WO2021241885A1 - 세포 유래 베시클 제조 방법 및 이의 활용 - Google Patents

세포 유래 베시클 제조 방법 및 이의 활용 Download PDF

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WO2021241885A1
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배신규
오승욱
한동우
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주식회사 엠디뮨
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell-derived vesicle, and more particularly, to a method for producing a cell-derived vesicle using a cell extruder and a syringe-type cell extruder for effectively producing a cell-derived vesicle. .
  • the secretome contains various bioactive factors that control the behavior of cells. Because it contains 'extracellular vesicle', research on its components and functions is being actively conducted.
  • extracellular vesicles Cells release various membrane types of ERs to the extracellular environment, and these ERs are commonly referred to as extracellular vesicles.
  • the extracellular vesicles are also called cell membrane-derived ERs, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, and the like, and in some cases are used separately from exosomes.
  • Exosomes are endoplasmic reticulum with a size of several tens to hundreds of nanometers made up of a double phospholipid membrane identical to the structure of the cell membrane, and contain proteins, mRNA, miRNA, etc. called exosome cargo inside.
  • Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, and these signaling factors are known to be cell type-specific and differentially regulated according to the environment of secretory cells.
  • Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells.
  • Exosomes contain specific genetic material and bioactive factors according to the nature and state of the cells from which they are derived. In the case of proliferating stem cell-derived exosomes, they control cell behavior such as cell migration, proliferation and differentiation, and reflect the characteristics of stem cells related to tissue regeneration.
  • Ultracentrifugation is the most widely used method so far to isolate exosomes or extracellular vesicles, but has the disadvantages of low yield, time-consuming, labor-intensive, and expensive equipment. In addition, ultracentrifugation has a disadvantage in that it may damage exosomes or extracellular vesicles during the separation process, which may interfere with subsequent analysis processes or applications.
  • Ultrafiltration is used together with ultracentrifugation to increase the purity of exosomes or extracellular vesicles, but there is a problem in that exosomes or extracellular vesicles adhere to the filter, resulting in a low yield after separation.
  • the immunoaffinity separation method is a method of separating the antibody by attaching it to exosomes or extracellular vesicles, and has the advantage of high specificity. and is not suitable for scale-up.
  • exosome separation kits such as exosome precipitation, total exosome isolation kit, or polymer based precipitation are commercially available. Although it is sold, it is easy to use and expensive, so it can be used to isolate exosomes or extracellular vesicles at a laboratory level, but there is a problem that is not suitable for isolating and purifying exosomes or extracellular vesicles in large quantities.
  • the cell-derived vesicles depended on the ratio of the penetration area through which the cell suspension passes to the area of the membrane filter, the number of intermediate filters, and the extrusion rate.
  • the present invention was completed by confirming that the production efficiency of the cicle was changed, and by confirming that the extrusion efficiency was significantly increased at a specific area ratio, a specific number of intermediate filters, and a specific extrusion speed.
  • the present invention includes the step of extruding a sample containing cells into a cell extruder including a support, an intermediate filter and a membrane filter, wherein the support supports the intermediate filter and the membrane filter.
  • a method for producing a cell-derived vesicle comprising a penetrating portion through which a sample containing cells passes through a central portion, and wherein the ratio (S2/S1) of the area (S2) of the membrane filter to the area of the penetrating portion (S1) is 50 to 300; to provide.
  • the present invention is 1 to 10 intermediate filters centering on the membrane filter; O-ring; a support having a penetrating portion formed in the center; external casting; And the syringe is symmetrically connected, the ratio of the area (S2) of the membrane filter to the area (S1) of the penetration part of the support (S2/S1) is 50 to 300, it provides a cell extruder.
  • cell-derived vesicle manufacturing method and the cell extruder according to the present invention By using the cell-derived vesicle manufacturing method and the cell extruder according to the present invention, cell-derived vesicles can be manufactured in a stable, economical, and mass-produced manner.
  • FIG. 1 is a view showing a syringe-type cell extruder.
  • FIG. 2 is a view showing the area of the area where the membrane filter touches and the area of the penetrating portion through which the cell suspension passes in the support portion of the extruder.
  • FIG. 3 is a view showing the support and O-rings used in the experimental group in which the penetration area and the membrane filter area were different.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating the pressure applied to the membrane filter and the amount of extruded sample when cells are extruded from the experimental group in which the penetration area and the membrane filter area are different.
  • FIG. 5 is a diagram showing the pressure applied to the extruder, the number of extruded cell suspensions and extruded cells, and the size of extruded cell-derived vesicles when the number of intermediate filters used during extrusion is changed.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the cell suspension diffusion effect according to the number of intermediate filters.
  • FIG. 7 is a diagram showing the size of cell-derived vesicles, polydispersity index (PDI), and the concentration of cell vesicles in the extruded solution according to the extrusion rate.
  • PDI polydispersity index
  • the present invention includes extruding a sample containing cells into a cell extruder including a support, an intermediate filter and a membrane filter, wherein the support supports the intermediate filter and the membrane filter, and the sample containing cells in the center of the support includes a penetrating portion, and the ratio (S2/S1) of the area (S2) to the area (S1) of the through-portion of the membrane filter is 50 to 300.
  • the term 'cell derived vesicles (CDV)' refers to vesicles artificially prepared from nucleated cells, and is separated from the cell membrane in almost all types of cells, and is a double phospholipid that is a structure of the cell membrane. It means that it has a membrane shape.
  • the cell-derived vesicle of the present invention may have a micrometer size, for example, 0.03 to 1 ⁇ m, and may be used interchangeably herein.
  • the cell-derived vesicle of the present invention is distinguished from the naturally secreted vesicle, and the 'vesicle' of the present invention is separated from the inside by a lipid double membrane composed of the cell membrane component of the cell from which it is derived, and the cell membrane lipid of the cell It has a cell membrane protein, nucleic acid, and cell components, and is smaller than the original cell, but is not limited thereto.
  • sample containing cells may be a sample containing nucleated cells or transformed cells thereof, and cells capable of producing vesicles may be samples containing without limitation.
  • the membrane filter may be used without limitation as long as it has a filterable membrane structure having a pore size of 0.1 to 10 ⁇ m, and preferably a polycarbonate membrane filter.
  • the intermediate filter is a filter selected from the group consisting of polyester, nylon, polypropylene, polyurethane, acrylic fiber, vinylon, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, wool, silk, cotton, hemp and rayon. It may be a filter, preferably a polyester material.
  • the intermediate filter having a thickness of 100 ⁇ m was stacked so that the total thickness of the stacked intermediate filter was 100 ⁇ m, 500 ⁇ m or 1000 ⁇ m, but the single or stacked total thickness was 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • a single or stacked intermediate filter may be used without limitation, and preferably 4 to 6 intermediate filters having a thickness of 90 to 110 ⁇ m may be stacked and used, or a single or stacked total thickness It may be to use an intermediate filter of 360 to 660 ⁇ m.
  • the support serves to support the membrane filter and the intermediate filter, and any object having a structure including a penetrating portion through which the cell suspension passes through the central portion of the support may be used without limitation.
  • the ratio (S2/S1) of the area (S2) of the membrane filter to the area (S1) of the penetration part may be 50 to 300, preferably, the ratio (S2/S1) may be 70 to 170 have.
  • the ratio (S2/S1) is 70 to 170
  • 4 to 6 intermediate filters having a thickness of 90 ⁇ m to 110 ⁇ m may be stacked and used, and the total of the intermediate filters by stacking alone or stacked It may be used so that the thickness is 360 ⁇ m to 660 ⁇ m.
  • the extruding may be extruding at an extrusion rate of 10 to 90 ml/min, preferably extruding at an extrusion rate of 60 to 90 ml/min.
  • the yield of cell-derived vesicles may be the highest, and when the extruding step is extruded at 60 ml/min or more, the polydispersity index (PDI) of the extruded sample ) may be 0.3 or less, which means that the size of the extruded cell-derived vesicle is constant, and the utilization of the cell-derived vesicle is excellent.
  • PDI polydispersity index
  • cell-derived vesicles are prepared by applying the extrusion rate of the present invention, it may be possible to manufacture cell-derived vesicles with high yield and high quality.
  • cell-derived vesicles can be manufactured, and in this case, stable cell extrusion is possible and a large amount of samples can be prepared. It may be one that can be extruded, and it may be one capable of producing high-yield and high-quality cell-derived vesicles.
  • the present invention provides a method for preparing a cell-derived vesicle, comprising extruding a sample containing cells into a cell extruder including a support, an intermediate filter and a membrane filter at an extrusion rate of 60 to 90 ml/min.
  • the yield of the cell-derived vesicle may be the highest, and the extruding step is 60 ml
  • the polydispersity index (PDI) of the extruded sample may be 0.3 or less, which means that the size of the extruded cell-derived vesicle is constant, and thus the utilization of the cell-derived vesicle is excellent.
  • the present invention comprises the step of extruding a sample containing cells into a cell extruder comprising a support, an intermediate filter and a membrane filter, wherein the intermediate filter has a total thickness of 360 to 660 ⁇ m, a method for producing a cell-derived vesicle to provide.
  • the sample containing cells reaches the membrane filter in a larger area than the resistance received while passing through the intermediate filter.
  • the effect of reducing the pressure caused by this is large, the load on the membrane filter is lowered, and the extrusion efficiency for manufacturing the cell-derived vesicle may be increased.
  • the present invention provides a syringe-type cell extruder in which an intermediate filter, an O-ring, a support, an outer casting and a syringe are sequentially and/or symmetrically connected to each other on the basis of a membrane filter.
  • FIG. 1 is an exploded view of the cell extruder according to the present invention, and the cell extruder can be completed by recombining them in the order shown.
  • the cell extruder includes an intermediate filter, an O-ring for fixing the membrane filter and the intermediate filter, a support including a penetrating portion through which a sample containing cells passes through the center, and a syringe.
  • a syringe in which a sample including an external casting and cells is dispensed is sequentially and/or symmetrically configured based on the membrane filter, which blocks the remaining components except for the outside.
  • the ratio (S2/S1) of the area (S2) of the membrane filter to the area (S1) of the penetration part may be 50 to 300, preferably, the ratio (S2/S1) may be 70 to 170 have.
  • the intermediate filter may be constructed by stacking 4 to 6 intermediate filters having a thickness of 90 ⁇ m to 110 ⁇ m, or an intermediate filter so that the total thickness of the single or stacked intermediate filters is 360 ⁇ m to 660 ⁇ m. It can be configured alone or by stacking them.
  • the intermediate filter may be constructed by stacking 4 to 6 intermediate filters having a thickness of 90 ⁇ m to 110 ⁇ m, or an intermediate filter so that the total thickness of the single or stacked intermediate filters is 360 ⁇ m to 660 ⁇ m. It can be configured alone or by stacking them.
  • the ratio (S2/S1) of the area (S2) of the membrane filter to the area (S1) of the penetration part may be 50 to 300, preferably, the ratio (S2/S1) may be 70 to 170 have
  • the thickness and number of the intermediate filters of the present invention when the cell-derived vesicle is manufactured with a cell extruder to which the ratio (S2/S1) is applied, an excessive load is not applied to the membrane filter during extrusion, and the sample containing cells has a larger area on the membrane filter than the resistance received while passing through the intermediate filter. It may be that the effect of reducing the pressure caused by reaching the vesicles is large, and the load on the membrane filter is lowered, thereby increasing the extrusion efficiency for the production of cell-derived vesicles.
  • Example 1 Comparison of cell extrusion efficiency according to the ratio of the support penetration area and the membrane filter area
  • a cell extruder for extruding cells to produce an extracellular vesicle was manufactured in the form of a syringe-type extruder equipped with a syringe pump.
  • the membrane filter whatman PC membrane filter 5 ⁇ m with a pore size of 5 ⁇ m was used.
  • the drain disc is a disk with a flat surface, used to prevent rupture of the membrane filter, and is made of a chemically inert polyester material with a thickness of 100 ⁇ m.
  • the syringe pump is designed to stop when a pressure of 50 psi or more is applied to the syringe pump.
  • the prepared syringe-type extruder is shown in FIG. 1
  • the support in the extruder is shown in FIG. 2 .
  • Extrusion efficiency was measured according to the set area ratio (S2/S1) of the through-portion and the membrane filter. Specifically, 30 mL of a cell suspension obtained by diluting human macrophage cell line U937 cells with a cell size of 9.8 ⁇ m in a phosphate buffer at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells/mL, as in the experimental group set above, the penetration area and membrane filter area in the support. was changed, and the number of intermediate filters was set to 5, extruded at a speed of 60 ml/min to the extruder prepared in Example 1.1, and the pressure applied to the extruder, the finally extruded cell suspension and the number of extruded cells were measured, The results are shown in Fig. 4. As shown in Fig.
  • the experimental groups were set up by setting the movement speed of the syringe pump to 10ml/min, 30ml/min, 60ml/min, and 90ml/min, the S2/S1 value was 156.25, and the Extrusion was performed in a cell extruder with a number of 5, a support, an intermediate filter, and a membrane filter, and the size of cell-derived vesicles, polydispersity index (PDI) and cell vesicles in the extruded solution according to the extrusion rate concentrations were compared, and the results are shown in FIG. 7 .
  • PDI polydispersity index
  • the size of the extruded cell-derived vesicles in each experimental group was measured to be about 180 to 210 nm. It was measured that the faster the PDI was, the higher the extrusion rate was, the more uniform the size of the cell-derived vesicles. In addition, it was confirmed that the production rate was improved by increasing the amount of cell-derived vesicles in the extrudate when extruding at a rate of 60 ml/min or more. In particular, when extruding at 60 ml/min, the concentration of cell-derived vesicles in the extruded solution was confirmed to be 5.45 x 10 10 /ml, and it was confirmed that it exhibited the highest production rate.

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Abstract

본 발명은 세포 유래 베시클을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포 압출기를 이용하여 세포 유래 베시클을 제조하는 방법 및 세포 유래 베시클을 효과적으로 제조하기 위한 시린지 타입의 세포 압출기에 대한 것이다. 본 발명에 따른 세포 유래 베시클 제조방법 및 세포 압출기를 이용하면, 안정적이면서도, 경제적이며, 대량생산이 가능한 방식으로 세포 유래 베시클을 제조할 수 있다.

Description

세포 유래 베시클 제조 방법 및 이의 활용
본 발명은 세포 유래 베시클을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포 압출기를 이용하여 세포 유래 베시클을 제조하는 방법 및 세포 유래 베시클을 효과적으로 제조하기 위한 시린지 타입의 세포 압출기에 대한 것이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동을 제어하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 나노소포체인 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(extracellular vesicle)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다.
이와 같은 엑소좀 또는 세포외소포체를 분리하는 종래 기술로는 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등이 있다.
초원심분리법(ultracentrifugation)은 엑소좀 또는 세포외소포체를 분리하는데 지금까지 가장 널리 사용되었던 방법이나, 수율이 낮고, 분리하는데 시간이 많이 소요되며 노동집약적이고, 비싼 기기가 필요하다는 단점이 있다. 또한, 초원심분리법은 분리과정에서 엑소좀 또는 세포외 소포체에 손상을 줄 수 있어 후속 분석 과정이나 응용에 지장을 줄 수 있는 단점이 있다.
초미세여과법(ultrafiltration)은 초원심분리법과 함께 사용되어, 엑소좀 또는 세포외소포체의 순도를 높일 수 있지만, 엑소좀 또는 세포외소포체가 필터에 달라붙어 분리 후의 수율이 낮다는 문제점이 있다.
또한, 면역친화성 분리법은 항체를 엑소좀 또는 세포외소포체에 붙여서 분리하는 방법으로 특이도가 높은 장점이 있지만, 항체를 만드는 과정과 분리 후 항체를 제거하는 과정이 필요하고 비용이 많이 드는 단점이 있으며 스케일-업(scale-up)에 부적합한 방식이다.
한편, 최근에는 엑소좀을 분리하는 방법으로 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등의 다양한 엑소좀 분리 키트가 상업적으로 판매되고 있으나, 사용이 간편한 대신 시약값이 고가여서 실험실 수준에서 엑소좀 또는 세포외소포체를 분리하기 위해 사용될 수는 있어도 대량으로 엑소좀 또는 세포외소포체를 분리 및 정제하기에는 적합하지 않은 문제가 있다.
무엇보다도 엑소좀 또는 세포외소포체의 분리과정에서 문제가 되는 것은 수율이 낮거나, 엑소좀 또는 세포외소포체의 분리 및 정제에는 시간이 많이 소모되고 번거로우며, 비용이 많이 소모된다. 또한, 순도를 높이기 위해 개발된 기존의 분리 방법은 스케일-업(scale-up)을 어렵게 하고 GMP(Good Manufacturing Practice)에 부적합한 문제가 있다.
따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 엑소좀 또는 세포외소포체를 효율적으로 분리 및 정제할 수 있는 기술에 대한 요구가 꾸준히 계속되고 있다.
본 발명은 세포 유래 베시클을 압출하여 제조하는 공정을 개선하는 방법에 대하여 연구하던 중, 세포 부유액이 관통하는 관통부 면적과 멤브레인 필터의 면적 비율, 중간 필터의 수 및 압출 속도에 따라 세포 유래 베시클의 생산 효율이 달라지는 것을 확인하고, 특정 면적 비율, 중간 필터의 특정 수, 특정 압출 속도에서 압출 효율이 현저히 증가함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포 유래 베시클을 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지지체, 중간 필터 및 멤브레인 필터를 포함하는 세포 압출기에 세포를 포함하는 시료를 압출하는 단계를 포함하며, 상기 지지체는 상기 중간 필터와 멤브레인 필터를 지지하는 것으로 지지체 중앙부에 세포를 포함하는 시료가 관통하는 관통부를 포함하고, 상기 멤브레인 필터의 면적 (S2)과 관통부 면적(S1)의 비(S2/S1)는 50 내지 300인, 세포 유래 베시클 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 멤브레인 필터를 중심으로 1 내지 10개의 중간 필터; 오 링(O-ring); 중앙에 관통부가 형성된 지지체; 외부 캐스팅; 및 시린지가 대칭적으로 연결된 것이며, 상기 멤브레인 필터의 면적(S2)과 상기 지지체의 관통부 면적(S1)비(S2/S1)가 50 내지 300인, 세포 압출기를 제공한다.
본 발명에 따른 세포 유래 베시클 제조방법 및 세포 압출기를 이용하면, 안정적이면서도, 경제적이며, 대량생산이 가능한 방식으로 세포 유래 베시클을 제조할 수 있다.
도 1은 시린지 타입의 세포 압출기를 나타낸 도이다.
도 2는 압출기의 지지체 부위에서 멤브레인 필터가 닿는 부위의 면적과 세포 부유액이 지나가는 관통부의 면적을 나타낸 도이다.
도 3은 관통부 면적과 멤브레인 필터 면적을 달리한 실험군에 사용된 지지체 및 오 링(O ring)을 나타낸 도이다.
도 4는 관통부 면적과 멤브레인 필터 면적을 달리한 실험군에서 세포를 압출하였을 때, 멤브레인 필터에 걸리는 압력과 압출된 샘플의 양을 나타낸 도이다.
도 5는 압출시 사용되는 중간 필터의 수를 달리하였을 때, 압출기에 걸리는 압력, 최종적으로 압출된 세포부유액 및 압출된 세포수, 압출된 세포 유래 베시클의 크기를 나타낸 도이다.
도 6은 중간 필터 개수에 따른 세포 부유액 확산 효과를 나타낸 모식도이다.
도 7은 압출 속도에 따른 세포 유래 베시클의 크기, PDI(polydispersity index, 다분산지수) 및 압출액 내 세포 베시클의 농도를 나타낸 도이다.
본 발명은 지지체, 중간 필터 및 멤브레인 필터를 포함하는 세포 압출기에 세포를 포함하는 시료를 압출하는 단계를 포함하며, 상기 지지체는 상기 중간 필터와 멤브레인 필터를 지지하는 것으로 지지체 중앙부에 세포를 포함하는 시료가 관통하는 관통부를 포함하고, 상기 멤브레인 필터의 면적 (S2)과 관통부 면적(S1)의 비(S2/S1)는 50 내지 300인, 세포 유래 베시클 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 ‘세포 유래 베시클(Cell derived vesicles, CDV)’은 유핵세포에서 인위적으로 제조된 베시클을 말하며, 거의 모든 종류의 세포에서 세포막으로부터 유리되어, 세포막의 구조인 이중 인지질(phospholipid) 막 형태를 가지고 있는 것을 말한다. 본 발명의 세포 유래 베시클은 마이크로미터 크기, 예컨대 0.03~1㎛를 가질 수 있으며, 본 명세서 내에서 혼용되어 사용할 수 있다. 본 발명의 세포 유래 베시클은 자연적으로 분비되는 베시클과 구별되며, 본 발명의 ‘베시클'은 유래한 세포의 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질, 핵산 및 세포 성분 등을 가지고 있으며, 원래 세포보다 크기가 작은 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 “세포를 포함하는 시료”는 유핵세포 또는 이의 형질전환된 세포를 포함하는 시료일 수 있으며, 베시클의 제조가 가능한 세포는 제한없이 포함하는 시료일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 멤브레인 필터는 공극의 크기가 0.1 내지 10μm 로 여과가능한 형태의 막(membrane) 구조의 필터라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 폴리카보네이트 멤브레인 필터일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 중간 필터는 폴리에스터, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리우레탄, 아크릴섬유, 비닐론, 폴리염화비닐리덴, 폴리비닐아세테이트, 울, 실크, 면, 마 및 레이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 필터일 수 있으며, 바람직하게는 폴리에스터 소재인 필터일 수 있다.
본 발명에 있어서, 중간 필터의 개수를 달리하여 적층하면, 세포 유래 베시클의 제조 효율을 높일 수 있으며, 이는 적층된 중간 필터의 총 두께를 변화시키는 것과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 일 실시예에서는 바람직한 구현예로 두께가 100 μm인 중간 필터를 적층하여, 적층된 중간 필터의 총 두께를 100μm, 500μm 또는 1000μm가 되도록 제조하였으나, 단일 또는 적층된 총 두께가 10μm 내지 1000 μm의 두께 범위를 만족시키는 범위라면 중간 필터를 단일 또는 적층하여 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 두께가 90 내지 110μm의 중간 필터를 4개 내지 6개 적층하여 사용할 수 있고, 또는 단일 또는 적층된 총 두께가 360 내지 660μm인 중간 필터를 사용하는 것 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지지체는 멤브레인 필터 및 중간필터를 지지하는 역할을 하며, 지지체 중앙부에 세포 부유액이 관통하는 관통부를 포함하는 구조의 물체라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 멤브레인 필터의 면적(S2)과 관통부의 면적(S1)의 비(S2/S1)는 50 내지 300일 수 있으며, 바람직하게 상기 비(S2/S1)는 70 내지 170일 수 있다.
본 발명의 상기 비(S2/S1)가 적용된 세포 압출기로 세포 유래 베시클을 제조하면, 압출시 멤브레인 필터에 과도한 부하가 걸리지 않아 압출 안정성이 높아지고, 압출되는 시료의 양이 증가하여 세포 유래 베시클 제조를 위한 압출 효율이 증가하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 비(S2/S1)가 70 내지 170인 경우, 두께가 90μm 내지 110 μm인 중간필터를 4개 내지 6개 적층하여 사용하는 것일 수 있으며, 단독 또는 적층하여 중간필터의 총 두께가 360μm 내지 660μm이 되도록, 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 중간 필터의 두께 및 개수를 적용한 세포 압출기로 세포 유래 베시클을 제조하면, 중간 필터를 통과하면서 받는 저항력보다 세포를 포함한 시료가 멤브레인 필터에 넓은 면적으로 도달하여 발생하는 압력 감소의 효과가 커서, 멤브레인 필터에 대한 부하가 낮아져 세포 유래 베시클 제조를 위한 압출 효율이 증가하는 것 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 압출하는 단계는 10 내지 90 ml/분의 압출 속도로 압출하는 것 일 수 있으며, 바람직하게는 60 내지 90 ml/분의 압출 속도로 압출하는 것일 수 있다. 약 60 ml/분의 압출 속도로 압출하는 경우, 세포 유래 베시클의 수율이 가장 높은 것일 수 있으며, 상기 압출하는 단계를 60 ml/분 이상으로 압출하는 경우, 압출된 시료의 다분산지수(PDI)가 0.3 이하일 수 있으며, 이는 압출된 세포 유래 베시클의 크기가 일정한 것을 의미하는바, 세포 유래 베시클의 활용도가 우수하다.
본 발명의 압출 속도를 적용하여 세포 유래 베시클을 제조하면, 높은 수율과 고품질의 세포 유래 베시클의 제조가 가능한 것일 수 있다.
본 발명의 상기 비(S2/S1), 상기 중간 필터의 두께 및 개수 및 상기 압출 속도를 모두 적용하여, 세포 유래 베시클의 제조가 가능하며, 이 경우 안정적인 세포 압출이 가능하여 많은 양의 시료를 압출할 수 있는 것일 수 있으며, 높은 수율과 고품질의 세포 유래 베시클의 제조가 가능한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 지지체, 중간 필터 및 멤브레인 필터를 포함하는 세포 압출기에 세포를 포함하는 시료를 60 내지 90ml/분의 압출 속도로 압출하는 단계를 포함하는, 세포 유래 베시클 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 60 내지 90ml/분의 압출 속도로 압출하는 단계를 포함하여 세포 유래 베시클을 제조하는 경우, 세포 유래 베시클의 수율이 가장 높은 것일 수 있으며, 상기 압출하는 단계를 60 ml/분 이상으로 압출하는 경우, 압출된 시료의 다분산지수(PDI)가 0.3 이하일 수 있으며, 이는 압출된 세포 유래 베시클의 크기가 일정한 것을 의미하는바, 세포 유래 베시클의 활용도가 우수하다.
또한, 본 발명은 지지체, 중간 필터 및 멤브레인 필터를 포함하는 세포 압출기에 세포를 포함하는 시료를 압출하는 단계를 포함하고, 상기 중간 필터는 총 두께가 360 내지 660μm인, 세포 유래 베시클 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 중간 필터의 총 두께를 360 내지 660μm로하여 제조한 세포 압출기로 세포 유래 베시클을 제조하면, 중간 필터를 통과하면서 받는 저항력보다 세포를 포함한 시료가 멤브레인 필터에 넓은 면적으로 도달하여 발생하는 압력 감소의 효과가 커서, 멤브레인 필터에 대한 부하가 낮아져 세포 유래 베시클 제조를 위한 압출 효율이 증가하는 것 일 수 있다.
또한, 본 발명은 멤브레인 필터를 기준으로 중간 필터, 오 링(O-ring), 지지체, 외부 캐스팅 및 시린지가 순차적으로 및/또는 대칭적으로 연결된 시린지 타입 세포 압출기를 제공한다.
이하, 본 발명의 상기 세포 압출기를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 세포 압출기를 분해 도시한 부품도로써, 이를 도시된 순서대로 다시 결합하여 세포 압출기를 완성할 수 있다.
도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따른 세포 압출기는 중간 필터, 멤브레인 필터와 중간 필터를 고정시키는 오 링(o ring), 중앙부에 세포를 포함하는 시료가 관통하는 관통부를 포함하는 지지체, 시린지를 제외한 나머지 구성요소를 외부와 차단시키는 외부 캐스팅 및 세포를 포함하는 시료가 분주되는 시린지가 멤브레인 필터를 기준으로 순차적 및/또는 대칭적으로 구성된다.
본 발명에 있어서, 상기 멤브레인 필터의 면적(S2)과 관통부의 면적(S1)의 비(S2/S1)는 50 내지 300일 수 있으며, 바람직하게 상기 비(S2/S1)는 70 내지 170일 수 있다.
본 발명의 상기 비(S2/S1)가 적용된 본 발명의 세포 압출기로 세포 유래 베시클을 제조하면, 압출시 멤브레인 필터에 과도한 부하가 걸리지 않아 압출 안정성이 높아지고, 압출되는 시료의 양이 증가하여 세포 유래 베시클 제조를 위한 압출 효율이 증가하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 중간 필터는 두께가 90μm 내지 110 μm인 중간 필터를 4개 내지 6개 적층하여 구성할 수 있고, 또는 단독 또는 적층된 중간 필터의 총 두께가 360μm 내지 660μm가 되도록 중간필터를 단독 또는 적층하여 구성할 수 있다.
본 발명의 상기 중간 필터의 두께 및 개수를 적용한 세포 압출기로 세포 유래 베시클을 제조하면, 중간 필터를 통과하면서 받는 저항력보다 세포를 포함한 시료가 멤브레인 필터에 넓은 면적으로 도달하여 발생하는 압력 감소의 효과가 커서, 멤브레인 필터에 대한 부하가 낮아져 세포 유래 베시클 제조를 위한 압출 효율이 증가하는 것 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 중간 필터는 두께가 90μm 내지 110 μm인 중간 필터를 4개 내지 6개 적층하여 구성할 수 있고, 또는 단독 또는 적층된 중간 필터의 총 두께가 360μm 내지 660μm가 되도록 중간필터를 단독 또는 적층하여 구성할 수 있다. 또한, 이에 더하여, 상기 멤브레인 필터의 면적(S2)과 관통부의 면적(S1)의 비(S2/S1)는 50 내지 300일 수 있으며, 바람직하게 상기 비(S2/S1)는 70 내지 170일 수 있다
본 발명의 상기 중간 필터의 두께 및 개수; 및 상기 비(S2/S1)를 적용한 세포 압출기로 세포 유래 베시클을 제조하면, 압출시 멤브레인 필터에 과도한 부하가 걸리지 않고, 중간 필터를 통과하면서 받는 저항력보다 세포를 포함한 시료가 멤브레인 필터에 넓은 면적으로 도달하여 발생하는 압력 감소의 효과가 커서, 멤브레인 필터에 대한 부하가 낮아져 세포 유래 베시클 제조를 위한 압출 효율이 증가하는 것 일 수 있다.
실시예 1. 지지체 관통부 면적과 멤브레인 필터 면적 비율에 따른 세포 압출효율의 비교
1.1 세포 압출기 제작
세포를 압출하여 세포외 베시클을 제작하기 위한 세포 압출기를 시린지 펌프가 부착된 시린지 타입의 압출기의 형태로 제작하였다. 멤브레인 필터는 공극 크기가 5μm인 whatman PC membrane filter 5㎛을 사용하였다. 중간 필터(drain disc)는 평평한 표면을 가진 디스크로, 멤브레인 필터의 파열 방지 목적으로 사용되며, 100μm의 두께에 화학적으로 비활성인 폴리에스테르 소재로 이루어져 있다. 멤브레인 필터에 과도한 부하가 걸리는 것을 방지하기 위해, 시린지 펌프에 50psi 이상의 압력이 걸리는 경우, 시린지 펌프가 정지하도록 설계하였다. 제작한 시린지 타입의 압출기를 도 1에 나타내으며, 압출기 내 지지체를 도 2에 나타내었다.
1.2 멤브레인 필터의 면적과 지지체 내 관통부의 면적 비율에 따른 압출 안정성 평가
멤브레인 필터의 면적과 지지체 내 관통부의 면적 비율을 달리하였을 때, 세포 압출 효율을 확인하기 위한 실험을 실시하였다.
실험군은 관통부의 면적(S1)과 멤브레인 필터의 면적(S2)을 달리한 4개 실험군을 설정하였으며 이를 표 1에 나타내었다. 상기 설정된 실험군에 맞추어 제작한 지지체를 도 3에 나타내었다.
S1 (관통부 면적) S2 (멤브레인 필터 면적) S2/S1
실험군 1 πmm 2(반지름: 1mm) 30.25πmm 2 (반지름 5.5mm) 30.25
실험군 2 4πmm 2(반지름: 2mm) 342.25πmm 2 (반지름 18.5mm) 85.56
실험군 3 πmm 2(반지름: 1mm) 156.25πmm 2(반지름 12.5mm) 156.25
실험군 4 πmm 2(반지름: 1mm) 342.25πmm 2(반지름 18.5mm) 342.25
상기 설정된 관통부와 멤브레인 필터의 면적비율(S2/S1)에 따른 압출 효율을 측정하였다. 구체적으로 세포의 크기가 9.8μm 인 Human macrophage cell line U937 세포를 1×10 6 cells/mL의 농도로 인산염 완충액에 희석한 세포부유액 30mL를 상기 설정한 실험군과 같이 지지체 내 관통부 면적 및 멤브레인 필터 면적을 달리하고, 중간필터의 개수를 5개로하여, 실시예 1.1에서 제작한 압출기에 60ml/min의 속도로 압출하고, 압출기에 걸리는 압력, 최종적으로 압출된 세포부유액 및 압출된 세포수를 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.도 4에 나타낸 바와 같이, 실험군 1의 경우 압출 시작 직후 멤브레인 필터에 걸리는 압력이 50 psi를 초과하여 압출이 거의 되지 않았다. 실험군 2의 경우, 압출 시작 25초가 경과한 후에도 멤브레인 필터에 걸리는 압력이 30psi를 초과하지 않아 안정적인 압출이 가능하며 세포부유액 전체가 압출되는 것을 확인하였다. 실험군 3의 경우, 압출 시작 약 25초 경과 후 멤브레인 필터에 걸리는 압력이 50psi를 초과하며, 그에 따라 세포부유액 30ml 중 약 25ml 정도가 압출되는 것을 확인하였다. 실험군 4의 경우, 압출 시작 약 10초 경과 후 멤브레인 필터에 걸리는 압력이 50psi를 초과하며, 그에 따라 세포부유액 30ml 중 약 10ml 정도가 압출되었으나, 시린지펌프가 멈추는 증상이 나타났다.
이러한 결과를 통해 S2/S1 값이 50 내지 300의 범위 내 인 경우에, 효율적인 압출이 가능하며 압출가능량이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. S2/S1 값이 50 미만인 경우, 대용량의 세포부유액을 압출하기에 멤브레인 필터의 면적이 절대적으로 부족하였고, 멤브레인 전후 압력차가 급상승하여 시린지펌프의 압력제한선에 도달하여 압출이 진행되지 않았다. S2/S1 값이 300을 초과하였을 때, 마찬가지로 멤브레인 전후 압력차가 압력제한선에 도달하는 시간이 짧아져, 시린지펌프의 멈춤현상이 발생하였고, 압출가능량이 감소하는 것을 확인하였다. 데이터에서 보여지는 공정은 9.8μm의 U937 세포를 공극 크기가 5μm인 멤브레인 필터를 통해 압출한 것으로, 이를 통해 평균 직경 400 내지 600nm의 사이즈를 가진 세포 베시클이 생산되는 것을 확인하였다.
실시예 2. 중간 필터 개수에 따른 압출 효율의 비교
세포 압출 시 사용하는 중간 필터의 갯수를 달리하였을 때, 세포 압출 효율을 평가하기 위한 실험을 실시하였다. 구체적으로 관통부와 멤브레인 필터의 면적비율(S2/S1)을 30.25, 156.25, 342.25로 설정한 실험군에서 각각 중간 필터의 갯수를 1개, 5개, 10개로 달리하여 실시예 1.1에서 제작한 압출기에 60ml/min의 속도로 압출하고, 압출기에 걸리는 압력, 최종적으로 압출된 세포부유액의 부피 및 압출된 세포수, 압출된 세포 유래 베시클의 크기를 측정하였으며, 이를 도 5에 나타내었다. 또한, 중간 필터 개수에 따른 세포 부유액 확산 효과를 나타내는 모식도를 도 6에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 중간 필터를 멤브레인 필터 앞쪽에 5개 체결하여 압출할 시, 1개 또는 10개보다 압출량이 유의하게 증가하였다. 이로 인해 압출되는 세포 수가 증가하고, 수득하는 세포 유래 베시클의 수도 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. S2/S1 값이 156.25인 실험군에서, 중간 필터를 5개 체결한 경우, 압력 제한선(50psi)까지 압력이 상승하는 데 약 25초가 소요되어, 중간 필터를 1개 또는 10개를 체결한 경우와 비교하여 유의한 정도로 압력이 느리게 상승하였으며, 이로 인해 작동시간이 길어져 압출량이 증가하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 중간 필터를 1개 체결하여 압출하는 경우에는 중간 필터를 통과하는 세포 부유액의 확산범위가 작아서, 세포 부유액이 도달하는 멤브레인 필터의 면적이 작아짐에 따라 압출 효율이 저하되는 것인데 반해, 중간 필터를 10개 이상 체결하는 경우 세포부유액이 중간필터를 통과하면서 받는 저항력이 확산에 의한 면적 증가에 따른 압력 감소의 효과보다 커지면서 압출 효율이 감소하는 것을 확인한 것이다.
또한, 본 실시예에서 생산한 세포 유래 베시클의 크기를 측정한 결과, 9800nm 직경의 세포가 5μm 공극을 가진 멤브레인 필터에 압출되는 과정에 의해 약 400 내지 600nm인 세포 유래 베시클로 압출되는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 멤브레인 필터의 면적과 지지체 내 관통부의 면적 비율(S2/S1)에 더하여, 중간필터의 개수 조절, 즉, 중간필터의 총 두께를 조절하여 세포 유래 베시클의 압출효율을 높일 수 있음을 의미한다.
실시예 3. 압출 속도에 따른 압출 효율의 비교
세포 압출시 압출 속도를 달리하기 위해, 시린지 펌프의 이동속도를 10ml/분, 30ml/분, 60ml/분, 90ml/분으로 하여 각각 실험군을 설정하고, S2/S1 값이 156.25이고, 중간필터의 개수가 5개인, 지지체, 중간필터 및 멤브레인 필터를 포함하는 세포 압출기에서 압출을 수행하였으며, 압출 속도에 따른 세포 유래 베시클의 크기, PDI(polydispersity index, 다분산지수) 및 압출액 내 세포 베시클의 농도를 비교하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 각 실험군의 압출된 세포 유래 베시클의 크기가 약 180 내지 210nm 정도인 것으로 측정되어 압출 속도를 달리하여도 세포 유래 베시클의 평균 직경은 유사한 것으로 확인되었으며, 압출 속도가 빠를수록 PDI가 낮아지는 것으로 측정되어 압출속도가 빠른 경우 세포 유래 베시클의 크기가 균일해지는 것을 확인하였다. 또한 60ml/분 이상의 속도로 압출하는 경우, 압출액 내 세포 유래 베시클의 양이 증가하여 생산률이 향상되는 것을 확인하였으며, 특히 60ml/분으로 압출하였을 때, 압출액 내 세포 유래 베시클의 농도가 5.45 x 10 10/ml인 것으로 확인되어, 가장 높은 생산률을 나타내는 것을 확인하였다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 지지체, 중간 필터 및 멤브레인 필터를 포함하는 세포 압출기에 세포를 포함하는 시료를 압출하는 단계를 포함하며, 상기 지지체는 상기 중간 필터와 멤브레인 필터를 지지하는 것으로, 지지체 중앙부에 세포를 포함하는 시료가 관통하는 관통부를 포함하고, 상기 멤브레인 필터의 면적(S2)과 관통부 면적(S1) 비(S2/S1)는 50 내지 300인 세포 유래 베시클 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 멤브레인 필터는 공극의 크기가 0.1 내지 10μm인, 세포 유래 베시클 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 멤브레인 필터의 면적(S2)과 관통부 면적(S1) 비(S2/S1)가 70 내지 170인, 세포 유래 베시클 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 중간 필터는 두께가 90 내지 110μm이고, 4개 내지 6개의 중간 필터가 적층되는 것인, 세포 유래 베시클 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 중간 필터는 총 두께가 360 내지 660μm인, 세포 유래 베시클 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압출하는 단계는 60 내지 90ml/분의 압출 속도로 압출하는 것인, 세포 유래 베시클 제조 방법.
  7. 지지체, 중간 필터 및 멤브레인 필터를 포함하는 세포 압출기에 세포를 포함하는 시료를 60 내지 90ml/분의 압출 속도로 압출하는 단계를 포함하는, 세포 유래 베시클 제조 방법.
  8. 지지체, 중간 필터 및 멤브레인 필터를 포함하는 세포 압출기에 세포를 포함하는 시료를 압출하는 단계를 포함하고, 상기 중간 필터는 총 두께가 360 내지 660μm인, 세포 유래 베시클 제조 방법.
  9. 시린지 타입의 세포 압출기에 있어서, 멤브레인 필터를 기준으로,
    1) 중간 필터;
    2) 오 링(o-ring);
    3) 중앙에 관통부가 형성된 지지체;
    4) 외부 캐스팅; 및
    5) 시린지가 순차적으로 연결된 것이며, 상기 멤브레인 필터의 면적(S2)과 상기 지지체의 관통부 면적(S1) 비(S2/S1)가 50 내지 300인, 세포 압출기.
  10. 제9항에 있어서, 상기 멤브레인 필터의 면적(S2)과 상기 지지체의 관통부 면적(S1) 비(S2/S1)가 70 내지 170이고, 상기 중간 필터는 두께가 90 내지 110μm이고, 4개 내지 6개의 중간 필터가 적층되는 것인, 세포 압출기.
  11. 제9항에 있어서, 상기 멤브레인 필터의 면적(S2)과 상기 지지체의 관통부 면적(S1) 비(S2/S1)가 70 내지 170이고, 상기 중간 필터는 총 두께가 360 내지 660μm인, 세포 압출기.
  12. 시린지 타입의 세포 압출기에 있어서, 멤브레인 필터를 기준으로,
    1) 중간 필터;
    2) 오 링(o-ring);
    3) 중앙에 관통부가 형성된 지지체;
    4) 외부 캐스팅; 및
    5) 시린지가 순차적으로 연결된 것이며, 상기 중간필터는 두께가 90 내지 110μm이고, 4개 내지 6개의 중간 필터가 적층된 것인, 세포 압출기.
  13. 시린지 타입의 세포 압출기에 있어서, 멤브레인 필터를 기준으로,
    1) 중간 필터;
    2) 오 링(o-ring);
    3) 중앙에 관통부가 형성된 지지체;
    4) 외부 캐스팅; 및
    5) 시린지가 순차적으로 연결된 것이며, 상기 중간필터는 총 두께가 360 내지 660μm인, 세포 압출기.
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