for cell colonization.
  • Example 4 Culture of the matrices of Examples 1 to 3 obtained by the method of the invention with non-human cells in a bioreactor
  • the matrices of Examples 1, 2 and 3 were sterilized in an autoclave at 121 ° C for 20 minutes at 105 kPa (1.05 bar) and were sterilely immersed in a final volume of 2 liter culture medium (Gibco TM OptiPRO TM). Then, a known cell density (13,000 cells / cm 2 ) was inoculated into the aforementioned matrices and kept under culture for prolonged periods of time (10 days or more) in a 48-hour perfusion bioreactor. The inoculated cells were mainly porcine myoblast cells, patented extraction obtained from muscle biopsies and extracted following the protocol described in JM Spinazzola et al., Bio Protoc. November 5, 2017; 7 (21).
  • Glucose biosensors are amperometric electrodes that have enzymes immobilized on their membranes. In the presence of oxygen and the substrate being measured, these enzymatic membranes produce hydrogen peroxide (H2O2), which is then oxidized at a platinum anode held at a constant potential. The resulting flow of electrons and the change in current are proportional to the glucose concentration in the sample. Measurements were carried out at different test times as an indirect measure of proliferation and tissue formation on the matrix of the present invention. The data obtained are shown in Fig. 9.
  • results show the existence of glucose consumption by the primary cells of porcine myoblasts seeded in the matrix of the invention with the passage of time (1-10 days of test), since a reduction in the glucose concentration values is observed compared to the initial glucose levels of the culture medium (approximately 4 g / l). Positive controls were run on each test day.
  • the results show that the matrices of the present invention are useful for cell culture and for obtaining tissue with high nutritive content and / or meat grown in vitro.

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Abstract

La presente invención se refiere a matrices tridimensionales (3D) macroporosas comestibles y esterilizables de ingeniería tisular que comprenden una red de polímero biocompatible reticulado, preferentemente un polímero natural. Adicionalmente, la matriz de la invención comprende, además, aditivos y células vivas que se adhieren y proliferan, colonizando toda la superficie de la matriz y dando origen a una materia prima para la posterior formación de tejido con contenido nutritivo elevado y/o carne cultivada, que puede ser procesada subsiguientemente en un alimento para consumo animal o humano sin requerir modificación o eliminación de las células de la matriz. En el presente documento también se describe un método de uso de las matrices para crear carne cultivada y/o tejidos para ser procesados como un alimento que comprende la matriz.

Description

MATRIZ TRIDIMENSIONAL POROSA COMESTIBLE Y ESTERILIZABLE Y USOS
DE LA MISMA
CAMPO TÉCNICO La invención se refiere a una matriz tridimensional (3D) macroporosa comestible y esterilizable de ingeniería tisular que comprende, preferentemente, un polímero natural. Además, la matriz de la invención comprende, adicionalmente, aditivos y células vivas que se adhieren y proliferan, colonizando toda la superficie de la matriz y dando origen a una materia prima para la posterior formación de tejidos diseñados in vitro, también conocidos en la técnica como carne cultivada, carne de base celular, carne celular y/o carne limpia que pueden ser procesados subsiguientemente en un alimento para consumo animal o humano sin requerir modificación o eliminación de las células de la matriz. En el presente documento también se describen un método de uso de las matrices y/o tejidos para ser procesados como alimento, incluyendo la matriz.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El crecimiento de la población humana, que se prevé que aumente continuamente (alcanzando los 9.770 millones en 2050 y 11.180 millones a final de siglo), traerá consigo una mayor producción de desechos y los requisitos nutritivos de nuestra especie continuarán creciendo, igual que nosotros. La carne se encuentra prominentemente entre los alimentos proteicos. Según se divulga en la información proporcionada por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, la FAO, la carne es definida por el Codex Alimentarius como “todas las partes de un animal que están previstas para el consumo humano o que se ha considerado que son seguras y adecuadas para el mismo”.
En los últimos 40 años, la producción global de carne ha crecido de forma significativa, debido principalmente al desarrollo de países. Este crecimiento ha limitado el sistema de producción, afectando de forma adversa al entorno en términos de recursos naturales (tierra y mar), salud humana (pandemias) y bienestar animal (sufrimiento animal), debido a lo cual el consumo de carne cultivada contribuye de forma significativa a la alimentación de todos los habitantes del planeta al ayudar a crear un sistema más sostenible. La FAO estima que en los siguientes 40 años la demanda de proteína animal y, a su vez, los retos para satisfacer esa demanda continuarán creciendo. El modelo actual de producción no podrá satisfacer esta demanda si no se combina con nuevas estrategias tales como la carne cultivada o carne producida mediante cultivo in vitro de células musculares extraídas anteriormente de un animal.
La mayoría de la investigación llevada a cabo sobre carne cultivada puede ser considerada variantes o aplicaciones de ingeniería tisular, que es la disciplina de biomedicina que, al combinar células, materiales y herramientas de diseño, intenta diseñar estructuras biológicas funcionales para reparar, sustituir o regenerar tejidos dañados. El avance realizado en este campo está basado principalmente en el uso de matrices/estructuras tridimensionales para el crecimiento tisular en una gran variedad de aplicaciones biomédicas tales como la regeneración de tejido óseo, tejido cardíaco, tejido hepático, etc.
La solicitud de patente internacional W01999031222 A 1 da a conocer la producción industrial de carne mediante el cultivo in vitro de células musculares de origen animal sembradas en matrices bidimensionales tradicionales, tales como, por ejemplo, colágeno. Además, la patente estadounidense US7270829B2 da a conocer un producto cárnico obtenido por medio de ingeniería de tejidos no humanos y un método para producir dicho producto cárnico. Dicho producto cárnico comprende células musculares cultivadas ex vivo y es usado para el consumo alimentario. Las células musculares pueden crecer y llegar a fijarse a una estructura de soporte y pueden derivarse de cualquier célula no humana. El producto cárnico también puede comprender otras células, tales como células adiposas, células cartilaginosas, o ambas, que son cultivadas ex vivo junto con células musculares. Este documento guarda silencio sobre el soporte para el crecimiento de las células.
La solicitud de patente US 2006/0121006 A1 , relacionada con el uso de células animales cultivadas para la producción de productos nutricionales o terapéuticos en los que dichas células se derivan de especies poco comunes o en peligro de extinción. También se incluyen productos comestibles que contienen carne, adecuada para un consumo humano o no humano, ya sea como alimento o como suplemento alimentario. La invención también se refiere a el uso de métodos de cultivo a gran escala para la proliferación de las células antes de ser añadidas a dichos productos. La invención abarca los métodos para la fabricación de los productos, los propios productos y los métodos y los usos de los mismos. Se muestra preferencia por el cultivo de células ancladas a soportes, en particular para soportes en forma de microestructuras (microesferas, fibras, etc.) de distintos materiales, tales como colágeno, quitina, poliestireno, poliéster o polipropileno, cuya elección dependerá del uso final del producto y de si la microestructura puede permanecer en el producto final o no. Los soportes de crecimiento celular incluyen microesferas y microesponjas, denominadas microportadoras, apropiadas para su uso en un biorreactor para cultivos celulares, que pueden ser usados para formar un producto cárnico comestible diseñado, también se describen en la solicitud de patente US 2015/0079238 A1. Específicamente, los soportes comestibles descritos incluyen: (i) microválvulas porosas que pueden ser usadas exclusivamente para cultivar células (por ejemplo, células musculares lisas); (ii) matrices con células fijadas que pueden estar incluidas en el producto cárnico final, sin requerir modificación o eliminación de las células de las mismas. En una realización particular, las matrices comestibles pueden formarse mediante pectina reticulada, tal como tiopropionilamidas (PTP) y polipéptidos que contienen secuencias de RGD, tales como la cardosina A tiolada. Por último, dicha solicitud de patente también describe métodos de síntesis de tales matrices comestibles para fabricar carne en un estado artificial. Es interesante destacar que estos inventores, en la solicitud estadounidense US 2013/0029008 A1, describieron diferentes métodos para elaborar carne comestible diseñada usando células cultivadas. Así, el producto cárnico final se formó de múltiples capas parcialmente fusionadas y en donde cada capa contiene cuerpos multicelulares fusionados (miocitos no humanos).
Las matrices a base de polímeros naturales han demostrado un gran potencial para aplicaciones médicas y farmacéuticas. Las matrices formadas por estos biopolímeros, algunos con la capacidad de comportarse como un hidrogel, ofrecen una serie de ventajas en términos de biocompatibilidad y de biodegradabilidad en comparación con las matrices formadas de polímeros sintéticos. Gracias a sus propiedades inherentes, tales como su gran capacidad para absorber agua (aumento de volumen/hidratación), los biopolímeros tienen capacidad de encapsular y liberar de forma eficaz una gran variedad de moléculas terapéuticas hidrófobas e hidrófilas de una forma controlada, incluyendo ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos, etc. (M. Efentakis, Adv. Polym. Tech. 2011, 30, 110-121). En aplicaciones biomédicas, han sido utilizados, por ejemplo, para una encapsulación celular, proceso que implica atrapar células en el polímero para protegerlas del sistema inmunitario (G. Orive et al., Nat. Med. 2003, 9, 104). Para una encapsulación celular con éxito, es importante mantener un equilibrio apropiado de difusión para transportar oxígeno y nutrientes a las células, aumentando la porosidad y la permeabilidad de los biopolímeros.
La preparación de matrices tridimensionales macroporosas usando diferentes técnicas basadas en biopolímeros naturales ha sido una estrategia adoptada para la regeneración tisular (CY, Chen et al., Theranostics. 2015, 5, 643-655), aunque este trabajo principalmente se ha llevado a cabo a pequeña escala y en una investigación básica. Normalmente, en esta investigación se ha propuesto que las matrices poliméricas concebidas para una regeneración tisular se degraden lentamente según se forma nuevo tejido. En cuanto a la industria alimentaria, al estar formadas fundamentalmente a partir de unidades de polisacáridos, son componentes clave en muchas formulaciones, siendo sus aplicaciones principales como agentes emulsionantes, gelantes y/o estabilizantes (E. Bouyer et al., Int. J. Pharm. 2012, 436, 359-378).
Dada la creciente demanda de sustitutos de la carne obtenida directamente de animales, sería interesante desarrollar una matriz que pueda estar constituida por un polímero natural autorizado para uso alimentario, que tenga una estructura tridimensional y una gran área superficial, que puede servir de soporte para células de origen animal en la producción de carne cultiva, incluso en biorreactores de gran escala, y que puede permanecer en el producto final debido a que está compuesta por un biopolímero natural autorizado para uso alimentario.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una matriz tridimensional (3D) macroporosa comestible y esterilizable de ingeniería tisular, en lo sucesivo, la matriz de la invención, que comprende al menos un polímero biocompatible. La matriz de la invención está compuesta principalmente de polímeros biocompatibles de origen natural o sintético a los que las células, preferentemente células de mamífero, con la condición de que sean células no humanas, pueden adherirse y proliferar adecuadamente, hasta colonizar toda la superficie útil de la matriz, en donde las células son, preferentemente, células adherentes.
Uno de los principales retos de soportar un crecimiento a gran escala de carne cultivada utilizando la técnica de creación de matrices es la compatibilidad de las matrices con las técnicas de esterilización utilizadas en biorreactores de gran escala. Es importante adaptar las matrices para lograr un proceso rentable para producciones de gran volumen de productos alimentarios. Este proceso de esterilización se basa en una combinación de vapor, presión y tiempo. El proceso es operado a temperatura y presión elevadas para matar microorganismos y esporas. Las matrices conocidas en la técnica no son adecuadas para lograr este proceso sin perder sus propiedades para la ingeniería tisular.
Por el contrario, la matriz de la invención tiene la sorprendente ventaja de ser esterilizare preferentemente por vapor caliente, dado que los polímeros biocompatibles seleccionados para la composición de la misma son capaces de resistir altas presiones de vapor de agua a altas temperaturas sin degradación ni/o desnaturalización. Es importante hacer notar que la matriz de la invención mantiene intacta su composición y su estructura después de ser sometida a un proceso de esterilización, preferentemente por vapor caliente, permitiendo la debida adhesión celular y la formación tisular. Además, el proceso de esterilización de la matriz de la invención no solo no cambia la aplicabilidad de los materiales debido a la posible degradación y/o desnaturalización, sino que incluso mejora las propiedades mecánicas para soportar la proliferación celular. Por lo tanto, la matriz de la invención podría ser esterilizable por cualquier método conocido por el experto en la técnica, preferentemente por vapor caliente, sin perder sus propiedades como matriz para la proliferación celular, facilitando su incorporación en procesos industriales que requieren un bajo coste y una producción de gran volumen.
En consecuencia, la presente invención da a conocer una matriz tisular tridimensional macroporosa comestible y esterilizable, preferentemente por vapor caliente, en donde los macroporos están interconectados y en donde la matriz comprende al menos un polímero biocompatible, propuesto como material de soporte para el crecimiento, la proliferación y la diferenciación de células de mamífero, preferentemente células no humanas, células adherentes no humanas, que pueden ser usadas para obtener carne cultivada.
A diferencia del estado conocido de la técnica relativo a la carne cultivada, que propone la idea de usar el concepto de la ingeniería tisular para hacer crecer carne cultivada, pero no define claramente los soportes adecuados o no se materializa en un ejemplo de ingeniería tisular, la presente invención propone, por vez primera, el uso de microestructuras macroporosas tridimensionales comestibles esterilizables que comprenden un polímero biocompatible, preferentemente de origen natural, como matrices para la proliferación de carne cultivada siguiendo las directrices definidas para la ingeniería tisular, y adaptables a procesos de fabricación a gran escala.
Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una matriz tridimensional macroporosa comestible y esterilizable, preferentemente por vapor caliente, de ingeniería tisular que comprende un polímero biocompatible y macroporos interconectados, preferentemente en donde los macroporos y la matriz comprenden células vivas.
Según se utiliza en la presente memoria, el término “comestible” se refiere a materiales, preferentemente material alimentario concebido para un contacto oral o un consumo mediante ingesta.
Las matrices comestibles descritas en la presente memoria son apropiadas para la biofabricación de tejidos diseñados, también denominados o conocidos por el experto como carne cultivada, carne de base celular, carne celular y/o carne limpia, que son adecuados para un consumo humano. Por ejemplo, en la presente memoria se describen matrices tridimensionales macroporosas comestibles y esterilizable, preferentemente por vapor caliente, de ingeniería tisular para ser usadas en la formación de un tejido con elevado contenido nutritivo y/o un producto cárnico cultivado. Aunque las matrices y los métodos de síntesis y los usos de las mismas descritos en la presente memoria son dirigidos fundamentalmente a productos cárnicos comestibles cultivados, tal matriz también puede hallar aplicación en una terapia celular para animales, incluyendo mamíferos y seres humanos, en donde se desea realizar una expansión celular en ausencia de productos derivados de animales.
Según se usan en la presente memoria, los términos “esterilizable” o “esterilizar” se refieren a un procedimiento de destrucción de todo microorganismo, preferentemente un microorganismo patógeno en o sobre un entorno o un material dados, para prevenir la propagación de infecciones. Esto suele hacerse usando calor, radiación o agentes químicos. En una realización preferida, el proceso de esterilización se lleva a cabo mediante vapor caliente.
Según se utilizan en la presente memoria, los términos “matriz” o “soporte”, utilizados de forma intercambiable en toda la presente divulgación, se refieren a una matriz tridimensional o un material que permite la fijación y la proliferación de las células, u otros compuestos tales como aditivos, o similares, según la presente invención. Según se utilizan en la presente memoria, “fijación”, “fijar” o “se fija” se refieren a células que se adhieren directa o indirectamente a la matriz, al igual que a células que se adhieren a otras células.
Según se utiliza en la presente memoria, la expresión “polímero biocompatible” se refiere a un material/polímero sintético o natural que es, por ejemplo, no tóxico a sistemas biológicos y/o congruente con procesos biológicos. En este sentido, la biocompatibilidad de materiales poliméricos denota un riesgo mínimo, insignificante o nulo de rechazo inmunitario, lesión, daño y/o toxicidad a células, tejidos, órganos y/o sistemas biológicos vivos.
En una realización preferida, el polímero biocompatible es un polímero natural. En una realización ilustrativa, el polímero natural es uno cualquiera que pueda resistir un proceso de esterilización a presiones y temperatura elevadas sin una degradación y/o una desnaturalización. Por lo tanto, el polímero natural o cualquier derivado del mismo es, por ejemplo, sin limitación, polipéptidos, polinucleótidos, resinas naturales, cauchos, poliésteres naturales y polisacáridos. En una realización más preferida, el polímero natural se selecciona de la lista que consiste en: alginato, quitosán, almidón, dextrano, pululano, heparina, sulfato de heparina, celulosa, hemicelulosa, glucomanano, agar, xantano, goma guar, sulfato de condroitina, gelatina, quitina, un polisacárido, un glicosaminoglicano o cualquier combinación de los mismos. En una realización más preferida, el polímero natural se selecciona entre quitosán y/o alginato.
En el caso particular del uso de gelatina como polímero natural, no es esterilizable mediante vapor caliente y presión elevada dado que es hidrolizada parcialmente y desnaturalizada si es sometida a estos procedimientos. En el caso de que este polímero natural se encuentre en el interior de la matriz como pequeñas trazas mezcladas con otro biopolímero tal como quitosán, la modificación de las propiedades de la matriz es mínima, manteniendo aún sus propiedades adhesivas.
Estos polímeros naturales pueden ser utilizados directamente sin ningún tratamiento por parte de fuentes comerciales o, de forma alternativa, se pueden llevar a cabo modificaciones químicas antes de ser utilizados para mejorar las propiedades de la matriz de la presente invención, en cualquiera de las etapas de su producción. Según se utiliza en la presente memoria, el término “derivado” es un compuesto similar obtenido cambiando químicamente una parte de un compuesto pero que tiene las mismas propiedades, o incluso mejores, que el compuesto original. Por lo tanto, los derivados de los polímeros naturales de la presente invención hacen referencia a modificaciones químicas que comprenden la incorporación de distintos grupos tales como grupos amino, grupos aldehido, grupos de ácido carboxílico, grupos amida, grupos cetona, grupos éster, grupos alcoxi, grupos sulfato, grupos fosfato o similares.
La matriz de la invención comprende el polímero natural mencionado anteriormente, que tiene la ventaja de estar compuesto de biopolímeros naturales autorizados para su uso alimentario por las instituciones competentes, tales como, por ejemplo, la U.S. Food and Drug Administration (FDA) y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA). En este sentido, los polímeros comestibles y biocompatibles utilizados en la matriz de la invención están diseñados de forma que la matriz sea comestible y no tenga que ser extraída del producto final; es decir, para evitar el proceso de recogida.
En la presente invención se recomienda encarecidamente evitar el uso de un polímero natural seleccionado de la lista que consiste en colágeno, albúmina (todos los tipos y las formas), caseínas, ácido hialurónico, fibrina, fibronectina y elastina, entre otros, dado que no son adecuados para un proceso de esterilización con vapor caliente.
En otra realización preferida, el polímero biocompatible es un polímero sintético o cualquier variante del mismo. Ejemplos de polímeros sintéticos incluyen, sin limitación, polipéptidos sintéticos de microorganismos o preparados mediante técnicas de síntesis química, bioésteres, obtenidos de la extracción de microorganismos o preparados mediante síntesis química a partir de sus monómeros, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, ácido poli(láctico-co-glicólico), polihidroxialcanoatos, o cualquier otro polímero sintético preparado a partir de monómeros naturales reconocidos generalmente, tales como monosacáridos (tales como glucosa, fructosa, mañosa, galactosa o cualquier derivado o variante, tal como glucosaminas, aminoazúcares, ... o similares), aminoácidos o cualquier derivado, nucleótidos o cualquier derivado, ácidos grasos o cualquier derivado, o similares en cualquier combinación.
En una realización más preferida, el peso molecular (Mw) de los polímeros biocompatibles, o cualquier derivado de los mismos, varía desde 1000 Da hasta 5000000 Da, preferentemente desde 10000 hasta 1000000 Da, más preferentemente desde 100000 hasta 500000 Da.
La matriz de la invención tiene macroporos, preferentemente macroporos jerárquicos e interconectados, que tienen un tamaño medio de poro en el intervalo de 1 pm a 10000 pm. En realizaciones particulares, el tamaño medio de poro oscila entre 50 y 1000 pm, preferentemente, entre 50 pm y 100 pm, más preferentemente, entre 100 pm y 1000 pm, o aún más preferentemente, entre 100 pm y 500 pm. Para obtener macroporos mayores, puede usarse un molde específico en el método para la producción de la matriz de la invención que haga posible obtener poros transversales o longitudinales en toda la matriz que tengan el tamaño medio de poro mencionado anteriormente. En este sentido, la disposición de poros obtenida a través de la formación de cristales de agua (disolvente), junto con los macroporos transversales permite la obtención de matrices biopoliméricas con estructuras porosas interconectadas y jerárquicas. El tamaño final de poro de la matriz de la invención se ve influido por la concentración del polímero usado en su formación. Además, los hidrogeles con una concentración elevada de polímero dan origen a tamaños de poro menores. En este caso, el proceso de producción de la matriz macroporosa tridimensional da un intervalo de tamaños de poro entre 50 pm y 10.000 pm, preferentemente de 100 pm a 1000 pm, más preferentemente entre 100 y 500 pm.
En otra realización preferida, el porcentaje en peso/volumen de los polímeros biocompatibles mencionados en la presente memoria o cualquier combinación de los mismos, disueltos en una solución acuosa, disolventes orgánicos, medios cultivados o en cualquier combinación de los mismos en los que se disuelvan, oscila entre 0,5 % y 16 %. En otra realización preferida, el porcentaje en peso/volumen oscila entre 1 % y 8 %, más preferentemente oscila entre 1 ,5 % y 4 %, más preferentemente aún es el 1 ,5 % o, alternativamente, en cualquiera de las relaciones relativas posibles cuando hay más de un polímero biocompatible en la matriz final.
En otra realización preferida, la matriz de la invención comprende, además, células vivas, preferentemente células vivas no humanas, y, más preferentemente, células vivas no humanas adherentes, que están distribuidas de manera homogénea por la matriz. Pueden usarse muchos tipos de células autoadherentes para formar los productos cárnicos cultivados descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, los productos cárnicos cultivados están diseñados para asemejarse a productos cárnicos tradicionales y los tipos de células elegidos para aproximarse a los encontrados en los productos cárnicos tradicionales. Para los fines de la presente divulgación, las células usadas para su cultivo en toda la matriz de la invención para proporcionar la carne cultivada o tejidos con contenido altamente nutritivo, descritas en la presente memoria, pueden incluir, por ejemplo, sin limitación, células musculares, células musculares progenitoras, preferentemente células musculares esqueléticas; células musculares lisas, células estromales, células satélite, células de fibroblastos, células de mioblastos, células endoteliales, células adiposas, tales como células progenitoras de adipocitos, hepatocitos, cardiomiocitos, etc. Gracias a su estructura, la matriz de la invención permite la proliferación y la diferenciación de diversos tipos de células tales como, entre otros, mioblastos/miotubos/fibroblastos (células musculares), células endoteliales, adipocitos (células adiposas), produciendo carne cultivada adecuada para el consumo humano con el contenido deseado de proteína- grasa por parte del consumidor final como el producto final. En cuanto a los tipos de células usados para la producción de carne cultivada, debería hacerse notar que la matriz de la invención permite la proliferación y la diferenciación de una amplia gama de líneas celulares, de modo que se podría llevar a cabo un cultivo diferente de un único tipo de células — por ejemplo, un cultivo de mioblastos — que se diferencian en miotubos para formar tejido muscular cárnico (proteína). Con estas características, el producto final está exento de grasa, a no ser que se lleven a cabo cocultivos de mioblastos con adipocitos, un proceso que también sería posible si se desea. De esta manera, es posible influir en las características finales del producto con el objetivo de hacerlo más atractivo para el consumidor y adaptarlo a las necesidades del consumidor.
En una realización adicional preferida, los cultivos de líneas celulares vivas en toda la matriz de la presente invención podrían ser obtenidos a partir de diversas fuentes animales, tales como, sin limitación, mamíferos como porcino, bovino, ovino, caballo, perro, gato; aviar; reptil; pez; anfibios; crustáceos o similares. Esto abre las puertas a un mercado inmenso, dado que brinda una oferta muy diversa a los consumidores finales.
Para proporcionar una matriz con características mejoradas, puede formarse y/o combinarse con otras moléculas/sustancias/biomoléculas seleccionadas entre un aditivo, moléculas bioactivas y/o un agente reticulante, o cualquier combinación de los mismos, que tengan un valor nutricional elevado o que proporcionen una textura mejorada o añadan aroma a la matriz final. Estos compuestos o sustancias también pueden mejorar las propiedades de adhesión y la proliferación de las futuras células que pueden ser sembradas y cultivadas con la matriz.
Por lo tanto, en otra realización preferida, la matriz de la presente invención comprende, además, ligandos bioactivos. Los ligandos bioactivos interactúan específicamente con una o más biomoléculas de células o unen biomoléculas que interactúan con biomoléculas de las células que se distribuyen en el interior de la matriz o que proliferan en el interior de la matriz, o migran al interior de la misma. Tales interacciones son eficaces para dirigir el destino celular o inducir que las células formen un tejido. Estos compuestos o sustancias también pueden mejorar las propiedades de adhesión y la proliferación de las futuras células que pueden ser sembradas y cultivadas con la matriz. La identidad de los ligandos bioactivos dependerá de la identidad de las células diana, y algunos ejemplos de ligandos bioactivos adecuados incluyen: carboxilo, amina, fenol, guanidina, tiol, indol, imidazol, hidroxilo, sulfato, norborneno, maleimida, laminina, fibrinógeno, secuencias de péptidos, moléculas de adhesión tales como la superfamilia de las inmunoglobulinas, cadherinas (E-, N-, P-, ...), selectinas (P-, E-, L-, ...) o integrinas: fibronectinas, poli-L-ornitina, colágeno, vitronectinas, lectina, poli-ornitina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, péptidos cíclicos, péptidos que contienen RGD (Arg-Gly-Asp), péptidos que contienen RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser), o cualquier otro compuesto o sustancia reconocido por un experto en el campo que fomente la adhesión celular a la matriz. Preferentemente, las moléculas bioactivas de la presente divulgación hacen referencia a aquellas sustancias que resisten el proceso de esterilización sin afectar de forma significativa a su capacidad para fomentar la adhesión celular. En una realización preferida, la molécula bioactiva es poli-L-lisina, más preferentemente, poli-s-lisina.
La roΐί-e-lisina (e-poli-L-lisina, EPL) es un péptido catiónico antibacteriano que se da de forma natural, un homopolímero de L-lisina, que es soluble en agua, comestible, biodegradable y no tóxico para seres humanos y para el medioambiente. La poli-s-lisina se utiliza normalmente como conservante alimentario natural, agente emulsionante, al igual que en la industria cosmecéutica y farmacéutica. En este sentido, la roΐί-e-lisina se utiliza habitualmente en aplicaciones alimentarias, tales como arroz hervido, verduras cocinadas, sopas, fideos, pescado en rodajas (sushi) y carne.
Esta es la primera vez que la roΐί-e-lisina es utilizada como molécula bioactiva, preferentemente como ligando bioactivo para mejorar la adhesión celular en cultivos celulares in vitro. Según se utiliza en la presente invención, la roΐί-e-lisina no solo se encuentra en la superficie de la matriz de la invención, sino también en su interior, siendo parte de la estructura tridimensional global de la matriz, permitiendo y mejorando, por lo tanto, la adhesión celular sobre la misma. Además, debido a la actividad antimicrobiana natural de la roN-e-lisina contra levaduras, hongos y bacterias, ayuda a inhibir el crecimiento de tales microorganismos patógenos en la matriz de la invención.
Además, la roN-e-lisina ya está disponible en grandes cantidades y a un precio económico para la industria alimentaria, permitiendo el uso industrializado de la misma en la producción de carne cultivada. Por lo tanto, esta propiedad junto con la ventaja sorprendente de la matriz de la invención caracterizadas porque son esterilizables, preferentemente mediante vapor caliente, sin degradación ni/o desnaturalización de los polímeros biocompatibles seleccionados para la composición de las mismas, hacen que sean adecuadas para una producción en reactores industriales de gran escala, que requieren, según se ha mencionado anteriormente, un coste muy bajo de producción.
Los aditivos incluyen, sin limitación, moléculas/sustancias con un valor nutricional elevado o que proporcionan una textura mejorada o añaden aroma al producto final según la presente invención y son, además, aquellas sustancias que resisten el proceso de esterilización sin afectar de forma significativa a su capacidad para fomentar la adhesión celular. El aditivo se selecciona de la lista que consiste en: un aroma, un potenciador del aroma, un colorante, un potenciador del color, sales, reguladores de la acidez, espesantes, emulsionantes, estabilizantes, un potenciador nutricional, tal como vitaminas, aminoácidos, fibra; fructooligosacáridos; inulinas; betacaroteno, ácidos grasos omega; espirulinas; probióticos, prebióticos, saponinas; antioxidantes; ácidos grasos esenciales; minerales; y similares, o cualquier combinación de los mismos. Los aditivos seleccionados para la matriz de la presente invención son, preferentemente, de origen o fuente natural. Adicionalmente, el término aditivo también abarca compuestos que mejoran las propiedades de adhesión y la proliferación de las futuras células que puedan ser sembradas en la matriz.
Ejemplos de grupos reticulares adecuados son los grupos hidroxilo, grupos carbonilo, grupos aldehido, grupo carboxilato, grupo carbonato, grupos carboxilo o derivados, grupos carboxamida, grupos imina, grupos imida, grupos tiol y/o cualquier otro grupo, polielectrolitos, iones inorgánicos o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización preferida, la matriz de la invención podría estar en forma de hidrogel. En una realización preferida, la matriz de la invención en forma de hidrogel es útil para soportar la proliferación de las células mientras se forma el tejido y, además, puede ser usada como estabilizante, texturizante y/o portadora de nutrientes, dando a la carne cultivada un gran valor añadido. Además, la matriz de la invención en forma de hidrogel es útil como depósito para el suministro de moléculas específicas. La introducción de un núcleo de matriz de hidrogel para el cultivo de carne proporciona un depósito para encapsular moléculas para la proliferación y la diferenciación celulares durante el proceso de producción, a la vez que mejora el contenido visual y nutricional del tejido final o del producto cárnico cultivado.
En otra realización preferida, la matriz de la presente invención está saturada con un medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, las matrices están saturadas con un medio que facilita la proliferación o la supervivencia celulares; es decir, un medio de cultivo celular. En una realización más preferida, el medio de cultivo celular se selecciona entre cualquier medio clásico disponible comercialmente, tal como medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM, MEM) y sus variantes, o medios de cultivo definidos específicamente para cada tipo de célula utilizado, conocidos por el experto en la técnica. En algunas realizaciones, la matriz puede estar impregnada con una biomolécula u otro material previsto para su administración al alimento, preferentemente carne.
La estructura de la matriz de la presente invención es conformada según se desee. La forma de la matriz de la presente invención puede ser regular (por ejemplo, cilindrica, esférica, redondeada, rectangular, cuadrada, etc.) o irregular. Además de tener la ventaja de ser comestible y de no tener que ser eliminada para preparar un producto alimenticio cárnico final listo para el consumo, la mayoría de los polímeros de muestra mencionados sirven para dar un valor añadido a productos que, si no, serían completamente descartados. Por ejemplo, la Fig. 1 ilustra variaciones de matrices que tienen formas cilindricas. Cualquiera de estas formas puede ser porosa.
A diferencia de otras estructuras de soporte propuestas con anterioridad para el cultivo celular concebidas para obtener carne cultivada, la matriz de la presente invención es fácilmente esterilizable dentro de grandes biorreactores, y su tamaño la hace adecuada para una producción a gran escala, y tiene la ventaja de ser una estructura preparada con materiales comestibles. En este sentido, la matriz de la invención tiene la sorprendente ventaja de ser esterilizable, dado que los polímeros biocompatibles seleccionados para la composición de la misma son capaces de resistir altas presiones de vapor de agua a temperaturas elevadas sin degradación ni/o desnaturalización. Es importante hacer notar que la matriz de la invención mantiene su composición y su estructura después de ser sometida a un proceso de esterilización, permitiendo la debida adhesión celular y la formación de tejidos. Además, el proceso de esterilización de la matriz de la invención no solo no cambia la aplicabilidad de los materiales debido a la posible degradación y/o desnaturalización, sino que incluso mejora las propiedades mecánicas para soportar la proliferación celular. Por lo tanto, la matriz de la invención podría ser esterilizable por cualquier método conocido por el experto en la técnica, preferentemente por vapor caliente, sin perder sus propiedades como matriz para la proliferación celular, facilitando su incorporación en procesos industriales que requieren un bajo coste y producción de gran volumen. En otra realización preferida, la esterilización de la matriz de la presente divulgación se lleva a cabo mediante una esterilización física o química, preferentemente un proceso de esterilización física, que se selecciona de la lista que consiste en: vapor caliente, calor seco, tindalización y radiación ionizante o no ionizante, preferentemente vapor caliente. En otra realización más preferida, el proceso de esterilización se lleva a cabo mediante vapor caliente en un autoclave o biorreactor a temperaturas que varían desde 121 °C hasta 134 °C, y a una presión que varía desde 50 hasta 105 kPa (0,5 hasta 1 ,05 bar), durante un tiempo que varía desde 10 hasta 60 min; más preferentemente, la esterilización mediante vapor caliente se lleva a cabo durante 20 min a una temperatura de al menos 121 °C y a una presión de 105 kPa (1 ,05 bar).
Además, gracias a la estructura muy macroporosa de la matriz mencionada anteriormente, se permite el transporte de nutrientes, facilitando, de ese modo, la adhesión y la proliferación celulares, y dando lugar a una materia prima que puede ser procesada subsiguientemente en alimentos preparados para su consumo. Además, la matriz de la invención distribuye las células en el espacio tridimensional completo. Hasta ahora, estas matrices nunca habían sido contempladas para este fin, dado que la técnica de producción a gran escala de carne cultivada se encuentra en sus comienzos. El concepto de esta matriz para producir carne cultivada es novedoso y la aplicación de los materiales utilizados para obtener la matriz, en esta forma de matriz comestible y esterilizable muy porosa, también es novedosa.
Por lo tanto, los polímeros biocompatibles utilizados en la matriz de la presente invención según se ha mencionado anteriormente y, por consiguiente, la matriz de la invención que los comprende, tienen las siguientes ventajas:
(i) también es utilizado como aglutinante, dando a la carne cultivada una textura y una compactación mejores;
(ii) mejora la dispersión, la biodisponibilidad y la absorción de nutrientes en la etapa de proceso digestivo;
(iii) teniendo en cuenta que el polímero biocompatible podría ser un biopolímero con propiedades de hidrogel, la matriz en donde se cultivan las células también puede actuar como viscosificador y agente gelante, proporcionando una textura agradable al paladar y al tacto;
(iv) también puede actuar como un potenciador del aroma y del color, dado que actúa per se como un sistema de liberación similar a un sistema (vehículo) de liberación de fármacos;
(v) también actúa como un sistema de suministro selectivo para componentes reconocidos beneficiosos para la salud en los alimentos y/o aminoácidos libres, abriendo, de ese modo, un amplio abanico de posibilidades para utilizar estas estructuras comestibles como posibles vehículos de vitaminas, minerales, ácidos nucleicos u otras biomoléculas.
La matriz de la invención satisface requisitos fundamentales de la ingeniería tisular, incluyendo: los macroporos muy interconectados que fomentan la difusión de nutrientes y facilitan la proliferación, la difusión, la migración celular y la comunicación entre células. La gran área superficial interna produce una gran capacidad para la proliferación de células; distribuye las células tridimensionalmente; facilita el transporte de nutrientes; soporta la migración y la proliferación celulares; y facilita el soporte mecánico para la nueva producción de tejidos.
Las matrices de la presente invención, según se ha descrito anteriormente, son adecuadas para una variedad de aplicaciones, incluyendo además la medicina regenerativa y la ingeniería tisular. Las matrices son particularmente útiles como ingeniería tisular. Por lo tanto, pueden ser utilizadas para facilitar la proliferación celular y la formación de tejido. La macroporosidad es adecuada para permitir una migración celular, la formación de la matriz intracelular, el suministro de nutrientes, la angiogénesis y similares. Además, una ventaja adicional de la matriz de la presente invención para su uso en medicina regenerativa y la ingeniería tisular es que es biocompatible.
La matriz de la invención es compatible con diversos tipos de reactores o biorreactores, incluso aquellos en los que se aplicarán corrientes eléctricas para estimular la proliferación celular, debido a lo cual, dichas matrices son eléctricamente conductoras.
Todas las definiciones y los términos mencionados anteriormente para el primer aspecto de la presente divulgación se aplican mutatis mutandis a los aspectos adicionales de la presente divulgación mencionados a continuación.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para obtener la matriz de la presente invención, comprendiendo el método: a) preparar una disolución del al menos un polímero biocompatible según la presente invención y un disolvente adecuado, preferentemente un medio de cultivo, b) añadir la solución de la etapa a) en moldes, para darle la forma y las dimensiones deseadas, y congelarla; preferentemente a una temperatura inferior a la temperatura de congelación de la solución, c) liofilizar la matriz congelada obtenida en la etapa b), d) curar la matriz liofilizada de la etapa c), y e) esterilizar la matriz, preferentemente mediante vapor caliente.
En una realización preferida del método de obtención de la matriz, el polímero biocompatible seleccionado, preferentemente un polímero natural mencionado anteriormente, se disuelve a la concentración requerida en un disolvente seleccionada de la lista que consiste en: soluciones acuosas, disolventes orgánicos, medios de cultivo o cualquier combinación de los mismos, en la etapa a). En otra realización preferida, los disolventes orgánicos se seleccionan de la lista que consiste en: etanol, dioxano, acetona, ácido acético, alcohol isopropílico, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, ácido trifluoracético o cualquier otro, puro o como un codisolvente en soluciones acuosas en cualquier relación apropiada.
En otra realización preferida, los medios de cultivo hacen referencia a una solución que contiene nutrientes para soportar la supervivencia celular en condiciones en las que se pueden cultivar las células seleccionadas. Se seleccionan ejemplos de medios adecuados de cultivo entre medios clásicos disponibles comercialmente, tales como medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM, MEM) o cualquier variante del mismo. En este sentido, el experto sabe que el medio específico de cultivo es adecuado para cada tipo de célula utilizado.
En otra realización preferida, la concentración del polímero biocompatible de la invención, o cualquier combinación del mismo, varía desde 0,5 % hasta 16 % (p/p), preferentemente entre 1 % y 8 %, más preferentemente entre 1,5 % y 4 % o, de forma alternativa, en cualquiera de las posibles relaciones relativas cuando hay más de un polímero biocompatible en la matriz final.
En otra realización preferida, el pH de la solución que comprende el disolvente y el polímero biocompatible puede ser neutro o puede ser un pH que puede variar desde 1 hasta 14, preferentemente desde 2 hasta 10, para mejorar la solubilidad del polímero dependiendo del polímero utilizado. Para mejorar la solubilidad de los polímeros biocompatibles seleccionados, se puede aumentar la temperatura de la etapa a) desde la temperatura ambiente hasta 180 °C. En una realización preferida, la temperatura varía desde 22 °C hasta 70 °C, más preferentemente desde 30 hasta 70 °C, más preferentemente aún, desde 35 °C hasta 65 °C.
En otra realización preferida, la matriz de la etapa b) se forma moldeando la disolución mediante extrusión directamente.
En otra realización preferida, la temperatura de congelación de la etapa b) oscila entre -15 °C y -80 °C.
En otra realización preferida, la liofilización de la etapa c) se lleva a cabo durante al menos un periodo que oscila entre 16 h y 96 h, preferentemente entre 24 y 72 h, más preferentemente entre 18 y 24, a una temperatura de condensación que varía desde 25 °C hasta -100 °C, preferentemente desde 25 °C hasta -100 °C, más preferentemente desde 20 °C hasta -50 °C, y más preferentemente desde -15 °C hasta -45 °C, y a una presión de 0,01 hasta 0,026 Pa (1 hasta 2,6 x 104 mbar), más preferentemente 100 hasta 40 Pa (1 hasta 0,4 mbar), más preferentemente 20 hasta 40 Pa (0,2 hasta 0,4 mbar). Para contribuir a la sublimación, se pueden calentar estantes liofilizados hasta 20 °C. Se recomienda una diferencia de temperatura de 15 °C hasta 20 °C entre la muestra y el condensador. En otra realización preferida, las matrices liofilizadas son reticuladas a continuación con un reticulante adecuado y/o un tratamiento de revestimiento superficial, llevándose a cabo este tratamiento con sustancias o biomoléculas que potencian la adhesión y la proliferación celulares. Los parámetros utilizados en el proceso de liofilización, tales como la duración, la temperatura y la presión, son seleccionados de una forma que las matrices pierdan al menos un 98 % del agua inicial. Véase la Fig. 3, en donde el diagrama de fases del agua indica el punto triple cuando se produce la liofilización.
En otra realización preferida, el proceso de curado de la etapa d) es preferentemente un proceso de curado térmico realizado a una temperatura que oscila entre 30 °C y 180 °C durante un periodo de tiempo que oscila entre 1 min y 48 h.
En otra realización preferida, el método de la invención comprende opcionalmente, además, en la etapa a) y/o en una etapa adicional entre las etapas c) y d), la adición de al menos un aditivo, al menos una molécula de adhesión, al menos un agente reticulante y/o cualquier combinación de los mismos, según lo que se da a conocer en toda la presente divulgación.
En otra realización preferida, el exceso de reticulantes y/o de moléculas de revestimiento superficial se elimina por lavado y las matrices pueden ser usadas inmediatamente o son congeladas y liofilizadas de nuevo para su almacenamiento.
En otra realización preferida, la esterilización de la etapa e) se lleva a cabo mediante esterilización física o química, preferentemente un proceso de esterilización física, que se selecciona de la lista que consiste en: vapor caliente, calor seco, tindalización y radiación ionizante o no ionizante, preferentemente vapor caliente. En otra realización más preferida, el proceso de esterilización se lleva a cabo mediante vapor caliente en un autoclave durante al menos 20 min a una temperatura de al menos 121 °C a una presión de 105 kPa (1 ,05 bar).
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una matriz obtenida por el método dado a conocer anteriormente.
Adicionalmente, un hecho particularmente innovador es que la matriz de la presente invención puede actuar como una portadora para una gran variedad de suplementos alimentarios, tales como, por ejemplo, fibra, vitaminas, aminoácidos o similares, y es adecuada para procesos de esterilización sin perder las propiedades de creación de matrices de ingeniería tisular. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a el uso in vitro de la matriz de la presente invención como portadora.
Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de la matriz de la presente invención para la producción in vitro de tejidos con contenido nutritivo elevado y/o productos cárnicos de cultivo.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método de obtención de un tejido con contenido nutritivo elevado y/o carne de cultivo, comprendiendo el método el cultivo de una pluralidad de (múltiples) células adherentes no humanas vivas con una pluralidad de matrices de la invención, en presencia de un medio nutriente adecuado, en donde el cultivo tiene lugar en un biorreactor adecuado para que la población inicial de células pueda expandirse y crecer para formar un volumen de tejido y/o de carne cultivada. Se puede hacer que los cultivos resultantes crezcan hasta un nivel deseado y que sean usados directamente para formar un tejido y/o carne cultivada (por ejemplo, por la fusión de las matrices de la invención), sin necesidad de separar las matrices o eliminarlas de otro modo.
En una realización preferida, las células adecuadas para obtener el tejido y/o la carne cultivada han sido dadas a conocer anteriormente. Generalmente, las células pueden ser cultivadas con cualquiera de las matrices comestibles y esterilizables descritas en la presente memoria en una suspensión, incluyendo en un biorreactor. Por ejemplo, las células pueden ser sembradas en el medio junto con las matrices comestibles y esterilizables y dejar que hagan contacto, se adhieran y crezcan en la matriz comestible y esterilizable apropiada. En algunas variaciones, el cultivo comprende cultivar una pluralidad de células musculares sobre matrices comestibles, esterilizables y libres de productos de origen animal, comprendiendo las matrices comestibles, esterilizables y libres de productos de origen animal un aroma, un potenciador del aroma, un colorante, un potenciador del color y un potenciador nutricional.
En algunas variaciones, las matrices de la invención con células cultivadas pueden ser formadas directamente dando lugar al producto cárnico cultivado después de una incubación en el biorreactor durante un tiempo apropiado para permitir que las células se fijen y proliferen (por ejemplo, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, etc.). Una vez que las células se han dividido y han proliferado suficientemente en las matrices, formando “matrices colonizadas” en las que las matrices están cubiertas al menos parcialmente por células (y/o llenas de las mismas), las matrices colonizadas pueden ser colocadas y se puede dejar que se fusionen para formar el producto cárnico cultivado. En algunas variaciones, una matriz colonizada está cubierta (por ejemplo, cubierta más de un 50 %, cubierta más de un 60 %, cubierta más de un 70 %, cubierta más de un 80 %, cubierta más de un 90 %, cubierta a confluencia) con las células.
Según se ha descrito previamente, las células usadas pueden ser de uno o más tipos, incluyendo en particular células musculares. Las matrices cubiertas hasta el grado apropiado con células (por ejemplo, >5 %, >10 %, >20 %, >30 %, >40 %, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, etc.) pueden ser denominadas matrices colonizadas. Las matrices colonizadas pueden ser usadas entonces para formar un agregado a partir del cual se forma la carne cultivada. Por ejemplo, puede formarse un agregado de las matrices colonizadas situando matrices colonizadas inmediatamente adyacentes entre sí. Por ejemplo, las matrices colonizadas pueden ser puestas en contacto mutuo para que las células de matrices colonizadas adyacentes (inmediatamente adyacentes) puedan hacer contacto entre sí y fusionarse para formar el volumen de tejido con contenido nutritivo elevado y/o carne cultivada.
Una vez se forma la carne diseñada, debe mantenerse estéril (libre de contaminación bacteriana o de otro tipo) sin el uso de antibióticos, fármacos o similares, ya que los tales pueden tener un impacto en el producto cárnico final más adelante. Por ejemplo, el volumen del tejido con contenido nutritivo elevado y/o la carne de cultivo pueden ser congelados después de que se forme.
En un aspecto adicional, la presente invención da a conocer productos cárnicos cultivados obtenidos por el método divulgado anteriormente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una carne cultivada de ingeniería tisular que comprende una pluralidad de matrices según la presente invención y una pluralidad de células no humanas vivas, preferentemente células musculares y, opcionalmente, comprende, además, una pluralidad de células satélite, células estromales, células de mioblastos, células de fibroblastos, células endoteliales, células adiposas, hepatocitos, hepatocitos, cardiomiocitos o cualquier combinación de los mismos.
En general, estos productos cárnicos cultivados pueden incluir un cuerpo comestible que tenga un volumen formado de múltiples matrices colonizadas, incluyendo cada matriz colonizada una matriz comestible y esterilizable según la presente invención, estando además las matrices colonizadas fusionadas al menos parcialmente entre sí. Según se ha mencionado, estas matrices comestibles pueden comprender un aditivo, una molécula biocompatible, un agente reticulante y cualquier combinación de los mismos. En una realización preferida, la carne cultivada comprende, además, al menos un aditivo seleccionado del grupo que consiste en un aroma, un potenciador del aroma, un colorante, un potenciador del color, un potenciador nutricional o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, los productos cárnicos cultivados son frescos. En otras realizaciones, los productos cárnicos cultivados están conservados. En realizaciones adicionales, la carne se conserva, por ejemplo, mediante cocción, desecación, ahumado, enlatado, encurtido, salado o congelación.
En algunas realizaciones, los productos cárnicos cultivados están sustancialmente libres de microorganismos patógenos. En realizaciones adicionales, métodos controlados y sustancialmente estériles de preparación celular, cultivo celular, preparación de matrices, y la preparación de carne cultivada dan lugar a un producto sustancialmente libre de microorganismos patógenos. En realizaciones adicionales, una ventaja adicional de tal producto es su mayor utilidad y seguridad.
Así, incluso los grandes volúmenes de carne cultivada formada por los métodos descritos en la presente memoria pueden o no tener vasos sanguíneos. Además, las carnes cultivadas descritas en la presente memoria pueden tener o pueden carecer de cualquier componente nervioso (por ejemplo, axones, dendritas, cuerpos de células nerviosas), ya que se puede hacer que crezcan con o sin tales componentes.
Los productos cárnicos cultivados dados a conocer en la presente memoria son comestibles y están concebidos para su consumo por seres humanos, animales no humanos o ambos. En algunas realizaciones, los productos cárnicos cultivados son productos alimenticios para seres humanos. En otras realizaciones, los productos cárnicos cultivados son alimento para animales, tal como pienso para el ganado, pienso para acuicultura, o pienso para mascotas domésticas. Por lo tanto, a la luz de la divulgación aquí proporcionada, los expertos en la técnica reconocerán que las células no humanas de una plétora de fuentes son adecuadas para su uso en la producción de tales productos y con los métodos divulgados en el presente documento. En diversas realizaciones, las matrices y los productos cárnicos cultivados comprenden células no humanas derivadas, a título de ejemplos no limitantes, de mamíferos, aves, reptiles, peces, crustáceos, cefalópodos, insectos, invertebrados no artrópodos y combinaciones de los mismos.
En este texto, no se debería entender el término “comprende” y sus derivados (tales como “comprendiendo”, etc.) en un sentido excluyente, es decir, no se debería interpretar que estos términos excluyan la posibilidad de que lo que se describe y define pueda incluir elementos, etapas adicionales, etc.
Por otra parte, la invención, evidentemente, no está limitada a la o las realizaciones específicas descritas en la presente memoria, sino que también abarca cualquier variación que pueda ser considerada por cualquier experto en la técnica (por ejemplo, en lo referente a la elección de materiales, dimensiones, componentes, configuración, etc.), dentro del alcance general de la invención, según se define en las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para completar la descripción y para permitir una mejor comprensión de la invención, se proporciona un conjunto de dibujos. Dichos dibujos forman parte integral de la descripción e ilustran una realización de la invención, que no debería interpretarse que restrinja el alcance de la invención, sino que es únicamente un ejemplo de cómo puede llevarse a cabo la invención. Los dibujos comprenden las siguientes figuras:
Figura 1. Matrices cilindricas de distintas longitudes y distintos diámetros formadas mediante moldeo. Las matrices a), b) y c) se corresponden con los Ejemplos 1 , 2 y 3, respectivamente.
Figura 2. Descripción esquemática de una extrusión en una superficie congelada. El recuadro muestra los microgránulos finales que pueden producirse mediante este método.
Figura 3. Diagrama de fases de agua que indica el punto triple, produciéndose el proceso de liofilización por debajo de este punto triple.
Figura 4. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de matrices porosas del Ejemplo 1 (4a), del Ejemplo 2 (4b) y del Ejemplo 3 (4c) antes de la siembra celular. Proliferación tisular sobre matrices del Ejemplo 1 (4d), del Ejemplo 2 (4e) y del Ejemplo 3 (4f).
Figura 5. Estudios de porosimetría de mercurio (Hg) antes (A) y después (B) del proceso de esterilización de la matriz dada a conocer en el Ejemplo 1. Datos de la porosidad total y del área superficial total.
Figura 6. Estudios de porosimetría de mercurio (Hg) antes (A) y después (B) del proceso de esterilización de la matriz dada a conocer en el Ejemplo 2. Datos de la porosidad total y del área superficial total.
Figura 7. Estudios de porosimetría de mercurio (Hg) antes (A) y después (B) del proceso de esterilización de la matriz dada a conocer en el Ejemplo 3. Datos de la porosidad total y del área superficial total. Figura 8. Espectros de FTIR (espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier) de muestras antes (línea superior) y después (línea inferior) del procedimiento de esterilización correspondientes a matrices de los Ejemplos 1 (8A), 2 (8B) y 3 (8C), respectivamente.
Figura 9. La figura muestra el consumo de glucosa (expresado como g/l) en distintos tiempos de ensayo (expresados como días) por las células de mamífero sembradas en la matriz obtenida en los Ejemplos 1 a 3 de la invención (Ejemplo 1, Ejemplo 2 y Ejemplo 3, en la leyenda) en comparación con la glucosa inicial (inicial, en la leyenda) y los controles de cultivo en ausencia de las matrices de la invención (control, en la leyenda).
EJEMPLOS
Siguen, a continuación, ejemplos de la invención por medio de ensayos llevados a cabo por los inventores, que evidencian la eficacia del producto de la invención. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no debe considerarse que limiten el alcance de la misma.
Ejemplo 1. Síntesis de la matriz, mediante el método de la presente invención, que comprende quitosán como polímero biocompatible
En un método típico de producción de la matriz tridimensional macroporosa comestible y esterilizable que será igualmente válido para otros polímeros biocompatibles y mezclas de los mismos, se disolvieron MEM Eagle comercial (medio mínimo esencial de Eagle) con BSS de Earle con aminoácidos no esenciales y L- glutamina, sin calcio en polvo (que oscila entre 0-600 mg, para lograr 0-200 % en relación con el peso de quitosán, más preferentemente 75 mg, 10 % en relación con el peso de quitosán), en ácido acético (0,1 M, 50 mi) y se añadió lentamente quitosán (750 mg, 1,5 %) con agitación. La mezcla fue agitada hasta que se obtuvieron soluciones homogéneas (65 °C, 2 horas) y se vertió la solución en moldes para proporcionar la forma y las dimensiones deseadas. Todas las muestras fueron congeladas a -20 °C durante 24 horas y liofilizadas a -40 °C durante 72 horas, a una presión de 26,3 Pa (0,263 mbar).
Este es un método para la fabricación de matrices con formas controladas, que serán determinadas por el receptáculo en donde se lleve a cabo el proceso.
Se retiraron las matrices de los moldes y fueron colocadas en el interior del horno a 135 °C durante 1 hora sin ventilación (el curado comienza precalentando el horno a 45 °C; en cuanto el horno alcanza 135 °C comienza el tiempo; después de 1 hora se deja que las matrices alcancen la temperatura ambiente en el interior del horno; lleva aproximadamente 1 h 30 minutos. En esta etapa, se lavaron las matrices con agua milliQ (3x100 mi durante 15 minutos), NaHCC>3 0,1 M (3x100 mi durante 15 minutos) y agua (3x100 mi durante 15 minutos).
Los resultados muestran que la matriz de la invención que comprende polvo de MEM (0 %) pierde su consistencia cuando es sumergida en agua. Por lo tanto, parece que la temperatura y el tiempo de reticulación no fueron suficientes para obtener una matriz con las propiedades deseadas en cuanto a la resistencia mecánica y el aspecto. Sin embargo, los resultados muestran que las matrices restantes que comprenden distintas concentraciones de MEM (1 %, 8 %, 16 %, 33 %, 133 %, 200 %, más preferentemente 8 %) presentan una buena consistencia y no pierden su forma. Estos datos indican que los componentes del MEM también actúan como reticulantes, proporcionando consistencia a las matrices, frangibles de lo contrario.
Posteriormente, se esterilizaron las matrices con una concentración de MEM del 8 % en un autoclave a 121 °C, a 105 kPa (1 ,05 bar), durante 20 minutos y fueron sometidas a ensayo. Las matrices son estables, y se ha producido cierto grado de reticulación debido a que las matrices no aumentan excesivamente de volumen; es decir, la reticulación reduce el aumento de volumen.
La macroporosidad de estas matrices de la invención que tienen un porcentaje en peso/volumen del polímero quitosán (1,5 %), podría controlarse y muestra un volumen poroso elevado y una porosidad total de un 90 % dando lugar a muestras similares a espuma. La matriz optimizada presenta un volumen y un tamaño elevados de macroporosidad interconectada en el intervalo de 1-500 pm como puede observarse mediante formación de imágenes digitales (Fig. 1a) y SEM (Fig. 4a).
En la Fig. 5 se muestra el análisis de porosidad por intrusión de Hg (mercurio) de la matriz obtenida en el presente ejemplo. Se utiliza esta técnica para analizar la porosidad conectada total, el volumen de los poros, la distribución del tamaño de poro y el área superficial de materiales sólidos y en polvo. El instrumento, conocido como porosímetro, emplea una cámara a presión para obligar al mercurio a introducirse en los vacíos en un sustrato poroso. Según se aplica presión, el mercurio llena primero los poros más grandes. Según aumenta la presión, el llenado prosigue a poros cada vez más pequeños. Tanto los poros interparticulares (entre las partículas individuales) como los poros intraparticulares (en la propia partícula) pueden caracterizarse utilizando esta técnica. Se monitoriza el volumen de mercurio que ha entrado en la muestra mediante un cambio de capacitancia en una célula analítica capilar revestida con una capa de metal denominada penetrómetro. Se mantiene la muestra en una sección de la célula penetrométrica, que está disponible en una variedad de volúmenes para acomodar polvo o trozos sólidos intactos. El tamaño de la muestra está limitado a unas dimensiones de aproximadamente 2,5 cm de longitud por 1,5 cm de anchura. Se utilizó esta potente técnica para analizar el cambio en la naturaleza porosa de la matriz antes (Fig. 5A) y después (Fig. 5B) de la esterilización de los trozos. Como puede verse en la Fig. 5, los resultados muestran una ligera reducción del volumen de poro total y del área superficial total debido a la contracción con respecto a la etapa de esterilización. No obstante, los valores después de la esterilización son más que adecuados para la aplicación que muestra el correcto intervalo de volumen de poro y un área superficial elevada disponible para una colonización celular.
Para demostrar que se han producido modificaciones no químicas durante un procedimiento de esterilización con vapor caliente que podrían poner en peligro la idoneidad de las matrices para un cultivo celular, se han analizado las matrices antes y después de la esterilización mediante FTIR (espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier). La FTIR es una técnica analítica para identificar materiales orgánicos (y, en algunos casos, inorgánicos). Esta técnica mide la absorción de radiación infrarroja por el material de la muestra en función de la longitud de onda. Las bandas de absorción infrarroja identifican componentes y estructuras moleculares. Como puede verse en la Fig. 8A, no hay cambios en la forma ni en la posición del espectro de bandas antes y después del proceso de esterilización, demostrando la idoneidad de la identidad química de las matrices.
Ejemplo 2. Síntesis de la matriz, mediante el método de la invención, que comprende alginato como polímero biocompatible y revestida con roN-e-lisina
Se añadió lentamente a agua (200 mi) sal sódica de ácido algínico (Sigma- Aldrich) a una concentración de 2,0 g con una agitación enérgica. Se agitó la mezcla a 50 °C durante 3 horas hasta que se obtuvo una solución homogénea y transparente. Se dejó que la solución alcanzase la temperatura ambiente.
A continuación, se vertió la solución en moldes para proporcionar la forma y las dimensiones deseadas. Todas las muestras fueron congeladas a -20 °C durante 24 horas y liofilizadas a -40 °C durante 72 horas a una presión de 26,3 Pa (0,263 mbar).
Las matrices liofilizadas obtenidas fueron retiradas de los moldes y sumergidas en una solución acuosa de cloruro cálcico al 2 % (4 g, 200 mi) (se puede utilizar cualquier otra solución acuosa, tal como, sulfato cálcico, carbonato cálcico, gluconato cálcico, citrato de calcio) en agua milliQ (200 mi) durante 15 minutos para provocar la reticulación del polímero. En esta solución, las matrices de alginato se gelificaron inmediatamente y fueron lavadas exhaustivamente con agua milliQ para eliminar los iones de calcio no unidos. Entonces, se sumergieron las matrices en una solución de poli-épsilon-lisina al 0,2 % (1 ,0 g en 500 mi) durante 16 horas, y luego fueron lavados exhaustivamente con agua milliQ. Se volvieron a congelar las matrices a -20 °C durante 24 horas y fueron liofilizadas a -40 °C durante 72 horas y a una presión de 26,3 Pa (0,263 mbar), y, posteriormente, se almacenaron hasta ser utilizadas.
Las matrices liofilizadas fueron calentadas posteriormente en un horno a 115 °C durante 1 hora sin ventilación (el curado comienza precalentando el horno a 45 °C; en cuanto el horno alcanza 115 °C comienza el tiempo; después de 1 hora se deja que las matrices alcancen la temperatura ambiente en el interior del horno; lleva aproximadamente 1 h 30 minutos).
Posteriormente, se esterilizaron las matrices en un autoclave a 121 °C durante 20 minutos a 105 kPa (1 ,05 bar).
La matriz optimizada presenta un volumen y un tamaño elevados de macroporosidad interconectada en el intervalo de 1-500 pm, como puede observarse mediante formación de imágenes digitales (Fig. 1b) y SEM (Fig. 4b).
Según se muestra en la Fig. 6, el análisis de la porosidad por intrusión de Hg (mercurio), antes (Fig. 6A) y después (Fig. 6B) de esterilizar los trozos, muestra una ligera reducción del volumen total del poro y del área superficial total. No obstante, los valores después de la esterilización son muy adecuados para la aplicación que muestra el correcto intervalo de volumen de poro y un área superficial elevada disponible para una colonización celular.
Como puede verse en la Fig. 8B, no hay cambios en la forma ni en la posición del espectro de bandas antes y después del proceso de esterilización, lo que demuestra la idoneidad de la identidad química de las matrices.
Ejemplo 3. Síntesis de la matriz, mediante el método de la invención, que comprende quitosán como polímero biocompatible y revestida con roN-e-lisina
Se mezcló quitosán (9,0 g) de calidad alimentaria con ácido acético (0,1 M, 600 mi) con agitación suave a 40 °C hasta que se disolvió el quitosán. Se añadió en porciones poli-s-L-lisina (360 mg en polvo; Mw: 1000-300000) a la anterior solución con agitación enérgica y se calentó la mezcla hasta 65 °C durante 2 horas y 30 minutos para obtener una solución homogénea y transparente.
Se dejó que la anterior solución alcanzase la temperatura ambiente y fue vertida en los moldes para proporcionar a las matrices la forma y el tamaño deseados (Fig. 1c). Se congeló la solución en el interior de los moldes a -20 °C durante 24 horas y fue liofilizada a -40 °C durante 72 horas y a una presión de 26,3 Pa (0,263 mbar).
Se retiraron las matrices de los moldes y fueron gelificadas con etanol absoluto (2 litros) durante 4 horas. Se lavaron las matrices con agua de alta pureza y se sumergieron las matrices en una solución de NaOH (1 %) durante 3 horas. Se lavaron exhaustivamente las matrices con agua de alta pureza hasta que el lixiviado alcanzó un pH neutro (6, 5-7, 5). Se congelaron las matrices formadas de esta manera a -20 °C durante 24 horas y fueron liofilizadas (72 horas, -40 °C y P = 26,3 Pa (0,263 mbar)). Se utilizaron las matrices directamente sin ningún tratamiento adicional o, de forma alternativa, pueden ser curadas. Las matrices curadas fueron sometidas a un tratamiento térmico introduciéndolas en el interior de un horno a 110 °C durante 1 hora sin ventilación (el curado comienza precalentando el horno a 45 °C; en cuanto el horno alcanza 110 °C comienza el tiempo; después de 1 hora se deja que las matrices alcancen la temperatura ambiente en el interior del horno; lleva aproximadamente 1 h 30 minutos). A continuación, se esterilizaron las matrices en un autoclave a 121 °C durante 20 minutos a 105 kPa (1,05 bar). La matriz optimizada presenta un volumen y un tamaño elevados de macroporosidad interconectada en el intervalo de 1-500 pm como puede observarse mediante formación de imágenes digitales (Fig. 1c) y SEM (Fig. 4c).
Según se muestra en la Fig. 7, el análisis de la porosidad por intrusión de Hg (mercurio), antes (Fig. 7A) y después (Fig. 7B) de esterilizar los trozos, muestra una ligera reducción del volumen total del poro y del área superficial total. No obstante, los valores después de la esterilización son muy adecuados para la aplicación, lo que muestra el correcto intervalo de volumen de poro y un área superficial elevada disponible para una colonización celular.
Como puede verse en la Fig. 8C, no hay cambios en la forma ni en la posición del espectro de bandas antes y después del proceso de esterilización, lo que demuestra la idoneidad de la identidad química de las matrices.
Ejemplo 4. Cultivo de las matrices de los Ejemplos 1 a 3 obtenidas mediante el método de la invención con células no humanas en un biorreactor
Para verificar que las matrices a base de quitosán (Ejemplos 1 y 3) y las matrices a base de alginato (Ejemplo 2) obtenidas mediante el método de la invención son útiles para obtener carne cultivada, los inventores cultivaron células vivas en todas las matrices mencionadas de la invención en un biorreactor.
Con este fin, se esterilizaron las matrices de los Ejemplos 1 , 2 y 3 en un autoclave a 121 °C durante 20 minutos a 105 kPa (1 ,05 bar) y fueron sumergidas de forma estéril en un volumen final de medio de cultivo de 2 litros (Gibco™ OptiPRO™). A continuación, se inoculó una densidad celular conocida (13.000 células/cm2) en las matrices mencionadas y se mantuvieron bajo cultivo durante periodos prolongados de tiempo (10 días o más) en un biorreactor de perfusión de 48 horas. Las células inoculadas fueron principalmente células de mioblastos porcinos, de extracción patentada obtenidas de biopsias musculares y extraídas siguiendo el protocolo descrito en JM Spinazzola et al., Bio Protoc. 5 de noviembre de 2017; 7(21). Las condiciones de cultivo para una proliferación celular adecuada requieren mantener una temperatura de 37 °C y un valor de pH de 7, 1-7,4. Adicionalmente, se mantiene un suministro continuo de gases, de forma que la concentración de oxígeno disuelto varíe entre 20 % - 30 %. Después de un periodo de 10 días, se retiraron las matrices del biorreactor y fueron deshidratadas con etanol para llevar a cabo una visualización por SEM (microscopía electrónica de barrido). Las imágenes de SEM (Figuras 4 d, e y f), muestran toda la proliferación tisular en la matriz del Ejemplo 1 , del Ejemplo 2 y del Ejemplo 3, respectivamente.
Durante el periodo de incubación de 10 días, se midió el consumo de glucosa con un analizador Bioprofile con un biosensor de glucosa. Los biosensores de glucosa son electrodos amperométricos que tienen enzimas inmovilizadas en sus membranas. En presencia de oxígeno y el sustrato que está siendo medido, estas membranas enzimáticas producen peróxido de hidrógeno (H2O2), que es entonces oxidado en un ánodo de platino mantenido a un potencial constante. El flujo resultante de electrones y el cambio de corriente son proporcionales a la concentración de glucosa de la muestra. Las mediciones fueron llevadas a cabo en distintos tiempos de ensayo como una medición indirecta de la proliferación y de la formación de tejido sobre la matriz de la presente invención. Los datos obtenidos se muestran en la Fig. 9. Los resultados muestran la existencia de consumo de glucosa por parte de las células primarias de mioblastos porcinos sembradas en la matriz de la invención con el paso del tiempo (1- 10 días de ensayo), dado que se observa una reducción en los valores de concentración de glucosa en comparación con los niveles iniciales de glucosa del medio de cultivo (aproximadamente 4 g/l). Se realizaron controles positivos cada día de ensayo.
Por lo tanto, los resultados muestran que las matrices de la presente invención son útiles para el cultivo celular y para obtener tejido con contenido nutritivo elevado y/o carne cultivada in vitro.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una matriz tridimensional macroporosa comestible y esterilizable por vapor caliente, de ingeniería tisular, que comprende un polímero biocompatible de origen natural o sintético, o cualquier variante del mismo, en donde el polímero biocompatible es preferentemente de origen natural.
2. La matriz según la reivindicación 1 en donde selecciona el polímero natural o cualquier variante del mismo se selecciona de la lista que consiste en: dextrano, alginato, quitosán, almidón, heparina, sulfato de heparina, pululano, celulosa, hemicelulosa, glucomanano, agar, sulfato de condroitina, gelatina, quitina, polinucleótidos, un polisacárido, un glicosaminoglicano, poliésteres naturales o cualquier combinación de los mismos; preferentemente, el polímero natural o cualquier variante del mismo se selecciona entre quitosán y/o alginato.
3. La matriz según la reivindicación 1 en donde el polímero sintético o cualquier variante del mismo se selecciona de la lista que consiste en: ácido poliláctico, ácido poliglicólico, ácido poli(láctico-co-glicólico), polihidroxialcanoatos, bioésteres o cualquier combinación de los mismos.
4. La matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde los macroporos son jerárquicos y están interconectados y tienen un tamaño medio de poro que oscila entre 1 pm y 10000 pm, preferentemente entre 50 y 1000 pm, más preferentemente entre 100 pm y 1000 pm, o aún más preferentemente entre 100 pm y 500 pm.
5. La matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde está esterilizada alternativamente, por un proceso físico o químico, preferentemente un proceso de esterilización físico.
6. La matriz según la reivindicación 5 en donde la esterilización física se selecciona de la lista que consiste en: calor seco, tindalización y radiación ionizante o no ionizante.
7. La matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde, además, comprende células vivas no humanas que están distribuidas de manera homogénea por toda la matriz.
8. La matriz según la reivindicación 7 en donde las células vivas no humanas son células adherentes, preferentemente seleccionadas de la lista que consiste en: células musculares, células endoteliales, células adiposas, hepatocitos, cardiomiocitos o similares.
9. La matriz según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 8 que, además, comprende al menos un aditivo, al menos una molécula bioactiva, al menos un agente reticulante y/o cualquier combinación de los mismos.
10. La matriz según la reivindicación 9 en donde el aditivo se selecciona de la lista que consiste en: aroma, un potenciador del aroma, un colorante, un potenciador del color, sales, reguladores de la acidez, espesantes, emulsionantes, estabilizantes, un potenciador nutricional, probióticos, prebióticos, saponinas, antioxidantes, ácidos grasos esenciales, minerales y cualquier combinación de los mismos.
11. La matriz según la reivindicación 9 en donde la molécula bioactiva se selecciona de la lista que consiste en: proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas, cadherinas, selectinas o integrinas; fibronectinas, poli-L-ornitina, colágeno, vitronectinas, lectina, poli-ornitina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, péptidos cíclicos, péptidos que contienen RGD, péptidos que contienen RGDS o cualquier combinación de los mismos, preferentemente la molécula bioactiva es poli-L-lisina, más preferentemente es poli-s-lisina.
12. La matriz según la reivindicación 9 en donde el agente reticulante se selecciona de la lista que consiste en grupos amina, grupos hidroxilo, grupos carbonilo, grupos aldehido, grupos carboxilato, grupos carbonato, grupos carboxilo, grupos carboxamida, grupos imina, grupos imida, grupos tiol, iones inorgánicos y cualquier combinación de los mismos.
13. La matriz según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 12 que está en forma de hidrogel.
14. El uso de la matriz según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 13 en la producción in vitro de un tejido y/o una carne cultivada.
15. El uso según la reivindicación 14 en donde la carne cultivada comprende una pluralidad de células adherentes, preferentemente células musculares y, opcionalmente, comprende, además, una pluralidad de células satélite, células estromales, células de fibroblastos, células de mioblastos, células endoteliales, células adiposas, hepatocitos, cardiomiocitos o combinaciones cualesquiera, o cualquier combinación de los mismos.
16. El uso según la reivindicación 15 en donde las células pertenecen a una fuente animal seleccionada de la lista que consiste en: mamíferos, preferentemente porcino, bovino, ovino, caballo, perro, gato; aviar; reptil; pez; anfibios; cefalópodos, crustáceos, o cualquier combinación de los mismos.
17. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en donde la matriz no tiene que ser eliminada de la carne cultivada final lista para su consumo.
18. El uso in vitro de la matriz según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 como portadora.
19. Un método de obtención de una carne de cultivo, en donde el método comprende cultivar una pluralidad de células vivas no humanas, preferentemente células musculares, con una pluralidad de matrices según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en presencia de un medio de cultivo nutriente adecuado.
20. Un método de obtención de una carne de cultivo según la reivindicación 19 en donde el cultivo tiene lugar en un biorreactor.
21. Una carne cultivada que comprende una pluralidad de matrices según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y una pluralidad de células vivas no humanas, preferentemente células musculares y que, opcionalmente, comprende, además, una pluralidad de células satélite, células de mioblastos, células de miofibroblastos, células de fibroblastos, células endoteliales, células adiposas, hepatocitos, cardiomiocitos o cualquier combinación de los mismos.
22. Una carne cultivada según la reivindicación 21 que, además, comprende al menos un aditivo seleccionado del grupo que consiste en un aroma, un potenciador del aroma, un colorante, un potenciador del color, un potenciador nutricional o cualquier combinación de los mismos.
23. Una carne cultivada según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22, en donde la carne cultivada comprende una pluralidad de matrices colonizadas inmediatamente adyacentes entre sí.
24. Una carne cultivada según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde la carne cultivada está sustancialmente libre de microorganismos patógenos.
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