WO2021234325A1 - Capture of bacteria by means of bacteriophages or bacteriophage proteins - Google Patents

Capture of bacteria by means of bacteriophages or bacteriophage proteins Download PDF

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WO2021234325A1
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bacteriophage
rbp
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protein
aureus
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Mai Huong CHATAIN-LY
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Vetophage
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus
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    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)

Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for the rapid detection of bacteria in a sample.
  • Bacterial infections are responsible for numerous pathologies, in particular in farms and more particularly in sheep or cattle farms.
  • diagnostic devices on the market are mainly based on screening for somatic cells found in milk.
  • this method does not identify the bacteria or bacteria responsible for the infection.
  • the latter can constitute a trace of a more or less old infection and therefore constitute a non-specific indicator of an ongoing infection. This therefore leads breeders to use antibiotic therapy on a massive scale and not targeted.
  • PCR polymerase chain reaction
  • culture method requires an incubation time of 24 to 48 hours, which represents too long a wait for the results, given the challenges of the sector.
  • PCR and / or quantitative PCR although faster and more specific, it is much more expensive.
  • the PCR technique only detects the presence of DNA from the bacteria and not the presence of viable bacteria, which can lead to the detection of false positives (dead bacteria already supported by the host's immune system) .
  • POCT point-of-care testing
  • Such a method of detecting bacteria could also be applied in various fields such as for example in food safety, water control or in human health.
  • the present invention relates to the use of a solution comprising a cation and a protein for immobilizing a bacteriophage protein on a support.
  • said bacteriophage protein is a receptor binding protein (RBP).
  • said bacteriophage protein is an RBP specific for S. aureus.
  • the protein of the solution used is a milk protein, albumin, bovine serum albumin (BSA), a serum protein, a chicken serum protein or an antibody.
  • the cation of the solution is chosen from a monovalent cation, a divalent cation, a trivalent cation or a salt, preferably from the group comprising Mg2 +, Ca2 +, Na +, K +, Fe2 +, Fe3 +, K +, Zn +, Au3 +, Cu +, carbocation, Mn +, Ag +, MgSO 4 , Na2SCO 4 , MgCk, CaCk, CaSO 4 , NaC1, K2SO 4 and KC1.
  • the invention relates to the use of a solution comprising a cation and a protein for the immobilization of a bacteriophage protein on a support in which the cation concentration in the solution is between 5 mM and 800 mM inclusive, and the protein concentration in the solution is between 5 ⁇ g / m L and 5 mg / mL inclusive.
  • the invention relates to the use of a solution comprising a cation and a protein for the immobilization of a bacteriophage protein on a support in which the cation concentration in the solution is between 5 mM and 800 mM inclusive, and the protein concentration in the solution is between 5 ⁇ g / m L and 5 mg / mL inclusive and in which the cation is MgSO 4 or NaCl and the protein is BSA.
  • the invention also relates to the use of a solution comprising a cation and a protein for the immobilization of a bacteriophage protein on a support in which the receptor binding protein (RBP) is chosen from an RBP of bacteriophage CNCM 1-5408, RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, RBP of bacteriophage CNCM 1- 5680 or a mixture thereof.
  • RBP receptor binding protein
  • the invention relates more particularly still to the use of a solution comprising a cation and a protein for the immobilization of a bacteriophage protein on a support in which the receptor binding protein (RBP) is chosen from an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP of sequence SEQ ID NO: 4, an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, or an RBP having a percentage identity of at least 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID No. 4, an RBP of sequence SEQ ID NO: 5 or an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, or a mixture thereof.
  • RBP receptor binding protein
  • a subject of the invention is also a method for preparing a device comprising a solid support, said method comprising a step a) of immobilizing a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins on the solid support, said immobilization step consisting in bringing the support into contact with a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins in the presence of a solution comprising a cation and a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP, optionally a step b) of removing the bacteriophage protein (s) not immobilized to the solid support, and optionally a step c) of rinsing, which can be repeated at least once.
  • Another object of the invention relates to a device obtained according to the preparation process described above, said device being a microtiter plate or a strip.
  • the invention relates to a lateral flow device comprising a solid support on which is immobilized a receptor binding protein (RBP).
  • RBP receptor binding protein
  • Another object of the invention relates to the use of the device, for the detection or quantification of one or more bacteria present in a sample.
  • the invention also relates to a method for the detection and / or quantification of one or more bacteria present in a sample with a device of the microtiter strip or plate type for an ELISA test, comprising the following steps : i) a step of immobilizing a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage protein on the solid support, said immobilization step consisting in bringing the support into contact with a bacteriophage protein or a combination of proteins of bacteriophages in the presence of a solution comprising a cation and a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP, ii) optionally a step of removing the bacteriophage protein (s) not immobilized to the solid support, iii) optionally a step rinsing, which can be repeated at least once, iv) detection of bacteria bound to bacteriophage proteins with a ligand specific for the bacterium chosen from a bacteriophage specific for the labele
  • a subject of the invention is also a protein binding to the receptor (RBP) of a bacteriophage specific for S. aureus
  • said RBP is chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, and an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, or an RBP having a percentage identity of at least 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5 or SEQ ID NO: 6.
  • Bacteriophage and “phage” are used interchangeably and denote the same entity.
  • Bacteriophage specific for a bacterium is a bacteriophage capable of binding specifically to this bacterium. This specificity can be determined by the spot method described in the present application.
  • Strip refers to a device for detection by lateral flow chromatography, also known as lateral flow immunochromatography. It is a method based on the movement of a liquid sample by capillary action through a strip. It has previously been described for the immunological detection of an analyte of interest in a liquid sample, using a primary antibody and a secondary antibody (EP1086372B1). They are simple paper-based devices intended to detect the presence (or absence) of a target analyte in a liquid sample (matrix). "Capture”, “link”, “coupling”, “fixation” are used interchangeably.
  • Immobilization is used to describe the binding of a bacteriophage or bacteriophage protein to a support.
  • the immobilization can be carried out, for example, by adsorption or by covalent bonding.
  • “Divalent cation” and “dication” are used interchangeably.
  • “Labeled element” is an element (protein, bacterium, molecule) conjugated to a molecule which can be detected visually. The marker is used to mark bacteria.
  • “Identical” or “Identity” when used in a relationship between the sequences of two or more amino acid sequences, this term refers to the degree of sequence relatedness between the amino acid sequences, as determined by the number of matches between the chains of two or more amino acid residues. Identity measures the percentage of identical matches between the smallest sequences of two or more sequences, whose "gap” alignments (if any) are processed by a particular mathematical model or computer program (that is, say "algorithms").
  • the identity of related amino acid sequences can be easily calculated by methods known to those skilled in the art.
  • the preferred methods for determining the identity of sequences are designed to give the greatest match between the sequences tested.
  • the methods of determining the identity between sequences are described in computer programs available to the public.
  • Bacteria-specific ligand is a ligand capable of specifically binding to bacteria. This specificity can be determined by the method of magnetic beads for example.
  • Conjugated marker can be a colloidal molecule, for example: a gold nanoparticle (AuNP) or colloidal gold, a carbon or colloidal carbon nanoparticle, a colored latex bead, a magnetic particle, a fluorescent molecule, a luminescent molecule or an enzyme such as horseradish peroxidase which catalyzes the conversion of chromogenic substrates into colored compounds, or which produces light from chemiluminescent substrates.
  • Merotiter plate refers to a device comprising a set of wells, it is a standard tool in research and clinical analysis of laboratory diagnostic tests. Their use is very common in the Enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS A).
  • ELIS A Enzyme-linked immunosorbent assay
  • Bacteriophage-specific protein of a bacterium is a protein capable of binding specifically to this bacterium.
  • Receptor binding protein or "(RBP) (Receptor Binding Protein) of a bacteriophage”: designates the proteins which ensure the initial contact with the receptor on the envelope of the host cell. Indeed, they are able to recognize target patterns on the surface of bacteria.
  • RBP Receptor Binding Protein
  • an RBP of a bacteriophage specific for a bacterium is an RBP capable of binding specifically to this bacterium. This specificity can be determined by the ELISA method as described in the present application.
  • RBP proteins are different from cell wall binding domains (CBD, Cell Binding Domain). RBP is involved in the first stage of the phage infection cycle, while CBD is involved in the late infection cycle. CBDs are protein domains found in lytic enzymes produced by phages, which allow the recognition of peptidoglycans in cell walls.
  • surfactant is an amphiphilic molecule for lowering the surface tension of an aqueous solution.
  • the surfactant is Tween 20.
  • the present invention relates to the use of a solution comprising a cation and a protein, for immobilizing a bacteriophage protein on a support.
  • the bacteriophage protein is preferably a receptor binding protein (RBP).
  • RBP receptor binding protein
  • the bacteriophage protein and in particular the RBP is specific for Staphylococcus aureus (S. aureus).
  • the bacteriophage proteins are in solution, said solution comprising a cation and a protein.
  • the use of the solution makes it possible to improve the immobilization of the bacteriophage protein on a solid support. It also makes it possible to improve the capture of a bacterium by the protein thus immobilized.
  • the solution can be used for the procedure for immobilizing the bacteriophage protein on the support and / or for the detection and / or quantification of a bacterium by bacteriophages or by bacteriophage proteins.
  • the protein of this solution is in particular chosen from milk proteins, in particular albumin, even more particularly bovine serum albumin (BSA), or a serum protein, more particularly from chicken serum or alternatively. an antibody.
  • the cation is chosen from a monovalent cation, a divalent cation, a trivalent cation or a salt, preferably from the group comprising Mg 2 +, Ca 2 +, Na + , K + , Le 2+ , Le 3+ , K + , Zn + , Au 3+ , Cu + , carbocation, Mn + , Ag + , MgS0 4 , Na 2 S04, MgCk, CaCk, CaS0 4 , NaCl, K2SO4 and KC1.
  • the cation concentration in the solution is between 5 mM and 800 mM inclusive.
  • the solution comprises MgSCL whose concentration is between 5 mM and 800 mM inclusive, in particular between 5 mM and 300 mM inclusive.
  • the solution comprises NaCl the concentration of which is between 5 mM and 800 mM inclusive.
  • the protein concentration in the solution is between 5 pg / mL and 5 mg / mL inclusive.
  • the protein is BSA and its concentration is between 0.1 mg / mL to 5 mg / mL inclusive.
  • the solution comprises BSA at a concentration of 5 ⁇ g / m L to 5 mg / mL and MgSCL at a concentration of 5 mM to 800 mM inclusive.
  • the solution comprises BSA at a concentration of 0.1 mg / mL to 5 mg / mL and MgSCL at a concentration of 5 mM to 300 mM inclusive.
  • the solution comprises BSA at a concentration of 2 mg / mL and MgSCL at a concentration of 50 mM.
  • the solution comprises BSA at a concentration of 5 Lig / m L to 5 mg / mL and NaCl at a concentration of 5 mM to 800 mM inclusive.
  • the solution comprises BSA at a concentration of 1 mg / mL and NaCl at a concentration of 150 mM.
  • said composition further comprises a stabilizing agent, such as glycerol and / or a sugar, for example sorbitol and / or sucrose.
  • a stabilizing agent such as glycerol and / or a sugar, for example sorbitol and / or sucrose.
  • any type of bacteriophage specific for a bacterium can be used.
  • the bacteriophage is specific for S. aureus, it is more particularly, a bacteriophage chosen from bacteriophages specific for S. aureus such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680. It may in particular be a bacteriophage specific for S. aureus, more particularly, a bacteriophage chosen from bacteriophages specific for S. aureus as deposited with the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, and CNCM 1-5492.
  • bacteriophage specific for S. aureus may in particular be a bacteriophage specific for S. aureus, more particularly, a bacteriophage chosen from bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of bacteriophages specific for S. aureus chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491 and CNCM 1-5492.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of bacteriophages specific for S. aureus chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 2 bacteriophages chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1 -5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophage CNCM 1-5408 with one of the bacteriophages CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 or CNCM 1-5680, ie a mixture of bacteriophages CNCM 1-5408 and CNCM 1-5409, bacteriophages CNCM 1-5408 and CNCM 1-5410, bacteriophages CNCM 1-5408 and CNCM 1-5491, bacteriophages CNCM 1- 5408 and CNCM 1-5492 or bacteriophages CNCM 1-5408 and CNCM 1-5680.
  • aureus is a mixture of the bacteriophage CNCM 1-5409 with one of the bacteriophages CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 or CNCM 1-5680 , ie a mixture of the bacteriophages CNCM 1-5409 and CNCM 1-5410, of the bacteriophages CNCM 1-5409 and CNCM 1-5491, bacteriophages CNCM 1-5409 and CNCM 1-5492 or bacteriophages CNCM 1-5409 and CNCM 1-5680.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophage CNCM 1-5410 with one of the bacteriophages CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 or CNCM 1-5680, ie a mixture of bacteriophages CNCM 1-5410 and CNCM 1-5491, bacteriophages CNCM 1-5410 and CNCM 1-5492 or bacteriophages CNCM 1-5410 and CNCM 1-5680.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophage CNCM 1-5491 with one of the bacteriophages CNCM 1-5492 or CNCM 1-5680, ie a mixture of the bacteriophages CNCM 1-5491 and CNCM 1-5492 or bacteriophages CNCM 1-5491 and CNCM 1-5680.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophage CNCM 1-5492 with the bacteriophage CNCM 1-5680, i.e. a mixture of the bacteriophages CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 3 bacteriophages chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1 -5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 and CNCM 1-5410. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5491 and CNCM 1-5492.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 4 bacteriophages chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1 -5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 5 bacteriophages chosen from the strains deposited at the CNCM under the CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680 numbers.
  • the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 6 bacteriophages chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1 -5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
  • any type of bacteriophage protein specific for a bacterium can be used.
  • the protein used is a phage receptor binding protein (Receptor Binding Protein or RBP).
  • RBP Receptor Binding Protein
  • it can act as an RBP of a bacteriophage specific for S. aureus chosen from bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 , CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, and CNCM 1-5492 or a mixture thereof.
  • 1 it may be an RBP of a bacteriophage specific for S. aureus chosen from bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the CNCM 1-5408, CNCM 1- 5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680 or a mixture thereof.
  • it may be an RBP of bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5680 , in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4 or a mixture thereof.
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 2 RBP chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1- 5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, and of an RBP chosen from an RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular a RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, and of a RBP chosen from an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1- 5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, and of a RBP chosen from an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, and of a RBP chosen from an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and of a RBP of the bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 3 RBP chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 4 RBPs chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 5 RBPs chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 6 RBPs chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 2 or 3 RBP chosen from an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of sequence SEQ ID NO: 3.
  • the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 2, 3, 4, 5 or 6 RBP chosen from an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP of sequence SEQ ID NO: 4, an RBP of sequence SEQ ID NO: 5 and an RBP of sequence SEQ ID NO: 6.
  • the previously described RBPs also include RBPs having a percentage identity of at least 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 or a mixture thereof.
  • the bacteriophages or bacteriophage proteins are immobilized on supports, for example microtiter plates, test strips, slides, wafers, filter media or continuous flow cell chambers.
  • the support structures can for example comprise polystyrene, polypropylene, polycarbonate, PMMA, cellulose acetate, nitrocellulose, glass or a silicon wafer.
  • the support is a paper-based device.
  • the present invention relates to a method for the detection and / or quantification of one or more bacteria present in a sample with a device of the microtiter strip or plate type for an ELISA test, comprising the steps following: i) a step of immobilizing a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage protein on the solid support, said immobilization step consisting of bringing the support into contact with a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins in the presence of a solution comprising a cation and a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP, ii) optionally a step of removing the bacteriophage protein (s) not immobilized to the solid support, iii) optionally a rinsing step, which can be repeated at least once, iv) detection of bacteria bound to bacteriophage proteins with a ligand specific for the bacterium chosen from a bacteriophage specific for the labeled
  • a subject of the present invention is also a method for preparing a device comprising a solid support, said device preferably being a microtiter plate or a strip, and said method comprising: a step a) of immobilizing a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins on the solid support, said immobilizing step consisting of contacting the support with a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins in the presence of a solution comprising a cation and a protein, optionally a step b) of elimination of the bacteriophage (s) or of the bacteriophage protein (s) not immobilized to the solid support, and optionally a rinsing step c), which can be repeated at least once.
  • a subject of the present invention is also a method for preparing a device comprising a solid support, said device preferably being a microtitration plate or a strip, and said method comprising: a step a) of immobilizing a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins on the solid support, said immobilization step consisting in bringing the support into contact with a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins bacteriophages in the presence of a solution comprising a cation and a protein, optionally a step b) of removing the bacteriophage protein (s) not immobilized to the solid support, and optionally a step c) of rinsing, which can be repeated at least Once.
  • the solid support is a microtiter plate or a strip.
  • the preparation process uses bacteriophages or a combination of bacteriophages or bacteriophage proteins or a combination of bacteriophage proteins as described above
  • the bacteriophages are specific for S. aureus, and more particularly still, are as described above.
  • the bacteriophage protein or the combination of bacteriophage proteins is an RBP or a combination of RBP, in particular the RBPs specific for S. aureus and more particularly still, the RBPs are such that described above.
  • the method for preparing the device according to the invention differs from the methods of the prior art in that the step of immobilizing a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins , in particular one or more RBP of bacteriophage, or of the bacteriophage or of a combination of bacteriophages, is carried out in a single step in the presence of a solution simultaneously comprising a cation and a protein.
  • step a) continues with incubation of the support in the presence of the solution of protein and cation and of a bacteriophage or of a combination of bacteriophages or of a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins.
  • the duration of this step and the incubation temperature are defined by those skilled in the art.
  • One of the objects of the present invention is a device obtained by the method described above, thus said device comprises a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a protein of bacteriophages or a combination of proteins of bacteriophages immobilized on its surface.
  • Another object of the invention is a lateral flow device comprising a solid support on which is immobilized a receptor binding protein (RBP).
  • RBP receptor binding protein
  • the bacteriophage or the combination of bacteriophages or a protein of bacteriophages or the protein combination of bacteriophages, the RBP or the combination of RBP is specific for S. aureus.
  • the bacterium of interest is S. aureus.
  • Another object of the invention is a microtiter plate obtained by the method described above using a solution comprising a cation and a protein, thus said microtiter plate comprises a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins immobilized on its surface (ie, surface of the solid support).
  • microtiter plate obtained by the method described above using a solution comprising a cation and a protein, thus said microtiter plate comprises a bacteriophage protein or a combination of proteins.
  • bacteriophage in particular an RBP or a combination of RBP, and in particular, a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins specific for S. aureus immobilized on its surface (ie, surface of the solid support).
  • the bacteriophage or the combination of bacteriophages or the protein of bacteriophages or the combination of proteins of bacteriophages is as described above.
  • the device obtained according to the preparation process is a microtiter plate or a strip, and the support preferably consisting of polystyrene, polypropylene, polycarbonate, cellulose acetate, cellulose, glass, and / or silicon.
  • the device according to the invention is a microtiter plate or a strip which comprises a solid support on which is immobilized a protein binding to the receptor (RB P), the support preferably consisting of polystyrene, polypropylene, polycarbonate, cellulose acetate, cellulose, glass, and / or silicon, the support being in particular coated with a protein.
  • RB P receptor
  • the binding, capture or binding of the bacteriophage or of the bacteriophage protein to the bacteria is one aspect of the invention. What is important in this regard is functional binding, that is, whether the bacteriophages or bacteriophage proteins, antibodies or aptamers have structures accessible to bacteria, despite immobilization to the support material.
  • the immobilization can be obtained on a bare support or on a support pre-coated with a protein and in particular albumin or an antibody.
  • the invention relates to a chromatography strip for detecting a bacterium of interest in a sample.
  • Another object of the invention is a strip obtained by the method described above using a solution comprising a cation and a protein, thus said microtiter plate comprises a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a protein of bacteriophages or a combination of bacteriophage proteins immobilized on its surface (ie, surface of the solid support).
  • Another object of the invention is a strip obtained by the method described above using a solution comprising a cation and a protein, thus said strip comprises a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins, in particular an RBP or a combination of RBP, and in particular, a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins immobilized on its surface (ie, surface of the solid support).
  • the subject of the invention is a strip on which is immobilized a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins.
  • the bacteriophage proteins or the combinations of bacteriophage proteins are as described above.
  • the particularity of the detection strip of the invention is the blocking of the migration of bacteria on the support.
  • the present invention relates in particular to a strip for detecting a bacterium of interest, in particular S. aureus, in a sample, comprising at least one part which comprises at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest and / or at least one protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest.
  • said lateral flow chromatography strip comprises in order at least: a contact part (sample pad) comprising a contact zone with the sample; a detection part comprising a zone for detecting the bacterium of interest which comprises at least one bacteriophage specific for said bacterium of interest and / or at least one protein of at least one bacteriophage specific for said bacterium of interest, an absorbent part.
  • the contact part comprises a contact zone intended to be brought into contact with the sample. Its function is to distribute the sample uniformly so that the migration of the sample by capillary action to the following parts is smooth, continuous and homogeneous.
  • the contact part and the contact area are a capillary matrix.
  • the contact portion and the contact area are made of cellulose or glass fibers.
  • the detection part comprises a detection zone where the bacterium of interest, if it is present in the sample analyzed, is captured on the strip thanks to a specific ligand thereof which is therein. immobilized. The role of the detection part is therefore to provide a good support and a good connection for immobilization of specific ligands, while limiting non-specific immobilizations.
  • the detection part and the detection area are a nitrocellulose membrane.
  • a ligand specific for a bacterium is chosen from an antibody directed against the bacterium, a bacteriophage specific for the bacterium, a protein of a bacteriophage specific for the bacterium, a bacteriophage specific for the bacterium.
  • bacterium coupled to an antibody directed against the bacterium a protein of a specific bacteriophage of the bacterium coupled to an antibody directed against the bacterium.
  • it is a ligand specific for S. aureus and is therefore chosen from an antibody directed against S. aureus (or anti-S. Aureus), a bacteriophage specific for S. aureus, a protein of a S. aureus specific bacteriophage, a S. aureus specific bacteriophage coupled to an anti-S. aureus, a bacteriophage protein specific for S. aureus coupled with an anti-S antibody. aureus.
  • the bacteriophages and bacteriophage proteins are as described above.
  • the absorbent part (absorption pad) has an absorption role. It thus helps to maintain the flow rate of the flow through the strip and allows the recovery of excess sample and reagents, thus preventing sample backflow.
  • the absorbent part is cotton.
  • "in order” means the order in which the different parts which make up the strip will be traversed by the flow containing the sample, but this term does not mean that these parts are necessarily contiguous.
  • one of the ends of the contact part is superimposed with one of the ends of the part downstream thereof to form a first superposition zone
  • one of the ends of the detection part is superimposed with one of the ends of the part upstream thereof to form a second overlapping zone and the other end of the detection part is superimposed with one of the ends of the part downstream thereof to form a third overlap zone
  • one of the ends of the absorbent part is superimposed with one of the ends of the downstream part thereof to form a fourth superposition zone.
  • the first, the second, the third and the fourth superposition zone are distinct from each other.
  • the contact zone is distinct from the first superposition zone.
  • the detection zone is distinct from the second and from the third superposition zone.
  • one of the ends of the detection part is superimposed with one of the ends of the contact part and the other end of the detection part is superimposed with one of the ends of the absorbent part.
  • one of the ends of the detection part is superimposed with one of the ends of the contact part to form a first superposition zone, and the other end of the part. sensor is superimposed with one of the ends of the absorbent part to form a second superposition zone.
  • the first and the second superposition zone are separated from each other.
  • the contact zone is distinct from the first superposition zone.
  • the detection zone is distinct from the first and from the second superposition zone.
  • the detection zone is a zone where the bacteriophages and / or bacteriophage proteins are deposited ( Figures 1, 3).
  • said strip further comprises, between the contact part and the detection part, a marking part which comprises a marking zone comprising a marker.
  • the labeling part comprises a labeling area where the bacteria are labeled with a marker when the flow of sample to be analyzed passes through. Its role is to maintain the marker until use of the strip and to release the marker when there is recognition between the marker and a bacterium, when the sample flow passes.
  • the marking part and the marking area are made of glass fibers, cellulose or polyesters.
  • the detection zone is distributed after the sample deposit zone (sample pad) and after the labeling zone (conjugate pad) if it is present (FIG. 2), or if it is absent ( Figure 4) before the adsorption zone.
  • the detection zone merges with the labeling zone (conjugate pad) (FIGS. 5 and 6).
  • markers can be used for the detection of bacteria captured by bacteriophages or bacteriophage proteins.
  • the marker can be any marker capable of marking a bacterium, a bacteriophage, a protein, in particular a bacteriophage protein, an antibody or an aptamer.
  • Bacteria markers are well known to those skilled in the art.
  • the label is a conjugated label, i.e. the label is linked to a ligand to label the bacteria.
  • the conjugate label is a label conjugated to at least one ligand specific for the bacterium of interest.
  • conjugated to at least one specific ligand is meant that a label can be conjugated to a specific ligand or to several different specific ligands.
  • said marker is coupled directly to the ligand to label the bacteria.
  • said label is indirectly coupled to the ligand via one or more molecule (s).
  • the markers used can be colloidal molecules, in particular gold nanoparticles (AuNP).
  • AuNP gold nanoparticles
  • these can be gold nanospheres or gold nanodrits.
  • the aggregation of the gold nanoparticles results in the appearance of a color, in particular a pink color, detectable in the visible, due to the absorbance wavelength of the gold nanoparticles.
  • the labeled element can be an antibody specific to the bacteria coupled with a enzyme, for example horseradish peroxidase (HRP), which catalyzes the conversion of chromogenic substrates into colored compounds, or which produces light from chemiluminescent substrates.
  • HRP horseradish peroxidase
  • substrates include, without limitation, ABTS, OPD, DAB, 1AEC or else TMB (3, 3 ', 5.5'-Tetramethylbenzidine).
  • HRP horseradish peroxidase
  • it is an antibody coupled with an enzyme (horseradish peroxidase) and the color is revealed by adding TMB.
  • Labeling can be carried out by an intermediate bond via a biotin / streptavidin complex which is coupled to HRP or to a colloidal molecule, in particular gold.
  • said at least one ligand specific for the bacterium of interest can be at least one antibody directed against the bacterium of interest, at least one aptamer specific for the bacterium of of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one protein of at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, at least one protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest.
  • the bacterium of interest is S. aureus and these specific ligands can be read as ligands specific for S. aureus or directed against S. aureus.
  • the bacteriophages and bacteriophage proteins are as described above.
  • the marker conjugated to a ligand specific for the bacterium of interest in particular S. aureus, can be a marker conjugated to an antibody directed against the bacterium of interest, a marker conjugated to an aptamer specific for the bacterium.
  • bacterium of interest a marker conjugated to a bacteriophage specific for the bacterium of interest, a marker conjugated to a protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest, a marker conjugated to a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, a marker conjugated to a protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, a marker conjugated to an antibody directed against the bacterium of interest coupled to a bacteriophage specific for the bacterium of interest or a marker conjugated to a protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest.
  • the present invention relates to a strip for detecting S. aureus in a sample, comprising in order at least: a contact portion comprising a contact area with the sample; a labeling part comprising a labeling area which comprises a label conjugated to at least one ligand specific for S. aureus, in particular a gold nanoparticle conjugated to at least one ligand specific for S. aureus; a detection part comprising a detection zone for S. aureus, which comprises at least one bacteriophage specific for S. aureus and / or a protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus, in particular an RBP, an absorbing part .
  • the labeling zone comprises a label conjugated to an anti-S antibody. aureus or a marker conjugated to an aptamer specific for S. aureus, more particularly a gold nanoparticle conjugated to an anti-S antibody. aureus or a gold nanoparticle conjugated to an aptamer specific to S. aureus.
  • the labeling zone comprises a marker conjugated to at least one bacteriophage specific for S. aureus.
  • it comprises a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5408, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5409, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5410, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5491, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5492, a marker conjugated to the CNCM 1-5680 bacteriophage or a marker conjugated to a mixture of bacteriophage as described above.
  • it comprises these five markers conjugated to bacteriophages.
  • said marker conjugated to these phages is a gold nanoparticle.
  • the labeling zone comprises a marker conjugated to at least one protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus.
  • said at least one protein is an RBP.
  • it comprises a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5408, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5409, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5410, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5491, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5492, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5680 or a marker conjugated to a mixture of bacteriophage proteins as described above.
  • it comprises these five markers conjugated to bacteriophage proteins.
  • said marker conjugated to these bacteriophage proteins is a gold nanoparticle.
  • the labeling zone comprises a label conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5408 coupled to an anti-S antibody. aureus, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5409 coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5410 coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5491 coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5492 coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5680 coupled to an anti-S. aureus or a marker conjugated to a mixture of bacteriophages as described above coupled to an anti-S antibody. aureus.
  • it comprises a marker conjugated to a protein of the bacteriophage CNCM 1-5408 coupled to an anti-S antibody. aureus, a marker conjugated to a bacteriophage CNCM 1-5409 protein coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to a bacteriophage CNCM 1-5410 protein coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to a bacteriophage CNCM 1-5491 protein coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to a bacteriophage CNCM 1-5492 protein coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to a bacteriophage CNCM 1-5680 protein coupled to an anti-S. aureus or a marker conjugated to a mixture of bacteriophage proteins as described above coupled to an anti-S antibody. aureus.
  • it is a marker conjugated to an anti-S antibody. aureus coupled to the bacteriophage CNCM 1-5408, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to the CNCM 1-5409 bacteriophage, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to the CNCM 1-5410 bacteriophage, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to the CNCM 1-5491 bacteriophage, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to the CNCM 1-5492 bacteriophage, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to the CNCM 1-5680 bacteriophage or a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a mixture of bacteriophages as described above.
  • it is a marker conjugated to an anti-S antibody. aureus coupled to a CNCM 1-5408 bacteriophage protein, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a bacteriophage CNCM 1-5409 protein, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a bacteriophage CNCM 1-5410 protein, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a bacteriophage CNCM 1-5491 protein, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a bacteriophage CNCM 1-5492 protein, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a CNCM 1-5680 bacteriophage protein or a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a mixture of bacteriophage proteins as described above.
  • the detection zone comprises at least one CNCM 1-5408 bacteriophage, at least one CNCM 1-5409 bacteriophage, at least one CNCM 1-5410 bacteriophage, at least one CNCM 1-5491 bacteriophage, at least one bacteriophage CNCM 1-5492, a bacteriophage CNCM 1-5680 or a mixture of bacteriophages as described above.
  • the detection zone comprises at least one protein of the bacteriophage CNCM 1-5408, at least one protein of the bacteriophage CNCM 1-5409, at least one protein of the bacteriophage CNCM 1-5410, at least one protein of the bacteriophage CNCM 1-5410.
  • said strip comprises in order at least: a contact part comprising a contact zone with the sample; a marking part comprising a marking zone which comprises a marker conjugated to at least one ligand specific for the bacterium of interest chosen from at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one protein of at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, at least one protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, a detection part comprising a detection zone for the bacterium of interest which comprises at least one ligand specific for the bacterium of interest, an absorbent part.
  • said at least one ligand specific for the bacterium of interest included in the detection zone is at least one antibody directed against the bacterium of interest, at least one aptamer specific for the bacterium of interest, at least. at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one protein of at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of of interest, at least one bacteriophage protein specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest.
  • the present invention relates to a strip for detecting S. aureus in a sample, comprising in order at least: a contact portion comprising a contact zone with the sample; a labeling part comprising a labeling area which comprises a label conjugated to at least one ligand specific for S. aureus chosen from: at least a bacteriophage specific for S. aureus, at least one protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus, at least one bacteriophage specific for S. aureus coupled to an antibody directed against S. aureus, at least one protein of a bacteriophage specific for S. aureus coupled to an antibody directed against S. aureus; a detection part comprising a detection zone for S. aureus, which comprises at least one ligand specific for S. aureus; an absorbent part.
  • the labeling zone comprises a marker conjugated to at least one bacteriophage specific for S. aureus.
  • it comprises a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5408, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5409, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5410, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5491, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5492, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5680 or a mixture of bacteriophage conjugated with a marker as described above.
  • said marker conjugated to these phages is a gold nanoparticle.
  • the labeling zone comprises a marker conjugated to at least one protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus.
  • said at least one protein is an RBP.
  • it comprises a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5408, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5409, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5410, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5491, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5492, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5680 or a mixture of proteins of bacteriophages conjugated with a marker as described above.
  • said marker conjugated to these bacteriophage proteins is a gold nanoparticle.
  • the detection zone comprises an anti-S aureus antibody or an aptamer specific for S. aureus.
  • the detection zone comprises at least a bacteriophage specific for the bacterium of interest, more particularly a bacteriophage CNCM 1-5408, a bacteriophage CNCM 1-5409, a bacteriophage CNCM 1-5410, a bacteriophage CNCM 1-5491, a bacteriophage CNCM 1-5492, a bacteriophage CNCM 1-5680 or a mixture of bacteriophages as described above. Even more particularly, it comprises these five bacteriophages.
  • the detection zone comprises at least one protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus, in particular a RBP. More particularly, it comprises at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5408, at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5409, at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5410, at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5491, minus one protein from bacteriophage CNCM 1-5492, at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5680 or a mixture of proteins from bacteriophages as described above. Even more particularly, it comprises these five bacteriophage proteins. In particular, the detection zone comprises at least one bacteriophage specific for S.
  • aureus coupled to an antibody directed against S. aureus and / or at least one protein of a bacteriophage specific for S. aureus coupled to a directed antibody. against S. aureus in particular said bacteriophage is chosen from the bacteriophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492, CNCM 1-5680 and a mixture of these bacteriophages such as as described above, and said protein is chosen from the proteins of these phages or a mixture of these bacteriophage proteins as described above.
  • the strip comprises at least four parts
  • one of the ends of the contact part is superimposed with one of the ends of the part downstream thereof to form a first overlap area
  • one of the ends of the marking part is superimposed with one of the ends of the part upstream thereof to form a second overlapping zone and the other end of the marking part is superimposed with one ends of the downstream portion thereof to form a third overlap zone
  • one of the ends of the detection part is superimposed with one of the ends of the part upstream thereof to form a fourth overlapping zone and the other end of the detection part is superimposed with one of the ends of the part downstream thereof to form a fifth zone overlay
  • one of the ends of the absorbent part is superimposed with one of the ends of the part downstream thereof to form a sixth zone of superposition.
  • the first, the second, the third, the fourth, the fifth and the sixth superposition zone are separated from each other.
  • the contact zone is distinct from the first superposition zone.
  • the marking zone is distinct from the second and the third superposition zone.
  • the detection zone is distinct from the fourth and the fifth superposition zone.
  • one of the ends of the marking part is superimposed on one of the ends of the contact part and the other end of the marking part is superimposed on one of the ends of the detection part; the other end of the sensing part being superimposed with one end of the absorbent part.
  • one of the ends of the marking part is superimposed on one of the ends of the contact part to form a first superposition zone
  • the other end of the part of marking is superimposed on one of the ends of the detection part to form a second superposition zone
  • the other end of the sensing part being superimposed with one end of the absorbent part to form a third zone of overlap
  • the first, the second and the third superposition zone are separated from each other.
  • the contact zone is distinct from the first superposition zone.
  • the marking zone is distinct from the first and from the second superposition zone.
  • the detection zone is distinct from the second and from the third superposition zone.
  • the detection zone is a line transverse to the strip, thus forming a detection line or test line (test line).
  • the detection zone is distributed and is limited by a line transverse to the strip.
  • the detection part can further comprise a control zone as described above.
  • TELISA The principle of TELISA consists in trapping, between a “capture antibody” and a “detection antibody”, the analytes (antigens, bacteria, viruses, etc.).
  • the specificity of the detection system of the present invention over the conventional ELISA system is the replacement of one or both antibodies by bacteriophages or bacteriophage proteins.
  • the detection and / or quantification of bacteria in a sample is carried out by replacing one of the two antibodies or of the two antibodies of the classical ELISA test using bacteriophages or bacteriophage proteins.
  • the detection and / or quantification of bacteria in a sample is carried out by replacing one of the two antibodies or of the two antibodies of the conventional ELISA test by bacteriophages or proteins of bacteriophages specific for S. aureus.
  • the antibody coupled to a marker by RBPs coupled directly or indirectly to a marker (gold or other probe). It is possible to use an antibody for revealing and / or detecting the presence of the bacteria in the sample. It is possible to use several bacteriophages or bacteriophage proteins or to combine them with the antibodies in order to capture several bacterial strains (detection spectrum).
  • the bacteriophages or the bacteriophage proteins are used for the capture of the bacteria (analytes) and an antibody is used for the detection (FIG. 7A).
  • the bacteriophages or bacteriophage proteins are immobilized on the support using a solution comprising a cation and a protein (in particular a solution of MgSO 4 and BSA or a solution of NaCl and BSA) .
  • the bacteriophages or bacteriophage proteins specific for S. aureus are immobilized on the support using a solution comprising a cation and a protein (in particular a solution of MgSC> 4 and BSA or a NaCl and BSA solution).
  • the bacteriophage proteins in particular the RBPs, are immobilized on the support using a solution comprising a cation and a protein.
  • the RBPs are immobilized on the support using a solution comprising a cation and a protein, these RBPs allow, in a particular implementation, the detection of S. aureus.
  • the antibody coupled to a marker by proteins of bacteriophages or bacteriophages coupled directly or indirectly to a marker (gold or other probe) for the detection of bacteria ( Figure 7B).
  • the bacteriophage proteins or bacteriophages are specific for S. aureus and are coupled directly or indirectly to a marker (gold or other probe) for the detection of bacteria
  • the bacteriophage proteins are used for the detection of bacteria and are used in a solution comprising a cation and a protein (in particular a solution of MgSO4 and BSA or a solution of NaCl and BSA).
  • the RBPs are used for the detection of bacteria and are used in a solution comprising a cation and a protein (in particular a solution of MgSO4 and BSA or a solution of NaCl and BSA).
  • the RBPs are specific for S. aureus.
  • alternative embodiments of the present invention include the use of bacteriophages or bacteriophage proteins for the capture and detection of bacteria ( Figure 7C) or the use of an antibody for the capture of bacteria and the use of bacteriophages or bacteriophage proteins for detection ( Figure 7B).
  • the bacteriophage proteins are specific for S. aureus.
  • the bacteriophage proteins in particular the RBP, are used for the capture and detection of bacteria and are used in a solution comprising a cation and a protein (in particular a solution of MgSO4 and BSA or a solution of NaCl and BSA).
  • the RBPs are specific for S. aureus.
  • bacteriophage can be replaced by one of the bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 , CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680 or by a mixture of these bacteriophages as described above.
  • RBP can be replaced by an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of bacteriophage CNCM-I-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6 or a mixture of these RBPs as described above.
  • RBP can be replaced by an RBP of bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of bacteriophage CNCM-I-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP from bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP from bacteriophage CNCM 1-5491, an RBP from bacteriophage CNCM 1-5492, an RBP from bacteriophage CNCM 1 -5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4 or else a mixture of these RBPs as described above.
  • Phase proteins as described above.
  • the present invention also relates to an RBP of a bacteriophage specific for S. aureus, in particular an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, more particularly an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of the bacteriophage CNCM-I -5409, more particularly an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, more particularly an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, more particularly an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, and an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5492, more particularly an RBP of sequence SEQ ID NO: 6.
  • the present invention relates to an RBP of bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, and an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3.
  • the RBPs as described above include RBPs having a percentage identity of at least 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • FIG. 1 is a diagram of an M1 embodiment in which A is a marker for the target bacterium (examples: antibody specific to the bacterium coupled to a tag or phage / phage protein coupled to a tag or a marker that stains bacteria) and the solid oval is bacteria.
  • the marker is deposited on the marking part.
  • the phages / phage proteins are deposited on a cellulose membrane line.
  • FIG. 2 is a diagram of an M2 embodiment in which A is a marker for the target bacterium (examples: antibody specific to the bacterium coupled to a tag or phage / phage protein coupled to a tag or a marker that stains bacteria) and the solid oval is bacteria.
  • the marker is deposited on the marking part.
  • the phages / phage proteins are deposited on part of the cellulose membrane.
  • FIG 3 is a diagram of an embodiment M3 identical to M1 but in which the bacteria are stained in the solution with a marker A, said marker A being a marker for the target bacterium (examples: antibody specific to the bacterium coupled to a tag or phage / phage protein coupled to a tag or a tag which stains the bacteria in the solution).
  • the phages / phage proteins are deposited on a cellulose membrane line.
  • FIG 4 is a diagram of an embodiment M4 identical to M2 but in which the bacteria are stained in the solution with a marker A, said marker A being a marker for the target bacterium (for example: a specific antibody to the bacteria coupled to a tag or phage / phage protein coupled to a tag or a tag which colors the bacteria).
  • the phages / phage proteins are deposited on part of the cellulose membrane.
  • FIG. 5 is a diagram of an embodiment M5 identical to M1 but in which the phages / phage proteins and the marker A of the bacteria are deposited on the labeling part (PAD conjugate), said marker A being a marker for the target bacterium (eg, an antibody specific to the bacterium coupled to a phage tag or phage protein coupled to a tag or a tag which stains the bacteria).
  • PID conjugate a marker for the target bacterium
  • FIG. 6 is a diagram of an M6 embodiment identical to M5 but in which the phages / phage proteins are deposited on the labeling part (PAD conjugate) but not the label.
  • the bacteria are stained in the solution with a marker A, said marker A being a marker for the target bacterium (for example: an antibody specific to the bacterium coupled to a marker or phage / phage protein coupled to a marker or a marker that stains the bacteria in the solution).
  • a marker A being a marker for the target bacterium (for example: an antibody specific to the bacterium coupled to a marker or phage / phage protein coupled to a marker or a marker that stains the bacteria in the solution).
  • Figure 7A is a schematic of one embodiment of the invention of an ELISA system, in which phages or phage proteins are used for the capture of the bacteria.
  • Figure 7B is a diagram of an embodiment of the invention of a system
  • ELISA in which phages or phage proteins are used for the detection of the bacteria.
  • Figure 7C is a diagram of one embodiment of the invention of an ELISA system, in which phages or phage proteins are used for the capture and detection of the bacteria.
  • FIG. 8 is a photograph showing the detection of S. aureus on a strip on which bacteriophage proteins are immobilized. The effect of solution A alone is tested (solution containing MgSOf), of solution B (BSA) or of the combination of solutions A and B.
  • FIG. 9 is a photograph showing the detection of S. aureus on a strip on which bacteriophage proteins are immobilized. Different concentrations of bacteria are tested as well as the absence of bacteria in the sample.
  • Figure 10A is a photograph showing a microtiter plate showing the presence of S. aureus.
  • FIG. 11 is a histogram showing the link between the measured optical density (OD) and the concentration of bacteria expressed in CFU / mL, a control without bacteria is present (TM (without bacteria)).
  • Figure 12 is a photograph showing that the expression of RBP proteins of phages 2, 35 and 7 in BL21 bacteria was verified on gel.
  • Figure 13 is a graph showing the specificity of phage phi5 proteins (cD5-biotinylated) by measuring the optical density (on the abscissa) for different strains of bacteria (whose names appear on the ordinate), evaluated by a test Indirect ELISA.
  • Figure 14 is a graph showing the specificity of the proteins of phage phi5 (cD5-biotinylated) and of the anti S. aureus antibody by measuring the optical density (on the abscissa) for different strains of bacteria (including the names appear on the ordinate), evaluated by an indirect ELISA test.
  • Figure 15 is a histogram showing the quantity of S. aureus bacteria of strain 79 captured (determined by the air under the curve) as a function of the solution used for the immobilization of the RBP of the bacteriophage phi 5 (protein ): NaCl and BSA, BSA alone, NaCl alone, and without BSA or NaCl.
  • Figure 16 is a histogram showing the quantity of S. aureus bacteria of the C24b strain captured (determined by the air under the curve) as a function of the solution used for the immobilization of the RBP of the bacteriophage phi 5 (protein ): NaCl and BSA, BSA alone, NaCl alone, and without BSA or NaCl.
  • Figure 17 is a histogram which shows that the RBPs protein of phage 2 has an affinity for the species S. aureus, ie, no affinity for the bacteria S. epidermis or S. algenitis.
  • bacteriophage Determination of the activity of a bacteriophage on a bacterial strain [0225] To identify whether a bacteriophage is specific for a bacterium, the spot method was used. On a Petri dish on which a culture of bacteria in exponential phase is spread, at least one spot comprising the bacteriophage is deposited. If a lysis plaque is observed around the spot, it means that the bacteriophage is active for this bacterium, in other words that the bacteriophage is specific for this bacterium. 1.2. Bacteriophages used
  • the activity spectrum was tested on the 30 strains of S. aureus (Table 1) or on 19 strains of S. aureus (Table 2) by the spot method.
  • Table 1 The intensity of lysis of these phages on each of the bacterial strains is detailed in Table 1 and Table 2.
  • Table 1 therefore represents the activity spectrum of the phages isolated on the strains of bovine S. aureus and Table 2 represents the spectrum of activity of the phages isolated on different bacterial strains.
  • phage K ATCC 19685-B1 (phage 1) infects 28 strains out of the 30 strains tested, ie 93% (Table 1);
  • Bacteriophage 5 infects 14 strains out of the 30 strains tested, ie 47% (Table 1);
  • Bacteriophage 6 infects 14 strains out of the 30 strains tested, ie 47% (Table 1);
  • CNCM 1-5408 (phage 2), CNCM 1-5409 (phage 3), and CNCM 1-5410 (phage 7) made it possible to infect all of the 30 strains, or 100% of the strains tested (Table 1).
  • the phages according to the invention have a broad spectrum of activity of infection of strains of S. aureus and a particularly advantageous rate of elimination of S. aureus (after 3 h of incubation at 37 ° C. in medium BHI).
  • Example 2 Selection of bacteriophage proteins
  • RBP Receptor Binding Protein
  • phages 2, 3, 5, 7, 9 and 10 were sequenced.
  • the search for RBPs was carried out from the complete annotations of the genomes of phages 2, 3, 5, 79 and 10 by targeting the sequences of the “flat base” region. Alignment of the "flat base” sequences of each phage was performed using the phage open reading firame (ORLs) BlastX technique.
  • the RBPs proteins were found at the level of the tail gene cluster and more precisely at the level of the "flat base” part.
  • RBPs of phages 2, 3, 5, 7, 9 and 10 correspond respectively to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the RBPs proteins of phages 2, 3, 5, 7, 9 and 10 were then produced in the bacterium BL21 by the cloning technique.
  • the genes corresponding to the phage proteins were cloned into a bacterial expression vector allowing the synthesis of proteins in fusion with the enzyme Glutathione-S-Transferase (GST) by the host bacterium BL21.
  • GST Glutathione-S-Transferase
  • the GST-P1 and GST-P2 proteins are expressed in a plasmid pDEST15 with an Escherichia coli BL21 star strain (Invitrogen, C601003) in an LB medium (BD, 240230) containing 100 mg / L of ampicillin (Fisher bioreagent , BP 1760-25).
  • a bacterial culture is inoculated at OD 0.05 in the same medium and incubated at 37 ° C and 140 rpm until OD 0.5.
  • the cultures are then induced with 0.1 mM IPTG (Invitrogen, 15529-019) and incubated at 25 ° C and 140 rpm overnight.
  • the cells are then centrifuged at 5000 g and the pellets are taken up in lysis buffer containing 50 mM Hepes (Fisher bioreagent, BP310-500) pH 8,
  • the resin is then recovered using a column with a sintered glass, washed with 50 mM HEPES buffer pH8, 250 mM NaCl, 10% Glycerol, 0.1% NP40; equilibrated with 50 mM HEPES buffer pH8, 50 mM NaCl and eluted in 50 mM HEPES buffer pH8, 50 mM NaCl, 20 mM oxidized glutathione.
  • the proteins are then stored at -80 ° C.
  • Example 3 Evaluation of the specificity of binding of phase proteins to S. aureus
  • the conjugated proteins were added to a mixture of bacteria comprising different species of Staphylococci (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus algnetis). The experiment is performed for each of the proteins independently.
  • the beads are then collected and spread in a Petri dish on a specific agar (Baird Parker). After incubation, the bacterial species immobilized by the proteins are visually identified according to the morphology and the color of the colonies developing on agar. The number of bacteria retained is also determined by counting the colonies on the agar. The affinity or interaction of the tested protein for the target bacteria is assessed by the number of bacteria retained. The higher the number of target bacteria on the agar, the greater the affinity of the protein for the target bacteria.
  • RBP proteins from phages 2, 3, 5 and 7 in BL21 bacteria was verified on gel ( Figure 12).
  • the respective sizes of RBPs of phages 2, 3 and 7 are 78.1 kDa, 100.8 kDa and 79.5 kDa.
  • the RBP size of phage 5 is 100 kDa.
  • the specificity of binding of these proteins to the bacterial species S. aureus was then studied. The results presented in FIG. 17 showed that the RBP protein (gp68) of phage 2 has an affinity for the bacterium Staphylococcus aureus and only for this species of Staphylococcus.
  • the ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the ELISA is an enzyme-linked immunosorbent assay on a solid support, based on the specific antigen-antibody reaction.
  • the principle of an indirect ELISA is to put an antigen on a microplate and add a primary antibody directed against this antigen. A secondary antibody against the heavy chains of the first antibody, coupled to an enzyme, is then added. The addition of the enzyme substrate provides a color reaction measurable by absorbance. 1. Isolation of RPB protein from phage 5
  • Phage 5 was isolated from a sample from a dairy farm in Lrance. This phage is specific to the bacterium Staphylococcus aureus (S. aureus). The phage was deposited with the CNCM (National Collection of Culture of Microorganisms - Institut Pasteur, 25 rue du Dondel Roux, L-75724 Paris cedex 15) on May 7, 2021 under the number CNCM 1-5680. The genome of this phage has been sequenced and the receptor binding protein (RBP) of phage phi5 has been identified (below).
  • CNCM National Collection of Culture of Microorganisms - Institut Pasteur, 25 rue du Do Frankfurt Roux, L-75724 Paris cedex 15
  • the protein sequence of the RBP protein of phage 5 is SEQ ID NO: 4.
  • the phage 5 proteins were reproduced in the BL21 bacterium by the cloning technique.
  • the genes corresponding to the phage proteins were cloned into a bacterial expression vector allowing the synthesis by the host bacterium of proteins using the fusion with the enzyme Glutathione-S-Transferase (GST).
  • GST Glutathione-S-Transferase
  • the proteins are biotinylated beforehand (biotin grafting) using a commercial kit (EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation, Thermo, Ref: 21955). Bacteria at a concentration of 10 7 CFU / mL are immobilized at the bottom of the wells of a microtiter plate for 1 h 30 min at 37 ° C. The bacterial suspension is removed and the wells are saturated with a solution containing 3% BSA and 0.05% Tween20. The saturation solution is removed, then the biotinylated RBP are added.
  • the RBPs are in a 10 ⁇ g / ml solution in 1% BSA, 0.05% Tween20 PBS buffer. An incubation of 1 hour at 37 ° C follows. The wells are washed 5 times with 0.05% PBS-Tween buffer. Streptavidin coupled to HRP (Invitrogene, ref, 434323) at 0.25 pg / mL, dissolved in 1% BSA, 0.05% Tween20 PBS buffer, is added and followed by incubation for 1 h at 37 ° C. The wells are washed 5 times with 0.05% PBS-Tween buffer. 100 ⁇ L of a TMB solution are added, and followed by an incubation of 15 to 30 min at room temperature. 50m1 of 2M sulfuric acid are added to stop the reaction. The optical density of the wells of the plate is then read at 540nm.
  • the affinity of the protein to the bacteria is expressed by the amount of protein retained by each bacterial strain. This amount is evaluated by the absorbance bound to streptavidin coupled to HRP.
  • Example 4 A protocol identical to that of Example 4 was used for the binding of the bacteria and for the performance of the ELISA test with the RBP of phi5.
  • the protocol is as follows; The bacteria are fixed at the bottom of the wells of a micro-plate (ELISA) at 10 7 CFU / mL for 1 h 30 min at 37 ° C. A saturation step with a solution containing 3% BSA and 0.05% Tween is carried out, then the BSA solution is removed. At the same time, in another microplate, the anti S.
  • aureus antibody (ThermoFischer, ref, PA1-7246) is deposited in each well of 9 pg / mL (the concentration can be modified in the range of 5 pg / mL at 50 pg / mL) in PBS buffer (1% BSA; 0.05% Tween). Incubation for 1 hour at 37 ° C. is then carried out. [0266] The wells of the two types of plates are washed (at least 5 times) with the buffer.
  • the affinity of the protein for the bacteria is expressed by the amount of protein or antibody retained by each bacterial strain. This amount is evaluated by the absorbance bound to streptavidin coupled to HRP for phage proteins and to the secondary antibody Goat anti Rabbit IgG (H + L) for the antibody.
  • the detection threshold is set at an optical density value of 0.6: beyond this value, the strain of bacteria is considered to be detected (D); below, she is considered undetected (ND).
  • phage proteins are more specific than antibody. They do not recognize strains of Staphylococcus non-aureus and other bacterial species, while the anti Staphylococcus antibody recognizes Staphylococcus saprophyticus and Staphyoloccus epidermidis.
  • This protein is therefore specific. It can therefore be used for the detection of S. aureus.
  • the immobilization of the phages or phage proteins using the specific solution leads, in the presence of the S. aureus bacteria in the sample, to blocking of. migration due to phage or phage protein immobilized on the membrane.
  • the phage protein immobilization solution comprises either compound A which is BSA used at the concentration of 2 mg / mL, or compound B, which is MgSCL used at the concentration 50 mM, ie the combination of solutions A and B (BSA at a concentration of 2 mg / mL and MgSCL used at a concentration of 50 mM).
  • Figure 8 shows (left) an embodiment in which phage proteins (RBP) have been immobilized in a solution containing BSA at a concentration of 2 mg / mL only (A without B).
  • the left strip is immersed in a sample of raw milk without bacteria
  • the right strip is immersed in a sample of raw milk containing S. aureus bacteria.
  • Figure 8 shows (center) an embodiment in which phage proteins (RBP) were immobilized in a solution containing MgSO4 only at the concentration of 50 mM (B without A).
  • the left strip is immersed in a sample of raw milk without bacteria
  • the right strip is immersed in a sample of raw milk containing S. aureus bacteria.
  • Figure 8 shows (right) an embodiment in which phage proteins (RBP) were immobilized in a solution containing BSA at the concentration of 2 mg / mL and MgSCL at the concentration of 50 mM (A and B).
  • the left strip is immersed in a sample of raw milk without bacteria
  • the right strip is immersed in a sample of raw milk containing S. aureus bacteria.
  • Figure 8 clearly establishes that when the phage proteins are immobilized on the strip thanks to the solution containing both BSA at the concentration of 2 mg / mL and MgSCL at the concentration of 50 mM, the bacteria are captured in the area where phage proteins (RBP) have been immobilized.
  • the strip system made it possible to detect bacteria at 10 3 CFU / mL in a sample of raw milk (FIG. 9).
  • the signal is different when the bacteria are present in the sample and when the bacteria are absent.
  • the strip system according to the invention is based on the immobilization of phages or phage proteins using the solution comprising a protein and a cation (BSA and MgSO 4 ); the signal reflecting the presence of the bacteria is not represented by a colored line as in the conventional system but by a blockage of migration. This type of signal is never described in the prior art.
  • Example 7 Use of the RBP of the bacteriophage phi 5 for the detection of bacteria by the LFA system (strip)
  • the RBP of bacteriophage phi 5 is deposited and immobilized on the membrane at a concentration of 1 mg / mL in a solution containing BSA at 1 mg / mL and NaCl at 150 mM -
  • the RBP of bacteriophage phi 5 is deposited and immobilized on the membrane at a concentration of 1 mg / mL in a solution containing BSA at 1 mg / mL.
  • the RBP of bacteriophage phi 5 is deposited and immobilized on the membrane at a concentration of 1 mg / mL in a solution containing 150 mM NaCl.
  • the RBP of bacteriophage phi 5 is deposited and immobilized on the membrane in a solution containing neither BSA nor NaCl.
  • the anti S. aureus antibody coupled to gold was deposited on the PAD Conjugate.
  • the system is soaked in the solution containing the bacteria at a concentration of 10 7 CFU / mL for 20 min.
  • the signal is processed by ImageJ software: selection of the processing zone and determination by software of the area under curve, proportional to the intensity of the signal.
  • the principle of ELISA consists in trapping, between a “capture antibody” and a “detection antibody”, the analytes (antigens, bacteria, viruses, etc.).
  • the specificity of the detection system of the present invention over the conventional ELISA system is the replacement of one or both antibodies by phages or phage proteins.
  • RBP protein on phage 2 is prepared in a coating buffer containing MgSO4 (50 mM) and BSA (2 mg / mL). The solution is distributed in the wells of a microtiter plate. The plate is then covered and placed in an enclosure at 4 ° C. overnight.
  • the immobilization solution (coating) is removed from each well and the plate is rinsed several times (at least 3 times) with a rinsing buffer (PBS buffer which optionally contains 0.5% Tween) .
  • a rinsing buffer PBS buffer which optionally contains 0.5% Tween
  • the non-specific interactions are then blocked with a saturation buffer, for example the reference buffer: Prod 37578 from Thermofischer.
  • the sample comprising S. aureus bacteria at different dilutions is distributed at the rate of 100 m ⁇ of sample in each well.
  • the PBS solution contains strain 79 at different concentrations.
  • a one hour incubation at room temperature follows. The sample is discarded and the wells are rinsed at least 3 times with the rinse buffer (PBS buffer which optionally contains 0.5% Tween).
  • the anti-S antibody. aureus (Staphylococcus aureus Rabbit Polyclonal Antibody supplied by Thermof ⁇ sher (Ref. 11578351)) conjugated to HRP is added: the volume of 50 ⁇ L of the antibody solution diluted 1/10000 in a PBS 1% BSA 0.05% Tween solution . An incubation of at least 30 min at a temperature of 4 ° C to 37 ° C is then carried out. The antibody solution is removed and the wells are rinsed at least 3 times with the rinsing buffer (PBS buffer which optionally contains 0.5% Tween).
  • PBS buffer which optionally contains 0.5% Tween
  • FIG. 10A A reading of the optical density is taken (FIG. 10A). The intensity of the signal is used to determine the concentration of bacteria ( Figure 10B).
  • the plate reader gives optical densities (OD) corresponding to each well.
  • the extracted results are processed in a spreadsheet.
  • the concentration is determined according to the following steps:

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Abstract

The present invention relates to the use of a solution containing a cation and a protein for immobilising a bacteriophage protein on a support.

Description

CAPTURE DE BACTERIES A L’AIDE DE BACTERIOPHAGES OU DE PROTEINES DE BACTERIOPHAGE CAPTURE OF BACTERIA USING BACTERIOPHAGES OR BACTERIOPHAGE PROTEINS
DOMAINE DE L’INVENTION [0001] La présente invention concerne un dispositif et une méthode de détection rapide de bactéries dans un échantillon. FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a device and a method for the rapid detection of bacteria in a sample.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE STATE OF THE ART
[0002] Les infections bactériennes sont responsables de nombreuses pathologies, notamment dans les élevages et plus particulièrement dans les élevages ovins ou bovins. [0002] Bacterial infections are responsible for numerous pathologies, in particular in farms and more particularly in sheep or cattle farms.
[0003] Pour cela, il est essentiel de pouvoir détecter la présence de la bactérie responsable de l’infection notamment dans le milieu d’élevage, et plus particulièrement d’avoir des méthodes de détection rapide afin de traiter et prévenir les infections bactériennes. Cependant, à ce jour, aucune méthode de détection n’est pleinement satisfaisante. [0003] For this, it is essential to be able to detect the presence of the bacteria responsible for the infection, particularly in the breeding environment, and more particularly to have rapid detection methods in order to treat and prevent bacterial infections. However, to date, no detection method is fully satisfactory.
[0004] Par exemple, les dispositifs de diagnostic présents sur le marché, notamment les dispositifs de détection de la mammite, sont principalement basés sur le dépistage des cellules somatiques qu’on retrouve dans le lait. Or, cette méthode ne permet pas d’identifier la ou les bactérie(s) responsable(s) de l’infection. D’autre part, ces dernières peuvent constituer une trace d’une infection plus ou moins ancienne et donc constituer un indicateur non-spécifique d’une infection en cours. Cela conduit donc les éleveurs à utiliser des antibiothérapies de façon massive et non ciblée. [0004] For example, diagnostic devices on the market, in particular mastitis detection devices, are mainly based on screening for somatic cells found in milk. However, this method does not identify the bacteria or bacteria responsible for the infection. On the other hand, the latter can constitute a trace of a more or less old infection and therefore constitute a non-specific indicator of an ongoing infection. This therefore leads breeders to use antibiotic therapy on a massive scale and not targeted.
[0005] D’autres méthodes de détection des bactéries peuvent être utilisées telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou la méthode de culture. Toutefois, celles-ci nécessitent d’envoyer les échantillons au laboratoire et donc l’intervention de personnes qualifiées pour mettre en œuvre la méthode de détection et pour analyser les résultats. [0006] De plus, l'utilisation de la méthode de culture nécessite un temps d’incubation de 24h à 48h, ce qui représente une attente trop longue des résultats, compte tenu des enjeux du secteur. Concernant l’approche par la biologie moléculaire (PCR et/ou PCR quantitative), bien que plus rapide et plus spécifique, celle-ci est bien plus onéreuse. De plus, la technique de PCR détecte seulement la présence d’ADN des bactéries et non la présence de bactéries viables, ce qui peut entraîner la détection de faux positifs (bactéries mortes et déjà prises en charge par le système immunitaire de l’hôte). [0005] Other methods for detecting bacteria can be used, such as the polymerase chain reaction (PCR) or the culture method. However, these require sending the samples to the laboratory and therefore the intervention of qualified persons to implement the detection method and to analyze the results. [0006] In addition, the use of the culture method requires an incubation time of 24 to 48 hours, which represents too long a wait for the results, given the challenges of the sector. Regarding the molecular biology approach (PCR and / or quantitative PCR), although faster and more specific, it is much more expensive. In addition, the PCR technique only detects the presence of DNA from the bacteria and not the presence of viable bacteria, which can lead to the detection of false positives (dead bacteria already supported by the host's immune system) .
[0007] Ces méthodes ont donc pour inconvénients d’être longues, fastidieuses, de mettre en œuvre des composés chimiques souvent toxiques pour le manipulateur et pour l’environnement, de nécessiter des matériels coûteux et d’être mises en œuvre dans des locaux adaptés, tels que des laboratoires. Elles ne répondent pas aux besoins des utilisateurs de terrain, notamment des éleveurs. [0007] These methods therefore have the drawbacks of being long, tedious, of using chemical compounds that are often toxic for the operator and for the environment, of requiring expensive equipment and of being implemented in suitable premises. , such as laboratories. They do not meet the needs of land users, especially breeders.
[0008] A titre d’ exemple particulièrement illustratif, il peut être cité le cas du vétérinaire souhaitant identifier rapidement un agent pathogène infectieux directement sur le lieu où se trouve l’animal malade. Cette approche dite « point-of-care testing » (POCT) fait l’objet d’une attention toute particulière auprès des professionnels concernés. [0008] As a particularly illustrative example, the case of the veterinarian wishing to quickly identify an infectious pathogen directly on the place where the sick animal is located can be cited. This so-called "point-of-care testing" (POCT) approach is the subject of special attention by the professionals concerned.
[0009] Il existe donc un besoin de mettre à disposition des moyens permettant une détection de bactéries rapide, peu coûteuse, peu nocive pour le manipulateur et pour l’environnement, et ne nécessitant pas la contrainte d’une mise en œuvre dans un laboratoire dédié. [0009] There is therefore a need to provide means allowing rapid detection of bacteria, inexpensive, little harmful to the manipulator and to the environment, and not requiring the constraint of an implementation in a laboratory. dedicated.
[0010] Il existe également un besoin de mettre à disposition des moyens permettant une détection de bactéries « universelle », quelle que soit la nature de l’échantillon d’origine contenant lesdites bactéries. [0010] There is also a need to provide means allowing "universal" detection of bacteria, regardless of the nature of the original sample containing said bacteria.
[0011] Une telle méthode de détection de bactéries pourra également être appliquée dans différents domaines comme par exemple dans la sécurité alimentaire, le contrôle des eaux ou en santé humaine. RÉSUMÉ [0011] Such a method of detecting bacteria could also be applied in various fields such as for example in food safety, water control or in human health. ABSTRACT
[0012] La présente invention concerne l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support. The present invention relates to the use of a solution comprising a cation and a protein for immobilizing a bacteriophage protein on a support.
[0013] Dans un aspect particulier de l’utilisation de cette solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support, ladite protéine de bactériophage est une protéine de liaison au récepteur (RBP). [0013] In a particular aspect of the use of this solution comprising a cation and a protein for immobilizing a bacteriophage protein on a support, said bacteriophage protein is a receptor binding protein (RBP).
[0014] Dans un aspect particulier de l’utilisation de cette solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support, ladite protéine de bactériophage est une RBP spécifique de S. aureus. [0015] Dans un aspect particulier de l’invention, la protéine de la solution utilisée est une protéine de lait, l’albumine, l’albumine de sérum bovin (BSA), une protéine de sérum, une protéine de sérum de poulet ou un anticorps. In a particular aspect of the use of this solution comprising a cation and a protein for the immobilization of a bacteriophage protein on a support, said bacteriophage protein is an RBP specific for S. aureus. In a particular aspect of the invention, the protein of the solution used is a milk protein, albumin, bovine serum albumin (BSA), a serum protein, a chicken serum protein or an antibody.
[0016] Dans un aspect particulier de l’invention, le cation de la solution est choisi parmi un cation monovalent, un cation bivalent, un cation trivalent ou un sel, préférentiellement parmi le groupe comprenant Mg2+, Ca2+, Na+, K+, Fe2+, Fe3+, K+, Zn+, Au3+, Cu+, carbocation, Mn+, Ag+, MgSO4, Na2SCO4, MgCk, CaCk, CaSO4, NaC1, K2SO4 et KC1. In a particular aspect of the invention, the cation of the solution is chosen from a monovalent cation, a divalent cation, a trivalent cation or a salt, preferably from the group comprising Mg2 +, Ca2 +, Na +, K +, Fe2 +, Fe3 +, K +, Zn +, Au3 +, Cu +, carbocation, Mn +, Ag +, MgSO 4 , Na2SCO 4 , MgCk, CaCk, CaSO 4 , NaC1, K2SO 4 and KC1.
[0017] Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support dans laquelle la concentration en cation dans la solution est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive, et la concentration en protéine dans la solution est comprise entre 5 μg/m L et 5 mg/mL de façon inclusive. In a particular aspect, the invention relates to the use of a solution comprising a cation and a protein for the immobilization of a bacteriophage protein on a support in which the cation concentration in the solution is between 5 mM and 800 mM inclusive, and the protein concentration in the solution is between 5 μg / m L and 5 mg / mL inclusive.
[0018] Dans un aspect encore plus particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support dans laquelle la concentration en cation dans la solution est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive, et la concentration en protéine dans la solution est comprise entre 5 μg/m L et 5 mg/mL de façon inclusive et dans laquelle le cation est MgSO4 ou NaC1 et la protéine est la BSA. [0019] L’invention concerne également l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support dans laquelle la protéine de liaison au récepteur (RBP) est choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, une RBP du bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de celles-ci. In an even more particular aspect, the invention relates to the use of a solution comprising a cation and a protein for the immobilization of a bacteriophage protein on a support in which the cation concentration in the solution is between 5 mM and 800 mM inclusive, and the protein concentration in the solution is between 5 μg / m L and 5 mg / mL inclusive and in which the cation is MgSO 4 or NaCl and the protein is BSA. The invention also relates to the use of a solution comprising a cation and a protein for the immobilization of a bacteriophage protein on a support in which the receptor binding protein (RBP) is chosen from an RBP of bacteriophage CNCM 1-5408, RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, RBP of bacteriophage CNCM 1- 5680 or a mixture thereof.
[0020] L’invention concerne plus particulièrement encore l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support dans laquelle la protéine de liaison au récepteur (RBP) est choisie parmi une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP de séquence SEQ ID NO : 4, une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, ou une RBP ayant un pourcentage d’identité d’au moins 95% avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID No. 4, une RBP de séquence SEQ ID NO : 5 ou une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, ou un mélange de celles-ci. The invention relates more particularly still to the use of a solution comprising a cation and a protein for the immobilization of a bacteriophage protein on a support in which the receptor binding protein (RBP) is chosen from an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP of sequence SEQ ID NO: 4, an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, or an RBP having a percentage identity of at least 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID No. 4, an RBP of sequence SEQ ID NO: 5 or an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, or a mixture thereof.
[0021] L’invention a également pour objet un procédé de préparation d'un dispositif comprenant un support solide, ledit procédé comprenant une étape a) d’immobilisation d’une protéine de bactériophage ou d’une combinaison de protéines de bactériophage sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP, optionnellement une étape b) d'élimination de la ou des protéines de bactériophage non immobilisées au support solide, et optionnellement une étape c) de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois. A subject of the invention is also a method for preparing a device comprising a solid support, said method comprising a step a) of immobilizing a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins on the solid support, said immobilization step consisting in bringing the support into contact with a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins in the presence of a solution comprising a cation and a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP, optionally a step b) of removing the bacteriophage protein (s) not immobilized to the solid support, and optionally a step c) of rinsing, which can be repeated at least once.
[0022] Un autre objet de l’invention concerne un dispositif obtenu selon le procédé de préparation décrit ci-dessus, ledit dispositif étant une plaque de microtitration ou une bandelette. [0023] Dans un autre aspect, l’invention concerne un dispositif de flux latéral comprenant un support solide sur lequel est immobilisé une protéine de liaison au récepteur (RBP). Another object of the invention relates to a device obtained according to the preparation process described above, said device being a microtiter plate or a strip. In another aspect, the invention relates to a lateral flow device comprising a solid support on which is immobilized a receptor binding protein (RBP).
[0024] Un autre objet de l’invention concerne l’utilisation du dispositif, pour la détection ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon. Another object of the invention relates to the use of the device, for the detection or quantification of one or more bacteria present in a sample.
[0025] L’invention concerne également un procédé pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon avec un dispositif de type bandelette ou plaque de microtitration pour un test ELISA, comprenant les étapes suivantes : i) une étape d’immobilisation d’une protéine de bactériophage ou d’une combinaison de protéine de bactériophages sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP, ii) optionnellement une étape d'élimination de la ou des protéines de bactériophage non immobilisées au support solide, iii) optionnellement une étape de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois, iv) détection des bactéries liées aux protéines de bactériophages avec un ligand spécifique de la bactérie choisi parmi un bactériophage spécifique de la bactérie marqué, une protéine de bactériophage spécifique de la bactérie marquée, un bactériophage spécifique de la bactérie couplé à un anticorps marqué, une protéine de bactériophage couplé à un anticorps marqué ou un anticorps marqué ou un aptamère marqué dirigé contre la bactérie dans lequel ladite étape iv) est optionnellement réalisée en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine. The invention also relates to a method for the detection and / or quantification of one or more bacteria present in a sample with a device of the microtiter strip or plate type for an ELISA test, comprising the following steps : i) a step of immobilizing a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage protein on the solid support, said immobilization step consisting in bringing the support into contact with a bacteriophage protein or a combination of proteins of bacteriophages in the presence of a solution comprising a cation and a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP, ii) optionally a step of removing the bacteriophage protein (s) not immobilized to the solid support, iii) optionally a step rinsing, which can be repeated at least once, iv) detection of bacteria bound to bacteriophage proteins with a ligand specific for the bacterium chosen from a bacteriophage specific for the labeled bacterium, a bacteriophage protein specific for the labeled bacterium, a bacteriophage specific for the bacterium coupled to a labeled antibody, a bacteriophage protein coupled to a labeled antibody or a labeled antibody or an aptamer labeled directed against the bacterium in which said step iv) is optionally carried out in the presence of a solution comprising a cation and a protein.
[0026] L’invention a également pour objet une protéine de liaison au récepteur (RBP) d’un bactériophage spécifique de S. aureus, ladite RBP est choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :2, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, ou une RBP ayant un pourcentage d’identité d’au moins 95% avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO :3 , SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 6. DÉFINITIONS A subject of the invention is also a protein binding to the receptor (RBP) of a bacteriophage specific for S. aureus, said RBP is chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, and an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, or an RBP having a percentage identity of at least 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5 or SEQ ID NO: 6. DEFINITIONS
[0027] Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante : In the present invention, the terms below are defined as follows:
[0028] « Bactériophage » et « phage » sont utilisés indifféremment et désignent la même entité. [0029] « Bactériophage spécifique d’une bactérie » est un bactériophage capable de se lier spécifiquement à cette bactérie. Cette spécificité peut être déterminée par la méthode des spots décrite dans la présente demande. "Bacteriophage" and "phage" are used interchangeably and denote the same entity. [0029] "Bacteriophage specific for a bacterium" is a bacteriophage capable of binding specifically to this bacterium. This specificity can be determined by the spot method described in the present application.
[0030] « Bandelette » désigne un dispositif de détection par chromatographie à flux latéral, également connu sous le nom d’immunochromatographie à flux latéral. C’est une méthode reposant sur le mouvement d’un échantillon liquide par capillarité à travers une bandelette. Elle a précédemment été décrite pour la détection immunologique d’un analyte d’intérêt dans un échantillon liquide, grâce à un anticorps primaire et un anticorps secondaire (EP1086372B1). Ce sont de simples dispositifs à base de papier destinés à détecter la présence (ou l'absence) d'un analyte cible dans un échantillon liquide (matrice). [0031] « Capture », « liaison », « couplage », « fixation » sont utilisés indifféremment. [0030] "Strip" refers to a device for detection by lateral flow chromatography, also known as lateral flow immunochromatography. It is a method based on the movement of a liquid sample by capillary action through a strip. It has previously been described for the immunological detection of an analyte of interest in a liquid sample, using a primary antibody and a secondary antibody (EP1086372B1). They are simple paper-based devices intended to detect the presence (or absence) of a target analyte in a liquid sample (matrix). "Capture", "link", "coupling", "fixation" are used interchangeably.
[0032] « Immobilisation » est utilisée pour décrire la liaison d’un bactériophage ou d’une protéine de bactériophage sur un support. L’immobilisation peut être réalisée par exemple par adsorption ou par liaison covalente. [0033] « Cation bivalent » et « dication » sont utilisés indifféremment. [0032] "Immobilization" is used to describe the binding of a bacteriophage or bacteriophage protein to a support. The immobilization can be carried out, for example, by adsorption or by covalent bonding. "Divalent cation" and "dication" are used interchangeably.
[0034] « Elément marqué » est un élément (protéine, bactérie, molécule) conjugué à une molécule pouvant être détectée visuellement. Le marqueur est utilisé pour marquer une bactérie. [0035] “ Identique” ou “ Identité” : lorsqu'il est utilisé dans une relation entre les séquences de deux ou plusieurs séquences d'acides aminés, ce terme fait référence au degré de parenté de séquence entre les séquences d'acides aminés, tel que déterminé par le nombre de correspondances entre les chaînes de deux ou plusieurs résidus d'acides aminés. L'identité mesure le pourcentage de correspondances identiques entre les plus petites séquences de deux ou plusieurs séquences, dont les alignements « à trous » (le cas échéant) sont traités par un modèle mathématique ou un programme informatique particulier (c'est-à-dire des "algorithmes"). L'identité de séquences d'acides aminés apparentées peut être facilement calculée par des méthodes connues par l’Homme du métier. Les méthodes préférées pour déterminer l'identité de séquences sont conçues pour donner la plus grande correspondance entre les séquences testées. Les méthodes de détermination de l'identité entre séquences sont décrites dans des programmes informatiques accessibles au public. [0034] "Labeled element" is an element (protein, bacterium, molecule) conjugated to a molecule which can be detected visually. The marker is used to mark bacteria. [0035] “Identical” or “Identity”: when used in a relationship between the sequences of two or more amino acid sequences, this term refers to the degree of sequence relatedness between the amino acid sequences, as determined by the number of matches between the chains of two or more amino acid residues. Identity measures the percentage of identical matches between the smallest sequences of two or more sequences, whose "gap" alignments (if any) are processed by a particular mathematical model or computer program (that is, say "algorithms"). The identity of related amino acid sequences can be easily calculated by methods known to those skilled in the art. The preferred methods for determining the identity of sequences are designed to give the greatest match between the sequences tested. The methods of determining the identity between sequences are described in computer programs available to the public.
[0036] « Ligand spécifique d’une bactérie » est un ligand capable de se lier spécifiquement à la bactérie. Cette spécificité peut être déterminée par la méthode des billes magnétiques par exemple. [0036] "Bacteria-specific ligand" is a ligand capable of specifically binding to bacteria. This specificity can be determined by the method of magnetic beads for example.
[0037] « Marqueur conjugué » peut être une molécule colloïdale par exemple : une nanoparticule d’or (AuNP) ou or colloïdale, une nanoparticule de carbone ou carbone colloïdal, une bille de latex colorée, une particule magnétique, une molécule fluorescente, une molécule luminescente ou une enzyme telle que la peroxydase de raifort qui catalyse la conversion de substrats chromogènes en composés colorés, ou qui produit de la lumière à partir de substrats chimio luminescents. [0037] "Conjugated marker" can be a colloidal molecule, for example: a gold nanoparticle (AuNP) or colloidal gold, a carbon or colloidal carbon nanoparticle, a colored latex bead, a magnetic particle, a fluorescent molecule, a luminescent molecule or an enzyme such as horseradish peroxidase which catalyzes the conversion of chromogenic substrates into colored compounds, or which produces light from chemiluminescent substrates.
[0038] « Plaque de microtitration » désigne un dispositif comprenant un ensemble de puits, il s’agit d’un outil standard dans la recherche et l'analyse clinique des tests de diagnostic des laboratoires. Leur utilisation est très fréquente dans l’Enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS A). [0038] "Microtiter plate" refers to a device comprising a set of wells, it is a standard tool in research and clinical analysis of laboratory diagnostic tests. Their use is very common in the Enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS A).
[0039] « Protéine d’un bactériophage spécifique d’une bactérie » est une protéine capable de se lier spécifiquement à cette bactérie. [0039] "Bacteriophage-specific protein of a bacterium" is a protein capable of binding specifically to this bacterium.
[0040] « Protéine de liaison au récepteur » ou « (RBP) (Receptor Binding Protein) d’un bactériophage » : désigne les protéines qui assurent le contact initial avec le récepteur sur l'enveloppe de la cellule hôte. En effet, celles-ci sont capables de reconnaître des motifs cibles à la surface des bactéries. Au sens de la présente demande, une RBP d’un bactériophage spécifique d’une bactérie est une RBP capable de se lier spécifiquement à cette bactérie. Cette spécificité peut être déterminée par la méthode ELISA telle que décrite dans la présente demande. "Receptor binding protein" or "(RBP) (Receptor Binding Protein) of a bacteriophage": designates the proteins which ensure the initial contact with the receptor on the envelope of the host cell. Indeed, they are able to recognize target patterns on the surface of bacteria. Within the meaning of the present application, an RBP of a bacteriophage specific for a bacterium is an RBP capable of binding specifically to this bacterium. This specificity can be determined by the ELISA method as described in the present application.
Les protéines RBP sont différentes des domaines de liaison à la paroi cellulaire (CBD, Cell Binding Domain). Les RBP sont impliquées dans la première étape du cycle d’infection des phages, alors que les CBD sont impliquées en fin du cycle d’infection. Les CDB sont des domaines protéiques retrouvées dans enzymes lytiques produites par les phages, qui permettent la reconnaissance des peptidoglycanes dans les parois cellulaires. RBP proteins are different from cell wall binding domains (CBD, Cell Binding Domain). RBP is involved in the first stage of the phage infection cycle, while CBD is involved in the late infection cycle. CBDs are protein domains found in lytic enzymes produced by phages, which allow the recognition of peptidoglycans in cell walls.
[0041] « Solution contenant des phages » et « suspension contenant des phages » sont utilisés indifféremment. "Solution containing phages" and "suspension containing phages" are used interchangeably.
[0042] « Surfactant » est une molécule amphiphile permettant d’abaisser la tension superficielle d’une solution aqueuse. A titre d’exemple, le surfactant est le Tween 20. [0042] "Surfactant" is an amphiphilic molecule for lowering the surface tension of an aqueous solution. For example, the surfactant is Tween 20.
[0043] « X conjugué à Y » et « Y conjugué à X » sont utilisés indifféremment. "X conjugated to Y" and "Y conjugated to X" are used interchangeably.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DETAILED DESCRIPTION
Utilisation d’une solution [0044] La présente invention concerne l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine, pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support. Use of a Solution [0044] The present invention relates to the use of a solution comprising a cation and a protein, for immobilizing a bacteriophage protein on a support.
[0045] Dans une mise en œuvre particulière de l’invention, la protéine de bactériophage est préférentiellement une protéine de liaison au récepteur (RBP). In a particular implementation of the invention, the bacteriophage protein is preferably a receptor binding protein (RBP).
[0046] Dans une mise en œuvre tout à fait préférentielle, la protéine de bactériophage et en particulier la RBP est spécifique de Staphylococcus aureus (S. aureus). In a completely preferred implementation, the bacteriophage protein and in particular the RBP is specific for Staphylococcus aureus (S. aureus).
[0047] Dans le cadre de la présente invention, les protéines de bactériophages sont en solution, ladite solution comprenant un cation et une protéine. [0048] L’utilisation de la solution permet d’améliorer l’immobilisation de la protéine de bactériophage sur un support solide. Elle permet également d’améliorer la capture d’une bactérie par la protéine ainsi immobilisée. In the context of the present invention, the bacteriophage proteins are in solution, said solution comprising a cation and a protein. The use of the solution makes it possible to improve the immobilization of the bacteriophage protein on a solid support. It also makes it possible to improve the capture of a bacterium by the protein thus immobilized.
[0049] Cette immobilisation améliorée est observée une fois la bactérie immobilisée sur le support solide par sa liaison avec le bactériophage ou la protéine de bactériophage et après détection de la bactérie ainsi capturée. This improved immobilization is observed once the bacterium is immobilized on the solid support by its binding with the bacteriophage or the bacteriophage protein and after detection of the bacterium thus captured.
[0050] La solution peut être utilisée pour la procédure d’immobilisation de la protéine de bactériophage sur le support et/ou pour détection et/ou quantification d’une bactérie par des bactériophages ou par des protéines de bactériophage. [0051] La protéine de cette solution est notamment choisie parmi les protéines de lait, en particulier l’albumine, encore plus particulièrement l’albumine de sérum bovin (BSA), ou une protéine de sérum, plus particulièrement de sérum de poulet ou encore un anticorps. The solution can be used for the procedure for immobilizing the bacteriophage protein on the support and / or for the detection and / or quantification of a bacterium by bacteriophages or by bacteriophage proteins. The protein of this solution is in particular chosen from milk proteins, in particular albumin, even more particularly bovine serum albumin (BSA), or a serum protein, more particularly from chicken serum or alternatively. an antibody.
[0052] Dans un mode de réalisation particulier, le cation est choisi parmi un cation monovalent, un cation bivalent, un cation trivalent ou un sel, préférentiellement parmi le groupe comprenant Mg2+, Ca2+, Na+, K+, Le2+, Le3+, K+, Zn+, Au3+, Cu+, carbocation, Mn+, Ag+, MgS04, Na2S04, MgCk, CaCk, CaS04, NaCl, K2SO4 et KC1. In a particular embodiment, the cation is chosen from a monovalent cation, a divalent cation, a trivalent cation or a salt, preferably from the group comprising Mg 2 +, Ca 2 +, Na + , K + , Le 2+ , Le 3+ , K + , Zn + , Au 3+ , Cu + , carbocation, Mn + , Ag + , MgS0 4 , Na 2 S04, MgCk, CaCk, CaS0 4 , NaCl, K2SO4 and KC1.
[0053] Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en cation dans la solution est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive. [0054] Dans un mode de réalisation plus particulier, la solution comprend du MgSCL dont la concentration est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive, en particulier entre 5 mM et 300 mM de façon inclusive. In a particular embodiment, the cation concentration in the solution is between 5 mM and 800 mM inclusive. In a more particular embodiment, the solution comprises MgSCL whose concentration is between 5 mM and 800 mM inclusive, in particular between 5 mM and 300 mM inclusive.
[0055] Dans un mode de réalisation plus particulier, la solution comprend du NaCl dont la concentration est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive. [0056] Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en protéine dans la solution est comprise entre 5 pg/mL et 5 mg/mL de façon inclusive. Dans un mode de réalisation plus particulier encore, la protéine est la BSA et sa concentration est comprise entre 0,1 mg/mL à 5 mg/mL de façon inclusive. In a more particular embodiment, the solution comprises NaCl the concentration of which is between 5 mM and 800 mM inclusive. In a particular embodiment, the protein concentration in the solution is between 5 pg / mL and 5 mg / mL inclusive. In a mode of more particularly still, the protein is BSA and its concentration is between 0.1 mg / mL to 5 mg / mL inclusive.
[0057] Dans un mode de réalisation, la solution comprend de la BSA à une concentration de 5 ug/m L à 5 mg/mL et du MgSCL à une concentration de 5 mM à 800 mM de façon inclusive. In one embodiment, the solution comprises BSA at a concentration of 5 µg / m L to 5 mg / mL and MgSCL at a concentration of 5 mM to 800 mM inclusive.
[0058] Dans un mode de réalisation, la solution comprend de la BSA à une concentration de 0,1 mg/mL à 5 mg/mL et du MgSCL à une concentration de 5 mM à 300 mM de façon inclusive. In one embodiment, the solution comprises BSA at a concentration of 0.1 mg / mL to 5 mg / mL and MgSCL at a concentration of 5 mM to 300 mM inclusive.
[0059] Dans un mode de réalisation particulier, la solution comprend de la BSA à la concentration de 2 mg/mL et du MgSCL à la concentration de 50 mM. In a particular embodiment, the solution comprises BSA at a concentration of 2 mg / mL and MgSCL at a concentration of 50 mM.
[0060] Dans un mode de réalisation, la solution comprend de la BSA à une concentration de 5 Lig/m L à 5 mg/mL et du NaCl à une concentration de 5 mM à 800 mM de façon inclusive. In one embodiment, the solution comprises BSA at a concentration of 5 Lig / m L to 5 mg / mL and NaCl at a concentration of 5 mM to 800 mM inclusive.
[0061] Dans un mode de réalisation, la solution comprend de la BSA à la concentration de 1 mg/mL et du NaCl à la concentration de 150 mM. In one embodiment, the solution comprises BSA at a concentration of 1 mg / mL and NaCl at a concentration of 150 mM.
[0062] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend en outre un agent stabilisant, comme le glycérol et/ou un sucre, par exemple du sorbitol et/ou du sucrose. In a particular embodiment, said composition further comprises a stabilizing agent, such as glycerol and / or a sugar, for example sorbitol and / or sucrose.
[0063] Dans le cadre de la présente invention, tout type de bactériophage spécifique d’une bactérie peut être utilisé. Dans un mode de réalisation particulier, le bactériophage est spécifique de S. aureus, il s’agit plus particulièrement, d’un bactériophage choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. [0064] Il peut s’agir en particulier d’un bactériophage spécifique de S. aureus, plus particulièrement, d’un bactériophage choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, et CNCM 1-5492. In the context of the present invention, any type of bacteriophage specific for a bacterium can be used. In a particular embodiment, the bacteriophage is specific for S. aureus, it is more particularly, a bacteriophage chosen from bacteriophages specific for S. aureus such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680. It may in particular be a bacteriophage specific for S. aureus, more particularly, a bacteriophage chosen from bacteriophages specific for S. aureus as deposited with the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, and CNCM 1-5492.
[0065] Il peut s’agir en particulier d’un bactériophage spécifique de S. aureus, plus particulièrement, d’un bactériophage choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. It may in particular be a bacteriophage specific for S. aureus, more particularly, a bacteriophage chosen from bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
[0066] En particulier, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de bactériophages spécifiques de S. aureus choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491 et CNCM 1-5492. In particular, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of bacteriophages specific for S. aureus chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491 and CNCM 1-5492.
[0067] En particulier, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de bactériophages spécifiques de S. aureus choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. [0068] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 2 bactériophages choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. In particular, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of bacteriophages specific for S. aureus chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 2 bacteriophages chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1 -5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
[0069] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange du bactériophage CNCM 1-5408 avec l’un des bactériophages CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 ou CNCM 1-5680, i.e. un mélange des bactériophages CNCM 1-5408 et CNCM 1-5409, des bactériophages CNCM 1-5408 et CNCM 1-5410, des bactériophages CNCM 1-5408 et CNCM 1-5491, des bactériophages CNCM 1-5408 et CNCM 1-5492 ou des bactériophages CNCM 1-5408 et CNCM 1-5680. [0070] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange du bactériophage CNCM 1-5409 avec l’un des bactériophages CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 ou CNCM 1-5680, i.e. un mélange des bactériophages CNCM 1-5409 et CNCM 1-5410, des bactériophages CNCM 1-5409 et CNCM 1-5491, des bactériophages CNCM 1-5409 et CNCM 1-5492 ou des bactériophages CNCM 1-5409 et CNCM 1-5680. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophage CNCM 1-5408 with one of the bacteriophages CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 or CNCM 1-5680, ie a mixture of bacteriophages CNCM 1-5408 and CNCM 1-5409, bacteriophages CNCM 1-5408 and CNCM 1-5410, bacteriophages CNCM 1-5408 and CNCM 1-5491, bacteriophages CNCM 1- 5408 and CNCM 1-5492 or bacteriophages CNCM 1-5408 and CNCM 1-5680. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophage CNCM 1-5409 with one of the bacteriophages CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 or CNCM 1-5680 , ie a mixture of the bacteriophages CNCM 1-5409 and CNCM 1-5410, of the bacteriophages CNCM 1-5409 and CNCM 1-5491, bacteriophages CNCM 1-5409 and CNCM 1-5492 or bacteriophages CNCM 1-5409 and CNCM 1-5680.
[0071] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange du bactériophage CNCM 1-5410 avec l’un des bactériophages CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 ou CNCM 1-5680, i.e. un mélange des bactériophages CNCM 1-5410 et CNCM 1-5491, des bactériophages CNCM 1-5410 et CNCM 1-5492 ou des bactériophages CNCM 1-5410 et CNCM 1-5680. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophage CNCM 1-5410 with one of the bacteriophages CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 or CNCM 1-5680, ie a mixture of bacteriophages CNCM 1-5410 and CNCM 1-5491, bacteriophages CNCM 1-5410 and CNCM 1-5492 or bacteriophages CNCM 1-5410 and CNCM 1-5680.
[0072] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange du bactériophage CNCM 1-5491 avec l’un des bactériophages CNCM 1-5492 ou CNCM 1-5680, i.e. un mélange des bactériophages CNCM 1-5491 et CNCM 1-5492 ou des bactériophages CNCM 1-5491 et CNCM 1-5680. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophage CNCM 1-5491 with one of the bacteriophages CNCM 1-5492 or CNCM 1-5680, ie a mixture of the bacteriophages CNCM 1-5491 and CNCM 1-5492 or bacteriophages CNCM 1-5491 and CNCM 1-5680.
[0073] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange du bactériophage CNCM 1-5492 avec le bactériophage CNCM 1-5680, i.e. un mélange des bactériophages CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. [0074] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 3 bactériophages choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophage CNCM 1-5492 with the bacteriophage CNCM 1-5680, i.e. a mixture of the bacteriophages CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 3 bacteriophages chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1 -5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
[0075] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange des bactériophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 et CNCM 1-5410. Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange des bactériophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5491 et CNCM 1-5492. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 and CNCM 1-5410. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of the bacteriophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5491 and CNCM 1-5492.
[0076] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 4 bactériophages choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 4 bacteriophages chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1 -5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
[0077] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 5 bactériophages choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 5 bacteriophages chosen from the strains deposited at the CNCM under the CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680 numbers.
[0078] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 6 bactériophages choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. According to one embodiment, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 6 bacteriophages chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1 -5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680.
[0079] Dans le cadre de la présente invention, tout type de protéine de bactériophage spécifique d’une bactérie peut être utilisé. In the context of the present invention, any type of bacteriophage protein specific for a bacterium can be used.
[0080] De façon préférentielle, la protéine utilisée est une protéine de liaison au récepteur des phages (Receptor Binding Protein ou RBP). Il s’agit en particulier de l’utilisation d’une protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus. Preferably, the protein used is a phage receptor binding protein (Receptor Binding Protein or RBP). This relates in particular to the use of a protein from a bacteriophage specific for S. aureus.
[0081] En particulier, il peut d’agir d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, et CNCM 1-5492 ou d’un mélange de celles-ci. In particular, it can act as an RBP of a bacteriophage specific for S. aureus chosen from bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 , CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, and CNCM 1-5492 or a mixture thereof.
[0082] En particulier, 1 il peut s’agir d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680 ou d’un mélange de celles-ci. [0083] En particulier, il peut s’agir d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4 ou d’un mélange de celles-ci. [0084] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 2 RBP choisies parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4. [0085] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, et d’une RBP choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquenceIn particular, 1 it may be an RBP of a bacteriophage specific for S. aureus chosen from bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the CNCM 1-5408, CNCM 1- 5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680 or a mixture thereof. In particular, it may be an RBP of bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5680 , in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4 or a mixture thereof. According to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 2 RBP chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1- 5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4. According to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, and of an RBP chosen from an RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular a RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence
SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4. SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
[0086] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :2, et d’une RBP choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4. According to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, and of a RBP chosen from an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1- 5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
[0087] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :3, et d’une RBP choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4. According to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, and of a RBP chosen from an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
[0088] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, et d’une RBP choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4. According to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, and of a RBP chosen from an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
[0089] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4. According to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and of a RBP of the bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
[0090] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 3 RBP choisies parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquenceAccording to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 3 RBP chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence
SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4. SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
[0091 ] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 4 RBP choisies parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquenceAccording to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 4 RBPs chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence
SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4. SEQ ID NO: 5, an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
[0092] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 5 RBP choisies parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquenceAccording to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 5 RBPs chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence
SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4. SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
[0093] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 6 RBP choisies parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquenceAccording to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 6 RBPs chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3; an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence
SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4. SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, and an RBP of bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4.
[0094] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 2 ou 3 RBP choisies parmi une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP de séquence SEQ ID NO : 3. According to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 2 or 3 RBP chosen from an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of sequence SEQ ID NO: 3.
[0095] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 2, 3, 4, 5 ou 6 RBP choisies parmi une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP de séquence SEQ ID NO :4, une RBP de séquence SEQ ID NO : 5 et une RBP de séquence SEQ ID NO : 6. [0096] Selon un mode de réalisation, les RBP précédemment décrites englobent également des RBP ayant un pourcentage d’identité d’au moins 95% avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6 ou un mélange de celles-ci. [0097] Notamment, dans le cadre de la procédure de détection selon l'invention, les bactériophages ou protéines de bactériophages, en particulier les protéines de bactériophages et plus particulièrement encore les RBP, sont immobilisés sur des supports par exemple des plaques de microtitration, des bandelettes d'essai, des lames, des plaquettes, des matériaux filtrants ou des chambres cellulaires à flux continu. Les structures de support peuvent par exemple comprendre du polystyrène, du polypropylène, du polycarbonate, du PMMA, de l'acétate de cellulose, de la nitrocellulose, du verre ou une plaquette de silicium. According to one embodiment, the RBP of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of 2, 3, 4, 5 or 6 RBP chosen from an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP of sequence SEQ ID NO: 4, an RBP of sequence SEQ ID NO: 5 and an RBP of sequence SEQ ID NO: 6. According to one embodiment, the previously described RBPs also include RBPs having a percentage identity of at least 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 or a mixture thereof. In particular, in the context of the detection procedure according to the invention, the bacteriophages or bacteriophage proteins, in particular the bacteriophage proteins and more particularly the RBP, are immobilized on supports, for example microtiter plates, test strips, slides, wafers, filter media or continuous flow cell chambers. The support structures can for example comprise polystyrene, polypropylene, polycarbonate, PMMA, cellulose acetate, nitrocellulose, glass or a silicon wafer.
[0098] Dans le cadre de la mise en œuvre sur un support de type bandelette, le support est un dispositif à base de papier. Procédé pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries nréscntcfs) dans un échantillon In the context of the implementation on a strip type support, the support is a paper-based device. Method for the detection and / or quantification of one or more nréscntcfs bacteria) in a sample
[0099] La présente invention a pour objet un procédé pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon avec un dispositif de type bandelette ou plaque de microtitration pour un test ELISA, comprenant les étapes suivantes : i) une étape d’immobilisation d’une protéine de bactériophage ou d’une combinaison de protéine de bactériophages sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP, ii) optionnellement une étape d’élimination de la ou des protéines de bactériophage non immobilisées au support solide, iii) optionnellement une étape de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois, iv) détection des bactéries liées aux protéines de bactériophages avec un ligand spécifique de la bactérie choisi parmi un bactériophage spécifique de la bactérie marqué, une protéine de bactériophage spécifique de la bactérie marquée, un bactériophage spécifique de la bactérie couplé à un anticorps marqué, une protéine de bactériophage couplé à un anticorps marqué ou un anticorps marqué ou un aptamère marqué dirigé contre la bactérie dans lequel ladite étape iv) est optionnellement réalisée en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine [0100] Les phages ou bactériophages utilisés dans le procédés sont telles que décrites ci-dessous. The present invention relates to a method for the detection and / or quantification of one or more bacteria present in a sample with a device of the microtiter strip or plate type for an ELISA test, comprising the steps following: i) a step of immobilizing a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage protein on the solid support, said immobilization step consisting of bringing the support into contact with a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins in the presence of a solution comprising a cation and a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP, ii) optionally a step of removing the bacteriophage protein (s) not immobilized to the solid support, iii) optionally a rinsing step, which can be repeated at least once, iv) detection of bacteria bound to bacteriophage proteins with a ligand specific for the bacterium chosen from a bacteriophage specific for the labeled bacterium, a bacteriophage protein specific for the labeled bacterium, a bacteriophage specific for the bacterium coupled to a labeled antibody, a bacteriophage protein coupled to a labeled antibody or a labeled antibody or a labeled aptamer directed against the bacteria in which said step iv) is optionally carried out in the presence of a solution comprising a cation and a protein [0100] The phages or bacteriophages used in the method are as described below.
Procédé de préparation d’un dispositif Method of preparing a device
[0101] La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un dispositif comprenant un support solide, ledit dispositif étant préférentiellement une plaque de microtitration ou une bandelette, et ledit procédé comprenant : une étape a) d’immobilisation d’un bactériophage ou d’une combinaison de bactériophages ou d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, optionnellement une étape b) d’élimination du ou des bactériophages ou de la ou des protéines de bactériophages non immobilisés au support solide, et optionnellement une étape c) de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois. [0101] A subject of the present invention is also a method for preparing a device comprising a solid support, said device preferably being a microtiter plate or a strip, and said method comprising: a step a) of immobilizing a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins on the solid support, said immobilizing step consisting of contacting the support with a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins in the presence of a solution comprising a cation and a protein, optionally a step b) of elimination of the bacteriophage (s) or of the bacteriophage protein (s) not immobilized to the solid support, and optionally a rinsing step c), which can be repeated at least once.
[0102] La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un dispositif comprenant un support solide, ledit dispositif étant préférentiellement une plaque de micro titration ou une bandelette, et ledit procédé comprenant : une étape a) d’immobilisation d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, optionnellement une étape b) d'élimination de la ou des protéines de bactériophages non immobilisés au support solide, et optionnellement une étape c) de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois. [0103] Dans une mise en œuvre particulière du procédé, le support solide est une plaque de microtitration ou une bandelette. [0102] A subject of the present invention is also a method for preparing a device comprising a solid support, said device preferably being a microtitration plate or a strip, and said method comprising: a step a) of immobilizing a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins on the solid support, said immobilization step consisting in bringing the support into contact with a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins bacteriophages in the presence of a solution comprising a cation and a protein, optionally a step b) of removing the bacteriophage protein (s) not immobilized to the solid support, and optionally a step c) of rinsing, which can be repeated at least Once. In a particular implementation of the method, the solid support is a microtiter plate or a strip.
[0104] Dans une mise en œuvre particulière de l’invention, le procédé de préparation met en œuvre des bactériophages ou une combinaison de bactériophages ou des protéines de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages tels que décrits précédemment [0104] In a particular implementation of the invention, the preparation process uses bacteriophages or a combination of bacteriophages or bacteriophage proteins or a combination of bacteriophage proteins as described above
[0105] Dans une mise en œuvre particulière du procédé, les bactériophages sont spécifiques de S. aureus, et plus particulièrement encore, sont tels que décrits ci-dessus. In a particular implementation of the method, the bacteriophages are specific for S. aureus, and more particularly still, are as described above.
[0106] Dans une mise en œuvre particulière du procédé, la protéine de bactériophage ou la combinaison de protéines de bactériophages est une RBP ou une combinaison de RBP, notamment les RBP spécifiques de S. aureus et plus particulièrement encore, les RBP sont telles que décrites ci-dessus. In a particular implementation of the method, the bacteriophage protein or the combination of bacteriophage proteins is an RBP or a combination of RBP, in particular the RBPs specific for S. aureus and more particularly still, the RBPs are such that described above.
[0107] Il est entendu que le procédé de préparation du dispositif selon l’invention se distingue des procédés de l’art antérieur en ce que l’étape d’immobilisation d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages, notamment une ou plusieurs RBP de bactériophage, ou du bactériophage ou d’une combinaison de bactériophages, se fait en une étape unique en présence d’une solution comprenant simultanément un cation et une protéine. [0108] Dans les différents procédés décrits ci-dessus, l’étape a) se poursuit par une incubation du support en présence de la solution de protéine et de cation et d’un bactériophage ou d’une combinaison de bactériophages ou d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages. La durée de cette étape et la température d’incubation sont définies par l’homme du métier. It is understood that the method for preparing the device according to the invention differs from the methods of the prior art in that the step of immobilizing a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins , in particular one or more RBP of bacteriophage, or of the bacteriophage or of a combination of bacteriophages, is carried out in a single step in the presence of a solution simultaneously comprising a cation and a protein. In the various methods described above, step a) continues with incubation of the support in the presence of the solution of protein and cation and of a bacteriophage or of a combination of bacteriophages or of a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins. The duration of this step and the incubation temperature are defined by those skilled in the art.
Dispositif obtenu Device obtained
[0109] Un des objets de la présente invention est un dispositif obtenu par le procédé décrit ci-dessus, ainsi ledit dispositif comprend un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages immobilisés à sa surface. One of the objects of the present invention is a device obtained by the method described above, thus said device comprises a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a protein of bacteriophages or a combination of proteins of bacteriophages immobilized on its surface.
[0110] Ainsi un autre objet de l’invention est un dispositif de flux latéral comprenant un support solide sur lequel est immobilisé une protéine de liaison au récepteur (RBP). [0110] Thus another object of the invention is a lateral flow device comprising a solid support on which is immobilized a receptor binding protein (RBP).
[0111] Dans une mise en œuvre de l’invention le bactériophage ou la combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou la combinaison de protéine de bactériophages, la RBP ou la combinaison de RBP est spécifique de S. aureus. [0111] In one implementation of the invention the bacteriophage or the combination of bacteriophages or a protein of bacteriophages or the protein combination of bacteriophages, the RBP or the combination of RBP is specific for S. aureus.
[0112] Dans une mise en œuvre de l’invention, la bactérie d’intérêt est S. aureus. [0112] In one embodiment of the invention, the bacterium of interest is S. aureus.
[0113] Un autre objet de l’invention est une plaque de microtitration obtenue par le procédé décrit ci-dessus mettant en œuvre une solution comprenant un cation et une protéine, ainsi ladite plaque de microtitration comprend un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages immobilisés à sa surface {i.e., surface du support solide). Another object of the invention is a microtiter plate obtained by the method described above using a solution comprising a cation and a protein, thus said microtiter plate comprises a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins immobilized on its surface (ie, surface of the solid support).
[0114] Un autre objet de l’invention est une plaque de microtitration obtenue par le procédé décrit ci-dessus mettant en œuvre une solution comprenant un cation et une protéine, ainsi ladite plaque de microtitration comprend une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage, notamment une RBP ou une combinaison de RBP, et en particulier, une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage spécifiques de S. aureus immobilisés à sa surface {i.e., surface du support solide). [0115] Dans une mise en œuvre de l’invention, le bactériophage ou la combinaison de bactériophages ou la protéine de bactériophages ou la combinaison de protéines de bactériophages est tel que décrit précédemment. Another object of the invention is a microtiter plate obtained by the method described above using a solution comprising a cation and a protein, thus said microtiter plate comprises a bacteriophage protein or a combination of proteins. bacteriophage, in particular an RBP or a combination of RBP, and in particular, a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins specific for S. aureus immobilized on its surface (ie, surface of the solid support). In one implementation of the invention, the bacteriophage or the combination of bacteriophages or the protein of bacteriophages or the combination of proteins of bacteriophages is as described above.
[0116] Dans une mise en œuvre selon l’invention, le dispositif obtenu selon le procédé de préparation est une plaque de microtitration ou une bandelette, et le support étant préférentiellement constitué de polystyrène, polypropylène, polycarbonate, cellulose acétate, cellulose, verre, et/ou silicium. In an implementation according to the invention, the device obtained according to the preparation process is a microtiter plate or a strip, and the support preferably consisting of polystyrene, polypropylene, polycarbonate, cellulose acetate, cellulose, glass, and / or silicon.
[0117] Dans une mise en œuvre particulière de l’invention, le dispositif selon l’invention est une plaque de microtitration ou une bandelette qui comprend un support solide sur lequel est immobilisé une protéine de liaison au récepteur (RB P), le support étant préférentiellement constitué de polystyrène, polypropylène, polycarbonate, cellulose acétate, cellulose, verre, et/ou silicium, le support étant notamment enduit avec une protéine. In a particular implementation of the invention, the device according to the invention is a microtiter plate or a strip which comprises a solid support on which is immobilized a protein binding to the receptor (RB P), the support preferably consisting of polystyrene, polypropylene, polycarbonate, cellulose acetate, cellulose, glass, and / or silicon, the support being in particular coated with a protein.
[0118] La fixation, capture ou liaison du bactériophage ou de la protéine de bactériophage à la bactérie est un des aspects de l’invention. Ce qui est important à cet égard, c'est la liaison fonctionnelle, c'est-à-dire que les bactériophages ou protéines de bactériophages, anticorps ou aptamères aient des structures accessibles aux bactéries, malgré l’immobilisation au matériau de support. [0118] The binding, capture or binding of the bacteriophage or of the bacteriophage protein to the bacteria is one aspect of the invention. What is important in this regard is functional binding, that is, whether the bacteriophages or bacteriophage proteins, antibodies or aptamers have structures accessible to bacteria, despite immobilization to the support material.
[0119] Pour supprimer une réaction non spécifique des bactéries à étudier avec le matériau du support, il est possible de mettre en œuvre notamment préalablement au couplage ou postérieurement au couplage sur un support solide, un blocage avec une protéine, notamment de l’albumine de sérum bovin (BSA) ou du Tween 20 ou des substances similaires connues, comme par exemple du lait en poudre ou encore un anticorps non spécifique de la bactérie. [0120] L'immobilisation peut être obtenue sur un support nu ou sur un support préenduit avec une protéine et notamment l’albumine ou un anticorps. To suppress a nonspecific reaction of the bacteria to be studied with the material of the support, it is possible to implement in particular before the coupling or after the coupling on a solid support, a blockage with a protein, in particular albumin. bovine serum (BSA) or Tween 20 or similar known substances, such as for example powdered milk or else an antibody not specific to the bacteria. [0120] The immobilization can be obtained on a bare support or on a support pre-coated with a protein and in particular albumin or an antibody.
[0121] Ces supports peuvent être produits, préalablement à leur utilisation et être stockés en vue de leur utilisation. [0122] À cette fin, une solution comprenant un cation et une protéine, et des bactériophages ou protéines de bactériophages, en particulier des RBP, est appliquée sur le support. Après immobilisation, par exemple à 4-20°C pendant la nuit ou à 30-65°C pendant 2-4 h, la solution est éliminée et la structure de support est séchée. Dispositif bandelette [0121] These supports can be produced prior to their use and be stored with a view to their use. To this end, a solution comprising a cation and a protein, and bacteriophages or bacteriophage proteins, in particular RBP, is applied to the support. After immobilization, for example at 4-20 ° C overnight or at 30-65 ° C for 2-4 h, the solution is removed and the support structure is dried. Strip device
[0123] Selon un aspect particulier, l’invention porte sur une bandelette de chromatographie pour détecter une bactérie d’intérêt dans un échantillon. [0123] According to a particular aspect, the invention relates to a chromatography strip for detecting a bacterium of interest in a sample.
[0124] Un autre objet de l’invention est une bandelette obtenue par le procédé décrit ci- dessus mettant en œuvre une solution comprenant un cation et une protéine, ainsi ladite plaque de microtitration comprend un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages immobilisés à sa surface (i.e., surface du support solide). Another object of the invention is a strip obtained by the method described above using a solution comprising a cation and a protein, thus said microtiter plate comprises a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a protein of bacteriophages or a combination of bacteriophage proteins immobilized on its surface (ie, surface of the solid support).
[0125] Un autre objet de l’invention est une bandelette obtenue par le procédé décrit ci- dessus mettant en œuvre une solution comprenant un cation et une protéine, ainsi ladite bandelette comprend une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage, notamment une RBP ou une combinaison de RBP, et en particulier, une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage immobilisées à sa surface (i.e., surface du support solide). Another object of the invention is a strip obtained by the method described above using a solution comprising a cation and a protein, thus said strip comprises a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins, in particular an RBP or a combination of RBP, and in particular, a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins immobilized on its surface (ie, surface of the solid support).
[0126] Chacune des mises en œuvre décrites ci-dessous est particulièrement adaptée à la détection de S. aureus. Each of the implementations described below is particularly suitable for the detection of S. aureus.
[0127] Les mises en œuvre décrites ci-dessous qui font références à des protéines de bactériophages sont particulièrement adaptées à des protéines de type RBP et plus particulièrement encore à des RBP spécifiques de S. aureus. The implementations described below which refer to bacteriophage proteins are particularly suited to proteins of RBP type and more particularly still to RBPs specific for S. aureus.
[0128] Selon un autre aspect, l’invention a pour objet une bandelette sur laquelle est immobilisée une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage. Selon un mode de réalisation, les protéines de bactériophage ou les combinaisons de protéines de bactériophage sont telles que décrites précédemment. [0129] La particularité de la bandelette de détection de l’invention est le blocage de la migration des bactéries sur le support. According to another aspect, the subject of the invention is a strip on which is immobilized a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins. According to one embodiment, the bacteriophage proteins or the combinations of bacteriophage proteins are as described above. The particularity of the detection strip of the invention is the blocking of the migration of bacteria on the support.
[0130] Les modes de réalisation de bandelette sont décrits dans les Figures 1 à 6. [0130] The strip embodiments are described in Figures 1 to 6.
[0131] Les modes de réalisation de la bandelette décrits ci-après sont décrits avant utilisation de ladite bandelette, c’est-à-dire avant mise en contact avec l’échantillon à analyser. [0131] The embodiments of the strip described below are described before use of said strip, that is to say before contacting the sample to be analyzed.
[0132] Ainsi, la présente invention concerne notamment une bandelette pour détecter une bactérie d’intérêt, en particulier S. aureus, dans un échantillon, comprenant au moins une partie qui comprend au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt et/ou au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt. [0132] Thus, the present invention relates in particular to a strip for detecting a bacterium of interest, in particular S. aureus, in a sample, comprising at least one part which comprises at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest and / or at least one protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest.
[0133] Dans un mode de réalisation particulier, ladite bandelette de chromatographie à flux latéral comprend dans l’ordre au moins : une partie de contact (sample pad) comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; - une partie de détection comprenant une zone de détection de la bactérie d’intérêt qui comprend au moins un bactériophage spécifique de ladite bactérie d’intérêt et/ou au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de ladite bactérie d’intérêt, une partie absorbante. [0133] In a particular embodiment, said lateral flow chromatography strip comprises in order at least: a contact part (sample pad) comprising a contact zone with the sample; a detection part comprising a zone for detecting the bacterium of interest which comprises at least one bacteriophage specific for said bacterium of interest and / or at least one protein of at least one bacteriophage specific for said bacterium of interest, an absorbent part.
[0134] La partie de contact (sample pad) comprend une zone de contact destinée à être mise en contact avec l’échantillon. Sa fonction est de répartir uniformément l'échantillon pour que la migration de l’échantillon par capillarité vers les parties suivantes soit lisse, continue et homogène. La partie de contact et la zone de contact sont une matrice capillaire. Par exemple, la partie de contact et la zone de contact sont en cellulose ou en fibres de verre. [0135] La partie de détection (détection pad) comprend une zone de détection où la bactérie d’intérêt, si elle est présente dans l’échantillon analysé, est captée sur la bandelette grâce à un ligand spécifique de celle-ci qui y est immobilisé. Le rôle de la partie de détection est donc de fournir un bon support et une bonne liaison pour l’immobilisation des ligands spécifiques, tout en limitant les immobilisations non spécifiques. Par exemple, la partie de détection et la zone de détection sont une membrane de nitrocellulose. The contact part (sample pad) comprises a contact zone intended to be brought into contact with the sample. Its function is to distribute the sample uniformly so that the migration of the sample by capillary action to the following parts is smooth, continuous and homogeneous. The contact part and the contact area are a capillary matrix. For example, the contact portion and the contact area are made of cellulose or glass fibers. The detection part (detection pad) comprises a detection zone where the bacterium of interest, if it is present in the sample analyzed, is captured on the strip thanks to a specific ligand thereof which is therein. immobilized. The role of the detection part is therefore to provide a good support and a good connection for immobilization of specific ligands, while limiting non-specific immobilizations. For example, the detection part and the detection area are a nitrocellulose membrane.
[0136] Au sens de la présente demande, un ligand spécifique d’une bactérie est choisi parmi un anticorps dirigé contre la bactérie, un bactériophage spécifique de la bactérie, une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie, un bactériophage spécifique de la bactérie couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie, une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie. En particulier, il s’agit d’un ligand spécifique de S. aureus et est donc choisi parmi un anticorps dirigé contre S. aureus (ou anti-S. aureus), un bactériophage spécifique de S. aureus, une protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus, un bactériophage spécifique de S. aureus couplé à un anticorps anti-S. aureus, une protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus couplée à un anticorps anti-S. aureus. For the purposes of the present application, a ligand specific for a bacterium is chosen from an antibody directed against the bacterium, a bacteriophage specific for the bacterium, a protein of a bacteriophage specific for the bacterium, a bacteriophage specific for the bacterium. bacterium coupled to an antibody directed against the bacterium, a protein of a specific bacteriophage of the bacterium coupled to an antibody directed against the bacterium. In particular, it is a ligand specific for S. aureus and is therefore chosen from an antibody directed against S. aureus (or anti-S. Aureus), a bacteriophage specific for S. aureus, a protein of a S. aureus specific bacteriophage, a S. aureus specific bacteriophage coupled to an anti-S. aureus, a bacteriophage protein specific for S. aureus coupled with an anti-S antibody. aureus.
[0137] Selon un mode de réalisation, les bactériophages et protéines de bactériophage sont tels que décrits précédemment. According to one embodiment, the bacteriophages and bacteriophage proteins are as described above.
[0138] La partie absorbante (absorption pad) a un rôle d’ absorption. Elle contribue ainsi à maintenir le débit du flux au travers de la bandelette et permet de récupérer les excédents d’échantillon et de réactifs, évitant ainsi le reflux d’échantillon. Par exemple, la partie absorbante est en coton. [0139] Au sens de la présente demande, « dans l’ordre » signifie l’ordre dans lequel les différentes parties qui composent la bandelette vont être traversées par le flux contenant l’échantillon, mais ce terme ne signifie pas que ces parties sont forcément contiguës. [0138] The absorbent part (absorption pad) has an absorption role. It thus helps to maintain the flow rate of the flow through the strip and allows the recovery of excess sample and reagents, thus preventing sample backflow. For example, the absorbent part is cotton. For the purposes of the present application, "in order" means the order in which the different parts which make up the strip will be traversed by the flow containing the sample, but this term does not mean that these parts are necessarily contiguous.
[0140] Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de contact est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une première zone de superposition, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en amont de celle-ci pour former une deuxième zone de superposition et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une troisième zone de superposition, et l’une des extrémités de la partie absorbante est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une quatrième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième, la troisième et la quatrième zone de superposition sont distinctes les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la deuxième et de la troisième zone de superposition. [0140] In a particular embodiment, one of the ends of the contact part is superimposed with one of the ends of the part downstream thereof to form a first superposition zone, one of the ends of the detection part is superimposed with one of the ends of the part upstream thereof to form a second overlapping zone and the other end of the detection part is superimposed with one of the ends of the part downstream thereof to form a third overlap zone, and one of the ends of the absorbent part is superimposed with one of the ends of the downstream part thereof to form a fourth superposition zone. In particular, the first, the second, the third and the fourth superposition zone are distinct from each other. In particular, the contact zone is distinct from the first superposition zone. In particular, the detection zone is distinct from the second and from the third superposition zone.
[0141] Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie de contact et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante. [0142] Dans un mode de réalisation plus particulier, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie de contact pour former une première zone de superposition, et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante pour former une deuxième zone de superposition. En particulier, la première et la deuxième zone de superposition sont séparées les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la première et de la deuxième zone de superposition. [0141] In a particular embodiment, one of the ends of the detection part is superimposed with one of the ends of the contact part and the other end of the detection part is superimposed with one of the ends of the absorbent part. [0142] In a more particular embodiment, one of the ends of the detection part is superimposed with one of the ends of the contact part to form a first superposition zone, and the other end of the part. sensor is superimposed with one of the ends of the absorbent part to form a second superposition zone. In particular, the first and the second superposition zone are separated from each other. In particular, the contact zone is distinct from the first superposition zone. In particular, the detection zone is distinct from the first and from the second superposition zone.
[0143] Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est une zone où les bactériophages et/ou protéines de bactériophages sont déposés (Figures 1, 3). [0144] Dans un mode de réalisation particulier, ladite bandelette comprend en outre, entre la partie de contact et la partie de détection, une partie de marquage qui comprend une zone de marquage comprenant un marqueur. In a particular embodiment, the detection zone is a zone where the bacteriophages and / or bacteriophage proteins are deposited (Figures 1, 3). [0144] In a particular embodiment, said strip further comprises, between the contact part and the detection part, a marking part which comprises a marking zone comprising a marker.
[0145] La partie de marquage (conjugate pad) comprend une zone de marquage où les bactéries sont marquées avec un marqueur lorsque le flux d’échantillon à analyser la traverse. Son rôle est de maintenir le marqueur jusqu’à utilisation de la bandelette et de libérer le marqueur lorsqu’il y a reconnaissance entre le marqueur et une bactérie, au passage du flux d’échantillon. Par exemple la partie de marquage et la zone de marquage sont en fibres de verre, cellulose ou polyesters. [0146] Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est répartie après la zone de dépôt de l’échantillon (sample pad) et après la zone de marquage (conjugate pad) si elle est présente (Figure 2), ou si elle est absente (Figure 4) avant la zone d’adsorption. The labeling part (conjugate pad) comprises a labeling area where the bacteria are labeled with a marker when the flow of sample to be analyzed passes through. Its role is to maintain the marker until use of the strip and to release the marker when there is recognition between the marker and a bacterium, when the sample flow passes. For example, the marking part and the marking area are made of glass fibers, cellulose or polyesters. In a particular embodiment, the detection zone is distributed after the sample deposit zone (sample pad) and after the labeling zone (conjugate pad) if it is present (FIG. 2), or if it is absent (Figure 4) before the adsorption zone.
[0147] Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection se confond avec la zone de marquage (conjugate pad) (Figure 5 et 6). In a particular embodiment, the detection zone merges with the labeling zone (conjugate pad) (FIGS. 5 and 6).
Marqueurs Markers
[0148] Différents types de marqueurs peuvent être utilisés pour la détection des bactéries capturés par les bactériophages ou protéines de bactériophages. Different types of markers can be used for the detection of bacteria captured by bacteriophages or bacteriophage proteins.
[0149] Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le marqueur peut être tout marqueur apte à marquer une bactérie, un bactériophage, une protéine, en particulier une protéine de bactériophage, un anticorps ou un aptamère. Les marqueurs de bactéries sont bien connus de l’Homme du métier. [0149] Thus, in a particular embodiment, the marker can be any marker capable of marking a bacterium, a bacteriophage, a protein, in particular a bacteriophage protein, an antibody or an aptamer. Bacteria markers are well known to those skilled in the art.
[0150] Dans un mode de réalisation, le marqueur est un marqueur conjugué, i.e. le marqueur est lié à un ligand pour marquer la bactérie. En particulier, le marqueur conjugué est un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt. Par « conjugué à au moins un ligand spécifique », on entend qu’un marqueur peut être conjugué à un ligand spécifique ou à plusieurs ligands spécifiques différents. [0150] In one embodiment, the label is a conjugated label, i.e. the label is linked to a ligand to label the bacteria. In particular, the conjugate label is a label conjugated to at least one ligand specific for the bacterium of interest. By "conjugated to at least one specific ligand" is meant that a label can be conjugated to a specific ligand or to several different specific ligands.
[0151] Dans un mode de réalisation, ledit marqueur est couplé directement au ligand pour marquer la bactérie. Dans un mode de réalisation, ledit marqueur est couplé indirectement au ligand via une ou plusieurs molécule(s). [0151] In one embodiment, said marker is coupled directly to the ligand to label the bacteria. In one embodiment, said label is indirectly coupled to the ligand via one or more molecule (s).
[0152] Dans la présente demande, les marqueurs utilisés peuvent être des molécules colloïdales, en particulier les nanoparticules d’or (AuNP). A titre d’exemple, il peut s’agit de nanosphères d’or ou de nanobâtonnets d’or. L’agrégation des nanoparticules d’or entraîne l’apparition d’une couleur, en particulier d’une couleur rose, détectable dans le visible, en raison de la longueur d’onde d’absorbance des nanoparticules d’or. [0152] In the present application, the markers used can be colloidal molecules, in particular gold nanoparticles (AuNP). For example, these can be gold nanospheres or gold nanodrits. The aggregation of the gold nanoparticles results in the appearance of a color, in particular a pink color, detectable in the visible, due to the absorbance wavelength of the gold nanoparticles.
[0153] Dans le cadre d’un dispositif de type plaque de microtitration pour un test ELIS A, l’élément marqué peut être un anticorps spécifique à la bactérie couplé avec une enzyme, par exemple la peroxydase de raifort (HRP), qui catalyse la conversion de substrats chromogènes en composés colorés, ou qui produit de la lumière à partir de substrats chimioluminescents. Des exemples de tels substrats incluent, de façon non limitative, l'ABTS, l'OPD, le DAB, 1AEC ou encore le TMB (3, 3', 5,5'- Tétraméthylbenzidine). Dans la présente demande, il s’agit un anticorps couplé avec une enzyme (la peroxydase de raifort) et la révélation de la couleur est faite grâce à l’ajout du TMB. In the context of a device of the microtiter plate type for an ELIS A test, the labeled element can be an antibody specific to the bacteria coupled with a enzyme, for example horseradish peroxidase (HRP), which catalyzes the conversion of chromogenic substrates into colored compounds, or which produces light from chemiluminescent substrates. Examples of such substrates include, without limitation, ABTS, OPD, DAB, 1AEC or else TMB (3, 3 ', 5.5'-Tetramethylbenzidine). In the present application, it is an antibody coupled with an enzyme (horseradish peroxidase) and the color is revealed by adding TMB.
[0154] Le marquage peut être réalisé par une liaison intermédiaire par un complexe biotine/streptavidine qui est couplé à HRP ou à une molécule colloïdale, en particulier l’or. [0154] Labeling can be carried out by an intermediate bond via a biotin / streptavidin complex which is coupled to HRP or to a colloidal molecule, in particular gold.
[0155] Sauf mention contraire, au sens de la présente invention, ledit au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt peut être au moins un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins un aptamère spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt. Unless otherwise stated, within the meaning of the present invention, said at least one ligand specific for the bacterium of interest can be at least one antibody directed against the bacterium of interest, at least one aptamer specific for the bacterium of of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one protein of at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, at least one protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest.
[0156] En particulier, la bactérie d’intérêt est S. aureus et ces ligands spécifiques se lisent comme des ligands spécifiques de S. aureus ou dirigés contre S. aureus. [0156] In particular, the bacterium of interest is S. aureus and these specific ligands can be read as ligands specific for S. aureus or directed against S. aureus.
[0157] Dans un mode de réalisation, les bactériophages et protéines de bactériophages sont tels que décrits précédemment. In one embodiment, the bacteriophages and bacteriophage proteins are as described above.
[0158] Ainsi, le marqueur conjugué à un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt, en particulier S. aureus, peut être un marqueur conjugué à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un aptamère spécifique de la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt couplé à un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt ou un marqueur conjugué à une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt. Thus, the marker conjugated to a ligand specific for the bacterium of interest, in particular S. aureus, can be a marker conjugated to an antibody directed against the bacterium of interest, a marker conjugated to an aptamer specific for the bacterium. bacterium of interest, a marker conjugated to a bacteriophage specific for the bacterium of interest, a marker conjugated to a protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest, a marker conjugated to a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, a marker conjugated to a protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, a marker conjugated to an antibody directed against the bacterium of interest coupled to a bacteriophage specific for the bacterium of interest or a marker conjugated to a protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest.
[0159] Dans un mode de réalisation plus particulier, la présente invention porte sur une bandelette pour détecter S. aureus dans un échantillon, comprenant dans l’ordre au moins : une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; une partie de marquage comprenant une zone de marquage qui comprend un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique de S. aureus, en particulier une nanoparticule d’or conjuguée à au moins un ligand spécifique de S. aureus ; une partie de détection comprenant une zone de détection de S. aureus, qui comprend au moins un bactériophage spécifique de S. aureus et/ou une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de S. aureus, en particulier une RBP, une partie absorbante. [0159] In a more particular embodiment, the present invention relates to a strip for detecting S. aureus in a sample, comprising in order at least: a contact portion comprising a contact area with the sample; a labeling part comprising a labeling area which comprises a label conjugated to at least one ligand specific for S. aureus, in particular a gold nanoparticle conjugated to at least one ligand specific for S. aureus; a detection part comprising a detection zone for S. aureus, which comprises at least one bacteriophage specific for S. aureus and / or a protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus, in particular an RBP, an absorbing part .
[0160] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus ou un marqueur conjugué à un aptamère spécifique de S. aureus, plus particulièrement une nanoparticule d’or conjugué à un anticorps anti-S. aureus ou une nanoparticule d’or conjugué à un aptamère spécifique de S. aureus. In particular, the labeling zone comprises a label conjugated to an anti-S antibody. aureus or a marker conjugated to an aptamer specific for S. aureus, more particularly a gold nanoparticle conjugated to an anti-S antibody. aureus or a gold nanoparticle conjugated to an aptamer specific to S. aureus.
[0161] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins un bactériophage spécifique de S. aureus. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5680 ou un marqueur conjugué à un mélange de bactériophage tel que décrit précédemment. En particulier, elle comprend ces cinq marqueurs conjugués à des bactériophages. Plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces phages est une nanoparticule d’or. [0162] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de S. aureus. En particulier, ladite au moins une protéine est une RBP. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 ou un marqueur conjugué à un mélange de protéines de bactériophages tel que décrit précédemment. En particulier, elle comprend ces cinq marqueurs conjugués à des protéines de bactériophages. Encore plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces protéines de bactériophages est une nanoparticule d’or. In particular, the labeling zone comprises a marker conjugated to at least one bacteriophage specific for S. aureus. In particular, it comprises a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5408, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5409, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5410, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5491, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5492, a marker conjugated to the CNCM 1-5680 bacteriophage or a marker conjugated to a mixture of bacteriophage as described above. In particular, it comprises these five markers conjugated to bacteriophages. More particularly, said marker conjugated to these phages is a gold nanoparticle. In particular, the labeling zone comprises a marker conjugated to at least one protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus. In particular, said at least one protein is an RBP. In particular, it comprises a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5408, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5409, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5410, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5491, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5492, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5680 or a marker conjugated to a mixture of bacteriophage proteins as described above. In particular, it comprises these five markers conjugated to bacteriophage proteins. Even more particularly, said marker conjugated to these bacteriophage proteins is a gold nanoparticle.
[0163] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5408 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5409 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5410 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5491 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5492 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5680 couplé à un anticorps anti-S. aureus ou un marqueur conjugué à un mélange de bactériophages tels que décrit précédemment couplé à un anticorps anti-S. aureus. In particular, the labeling zone comprises a label conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5408 coupled to an anti-S antibody. aureus, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5409 coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5410 coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5491 coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5492 coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5680 coupled to an anti-S. aureus or a marker conjugated to a mixture of bacteriophages as described above coupled to an anti-S antibody. aureus.
[0164] En particulier, elle comprend un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5408 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5409 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5410 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5491 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5492 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 couplé à un anticorps anti-S. aureus ou un marqueur conjugué à un mélange de protéines de bactériophages tel que décrit précédemment couplé à un anticorps anti-S. aureus. In particular, it comprises a marker conjugated to a protein of the bacteriophage CNCM 1-5408 coupled to an anti-S antibody. aureus, a marker conjugated to a bacteriophage CNCM 1-5409 protein coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to a bacteriophage CNCM 1-5410 protein coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to a bacteriophage CNCM 1-5491 protein coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to a bacteriophage CNCM 1-5492 protein coupled to an anti-S. aureus, a marker conjugated to a bacteriophage CNCM 1-5680 protein coupled to an anti-S. aureus or a marker conjugated to a mixture of bacteriophage proteins as described above coupled to an anti-S antibody. aureus.
[0165] En particulier, il s’agit d’un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5680 ou un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à un mélange de bactériophages tel que décrit précédemment. [0165] In particular, it is a marker conjugated to an anti-S antibody. aureus coupled to the bacteriophage CNCM 1-5408, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to the CNCM 1-5409 bacteriophage, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to the CNCM 1-5410 bacteriophage, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to the CNCM 1-5491 bacteriophage, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to the CNCM 1-5492 bacteriophage, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to the CNCM 1-5680 bacteriophage or a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a mixture of bacteriophages as described above.
[0166] En particulier, il s’agit d’un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 ou un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à un mélange de protéines du bactériophages tel que décrit précédemment. [0166] In particular, it is a marker conjugated to an anti-S antibody. aureus coupled to a CNCM 1-5408 bacteriophage protein, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a bacteriophage CNCM 1-5409 protein, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a bacteriophage CNCM 1-5410 protein, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a bacteriophage CNCM 1-5491 protein, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a bacteriophage CNCM 1-5492 protein, a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a CNCM 1-5680 bacteriophage protein or a marker conjugated to an anti-S. aureus coupled to a mixture of bacteriophage proteins as described above.
[0167] En particulier, la zone de détection comprend au moins un bactériophage CNCM 1-5408, au moins un bactériophage CNCM 1-5409, au moins un bactériophage CNCM 1-5410, au moins un bactériophage CNCM 1-5491, au moins un bactériophage CNCM 1-5492, un bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de bactériophages tel que décrit précédemment. [0167] In particular, the detection zone comprises at least one CNCM 1-5408 bacteriophage, at least one CNCM 1-5409 bacteriophage, at least one CNCM 1-5410 bacteriophage, at least one CNCM 1-5491 bacteriophage, at least one bacteriophage CNCM 1-5492, a bacteriophage CNCM 1-5680 or a mixture of bacteriophages as described above.
[0168] En particulier, la zone de détection comprend au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5408, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5409, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5410, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5491, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5492, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de protéines de bactériophages tel que décrit précédemment. In particular, the detection zone comprises at least one protein of the bacteriophage CNCM 1-5408, at least one protein of the bacteriophage CNCM 1-5409, at least one protein of the bacteriophage CNCM 1-5410, at least one protein of the bacteriophage CNCM 1-5410. bacteriophage CNCM 1-5491, at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5492, at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5680 or a mixture of bacteriophage proteins as described above.
[0169] Dans un autre mode de réalisation, ladite bandelette (de chromatographie à flux latéral) comprend dans l’ordre au moins : une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; une partie de marquage comprenant une zone de marquage qui comprend un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt choisi parmi au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, une partie de détection comprenant une zone de détection de la bactérie d’intérêt qui comprend au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt, une partie absorbante. [0169] In another embodiment, said strip (lateral flow chromatography) comprises in order at least: a contact part comprising a contact zone with the sample; a marking part comprising a marking zone which comprises a marker conjugated to at least one ligand specific for the bacterium of interest chosen from at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one protein of at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, at least one protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, a detection part comprising a detection zone for the bacterium of interest which comprises at least one ligand specific for the bacterium of interest, an absorbent part.
[0170] En particulier, ledit au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt compris dans la zone de détection est au moins un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins un aptamère spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt. In particular, said at least one ligand specific for the bacterium of interest included in the detection zone is at least one antibody directed against the bacterium of interest, at least one aptamer specific for the bacterium of interest, at least. at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one protein of at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of of interest, at least one bacteriophage protein specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest.
[0171] Dans un mode de réalisation plus particulier, la présente invention porte sur une bandelette pour détecter S. aureus dans un échantillon, comprenant dans l’ordre au moins : une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; une partie de marquage comprenant une zone de marquage qui comprend un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique de S. aureus choisi parmi : au moins un bactériophage spécifique de S. aureus, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique S. aureus, au moins un bactériophage spécifique de S. aureus couplé à un anticorps dirigé contre S. aureus, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus couplée à un anticorps dirigé contre S. aureus ; - une partie de détection comprenant une zone de détection de S. aureus, qui comprend au moins un ligand spécifique de S. aureus ; une partie absorbante. [0171] In a more particular embodiment, the present invention relates to a strip for detecting S. aureus in a sample, comprising in order at least: a contact portion comprising a contact zone with the sample; a labeling part comprising a labeling area which comprises a label conjugated to at least one ligand specific for S. aureus chosen from: at least a bacteriophage specific for S. aureus, at least one protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus, at least one bacteriophage specific for S. aureus coupled to an antibody directed against S. aureus, at least one protein of a bacteriophage specific for S. aureus coupled to an antibody directed against S. aureus; a detection part comprising a detection zone for S. aureus, which comprises at least one ligand specific for S. aureus; an absorbent part.
[0172] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins un bactériophage spécifique de S. aureus. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de bactériophage conjugués avec un marqueur tel que décrit précédemment. Encore plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces phages est une nanoparticule d’or. In particular, the labeling zone comprises a marker conjugated to at least one bacteriophage specific for S. aureus. In particular, it comprises a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5408, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5409, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5410, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5491, a marker conjugated with bacteriophage CNCM 1-5492, a marker conjugated to the bacteriophage CNCM 1-5680 or a mixture of bacteriophage conjugated with a marker as described above. Even more particularly, said marker conjugated to these phages is a gold nanoparticle.
[0173] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de S. aureus. En particulier, ladite au moins une protéine est une RBP. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de protéines de bactériophages conjugués avec un marqueur tel que décrit précédemment. Encore plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces protéines de bactériophages est une nanoparticule d’or. [0173] In particular, the labeling zone comprises a marker conjugated to at least one protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus. In particular, said at least one protein is an RBP. In particular, it comprises a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5408, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5409, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5410, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5491, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5492, a marker conjugated to at least one protein of bacteriophage CNCM 1-5680 or a mixture of proteins of bacteriophages conjugated with a marker as described above. Even more particularly, said marker conjugated to these bacteriophage proteins is a gold nanoparticle.
[0174] En particulier, la zone de détection comprend un anticorps anti-S aureus ou un aptamère spécifique de S. aureus. En particulier, la zone de détection comprend au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, plus particulièrement un bactériophage CNCM 1-5408, un bactériophage CNCM 1-5409, un bactériophage CNCM 1-5410, un bactériophage CNCM 1-5491, un bactériophage CNCM 1-5492, un bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de bactériophages tel que décrit précédemment. Encore plus particulièrement, elle comprend ces cinq bactériophages. In particular, the detection zone comprises an anti-S aureus antibody or an aptamer specific for S. aureus. In particular, the detection zone comprises at least a bacteriophage specific for the bacterium of interest, more particularly a bacteriophage CNCM 1-5408, a bacteriophage CNCM 1-5409, a bacteriophage CNCM 1-5410, a bacteriophage CNCM 1-5491, a bacteriophage CNCM 1-5492, a bacteriophage CNCM 1-5680 or a mixture of bacteriophages as described above. Even more particularly, it comprises these five bacteriophages.
[0175] En particulier, la zone de détection comprend au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de S. aureus, en particulier une RBP. Plus particulièrement, elle comprend au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5408, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5409, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5410, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5491, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5492, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de protéines de bactériophages tel que décrit précédemment. Encore plus particulièrement, elle comprend ces cinq protéines de bactériophages. [0176] En particulier, la zone de détection comprend au moins un bactériophage spécifique de S. aureus couplé à un anticorps dirigé contre S. aureus et/ou au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus couplée à un anticorps dirigé contre S. aureus, en particulier ledit bactériophage est choisi parmi les bactériophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492, CNCM 1-5680 et un mélange de ces bactériophages tel que décrit précédemment, et ladite protéine est choisie parmi les protéines de ces phages ou un mélange de ces protéines de bactériophage tel que décrit précédemment. [0175] In particular, the detection zone comprises at least one protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus, in particular a RBP. More particularly, it comprises at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5408, at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5409, at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5410, at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5491, minus one protein from bacteriophage CNCM 1-5492, at least one protein from bacteriophage CNCM 1-5680 or a mixture of proteins from bacteriophages as described above. Even more particularly, it comprises these five bacteriophage proteins. In particular, the detection zone comprises at least one bacteriophage specific for S. aureus coupled to an antibody directed against S. aureus and / or at least one protein of a bacteriophage specific for S. aureus coupled to a directed antibody. against S. aureus, in particular said bacteriophage is chosen from the bacteriophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492, CNCM 1-5680 and a mixture of these bacteriophages such as as described above, and said protein is chosen from the proteins of these phages or a mixture of these bacteriophage proteins as described above.
[0177] Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la bandelette comprend au moins quatre parties, l’une des extrémités de la partie de contact est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une première zone de superposition ; l’une des extrémités de la partie de marquage est superposée avec l’une des extrémités de la partie en amont de celle-ci pour former une deuxième zone de superposition et l’autre extrémité de la partie de marquage est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une troisième zone de superposition ; l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en amont de celle-ci pour former une quatrième zone de superposition et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une cinquième zone de superposition ; et l’une des extrémités de la partie absorbante est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une sixième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième, la troisième, la quatrième, la cinquième et la sixième zone de superposition sont séparées les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de marquage est distincte de la deuxième et de la troisième zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la quatrième et de la cinquième zone de superposition. [0177] In a particular embodiment, when the strip comprises at least four parts, one of the ends of the contact part is superimposed with one of the ends of the part downstream thereof to form a first overlap area; one of the ends of the marking part is superimposed with one of the ends of the part upstream thereof to form a second overlapping zone and the other end of the marking part is superimposed with one ends of the downstream portion thereof to form a third overlap zone; one of the ends of the detection part is superimposed with one of the ends of the part upstream thereof to form a fourth overlapping zone and the other end of the detection part is superimposed with one of the ends of the part downstream thereof to form a fifth zone overlay; and one of the ends of the absorbent part is superimposed with one of the ends of the part downstream thereof to form a sixth zone of superposition. In particular, the first, the second, the third, the fourth, the fifth and the sixth superposition zone are separated from each other. In particular, the contact zone is distinct from the first superposition zone. In particular, the marking zone is distinct from the second and the third superposition zone. In particular, the detection zone is distinct from the fourth and the fifth superposition zone.
[0178] Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de contact et l’autre extrémité de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de détection ; l’autre extrémité de la partie de détection étant superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante. [0178] In a particular embodiment, one of the ends of the marking part is superimposed on one of the ends of the contact part and the other end of the marking part is superimposed on one of the ends of the detection part; the other end of the sensing part being superimposed with one end of the absorbent part.
[0179] Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de contact pour former une première zone de superposition, et l’autre extrémité de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de détection pour former une deuxième zone de superposition ; l’autre extrémité de la partie de détection étant superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante pour former une troisième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième et la troisième zone de superposition sont séparées les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de marquage est distincte de la première et de la deuxième zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la deuxième et de la troisième zone de superposition. [0179] In a particular embodiment, one of the ends of the marking part is superimposed on one of the ends of the contact part to form a first superposition zone, and the other end of the part of marking is superimposed on one of the ends of the detection part to form a second superposition zone; the other end of the sensing part being superimposed with one end of the absorbent part to form a third zone of overlap. In particular, the first, the second and the third superposition zone are separated from each other. In particular, the contact zone is distinct from the first superposition zone. In particular, the marking zone is distinct from the first and from the second superposition zone. In particular, the detection zone is distinct from the second and from the third superposition zone.
[0180] Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est une ligne transversale à la bandelette, formant ainsi une ligne de détection ou ligne de test (test line). [0181] Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est répartie et est limitée par une ligne transversale à la bandelette. [0180] In a particular embodiment, the detection zone is a line transverse to the strip, thus forming a detection line or test line (test line). In a particular embodiment, the detection zone is distributed and is limited by a line transverse to the strip.
[0182] Optionnellement, la partie de détection peut comprendre en outre une zone de contrôle comme décrit précédemment. Test ELI SA [0182] Optionally, the detection part can further comprise a control zone as described above. ELI SA test
[0183] Le principe de TELISA consiste à piéger, entre un « anticorps de capture » et un « anticorps de détection », les analytes (antigènes, bactéries, virus, etc...). La spécificité du système de détection de la présente invention par rapport au système ELISA classique est le remplacement d’un ou des deux anticorps par les bactériophages ou les protéines de bactériophages. The principle of TELISA consists in trapping, between a “capture antibody” and a “detection antibody”, the analytes (antigens, bacteria, viruses, etc.). The specificity of the detection system of the present invention over the conventional ELISA system is the replacement of one or both antibodies by bacteriophages or bacteriophage proteins.
[0184] Dans le cadre de mise en œuvre de la présente invention sous la forme d’un test ELISA, la détection et/ou quantification des bactéries dans un échantillon est réalisée par le remplacement d’un des deux anticorps ou des deux anticorps du test ELISA classique par les bactériophages ou les protéines de bactériophages. [0185] Dans un mode de réalisation particulier du test ELISA selon l’invention, la détection et/ou quantification des bactéries dans un échantillon est réalisée par le remplacement d’un des deux anticorps ou des deux anticorps du test ELISA classique par les bactériophages ou les protéines de bactériophages spécifiques de S. aureus. [0184] In the context of implementing the present invention in the form of an ELISA test, the detection and / or quantification of bacteria in a sample is carried out by replacing one of the two antibodies or of the two antibodies of the classical ELISA test using bacteriophages or bacteriophage proteins. In a particular embodiment of the ELISA test according to the invention, the detection and / or quantification of bacteria in a sample is carried out by replacing one of the two antibodies or of the two antibodies of the conventional ELISA test by bacteriophages or proteins of bacteriophages specific for S. aureus.
[0186] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, il est possible de remplacer l’anticorps couplé à un marqueur par des protéines de bactériophages ou des bactériophages couplés directement ou indirectement à un marqueur (or ou autre sonde). [0186] In a particular embodiment of the invention, it is possible to replace the antibody coupled to a marker by proteins of bacteriophages or bacteriophages coupled directly or indirectly to a marker (gold or other probe).
[0187] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, il est possible de remplacer l’anticorps couplé à un marqueur par des RBP couplées directement ou indirectement à un marqueur (or ou autre sonde). [0188] Il est possible d’utiliser un anticorps pour la révélation et /ou de la détection de la présence de la bactérie dans l’échantillon. [0189] Il est possible d’utiliser plusieurs bactériophages ou protéines de bactériophages ou de les combiner avec les anticorps afin de capter plusieurs souches bactériennes (spectre de détection). In a particular embodiment of the invention, it is possible to replace the antibody coupled to a marker by RBPs coupled directly or indirectly to a marker (gold or other probe). It is possible to use an antibody for revealing and / or detecting the presence of the bacteria in the sample. It is possible to use several bacteriophages or bacteriophage proteins or to combine them with the antibodies in order to capture several bacterial strains (detection spectrum).
[0190] Dans ce système, au lieu d’utiliser l’anticorps couplé à la HRP, il est possible d’utiliser l’anticorps couplé à une molécule colloïdale telle que l’or ou une autre molécule de marqueur afin de mesurer l’absorbance directement, sans besoin de l’étape de la révélation par TMB. [0190] In this system, instead of using the antibody coupled to HRP, it is possible to use the antibody coupled to a colloidal molecule such as gold or another label molecule in order to measure the. absorbance directly, without the need for the TMB revealing step.
[0191] Selon un mode de réalisation, les bactériophages ou les protéines de bactériophages sont utilisés pour la capture des bactéries (analytes) et un anticorps est utilisé pour la détection (Figure 7A). Dans cette mise en œuvre particulière, les bactériophages ou protéines de bactériophage sont immobilisés sur le support à l’aide d’une solution comprenant un cation et une protéine (en particulier une solution de MgSO4 et BSA ou une solution de NaCl et BSA). Dans une mise en œuvre particulière, les bactériophages ou protéines de bactériophage spécifiques de S. aureus sont immobilisées sur le support à l’aide d’une solution comprenant un cation et une protéine (en particulier une solution de MgSC>4 et BSA ou une solution de NaCl et BSA). [0191] According to one embodiment, the bacteriophages or the bacteriophage proteins are used for the capture of the bacteria (analytes) and an antibody is used for the detection (FIG. 7A). In this particular implementation, the bacteriophages or bacteriophage proteins are immobilized on the support using a solution comprising a cation and a protein (in particular a solution of MgSO 4 and BSA or a solution of NaCl and BSA) . In a particular implementation, the bacteriophages or bacteriophage proteins specific for S. aureus are immobilized on the support using a solution comprising a cation and a protein (in particular a solution of MgSC> 4 and BSA or a NaCl and BSA solution).
[0192] Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les protéines de bactériophage, en particulier les RBP, sont immobilisées sur le support à l’aide d’une solution comprenant un cation et une protéine. Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les RBP sont immobilisées sur le support à l’aide d’une solution comprenant un cation et une protéine, ces RBP permettent dans une mise en œuvre particulière, la détection de S. aureus. [0192] In another implementation of the invention, the bacteriophage proteins, in particular the RBPs, are immobilized on the support using a solution comprising a cation and a protein. In another implementation of the invention, the RBPs are immobilized on the support using a solution comprising a cation and a protein, these RBPs allow, in a particular implementation, the detection of S. aureus.
[0193] Il est aussi possible de remplacer l’anticorps couplé à un marqueur par des protéines de bactériophages ou des bactériophages couplés directement ou indirectement à un marqueur (or ou autre sonde) pour la détection des bactéries (Figure 7B). Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les protéines de bactériophage ou les bactériophages sont spécifiques de S. aureus et sont couplés directement ou indirectement à un marqueur (or ou autre sonde) pour la détection des bactéries [0193] It is also possible to replace the antibody coupled to a marker by proteins of bacteriophages or bacteriophages coupled directly or indirectly to a marker (gold or other probe) for the detection of bacteria (Figure 7B). In another implementation of the invention, the bacteriophage proteins or bacteriophages are specific for S. aureus and are coupled directly or indirectly to a marker (gold or other probe) for the detection of bacteria
[0194] Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les protéines de bactériophage, en particulier les RBP, sont utilisées pour la détection des bactéries et sont utilisées dans une solution comprenant un cation et une protéine (en particulier une solution de MgS04 et BSA ou une solution de NaCl et BSA). [0194] In another implementation of the invention, the bacteriophage proteins, in particular the RBP, are used for the detection of bacteria and are used in a solution comprising a cation and a protein (in particular a solution of MgSO4 and BSA or a solution of NaCl and BSA).
[0195] Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les RBP sont utilisées pour la détection des bactéries et sont utilisées dans une solution comprenant un cation et une protéine (en particulier une solution de MgS04 et BSA ou une solution de NaCl et BSA). Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les RBP sont spécifiques de S. aureus. [0195] In another implementation of the invention, the RBPs are used for the detection of bacteria and are used in a solution comprising a cation and a protein (in particular a solution of MgSO4 and BSA or a solution of NaCl and BSA). In another implementation of the invention, the RBPs are specific for S. aureus.
[0196] Ainsi, des modes de réalisation alternatifs de la présente invention incluent l’utilisation des bactériophages ou protéines de bactériophages pour la capture et la détection des bactéries (Figure 7C) ou l’utilisation d’un anticorps pour la capture des bactéries et l’utilisation de bactériophages ou protéines de bactériophages pour la détection (Figure 7B). Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les protéines de bactériophage sont spécifiques de S. aureus. [0196] Thus, alternative embodiments of the present invention include the use of bacteriophages or bacteriophage proteins for the capture and detection of bacteria (Figure 7C) or the use of an antibody for the capture of bacteria and the use of bacteriophages or bacteriophage proteins for detection (Figure 7B). In another embodiment of the invention, the bacteriophage proteins are specific for S. aureus.
[0197] Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les protéines de bactériophage, en particulier les RBP, sont utilisées pour la capture et la détection des bactéries et sont utilisées dans une solution comprenant un cation et une protéine (en particulier une solution de MgS04 et BSA ou une solution de NaCl et BSA). Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les RBP sont spécifiques de S. aureus. [0197] In another implementation of the invention, the bacteriophage proteins, in particular the RBP, are used for the capture and detection of bacteria and are used in a solution comprising a cation and a protein (in particular a solution of MgSO4 and BSA or a solution of NaCl and BSA). In another implementation of the invention, the RBPs are specific for S. aureus.
[0198] Il est également possible d’utiliser plusieurs bactériophages ou protéines de bactériophage ou de les combiner avec les anticorps afin de capter plusieurs souches bactériennes (spectre de détection). [0198] It is also possible to use several bacteriophages or bacteriophage proteins or to combine them with the antibodies in order to capture several bacterial strains (detection spectrum).
Mises en œuyre particulières de l’invention Particular implementations of the invention
[0199] Dans le cadre de l’invention, il est entendu que le terme bactériophage peut être remplacé par l’un des bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680 ou par un mélange de ces bactériophages tel que décrit précédemment. [0199] In the context of the invention, it is understood that the term bacteriophage can be replaced by one of the bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the numbers CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 , CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 and CNCM 1-5680 or by a mixture of these bacteriophages as described above.
[0200] De la même façon, il est entendu que le terme RBP peut être remplacé par une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM-I-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :4, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6 ou un mélange de ces RBP tel que décrit précédemment. Il est entendu également que le terme RBP peut être remplacé par une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM-I-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :4 ou encore un mélange de ces RBP tel que décrit précédemment. Protéines de phases Likewise, it is understood that the term RBP can be replaced by an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of bacteriophage CNCM-I-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, a RBP of bacteriophage CNCM 1-5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6 or a mixture of these RBPs as described above. It is also understood that the term RBP can be replaced by an RBP of bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of bacteriophage CNCM-I-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP from bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP from bacteriophage CNCM 1-5491, an RBP from bacteriophage CNCM 1-5492, an RBP from bacteriophage CNCM 1 -5680, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 4 or else a mixture of these RBPs as described above. Phase proteins
[0201] La présente invention concerne également une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus, en particulier une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, plus particulièrement une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM-I-5409, plus particulièrement une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, plus particulièrement une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, plus particulièrement une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, plus particulièrement une RBP de séquence SEQ ID NO : 6. The present invention also relates to an RBP of a bacteriophage specific for S. aureus, in particular an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, more particularly an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of the bacteriophage CNCM-I -5409, more particularly an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, more particularly an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, more particularly an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, and an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5492, more particularly an RBP of sequence SEQ ID NO: 6.
[0202] En particulier, la présente invention concerne une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :2, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3. [0203] Selon un mode de réalisation, les RBP telles que décrites précédemment englobent des RBP ayant un pourcentage d’identité d’au moins 95% avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 6. BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES In particular, the present invention relates to an RBP of bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, and an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3. [0203] According to one embodiment, the RBPs as described above include RBPs having a percentage identity of at least 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
[0204] Figure 1 est un schéma d’un mode de réalisation Ml dans lequel A est un marqueur de la bactérie cible (exemples : anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie) et l’ovale plein est une bactérie. Le marqueur est déposé sur la partie de marquage. Les phages/protéines de phages sont déposé(e)s sur une ligne de la membrane de cellulose. [0204] Figure 1 is a diagram of an M1 embodiment in which A is a marker for the target bacterium (examples: antibody specific to the bacterium coupled to a tag or phage / phage protein coupled to a tag or a marker that stains bacteria) and the solid oval is bacteria. The marker is deposited on the marking part. The phages / phage proteins are deposited on a cellulose membrane line.
[0205] Figure 2 est un schéma d’un mode de réalisation M2 dans lequel A est un marqueur de la bactérie cible (exemples : anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie) et l’ovale plein est une bactérie. Le marqueur est déposé sur la partie de marquage. Les phages/protéines de phages sont déposé(e)s sur une partie de la membrane de cellulose. [0205] Figure 2 is a diagram of an M2 embodiment in which A is a marker for the target bacterium (examples: antibody specific to the bacterium coupled to a tag or phage / phage protein coupled to a tag or a marker that stains bacteria) and the solid oval is bacteria. The marker is deposited on the marking part. The phages / phage proteins are deposited on part of the cellulose membrane.
[0206] Figure 3 est un schéma d’un mode de réalisation M3 identique à Ml mais dans lequel les bactéries sont colorées dans la solution par un marqueur A, ledit marqueur A étant un marqueur de la bactérie cible (exemples : anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie dans la solution). Les phages/protéines de phages sont déposé(e)s sur une ligne de la membrane de cellulose. [0206] Figure 3 is a diagram of an embodiment M3 identical to M1 but in which the bacteria are stained in the solution with a marker A, said marker A being a marker for the target bacterium (examples: antibody specific to the bacterium coupled to a tag or phage / phage protein coupled to a tag or a tag which stains the bacteria in the solution). The phages / phage proteins are deposited on a cellulose membrane line.
[0207] Figure 4 est un schéma d’un mode de réalisation M4 identique à M2 mais dans lequel les bactéries sont colorées dans la solution par un marqueur A, ledit marqueur A étant un marqueur de la bactérie cible (par exemple : un anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie). Les phages/protéines de phages sont déposé(e)s sur une partie de la membrane cellulose. [0208] Figure 5 est un schéma d’un mode de réalisation M5 identique à Ml mais dans lequel les phages/protéines de phages et le marqueur A des bactéries sont déposés sur la partie de marquage (Conjuguée PAD), ledit marqueur A étant un marqueur de la bactérie cible (par exemple, un anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie). [0207] Figure 4 is a diagram of an embodiment M4 identical to M2 but in which the bacteria are stained in the solution with a marker A, said marker A being a marker for the target bacterium (for example: a specific antibody to the bacteria coupled to a tag or phage / phage protein coupled to a tag or a tag which colors the bacteria). The phages / phage proteins are deposited on part of the cellulose membrane. [0208] Figure 5 is a diagram of an embodiment M5 identical to M1 but in which the phages / phage proteins and the marker A of the bacteria are deposited on the labeling part (PAD conjugate), said marker A being a marker for the target bacterium (eg, an antibody specific to the bacterium coupled to a phage tag or phage protein coupled to a tag or a tag which stains the bacteria).
[0209] Figure 6 est un schéma d’un mode de réalisation M6 identique à M5 mais dans lequel les phages/protéines de phages sont déposé(e)s sur la partie de marquage (Conjuguée PAD) mais pas le marqueur. Les bactéries sont colorées dans la solution par un marqueur A, ledit marqueur A étant un marqueur de la bactérie cible (par exemple : un anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie dans la solution). [0209] Figure 6 is a diagram of an M6 embodiment identical to M5 but in which the phages / phage proteins are deposited on the labeling part (PAD conjugate) but not the label. The bacteria are stained in the solution with a marker A, said marker A being a marker for the target bacterium (for example: an antibody specific to the bacterium coupled to a marker or phage / phage protein coupled to a marker or a marker that stains the bacteria in the solution).
[0210] Figure 7A est un schéma d’un mode de réalisation de l’invention d’un système ELISA, dans lequel les phages ou protéines de phage sont utilisé(e)s pour la capture de la bactérie. [0211] Figure 7B est un schéma d’un mode de réalisation de l’invention d’un système[0210] Figure 7A is a schematic of one embodiment of the invention of an ELISA system, in which phages or phage proteins are used for the capture of the bacteria. [0211] Figure 7B is a diagram of an embodiment of the invention of a system
ELISA, dans lequel les phages ou protéines de phage sont utilisé(e)s pour la détection de la bactérie. ELISA, in which phages or phage proteins are used for the detection of the bacteria.
[0212] Figure 7C est schéma d’un mode de réalisation de l’invention d’un système ELISA, dans lequel les phages ou protéines de phage sont utilisé(e)s pour la capture et la détection de la bactérie. [0212] Figure 7C is a diagram of one embodiment of the invention of an ELISA system, in which phages or phage proteins are used for the capture and detection of the bacteria.
[0213] Figure 8 est une photographie montrant la détection de S. aureus sur une bandelette sur laquelle sont immobilisées des protéines de bactériophages. L’effet de la solution A seule est testée (solution contenant du MgSOf), de la solution B (BSA) ou de la combinaison des solutions A et B. [0214] Figure 9 est une photographie montrant la détection de S. aureus sur une bandelette sur laquelle sont immobilisée des protéines de bactériophages. Différentes concentrations de bactéries sont testées ainsi que l’absence de bactérie dans l’échantillon. [0215] Figure 10A est une photographie montrant une plaque de microtitration montrant la présence de S. aureus. [0213] FIG. 8 is a photograph showing the detection of S. aureus on a strip on which bacteriophage proteins are immobilized. The effect of solution A alone is tested (solution containing MgSOf), of solution B (BSA) or of the combination of solutions A and B. [0214] FIG. 9 is a photograph showing the detection of S. aureus on a strip on which bacteriophage proteins are immobilized. Different concentrations of bacteria are tested as well as the absence of bacteria in the sample. [0215] Figure 10A is a photograph showing a microtiter plate showing the presence of S. aureus.
[0216] Figure 10B est un graphique montrant l’intensité du signal en fonction de la concentration en bactéries. [0217] Figure 11 est un histogramme présentant le lien entre la densité optique mesurée (OD) et la concentration en bactérie exprimée en UFC/mL, un témoin sans bactérie est présent (TM (sans bactérie)). [0216] Figure 10B is a graph showing signal strength versus bacteria concentration. [0217] FIG. 11 is a histogram showing the link between the measured optical density (OD) and the concentration of bacteria expressed in CFU / mL, a control without bacteria is present (TM (without bacteria)).
[0218] Figure 12 est une photographie montrant que l’expression des protéines RBP des phages 2, 3 5 et 7 dans les bactéries BL21 a été vérifiée sur gel. [0219] Figure 13 est un graphique montrant la spécificité des protéines des phages phi5 (cD5-biotinylé) par la mesure de la densité optique (en abscisse) pour différentes souches de bactéries (dont les noms figurent en ordonnée), évaluée par un test ELISA indirect. [0218] Figure 12 is a photograph showing that the expression of RBP proteins of phages 2, 35 and 7 in BL21 bacteria was verified on gel. [0219] Figure 13 is a graph showing the specificity of phage phi5 proteins (cD5-biotinylated) by measuring the optical density (on the abscissa) for different strains of bacteria (whose names appear on the ordinate), evaluated by a test Indirect ELISA.
[0220] Figure 14 est un graphique montrant la spécificité des protéines du phage phi5 (cD5-biotinylé) et de l’anticorps anti S. aureus par la mesure de la densité optique (en abscisse) pour différentes souches de bactéries (dont les noms figurent en ordonnée), évaluée par un test ELISA indirect. [0220] Figure 14 is a graph showing the specificity of the proteins of phage phi5 (cD5-biotinylated) and of the anti S. aureus antibody by measuring the optical density (on the abscissa) for different strains of bacteria (including the names appear on the ordinate), evaluated by an indirect ELISA test.
[0221] Figure 15 est un histogramme montrant la quantité de bactérie S. aureus de la souche 79 capturée (déterminée par l’air sous la courbe) en fonction de la solution utilisée pour l’immobilisation de la RBP du bactériophage phi 5 (protéine) : NaCl et BSA, BSA seul, NaCl seul, et sans BSA ni NaCl. [0221] Figure 15 is a histogram showing the quantity of S. aureus bacteria of strain 79 captured (determined by the air under the curve) as a function of the solution used for the immobilization of the RBP of the bacteriophage phi 5 (protein ): NaCl and BSA, BSA alone, NaCl alone, and without BSA or NaCl.
[0222] Figure 16 est un histogramme montrant la quantité de bactérie S. aureus de la souche C24b capturée (déterminée par l’air sous la courbe) en fonction de la solution utilisée pour l’immobilisation de la RBP du bactériophage phi 5 (protéine) : NaCl et BSA, BSA seul, NaCl seul, et sans BSA ni NaCl. [0223] Figure 17 est un histogramme qui montre que la protéine RBPs du phage 2 a une affinité pour l’espèce S. aureus, i.e., pas d’affinité pour les bactéries S. epidermis ou S. algenitis. EXEMPLES [0222] Figure 16 is a histogram showing the quantity of S. aureus bacteria of the C24b strain captured (determined by the air under the curve) as a function of the solution used for the immobilization of the RBP of the bacteriophage phi 5 (protein ): NaCl and BSA, BSA alone, NaCl alone, and without BSA or NaCl. [0223] Figure 17 is a histogram which shows that the RBPs protein of phage 2 has an affinity for the species S. aureus, ie, no affinity for the bacteria S. epidermis or S. algenitis. EXAMPLES
[0224] La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention. [0224] The present invention will be better understood on reading the following examples which non-limitatively illustrate the invention.
Exemple 1 : Activité de bactériophages Example 1: Activity of bacteriophages
1.1. Détermination de l’activité d’un bactériophage sur une souche bactérienne [0225] Pour identifier si un bactériophage est spécifique d’une bactérie, la méthode des spots a été utilisé. Sur une boite de Pétri où est étalée une culture de bactérie en phase exponentielle, au moins un spot comprenant le bactériophage est déposé. Si une plage de lyse est observée autour du spot, cela signifie que le bactériophage est actif pour cette bactérie, autrement dit que le bactériophage est spécifique de cette bactérie. 1.2. Bactériophages utilisés 1.1. Determination of the activity of a bacteriophage on a bacterial strain [0225] To identify whether a bacteriophage is specific for a bacterium, the spot method was used. On a Petri dish on which a culture of bacteria in exponential phase is spread, at least one spot comprising the bacteriophage is deposited. If a lysis plaque is observed around the spot, it means that the bacteriophage is active for this bacterium, in other words that the bacteriophage is specific for this bacterium. 1.2. Bacteriophages used
[0226] Plusieurs phages ont été testés dans la présente demande, notamment les souches suivantes : Several phages were tested in the present application, in particular the following strains:
- la souche de bactériophage déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro CNCM 1-5408 (phage 2), - la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro- the bacteriophage strain deposited at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under the number CNCM 1-5408 (phage 2), - the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number
CNCM 1-5409 (phage 3), CNCM 1-5409 (phage 3),
- la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro- the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number
CNCM 1-5410 (phage 7), CNCM 1-5410 (phage 7),
- la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5491 (phage 9), - the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM 1-5491 (phage 9),
- la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro- the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number
CNCM 1-5492 (phage 10), CNCM 1-5492 (phage 10),
- la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5680 (phage 5). - the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM 1-5680 (phage 5).
1.3 Détermination du spectre d’activité des phages isolés 1.3 Determination of the activity spectrum of isolated phages
[0227] Selon les profils de digestion, neuf phages ont finalement été sélectionnés pour tester leur activité sur différentes souches de S. aureus isolées à partir des échantillons d’élevage. [0227] According to the digestion profiles, nine phages were finally selected to test their activity on different strains of S. aureus isolated from breeding samples.
[0228] Pour les phages 2 à 7, l’activité des phages isolés est comparée à celle du phage de référence qui est le phage K (phage 1). [0228] For phages 2 to 7, the activity of the isolated phages is compared with that of the reference phage which is phage K (phage 1).
[0229] Résultats : [0229] Results:
Le spectre d’activité a été testé sur les 30 souches de S. aureus (Tableau 1) ou sur 19 souches de S. aureus (Tableau 2) par la méthode de spot. L’intensité de lyse de ces phages sur chacune des souches bactériennes est détaillée dans le tableau 1 et le tableau 2. Le tableau 1 représente donc le spectre d’activité des phages isolés sur les souches de S. aureus bovines et le tableau 2 représente le spectre d’activité des phages isolés sur différentes souches bactériennes. La lyse obtenue par la méthode de spot est notée de (-) = pas d’activité à (+++++) = très active. The activity spectrum was tested on the 30 strains of S. aureus (Table 1) or on 19 strains of S. aureus (Table 2) by the spot method. The intensity of lysis of these phages on each of the bacterial strains is detailed in Table 1 and Table 2. Table 1 therefore represents the activity spectrum of the phages isolated on the strains of bovine S. aureus and Table 2 represents the spectrum of activity of the phages isolated on different bacterial strains. The lysis obtained by the spot method is noted from (-) = no activity to (+++++) = very active.
Tableau 1 :
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
H cr cTTable 1:
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
H cr cT
C VS
K)
Figure imgf000047_0002
Figure imgf000047_0001
K)
Figure imgf000047_0002
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000048_0001
[0230] L’appréciation de l’intensité de lyse est appréciée de 0 (-) à +++++. La notation «C » signifie que quelques colonies sont observées dans la plage de lyse. [0230] The assessment of the intensity of lysis is assessed from 0 (-) to +++++. The "C" notation means that a few colonies are observed within the lysis range.
[0231] Ces résultats montrent que : [0231] These results show that:
- Le phage K (ATCC 19685-B1) (phage 1) infecte 28 souches sur les 30 souches testées, soit 93 % (Tableau 1) ; - The phage K (ATCC 19685-B1) (phage 1) infects 28 strains out of the 30 strains tested, ie 93% (Table 1);
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5408 (phage 2) infecte 29 souches sur les 30 souches testées, soit 97 % (Tableau 1) ; - The bacteriophage deposited at the CNCM under the number CNCM 1-5408 (phage 2) infects 29 strains out of the 30 strains tested, ie 97% (Table 1);
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5409 (phage 3) infecte 22 souches sur les 30 souches testées, soit 73 % (Tableau 1) ; - Le bactériophage 4 infecte 25 souches sur les 30 souches testées, soit 83 % (Tableau 1) ;- The bacteriophage deposited at the CNCM under the number CNCM 1-5409 (phage 3) infects 22 strains out of the 30 strains tested, ie 73% (Table 1); - Bacteriophage 4 infects 25 strains out of the 30 strains tested, ie 83% (Table 1);
- Le bactériophage 5 infecte 14 souches sur les 30 souches testées, soit 47 % (Tableau 1) ; - Le bactériophage 6 infecte 14 souches sur les 30 souches testées, soit 47 % (Tableau 1) ;- Bacteriophage 5 infects 14 strains out of the 30 strains tested, ie 47% (Table 1); - Bacteriophage 6 infects 14 strains out of the 30 strains tested, ie 47% (Table 1);
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5410 (phage 7) infecte 28 souches sur les 30 souches testées, soit 93 % (Tableau 1) ; - The bacteriophage deposited at the CNCM under the number CNCM 1-5410 (phage 7) infects 28 strains out of the 30 strains tested, ie 93% (Table 1);
- Le cocktail des trois phages (2, 3 et 7) infecte 30 souches sur les 30 souches testées, soit 100 % (Tableau 1) ; - The cocktail of the three phages (2, 3 and 7) infects 30 strains out of the 30 strains tested, ie 100% (Table 1);
- Le bactériophage 8 infecte 14 souches sur 19 souches S. aureus, soit 68.4% (Tableau 2) ; - Bacteriophage 8 infects 14 strains out of 19 S. aureus strains, ie 68.4% (Table 2);
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5491 (phage 9) infecte 15 souches sur 19 souches S. aureus, soit 79% (Tableau 2) ; - Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5492 (phage 10) infecte- The bacteriophage deposited at the CNCM under the number CNCM 1-5491 (phage 9) infects 15 strains out of 19 S. aureus strains, ie 79% (Table 2); - The bacteriophage deposited at the CNCM under the number CNCM 1-5492 (phage 10) infects
15 souches sur 19 souches S. aureus, soit 79% (Tableau 2) ; 15 strains out of 19 S. aureus strains, ie 79% (Table 2);
- Le cocktail des trois phages (2, 9 et 10) infecte 19 souches sur 19 souches S. aureus, soit 100% des souches S. aureus testées (Tableau 2). - The cocktail of three phages (2, 9 and 10) infects 19 strains out of 19 S. aureus strains, ie 100% of the S. aureus strains tested (Table 2).
- Le bactériophage 5 infecte 17 souches sur les 19 souches testées, soit 89 % (Tableau 2). [0232] Le spectre d’activité du phage 2 (CNCM 1-5408) est le plus large et comparable au phage K (phage référence). Cependant, le phage K ne peut pas infecter toutes les souches testées. En revanche, certains mélanges de bactériophages selon l’invention permettent d’infecter plus de souches de S. aureus que le phage K, voire 100% des souches de S. aureus testées. [0233] En particulier, il a été montré que le mélange des phages- Bacteriophage 5 infects 17 strains out of the 19 strains tested, ie 89% (Table 2). [0232] The activity spectrum of phage 2 (CNCM 1-5408) is the broadest and comparable to phage K (reference phage). However, phage K cannot infect all strains tested. On the other hand, certain mixtures of bacteriophages according to the invention make it possible to infect more strains of S. aureus than phage K, or even 100% of the strains of S. aureus tested. [0233] In particular, it has been shown that the mixture of phages
CNCM 1-5408 (phage 2), CNCM 1-5409 (phage 3), et CNCM 1-5410 (phage 7) permettait d’infecter la totalité des 30 souches, soit 100 % des souches testées (Tableau 1). CNCM 1-5408 (phage 2), CNCM 1-5409 (phage 3), and CNCM 1-5410 (phage 7) made it possible to infect all of the 30 strains, or 100% of the strains tested (Table 1).
[0234] Il a été également montré que le mélange des phages CNCM 1-5408 (phage 2), CNCM 1-5491 (phage 9), et CNCM 1-5492 (phage 10) permettait d’infecter la totalité des 19 souches S. aureus, soit 100 % des souches S. aureus testées (Tableau 2). [0234] It was also shown that the mixture of phages CNCM 1-5408 (phage 2), CNCM 1-5491 (phage 9), and CNCM 1-5492 (phage 10) made it possible to infect all of the 19 S strains aureus, ie 100% of the S. aureus strains tested (Table 2).
[0235] Les phages selon l’invention ont un large spectre d’activité d’infection des souches de S. aureus et une vitesse d’élimination de S. aureus particulièrement intéressante (après 3 h d’incubation à 37°C en milieu BHI). Exemple 2 : Sélection des protéines de bactériophages The phages according to the invention have a broad spectrum of activity of infection of strains of S. aureus and a particularly advantageous rate of elimination of S. aureus (after 3 h of incubation at 37 ° C. in medium BHI). Example 2: Selection of bacteriophage proteins
[0236] L’adsorption des bactériophages sur la bactérie hôte s’effectue grâce à la reconnaissance spécifique des protéines de liaison des phages (Receptor Binding Protein ou RBP) à la surface bactérienne. Ces protéines sont localisées à la base (« baseplate ») de la queue des phages. [0236] The adsorption of bacteriophages on the host bacterium takes place thanks to the specific recognition of phage binding proteins (Receptor Binding Protein or RBP) on the bacterial surface. These proteins are located at the base (“baseplate”) of the phage tail.
[0237] Afin de déterminer la spécificité de liaison des différents types de protéines de phages à S. aureus, les protéines suivantes ont été sélectionnées et synthétisées : In order to determine the specificity of binding of the different types of phage proteins to S. aureus, the following proteins were selected and synthesized:
- une RBP du phage 2, - a phage 2 RBP,
- une RBP du phage 3, - une RBP du phage 7 - a phage 3 RBP, - a phage 7 RBP
- une RBP du phage 9 - a phage 9 RBP
- une RBP du phage 10 - a phage 10 RBP
- une RBP du phage 5. - an RBP of phage 5.
[0238] Pour cela, les phages 2, 3, 5, 7, 9 et 10 ont été séquencés. La recherche des RBPs a été réalisée à partir des annotations complètes des génomes des phages 2, 3, 5, 7 9 et 10 en ciblant sur les séquences de la région « base plate ». L’alignement des séquences « base plate » de chaque phage a été réalisé un utilisant la technique BlastX des ORLs (open reading firame) des phages. For this, phages 2, 3, 5, 7, 9 and 10 were sequenced. The search for RBPs was carried out from the complete annotations of the genomes of phages 2, 3, 5, 79 and 10 by targeting the sequences of the “flat base” region. Alignment of the "flat base" sequences of each phage was performed using the phage open reading firame (ORLs) BlastX technique.
[0239] Les protéines RBPs ont été retrouvées au niveau du cluster des gènes de la queue et plus précisément au niveau de la partie « base plate ». The RBPs proteins were found at the level of the tail gene cluster and more precisely at the level of the "flat base" part.
[0240] Les RBP des phages 2, 3, 5, 7, 9 et 10 correspondent respectivement à SEQ ID NO :1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO :6. [0240] The RBPs of phages 2, 3, 5, 7, 9 and 10 correspond respectively to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
Production des RBP de phage [0241] Les protéines RBPs des phages 2, 3, 5, 7, 9 et 10 ont ensuite été produites dans la bactérie BL21 par la technique de clonage. Pour cela, les gènes correspondants aux protéines de phages ont été clonés dans un vecteur d’expression bactérien permettant la synthèse des protéines en fusion avec l’enzyme Glutathione-S-Transférase (GST) par la bactérie hôte BL21. Production of phage RBPs [0241] The RBPs proteins of phages 2, 3, 5, 7, 9 and 10 were then produced in the bacterium BL21 by the cloning technique. For this, the genes corresponding to the phage proteins were cloned into a bacterial expression vector allowing the synthesis of proteins in fusion with the enzyme Glutathione-S-Transferase (GST) by the host bacterium BL21.
[0242] Les protéines GST-P1 et GST-P2 sont exprimées dans un plasmide pDEST15 avec une souche Escherichia coli BL21 star (Invitrogen, C601003) dans un milieu LB (BD, 240230) contenant 100 mg/L d’ampicilline (Fisher bioreagent, BP 1760-25). Une culture bactérienne est ensemencée à DO 0.05 dans le même milieu et incubée à 37°C et 140 rpm jusqu’à DO 0.5. Les cultures sont ensuite induites avec 0.1 mM d’IPTG (Invitrogen, 15529-019) et incubées à 25°C et 140 rpm pendant une nuit. Les cellules sont ensuite centrifugées à 5000 g et les culots sont repris dans un tampon de lyse contenant de l’Hepes 50 mM (Fisher bioreagent , BP310-500) pH 8,[0242] The GST-P1 and GST-P2 proteins are expressed in a plasmid pDEST15 with an Escherichia coli BL21 star strain (Invitrogen, C601003) in an LB medium (BD, 240230) containing 100 mg / L of ampicillin (Fisher bioreagent , BP 1760-25). A bacterial culture is inoculated at OD 0.05 in the same medium and incubated at 37 ° C and 140 rpm until OD 0.5. The cultures are then induced with 0.1 mM IPTG (Invitrogen, 15529-019) and incubated at 25 ° C and 140 rpm overnight. The cells are then centrifuged at 5000 g and the pellets are taken up in lysis buffer containing 50 mM Hepes (Fisher bioreagent, BP310-500) pH 8,
NaCl 250 mM (Euromedex, 1112-A), Glycerol 10 % (Carlo Erba, 453751), NP40 0.1% (Sigma Aldrich, 18896)) et soniquées 4 x 1 minute. Les lysas sont ensuite centrifugés à 14000 g pendant 30 minutes. Le surnageant est récupéré est incubé une nuit avec la résine Glutathione Sepharose 4B (Cytiva, 17-0756-01). La résine est ensuite récupérée à l’aide d’une colonne avec un verre fritté, lavée avec le tampon HEPES 50 mM pH8, NaCl 250 mM, Glycerol 10 %, NP40 0.1% ; équilibrée avec le tampon HEPES 50 mM pH8, NaCl 50 mM et éluée dans le tampon HEPES 50 mM pH8, NaCl 50 mM, 20 mM glutathion oxydé. Les protéines sont ensuite conservées à -80°C Exemple 3 : Évaluation de la spécificité de liaison des protéines de phases à S. aureus250 mM NaCl (Euromedex, 1112-A), Glycerol 10% (Carlo Erba, 453751), NP40 0.1% (Sigma Aldrich, 18896)) and sonicated 4 x 1 minute. The lysas are then centrifuged at 14,000 g for 30 minutes. The supernatant is recovered and incubated overnight with Glutathione Sepharose 4B resin (Cytiva, 17-0756-01). The resin is then recovered using a column with a sintered glass, washed with 50 mM HEPES buffer pH8, 250 mM NaCl, 10% Glycerol, 0.1% NP40; equilibrated with 50 mM HEPES buffer pH8, 50 mM NaCl and eluted in 50 mM HEPES buffer pH8, 50 mM NaCl, 20 mM oxidized glutathione. The proteins are then stored at -80 ° C. Example 3: Evaluation of the specificity of binding of phase proteins to S. aureus
3.1 - Matériel et Méthodes 3.1 - Material and Methods
[0243] Pour évaluer la spécificité de liaison de chacune de ces protéines pour l’espèce bactérienne S. aureus, des billes magnétiques conjuguées aux protéines à tester ont été utilisées. [0244] Chacune des protéines a été conjuguée avec des billes magnétiques de manière à ce que la surface de ces billes soit recouverte par l’une des protéines RBP. [0243] To assess the binding specificity of each of these proteins for the bacterial species S. aureus, magnetic beads conjugated to the proteins to be tested were used. [0244] Each of the proteins was conjugated with magnetic beads so that the surface of these beads was covered by one of the RBP proteins.
[0245] Les protéines conjuguées ont été ajoutées à un mélange de bactéries comprenant différentes espèces de Staphylocoques ( Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis et Staphylococcus algnetis). L’expérience est réalisée pour chacune des protéines indépendamment. The conjugated proteins were added to a mixture of bacteria comprising different species of Staphylococci (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus algnetis). The experiment is performed for each of the proteins independently.
[0246] S’il y a une interaction spécifique (une affinité) entre la protéine testée et une ou plusieurs espèces bactériennes du mélange, la protéine va capturer la ou les bactéries. [0247] Les billes sont ensuite séparées de la phase liquide grâce à un support aimanté, et lavées plusieurs fois avec une solution tampon afin d’éliminer les interactions non spécifiques. [0246] If there is a specific interaction (an affinity) between the protein tested and one or more bacterial species in the mixture, the protein will capture the bacteria (s). [0247] The beads are then separated from the liquid phase using a magnetic support, and washed several times with a buffer solution in order to eliminate non-specific interactions.
[0248] Les billes sont ensuite récupérées et étalées en boite de Pétri sur une gélose spécifique (Baird Parker). Après incubation, les espèces bactériennes immobilisées par les protéines sont identifiées visuellement selon la morphologie et la couleur des colonies se développant sur gélose. Le nombre de bactéries retenues est également déterminé par dénombrement des colonies sur la gélose. L’affinité ou l’interaction de la protéine testée pour la bactérie cible est évaluée par le nombre de bactéries retenues. Plus le nombre de bactéries cibles sur la gélose est élevé, plus l’affinité de la protéine pour la bactérie cible est grande. The beads are then collected and spread in a Petri dish on a specific agar (Baird Parker). After incubation, the bacterial species immobilized by the proteins are visually identified according to the morphology and the color of the colonies developing on agar. The number of bacteria retained is also determined by counting the colonies on the agar. The affinity or interaction of the tested protein for the target bacteria is assessed by the number of bacteria retained. The higher the number of target bacteria on the agar, the greater the affinity of the protein for the target bacteria.
3.2. - Résultats 3.2. - Results
[0249] L’expression des protéines RBP des phages 2, 3, 5 et 7 dans les bactéries BL21 a été vérifiée sur gel (Figure 12). Les tailles respectives des RBPs des phages 2, 3 et 7 sont 78,1 kDa, 100,8 kDa et 79,5 kDa. La taille de RBP du phage 5 est de 100 kDa. [0250] La spécificité de liaison de ces protéines à l’espèce bactérienne S. aureus a ensuite été étudiée. Les résultats présentés en Figure 17 ont montré que la protéine RBP (gp68) du phage 2 a une affinité pour la bactérie Staphylococcus aureus et uniquement pour cette espèce de Staphylocoque. [0249] The expression of RBP proteins from phages 2, 3, 5 and 7 in BL21 bacteria was verified on gel (Figure 12). The respective sizes of RBPs of phages 2, 3 and 7 are 78.1 kDa, 100.8 kDa and 79.5 kDa. The RBP size of phage 5 is 100 kDa. [0250] The specificity of binding of these proteins to the bacterial species S. aureus was then studied. The results presented in FIG. 17 showed that the RBP protein (gp68) of phage 2 has an affinity for the bacterium Staphylococcus aureus and only for this species of Staphylococcus.
[0251] Les résultats obtenus avec la RBP des bactériophages 3 et 7 sont identiques à ceux obtenus avec la RBP du bactériophage 2. Exemple 4 : Évaluation de la spécificité de liaison de la RBP du phage phi 5 The results obtained with the RBP of bacteriophages 3 and 7 are identical to those obtained with the RBP of bacteriophage 2. Example 4: Evaluation of the binding specificity of the RBP of phage phi 5
4.1 Méthode : ELISA indirect 4.1 Method: indirect ELISA
[0252] L'ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay,) est un dosage immuno-enzymatique sur support solide, basé sur la réaction spécifique antigène-anticorps. The ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) is an enzyme-linked immunosorbent assay on a solid support, based on the specific antigen-antibody reaction.
Le principe d’un ELISA indirect est de mettre sur une micro-plaque un antigène et ajouter un anticorps primaire dirigé contre cet antigène. Un anticorps secondaire contre les chaînes lourdes du premier anticorps, couplé à une enzyme, est ensuite ajouté. L’ajout du substrat de l’enzyme permet d’obtenir une réaction colorée dosable par absorbance. 1. Isolement de la protéine RPB du phage 5 The principle of an indirect ELISA is to put an antigen on a microplate and add a primary antibody directed against this antigen. A secondary antibody against the heavy chains of the first antibody, coupled to an enzyme, is then added. The addition of the enzyme substrate provides a color reaction measurable by absorbance. 1. Isolation of RPB protein from phage 5
[0253] Le phage 5 a été isolé à partir d’un échantillon provenant d’une ferme laitière en Lrance. Ce phage est spécifique à la bactérie Staphylococcus aureus (S. aureus ). Le phage a été déposé auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, L-75724 Paris cedex 15) le 7 mai 2021 sous le numéro CNCM 1-5680. Le génome de ce phage a été séquencé et la protéine de liaison au récepteur (RBP) du phage phi5 a été identifiée (ci-dessous). [0253] Phage 5 was isolated from a sample from a dairy farm in Lrance. This phage is specific to the bacterium Staphylococcus aureus (S. aureus). The phage was deposited with the CNCM (National Collection of Culture of Microorganisms - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, L-75724 Paris cedex 15) on May 7, 2021 under the number CNCM 1-5680. The genome of this phage has been sequenced and the receptor binding protein (RBP) of phage phi5 has been identified (below).
[0254] La séquence protéique de la protéine RBP du phage 5 est SEQ ID NO : 4. The protein sequence of the RBP protein of phage 5 is SEQ ID NO: 4.
2, Production de la protéine RPB du phage 5 2, Production of the RPB protein of phage 5
[0255] Les protéines de phage 5 ont été reproduites dans la bactérie BL21 par la technique de clonage. Les gènes correspondants aux protéines de phages ont été clonés dans un vecteur d’expression bactérien permettant la synthèse par la bactérie hôte de protéines en utilisant la fusion avec l’enzyme Glutathione-S-Transférase (GST). La production de la protéine est faite selon le protocole décrit dans l’exemple 2. 3. Evaluation de la spécificité de la protéine RPB du phage 5 [0255] The phage 5 proteins were reproduced in the BL21 bacterium by the cloning technique. The genes corresponding to the phage proteins were cloned into a bacterial expression vector allowing the synthesis by the host bacterium of proteins using the fusion with the enzyme Glutathione-S-Transferase (GST). The production of the protein is carried out according to the protocol described in Example 2. 3. Evaluation of the specificity of the RPB protein of phage 5
[0256] Pour déterminer la spécificité des protéines, ce principe a été adapté comme suit. Les protéines sont biotinylées préalablement (greffage de biotine) à l’aide d’un kit commercial (EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation, Thermo, Réf : 21955). Des bactéries à la concentration de 107 UFC/mL sont immobilisées au fond des puits d’une plaque de microtitration pendant lh30 à 37°C. La suspension bactérienne est enlevée et les puits sont saturés avec une solution contenant de la BSA à 3% et du Tween20 à 0,05 %. La solution de saturation est éliminée, puis les RBP biotinylées sont ajoutées. Les RBP sont dans une solution à 10pg/ml dans un tampon PBS 1% BSA, 0,05% Tween20. Une incubation de lh à 37°C suit. Les puits sont lavés 5 fois avec tampon PBS -Tween de 0,05%. De la streptavidine couplée à HRP (Invitrogene, ref, 434323) à 0,25 pg/mL, en solution dans un tampon PBS 1% BSA, 0,05% Tween20, est ajoutée et suivie d’une incubation pendant 1 h à 37°C. Les puits sont lavés 5 fois avec tampon PBS -Tween de 0,05%. 100pL d’une solution de TMB sont ajoutés, et suivi par une incubation de 15 à 30 min à température ambiante. 50m1 d’acide sulfurique 2 M sont ajoutés pour stopper la réaction. La densité optique des puits de la plaque est ensuite lue à 540nm. To determine the specificity of proteins, this principle has been adapted as follows. The proteins are biotinylated beforehand (biotin grafting) using a commercial kit (EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation, Thermo, Ref: 21955). Bacteria at a concentration of 10 7 CFU / mL are immobilized at the bottom of the wells of a microtiter plate for 1 h 30 min at 37 ° C. The bacterial suspension is removed and the wells are saturated with a solution containing 3% BSA and 0.05% Tween20. The saturation solution is removed, then the biotinylated RBP are added. The RBPs are in a 10 µg / ml solution in 1% BSA, 0.05% Tween20 PBS buffer. An incubation of 1 hour at 37 ° C follows. The wells are washed 5 times with 0.05% PBS-Tween buffer. Streptavidin coupled to HRP (Invitrogene, ref, 434323) at 0.25 pg / mL, dissolved in 1% BSA, 0.05% Tween20 PBS buffer, is added and followed by incubation for 1 h at 37 ° C. The wells are washed 5 times with 0.05% PBS-Tween buffer. 100 μL of a TMB solution are added, and followed by an incubation of 15 to 30 min at room temperature. 50m1 of 2M sulfuric acid are added to stop the reaction. The optical density of the wells of the plate is then read at 540nm.
4.2 - Résultats 4.2 - Results
[0257] L’affinité de la protéine à la bactérie est exprimée par la quantité de protéines retenues par chaque souche bactérienne. Cette quantité est évaluée par l’absorbance liée à la streptavidine couplée à HRP. [0257] The affinity of the protein to the bacteria is expressed by the amount of protein retained by each bacterial strain. This amount is evaluated by the absorbance bound to streptavidin coupled to HRP.
[0258] Différentes souches ont été testés par le système ELISA indirect avec la protéine RPB du phage 5 biotinylée. [0258] Different strains were tested by the indirect ELISA system with the RPB protein of the biotinylated phage 5.
[0259] Les résultats sont présentés dans le tableau 3 (D : détection, ND : pas de détection) et dans la Figure 13. [0260] Le seuil de détection est fixé à une valeur de densité optique de 0,6 : au-delà de cette valeur, la souche de bactérie est considérée comme détectée (D) ; en deçà, elle est considérée comme non détectée (ND). [0261] Tableau 3
Figure imgf000055_0001
[0259] The results are presented in Table 3 (D: detection, ND: no detection) and in Figure 13. [0260] The detection threshold is set at an optical density value of 0.6: au- beyond this value, the strain of bacteria is considered to be detected (D); below, it is considered undetected (ND). [0261] Table 3
Figure imgf000055_0001
[0262] Les résultats obtenus démontrent que la protéine de phage phi5 reconnaît 100% des souches de S.aureus testées. Elle ne reconnaît pas les souches de Staphylocoques non aureus et les autres types de bactéries. Exemple 5 : Comparaison de la spécificité de la protéine 5 et l’anticorps antiThe results obtained demonstrate that the phage phi5 protein recognizes 100% of the strains of S. aureus tested. It does not recognize strains of Staphylococcus non aureus and other types of bacteria. Example 5: Comparison of the specificity of protein 5 and the anti
Stavhylococcus aureus „ évaluée par ELISA indirect Stavhylococcus aureus „evaluated by indirect ELISA
[0263] Un protocole identique à celui de l’exemple 4 a été utilisé pour la fixation des bactéries et pour la réalisation du test ELISA avec la RBP de phi5. [0264] Pour déterminer la spécificité de l’anticorps anti S. aureus (ThermoFischer, ref, PA1-7246), le protocole est le suivant ; Les bactéries sont fixées au fond des puits d’une micro-plaque (ELISA) à 107 UFC/mL pendant lh30 à 37°C. Une étape de saturation par une solution contenant de la BSA à 3% et du Tween à 0,05 % est réalisée, puis la solution de BSA est éliminée. [0265] Parallèlement, dans une autre micro plaque, l’anticorps anti S. aureus (ThermoFischer, ref, PA1-7246) est déposé dans chaque puits de 9 pg/mL (la concentration peut être modifiée dans l’intervalle de 5 pg/mL à 50 pg/mL) dans un tampon PBS (1% BSA ; 0,05% Tween). Une incubation pendant lh à 37°C est ensuite réalisée. [0266] Les puits des deux types de plaques sont lavés (au moins 5 fois) avec le tamponA protocol identical to that of Example 4 was used for the binding of the bacteria and for the performance of the ELISA test with the RBP of phi5. To determine the specificity of the anti S. aureus antibody (ThermoFischer, ref, PA1-7246), the protocol is as follows; The bacteria are fixed at the bottom of the wells of a micro-plate (ELISA) at 10 7 CFU / mL for 1 h 30 min at 37 ° C. A saturation step with a solution containing 3% BSA and 0.05% Tween is carried out, then the BSA solution is removed. At the same time, in another microplate, the anti S. aureus antibody (ThermoFischer, ref, PA1-7246) is deposited in each well of 9 pg / mL (the concentration can be modified in the range of 5 pg / mL at 50 pg / mL) in PBS buffer (1% BSA; 0.05% Tween). Incubation for 1 hour at 37 ° C. is then carried out. [0266] The wells of the two types of plates are washed (at least 5 times) with the buffer.
PBS contenant du Tween à 0,05%. Une étape d’incubation avec l’anticorps secondaire Goat anti Rabbit IgG (H+L) couplé à HRP (ThermoFischer, ref Al 6096) à 1 mg/mL. Les puits sont lavés (au moins 5 fois) avec le tampon PBS contenant du Tween à 0,05%. Pour la détection, 100 pl d’une solution de TMB sont ajoutés et incubés de 15 à 30 minutes à température ambiante. Puis, 50pl d’acide sulfurique 2 M sont ajoutés pour stopper la réaction. La plaque est ensuite lue à 540nm. PBS containing 0.05% Tween. An incubation step with the secondary Goat anti Rabbit IgG antibody (H + L) coupled to HRP (ThermoFischer, ref Al 6096) at 1 mg / mL. The wells are washed (at least 5 times) with PBS buffer containing 0.05% Tween. For detection, 100 µl of TMB solution is added and incubated for 15 to 30 minutes at room temperature. Then, 50 µl of 2 M sulfuric acid are added to stop the reaction. The plate is then read at 540nm.
[0267] Les résultats sont présentés en Figure 14. [0267] The results are shown in Figure 14.
[0268] L’affinité de la protéine pour la bactérie est exprimée par la quantité de protéines ou d’anticorps retenue par chaque souche bactérienne. Cette quantité est évaluée par l’absorbance liée à la streptavidine couplé à HRP pour les protéines de phage et à l’anticorps secondaire Goat anti Rabbit IgG (H+L) pour l’anticorps. [0268] The affinity of the protein for the bacteria is expressed by the amount of protein or antibody retained by each bacterial strain. This amount is evaluated by the absorbance bound to streptavidin coupled to HRP for phage proteins and to the secondary antibody Goat anti Rabbit IgG (H + L) for the antibody.
[0269] Le seuil de détection est fixé à une valeur de densité optique de 0,6 : au-delà de cette valeur, la souche de bactérie est considérée comme détectée (D) ; en deçà, elle est considérée comme non détectée (ND). The detection threshold is set at an optical density value of 0.6: beyond this value, the strain of bacteria is considered to be detected (D); below, she is considered undetected (ND).
[0270] Les résultats montrent que les protéines de phages sont plus spécifiques que l’anticorps. Elles ne reconnaissent pas les souches de Staphylocoques non-aureus et les autres espèces bactériennes alors que l’anticorps anti Staphylococcus reconnaît Staphylococcus saprophyticus et Staphyoloccus epidermidis. [0270] The results show that phage proteins are more specific than antibody. They do not recognize strains of Staphylococcus non-aureus and other bacterial species, while the anti Staphylococcus antibody recognizes Staphylococcus saprophyticus and Staphyoloccus epidermidis.
[0271] Cette protéine est donc spécifique. Elle peut donc être utilisée pour la détection de S. aureus. This protein is therefore specific. It can therefore be used for the detection of S. aureus.
Exemple 6 : Système bandelette Example 6: Strip system
[0272] Dans un mode de réalisation du système de bandelette selon l’invention, l’immobilisation des phages ou des protéines de phages en utilisant la solution spécifique entraîne, en présence de la bactérie S. aureus dans l’échantillon, un blocage de la migration due aux phages ou à la protéine de phage immobilisé(s) sur la membrane. [0272] In one embodiment of the strip system according to the invention, the immobilization of the phages or phage proteins using the specific solution leads, in the presence of the S. aureus bacteria in the sample, to blocking of. migration due to phage or phage protein immobilized on the membrane.
[0273] Les protéines du bactériophage 2 ont été déposées sur la membrane. Un séchage à 37°C pendant 1 h. Le lait cru contenant la souche de S. aureus 79 à 108 UFC/mL a été dilué au l/10eme dans un tampon contenant du Tween de 6% et du NaCl à 200 mM[0273] The proteins of bacteriophage 2 were deposited on the membrane. Drying at 37 ° C for 1 hour. The raw milk containing the strain of S. aureus 79 at 10 8 CFU / mL was diluted to 1/10 in a buffer containing 6% Tween and 200 mM NaCl
[0274] La bandelette est ensuite trempée 10 min puis sortie de l’échantillon, la migration des bactéries se fait pendant 10 min avant de voir le signal. Les résultats sont présentés dans la Figure 8. [0274] The strip is then soaked for 10 min and then removed from the sample, the bacteria migrating for 10 min before seeing the signal. The results are shown in Figure 8.
[0275] Dans le cadre de cet exemple, la solution d’immobilisation des protéines de phage comprend soit le composé A qui est la BSA utilisée à la concentration de 2 mg/mL, soit le composé B, qui est MgSCL utilisé à la concentration de 50 mM, soit la combinaison des solutions A et B (BSA à la concentration de 2 mg/mL et MgSCL utilisé à la concentration de 50 mM). In the context of this example, the phage protein immobilization solution comprises either compound A which is BSA used at the concentration of 2 mg / mL, or compound B, which is MgSCL used at the concentration 50 mM, ie the combination of solutions A and B (BSA at a concentration of 2 mg / mL and MgSCL used at a concentration of 50 mM).
[0276] La Figure 8 présente (à gauche) un mode de réalisation dans lequel les protéines de phages (RBP) ont été immobilisées dans une solution contenant de la BSA à la concentration de 2 mg/mL uniquement (A sans B). La bandelette de gauche est plongée dans un échantillon de lait cru sans bactéries, la bandelette de droite est plongée dans un échantillon de lait cru contenant des bactéries S. aureus. [0276] Figure 8 shows (left) an embodiment in which phage proteins (RBP) have been immobilized in a solution containing BSA at a concentration of 2 mg / mL only (A without B). The left strip is immersed in a sample of raw milk without bacteria, the right strip is immersed in a sample of raw milk containing S. aureus bacteria.
[0277] La Figure 8 présente (au centre) un mode de réalisation dans lequel les protéines de phages (RBP) ont été immobilisées dans une solution contenant du MgS04 uniquement à la concentration de 50 mM (B sans A). La bandelette de gauche est plongée dans un échantillon de lait cru sans bactéries, la bandelette de droite est plongée dans un échantillon de lait cru contenant des bactéries S. aureus. [0277] Figure 8 shows (center) an embodiment in which phage proteins (RBP) were immobilized in a solution containing MgSO4 only at the concentration of 50 mM (B without A). The left strip is immersed in a sample of raw milk without bacteria, the right strip is immersed in a sample of raw milk containing S. aureus bacteria.
[0278] La Figure 8 présente (à droite) un mode de réalisation dans lequel les protéines de phages (RBP) ont été immobilisées dans une solution contenant de la BSA à la concentration de 2 mg/mL et du MgSCL à la concentration de 50 mM (A et B). La bandelette de gauche est plongée dans un échantillon de lait cru sans bactéries, la bandelette de droite est plongée dans un échantillon de lait cru contenant des bactéries S. aureus. [0278] Figure 8 shows (right) an embodiment in which phage proteins (RBP) were immobilized in a solution containing BSA at the concentration of 2 mg / mL and MgSCL at the concentration of 50 mM (A and B). The left strip is immersed in a sample of raw milk without bacteria, the right strip is immersed in a sample of raw milk containing S. aureus bacteria.
[0279] La Figure 8 établit clairement que lorsque les protéines de phages sont immobilisées sur la bandelette grâce à la solution contenant à la fois de la BSA à la concentration de 2 mg/mL et du MgSCL à la concentration de 50 mM, les bactéries sont capturées dans la zone où les protéines de phage (RBP) ont été immobilisées. [0279] Figure 8 clearly establishes that when the phage proteins are immobilized on the strip thanks to the solution containing both BSA at the concentration of 2 mg / mL and MgSCL at the concentration of 50 mM, the bacteria are captured in the area where phage proteins (RBP) have been immobilized.
[0280] Le système de bandelette a permis de détecter les bactéries à 103UFC/mL dans un échantillon de lait cru (Figure 9). Le signal est différent lorsque la bactérie est présente dans l’échantillon et en l’absence de la bactérie. [0281] En conclusion : le système de bandelette selon l’invention est basé sur l’immobilisation des phages ou des protéines de phages en utilisant la solution comprenant une protéine et un cation (BSA et MgSO4) ; le signal traduisant la présence de la bactérie n’est pas représenté par une ligne de couleur comme dans le système classique mais par un blocage de la migration. Ce type de signal n’est jamais décrit dans l’art antérieur. [0280] The strip system made it possible to detect bacteria at 10 3 CFU / mL in a sample of raw milk (FIG. 9). The signal is different when the bacteria are present in the sample and when the bacteria are absent. In conclusion: the strip system according to the invention is based on the immobilization of phages or phage proteins using the solution comprising a protein and a cation (BSA and MgSO 4 ); the signal reflecting the presence of the bacteria is not represented by a colored line as in the conventional system but by a blockage of migration. This type of signal is never described in the prior art.
[0282] La sensibilité de détection fait la différence essentielle entre le système classique et le système de l’invention. Exemple 7 : Utilisation de la RBP du bactériophage phi 5 pour la détection des bactéries par le système LFA (bandelette) The detection sensitivity makes the essential difference between the conventional system and the system of the invention. Example 7: Use of the RBP of the bacteriophage phi 5 for the detection of bacteria by the LFA system (strip)
7.1 - Matériel et Méthodes 7.1 - Material and Methods
[0283] Deux souches de S.aureus (79 et C24b) sont utilisées, le contrôle est réalisé sans bactéries. [0283] Two strains of S. aureus (79 and C24b) are used, the control is carried out without bacteria.
[0284] Les tests suivants sont réalisés : [0284] The following tests are carried out:
- La RBP du bactériophage phi 5 est déposée et immobilisée sur la membrane à une concentration de 1 mg/mL dans une solution contenant de la BSA à lmg/mL et du NaCl à 150 mM - La RBP du bactériophage phi 5 est déposée et immobilisée sur la membrane à une concentration de 1 mg/mL dans une solution contenant de la BSA à 1 mg/mL. - The RBP of bacteriophage phi 5 is deposited and immobilized on the membrane at a concentration of 1 mg / mL in a solution containing BSA at 1 mg / mL and NaCl at 150 mM - The RBP of bacteriophage phi 5 is deposited and immobilized on the membrane at a concentration of 1 mg / mL in a solution containing BSA at 1 mg / mL.
- La RBP du bactériophage phi 5 est déposée et immobilisée sur la membrane à une concentration de 1 mg/mL dans une solution contenant du NaCl à 150 mM. - The RBP of bacteriophage phi 5 is deposited and immobilized on the membrane at a concentration of 1 mg / mL in a solution containing 150 mM NaCl.
- La RBP du bactériophage phi 5 est déposée et immobilisée sur la membrane dans une solution ne contenant ni BSA, ni NaCl. - The RBP of bacteriophage phi 5 is deposited and immobilized on the membrane in a solution containing neither BSA nor NaCl.
[0285] L’anticorps anti S. aureus couplé à l’or a été déposé sur le Conjugé PAD. Le système est trempé dans la solution contenant les bactéries à une concentration de 107 UFC/mL pendant 20 min. Le signal est traité par un logiciel ImageJ : sélection de la zone de traitement et détermination par logiciel aire sous courbe, proportionnelle à l’intensité du signal. The anti S. aureus antibody coupled to gold was deposited on the PAD Conjugate. The system is soaked in the solution containing the bacteria at a concentration of 10 7 CFU / mL for 20 min. The signal is processed by ImageJ software: selection of the processing zone and determination by software of the area under curve, proportional to the intensity of the signal.
7.2 - Résultats 7.2 - Results
[0286] Les résultats présentés sur les Figures 15 et 16 montrent que la quantité de bactéries capturées par la RBP du phage phi 5 est beaucoup plus importante lorsque la RBP est immobilisée sur la membrane en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine (NaCl et BSA). Exemple 8 : mode de réalisation ELISA [0286] The results presented in Figures 15 and 16 show that the quantity of bacteria captured by the RBP of phage phi 5 is much greater when the RBP is immobilized on the membrane in the presence of a solution comprising a cation and a protein. (NaCl and BSA). Example 8: ELISA embodiment
[0287] Le principe de l’ELISA consiste à piéger, entre un « anticorps de capture » et un « anticorps de détection », les analytes (antigènes, bactéries, virus, etc...). La spécificité du système de détection de la présente invention par rapport au système ELISA classique est le remplacement d’un ou des deux anticorps par les phages ou les protéines de phages. [0287] The principle of ELISA consists in trapping, between a "capture antibody" and a "detection antibody", the analytes (antigens, bacteria, viruses, etc.). The specificity of the detection system of the present invention over the conventional ELISA system is the replacement of one or both antibodies by phages or phage proteins.
8.1 - Matériel et Méthodes 8.1 - Material and Methods
[0288] La protéine RBP sur phage 2 est préparée dans un tampon de coating contenant du MgS04 (50 mM) et de la BSA (2 mg/mL). La solution est répartie dans les puits d’une plaque de microtitration. La plaque est ensuite couverte et placée dans une enceinte à 4°C durant une nuit. [0288] The RBP protein on phage 2 is prepared in a coating buffer containing MgSO4 (50 mM) and BSA (2 mg / mL). The solution is distributed in the wells of a microtiter plate. The plate is then covered and placed in an enclosure at 4 ° C. overnight.
[0289] Le lendemain, la solution d’immobilisation (coating) est éliminée de chaque puit et la plaque est rincée plusieurs fois (au moins 3 fois) avec un tampon de rinçage (tampon PBS qui contient optionnellement du Tween 0,5%). [0290] Optionnellement, les interactions non spécifiques sont ensuite bloquées avec un tampon de saturation, par exemple le tampon de référence : Prod 37578 de Thermofischer. The next day, the immobilization solution (coating) is removed from each well and the plate is rinsed several times (at least 3 times) with a rinsing buffer (PBS buffer which optionally contains 0.5% Tween) . Optionally, the non-specific interactions are then blocked with a saturation buffer, for example the reference buffer: Prod 37578 from Thermofischer.
[0291] L’échantillon comprenant des bactéries S. aureus à différentes dilutions est distribué à raison de 100 mΐ d’échantillon dans chaque puits. Dans cet exemple, la solution PBS contient la souche 79 à différentes concentrations. Une incubation d’une heure à température ambiante suit. L’échantillon est éliminé et les puits sont rincés au moins 3 fois avec le tampon de rinçage (tampon PBS qui contient optionnellement du Tween 0,5%). [0291] The sample comprising S. aureus bacteria at different dilutions is distributed at the rate of 100 mΐ of sample in each well. In this example, the PBS solution contains strain 79 at different concentrations. A one hour incubation at room temperature follows. The sample is discarded and the wells are rinsed at least 3 times with the rinse buffer (PBS buffer which optionally contains 0.5% Tween).
[0292] L’anticorps anti-S. aureus (Staphylococcus aureus Rabbit Polyclonal Antibody fourni par Thermofïsher (Réf. 11578351)) conjugué à HRP est ajouté : le volume de 50 μL de la solution de l’anticorps dilué 1/10000 dans une solution PBS 1% BSA 0,05% Tween. Une incubation d’au moins 30 min à une température de 4°C à 37°C est ensuite réalisée. [0293] La solution d’anticorps est éliminée et les puits sont rincés au moins 3 fois avec le tampon de rinçage (tampon PBS qui contient optionnellement du Tween 0,5%). [0292] The anti-S antibody. aureus (Staphylococcus aureus Rabbit Polyclonal Antibody supplied by Thermofïsher (Ref. 11578351)) conjugated to HRP is added: the volume of 50 μL of the antibody solution diluted 1/10000 in a PBS 1% BSA 0.05% Tween solution . An incubation of at least 30 min at a temperature of 4 ° C to 37 ° C is then carried out. The antibody solution is removed and the wells are rinsed at least 3 times with the rinsing buffer (PBS buffer which optionally contains 0.5% Tween).
[0294] La révélation de la présence de bactérie est faite par l’ajout de TMB (prêt à l’emploi). [0295] La réaction est stoppée par ajout de 100 pL d’acide sulfurique à 1 M. [0294] The presence of bacteria is revealed by the addition of TMB (ready to use). [0295] The reaction is stopped by adding 100 μL of 1 M sulfuric acid.
[0296] Une lecture de la densité optique est faite (Figure 10A). L’intensité du signal permet de déterminer la concentration en bactéries (Figure 10B). [0296] A reading of the optical density is taken (FIG. 10A). The intensity of the signal is used to determine the concentration of bacteria (Figure 10B).
8.2 - Interprétation des résultats et analyse 8.2 - Interpretation of results and analysis
[0297] Le lecteur de plaque donne des densités optiques (DO) correspondantes à chaque puits. Les résultats extraits sont traités dans un tableur. La détermination des concentrations se fait selon les étapes suivantes : [0297] The plate reader gives optical densities (OD) corresponding to each well. The extracted results are processed in a spreadsheet. The concentration is determined according to the following steps:
- Soustraire pour chaque DO la DO correspondant au 0 (DO du tampon) - Subtract for each OD the OD corresponding to 0 (OD of the buffer)
- Déterminer l’équation de la gamme (qui généralement est linéaire, avec les concentrations de gamme en X et les DO correspondantes en Y) : DO=A*[C] + B [0298] À partir de cette équation, une gamme est établie (Figure 11). Elle permet de déterminer les concentrations en introduisant les valeurs de DO obtenues pour les échantillons et de ramener ensuite ces concentrations aux valeurs réelles en fonction des dilutions opérées de l’échantillon. - Determine the equation of the range (which is generally linear, with the range concentrations in X and the corresponding ODs in Y): DO = A * [C] + B [0298] From this equation, a range is established (Figure 11). It makes it possible to determine the concentrations by entering the OD values obtained for the samples and then to bring these concentrations to the actual values according to the dilutions made of the sample.
[0299] La détection de S. aureus en utilisant la protéine du phage 2 (immobilisée au puits des plaques) pour la capture des bactéries et un anticorps anti-S. aureus couplé à la HRP pour la révélation par TMB a permis de détecter S. aureus à un seuil entre 102 à 103 bactéries/mL (Figure 11). [0299] The detection of S. aureus using the phage 2 protein (immobilized in the wells of the plates) for the capture of bacteria and an anti-S antibody. aureus coupled to HRP for revelation by TMB made it possible to detect S. aureus at a threshold between 10 2 to 10 3 bacteria / mL (FIG. 11).
Références à du matériel biologique déposé References to deposited biological material
[0300] Dans la présente demande, il est fait référence aux souches de bactériophages suivantes, déposées à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) le 21 Mars 2019 par Vetophage SAS : [0300] In the present application, reference is made to the following strains of bacteriophages, deposited at the CNCM (National Collection of Culture of Microorganisms - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) on March 21, 2019 through Vetophage SAS:
- phage 2, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 2 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5408 » ; - phage 2, CNCM identification reference "Vetophage - phi 2", whose registration number is "CNCM 1-5408";
- phage 3, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 3 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5409 », - phage 3, CNCM identification reference "Vetophage - phi 3", whose registration number is "CNCM 1-5409",
- phage 7, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 7 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5410 ». - phage 7, CNCM identification number "Vetophage - phi 7", whose registration number is "CNCM 1-5410".
[0301] Dans la présente demande, il est fait référence aux souches de bactériophages suivantes, déposées à la CNCM Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) le 12 février 2020 par Vetophage SAS : [0301] In the present application, reference is made to the following strains of bacteriophages, deposited at the CNCM Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) on February 12, 2020 by Vetophage SAS:
- phage 9, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 9 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5491 » ; - phage 9, CNCM identification number "Vetophage - phi 9", whose registration number is "CNCM 1-5491";
- phage 10, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 10 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5492 ». - phage 10, CNCM identification number "Vetophage - phi 10", whose registration number is "CNCM 1-5492".
[0302] Dans la présente demande, il est fait référence à la souche de bactériophage déposée à la CNCM Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) le 7 mai 2021 par Vetophage SAS : phage 5 (phi 5), référence d’identification auprès de la CNCM « CNCM -39284. 2105 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5680 ». In the present application, reference is made to the bacteriophage strain deposited at the CNCM Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) on May 7, 2021 by Vetophage SAS: phage 5 (phi 5), CNCM identification reference “CNCM -39284. 2105 ", whose registration number is" CNCM 1-5680 ".

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support. 1. Use of a solution comprising a cation and a protein for immobilizing a bacteriophage protein on a support.
2. Utilisation d’une solution selon la revendication 1, dans laquelle ladite protéine de bactériophage est une protéine de liaison au récepteur (RBP). 2. Use of a solution according to claim 1, wherein said bacteriophage protein is a receptor binding protein (RBP).
3. Utilisation d’une solution selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2 dans laquelle ladite protéine de bactériophage est une RBP spécifique de S. aureus. 3. Use of a solution according to any one of claims 1 or 2 wherein said bacteriophage protein is S. aureus specific RBP.
4. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la protéine est une protéine de lait, l’albumine, l’albumine de sérum bovin (BSA), une protéine de sérum, une protéine de sérum de poulet ou un anticorps. 4. Use according to any one of claims 1 to 3, wherein the protein is a milk protein, albumin, bovine serum albumin (BSA), a serum protein, a chicken serum protein or an antibody.
5. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 dans laquelle le cation est choisi parmi un cation monovalent, un cation bivalent, un cation trivalent ou un sel, préférentiellement parmi le groupe comprenant Mg2+, Ca2+, Na+, K+, Fe2+, Fe3+, K+, Zn+, Au3+, Cu+, carbocation, Mn+, Ag+, MgSCk, Na2SC>4, MgCk, CaCk, CaS04, NaCl, K2SO4 et KC1. 5. Use according to any one of claims 1 to 4 in which the cation is chosen from a monovalent cation, a divalent cation, a trivalent cation or a salt, preferably from the group comprising Mg 2 +, Ca 2 +, Na + , K + , Fe 2+ , Fe 3+ , K + , Zn + , Au 3+ , Cu + , carbocation, Mn + , Ag + , MgSCk, Na2SC> 4, MgCk, CaCk, CaS0 4 , NaCl, K2SO4 and KC1.
6. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 dans laquelle la concentration en cation dans la solution est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive, et la concentration en protéine dans la solution est comprise entre 5 Lig/m L et 5 mg/mL de façon inclusive. 6. Use according to any one of claims 1 to 5 wherein the cation concentration in the solution is between 5 mM and 800 mM inclusive, and the protein concentration in the solution is between 5 Lig / m L. and 5 mg / mL inclusive.
7. Utilisation l’une quelconque des revendications 1 à 6 dans laquelle le cation est MgSCk ou NaCl, et la protéine est la BSA. 7. The use of any one of claims 1 to 6 wherein the cation is MgSCk or NaCl, and the protein is BSA.
8. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 2 à 7, dans laquelle la protéine de liaison au récepteur (RBP) est choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, une RBP du bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de celles-ci. 8. Use according to any one of claims 2 to 7, wherein the receptor binding protein (RBP) is selected from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5409, an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5409. Bacteriophage CNCM 1-5410, Bacteriophage CNCM 1-5491 RBP, Bacteriophage CNCM 1-5492 RBP, Bacteriophage CNCM 1-5680 RBP or a mixture thereof.
9. Utilisation selon la revendication 8, dans laquelle la protéine de liaison au récepteur (RBP) est choisie parmi une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP de séquence SEQ ID NO :2, une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP de séquence SEQ ID NO : 4, une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, ou une RBP ayant un pourcentage d’identité d’au moins 95% avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID No. 4, une RBP de séquence SEQ ID NO : 5 ou une RBP de séquence9. Use according to claim 8, in which the receptor binding protein (RBP) is chosen from an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP of sequence SEQ ID NO: 4, an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, or an RBP having a percentage identity of at least 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID No. 4, an RBP of sequence SEQ ID NO: 5 or an RBP of sequence
SEQ ID NO : 6, ou un mélange de celles-ci. SEQ ID NO: 6, or a mixture thereof.
10. Procédé de préparation d'un dispositif comprenant un support solide, ledit procédé comprenant : une étape a) d’immobilisation d’une protéine de bactériophage ou d’une combinaison de protéines de bactériophage sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP, - optionnellement une étape b) d’élimination de la ou des protéines de bactériophage non immobilisées au support solide, et optionnellement une étape c) de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois. 10. A method of preparing a device comprising a solid support, said method comprising: a step a) of immobilizing a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins on the solid support, said immobilization step. consisting in bringing the support into contact with a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins in the presence of a solution comprising a cation and a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP, - optionally a step b) of elimination of the bacteriophage protein (s) not immobilized on the solid support, and optionally a rinsing step c), which can be repeated at least once.
11. Dispositif obtenu selon le procédé de préparation selon la revendication 10, ledit dispositif étant une plaque de microtitration ou une bandelette. 11. Device obtained according to the preparation process according to claim 10, said device being a microtiter plate or a strip.
12. Dispositif de flux latéral comprenant un support solide sur lequel est immobilisé une protéine de liaison au récepteur (RBP). 12. A lateral flow device comprising a solid support on which is immobilized a receptor binding protein (RBP).
13. Utilisation du dispositif selon la revendication 11 ou 12, pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon. 13. Use of the device according to claim 11 or 12, for the detection and / or quantification of one or more bacteria present in a sample.
14. Procédé pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon avec un dispositif de type bandelette ou plaque de microtitration pour un test ELISA, comprenant les étapes suivantes : i) une étape d’immobilisation d’une protéine de bactériophage ou d’une combinaison de protéine de bactériophages sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP, ii) optionnellement une étape d'élimination de la ou des protéines de bactériophage non immobilisées au support solide, iii) optionnellement une étape de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois, iv) détection des bactéries liées aux protéines de bactériophages avec un ligand spécifique de la bactérie choisi parmi un bactériophage spécifique de la bactérie marqué, une protéine de bactériophage spécifique de la bactérie marquée, un bactériophage spécifique de la bactérie couplé à un anticorps marqué, une protéine de bactériophage couplé à un anticorps marqué ou un anticorps marqué ou un aptamère marqué dirigé contre la bactérie dans lequel ladite étape iv) est optionnellement réalisée en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine. 14. Method for the detection and / or quantification of one or more bacteria present in a sample with a device of the microtiter strip or plate type for an ELISA test, comprising the following steps: i) a step of immobilizing a bacteriophage protein or a bacteriophage protein combination on the solid support, said immobilizing step comprising contacting the support with a bacteriophage protein or a bacteriophage protein combination in the presence of a solution comprising a cation and a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP, ii) optionally a step of removing the bacteriophage protein (s) not immobilized to the solid support, iii) optionally a rinsing step, which can be repeated at least once, iv) detection of bacteria bound to bacteriophage proteins with a ligand specific for the bacterium chosen from a bacteriophage labeled bacterium-specific hage, a bacteriophage protein specific for the labeled bacterium, a bacterium-specific bacteriophage coupled to a labeled antibody, a bacteriophage protein coupled to a labeled antibody or a labeled antibody or a labeled aptamer directed against the bacteria wherein said step iv) is optionally carried out in the presence of a solution comprising a cation and a protein.
15. Protéine de liaison au récepteur (RBP) d’un bactériophage spécifique de S. aureus, ladite RBP est choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :2, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, ou une RBP ayant un pourcentage d’identité d’au moins 95% avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO :3 ,15. Receptor binding protein (RBP) of a bacteriophage specific for S. aureus, said RBP is chosen from an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, and an RBP of bacteriophage CNCM 1-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, an RBP of bacteriophage CNCM 1-5491, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 5, an RBP of the bacteriophage CNCM 1-5492, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 6, or an RBP having a percentage identity of at least 95% with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 6. SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
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