FR3110574A1 - CAPTURE OF BACTERIA USING BACTERIOPHAGES OR BACTERIOPHAGE PROTEINS - Google Patents
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Abstract
CAPTURE DE BACTERIES A L’AIDE DE BACTERIOPHAGES OU DE PROTEINES DE BACTERIOPHAGE La présente invention concerne l’utilisation d’une solution comprenant un cation et/ou une protéine, pour la capture et/ou pour la détection et/ou la quantification d’une bactérie par un bactériophage ou protéine de bactériophage, ladite protéine de bactériophage étant préférentiellement une protéine de liaison au récepteur (RBP) et ladite solution comprenant préférentiellement un cation et une protéine. Figure de l’abrégé: Fig. 1CAPTURE OF BACTERIA USING BACTERIOPHAGES OR BACTERIOPHAGE PROTEINS The present invention relates to the use of a solution comprising a cation and / or a protein, for the capture and / or for the detection and / or quantification of a bacterium by a bacteriophage or bacteriophage protein, said bacteriophage protein preferably being a receptor binding protein (RBP) and said solution preferably comprising a cation and a protein. Abstract figure: Fig. 1
Description
DOMAINE DE L’INVENTIONFIELD OF THE INVENTION
La présente invention concerne un dispositif et une méthode de détection rapide de bactéries dans un échantillon.The present invention relates to a device and a method for the rapid detection of bacteria in a sample.
ÉTAT DE LA TECHNIQUESTATE OF THE ART
Les infections bactériennes sont responsables de nombreuses pathologies, notamment dans les élevages et plus particulièrement dans les élevages ovins ou bovins.Bacterial infections are responsible for many pathologies, especially in farms and more particularly in sheep or cattle farms.
Pour cela, il est essentiel de pouvoir détecter la présence de la bactérie responsable de l’infection notamment dans le milieu d’élevage, et plus particulièrement les méthodes de détection rapide afin de traiter et prévenir les infections bactériennes. Cependant, à ce jour, aucune méthode de détection n’est pleinement satisfaisante.For this, it is essential to be able to detect the presence of the bacterium responsible for the infection, particularly in the breeding environment, and more particularly rapid detection methods in order to treat and prevent bacterial infections. However, to date, no detection method is fully satisfactory.
Par exemple, les dispositifs de diagnostic présents sur le marché, notamment, les dispositifs de détection de la mammite sont principalement basés sur le dépistage des cellules somatiques qu’on retrouve dans le lait. Or, cette méthode ne permet pas d’identifier la ou les bactérie(s) responsable(s) de l’infection. D’autre part ces dernières peuvent constituer une trace d’une infection plus ou moins ancienne et donc constituer un indicateur non-spécifique d’une infection en cours. Cela conduit donc les éleveurs à utiliser des antibiothérapies de façon massive et non ciblée.For example, diagnostic devices on the market, in particular mastitis detection devices, are mainly based on the detection of somatic cells found in milk. However, this method does not make it possible to identify the bacterium(ies) responsible for the infection. On the other hand, the latter can constitute a trace of a more or less old infection and therefore constitute a non-specific indicator of an ongoing infection. This therefore leads breeders to use antibiotic therapies on a massive and non-targeted basis.
D’autres méthodes de détection des bactéries peuvent être utilisées telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou la méthode de culture. Toutefois, celles-ci nécessitent d’envoyer les échantillons au laboratoire et donc l’intervention de personnes qualifiées pour mettre en oeuvre la méthode de détection et pour analyser les résultats.Other bacteria detection methods can be used such as the polymerase chain reaction (PCR) or the culture method. However, these require sending the samples to the laboratory and therefore the intervention of qualified people to implement the detection method and to analyze the results.
De plus, l’utilisation de la méthode de culture nécessite un temps d’incubation de 24h à 48h, ce qui représente une attente trop longue des résultats, compte tenu des enjeux du secteur. Concernant l’approche par la biologie moléculaire (PCR et/ou PCR quantitative), bien que plus rapide et plus spécifique, celle-ci est bien plus onéreuse. De plus, la technique de PCR détecte seulement la présence d’ADN des bactéries et non la présence de bactéries viables, ce qui peut entraîner la détection de faux positifs (bactéries mortes et déjà prises en charge par le système immunitaire de l’hôte).In addition, the use of the culture method requires an incubation time of 24 to 48 hours, which represents too long a wait for results, given the challenges of the sector. Regarding the molecular biology approach (PCR and/or quantitative PCR), although faster and more specific, it is much more expensive. In addition, the PCR technique only detects the presence of bacterial DNA and not the presence of viable bacteria, which can lead to the detection of false positives (dead bacteria and already taken care of by the host's immune system) .
Ces méthodes ont donc pour inconvénients d’être longues, fastidieuses, de mettre en œuvre des composés chimiques souvent toxiques pour le manipulateur et pour l’environnement, de nécessiter des matériels couteux, tels que des hottes aspirantes, des gants de protection, des centrifugeuses, etc, et d’être mises en œuvre dans des locaux adaptés, tels que des laboratoires. Elles ne répondent pas ne répondent pas aux besoins des utilisateurs de terrain, notamment des éleveurs.These methods therefore have the disadvantages of being long, tedious, of using chemical compounds that are often toxic for the operator and for the environment, of requiring expensive equipment, such as extractor hoods, protective gloves, centrifuges , etc., and to be implemented in suitable premises, such as laboratories. They do not meet the needs of field users, especially livestock farmers.
A titre d’exemple particulièrement illustratif, il peut être cité le cas du vétérinaire souhaitant identifier rapidement un agent pathogène infectieux directement sur le lieu où se trouve l’animal malade. Cette approche dite « point-of-care testing » (POCT) fait l’objet d’une attention toute particulière auprès des professionnels concernés.As a particularly illustrative example, the case of the veterinarian wishing to quickly identify an infectious pathogenic agent directly at the location of the sick animal can be cited. This so-called “point-of-care testing” (POCT) approach is the subject of particular attention from the professionals concerned.
Il existe donc un besoin de mettre à disposition des moyens permettant une détection de bactéries rapide, peu couteuse, peu nocive pour le manipulateur et pour l’environnement, et ne nécessitant pas la contrainte d’une mise en œuvre dans un laboratoire dédié.There is therefore a need to provide means allowing rapid, inexpensive detection of bacteria, which is not harmful to the operator and to the environment, and does not require the constraint of implementation in a dedicated laboratory.
Il existe également un besoin de mettre à disposition des moyens permettant une détection de bactéries « universelle », quelle que soit la nature de l’échantillon d’origine contenant lesdites bactéries.There is also a need to provide means allowing “universal” detection of bacteria, regardless of the nature of the original sample containing said bacteria.
Une telle méthode de détection de bactéries pourra également être appliquée dans différents domaines comme par exemple dans la sécurité alimentaire, le contrôle des eaux ou en santé humaine.Such a method for detecting bacteria could also be applied in various fields such as, for example, in food safety, water control or in human health.
RÉSUMÉSUMMARY
L’invention concerne donc l’utilisation d’une solution comprenant un cation et/ou une protéine, pour la capture et/ou pour la détection et/ou la quantification d’une bactérie par un bactériophage ou protéine de bactériophage, ladite protéine de bactériophage étant préférentiellement une protéine de liaison au récepteur (RBP) et ladite solution comprenant préférentiellement un cation et une protéine.The invention therefore relates to the use of a solution comprising a cation and/or a protein, for the capture and/or for the detection and/or the quantification of a bacterium by a bacteriophage or bacteriophage protein, said protein of bacteriophage preferably being a receptor binding protein (RBP) and said solution preferably comprising a cation and a protein.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’une solution pour la capture et/ou pour la détection et/ou la quantification d’une bactérie par un bactériophage ou protéine de bactériophage comprenant un cation et/ou une protéine dans laquelle la protéine est une protéine de lait en particulier l’albumine, encore plus particulièrement l’albumine de sérum bovin (BSA), un sérum, plus particulièrement le sérum de poulet ou un anticorps.The invention also relates to the use of a solution for the capture and/or for the detection and/or the quantification of a bacterium by a bacteriophage or bacteriophage protein comprising a cation and/or a protein in which the protein is a milk protein in particular albumin, even more particularly bovine serum albumin (BSA), a serum, more particularly chicken serum or an antibody.
Dans une autre mise en œuvre, la solution telle qu’utilisée comprend un cation choisi parmi des cations contenant un cation bivalent ou dication, notamment le Mg2+ou Ca2+ou encore contenant Na+, K+, Fe2+, Fe3+, K+, Zn+, Au3+, Cu+, Carbocation, Mn+, Ag+, plus particulièrement comprenant les sels MgSO4, Na2SO4, MgCl2, CaCl2, CaSO4, K2SO4ou KCl.In another implementation, the solution as used comprises a cation chosen from cations containing a divalent cation or dication, in particular Mg 2+ or Ca 2+ or even containing Na + , K + , Fe 2+ , Fe 3+ , K + , Zn + , Au 3+ , Cu + , Carbocation, Mn + , Ag + , more particularly comprising the salts MgSO 4 , Na 2 SO 4 , MgCl 2 , CaCl 2 , CaSO 4 , K 2 SO 4 or KCl.
Dans une mise en œuvre particulière, la solution contenant un cation et une protéine est telle que la concentration en cation, en particulier MgSO4, comprise entre 5 mM et 300 mM de façon inclusive et la concentration en protéine, en particulier en BSA, est comprise entre 0,1 mg/mL à 5 mg/mL de façon inclusive.In a particular implementation, the solution containing a cation and a protein is such that the cation concentration, in particular MgSO 4 , is between 5 mM and 300 mM inclusively and the protein concentration, in particular BSA, is between 0.1 mg/mL to 5 mg/mL inclusive.
Dans une autre mise en œuvre particulière la solution contenant un cation et une protéine est utilisée pour la fixation entreStaphylococcus aureusun bactériophage est spécifique deStaphylococcus aureus.In another particular implementation, the solution containing a cation and a protein is used for the fixing between Staphylococcus aureus a bacteriophage is specific for Staphylococcus aureus .
Dans une mise en œuvre particulière ledit bactériophage est choisi parmi les bactériophages spécifiques deS. aureustels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492, ou est un mélange de ces bactériophagesIn a particular implementation, said bacteriophage is chosen from bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 and CNCM I- 5492, or is a mixture of these bacteriophages
Dans une autre mise en œuvre, la protéine de bactériophage est une protéine de liaison au récepteur (RBP), en particulier spécifique deStaphylococcus aureus, plus préférentiellement choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM I-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM I-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :2, une RBP du bactériophage CNCM I-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, ou un mélange de celles-ci.In another implementation, the bacteriophage protein is a receptor-binding protein (RBP), in particular specific to Staphylococcus aureus , more preferably chosen from an RBP of bacteriophage CNCM I-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO:1, an RBP from bacteriophage CNCM I-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO:2, an RBP from bacteriophage CNCM I-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, or a mixture of these.
Un autre aspect de l’invention concerne un procédé de préparation d'un dispositif comprenant un support solide, ledit dispositif étant préférentiellement une plaque de microtitration ou une bandelette, ledit procédé comprenant :Another aspect of the invention relates to a process for preparing a device comprising a solid support, said device preferably being a microtiter plate or a strip, said process comprising:
une étape a) de couplage d’un bactériophage ou d’une combinaison de bactériophages ou d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages sur le support solide, ladite étape de couplage consistant à mettre en contact le support avec un bactériophage ou une combinaison de bactériophages et/ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et/ou une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP, le procédé comprend optionnellement une étape b) d'élimination du ou des bactériophages et / ou de la ou des protéines de bactériophages non liés au support solide, et optionnellement une étape c) de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois.a step a) of coupling a bacteriophage or of a combination of bacteriophages or of a protein of bacteriophages or of a combination of proteins of bacteriophages on the solid support, the said coupling step consisting in bringing the support into contact with a bacteriophage or a combination of bacteriophages and/or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins in the presence of a solution comprising a cation and/or a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP, the method optionally comprising a step b) of eliminating the bacteriophage(s) and/or the bacteriophage protein(s) not bound to the solid support, and optionally a step c) of rinsing, which can be repeated at least once.
Dans une mise en œuvre particulière, le dispositif obtenu selon le procédé de préparation de l’invention est préférentiellement une plaque de microtitration ou une bandelette et le support étant préférentiellement constitué de polystyrène, polypropylène, polycarbonate, cellulose acétate, cellulose, verre, et/ou silicium.In a particular implementation, the device obtained according to the preparation process of the invention is preferably a microtiter plate or a strip and the support being preferably made of polystyrene, polypropylene, polycarbonate, cellulose acetate, cellulose, glass, and/ or silicon.
Dans un autre aspect, l’invention concerne un dispositif choisi parmi une plaque de microtitration ou une bandelette comprend un support solide sur lequel est fixé au moins une protéine de liaison au récepteur (RBP), le support étant préférentiellement constitué de polystyrène, polypropylène, polycarbonate, cellulose acétate, cellulose, verre, et/ou silicium, le support est notamment précoaté avec au moins une protéine.In another aspect, the invention relates to a device chosen from a microtitration plate or a strip comprising a solid support on which is fixed at least one receptor-binding protein (RBP), the support being preferably made of polystyrene, polypropylene, polycarbonate, cellulose acetate, cellulose, glass, and/or silicon, the support is in particular precoated with at least one protein.
Dans un autre aspect, l’invention a pour objet l’utilisation du dispositif selon l’invention pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon.In another aspect, the subject of the invention is the use of the device according to the invention for the detection and/or the quantification of one or more bacteria present in a sample.
Dans un autre aspect, l’invention concerne un procédé pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon avec un dispositif de type bandelette ou ELISA, comprenant les étapes suivantesIn another aspect, the invention relates to a method for the detection and/or quantification of one or more bacteria present in a sample with a device of the strip or ELISA type, comprising the following steps
- mise en contact de l’échantillon susceptible de contenir des bactéries avec un dispositif selon l’invention,bringing the sample likely to contain bacteria into contact with a device according to the invention,
- optionnellement élimination des bactéries non liées aux bactériophages et / ou aux protéines de bactériophages,optionally elimination of bacteria not related to bacteriophages and / or bacteriophage proteins,
- détection des bactéries liées aux bactériophages et / ou aux protéines de bactériophages avec un ligand spécifique de la bactérie.detection of bacteria bound to bacteriophages and/or bacteriophage proteins with a bacterium-specific ligand.
Dans une mise en œuvre particulière, le procédé pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon dans lequel, ligand spécifique de la bactérie de l’étape c) comprend un bactériophage spécifique de la bactérie marqué, une protéine de bactériophage spécifique de la bactérie marquée, un bactériophage spécifique de la bactérie couplé à un anticorps marqué ou une protéine de bactériophage couplé à un anticorps marqué, et dans lequel ladite étape c) est réalisée en présence d’une solution comprenant un cation et/ou une protéine, de préférence un cation et une protéine ou le ligand spécifique de la bactérie est un anticorps marqué ou un aptamer marqué dirigé contre la bactérie.In a particular implementation, the method for the detection and/or the quantification of one or more bacteria present in a sample in which the ligand specific for the bacterium of step c) comprises a bacteriophage specific for the labeled bacterium, a bacteriophage protein specific for the labeled bacterium, a bacteriophage specific for the bacterium coupled to a labeled antibody or a bacteriophage protein coupled to a labeled antibody, and in which the said step c) is carried out in the presence of a solution comprising a cation and/or a protein, preferably a cation and a protein, or the bacterium-specific ligand is a labeled antibody or a labeled aptamer directed against the bacterium.
Dans un aspect particulier, l’invention a pour objet un procédé pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon avec un dispositif d’immunodétection de type bandelette ou ELISA, comprenant les étapes suivantes :In a particular aspect, the subject of the invention is a method for the detection and/or quantification of one or more bacteria present in a sample with an immunodetection device of the strip or ELISA type, comprising the following steps :
- mise en contact de l’échantillon susceptible de contenir des bactéries avec un dispositif d’immuno détection, sur lequel est fixé un ligand spécifique de la bactérie, de préférence un anticorps spécifique de la bactérie ou un aptamère spécifique de la bactérie,bringing the sample likely to contain bacteria into contact with an immunodetection device, on which is fixed a ligand specific for the bacteria, preferably an antibody specific for the bacteria or an aptamer specific for the bacteria,
- optionnellement élimination des bactéries non liées au ligand spécifique de la bactérie,optionally elimination of bacteria not bound to the specific ligand of the bacterium,
- détection des bactéries liées au ligand spécifique de la bactérie à l’aide d’une solution comprenant un bactériophage marqué spécifique de la bactérie, une protéine de bactériophage marquée spécifique de la bactérie, un bactériophage spécifique de la bactérie couplé à un anticorps marqué ou une protéine de bactériophage couplé à un anticorps marqué, et un cation et/ou une protéine, de préférence un cation et une protéinedetection of bacteria bound to the bacterium-specific ligand using a solution comprising a labeled bacteriophage specific to the bacterium, a labeled bacteriophage protein specific to the bacterium, a bacteriophage specific to the bacterium coupled to a labeled antibody or a bacteriophage protein coupled to a labeled antibody, and a cation and/or a protein, preferably a cation and a protein
L’invention concerne également une protéine de liaison au récepteur (RBP) d’un bactériophage spécifique deS. aureus, ladite RBP étant choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM I-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM I-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :2, et une RBP du bactériophage CNCM I-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3.The invention also relates to a receptor-binding protein (RBP) of a bacteriophage specific for S. aureus , said RBP being chosen from an RBP of bacteriophage CNCM I-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP from bacteriophage CNCM I-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, and an RBP from bacteriophage CNCM I-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3.
DÉFINITIONSDEFINITIONS
Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :In the present invention, the terms below are defined as follows:
Un“ bactériophage spécifique d’une bactérie” est un bactériophage capable de se lier spécifiquement à cette bactérie. Cette spécificité peut être déterminée par la méthode des spots décrite dans la présente demande. Il s’agit en particulier d’un bactériophage spécifique deS. aureus, plus particulièrement, d’un bactériophage choisi parmi les bactériophages spécifiques deS. aureustels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492. En particulier, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de bactériophages spécifiques de S. aureus choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410 CNCM I-5491 et CNCM I-5492.A “bacteriophage specific for a bacterium” is a bacteriophage capable of binding specifically to this bacterium. This specificity can be determined by the spot method described in the present application. It is in particular a bacteriophage specific for S. aureus , more particularly, a bacteriophage chosen from the bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409 , CNCM I-5410, CNCM I-5491 and CNCM I-5492. In particular, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of bacteriophages specific for S. aureus chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410 CNCM I-5491 and CNCM I-5492.
“Bactériophage” et “phage” sont utilisés indifféremment et désignent la même entité.“Bacteriophage” and “phage” are used interchangeably and refer to the same entity.
“Protéine d’un bactériophage”, spécifique d’une bactérie est une protéine capable de se lier spécifiquement à cette bactérie.Bacteriophage protein specific to a bacterium is a protein capable of binding specifically to this bacterium.
“X conjugué à Y” et “Y conjugué à X” sont utilisés indifféremment.“X conjugate to Y” and “Y conjugate to X” are used interchangeably.
“Cation bivalent” et “dication” sont utilisés indifféremment.“Bivalent cation” and “dication” are used interchangeably.
“Solution contenant des phages ” et “suspension contenant des phages ” sont utilisés indifféremment.“Phage-containing solution” and “phage-containing suspension” are used interchangeably.
Un “ligand spécifique d’une bactérie” est un ligand capable de se lier spécifiquement à la bactérie. Cette spécificité peut être déterminée par la méthode des billes magnétiques par exemple.A “bacterium-specific ligand” is a ligand capable of binding specifically to bacteria. This specificity can be determined by the method of magnetic beads for example.
Un “marqueur conjugué” peut être une molécule colloïdale par exemple : une nanoparticule d’or (AuNP) ou or colloïdale, une nanoparticule de carbone ou carbone colloïdal, une bille de latex colorée, une particule magnétique, ou une molécule fluorescente, une molécule luminescente ou une enzyme telles que la peroxydase de raifort qui catalyse la conversion de substrats chromogènes en composés colorés, ou qui produit de la lumière à partir de substrats chimioluminescents.A “conjugated label” can be a colloidal molecule, for example: a gold nanoparticle (AuNP) or colloidal gold, a carbon nanoparticle or colloidal carbon, a colored latex ball, a magnetic particle, or a fluorescent molecule, a molecule luminescent agent or an enzyme such as horseradish peroxidase which catalyzes the conversion of chromogenic substrates into colored compounds, or which produces light from chemiluminescent substrates.
Un élément “ marqué” est élément (protéine, bactérie, molécule) conjugué à une molécule pouvant être détectée visuellement. Le marqueur est utilisé pour marquer une bactérie.A “marked” element is an element (protein, bacterium, molecule) conjugated to a molecule that can be detected visually. The marker is used to label a bacterium.
Un “surfactant” est une molécule amphiphile permettant d’abaisser la tension superficielle d’une solution aqueuse. A titre d’exemple le surfactant est le Tween 20.A “surfactant” is an amphiphilic molecule that lowers the surface tension of an aqueous solution. For example, the surfactant is Tween 20.
Une “ bandelette” désigne un dispositif de détection chromatographie de flux latéral également connus sous le nom d’immunochromatographie à flux latéral est une méthode reposant sur le mouvement d’un échantillon liquide par capillarité à travers une bandelette. Elle a précédemment été décrite pour la détection immunologique d’un analyte d’intérêt dans un échantillon liquide, grâce à un anticorps primaire et un anticorps secondaire (EP1086372B1). Ce sont de simples dispositifs à base de papier destinés à détecter la présence (ou l'absence) d'un analyte cible dans un échantillon liquide (matrice).A “strip” refers to a detection device Lateral flow chromatography also known as lateral flow immunochromatography is a method that relies on the movement of a liquid sample by capillary action through a strip. It has previously been described for the immunological detection of an analyte of interest in a liquid sample, using a primary antibody and a secondary antibody (EP1086372B1). They are simple paper-based devices intended to detect the presence (or absence) of a target analyte in a liquid sample (matrix).
Une “plaque de microtritration” désigne un dispositif comprenant un ensemble de puits, il s’agit d’un outil standard dans la recherche et l'analyse clinique des tests de diagnostic des laboratoires. Leur utilisation est très fréquente dans l'Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).A "microtritration plate" refers to a device comprising a set of wells, it is a standard tool in research and clinical analysis of laboratory diagnostic tests. Their use is very frequent in the Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
DESCRIPTION DÉTAILLÉEDETAILED DESCRIPTION
La présente invention concerne l’utilisation d’une solution comprenant un cation et/ou une protéine, pour la capture et/ou pour la détection et/ou la quantification d’une bactérie par un bactériophage ou protéine de bactériophage, ladite protéine de bactériophage étant préférentiellement une protéine de liaison au récepteur (RBP) et ladite solution comprenant préférentiellement un cation et une protéine.The present invention relates to the use of a solution comprising a cation and/or a protein, for the capture and/or for the detection and/or the quantification of a bacterium by a bacteriophage or bacteriophage protein, said bacteriophage protein preferably being a receptor binding protein (RBP) and said solution preferably comprising a cation and a protein.
Dans le cadre de la présente invention, les bactériophages ou les protéines de bactériophages sont en solution, ladite solution comprenant un cation et/ou une protéine, de préférence un cation et une protéine.In the context of the present invention, the bacteriophages or the bacteriophage proteins are in solution, said solution comprising a cation and/or a protein, preferably a cation and a protein.
L’utilisation d’une telle solution comprenant un cation et/ou une protéine, de préférence un cation et une protéine. L’utilisation de la solution permet d’augmenter la capture d’une bactérie par le phage ou la protéine de phage.The use of such a solution comprising a cation and/or a protein, preferably a cation and a protein. The use of the solution makes it possible to increase the capture of a bacterium by the phage or the phage protein.
La solution peut être utilisée pour la procédure de capture, détection et/ou quantification d’une bactérie par des bactériophages ou par protéine de bactériophage.The solution can be used for the procedure of capture, detection and/or quantification of a bacterium by bacteriophages or by bacteriophage protein.
La protéine de cette solution est notamment choisie parmi les protéines de lait en particulier l’albumine, encore plus particulièrement l’albumine de sérum bovin (BSA), ou une protéine de sérum, plus particulièrement de sérum de poulet ou encore un anticorps.The protein of this solution is chosen in particular from milk proteins, in particular albumin, even more particularly bovine serum albumin (BSA), or a serum protein, more particularly chicken serum, or else an antibody.
Dans un mode de réalisation particulier, le cation est choisi parmi un cation bivalent, notamment le Mg2+ou Ca2+ou encore contenant Na+, K+, Fe2+, Fe3+K+, Zn+,Au3+, ou encore Cu+,carbocation, Mn+, Ag+, plus particulièrement comprenant les sels MgSO4, Na2SO4, MgCl2, CaCl2, CaSO4, K2SO4ou KCl.In a particular embodiment, the cation is chosen from a divalent cation, in particular Mg 2+ or Ca 2+ or else containing Na + , K + , Fe 2+ , Fe 3+ K + , Zn +, Au 3+ , or also Cu +, carbocation, Mn + , Ag + , more particularly comprising the MgSO 4 , Na 2 SO 4 , MgCl 2 , CaCl 2 , CaSO 4 , K 2 SO 4 or KCl salts.
Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en cation dans la solution est comprise entre 5 mM et 300 mM de façon inclusive. Dans un mode de réalisation plus particulier, la solution comprend de MgSO4dont la concentration est comprise entre 5 mM et 300 mM de façon inclusive.In a particular embodiment, the cation concentration in the solution is between 5 mM and 300 mM inclusive. In a more particular embodiment, the solution comprises MgSO 4 whose concentration is between 5 mM and 300 mM inclusively.
Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en protéine dans la solution est comprise entre 0,1 mg/mL à 5 mg/mL de façon inclusive. Dans un mode de réalisation plus particulier encore la protéine est la BSA et sa concentration est comprise entre 0,1 mg/mL à 5 mg/mL.In a particular embodiment, the protein concentration in the solution is between 0.1 mg/mL to 5 mg/mL inclusive. In an even more particular embodiment, the protein is BSA and its concentration is between 0.1 mg/mL to 5 mg/mL.
Dans un mode de réalisation, la solution comprend de la BSA à la concentration de 0,1 mg/mL à 5 mg/mL et du MgSO4à la concentration de 5 mM et 300 mM de façon inclusive.In one embodiment, the solution comprises BSA at a concentration of 0.1 mg/mL to 5 mg/mL and MgSO 4 at a concentration of 5 mM and 300 mM inclusively.
Dans un mode de réalisation particulier, la solution comprend de la BSA à la concentration de 2 mg/mL et du MgSO4à la concentration de 50 mM.In a particular embodiment, the solution comprises BSA at a concentration of 2 mg/mL and MgSO 4 at a concentration of 50 mM.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend en outre un agent stabilisant, comme le glycérol et/ou un sucre par exemple sorbitol et/ou sucrose.In a particular embodiment, said composition also comprises a stabilizing agent, such as glycerol and/or a sugar, for example sorbitol and/or sucrose.
Dans le cadre de la présente invention, tout type de bactériophage spécifique d’une bactérie peut être utilisé. Il s’agit en particulier d’un bactériophage spécifique de S. aureus, plus particulièrement, d’un bactériophage choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492. En particulier, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de bactériophages spécifiques de S. aureus choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410 CNCM I-5491 et CNCM I-5492In the context of the present invention, any type of bacteriophage specific for a bacterium can be used. It is in particular a bacteriophage specific for S. aureus, more particularly, a bacteriophage chosen from bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409 , CNCM I-5410, CNCM I-5491 and CNCM I-5492. In particular, the bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of bacteriophages specific for S. aureus chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410 CNCM I-5491 and CNCM I-5492
Dans le cadre de la présente invention, tout type de protéine de bactériophage spécifique d’une bactérie peut être utilisé Il s’agit en particulier d’une protéine de liaison au récepteur des phages (Receptor Binding Protein ou RBP ; RBP). Il s’agit en particulier d’une protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus, ledit bactériophage spécifique de S. aureus étant en particulier choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM-I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492. Plus particulier, il s’agit d’une RBP du bactériophage CNCM I-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM-I-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM I-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3. En particulier, ladite protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de RBPs de bactériophages spécifiques deS. aureus, lesdits bactériophages spécifiques de S. aureus étant choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410 CNCM I-5491 et CNCM I-5492. Par exemple, il s’agit d’un mélange d’une RBP du bactériophage CNCM I-5408 et d’une RBP du bactériophage CNCM I-5409, d’une RBP du bactériophage CNCM I-5408 et d’une RBP du bactériophage CNCM I-5410, d’une RBP du bactériophage CNCM- I-5409 et d’une RBP du bactériophage CNCM I-5410 ou d’une RBP du bactériophage CNCM I-5408, d’une RBP du bactériophage CNCM I-5409 et d’une RBP du bactériophage CNCM I-5410. Plus particulièrement, il s’agit d’un mélange d’une RBP de séquence SEQ ID NO : 1 et d’une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, d’une RBP de séquence SEQ ID NO : 1 et d’une RBP de séquence SEQ ID NO :3, d’une RBP de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, ou d’une RBP de séquence SEQ ID NO : 1, d’une RBP de séquence SEQ ID NO : 1 et d’une RBP de séquence SEQ ID NO : 3.In the context of the present invention, any type of bacteriophage protein specific to a bacterium can be used. This is in particular a phage receptor binding protein (Receptor Binding Protein or RBP; RBP). It is in particular a protein of a bacteriophage specific for S. aureus, said bacteriophage specific for S. aureus being in particular chosen from bacteriophages specific for S. aureus as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I -5408, CNCM I-5409, CNCM-I-5410, CNCM I-5491 and CNCM I-5492. More particularly, it is an RBP of bacteriophage CNCM I-5408, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, an RBP of bacteriophage CNCM-I-5409, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of bacteriophage CNCM I-5410, in particular an RBP of sequence SEQ ID NO: 3. In particular, said protein of a bacteriophage specific for S. aureus is a mixture of RBPs of bacteriophages specific for S. aureus , said bacteriophages specific for S. aureus being chosen from the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410 CNCM I-5491 and CNCM I-5492. For example, it is a mixture of an RBP of bacteriophage CNCM I-5408 and an RBP of bacteriophage CNCM I-5409, an RBP of bacteriophage CNCM I-5408 and an RBP of bacteriophage CNCM I-5410, an RBP of bacteriophage CNCM-I-5409 and an RBP of bacteriophage CNCM I-5410 or an RBP of bacteriophage CNCM I-5408, an RBP of bacteriophage CNCM I-5409 and of an RBP of bacteriophage CNCM I-5410. More particularly, it is a mixture of an RBP of sequence SEQ ID NO: 1 and an RBP of sequence SEQ ID NO: 2, an RBP of sequence SEQ ID NO: 1 and an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, of an RBP of sequence SEQ ID NO: 2 and of an RBP of sequence SEQ ID NO: 3, or of an RBP of sequence SEQ ID NO: 1, of an RBP of sequence SEQ ID NO: 1 and an RBP of sequence SEQ ID NO: 3.
Dans le cadre de la présente invention, l’utilisation de la solution comprenant un cation et/ou une protéine est mise en œuvre en présence d’un support. Notamment, dans le cadre de la procédure de détection selon l'invention, les bactériophages ou protéines bactériophages sont immobilisées sur des supports, par exemple des plaques de microtitration, des bandelettes d'essai, des lames, des plaquettes, des matériaux filtrants ou des chambres cellulaires à flux continu. Les structures de support peuvent par exemple comprendre du polystyrène, du polypropylène, du polycarbonate, du PMMA, de l'acétate de cellulose, de la nitrocellulose, du verre ou une plaquette de silicium.In the context of the present invention, the use of the solution comprising a cation and/or a protein is implemented in the presence of a support. In particular, in the context of the detection procedure according to the invention, the bacteriophages or bacteriophage proteins are immobilized on supports, for example microtiter plates, test strips, slides, platelets, filter materials or continuous flow cell chambers. The support structures can for example comprise polystyrene, polypropylene, polycarbonate, PMMA, cellulose acetate, nitrocellulose, glass or a silicon wafer.
Dans le cadre de la mise en œuvre sur un support de type bandelette, le support est un dispositif à base de papier.In the context of implementation on a tape-type medium, the medium is a paper-based device.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un dispositif comprenant un support solide, ledit dispositif étant préférentiellement une plaque de microtitration ou une bandelette, ledit procédé comprend une étape a) de couplage d’un bactériophage ou d’une combinaison de bactériophages ou d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages sur le support solide, ladite étape de couplage consistant à mettre en contact le support avec un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et/ou une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP, optionnellement une étape b) d'élimination du ou des bactériophages ou de la ou des protéines de bactériophages non couplés/liés au support solide, et optionnellement une étape c) de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois.The subject of the present invention is a method for preparing a device comprising a solid support, said device preferably being a microtiter plate or a strip, said method comprises a step a) of coupling a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins on the solid support, said coupling step comprising contacting the support with a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins in the presence of a solution comprising a cation and/or a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP, optionally a step b) of eliminating the bacteriophage(s) or the uncoupled bacteriophage protein(s)/ bound to the solid support, and optionally a step c) of rinsing, which can be repeated at least once.
Dans une mise en œuvre particulière, l’invention a pour objet un procédé de préparation d’une bandelette comprenant une étape a) de couplage d’un bactériophage ou d’une combinaison de bactériophages ou d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages sur ladite bandelette comprenant un support solide, ladite étape de couplage consistant à mettre en contact le support avec un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP, optionnellement une étape b) d'élimination du ou des bactériophages ou de la ou des protéines de bactériophages non couplés/liés au support solide, et optionnellement une étape c) de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois.In a particular implementation, the subject of the invention is a method for preparing a strip comprising a step a) of coupling a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins on said strip comprising a solid support, said coupling step comprising contacting the support with a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a protein of bacteriophages or a combination of bacteriophage proteins in the presence of a solution comprising a cation and a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP, optionally a step b) of eliminating the bacteriophage(s) or the bacteriophage protein(s) not coupled/bound to the solid support, and optionally a step c) rinsing, which can be repeated at least once.
Un des objets de la présente invention est une bandelette obtenue par le procédé décrit ci-dessus, ainsi ladite bandelette comprend un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages fixés à sa surface de ladite bandelette et plus particulièrement à la surface du conjugate pad ou de la une zone de détection de la bactérie d’intérêt de la membrane de nitrocellulose située après le conjugate pad. Ces mises en œuvre sont plus particulièrement décrites dans les exemples ci-après.One of the objects of the present invention is a strip obtained by the method described above, thus said strip comprises a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a protein of bacteriophages or a combination of proteins of bacteriophages attached to its surface of said strip and more particularly on the surface of the conjugate pad or of the area for detecting the bacterium of interest of the nitrocellulose membrane located after the conjugate pad. These implementations are more particularly described in the examples below.
Un autre objet de l’invention est une plaque de microtitration obtenue par le procédé décrit ci-dessus mettant en œuvre une solution comprenant un cation ou une protéine, ainsi ladite plaque de microtitration comprend un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages fixés à sa surface (i.e., surface du support solide). Dans une mise en œuvre particulière, la plaque de microtitration est obtenue par le procédé décrit ci-dessus mettant en œuvre une solution comprenant un cation et une protéine, ainsi ladite plaque de microtitration comprend un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages fixés à sa surface (i.e., surface du support solide).Another object of the invention is a microtiter plate obtained by the method described above using a solution comprising a cation or a protein, thus said microtiter plate comprises a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins attached to its surface ( ie , surface of the solid support). In a particular implementation, the microtiter plate is obtained by the method described above using a solution comprising a cation and a protein, thus said microtiter plate comprises a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a bacteriophage protein or a combination of bacteriophage proteins attached to its surface ( ie , surface of the solid support).
Dans une autre mise en œuvre selon l’invention, le dispositif obtenu selon le procédé de préparation est une plaque de microtitration ou une bandelette et le support étant préférentiellement constitué de polystyrène, polypropylène, polycarbonate, cellulose acétate, cellulose, verre, et/ou silicium.In another implementation according to the invention, the device obtained according to the preparation process is a microtiter plate or a strip and the support being preferably made of polystyrene, polypropylene, polycarbonate, cellulose acetate, cellulose, glass, and/or silicon.
Dans une mise en œuvre particulière de l’invention, le dispositif selon l’invention est une plaque de microtitration ou une bandelette qui comprend un support solide sur lequel est fixé une protéine de liaison au récepteur (RBP), le support étant préférentiellement constitué de polystyrène, polypropylène, polycarbonate, cellulose acétate, cellulose, verre, et/ou silicium, le support est notamment précoaté avec une protéine.In a particular implementation of the invention, the device according to the invention is a microtiter plate or a strip which comprises a solid support on which is fixed a receptor-binding protein (RBP), the support preferably consisting of polystyrene, polypropylene, polycarbonate, cellulose acetate, cellulose, glass, and/or silicon, the support is in particular precoated with a protein.
L'immobilisation, capture ou liaison du bactériophage ou de la protéine de bactériophage est un des aspects de l’invention. Ce qui est important à cet égard, c'est l'immobilisation fonctionnelle, c'est-à-dire que les bactériophages ou protéines de bactériophages, anticorps ou aptamères aient des structures accessibles aux bactéries, malgré la liaison au matériau de support.The immobilization, capture or binding of bacteriophage or bacteriophage protein is one aspect of the invention. What is important in this regard is the functional immobilization, i.e. that the bacteriophages or bacteriophage proteins, antibodies or aptamers have structures accessible to bacteria, despite binding to the support material.
Pour supprimer une réaction non spécifique des bactéries à étudier avec le matériau du support, il est possible de mettre en œuvre notamment préalablement au couplage ou postérieurement au couplage sur un support solide, un blocage avec une protéine, notamment de la sérum-albumine bovine ou du Tween 20 ou des substances similaires connues, comme par exemple du lait en poudre ou encore un anticorps non spécifique de la bactérie.To eliminate a non-specific reaction of the bacteria to be studied with the material of the support, it is possible to implement in particular prior to the coupling or after the coupling on a solid support, a blocking with a protein, in particular bovine serum albumin or Tween 20 or known similar substances, such as powdered milk or an antibody that is not specific to the bacteria.
L'immobilisation peut être obtenue sur un support nu ou sur un support précoaté avec une protéine et notamment l’albumine ou un anticorps.Immobilization can be obtained on a bare support or on a support precoated with a protein and in particular albumin or an antibody.
Ces supports peuvent être produits, préalablement à leur utilisation et être stockés en vue de leur utilisation.These media can be produced prior to their use and be stored for their use.
À cette fin, une solution comprenant un cation et/ou une protéine et des bactériophages ou protéines bactériophage en particulier des protéines RBP est appliquée sur le support. Après adsorption, par exemple à 4-20°C pendant la nuit ou à 30-65°C pendant 2-4 h, la solution est éliminée et la structure de support est séchée.To this end, a solution comprising a cation and/or a protein and bacteriophages or bacteriophage proteins, in particular RBP proteins, is applied to the support. After adsorption, for example at 4-20°C overnight or at 30-65°C for 2-4 hours, the solution is removed and the support structure is dried.
Selon un aspect particulier, l’invention porte sur une bandelette de chromatographie pour détecter une bactérie d’intérêt dans un échantillon.According to a particular aspect, the invention relates to a chromatography strip for detecting a bacterium of interest in a sample.
La particularité de la bandelette de détection de l’invention est le blocage de la migration des bactéries sur le support.The particularity of the detection strip of the invention is the blocking of the migration of bacteria on the support.
Les modes de réalisation de bandelette sont décrits dans les Figures 1 à 6.Sling embodiments are depicted in Figures 1 through 6.
Les modes de réalisation de bandelette décrits ci-après sont décrits avant utilisation de ladite bandelette, c’est-à-dire avant mise en contact avec l’échantillon à analyser.The strip embodiments described below are described before use of said strip, that is to say before contacting with the sample to be analyzed.
Ainsi, la présente invention concerne notamment une bandelette pour détecter une bactérie d’intérêt, en particulierS. aureus, dans un échantillon, comprenant au moins une partie qui comprend au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt et/ou au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt.Thus, the present invention relates in particular to a strip for detecting a bacterium of interest, in particular S. aureus , in a sample, comprising at least one part which comprises at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest and/or at least a protein from a bacteriophage specific for the bacterium of interest.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite bandelette de chromatographie à flux latéral comprend dans l’ordre au moins :In a particular embodiment, said lateral flow chromatography strip comprises in order at least:
- une partie de contact (sample pad) comprenant une zone de contact avec l’échantillon ;a contact part (sample pad) comprising a contact zone with the sample;
- une partie de détection comprenant une zone de détection de la bactérie d’intérêt qui comprend au moins un bactériophage spécifique de ladite bactérie d’intérêt et/ou au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de ladite bactérie d’intérêt,a detection part comprising a zone for detecting the bacterium of interest which comprises at least one bacteriophage specific for said bacterium of interest and/or at least one protein of at least one bacteriophage specific for said bacterium of interest,
- une partie absorbante.an absorbent part.
La partie de contact (sample pad) comprend une zone de contact destinée à être mise en contact avec l’échantillon. Sa fonction est de répartir uniformément l'échantillon pour que la migration de l’échantillon par capillarité vers les parties suivantes soit lisse, continue et homogène. La partie de contact et la zone de contact sont une matrice capillaire. Par exemple, la partie de contact et la zone de contact sont en cellulose ou de fibres de verre.The contact part (sample pad) comprises a contact zone intended to be brought into contact with the sample. Its function is to evenly distribute the sample so that the migration of the sample by capillarity to the following parts is smooth, continuous and homogeneous. The contact part and the contact zone are a capillary matrix. For example, the contact part and the contact area are made of cellulose or fiberglass.
La partie de marquage (conjugate ou conjuguée pad) comprend une zone de marquage où les bactéries sont marquées avec un marqueur lorsque le flux d’échantillon à analyser la traverse. Leur rôle est de maintenir le marqueur jusqu’à utilisation de la bandelette et de libérer le marqueur lorsqu’il y a reconnaissance entre le marqueur et une bactérie, au passage du flux d’échantillon. Par exemple la partie de marquage et la zone de marquage sont en fibres de verre, cellulose ou polyestersThe labeling part (conjugate or conjugate pad) includes a labeling area where the bacteria are labeled with a marker when the flow of sample to be analyzed passes through it. Their role is to maintain the marker until the strip is used and to release the marker when there is recognition between the marker and a bacterium, when the sample flow passes. For example the marking part and the marking area are made of fiberglass, cellulose or polyester
La partie de détection (detection pad) comprend une zone de détection où la bactérie d’intérêt, si elle est présente dans l’échantillon analysé, est captée sur la bandelette grâce à un ligand spécifique de celle-ci qui y est immobilisé. Le rôle de la partie de détection est donc de fournir un bon support et une bonne liaison pour l’immobilisation des ligands spécifiques, tout en limitant les adsorptions non spécifiques. Par exemple, la partie de détection et la zone de détection sont une membrane de nitrocellulose.The detection part (detection pad) includes a detection zone where the bacterium of interest, if it is present in the sample analyzed, is captured on the strip thanks to a ligand specific for it which is immobilized there. The role of the detection part is therefore to provide a good support and a good bond for the immobilization of specific ligands, while limiting non-specific adsorptions. For example, the detection part and the detection zone are a nitrocellulose membrane.
Au sens de la présente demande un ligand spécifique d’une bactérie est choisi parmi un anticorps dirigé contre la bactérie, un bactériophage spécifique de la bactérie, une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie, un bactériophage spécifique de la bactérie couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie, une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie En particulier, il s’agit d’un ligand spécifique deS. aureuset est donc choisi parmi un anticorps dirigé contreS. aureus(ou anti-S . aureus), un bactériophage spécifique deS. aureus, une protéine d’un bactériophage spécifique deS. aureus, un bactériophage spécifique deS. aureuscouplé à un anticorps anti-S . aureus, une protéine d’un bactériophage spécifique deS. aureuscouplée à un anticorps anti-S . aureus.Within the meaning of the present application, a ligand specific for a bacterium is chosen from an antibody directed against the bacterium, a bacteriophage specific for the bacterium, a protein of a bacteriophage specific for the bacterium, a bacteriophage specific for the bacterium coupled to a antibody directed against the bacterium, a bacteriophage protein specific for the bacterium coupled to an antibody directed against the bacterium In particular, it is a specific ligand for S. aureus and is therefore selected from an antibody directed against S . aureus (or anti- S . aureus ), a bacteriophage specific for S. aureus , a protein of a bacteriophage specific for S. aureus , a bacteriophage specific for S. aureus coupled with an anti- S . aureus , a bacteriophage protein specific for S. aureus coupled to an anti- S . aureus .
La partie absorbante (absorbent pad) a un rôle d’absorption. Elle contribue ainsi à maintenir le débit du flux au travers de la bandelette et permet de récupérer les excédents d’échantillon et de réactifs, évitant ainsi le reflux d’échantillon. Par exemple, la partie absorbante est en coton.The absorbent part (absorbent pad) has an absorption role. It thus helps to maintain the flow rate through the strip and allows the recovery of excess sample and reagents, thus avoiding sample reflux. For example, the absorbent part is made of cotton.
Au sens de la présente demande « dans l’ordre » signifie l’ordre dans lequel les différentes parties qui composent la bandelette vont être traversées par le flux contenant l’échantillon, mais ce terme ne signifie pas que ces parties sont forcément contiguës.Within the meaning of the present application "in order" means the order in which the different parts which make up the strip will be crossed by the flow containing the sample, but this term does not mean that these parts are necessarily contiguous.
Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de contact est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une première zone de superposition, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en amont de celle-ci pour former une deuxième zone de superposition et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une troisième zone de superposition, et l’une des extrémités de la partie absorbante est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une quatrième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième et la troisième zone de superposition sont distinctes les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la deuxième et de la troisième zone de superposition.In a particular embodiment, one of the ends of the contact part is superimposed with one of the ends of the part downstream of the latter to form a first zone of superposition, one of the ends of the part of detection is superimposed with one of the ends of the part upstream of the latter to form a second overlapping zone and the other end of the detection part is superimposed with one of the ends of the part downstream of the latter to form a third superposition zone, and one of the ends of the absorbent part is superposed with one of the ends of the part downstream thereof to form a fourth superposition zone. In particular, the first, the second and the third overlap zone are distinct from each other. In particular, the contact zone is distinct from the first overlapping zone. In particular, the detection zone is distinct from the second and from the third superposition zone.
Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie de contact et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante.In a particular embodiment, one of the ends of the detection part is superimposed with one of the ends of the contact part and the other end of the detection part is superimposed with one of the ends of the absorbent part.
Dans un mode de réalisation plus particulier, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie de contact pour former une première zone de superposition, et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante pour former une deuxième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième et la troisième zone de superposition sont séparées les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la première et de la deuxième zone de superposition.In a more particular embodiment, one of the ends of the detection part is superimposed with one of the ends of the contact part to form a first overlapping zone, and the other end of the detection part is superimposed with one of the ends of the absorbent part to form a second overlapping zone. In particular, the first, the second and the third overlap zone are separated from each other. In particular, the contact zone is distinct from the first overlapping zone. In particular, the detection zone is distinct from the first and from the second superposition zone.
Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est une zone où les phages/protéines de phages sont déposés (Figures 1, 3).In a particular embodiment, the detection zone is an area where the phages/phage proteins are deposited (Figures 1, 3).
Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est répartie après la zone de dépôt de l’échantillon (sample pad) et après la zone de conjugaison (conjugate pad) si elle est présente (
Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection se confond avec la zone de conjugaison (conjugate pad) (
Dans un mode de réalisation particulier, ladite bandelette comprend en outre, entre la partie de contact et la partie de détection, une partie de marquage qui comprend une zone de marquage comprenant un marqueur.In a particular embodiment, said strip further comprises, between the contact part and the detection part, a marking part which comprises a marking zone comprising a marker.
La partie de marquage (conjugate pad) comprend une zone de marquage où les bactéries sont marquées avec un marqueur lorsque le flux d’échantillon à analyser la traverse. Leur rôle est de maintenir le marqueur jusqu’à utilisation de la bandelette et de libérer le marqueur lorsqu’il y a reconnaissance entre le marqueur et une bactérie, au passage du flux d’échantillon. Par exemple la partie de marquage et la zone de marquage sont en fibres de verre, cellulose ou polyesters.The labeling part (conjugate pad) includes a labeling area where the bacteria are labeled with a marker when the sample flow passes through it. Their role is to maintain the marker until the strip is used and to release the marker when there is recognition between the marker and a bacterium, when the sample flow passes. For example, the marking part and the marking zone are made of glass fibers, cellulose or polyesters.
Pour la détection de la capture des bactéries par les bactériophages ou protéines de bactériophages, différents types de marqueurs peuvent être utilisés.For the detection of the capture of bacteria by bacteriophages or bacteriophage proteins, different types of markers can be used.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le marqueur peut être tout marqueur apte à marquer une bactérie, un bactériophage, une protéine, en particulier une protéine de bactériophage, un anticorps ou un aptamère. Les marqueurs de bactéries sont bien connus de l’Homme du métier.Thus, in a particular embodiment, the label can be any label capable of labeling a bacterium, a bacteriophage, a protein, in particular a bacteriophage protein, an antibody or an aptamer. Bacterial markers are well known to those skilled in the art.
Le terme « marqueur » englobe les marqueurs non conjugués et les marqueurs conjugués.The term "label" encompasses unconjugated labels and conjugated labels.
Au sens de la présente demande, un marqueur non conjugué est un marqueur libre, c’est-à-dire qu’il n’est pas lié à un ligand pour marquer la bactérie.Within the meaning of the present application, an unconjugated marker is a free marker, that is to say that it is not bound to a ligand to mark the bacterium.
Dans la présente demande, les marqueurs utilisés peuvent être des molécules colloïdales en particulier les nanoparticules d’or (AuNP). A titre d’exemple, il peut s’agit de nanosphères d’or ou de nanobâtonnets d’or. L’agrégation des nanoparticules d’or entraine l’apparition d’une couleur, en particulier d’une couleur rose, détectable dans le visible, en raison de la longueur d’onde d’absorbance des nanoparticules d’or. Dans le cadre d’un dispositif de type ELISA l’élément marqué peut être un anticorps spécifique à la bactérie couplé avec un substrat par exemple la peroxydase de raifort, qui catalyse la conversion de substrats chromogènes en composés colorés, ou qui produit de la lumière à partir de substrats chimioluminescents ; on peut noter l'ABTS, l'OPD, le DAB (en), l'AEC (en) ou encore le TMB (3,3',5,5'-Tétraméthylbenzidine). Dans la présente demande, il s’agit un anticorps couplé avec une enzyme peroxydase et la révélation de la couleur est faite grâce à l’ajout du TMB.In the present application, the markers used can be colloidal molecules, in particular gold nanoparticles (AuNP). For example, they may be gold nanospheres or gold nanorods. The aggregation of gold nanoparticles leads to the appearance of a color, in particular a pink color, detectable in the visible, due to the absorbance wavelength of the gold nanoparticles. In the context of an ELISA-type device, the labeled element may be an antibody specific to the bacterium coupled with a substrate, for example horseradish peroxidase, which catalyzes the conversion of chromogenic substrates into colored compounds, or which produces light from chemiluminescent substrates; we can note ABTS, OPD, DAB (in), AEC (in) or even TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine). In the present application, it is an antibody coupled with a peroxidase enzyme and the revelation of the color is made thanks to the addition of TMB.
Au sens de la présente demande, un marqueur conjugué signifie que le marqueur est lié à un ligand pour marquer la bactérie. En particulier, le marqueur conjugué est un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt. Par « conjugué à au moins un ligand spécifique », on entend qu’un marqueur peut être conjugué à un ligand spécifique ou à plusieurs ligands spécifiques différents.Within the meaning of the present application, a conjugated label means that the label is bound to a ligand to label the bacterium. In particular, the conjugated marker is a marker conjugated to at least one specific ligand of the bacterium of interest. By “conjugated to at least one specific ligand”, it is meant that a label can be conjugated to a specific ligand or to several different specific ligands.
Sauf mention contraire, au sens de la présente invention, ledit au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt peut être au moins un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins un aptamère spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt. En particulier, la bactérie d’intérêt estS. aureuset ces ligands spécifiques se lisent comme des ligands spécifiques deS. aureusou dirigés contreS. aureus. En particulier, lorsque le ligand est spécifique deS. aureus, ledit au moins un bactériophage spécifique deS. aureusest un bactériophage CNCM I-5408, un bactériophage CNCM I-5409 et/ou un bactériophage CNCM I-5410, et/ou un bactériophage CNCM I-5491, et/ou un bactériophage CNCM I-5492 et ladite au moins protéine d’au moins un bactériophage, en particulier une RBP, est au moins protéine du bactériophage CNCM I-5408, au moins protéine du bactériophage CNCM I-5409 et/ou au moins protéine du bactériophage CNCM I-5410 au moins protéine du bactériophage CNCM I-5491, au moins protéine du bactériophage CNCM I-5492.Unless otherwise stated, within the meaning of the present invention, said at least one ligand specific for the bacterium of interest can be at least one antibody directed against the bacterium of interest, at least one aptamer specific for the bacterium of interest, at least at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one protein of at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, at least one protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest. In particular, the bacterium of interest is S. aureus and these specific ligands read as ligands specific for S. aureus or directed against S. aureus . In particular, when the ligand is specific for S. aureus , said at least one bacteriophage specific for S. aureus is a bacteriophage CNCM I-5408, a bacteriophage CNCM I-5409 and/or a bacteriophage CNCM I-5410, and/or a bacteriophage CNCM I-5491, and/or a bacteriophage CNCM I-5492 and said at least protein of at least one bacteriophage, in particular an RBP, is at least protein of bacteriophage CNCM I-5408, at least protein of bacteriophage CNCM I-5409 and/or at least bacteriophage CNCM I-5410 protein at least bacteriophage CNCM I-5491 protein, at least bacteriophage CNCM I-5492 protein.
Ainsi, le marqueur conjugué à un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt, en particulierS. aureus, peut être un marqueur conjugué à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un aptamère spécifique de la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un phage spécifique de la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à une protéine d’un phage spécifique de la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un phage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à une protéine d’un phage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt couplé à un phage spécifique de la bactérie d’intérêt ou un marqueur conjugué à une protéine d’un phage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt.Thus, the label conjugated to a ligand specific for the bacterium of interest, in particular S. aureus , can be a label conjugated to an antibody directed against the bacterium of interest, a label conjugated to an aptamer specific to the bacterium of interest, a marker conjugated to a phage specific to the bacterium of interest, a marker conjugated to a protein of a phage specific to the bacterium of interest, a marker conjugated to a phage specific to the bacterium of interest coupled to a antibody directed against the bacterium of interest, a marker conjugated to a protein of a specific phage of the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, a marker conjugated to an antibody directed against the bacterium of interest coupled to a phage specific to the bacterium of interest or a marker conjugated to a protein of a phage specific to the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest.
Dans un mode de réalisation plus particulier, la présente invention porte sur une bandelette pour détecterS. aureusdans un échantillon, comprenant dans l’ordre au moins :In a more particular embodiment, the present invention relates to a strip for detecting S. aureus in a sample, comprising in order at least:
- une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ;a contact part comprising a contact zone with the sample;
- une partie de marquage comprenant une zone de marquage qui comprend un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique deS. aureus, en particulier une nanoparticule d’or conjuguée à au moins un ligand spécifique deS. aureus;a labeling part comprising a labeling zone which comprises a label conjugated to at least one ligand specific for S. aureus , in particular a gold nanoparticle conjugated to at least one ligand specific for S. aureus ;
- une partie de détection comprenant une zone de détection deS. aureusqui comprend au moins un bactériophage spécifique deS. aureuset/ou une protéine d’au moins un bactériophage spécifique deS. aureus, en particulier une protéine RBP,a detection part comprising a zone for detecting S. aureus which comprises at least one bacteriophage specific for S. aureus and/or a protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus , in particular an RBP protein,
- une partie absorbante.an absorbent part.
En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à un anticorps anti-S . aureusou marqueur conjugué à un aptamère spécifique deS. aureus, plus particulièrement une nanoparticule d’or conjugué à un anticorps anti-S . aureusou une nanoparticule d’or conjugué à un aptamère spécifique deS. aureus.In particular, the labeling zone comprises a label conjugated to an anti- S antibody . aureus or marker conjugated to an aptamer specific to S. aureus , more particularly a gold nanoparticle conjugated to an anti- S . aureus or a gold nanoparticle conjugated to an aptamer specific to S. aureus .
En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins un bactériophage spécifique deS. aureus. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué au phage CNCM I-5408, un marqueur conjugué au phage CNCM I-5409, et/ou un marqueur conjugué au phage CNCM I-5410, et/ou un marqueur conjugué au phage CNCM I-5491, et/ou un marqueur conjugué au phage CNCM I-5492. En particulier, elle comprend ces trois marqueurs conjugués à des phages. Plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces phages est une nanoparticule d’or.In particular, the labeling zone comprises a label conjugated to at least one bacteriophage specific for S. aureus . In particular, it comprises a marker conjugated to phage CNCM I-5408, a marker conjugated to phage CNCM I-5409, and/or a marker conjugated to phage CNCM I-5410, and/or a marker conjugated to phage CNCM I-5491 , and/or a marker conjugated to CNCM I-5492 phage. In particular, it comprises these three markers conjugated to phages. More particularly, said label conjugated to these phages is a gold nanoparticle.
En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique deS. aureus. En particulier, ladite au moins une protéine est une RBP. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5408, un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5409, et/ou un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5410, et/ou un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5491, et/ou un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5492. En particulier, elle comprend ces trois marqueurs conjugués à des protéines de phages. Encore plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces protéines de phages est une nanoparticule d’or.In particular, the labeling zone comprises a label conjugated to at least one protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus . In particular, said at least one protein is an RBP. In particular, it comprises a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5408, a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5409, and/or a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I -5410, and/or a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5491, and/or a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5492. In particular, it comprises these three markers conjugated to phage proteins. Even more particularly, said label conjugated to these phage proteins is a gold nanoparticle.
En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué au phage CNCM I-5408 couplé à un anticorps anti-S . aureus, un marqueur conjugué au phage CNCM I-5409 couplé à un anticorps anti-S . aureus, un marqueur conjugué au phage CNCM I-5410 couplé à un anticorps anti-S . aureus, un marqueur conjugué au phage CNCM I-5491 couplé à un anticorps anti-S . aureuset/ou un marqueur conjugué au phage CNCM I-5492couplé à un anticorps anti-S . aureus. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué à une protéine du phage CNCM I-5408 couplé à un anticorps anti-S . aureus, un marqueur conjugué à une protéine du phage CNVM I-5409 couplé à un anticorps anti-S . aureuset/ou un marqueur conjugué à une protéine du phage CNCM I-5410 couplé à un anticorps anti-S . aureuset/ou un marqueur conjugué à une protéine du phage CNCM I-5491 couplé à un anticorps anti-S . aureus, et/ou un marqueur conjugué à une protéine du phage CNCM I-5492 couplé à un anticorps anti-S . aureus. En particulier, il s’agit d’un marqueur conjugué à un anticorps anti-S . aureuscouplé au phage CNCM I-5408, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S . aureuscouplé au phage CNCM I-5409 et/ou un marqueur conjugué à un anticorps anti-S . aureuscouplé au phage CNCM I-5410, et/ou un marqueur conjugué à un anticorps anti-S . aureuscouplé au phage CNCM I-5491, et/ou un marqueur conjugué à un anticorps anti-S . aureuscouplé au phage CNCM I-5492. En particulier, il s’agit d’un marqueur conjugué à un anticorps anti-S . aureuscouplé à une protéine du phage CNCM I-5408, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S . aureuscouplé à une protéine du phage CNCM I-5409 et/ou un marqueur conjugué à un anticorps anti-S . aureuscouplé à une protéine du phage CNCM I-5410, et/ou un marqueur conjugué à un anticorps anti-S . aureuscouplé à une protéine du phage CNCM I-5491, et/ou un marqueur conjugué à un anticorps anti-S . aureuscouplé à une protéine du phage CNCM I-5492.In particular, the labeling zone comprises a label conjugated to phage CNCM I-5408 coupled to an anti- S antibody . aureus , a CNCM I-5409 phage-conjugated marker coupled to an anti- S . aureus , a CNCM I-5410 phage-conjugated marker coupled to an anti- S . aureus , a CNCM I-5491 phage-conjugated marker coupled to an anti- S . aureus and/or a marker conjugated to the CNCM I-5492 phage coupled to an anti- S . aureus . In particular, it comprises a marker conjugated to a protein of the CNCM I-5408 phage coupled to an anti- S antibody . aureus , a CNVM I-5409 phage protein-conjugated marker coupled to an anti- S . aureus and/or a marker conjugated to a CNCM I-5410 phage protein coupled to an anti- S . aureus and/or a marker conjugated to a CNCM I-5491 phage protein coupled to an anti- S . aureus , and/or a marker conjugated to a CNCM I-5492 phage protein coupled to an anti- S . aureus . In particular, it is a marker conjugated to an anti- S antibody . aureus coupled to phage CNCM I-5408, a marker conjugated to an anti- S . aureus coupled to phage CNCM I-5409 and/or a marker conjugated to an anti- S antibody . aureus coupled to phage CNCM I-5410, and/or a marker conjugated to an anti- S antibody . aureus coupled to the CNCM I-5491 phage, and/or a marker conjugated to an anti- S antibody . aureus coupled to CNCM I-5492 phage. In particular, it is a marker conjugated to an anti- S antibody . aureus coupled to a protein from phage CNCM I-5408, a marker conjugated to an anti- S . aureus coupled to a CNCM I-5409 phage protein and/or a label conjugated to an anti- S antibody . aureus coupled to a protein from phage CNCM I-5410, and/or a label conjugated to an anti- S antibody . aureus coupled to a protein from phage CNCM I-5491, and/or a marker conjugated to an anti- S antibody . aureus coupled to a protein from phage CNCM I-5492.
En particulier, la zone de détection comprend un phage CNCM I-5408, un phage CNCM I-5409 et/ou un phage CNCM I-5410, et/ou un phage CNCM I-5491 et/ou un phage CNCM I-5492. En particulier, la zone de détection comprend un phage CNCM I-5408, un phage CNCM I-5409 et un phage CNCM I-5410. En particulier, la zone de détection comprend un phage CNCM I-5408, un phage CNCM I-5409, un phage CNCM I-5410, En particulier, la zone de détection comprend un phage CNCM I-5408, un phage CNCM I-5409, un phage CNCM I-5491 et un phage CNCM I-5492.In particular, the detection zone comprises a CNCM I-5408 phage, a CNCM I-5409 phage and/or a CNCM I-5410 phage, and/or a CNCM I-5491 phage and/or a CNCM I-5492 phage. In particular, the detection zone comprises a CNCM I-5408 phage, a CNCM I-5409 phage and a CNCM I-5410 phage. In particular, the detection zone comprises CNCM I-5408 phage, CNCM I-5409 phage, CNCM I-5410 phage, In particular, the detection zone comprises CNCM I-5408 phage, CNCM I-5409 phage , a CNCM I-5491 phage and a CNCM I-5492 phage.
En particulier, la zone de détection comprend au moins une protéine du phage CNCM I-5408, au moins une protéine du phage CNCM I-5409, et/ou au moins une protéine du phage CNCM I-5410, et/ou au moins une protéine du phage CNCM I-5491, et/ou au moins une protéine du phage CNCM I-5492. En particulier, la zone de détection comprend au moins une protéine du phage CNCM I-5408, au moins une protéine du phage CNCM I-5409 et au moins une protéine du phage CNCM I-5410. En particulier, la zone de détection comprend au moins une protéine du phage CNCM I-5408, au moins une protéine du phage CNCM I-5409 et au moins une protéine du phage CNCM I-5410, et au moins une protéine du phage CNCM I-5491 et au moins une protéine du phage CNCM I-5492.In particular, the detection zone comprises at least one protein from phage CNCM I-5408, at least one protein from phage CNCM I-5409, and/or at least one protein from phage CNCM I-5410, and/or at least one protein from phage CNCM I-5491, and/or at least one protein from phage CNCM I-5492. In particular, the detection zone comprises at least one protein from phage CNCM I-5408, at least one protein from phage CNCM I-5409 and at least one protein from phage CNCM I-5410. In particular, the detection zone comprises at least one protein from phage CNCM I-5408, at least one protein from phage CNCM I-5409 and at least one protein from phage CNCM I-5410, and at least one protein from phage CNCM I -5491 and at least one protein from phage CNCM I-5492.
Dans un autre mode de réalisation, ladite bandelette (de chromatographie à flux latéral) comprend dans l’ordre au moins :In another embodiment, said strip (for lateral flow chromatography) comprises in order at least:
- une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ;a contact part comprising a contact zone with the sample;
- une partie de marquage comprenant une zone de marquage qui comprend un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt choisi parmi au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt,a labeling part comprising a labeling zone which comprises a label conjugated to at least one ligand specific for the bacterium of interest chosen from at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one protein of at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, at least one protein of a bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest,
- une partie de détection comprenant une zone de détection de la bactérie d’intérêt qui comprend au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt,a detection part comprising a zone for detecting the bacterium of interest which comprises at least one ligand specific for the bacterium of interest,
- une partie absorbante.an absorbent part.
En particulier, ledit au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt compris dans la zone de détection est au moins un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins un aptamère spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt.In particular, said at least one ligand specific for the bacterium of interest included in the detection zone is at least one antibody directed against the bacterium of interest, at least one aptamer specific for the bacterium of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one protein of at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest, at the at least one bacteriophage protein specific for the bacterium of interest coupled to an antibody directed against the bacterium of interest.
Dans un mode de réalisation plus particulier, la présente invention porte sur une bandelette pour détecterS. aureusdans un échantillon, comprenant dans l’ordre au moins :In a more particular embodiment, the present invention relates to a strip for detecting S. aureus in a sample, comprising in order at least:
- une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ;a contact part comprising a contact zone with the sample;
- une partie de marquage comprenant une zone de marquage qui comprend un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique de S. aureus choisi parmi : au moins un bactériophage spécifique deS. aureus, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifiqueS. aureus,au moins un bactériophage spécifique de S. aureuscouplé à un anticorps dirigé contreS. aureus, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique deS. aureuscouplée à un anticorps dirigé contreS. aureus;a labeling part comprising a labeling zone which comprises a label conjugated to at least one ligand specific for S. aureus chosen from: at least one bacteriophage specific for S. aureus , at least one protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus, at least one bacteriophage specific for S. aureus coupled to an antibody directed against S. aureus , at least one protein of a bacteriophage specific for S. aureus coupled to an antibody directed against S. aureus ;
- une partie de détection comprenant une zone de détection deS. aureusqui comprend au moins un ligand spécifique deS. aureus, ;a detection part comprising an S. aureus detection zone which comprises at least one ligand specific for S. aureus ;
- une partie absorbante.an absorbent part.
En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins un bactériophage spécifique deS. aureus. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué au phage CNCM I-5408, un marqueur conjugué au phage CNCM I-5409, et/ou un marqueur conjugué au phage CNCM I-5410, et/ou un marqueur conjugué au phage CNCM I-5491, et/ou un marqueur conjugué au phage CNCM I-5492. Plus particulièrement, elle comprend un marqueur conjugué au phage CNCM I-5408, un marqueur conjugué au phage CNCM I-5409, un marqueur conjugué au phage CNCM I-5410, un marqueur conjugué au phage CNCM I-5491 et un marqueur conjugué au phage CNCM I-5492. Plus particulièrement, elle comprend un marqueur conjugué au phage CNCM I-5408, un marqueur conjugué au phage CNCM I-5409 et un marqueur conjugué au phage CNCM I-5410. Encore plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces phages est une nanoparticule d’or.In particular, the labeling zone comprises a label conjugated to at least one bacteriophage specific for S. aureus . In particular, it comprises a marker conjugated to phage CNCM I-5408, a marker conjugated to phage CNCM I-5409, and/or a marker conjugated to phage CNCM I-5410, and/or a marker conjugated to phage CNCM I-5491 , and/or a marker conjugated to CNCM I-5492 phage. More particularly, it comprises a marker conjugated to phage CNCM I-5408, a marker conjugated to phage CNCM I-5409, a marker conjugated to phage CNCM I-5410, a marker conjugated to phage CNCM I-5491 and a marker conjugated to phage CNCM I-5492. More particularly, it comprises a marker conjugated to phage CNCM I-5408, a marker conjugated to phage CNCM I-5409 and a marker conjugated to phage CNCM I-5410. Even more particularly, said label conjugated to these phages is a gold nanoparticle.
En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de S. aureus. En particulier, ladite au moins une protéine est une RBP. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5408, un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5409, et/ou un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5410, et/ou un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5491, et/ou un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5492. Plus particulièrement, elle comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5408, un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5409 et un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5410. Plus particulièrement, elle comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5408, un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5409, un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5410, un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5491 et un marqueur conjugué à au moins une protéine du phage CNCM I-5492. Encore plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces protéines de phages est une nanoparticule d’or.In particular, the labeling zone comprises a label conjugated to at least one protein of at least one bacteriophage specific for S. aureus. In particular, said at least one protein is an RBP. In particular, it comprises a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5408, a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5409, and/or a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I -5410, and/or a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5491, and/or a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5492. More particularly, it comprises a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5408, a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5409 and a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5410. More particularly, it comprises a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5408, a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5409, a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5410, a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5491 and a marker conjugated to at least one protein from phage CNCM I-5492. Even more particularly, said marker conjugated to these phage proteins is a gold nanoparticle.
En particulier, la zone de détection comprend un anticorps anti-S aureusou un aptamère spécifique de S. aureus. En particulier, la zone de détection comprend au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, plus particulièrement un bactériophage CNCM I-5408, un bactériophage CNCM I-5409 et/ou un bactériophage CNCM I-5410, et/ou un bactériophage CNCM I-5491, et/ou un bactériophage CNCM I-5492. Plus particulièrement, elle comprend ces trois bactériophages. Encore plus particulièrement, Plus particulièrement, elle comprend ces cinq bactériophages.In particular, the detection zone comprises an anti- S aureus antibody or an aptamer specific for S. aureus. In particular, the detection zone comprises at least one bacteriophage specific for the bacterium of interest, more particularly a bacteriophage CNCM I-5408, a bacteriophage CNCM I-5409 and/or a bacteriophage CNCM I-5410, and/or a bacteriophage CNCM I-5491, and/or a CNCM I-5492 bacteriophage. More particularly, it comprises these three bacteriophages. Even more particularly, More particularly, it comprises these five bacteriophages.
En particulier, la zone de détection comprend au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique deS. aureus, en particulier une RBP. Plus particulièrement, elle comprend au moins protéine du bactériophage CNCM I-5408, au moins protéine du bactériophage CNCM I-5409 et/ou au moins protéine du bactériophage CNCM I-5410, et/ou au moins protéine du bactériophage CNCM I-5491, et/ou au moins protéine du bactériophage CNCM I-5492. Encore plus particulièrement, elle comprend au moins protéine du bactériophage CNCM I-5408, au moins protéine du bactériophage CNCM I-5409 et au moins protéine du bactériophage CNCM I-5410. Encore plus particulièrement, elle comprend au moins protéine du bactériophage CNCM I-5408, au moins protéine du bactériophage CNCM I-5409, au moins protéine du bactériophage CNCM I-5410, au moins protéine du bactériophage CNCM I-5491 et au moins protéine du bactériophage CNCM I-5492.In particular, the detection zone comprises at least one protein from at least one bacteriophage specific for S. aureus , in particular an RBP. More particularly, it comprises at least bacteriophage CNCM I-5408 protein, at least bacteriophage CNCM I-5409 protein and/or at least bacteriophage CNCM I-5410 protein, and/or at least bacteriophage CNCM I-5491 protein, and/or at least bacteriophage CNCM I-5492 protein. Even more particularly, it comprises at least bacteriophage CNCM I-5408 protein, at least bacteriophage CNCM I-5409 protein and at least bacteriophage CNCM I-5410 protein. Even more particularly, it comprises at least bacteriophage CNCM I-5408 protein, at least bacteriophage CNCM I-5409 protein, at least bacteriophage CNCM I-5410 protein, at least bacteriophage CNCM I-5491 protein and at least bacteriophage protein CNCM I-5492 bacteriophage.
En particulier, la zone de détection comprend au moins un bactériophage spécifique de S. aureuscouplé à un anticorps dirigé contreS. aureuset/ou au moins une protéine d’un bactériophage spécifique deS. aureuscouplée à un anticorps dirigé contreS. aureus, en particulier dans lesquels ledit bactériophage est choisi parmi les bactériophages CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et ladite protéine est choisie parmi les protéines de ces phages.In particular, the detection zone comprises at least one bacteriophage specific for S. aureus coupled to an antibody directed against S. aureus and/or at least one protein of a bacteriophage specific for S. aureus coupled to an antibody directed against S. aureus , in particular in which said bacteriophage is chosen from bacteriophages CNCM I- 5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5410, CNCM I-5491 and CNCM I-5492 and said protein is chosen from the proteins of these phages.
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la bandelette comprend au moins quatre parties, l’une des extrémités de la partie de contact est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une première zone de superposition ; l’une des extrémités de la partie de marquage est superposée avec l’une des extrémités de la partie en amont de celle-ci pour former une deuxième zone de superposition et l’autre extrémité de la partie de marquage est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une troisième zone de superposition ; l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en amont de celle-ci pour former une quatrième zone de superposition et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une cinquième zone de superposition ; et l’une des extrémités de la partie absorbante est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une sixième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième, la troisième, la quatrième, la cinquième et la sixième zone de superposition sont séparées les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de marquage est distincte de la deuxième et de la troisième zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la quatrième et de la cinquième zone de superposition.In a particular embodiment, when the strip comprises at least four parts, one of the ends of the contact part is superimposed with one of the ends of the part downstream of the latter to form a first zone of superposition ; one of the ends of the marking part is superimposed with one of the ends of the part upstream of the latter to form a second overlapping zone and the other end of the marking part is superimposed with one ends of the part downstream thereof to form a third superposition zone; one of the ends of the detection part is superimposed with one of the ends of the upstream part thereof to form a fourth superposition zone and the other end of the detection part is superimposed with one ends of the part downstream thereof to form a fifth overlapping zone; and one of the ends of the absorbent part is overlapped with one of the ends of the part downstream thereof to form a sixth zone of overlap. In particular, the first, the second, the third, the fourth, the fifth and the sixth overlapping zone are separated from each other. In particular, the contact zone is distinct from the first overlapping zone. In particular, the marking zone is distinct from the second and from the third overlapping zone. In particular, the detection zone is distinct from the fourth and from the fifth overlapping zone.
Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de contact et l’autre extrémité de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de détection ; l’autre extrémité de la partie de détection étant superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante.In a particular embodiment, one of the ends of the marking part is superimposed on one of the ends of the contact part and the other end of the marking part is superimposed on one of the ends of the detection part; the other end of the detection part being superimposed with one of the ends of the absorbing part.
Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de contact pour former une première zone de superposition, et l’autre extrémité de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de détection pour former une deuxième zone de superposition ; l’autre extrémité de la partie de détection étant superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante pour former une troisième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième et la troisième zone de superposition sont séparées les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de marquage est distincte de la première et de la deuxième zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la deuxième et de la troisième zone de superposition.In a particular embodiment, one of the ends of the marking part is superimposed on one of the ends of the contact part to form a first superposition zone, and the other end of the marking part is superimposed at one of the ends of the detection part to form a second overlapping zone; the other end of the detection part being superposed with one of the ends of the absorbing part to form a third superposition zone. In particular, the first, the second and the third overlap zone are separated from each other. In particular, the contact zone is distinct from the first overlapping zone. In particular, the marking area is distinct from the first and from the second overlapping area. In particular, the detection zone is distinct from the second and from the third superposition zone.
Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est une ligne transversale à la bandelette, formant ainsi une ligne de détection ou ligne de test (test line).In a particular embodiment, the detection zone is a line transverse to the strip, thus forming a detection line or test line.
Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est répartie et est limitée par une ligne transversale à la bandelette.In a particular embodiment, the detection zone is distributed and is limited by a line transverse to the strip.
Optionnellement, la partie de détection peut comprendre en outre une zone de contrôle comme décrit précédemment.Optionally, the detection part can also comprise a control zone as described previously.
Test ELISAELISA test
Le principe de l’ELISA consiste à piéger, entre un « anticorps de capture » et un « anticorps de détection », les analytes (antigènes, bactéries, virus, etc…). La spécificité du système de détection de la présente invention par rapport au système ELISA classique est le remplacement d’un ou des deux anticorps par les phages ou les protéines de phages.The principle of ELISA consists in trapping, between a "capture antibody" and a "detection antibody", the analytes (antigens, bacteria, viruses, etc.). The specificity of the detection system of the present invention compared to the conventional ELISA system is the replacement of one or both antibodies by phages or phage proteins.
Dans le cadre de mise en œuvre de la présente invention sous la forme d’un test ELISA, la détection et/ou quantification des bactéries dans un échantillon est réalisée par le remplacement d’un des deux anticorps ou des deux anticorps du test ELISA classique par les phages ou les protéines de phages.In the context of implementing the present invention in the form of an ELISA test, the detection and/or quantification of bacteria in a sample is carried out by replacing one of the two antibodies or the two antibodies of the conventional ELISA test by phages or phage proteins.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, il est possible de remplacer l’anticorps couplé à un marqueur par protéines de phages ou des phages couplé directement ou indirectement à un marqueur (or ou d’autre sonde).In a particular embodiment of the invention, it is possible to replace the antibody coupled to a marker with phage proteins or phages coupled directly or indirectly to a marker (gold or other probe).
Il est possible d’utiliser un anticorps pour la révélation et /ou de la détection de la présence de bactérie dans l’échantillon.It is possible to use an antibody for the revelation and/or detection of the presence of bacteria in the sample.
Il est possible d’utiliser plusieurs phages ou protéines de phages ou de les combiner avec les anticorps afin de capter plusieurs souches bactériennes (spectre de détection).It is possible to use several phages or phage proteins or to combine them with antibodies in order to capture several bacterial strains (detection spectrum).
Dans ce système au lieu d’utiliser l’anticorps couplé au HRP, il est possible d’utiliser l’anticorps couplé à une molécule colloïdale telle que l’or ou une autre molécule d marqueur afin de mesurer l’absorbance directement sans besoin de l’étape de la révélation par TMB.In this system instead of using the antibody coupled to HRP, it is possible to use the antibody coupled to a colloidal molecule such as gold or another label molecule in order to measure the absorbance directly without the need for the stage of revelation by TMB.
Selon un mode de réalisation, les phages ou les protéines de phages sont utilisés pour la capture des bactéries (analytes) et un anticorps est utilisé pour la détection (
Il est aussi possible de remplacer l’anticorps couplé à un marqueur par des protéines de phages ou des phages couplés directement ou indirectement à un marqueur (or ou autre sonde) pour la détection des bactéries (Figure 7 B). Dans une autre mise en œuvre de l’invention les protéines de phage, en particulier les RBP, sont utilisées pour la détection des bactéries et sont utilisées dans une solution comprenant un cation et une protéine ou dans une solution comprenant un cation ou une protéine (en particulier une solution de MgSO4 et BSA).It is also possible to replace the antibody coupled to a label with phage proteins or phages coupled directly or indirectly to a label (gold or other probe) for the detection of bacteria (Figure 7 B). In another implementation of the invention phage proteins, in particular RBPs, are used for the detection of bacteria and are used in a solution comprising a cation and a protein or in a solution comprising a cation or a protein ( in particular a solution of MgSO4 and BSA).
Ainsi, des modes de réalisation alternatifs de la présente invention incluent l’utilisation des phages ou protéines de phages pour la capture et la détection des bactéries ou l’utilisation d’un anticorps pour la capture des bactéries et l’utilisation de phages ou protéines de phages pour la détection (
Il est également possible d’utiliser plusieurs phages ou protéines de phages ou de les combiner avec les anticorps afin de capter plusieurs souches bactériennes (spectre de détection).It is also possible to use several phages or phage proteins or to combine them with the antibodies in order to capture several bacterial strains (detection spectrum).
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURESBRIEF DESCRIPTION OF FIGURES
EXEMPLESEXAMPLES
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention.The present invention will be better understood on reading the following examples which illustrate the invention without limitation.
Exemple 1 : Activité des bactériophagesExample 1: Bacteriophage activity
1.1. Détermination de l’activité d’un bactériophage sur une souche bactérienne1.1. Determination of the activity of a bacteriophage on a bacterial strain
Pour identifier si un bactériophage est spécifique d’une bactérie, on utilise la méthode des spots. Sur une boite de Pétri où est étalée une culture de bactérie en phase exponentielle, au moins un spot comprenant le bactériophage est déposé. Si une plage de lyse est observée autour du spot, cela signifie que le bactériophage est actif pour cette bactérie, autrement dit que le bactériophage est spécifique de cette bactérie.To identify whether a bacteriophage is specific to a bacterium, the spot method is used. On a Petri dish on which is spread a culture of bacteria in the exponential phase, at least one spot comprising the bacteriophage is deposited. If a lysis patch is observed around the spot, this means that the bacteriophage is active for this bacterium, in other words that the bacteriophage is specific for this bacterium.
1.2. Bactériophages utilisés1.2. Bacteriophages used
Cinq phages ont été testés dans la présente demande :Five phages were tested in this application:
Souches de bactériophagesBacteriophage strains
La présente invention concerne la souche de bactériophage déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro CNCM I-5408.The present invention relates to the bacteriophage strain deposited at the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM) under the number CNCM I-5408.
La présente invention concerne également la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5409.The present invention also relates to the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5409.
La présente invention concerne également la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5410.The present invention also relates to the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5410.
La présente invention concerne également la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5491.The present invention also relates to the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5491.
La présente invention concerne également la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5492.The present invention also relates to the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5492.
- Détermination du spectre d’activité des phages isolésDetermination of the activity spectrum of isolated phages
Selon les profils de digestion, neuf phages ont finalement été sélectionnés pour tester leur activité sur différentes souches deS. aureusisolées à partir des échantillons d’élevage.According to the digestion profiles, nine phages were finally selected to test their activity on different strains of S. aureus isolated from the breeding samples.
Pour les phages 2 à 7, l’activité des phages isolés est comparée à celle du phage de référence qui est le phage K (phage 1).For phages 2 to 7, the activity of the isolated phages is compared with that of the reference phage which is phage K (phage 1).
RésultatsResults
Le spectre d’activité a été testé sur les 30 souches deS. aureus(Tableau 1) ou sur 25 souches bactériennes dont 19 souches deS. Aureuset 6 souches nonS. Aureus(Tableau 2) par la méthode de spot. L’intensité de lyse de ces phages sur chacune des souches bactériennes est détaillée dans le tableau 1 et le tableau 2. Le tableau 1 représente donc le spectre d’activité des phages isolés sur les souches deS. aureusbovine et le tableau 2 représente le spectre d’activité des phages isolés sur différentes souches bactériennes. La lyse obtenue par la méthode de spot est notée de (-) = pas d’activité à (++++) = très active.The spectrum of activity was tested on the 30 strains of S. aureus (Table 1) or on 25 bacterial strains including 19 strains of S. Aureus and 6 non- S. Aureus strains (Table 2) by the spot method. The intensity of lysis of these phages on each of the bacterial strains is detailed in Table 1 and Table 2. Table 1 therefore represents the spectrum of activity of the phages isolated on the strains of bovine S. aureus and Table 2 represents the spectrum of activity of the phages isolated on different bacterial strains. The lysis obtained by the spot method is noted from (-)=no activity to (++++)=very active.
SouchePhage/
Strain
L’appréciation de l’intensité de lyse est appréciée de 0 (-) à ++++). La notation « C » signifie que quelques colonies sont observées dans la plage de lyse.The assessment of the lysis intensity is assessed from 0 (-) to ++++). The notation "C" means that a few colonies are observed in the lysis range.
Ces résultats montrent que :These results show that:
- Le phage K (ATCC 19685-B1) (phage 1) infecte 28 souches sur les 30 souches testées, soit 93 % (Tableau 1).Phage K (ATCC 19685-B1) (phage 1) infects 28 strains out of the 30 strains tested, ie 93% (Table 1).
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5408 (phage 2) infecte 29 souches sur les 30 souches testées, soit 97 % (Tableau 1) ;The bacteriophage deposited at the CNCM under the number CNCM I-5408 (phage 2) infects 29 strains out of the 30 strains tested, ie 97% (Table 1);
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5409 (phage 3) infecte 22 souches sur les 30 souches testées, soit 73 % (Tableau 1) ;The bacteriophage deposited at the CNCM under the number CNCM I-5409 (phage 3) infects 22 strains out of the 30 strains tested, ie 73% (Table 1);
- Le bactériophage 4 infecte 25 souches sur les 30 souches testées, soit 83 % (Tableau 1) ;Bacteriophage 4 infects 25 strains out of the 30 strains tested, i.e. 83% (Table 1);
- Le bactériophage 5 infecte 14 souches sur les 30 souches testées, soit 47 % (Tableau 1) ;Bacteriophage 5 infects 14 strains out of the 30 strains tested, ie 47% (Table 1);
- Le bactériophage 6 infecte 14 souches sur les 30 souches testées, soit 47 % (Tableau 1) ;Bacteriophage 6 infects 14 strains out of the 30 strains tested, i.e. 47% (Table 1);
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5410 (phage 7) infecte 28 souches sur les 30 souches testées soit 93 % (Tableau 1) ;The bacteriophage deposited at the CNCM under the number CNCM I-5410 (phage 7) infects 28 strains out of the 30 strains tested, i.e. 93% (Table 1);
- Le cocktail des trois phages (2, 3 et 7) infecte 30 souches sur les 30 souches testées, soit 100 % (Tableau 1) ;The cocktail of three phages (2, 3 and 7) infects 30 strains out of the 30 strains tested, i.e. 100% (Table 1);
- Le bactériophage 8 infecte 14 souches sur 19 souchesS. aureus,soit 68.4% (Tableau 2)Bacteriophage 8 infects 14 strains out of 19 S. aureus strains, i.e. 68.4% (Table 2)
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5491 (phage 9) infecte 15 souches sur 19 souchesS. aureussoit 79% (Tableau 2) ;The bacteriophage deposited at the CNCM under the number CNCM I-5491 (phage 9) infects 15 strains out of 19 S. aureus strains, i.e. 79% (Table 2);
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5492 (phage 10) infecte 15 souches sur 19 souchesS. aureussoit 79% (Tableau 2) ;The bacteriophage deposited at the CNCM under the number CNCM I-5492 (phage 10) infects 15 strains out of 19 S. aureus strains, i.e. 79% (Table 2);
- Le cocktail des trois phages (2, 9 et 10) infecte 19 souches sur 19 souchesS. aureussoit 100% des souchesS. aureustestées (Tableau 2).The cocktail of three phages (2, 9 and 10) infects 19 strains out of 19 S. aureus strains, ie 100% of the S. aureus strains tested (Table 2).
Le spectre d’activité du phage 2 (CNCM I-5408) est le plus large et comparable au phage K (phage référence). Cependant, le phage K ne peut pas infecter toutes les souches testées. En revanche, certains mélanges de bactériophages selon l’invention permettent d’infecter plus de souches deS. aureusque le phage K, voire 100% des souches deS. aureustestées.The activity spectrum of phage 2 (CNCM I-5408) is the broadest and comparable to phage K (reference phage). However, phage K cannot infect all strains tested. On the other hand, certain mixtures of bacteriophages according to the invention make it possible to infect more strains of S. aureus than phage K, or even 100% of the strains of S. aureus tested.
En particulier, il a été montré que le mélange des phages n°CNCM I-5408 (phage 2), n°CNCM I-5409 (phage 3), et n°CNCM I-5410 (phage 7) permettait d’infecter la totalité des 30 souches, soit 100 % des souches testées (Tableau 1).In particular, it was shown that the mixture of phages n°CNCM I-5408 (phage 2), n°CNCM I-5409 (phage 3), and n°CNCM I-5410 (phage 7) made it possible to infect the all of the 30 strains, i.e. 100% of the strains tested (Table 1).
Il a été également montré que le mélange des phages n°CNCM I-5408 (phage 2), n°CNCM I-5491 (phage 9), et n°CNCM I-5492 (phage 10) permettait d’infecter la totalité des 19 souchesS Aureus, soit 100 % des souchesS. Aureustestées (Tableau 2).It was also shown that the mixture of phages n°CNCM I-5408 (phage 2), n°CNCM I-5491 (phage 9), and n°CNCM I-5492 (phage 10) made it possible to infect all the 19 S Aureus strains, i.e. 100% of the S. Aureus strains tested (Table 2).
Les phages selon l’invention ont un large spectre d’activité sur l’infection de souches deS. aureuset ont aussi été sélectionnées pour leur vitesse d’élimination deS. aureus(après 3 h d’incubation à 37°C en BHI).The phages according to the invention have a broad spectrum of activity on the infection of strains of S. aureus and were also selected for their rate of elimination of S. aureus (after 3 h of incubation at 37° C. in BHI).
Exemple 2 : Sélection des protéines de bactériophagesExample 2: Selection of Bacteriophage Proteins
2.1. Choix des protéines de bactériophages2.1. Choice of bacteriophage proteins
L’adsorption des bactériophages dans la bactérie hôte s’effectue grâce à la reconnaissance spécifique à la surface bactérienne, des protéines de liaison des phages (Receptor Binding Protein ou RBP), localisées à la base (« baseplate ») de la queue des phages (
Afin de déterminer la spécificité de liaison des différents types de protéines de phages àS. aureus, les protéines suivantes ont été sélectionnées et synthétisées :In order to determine the binding specificity of different types of phage proteins to S. aureus , the following proteins were selected and synthesized:
- une RBP du phage 2,a phage 2 RBP,
- une RBP du phage 3,a phage 3 RBP,
- une RBP du phage 7.a phage 7 RBP.
Pour cela, les phages 2, 3 et 7 ont été séquencés. La recherche des RBPs a été réalisée à partir des annotations complètes des génomes des phages 2, 3 et 7 en ciblant sur les séquences de la région « base plate ». L’alignement des séquences « base plate » de chaque phage a été réalisé un utilisant la technique BlastX des ORFs (open reading frame) des phages.For this, phages 2, 3 and 7 were sequenced. The search for RBPs was carried out using complete annotations of the genomes of phages 2, 3 and 7, targeting the sequences of the “flat base” region. The alignment of the "flat base" sequences of each phage was carried out using the BlastX technique of the ORFs (open reading frame) of the phages.
Les protéines RBPs ont été retrouvées au niveau du cluster des gènes de la queue aux alentours de 55000 pb à 84000 pb et plus précisément au niveau de la partie « base plate ».The RBPs proteins were found at the level of the tail gene cluster around 55,000 bp to 84,000 bp and more precisely at the “flat base” part.
Les protéines RBPs des phages 2, 3 et 7 ont ensuite été produites dans la bactérie BL21 par la technique de clonage. Pour cela, les gènes correspondants aux protéines de phages ont été clonés dans un vecteur d’expression bactérien permettant la synthèse des protéines en fusion avec l’enzyme Glutathione-S-Transférase (GST) par la bactérie hôte BL21.The RBPs proteins of phages 2, 3 and 7 were then produced in the bacterium BL21 by the cloning technique. For this, the genes corresponding to the phage proteins were cloned into a bacterial expression vector allowing the synthesis of proteins in fusion with the enzyme Glutathione-S-Transferase (GST) by the host bacterium BL21.
Évaluation de la spécificité de liaison des protéines de phages àS. aureus Assessing phage protein binding specificity to S. aureus
Après purification, les protéines ont été séparément conjuguées avec des billes magnétiques de manière à ce que la surface de ces billes soit par l’une des protéines RBP.After purification, the proteins were separately conjugated with magnetic beads so that the surface of these beads was by one of the RBP proteins.
Pour évaluer la spécificité de liaison de chacune de ces protéines à l’espèce bactérienne S. aureus, les billes magnétiques conjuguées aux protéines à tester ont été séparément ajoutées à un mélange de bactéries comprenant différentes espèces deStaphylocoques (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis et Staphylococcus algnetis).To assess the binding specificity of each of these proteins to the bacterial species S. aureus, the magnetic beads conjugated to the proteins to be tested were separately added to a mixture of bacteria comprising different species of Staphylococci (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus algnetis ).
S’il y a une interaction spécifique (une affinité) entre la protéine testée et une ou plusieurs espèces bactériennes du mélange, la protéine va capturer le ou les bactéries.If there is a specific interaction (affinity) between the tested protein and one or more bacterial species in the mixture, the protein will capture the bacteria(s).
Les billes sont ensuite séparées de la phase liquide grâce à un support aimanté, et lavées plusieurs fois avec une solution tampon afin d’éliminer les interactions non spécifiques.The beads are then separated from the liquid phase using a magnetic support, and washed several times with a buffer solution in order to eliminate non-specific interactions.
Les billes sont ensuite récupérées et étalées en boite de Pétri sur une gélose spécifique (Baird Parker). Après incubation, les espèces bactériennes fixées par les protéines sont identifiées visuellement selon la morphologie et la couleur des colonies se développant sur gélose. Le nombre de bactéries retenues est également déterminé par dénombrement des colonies sur la gélose. L’affinité ou l’interaction de la protéine testée avec la bactérie cible (S. aureus) est évaluée par le nombre de bactéries retenues. Plus le nombre de bactéries cibles sur la gélose est élevé, plus l’affinité de la protéine pour la bactérie cible est grande.The beads are then recovered and spread in a Petri dish on a specific agar (Baird Parker). After incubation, the bacterial species fixed by the proteins are visually identified according to the morphology and the color of the colonies developing on agar. The number of bacteria retained is also determined by counting the colonies on the agar. The affinity or the interaction of the protein tested with the target bacterium ( S. aureus ) is evaluated by the number of bacteria retained. The higher the number of target bacteria on the agar, the greater the affinity of the protein for the target bacteria.
2.3. Résultats2.3. Results
L’expression des protéines RBP des phages 2, 3 et 7 dans les bactéries BL21 a été vérifiée sur gel (
La spécificité de liaison de ces protéines à l’espèce bactérienne S. aureus a ensuite été étudiée. Les résultats ont montré que la protéine RBP gp68 du phage 2 a une affinité pour la bactérie Staphylococcus aureus et uniquement pour cette espèce de Staphylocoque. De plus, les résultats en
Exemple 3 : différents modes de réalisationExample 3: different embodiments
Selon un mode de réalisation, la bandelette de détection d’une bactérie, en particulier deS. aureus, par une bandelette, est composée de 4 parties, avec dans l’ordre :According to one embodiment, the strip for detecting a bacterium, in particular S. aureus , by a strip, is composed of 4 parts, with in order:
- une partie de contact (sample pad) ;a contact part (sample pad);
- une partie de marquage (conjugate pad) ;a marking part (conjugate pad);
- une partie de détection (test pad) ;a detection part (test pad);
- une partie absorbante (absorption pad) ; destinée à absorber l’excès des réactifs ou des solutions ; dans laquelle l’une des extrémités de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de contact, l’autre extrémité de la partie de marquage est superposée avec l’une des extrémités de la partie de détection, et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante, pour former respectivement une première, une seconde et une troisième zone de superposition, lesdites zones de superposition étant séparées les unes des autres.an absorbent part (absorption pad); designed to absorb excess reagents or solutions; wherein one of the ends of the marking part is overlapped with one of the ends of the contact part, the other end of the marking part is overlapped with one of the ends of the detection part, and the other end of the detection part is superimposed with one of the ends of the absorbent part, to respectively form a first, a second and a third superposition zone, said superposition zones being separated from each other.
La partie de contact (sample pad) comprend une zone de contact destinée à être mise en contact avec l’échantillon. En particulier, cette zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la partie de contact et la zone de contact ont la même composition. Elles sont composées d’une matrice capillaire destinée à promouvoir et à répartir uniformément l'échantillon pour sa migration par capillarité. En effet, lors de la mise en contact de la zone de contact avec l’échantillon, un flux de migration de l’échantillon par capillarité, de la partie de contact jusqu’à la partie absorbante, s’instaure.The contact part (sample pad) comprises a contact zone intended to be brought into contact with the sample. In particular, this contact zone is distinct from the first superposition zone. In particular, the contact part and the contact zone have the same composition. They are composed of a capillary matrix intended to promote and evenly distribute the sample for its migration by capillarity. Indeed, when the contact zone is brought into contact with the sample, a migration flow of the sample by capillarity, from the contact part to the absorbent part, is established.
La partie de marquage (Conjugate pad) comprend une zone de marquage où est déposée un ligand conjugué à un marqueur et capable de se lier spécifiquement à la bactérie d’intérêt. En particulier, le marqueur est une nanoparticule d’or (AuNP). En particulier, le ligand est un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt. En particulier, la zone de marquage est sur la partie de marquage, entre la première et la deuxième zone de superposition.The labeling part (Conjugate pad) includes a labeling area where a ligand conjugated to a label and capable of binding specifically to the bacterium of interest is deposited. In particular, the marker is a gold nanoparticle (AuNP). In particular, the ligand is an antibody directed against the bacterium of interest. In particular, the marking zone is on the marking part, between the first and the second overlapping zone.
Lorsque le liquide de l’échantillon au travers de la zone de marquage, le ligand marqué se fixe sur la bactérie, formant ainsi un complexe bactérie/ligand marqué. Ledit complexe est ensuite entrainé par le flux de migration au travers de la partie de marquage, puis au travers de la partie de détection.When the sample fluid passes through the labeling area, the labeled ligand binds to the bacterium, forming a bacterium/labeled ligand complex. Said complex is then entrained by the migration flow through the labeling part, then through the detection part.
La partie de détection comprend une zone de détection, où est immobilisé un phage spécifique de la bactérie d’intérêt ou une protéine d’un phage spécifique de la bactérie d’intérêt. En particulier, la zone de détection est sur la partie de détection, entre la deuxième et de la troisième zone de superposition.The detection part comprises a detection zone, where a phage specific to the bacterium of interest or a protein of a phage specific to the bacterium of interest is immobilized. In particular, the detection zone is on the detection part, between the second and the third overlapping zone.
Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est une ligne transversale à la bandelette, lors le liquide est dirigé vers la zone de test, les bactéries colorées par un marquage sont captées par les phages/protéines de phages entrainant une zone de coloration liée au blocage des bactéries à la ligne de test.In a particular embodiment, the detection zone is a line transverse to the strip, when the liquid is directed towards the test zone, the bacteria stained by a label are picked up by the phages / phage proteins resulting in a coloring zone related to bacteria blockage at the test line.
En particulier, la partie de détection et la zone de détection ont la même composition. Elles sont composées d’une membrane, plus particulièrement d’une membrane de nitrocellulose.In particular, the detection part and the detection zone have the same composition. They are composed of a membrane, more specifically a nitrocellulose membrane.
Au passage de la ligne de test, les complexes bactérie/ligand marqué sont immobilisés par la ligne de test.When passing the test line, the bacteria/labeled ligand complexes are immobilized by the test line.
La présence de l’analyte est alors révélée grâce au marqueur, par l’apparition d’un signal visuel sur la bandelette. En particulier, lorsque le marqueur est une nanoparticule d’or, l’accumulation des AuNP sur la zone de migration jusqu’à la ligne de test entraine l’apparition d’un signal visuel, en particulier de couleur rose.The presence of the analyte is then revealed thanks to the marker, by the appearance of a visual signal on the strip. In particular, when the marker is a gold nanoparticle, the accumulation of AuNPs on the migration zone up to the test line leads to the appearance of a visual signal, in particular of pink color.
La
- une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon à tester ;a contact part comprising a contact zone with the sample to be tested;
- une partie de marquage comprenant une zone de marquage où est déposée un anticorps dirigé contreS. aureusmarqué avec une nanoparticule d’or (AuNP) ;a labeling part comprising a labeling zone where an antibody directed against S. aureus labeled with a gold nanoparticle (AuNP) is deposited;
- une partie de détection comprenant une zone de détection de S. aureus, où est immobilisé un bactériophage spécifique deS. aureusou une protéine d’un bactériophage spécifique deS. aureus,a detection part comprising an S. aureus detection zone, where a bacteriophage specific for S. aureus or a bacteriophage protein specific for S. aureus is immobilized,
- une partie absorbante.an absorbent part.
En particulier le premier ligand est marqué avec une nanoparticule d’or. Le signal visuel sera l’apparition d’une couleur rose le long de la bandelette.In particular, the first ligand is labeled with a gold nanoparticle. The visual signal will be the appearance of a pink color along the strip.
Exemple 4 : système bandeletteExample 4: strip system
Le système bandelette de détection de la bactérie selon l’invention est une bandelette que les phages et les protéines de phages peuvent être utilisés. Dans le système de bandelette selon l’invention, la fixation des phages ou les protéines de phages en utilisant la solution spécifique qui entraine une réponse de la présence de la bactérie par un blocage de la migration due aux phages ou à la protéine fixée sur la membrane.The bacteria detection strip system according to the invention is a strip that phages and phage proteins can be used. In the strip system according to the invention, the fixing of the phages or the phage proteins using the specific solution which causes a response of the presence of the bacterium by blocking the migration due to the phages or the protein fixed on the membrane.
La fixation des protéines des phages peut capter les bactéries. La présence de la bactérie est traduite par le blocage de la migration (
Dans le cadre de cet exemple le composé A est BSA. Il est utilisé à la concentration de 2 mg/mL, le composé B est MgSO4. Il est utilisé à la concentration de 50 mM.In the context of this example, compound A is BSA. It is used at a concentration of 2 mg/mL, compound B is MgSO 4 . It is used at a concentration of 50 mM.
La
Le système de bandelette a permis de détecter les bactéries à 103UFC/mL dans un échantillon de lait cru (
Conclusion :Conclusion :
Le système de bandelette selon l’invention est basé sur la fixation des phages ou des protéines de phages utilisant la formulation spécifique de fixation des phages ou des protéines de phages ; le signal traduisant la présence de la bactérie n’est pas représenté par une ligne de couleur comme dans le système classique mais par un blocage de la migration. Ce type de signal n’est jamais observé dans la littérature et ni sur le marché.The strip system according to the invention is based on phage or phage protein binding using the specific phage or phage protein binding formulation; the signal reflecting the presence of the bacterium is not represented by a colored line as in the classic system but by a blocking of migration. This type of signal is never observed in the literature or on the market.
La sensibilité de détection fait la différence essentielle entre le système classique et le système de l’invention.The detection sensitivity makes the essential difference between the conventional system and the system of the invention.
Exemple 5 : mode de réalisation ELISAExample 5: ELISA embodiment
Le principe de l’ELISA consiste à piéger, entre un « anticorps de capture » et un « anticorps de détection », les analytes (antigènes, bactéries, virus, etc…). La spécificité du système de détection de la présente invention par rapport au système ELISA classique est le remplacement d’un ou des deux anticorps par les phages ou les protéines de phages.The principle of ELISA consists in trapping, between a "capture antibody" and a "detection antibody", the analytes (antigens, bacteria, viruses, etc.). The specificity of the detection system of the present invention compared to the conventional ELISA system is the replacement of one or both antibodies by phages or phage proteins.
Les phages ou les protéines de phages sont préparés dans un tampon de coating contenant du MgSO4(50 mM) et BSA (2 mg/mL). La solution est répartie dans les puits d’une plaque de microtitration. La plaque est ensuite couverte et placée dans une enceinte à 4°C durant une nuit.The phages or the phage proteins are prepared in a coating buffer containing MgSO 4 (50 mM) and BSA (2 mg/mL). The solution is distributed in the wells of a microtiter plate. The plate is then covered and placed in an enclosure at 4° C. overnight.
Le lendemain chaque puit plusieurs fois (au moins 3 fois) avec un tampon de rinçage (Tampon PBS contient optionnellement Tween 0,5%).The following day each well several times (at least 3 times) with a rinsing buffer (PBS buffer optionally contains Tween 0.5%).
Optionnellement, les interactions non spécifiques sont ensuite bloquées avec un tampon de saturation.Optionally, non-specific interactions are then blocked with a saturation buffer.
L’échantillon contenant potentiellement des bactéries est distribué à raison de 100 µl d’échantillon dans chaque puits. Une incubation d’une heure à température ambiante suit. L’échantillon est éliminé et les puits sont rincés au moins 3 fois fois avec le Tampon de rinçage (Tampon PBS contient optionnellement du Tween 0,5%).The sample potentially containing bacteria is distributed at a rate of 100 µl of sample in each well. A one-hour incubation at room temperature follows. The sample is removed and the wells are rinsed at least 3 times with Rinse Buffer (PBS Buffer optionally contains 0.5% Tween).
L’anticorps anti-S . aureus,Staphylococcus aureusRabbit Polyclonal Antibody fourni par Thermofisher (Réf. 11578351), conjugué à HRP est ajouté. Une incubation au moins 30 min à T° de 4°C à 37°C.The antibody to S. aureus , Staphylococcus aureus Rabbit Polyclonal Antibody supplied by Thermofisher (Ref. 11578351), conjugated to HRP is added. Incubation at least 30 min at T° from 4°C to 37°C.
La solution d’anticorps est éliminée et les puits sont rincés au moins 3 fois avec le tampon de rinçage (Tampon PBS qui contient optionnellement Tween 0,5%).The antibody solution is removed and the wells are rinsed at least 3 times with the rinsing buffer (PBS buffer which optionally contains Tween 0.5%).
La révélation de la présence de bactérie est faite par l’ajout de TMB (prêt à l’emploi).The presence of bacteria is revealed by adding TMB (ready to use).
La réaction est stoppée par ajout de 100 µL d’acide sulfurique à 1 M.The reaction is stopped by adding 100 µL of 1 M sulfuric acid.
Une lecture de la densité optique est faite (Figure 10). La fixation des phages où des protéines de phages ont été effectuée dans la solution contenant à la fois les deux composés A et B (Formulation spécifique).A reading of the optical density is taken (Figure 10). The fixation of the phages or phage proteins was carried out in the solution containing both the two compounds A and B (specific formulation).
Les principales étapes du test :The main stages of the test:
INTERPRETATION DES RESULTATS/ANALYSEINTERPRETATION OF RESULTS/ANALYSIS
Le lecteur de plaque donne des densités optiques (DO) correspondantes à chaque puit, à extraire dans un tableur pour le traitement. La détermination des concentrations se fait selon les étapes suivantes :The plate reader gives corresponding optical densities (OD) to each well, to be extracted into a spreadsheet for processing. The determination of the concentrations is done according to the following steps:
- Soustraire de chaque DO à la DO correspondant au 0 (DO du tampon)Subtract from each OD the OD corresponding to 0 (buffer OD)
- Déterminer l’équation de la gamme (qui généralement est linéaire, avec les concentrations de gamme X et les DO correspondantes en Y) : DO=A*[C] + BDetermine the equation of the range (which is generally linear, with the concentrations of range X and the corresponding DOs in Y): DO=A*[C] + B
- À partir de cette équation de gamme (Figure 11) déterminer les concentrations en introduisant les valeurs de DO obtenues pour les échantillons. Ramener ces concentrations aux valeurs réelles en fonction de la dilution de l’échantillon opérée.From this range equation (Figure 11) determine the concentrations by introducing the OD values obtained for the samples. Reduce these concentrations to the real values according to the dilution of the sample operated.
La détection de S. aureus en utilisant la protéine de phages S. aureus pour la capture (fixé au puits des plaques) et un anticorps anti-S. aureus couplé au HRP pour la révélation par TMB. Le système a permis d’une détection de S. aureus à un seuil entre 102 à 103 bactéries/mL (Figure 10).Detection of S. aureus using S. aureus phage protein for capture (attached to plate wells) and anti-S. aureus coupled to HRP for revelation by TMB. The system allowed detection of S. aureus at a threshold between 102 to 103 bacteria/mL (Figure 10).
Références à du matériel biologique déposéReferences to deposited biological material
Dans la présente demande, il est fait référence aux souches de bactériophages suivantes, déposées à la CNCM le 21 Mars 2019 par Vetophage SAS:In this application, reference is made to the following bacteriophage strains, filed at the CNCM on March 21, 2019 by Vetophage SAS:
- phage 2, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage – phi 2 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM I-5408 » ;phage 2, identification reference with the CNCM “Vetophage – phi 2”, whose registration number is “CNCM I-5408”;
- phage 3, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage – phi 3 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM I-5409 ».phage 3, identification reference with the CNCM “Vetophage – phi 3”, whose registration number is “CNCM I-5409”.
Dans la présente demande, il est fait référence aux souches de bactériophages suivantes, déposées à la CNCM le 12 février 2020 par Vetophage SAS, :In this application, reference is made to the following strains of bacteriophages, submitted to the CNCM on February 12, 2020 by Vetophage SAS:
- phage 9, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage – phi 9 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM I-5491 » ;phage 9, identification reference with the CNCM “Vetophage – phi 9”, whose registration number is “CNCM I-5491”;
- phage 10, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage – phi 10 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM I-5492 ». phage 10, identification reference with the CNCM “Vetophage – phi 10”, whose registration number is “CNCM I-5492”.
Claims (15)
- la concentration en cation, en particulier MgSO4, dans la solution est comprise entre 5 mM et 300 mM de façon inclusive, et
- la concentration en protéine, en particulier en BSA, dans la solution est comprise entre 0,1 mg/mL à 5 mg/mL de façon inclusive.
- the cation concentration, in particular MgSO4, in the solution is between 5 mM and 300 mM inclusive, and
- the protein concentration, in particular BSA, in the solution is between 0.1 mg/mL to 5 mg/mL inclusively.
- une étape a) de couplage d’un bactériophage ou d’une combinaison de bactériophages ou d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages sur le support solide, ladite étape de couplage consistant à mettre en contact le support avec un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP,
- optionnellement une étape b) d'élimination du ou des bactériophages ou de la ou des protéines de bactériophages non liés au support solide, et
- optionnellement une étape c) de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois.
- a step a) of coupling a bacteriophage or of a combination of bacteriophages or of a protein of bacteriophages or of a combination of proteins of bacteriophages on the solid support, the said coupling step consisting in bringing the support into contact with a bacteriophage or a combination of bacteriophages or a protein of bacteriophages or a combination of proteins of bacteriophages in the presence of a solution comprising a cation and a protein, the bacteriophage protein preferably being an RBP,
- optionally a step b) of eliminating the bacteriophage(s) or the bacteriophage protein(s) not bound to the solid support, and
- optionally a step c) of rinsing, which can be repeated at least once.
- mise en contact de l’échantillon susceptible de contenir des bactéries avec un dispositif selon l’une quelconque des revendications12ou13,
- optionnellement élimination des bactéries non liées aux bactériophages ou aux protéines de bactériophages,
- détection des bactéries liées aux bactériophages ou aux protéines de bactériophages avec un ligand spécifique de la bactérie choisi parmi un bactériophage spécifique de la bactérie marqué, une protéine de bactériophage spécifique de la bactérie marquée, un bactériophage spécifique de la bactérie couplé à un anticorps marqué ou une protéine de bactériophage couplé à un anticorps marqué, et dans lequel ladite étape c) est réalisée en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, ou choisi parmi un anticorps marqué ou un aptamère marqué dirigé contre la bactérie.
- bringing the sample likely to contain bacteria into contact with a device according to any one of claims 12 or 13 ,
- optionally elimination of bacteria not related to bacteriophages or bacteriophage proteins,
- detecting bacteria bound to bacteriophages or bacteriophage proteins with a bacterium-specific ligand selected from labeled bacteriophage-specific bacteriophage, labeled bacteriophage-specific bacteriophage protein, bacteriophage-specific bacteriophage coupled to a labeled antibody or a bacteriophage protein coupled to a labeled antibody, and in which said step c) is carried out in the presence of a solution comprising a cation and a protein, or chosen from among a labeled antibody or a labeled aptamer directed against the bacterium.
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