WO2021225410A1 - 뇌암 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

뇌암 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2021225410A1
WO2021225410A1 PCT/KR2021/005744 KR2021005744W WO2021225410A1 WO 2021225410 A1 WO2021225410 A1 WO 2021225410A1 KR 2021005744 W KR2021005744 W KR 2021005744W WO 2021225410 A1 WO2021225410 A1 WO 2021225410A1
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cancer
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temozolomide
glioblastoma
fatty acid
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PCT/KR2021/005744
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강석구
육종인
김현실
심진경
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연세대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition capable of inhibiting the growth, proliferation, invasiveness and metastasis of brain cancer among cancer cells.
  • Cancer is one of the most common causes of death worldwide. About 10 million new cases occur each year, accounting for about 12% of all deaths, making it the third leading cause of death. Among various types of cancer, especially brain cancer occurs regardless of age, and the incidence rate in children is higher than that of other cancers. Brain cancer is divided into primary brain tumors that occur in the brain tissue and the meninges that surround the brain, and secondary brain tumors that metastasize from cancer that occurs in the skull or other parts of the body. , local symptoms such as balance disturbance, and symptoms of intracranial hypertension.
  • the brain cancer includes various types of cancers, such as glioblastoma multiforme, glioma malignant, lymphadenoma, germ cell tumor, and metastatic tumor, unlike cancers that occur in other tissues where one or two types of cancer are tissue-specific. , among them, glioma, especially glioblastoma, is the most malignant and aggressive, so it has a very poor prognosis, and is a very fatal disease with an average survival period of less than about one year after diagnosis. Since the boundary between brain cells and tumor cells is not clear in patients with glioblastoma, it is known that it is almost impossible to completely remove cancerous tissue surgically.
  • cancers such as glioblastoma multiforme, glioma malignant, lymphadenoma, germ cell tumor, and metastatic tumor, unlike cancers that occur in other tissues where one or two types of cancer are tissue-specific. , among them, glioma, especially glioblastoma, is the most malignant and aggressive
  • glioblastoma contains various genetic mutations, the average survival rate of glioblastoma patients is significantly improved even now that the combination treatment method is used. low, the development of new therapeutic agents is required.
  • glioblastoma exhibits an aggressive variant when compared to other brain tumors, which, if not treated promptly, can have fatal consequences within a few weeks.
  • One object of the present invention relates to a pharmaceutical composition that can effectively prevent or treat invasive or metastatic glioblastoma tumor cells.
  • Another object of the present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting the stem cell ability of glioblastoma tumor cells.
  • references to "in one embodiment” or “an embodiment” in various places throughout this specification do not necessarily refer to the same embodiment of the invention. Additionally, the particular features, forms, compositions, or properties may be combined in any suitable manner in one or more embodiments. Unless specifically defined in the present invention, all scientific and technical terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.
  • the inventors of the present invention found that when an alkylating agent and a fatty acid oxidation inhibitor are administered in combination, the growth, proliferation, invasiveness, metastasis and stem cell ability of cancer cells, especially brain cancer cells, are significantly inhibited. came to the invention.
  • a pharmaceutical composition for inhibiting invasiveness or metastasis of cancer comprising an alkylating agent and a fatty acid oxidation inhibitor as active ingredients.
  • the alkylating agent interferes with cytotoxic action and DNA replication and RNA transcription by alkylating or methylating DNA.
  • it may act non-specifically on the cell cycle to inhibit cell division with high proliferative potential.
  • the alkylating agent is temozolomide (TMZ), cyclophosphamide (Cyclophosphamide), mechlorethamine, chlorambucil (Chlorambucil), melphalan (Melphalan), carmustine (Carmustine, BCNU), Lomustine (CCNU), Ifosfamide, Procarbazine, dacarbazine (DTIC), Altretamine, Cisplatin, Carboplatin ) and may be at least one selected from the group consisting of oxaliplatin, preferably temozolomide, but is not limited thereto.
  • the temozolomide may be included in a concentration of 50 to 1000 ⁇ M.
  • concentration of the temozolomide is 50 to 1000 ⁇ M, it shows a specifically excellent effect in inhibiting cancer invasiveness or metastasis.
  • concentration of temozolomide is less than 50 ⁇ M, the effect of the composition may not be sufficiently exhibited, and when the concentration of temozolomide exceeds 1000 ⁇ M, the toxicity of the composition to normal cells may increase.
  • the fatty acid oxidation inhibitor is a new drug used for the treatment of stable angina pectoris (SAP) chronic renal failure. Inhibits oxidation.
  • the fatty acid oxidation inhibitor may be a carnitine palmitoyltransferase I (CPT1) inhibitor.
  • CPT1 serves to convert fatty acyl-CoA into fatty acyl-carnitine.
  • the CPT1 inhibitor may be one or more selected from the group consisting of etomoxir, oxfenicine, perhexiline and ranolazine, preferably etomoxir. It may be a wooden room, but is not limited thereto.
  • the etomoxil may be included at a concentration of 10 to 500 ⁇ M.
  • concentration of etomoxil is 10 to 500 ⁇ M, it shows a specifically excellent effect in inhibiting cancer invasiveness or metastasis.
  • concentration of etomoxil is less than 10 ⁇ M, the effect of the composition may not be sufficiently exhibited, and when the concentration of etomoxil exceeds 500 ⁇ M, the toxicity of the composition to normal cells may increase.
  • the alkylating agent and the fatty acid oxidation inhibitor may be included in a concentration ratio of 1 to 10:1, preferably in a molar concentration ratio.
  • the alkylating agent and the fatty acid oxidation inhibitor have a concentration ratio of 1 to 10: 1, they show a specifically excellent effect in inhibiting cancer invasiveness or metastasis.
  • the weight ratio of the alkylating agent and the fatty acid oxidation inhibitor is out of the above range, the effect of the composition may not be sufficiently exhibited.
  • tumor or “cancer” is a disease in which the cell cycle is not controlled and continues to divide, and is divided into Carcinoma and Sarcoma depending on the site of occurrence.
  • Carcinoma refers to a malignant tumor that arises from epithelial cells such as mucous membranes and skin
  • sarcoma refers to a malignant tumor that arises from non-epithelial cells such as muscle, connective tissue, bone, cartilage, and blood vessels.
  • the cancer is oral cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, brain cancer, head or neck cancer, tongue cancer, cervical cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, small intestine cancer, rectal cancer, fallopian tube carcinoma, perianal cancer, Endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, lymph gland cancer, bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, kidney cancer, skin cancer It may be at least one selected from the group consisting of, and preferably may be brain cancer, but is not limited thereto.
  • the brain cancer may be glioblastoma (GBM).
  • GBM glioblastoma
  • the "glioblastoma (GBM)” refers to tumors originating from glial cells that are normally abundantly present in brain tissue.
  • glioblastoma is a type of intractable brain tumor, and the average total survival time after diagnosis is only about 15 months.
  • the target of the invasive or metastatic inhibition may be a glioblastoma tumor cell, particularly among glioblastoma cells.
  • the glioblastoma tumorsphere refers to a cell aggregate formed by some cells having characteristics similar to stem cells among the cells constituting the cancer tissue under three-dimensional culture conditions,
  • the diameter size is not particularly limited, but may be, for example, 10 to 500 ⁇ m.
  • the glioblastoma tumor cells the expression level of AXIN2 protein or mRNA, which plays an important role in regulating the stability of beta-catenin in the Wnt signaling pathway, is lower than that of normal tissues or is not expressed. desirable.
  • the pharmaceutical composition may be characterized in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages, and the pharmaceutical composition may be characterized in that it is intended for humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, but each can be formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, fragrances, etc., for oral administration, and in the case of injections, buffers, preservatives, pain-freezing agents A topical agent, solubilizer, isotonic agent, stabilizer, etc.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in the form of unit dose ampoules or multiple doses. have.
  • it can be formulated as a solution, suspension, tablet, capsule, sustained release formulation, and the like.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil may be used.
  • fillers, anti-agglomeration agents, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may be further included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited thereto, but oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical , sublingual or rectal, but oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be administered in the form of a suppository for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention depends on several factors including the activity of the specific compound used, age, weight, general health, sex, diet, administration time, administration route, excretion rate, drug formulation, and the severity of the specific disease to be prevented or treated.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but may be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 to 50 mg/day per day kg or 0.001 to 50 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, and suspensions.
  • a pharmaceutical composition for inhibiting stem cell ability of cancer comprising an alkylating agent and a fatty acid oxidation inhibitor as an active ingredient.
  • the alkylating agent is temozolomide, cyclophosphamide, mechlorethamine, chlorambucil, melphalan, carmustine (Carmustine, BCNU) , Lomustine (CCNU), Ifosfamide, Procarbazine, dacarbazine (DTIC), Altretamine, Cisplatin, Carboplatin, and It may be one or more selected from the group consisting of oxaliplatin, but most preferably temozolomide.
  • the temozolomide may be included in a concentration of 50 to 1000 ⁇ M.
  • concentration of the temozolomide is 50 to 1000 ⁇ M, it shows a specifically excellent effect in inhibiting cancer invasiveness or metastasis.
  • concentration of temozolomide is less than 50 ⁇ M, the effect of the composition may not be sufficiently exhibited, and when the concentration of temozolomide exceeds 1000 ⁇ M, the toxicity of the composition to normal cells may increase.
  • the fatty acid oxidation inhibitor is a new drug used for the treatment of stable angina pectoris (SAP) chronic renal failure. Inhibits oxidation.
  • the fatty acid oxidation inhibitor may be a carnitine palmitoyltransferase I (CPT1) inhibitor.
  • the CPT1 inhibitor may be at least one selected from the group consisting of etomoxir, oxfenicine, perhexiline and ranolazine, but is not limited thereto.
  • the etomoxil may be included at a concentration of 10 to 500 ⁇ M.
  • concentration of etomoxil is 10 to 500 ⁇ M, it shows a specifically excellent effect in inhibiting cancer invasiveness or metastasis.
  • concentration of etomoxil is less than 10 ⁇ M, the effect of the composition may not be sufficiently exhibited, and when the concentration of etomoxil exceeds 500 ⁇ M, the toxicity of the composition to normal cells may increase.
  • the alkylating agent and the fatty acid oxidation inhibitor may be included in a concentration ratio of 1 to 10:1, preferably in a molar concentration ratio.
  • the alkylating agent and the fatty acid oxidation inhibitor have a concentration ratio of 1 to 10: 1, they show a specifically excellent effect in inhibiting cancer invasiveness or metastasis.
  • the weight ratio of the alkylating agent and the fatty acid oxidation inhibitor is out of the above range, the effect of the composition may not be sufficiently exhibited.
  • the cancer is oral cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, brain cancer, head or neck cancer, tongue cancer, cervical cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, small intestine cancer, rectal cancer, fallopian tube carcinoma, perianal cancer, Endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, lymph gland cancer, bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, kidney cancer, skin cancer It may be at least one selected from the group consisting of, and preferably may be brain cancer, but is not limited thereto.
  • the brain cancer may be glioblastoma (GBM).
  • GBM glioblastoma
  • the cancer that is the target of the inhibition of stem cell ability may be, in particular, glioblastoma tumor cells among glioblastoma cells.
  • the diameter size of the glioblastoma tumor sphere is not particularly limited, but may be, for example, 10 to 500 ⁇ m.
  • the glioblastoma tumor cells the expression level of AXIN2 protein or mRNA, which plays an important role in regulating the stability of beta-catenin in the Wnt signaling pathway, is lower than that of normal tissues or is not expressed. desirable.
  • the "stem cell ability of cancer” means the ability to generate a tumor with cancer cells (tumorigenic).
  • Current cancer treatment methods most often proceed on a part of the tumor mass, and do not necessarily select drugs that have activity against stem cell capacity. Therefore, general chemotherapy, which leaves the stem cell capacity of cancer, does not create new cells, but kills differentiated or differentiated cells that make up the majority of tumors, and the generated cancer stem cell part remains as it is, which may cause recurrence. have. Therefore, it is expected that if the stem cell ability of cancer is suppressed, the risk of recurrence after cancer treatment can be lowered.
  • Cancer stem cells generally have the ability of cancer stem cells.
  • the cancer stem cells (Cancer Stem CELL, Tumor Initiating Cells; CSC, TICs) were discovered by Bonnet and Dick in 1997 by isolating a subset of leukocyte cells expressing CD34 without expressing the surface marker CD38.
  • it relates to a method for inhibiting invasiveness or metastasis of cancer, comprising administering an alkylating agent and a fatty acid oxidation inhibitor to an individual in need of administration.
  • the "individual” refers to an individual having cancer or suspected of having cancer, and refers to mammals including mice, livestock, etc. do.
  • the "combination administration" of the alkylating agent and the fatty acid oxidation inhibitor refers to simultaneous, separate or sequential administration. If the administration is sequential or separate, the interval between administration of the second component should be such that the beneficial effect of the combination is not lost.
  • the definition, concentration and concentration ratio of the alkylating agent and the fatty acid oxidation inhibitor, the definition of cancer, the route of administration, the method and the dose, etc. overlap with those described in the previous composition, so that excessive The description is omitted to avoid complexity.
  • it relates to a method of inhibiting stem cell ability of cancer, comprising administering to an individual in need of administration, an alkylating agent and a fatty acid oxidation inhibitor.
  • the definition, concentration and concentration ratio of the alkylating agent and the fatty acid oxidation inhibitor, the definition of cancer, the route of administration, the method and the dose are overlapped with those described in the previous composition, and other individuals
  • the definition of concomitant administration overlaps with that described in the method for inhibiting invasive or metastasis of cancer, and the description thereof is omitted to avoid excessive complexity of the following specification.
  • the pharmaceutical composition provided in the present invention can inhibit the invasiveness or metastasis of glioblastoma, particularly glioblastoma tumor cells, and can also effectively inhibit stem cell ability.
  • TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells are a glioblastoma tumor cell TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells, respectively, after administration of temozolomide (TMZ) and etomoxir (Etomoxir) alone or a mixture thereof
  • TTZ temozolomide
  • Etomoxir etomoxir
  • Figure 2 shows glioblastoma tumor cells, TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells, respectively, after administration of temozolomide (TMZ) and etomoxir alone or a mixture thereof.
  • TMZ temozolomide
  • etomoxir alone or a mixture thereof.
  • the result of analyzing the change in cell viability according to the concentration is shown as a graph.
  • FIG. 3 shows the ratio of the number of wells in which tumorspheres are formed to the total number of wells by photographing the tumorisphere-forming ability of glioblastoma tumorocytes, TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells, respectively, using a phase-contrast microscope. shown graphically.
  • FIG. 4 shows photographs taken with a phase-contrast microscope to confirm the tumor formation ability and tumor diameter of glioblastoma tumor cells, TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells, respectively.
  • FIG. 5 is a graph showing the size of tumor cells in the wells in which the tumor cells are formed by imaging the tumorigenicity of each of the glioblastoma tumor cells, TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells, using a phase-contrast microscope. will be.
  • Figure 6 is a western blot after treatment with temozolomide and etomoxir alone or a mixture of TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells, respectively, which are glioblastoma tumorocytes.
  • nestin Neestin
  • Sox2, PDPN, Msi-1, CD44, Bmi-1 shows the results.
  • Figure 7 is glioblastoma tumor cells TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells, respectively, after treatment with temozolomide and etomoxir alone or a mixture thereof.
  • the picture shows the cells taken with a phase-contrast microscope in order to check the shape change of the cells.
  • Figure 8 is glioblastoma tumor cell TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells, respectively, after treatment with temozolomide and etomoxir alone or a mixture thereof.
  • the change in the invasion area of the tumor cells is shown as a graph.
  • TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells are glioblastoma tumorocytes.
  • TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells are glioblastoma tumorocytes.
  • FIG. 10 shows the results of confirming the change in the transcription profile by RNA sequencing after treating glioblastoma tumor cells with temozolomide and etomoxir alone or a mixture thereof.
  • Figure 11 shows the change in mRNA expression level of stem cell ability (stemness) or invasiveness-related genes after treatment of glioblastoma tumor cells with temozolomide and etomoxir alone or a mixture thereof. The results of the analysis are shown.
  • alkylating agent temozolomide
  • TMZ temozolomide
  • Fatty acid oxidation inhibitor preferably etomoxil (Etomoxir)
  • brain cancer preferably glioblastoma tumor cell invasiveness, metastatic or stem cell activity inhibition pharmaceutical composition comprising as an active ingredient; .
  • Curr Probl Cancer 32 124-142; Kong BH, Park NR, Shim JK, Kim BK, Shin HJ, Lee JH, Huh YM, Lee SJ, Kim SH, Kim EH, Park EK, Chang JH, Kim DS, Kim SH, Hong YK, Kang SG, Lang FF (2013) Isolation of glioma cancer stem cells in relation to histological grades in glioma specimens.
  • EGF epidermal growth factor
  • streptomycin Gibco, Grand Island, NY, USA
  • FIG. 1 The effect of the administration of temozolomide and etomoxir on the cellular activity of patient-derived cells TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 is shown in FIG. 1 . .
  • the cells were inoculated into 96 wells at 1 ⁇ 10 4 cells/150 ⁇ L, respectively, and treated with temozolomide and etomoxir for 72 hours at each concentration, followed by an ATP assay. ) was confirmed. According to the ATP assay, the ability of administration of temozolomide and etomoxir to inhibit ATP production, a cellular energy source, was evaluated.
  • a measurement kit was used to evaluate ATP production, and 1 temozolomide 250 ⁇ M alone, 2 Etomoxir 100 ⁇ M alone, 3 temozolomide 250 ⁇ M, etomoxil ( Etomoxir) 100 ⁇ M co-administered, and after 72 hours of treatment, the absorbance was measured by adding an assay reagent (CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, Cat# G7572, Promega), and the results are shown in FIG. 1 .
  • an assay reagent CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
  • ATP assay uses luciferase to promote the formation of light from ATP and D-luciferin, and is a method of measuring cell activity as a result of measurement with a luminometer or a beta counter. The ability to inhibit the generation of ATP, which is an energy source, can be evaluated.
  • ATP production inhibitory activity was confirmed in TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 cells with respect to each administration of temozolomide and etomoxir.
  • TS15-88 and TS14-15 were about 20% in the group treated with temozolomide and etomoxir compared to the untreated control group, and TS14-08 was Temo compared to the untreated control group. About 15% in the group treated with the combination of temozolomide and etomoxir, and about 35% in the group treated with temozolomide and etomoxir compared to the control group without TS13-64. It was confirmed that the level of ATP decreased.
  • the cells were seeded into 96 wells with 1 ⁇ 10 4 cells/150 ⁇ L, respectively, 1 temozolomide 250 ⁇ M alone, 2 etomoxir 100 ⁇ M alone, 3 temozolomide (Temozolomide) 250 ⁇ M and etomoxir 100 ⁇ M were co-administered and treated for 72 hours, and then confirmed by WST assay, and the results are shown in FIG. 2 .
  • WST assay is a method for quantifying cell proliferation or cell viability, and it means that the formation of a chromogenic substance called formazan from Tetrazolium Salts by intracellular mitochondrial dehydrogenase is measured by ELISA. It is due to the succinate-tetrazolium reductase system, a dehydrogenase present in the mitochondrial electron transport system of cells that are metabolically active, and is effective only in living cells. Represents a linear correlation.
  • TS15-88, TS14-15, TS14-08 was about 30% in the combination treatment group of temozolomide and etomoxir compared to the untreated control group
  • TS13-64 was Compared to the untreated control group, the cell activation ability was reduced by about 25% in the combined treatment group of temozolomide and etomoxir. That is, compared to the group in which temozolomide and etomoxir were administered to TS15-88, TS14-15 and TS14-08, temozolomide and etomoxir were administered in combination. It was confirmed that the cell activation ability was decreased in one group.
  • the number of wells in which spheres were formed was measured, and the ratio of wells in which spheres were formed in the treated group compared to the untreated control group was calculated, and the results are shown as a percentage in FIG. 3 .
  • 1 ⁇ B27 supplement (Invitrogen, San Diego, CA, USA), basic fibroblast growth factor (bFGF) 20 ng/ml, epidermal growth factor (EGF) 20 ng/ml, and 50 U/ml penicillin/ml Tumor cells were cultured in DMEM/F-12 medium containing 50 mg/ml streptomycin.
  • GBM glioblastoma
  • accutase accutase
  • 10 single cells were seeded into 96-well plates and TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-
  • TS15-88 As shown in FIG. 3, in TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64, when temozolomide and etomoxir were co-administered, tumor cells compared to the case of single administration The proportion of wells in which were formed was low. Specifically, TS15-88 was about 35% in the group treated with temozolomide and etomoxir compared to the untreated control group, and TS14-08 was temozolomide compared to the untreated control group. About 95% of neurospheres in the group treated with the combination of Etomoxir and TS14-15 and TS13-64 were 100% in the group treated with Temozolomide and Etomoxir compared to the untreated control group. By inhibiting neurosphere formation, it was confirmed that the tumor cell suppression ability was excellent.
  • the diameter of the tumor spheres decreased, especially when temozolomide and etomoxir were co-administered. , the tumor sphere diameter was significantly reduced compared to the case of single administration. Specifically, TS15-88 was about 40% in the group treated with TMZ and Etomoxir compared to the untreated control group, and TS14-08 was treated with temozolomide and etomoxir in combination compared to the untreated control group.
  • TS14-15 and TS13-64 reduced the tumor sphere diameter (neurosphere radius) by 100% in the group treated with temozolomide and etomoxir compared to the untreated control group Thus, it was confirmed that the tumor cell suppression ability was excellent.
  • a 3D invasion assay was used to confirm the invasiveness of tumorocyte cells. Specifically, each well of a 96-well plate was filled with a mixed Matrigel matrix composed of Matrigel, Type I Collagen (Corning) and Tumorsphere Complete Medium. The matrix was inoculated with single spheroids prior to gelation. After 30 minutes, in order to prevent the gelled matrix from drying out, tumor cell complete medium was supplemented in an amount of 50 ⁇ l per well. An image was taken as shown in FIG. 7 using a phase-contrast microscope, and the result is shown as a graph in FIG. 8 .
  • TS15-88, TS14-15, TS14-08 and TS13-64 GBM tumorocyte cells were treated with temozolomide or etomoxir alone compared to the case of these It can be seen that the invasiveness of tumor cells was significantly reduced when the mixture was treated.
  • TS15-88 was about 45% in the group treated with temozolomide and etomoxir compared to the untreated control group
  • TS14-15 was temozolomide and etomoxil compared to the control group.
  • Etomoxir about 55%
  • TS14-08 compared to the control group
  • temozolomide and etomoxir about 50%
  • TS13-64 compared to the control group
  • about 50% temozolomide (Temozolomide) and etomoxir (Etomoxir) in the combined treatment group was found to suppress the invasiveness (invasiveness) of 35%.
  • the change in the transcriptional profile was analyzed through RNA sequencing, and the results are shown in FIG. 10 .
  • the results of analyzing the changes in the mRNA expression level of the stem cell ability (stemness) and invasiveness (invasiveness) related genes are shown in FIG. 11 .
  • temozolomide and etomoxir were administered in combination according to the present invention, the growth of the already formed tumorocyte cells was more effectively inhibited than when they were administered alone.
  • the formation ability, ie, proliferation, was also inhibited, but most significantly, the invasiveness was significantly inhibited beyond a level that was difficult to predict.
  • cancer progression is slowed, and cancer invasion, metastasis, and stem cell ability can be significantly inhibited.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition and method for inhibiting the invasiveness or metastasis of cancer, particularly brain cancer.

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Abstract

본 발명은 암 중에서도 특히 뇌암의 전이성, 침윤성 및 줄기세포능을 억제할 수 있는 약학적 조성물에 관한 것으로, 알킬화제 및 지방산 산화 억제제를 유효 성분으로 포함할 수 있다.

Description

뇌암 치료용 약학적 조성물
본 발명은 암 세포 중에서도 특히 뇌암의 성장, 증식, 침윤성 및 전이성을 억제할 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 가장 보편적인 사망원인 중의 하나이다. 약 천만 건의 새로운 케이스가 매년 발생하며, 전체 사망원인의 약 12%를 차지하여 세 번째로 많은 사망의 원인이 되고 있다. 여러 가지 종류의 암 중에서 특히 뇌암은 연령에 관계없이 발생되며, 소아에 발생 빈도가 다른 암에 비하여 높은 특징이 있다. 뇌암은 뇌조직과 뇌를 싸고 있는 뇌막에서 발생되는 일차성 뇌종양과 두개골이나 신체의 다른 부위에서 발생된 암으로부터 전이된 이차성 뇌종양으로 구별되는데, 증세로는 운동 마비, 지각마비, 언어 장애, 시력 장애, 평형 장애 등과 같은 국소 증상과 두개내압항진 증상을 들 수 있다. 상기 뇌암은 조직특이적으로 1 내지 2종의 암이 발병되는 다른 조직에서 발병되는 암과는 달리 다형성아교모세포종, 악성신경교종, 임파선종, 배아세포종, 전이성 종양 등의 다양한 종류의 암을 포함하는데, 이 중에서도 신경교종(glioma), 특히 교모세포종(glioblastoma)은 가장 악성이고 공격적이어서 예후가 매우 좋지 않으며, 진단 후 평균 생존 기간이 약 1년을 넘지 못하는 매우 치명적인 질환이다. 상기 교모세포종이 발병된 환자에서는 뇌세포와 종양세포 간의 경계가 분명하지 않기 때문에, 암 조직을 외과적으로 완전히 제거하는 것은 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.
이에, 상기 교모세포종을 치료하는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구가 수행되고 있지만, 교모세포종은 다양한 유전적 돌연변이를 포함하기 때문에, 상기 병용 치료 방법이 사용되고 있는 현재에도 교모세포종 환자의 평균 생존율이 현저히 낮아, 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있다.
한편, 상기 뇌 종양의 경우, 뇌혈관 장벽(Brain Blood Barrier)이 존재하기 때문에 치료를 위한 약물 전달이 목적하는 뇌 부위로 전달되기 어려울 뿐만 아니라, 상대적으로 뇌신경 생물학에 대한 이해가 부족하여 치료제 개발이 활발하지 못한 것이 현실이다. 더욱이, 교모세포종은 다른 뇌 종양과 비교해볼 때 공격적 변이(aggressive variant)를 나타내어, 이를 빠른 시일 내에 치료하지 않으면 몇 주 이내에 치명적인 결과를 초래할 수 있다.
특히, 개선되거나 최적화된 교모세포종(GBM)의 줄기세포능 및 전이를 억제하는 치료법에 대한 필요성을 오랫동안 통감하고 있는 실정이다.
본 발명의 일 목적은 교모세포종 종양구의 침윤성 또는 전이성을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 교모세포종 종양구의 줄기세포능 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예에서" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다. 본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 발명자들은 알킬화제(Alkylating agent)와 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)를 병용 투여하는 경우 암 세포 중에서도 특히 뇌암 세포의 성장, 증식, 침윤성, 전이성 및 줄기세포능이 현저히 억제되는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 알킬화제(Alkylating agent) 및 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)를 유효 성분으로 포함하는 암의 침윤성 또는 전이성 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 알킬화제는 DNA를 알킬화 또는 메틸화하여 세포독성 작용 및 DNA 복제와 RNA 전사를 방해하는 것으로, 특히 세포주기에 비특이적으로 작용하여 증식성이 높은 세포분열을 저지하는 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 알킬화제는 테모졸로마이드(Temozolomide; TMZ), 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 메클로레타민(Mechlorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 멜팔란(Melphalan), 카무스틴(Carmustine, BCNU), 로무스틴(Lomustine, CCNU), 이포스파마이드(Ifosfamide), 프로카바진(Procarbazine), 다카바진(Dacarbazine, DTIC), 알트레타민(Altretamine), 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin) 및 옥살리플라틴(Oxaliplatin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 테모졸로마이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 테모졸로마이드는 50 내지 1000μM의 농도로 포함되는 것 일 수 있다. 상기 테모졸로마이드의 농도가 50 내지 1000μM 인 경우, 암 침윤성 또는 전이성을 억제하는데 특이적으로 뛰어난 효과를 보인다. 상기 테모졸로마이드의 농도가 50μM 미만인 경우, 조성물의 효과가 충분하게 나타나지 않을 수 있고, 상기 테모졸로마이드의 농도가 1000μM을 초과하는 경우, 정상 세포에 대한 조성물의 독성이 커질 수 있다.
본 발명에서, 상기 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)는 안정 가슴조임증(stable angina pectoris; SAP) 만성 신부전 치료에 사용되는 새로운 약물로, 상기 지방산 산화 억제제는 미토콘드리아의 피루브산 산화와 포도당의 흡수와 산화를 억제한다. 상기 지방산 산화 억제제는 카르니틴 팔미토일 트랜스퍼라제 I(Carnitine palmitoyltransferase I; CPT1) 억제제일 수 있다. 상기 CPI1은 fatty acyl-CoA를 fatty acyl-carnitine로 전환하는 역할을 한다.
본 발명에서, 상기 CPT1 억제제는 에토목실(Etomoxir), 옥스페니신(Oxfenicine), 퍼헥린(Perhexiline) 및 라놀라진(Ranolazine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 이상일 수 있고, 바람직하게는 에토목실일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 에토목실은 10 내지 500μM의 농도로 포함되는 것일 수 있다. 상기 에토목실의 농도가 10 내지 500μM 인 경우, 암 침윤성 또는 전이성을 억제하는데 특이적으로 뛰어난 효과를 보인다. 상기 에토목실의 농도가 10μM 미만인 경우, 조성물의 효과가 충분하게 나타나지 않을 수 있고, 상기 에토목실의 농도가 500μM을 초과하는 경우, 정상 세포에 대한 조성물의 독성이 커질 수 있다.
본 발명에서, 상기 알킬화제 및 지방산 산화 억제제는 1~10:1의 농도비, 바람직하게는 몰 농도비로 포함될 수 있다. 상기 알킬화제 및 지방산 산화 억제제는 1~10:1의 농도비인 경우, 암 침윤성 또는 전이성을 억제하는데 특이적으로 뛰어난 효과를 보인다. 상기 알킬화제 및 지방산 산화 억제제의 중량비가 상기한 범위를 벗어나는 경우, 조성물의 효과가 충분하게 나타나지 않을 수 있다.
본 발명에서, "종양" 또는 "암"은 세포 주기가 조절되지 않아 세포 분열을 계속하는 질병으로서, 발생 부위에 따라 암종(Carcinoma)과 육종(Sarcoma)으로 나뉜다. 암종(Carcinoma)은 점막, 피부 같은 상피성 세포에서 발생한 악성 종양을 뜻하고, 육종(Sarcoma)은 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 등의 비상피성 세포에서 발생한 악성 종양을 뜻한다.
본 발명에서, 상기 암은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 췌장암, 뇌암, 두부 또는 경부암, 혀암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 신장암, 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 바람직하게는 뇌암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 뇌암은 교모세포종(Glioblastoma; GBM)일 수 있다. 상기 "교모세포종(Glioblastoma; GBM)"은 정상적으로 뇌조직에 풍부하게 존재하고 있는 신경교세포에서 기원한 종양을 통틀어 일컫는다. 또한 교모세포종은 난치성 뇌 종양의 일종으로, 진단 후 평균 총 생존기간이 15개월 정도에 불과하다.
본 발명에서, 상기 침윤성 또는 전이성 억제의 대상이 되는 것은, 교모세포종 세포 중에서도 특히 교모세포종 종양구일 수 있다. 상기 교모세포종 종양구(GBM tumorsphere)는 암 조직을 구성하는 세포 중 줄기세포(stem cells)와 유사한 특성을 가지는 일부의 세포가 3차원 배양 조건에서 형성하는 세포응집체를 의미하며, 상기 교모세포종 종양구의 직경 사이즈는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면 10 내지 500 ㎛일 수 있다.
본 발명에서, 상기 교모세포종 종양구는, Wnt 신호 전달 경로에서 베타 카테닌(beta-catenin)의 안정성을 조절하는 데에 중요한 역할을 하는 AXIN2 단백질 또는 mRNA의 발현 수준이 정상 조직보다 낮거나 발현되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함되나, 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육 내, 관절 내, 활액낭 내, 흉골 내, 경막 내, 병소 내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 알킬화제(Alkylating agent) 및 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)를 유효 성분으로 포함하는 암의 줄기세포능 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 알킬화제는 테모졸로마이드(Temozolomide), 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 메클로레타민(Mechlorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 멜팔란(Melphalan), 카무스틴(Carmustine, BCNU), 로무스틴(Lomustine, CCNU), 이포스파마이드(Ifosfamide), 프로카바진(Procarbazine), 다카바진(Dacarbazine, DTIC), 알트레타민(Altretamine), 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin) 및 옥살리플라틴(Oxaliplatin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 가장 바람직하게는 테모졸로마이드일 수 있다.
본 발명에서, 상기 테모졸로마이드는 50 내지 1000μM의 농도로 포함되는 것일 수 있다. 상기 테모졸로마이드의 농도가 50 내지 1000μM 인 경우, 암 침윤성 또는 전이성을 억제하는데 특이적으로 뛰어난 효과를 보인다. 상기 테모졸로마이드의 농도가 50μM 미만인 경우, 조성물의 효과가 충분하게 나타나지 않을 수 있고, 상기 테모졸로마이드의 농도가 1000μM을 초과하는 경우, 정상 세포에 대한 조성물의 독성이 커질 수 있다.
본 발명에서, 상기 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)는 안정 가슴조임증(stable angina pectoris; SAP) 만성 신부전 치료에 사용되는 새로운 약물로, 상기 지방산 산화 억제제는 미토콘드리아의 피루브산 산화와 포도당의 흡수와 산화를 억제한다. 상기 지방산 산화 억제제는 카르니틴 팔미토일 트랜스퍼라제 I(Carnitine palmitoyltransferase I; CPT1) 억제제일 수 있다.
본 발명에서, 상기 CPT1 억제제는 에토목실(Etomoxir), 옥스페니신(Oxfenicine), 퍼헥린(Perhexiline) 및 라놀라진(Ranolazine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 에토목실은 10 내지 500μM의 농도로 포함되는 것일 수 있다. 상기 에토목실의 농도가 10 내지 500μM 인 경우, 암 침윤성 또는 전이성을 억제하는데 특이적으로 뛰어난 효과를 보인다. 상기 에토목실의 농도가 10μM 미만인 경우, 조성물의 효과가 충분하게 나타나지 않을 수 있고, 상기 에토목실의 농도가 500μM을 초과하는 경우, 정상 세포에 대한 조성물의 독성이 커질 수 있다.
본 발명에서, 상기 알킬화제 및 지방산 산화 억제제는 1~10:1의 농도비, 바람직하게는 몰 농도비로 포함될 수 있다. 상기 알킬화제 및 지방산 산화 억제제는 1~10:1의 농도비인 경우, 암 침윤성 또는 전이성을 억제하는데 특이적으로 뛰어난 효과를 보인다. 상기 알킬화제 및 지방산 산화 억제제의 중량비가 상기한 범위를 벗어나는 경우, 조성물의 효과가 충분하게 나타나지 않을 수 있다.
본 발명에서, 상기 암은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 췌장암, 뇌암, 두부 또는 경부암, 혀암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 신장암, 피부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 바람직하게는 뇌암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 뇌암은 교모세포종(Glioblastoma; GBM)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 줄기세포능 억제의 대상이 되는 암은, 교모세포종 세포 중에서도 특히 교모세포종 종양구일 수 있다. 상기 교모세포종 종양구의 직경 사이즈는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면 10 내지 500 ㎛일 수 있다
본 발명에서, 상기 교모세포종 종양구는, Wnt 신호 전달 경로에서 베타 카테닌(beta-catenin)의 안정성을 조절하는 데에 중요한 역할을 하는 AXIN2 단백질 또는 mRNA의 발현 수준이 정상 조직보다 낮거나 발현되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 상기 "암의 줄기세포능"은 암 세포들로 종양을 생성할 수 있는 능력(tumorigenic)을 의미한다. 현재 존재하는 암 치료 방법은 대부분 흔히 종양 덩어리 일부에 관해 진행하고, 꼭 줄기세포 능력에 대한 활성을 갖는 약을 꼭 선택하지는 않는다. 따라서 암의 줄기세포능을 남겨두는 일반적인 화학요법(Chemotherapy)은 새로운 세포를 생성하지는 않지만 종양의 대부분을 차지하는 분화되었거나 분화중인 세포를 죽이며, 발생된 암 줄기세포 부분은 그대로 남아 재발의 원인이 될 수 있다. 따라서 암의 줄기세포능을 억제할 경우, 암 치료 후 재발의 위험성을 낮출 수 있을 것이라 기대된다. 상기 암의 줄기세포능은 일반적으로 암 줄기세포가 가진다. 상기 암 줄기세포(Cancer Stem CELL, Tumor Initiating Cells; CSC, TICs)는 1997년에 Bonnet 과 Dick이 표면 표지자 CD38를 발현하지 않고 CD34를 발현하는 백혈구 세포 일부 집단을 분리하여 발견하였다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 투여가 필요한 개체에게, 알킬화제(Alkylating agent) 및 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 침윤성 또는 전이성 억제 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "개체"는 암이 발병하였거나 발병이 의심되는 개체로서, 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 의미하나, 본 발명에서 제공하는 유효 물질로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 상기 알킬화제(Alkylating agent) 및 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)의 "병용 투여" 시 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
본 발명의 암의 침윤성 또는 전이성 억제 방법에서, 상기 알킬화제 및 지방산 산화 억제제의 정의, 농도 및 농도비와 암의 정의, 투여 경로, 방법 및 용량 등에 관한 내용은 앞선 조성물에서 기재된 바와 중복되어 이하 명세서의 과도한 복잡을 피하고자 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 투여가 필요한 개체에게, 알킬화제(Alkylating agent) 및 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 줄기세포능 억제 방법에 관한 것이다.
본 발명의 암의 줄기세포능 억제 방법에서, 상기 알킬화제 및 지방산 산화 억제제의 정의, 농도 및 농도비와 암의 정의, 투여 경로, 방법 및 용량 등에 관한 내용은 앞선 조성물에서 기재된 바와 중복되고, 그 외에 개체 및 병용 투여에 관한 정의는 암의 침윤성 또는 전이성 억제 방법에서 기재된 바와 중복되어 이하 명세서의 과도한 복잡을 피하고자 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 제공하는 약학적 조성물은 교모세포종, 특히 교모세포종 종양구의 침윤성 또는 전이성을 억제하고, 줄기세포능 또한 효과적으로 억제할 수 있다.
도 1은 교모세포종 종양구 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 세포 각각에 테모졸로마이드(Temozolomide; TMZ) 및 에토목실(Etomoxir)을 단독 또는 이들 혼합물로 투여한 뒤 처리 농도에 따른 세포 ATP 생성을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 교모세포종 종양구 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 세포 각각에 테모졸로마이드(Temozolomide; TMZ) 및 에토목실(Etomoxir) 단독 또는 이들 혼합물로 투여한 뒤 처리 농도에 따른 세포 생존율의 변화를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 교모세포종 종양구 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 세포 각각에 대한 종양구 형성능을 위상차 현미경으로 촬영하여 전체 웰 수에서 종양구가 형성된 웰 수의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 교모세포종 종양구 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 세포 각각에 대한 종양구 형성능 및 종양구 직경을 확인하기 위하여 위상차 현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 교모세포종 종양구 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 세포 각각에 대한 종양구 형성능을 위상차 현미경으로 촬영하여 종양구가 형성된 웰에서 종양구의 사이즈를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 교모세포종 종양구 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 세포 각각에 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)을 단독 또는 이들 혼합물을 처리한 후 웨스턴 블럿으로 네스틴(Nestin), Sox2, PDPN, Msi-1, CD44, Bmi-1의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 교모세포종 종양구 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 세포 각각에 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)을 단독 또는 이들 혼합물을 처리한 후 종양구 세포의 형상 변화를 확인하기 위하여 위상차 현미경으로 세포를 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 교모세포종 종양구 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 세포 각각에 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)을 단독 또는 이들 혼합물을 처리한 후 종양구 세포의 형상 변화를 확인하기 위하여 종양구 세포의 침윤 면적 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 교모세포종 종양구 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 세포 각각에 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)을 단독 또는 이들 혼합물을 처리한 후 웨스턴 블럿으로 β-카테닌(β-catenin), N-카데린(N-cadherin), 스네일(Snail), Zeb1, Twist의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 교모세포종 종양구 세포에 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)을 단독 또는 이들 혼합물을 처리한 후 RNA 시퀀싱(sequencing)에 의해 전사 프로파일의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 교모세포종 종양구 세포에 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)을 단독 또는 이들 혼합물을 처리한 후 줄기세포능(stemness) 또는 침윤성(invasiveness) 관련 유전자의 mRNA 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 알킬화제(Alkylating agent)로 바람직하게는 테모졸로마이드(Temozolomide; TMZ); 및 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)로 바람직하게는 에토목실(Etomoxir);를 유효 성분으로 포함하는 뇌암, 바람직하게는 교모세포종 종양구의 침윤성, 전이성 또는 줄기세포능 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[준비예] 교모세포종 환자로부터 세포의 분리
이하의 실험은 환자유래 교모세포종 종양구 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64를 사용하여 수행하였다. 임상시험심사위원회에서 승인된 프로토콜에 따라 종래에 알려진 방법을 통해 교모세포종 조직으로부터 유래된 환자 유래 종양구를 획득하였다. (Sulman E, Aldape K, Colman H (2008) Brain tumor stem cells. Curr Probl Cancer 32: 124-142; Kong BH, Park NR, Shim JK, Kim BK, Shin HJ, Lee JH, Huh YM, Lee SJ, Kim SH, Kim EH, Park EK, Chang JH, Kim DS, Kim SH, Hong YK, Kang SG, Lang FF (2013) Isolation of glioma cancer stem cells in relation to histological grades in glioma specimens. Childs Nerv Syst 29: 217-229; Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, Bonn VE, Hawkins C, Squire J, Dirks PB (2003) Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res 63: 5821-5828). 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)에 따라 사전 동의를 받았고, 신경 병리학자는 WHO 분류에 따라 외래적 시료를 진단하였다. 세포 분리 절차는, 외과적 시료를 분쇄한 후 둘베코 변형 이글 배지/햄 F-12 50/50 혼합(DMEM/F-12; Corning Incorporated, NY, USA) 배지에서 메스(scalpel)로 해리한 뒤 100㎛ 나일론 메쉬 세포 스트레이너(cell strainers)(BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)를 통과시켰다. 세포 부유물을 DMEM/F-12에서 2차례 세척하고 1×B27 보충제(Invitrogen, San Diego, CA, USA), 염기성 섬유 아세포 생장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF; Sigma, St. Louis, MO, USA) 20 ng/ml, 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF; Sigma) 20 ng/ml, 및 50 U/ml 페니실린/50 mg/ml 스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 포함하는 완전배지(DMEM/F-12)에서 배양하였다.
[실험예 1] 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)의 단독 또는 병용 처리에 따른 ATP 생성능의 변화 분석
테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir) 투여가 환자 유래 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64의 세포 활성에 미치는 영향을 확인하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.
구체적으로는, 상기 세포들을 각각 1Х104 cells/150μL 로 96 웰(well)에 접종(seeding) 하고 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)을 농도 별로 72시간 동안 처리한 후 ATP 어쎄이(assay)로 확인하였다. ATP 어쎄이에 따라, 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir) 투여가 세포 에너지원인 ATP 생성을 저해하는 능력을 평가하였다. ATP 생성을 평가하기 위해서 측정 키트를 사용하였고, 배양한 세포들에 ① 테모졸로마이드(Temozolomide) 250μM 단독 투여, ② 에토목실(Etomoxir) 100μM 단독 투여, ③ 테모졸로마이드(Temozolomide) 250μM, 에토목실(Etomoxir) 100μM 병용 투여하여 72시간 처리 후 어쎄이 시약(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, Cat# G7572, Promega)을 더해 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.
ATP 어쎄이는, 루시페라제를 이용하여 ATP 및 D-루시페린으로부터의 빛의 형성을 촉진하여, 루미노미터(luminometer) 또는 베타 카운터(Beta Counter)로 측정한 결과로 세포 활성도를 측정하는 방법으로 세포 에너지원인 ATP 생성을 저해하는 능력을 평가할 수 있다.
그 결과, 도 1과 같이, 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir) 각각의 투여에 관하여 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 세포에서 ATP 생성 저해 활성이 확인되었다.
구체적으로 살펴보면, TS15-88과 TS14-15는 무처리한 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 약 20%, TS14-08은 무처리한 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 약 15%, TS13-64는 무처리한 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 약 35% 정도 ATP 수준이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 2] 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)의 단독 또는 병용 처리에 따른 세포 생존율의 변화 분석
테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir) 투여가 환자 유래 세포인 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64의 세포 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
구체적으로는, 상기 세포들을 각각 1Х104 cells/150μL 로 96 웰(well)에 접종(seeding) 하고 ① 테모졸로마이드(Temozolomide) 250μM 단독 투여, ② 에토목실(Etomoxir) 100μM 단독 투여, ③ 테모졸로마이드(Temozolomide) 250μM, 에토목실(Etomoxir) 100μM 병용 투여하여 72시간 동안 처리한 후 WST 어쎄이(assay)로 확인하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
WST 어쎄이는, 세포 증식 능력이나 세포 생존 능력을 정량화하기 위한 방법으로, 세포 내 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 Tetrazolium Salts에서 formazan이라는 발색물질이 생성되는 것을 ELISA로 측정한 것을 의미한다. 대사적으로 왕성한 활동을 하는 세포의 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 탈수소효소인 숙신산염-테트라졸륨 환원 효소 시스템(succinate-tetrazolium reductase system)에 의한 것으로, 살아있는 세포에만 유효하며, 곧 발생 강도가 세포수와 직선 상관 관계를 나타낸다.
도 2에서 보는 바와 같이, TS15-88, TS14-15, TS14-08은 무처리한 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 약 30%, TS13-64는 무처리한 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 약 25% 정도 세포활성 능력이 감소하였다. 즉, TS15-88, TS14-15 및 TS14-08에 대하여 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)을 각각 투여한 군에 비하여, 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)을 병용 투여한 군에서 세포 활성 능력이 감소함을 확인하였다.
[실험예 3] 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)의 단독 또는 병용 처리에 따른 종양구 형성능 변화 분석
배양된 종양구에서, 구(sphere)가 형성된 웰의 수를 측정하고, 무처리한 대조군 대비 처리한 군에서 구가 형성된 웰의 비율을 계산하여 그 결과를 도 3에 퍼센티지로 나타내었다.
구체적으로는, 1×B27 보충제(Invitrogen, San Diego, CA, USA), 염기성 섬유 아세포 생장 인자(bFGF) 20 ng/ml, 표피 성장 인자(EGF) 20 ng/ml, 및 50 U/ml 페니실린/50 mg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F-12 배지에서 종양구 세포를 배양하였다. 아큐타제(accutase)(Gibco)를 사용하여 상기 교모세포종(GBM) 종양구 세포를 해리시킨 뒤 10개의 단일 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 세포 각각에 ① 테모졸로마이드(Temozolomide) 250μM 단독 투여, ② 에토목실(Etomoxir) 100μM 단독 투여, ③ 테모졸로마이드(Temozolomide) 250μM, 에토목실(Etomoxir) 100μM 병용 투여하여 3주 동안 배양하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64에서, 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)을 병용 투여한 경우, 단독 투여한 경우에 비해 종양구가 형성된 웰의 비율이 낮았다. 구체적으로, TS15-88은 무처리한 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 약 35%, TS14-08은 무처리한 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 약 95%, TS14-15와 TS13-64는 무처리한 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 100%의 신경구 형성능(neurosphere formation)을 억제하여, 종양구 억제능이 탁월함을 확인하였다.
[실험예 4] 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)의 단독 또는 병용 처리에 따른 종양구 직경 변화 분석
다음으로, 위상차 현미경(inverted phase-contrast microscope)(Optinity KI 400; Seongnam, Korea)으로 세포 배양물을 관찰하여 교모세포종(GBM) 종양구의 사이즈를 확인하여 그 결과를 도 4 및 5와 같이 나타내었다. 세포 사진은 톱뷰(ToupView) 이미지 분석 소프트웨어(ToupTek Photonics, Zhejiang, China)를 사용하여 디지털 카메라(Industrial Digital Microscope Camera; Huaguang, Zhejiang, China)로 촬영하였다.
도 4 및 5와 같이, TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 모두에서, 종양구의 직경이 감소하였는데, 특히 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)을 병용 투여한 경우, 단독 투여한 경우에 비해 종양구 직경이 큰 폭으로 감소하였다. 구체적으로, TS15-88은 무처리한 대조군에 비해 TMZ과 Etomoxir의 병용 처리 군에서 약 40%, TS14-08은 무처리한 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 약 70%, TS14-15와 TS13-64는 무처리한 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 100%의 종양구 직경(neurosphere의 radius)이 감소하여, 종양구 억제능이 탁월함을 확인하였다.
[실험예 5] 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)의 단독 또는 병용 처리에 따른 종양구 줄기세포능 유전자 발현 변화 분석
웨스턴 블럿 분석을 위하여 10% 글라이신-SDS-PAGE를 이용하여 세포 용해물을 분리하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 이동시킨 후 네스틴(Nestin), 삭스2(Sox2), PDPN, Msi-1, CD44, Bmi-1 및 대조군으로 GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)에 대한 항체를 이용하여 상기 단백질을 탐지하였다. 밴드 검출을 위하여, 홀스래디쉬 페록시다제-컨쥬게이트된 염소 항-토끼 및 항-마우스 IgG (Santa Cruz Biotechnology)를 2차 항체로 부착시킨 뒤 Western Lightning Plus-증강 화학발광 시약(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 발전시켰다. 이미지퀀트(ImageQuant) LAS 4000 mini (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK)으로 이미지를 촬영하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 보는 바와 같이, 교모세포종(GBM) 종양구 세포에 테모졸로마이드(Temozolomide), 에토목실(Etomoxir)을 단독으로 처리한 경우에 비하여 이들을 혼합하여 처리한 경우 상기 네스틴(Nestin), 삭스2(Sox2), PDPN, Msi-1, CD44, Bmi-1의 발현 수준이 현저히 감소하는 것을 볼 수 있었다.
[실험예 6] 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)의 단독 또는 병용 처리에 따른 종양구 침윤성 변화 분석
3D 침윤 분석을 사용하여 종양구 세포의 침윤성을 확인하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트의 각각의 웰을 마트리겔, I형 콜라겐(Corning) 및 종양구 완전 배지로 구성된 혼합 마트리겔 매트릭스로 채웠다. 겔화 전에 상기 매트릭스에 단일 스페로이드를 접종하였다. 30분 경과 후 겔화된 매트릭스가 건조되는 것을 방지하기 위하여 종양구 완전 배지를 웰당 50 ㎕의 양으로 보충하였다. 위상차 현미경(phase-contrast microscope)을 사용하여 도 7과 같이 이미지를 촬영하고, 그 결과를 도 8에 그래프로 나타내었다.
도 7 및 8에서 보는 바와 같이, TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 GBM 종양구 세포에 테모졸로마이드(Temozolomide) 또는 에토목실(Etomoxir)을 단독으로 처리한 경우에 비하여 이들의 혼합물을 처리한 경우 종양구 세포의 침윤성이 현저하게 감소한 것을 볼 수 있다.
구체적으로, TS15-88은 무처리한 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 약 45%, TS14-15는 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 약 55%, TS14-08은 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 약 50%, TS13-64는 대조군에 비해 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)의 병용 처리 군에서 35%의 침윤성(invasiveness)을 억제하는 것을 알 수 있었다.
[실험예 7] 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)의 단독 또는 병용 처리에 따른 종양구 침윤성 유전자 발현 변화 분석
웨스턴 블럿 분석을 통해 β-카테닌(β-catenin), N-카데린(N-cadherin), 스네일(Snail), Zeb1, Twist과 같은 침윤성 관련 마커를 확인하여, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, TS15-88, TS14-15, TS14-08 및 TS13-64 종양구에 β-카테닌(β-catenin), N-카데린(N-cadherin), 스네일(Snail), Zeb1, Twist의 발현양이 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir) 병용 처리 군에서 현저히 감소한 것을 확인하였다.
[실험예 8] 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)의 단독 또는 병용 처리에 따른 전사 프로파일(transcriptional profile)의 변화 분석
교모세포종 종양구에 테모졸로마이드(Temozolomide) 및 에토목실(Etomoxir)을 단독 또는 병용 처리한 뒤 RNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 전사 프로파일(transcriptional profile)의 변화를 분석하여 그 결과를 도 10에 나타내었고, 특히 줄기세포능(stemness) 및 침윤성(invasiveness) 관련 유전자의 mRNA 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 10 및 11에서 보는 바와 같이, 교모세포종 종양구에 테모졸로마이드(Temozolomide) 또는 에토목실(Etomoxir)을 단독 처리한 경우와 비교하여 이들을 병용 처리 시 줄기세포능(stemness) 및 침윤성(invasiveness) 관련 유전자의 mRNA의 발현 수준이 감소되는 것을 확인하였다.
상기와 같이, 본 발명에 따라 테모졸로마이드(Temozolomide)와 에토목실(Etomoxir)을 병용 투여하는 경우 이들을 단독으로 투여한 경우보다 이미 형성된 종양구 세포의 크기가 성장하는 것을 효과적으로 억제하였고, 종양구 세포의 형성능, 즉 증식 또한 억제하였으나, 가장 의미있게는 침윤성을 예측하기 어려운 수준 이상으로 현저히 억제하는 것을 볼 수 있었다.
이에 따라, 본 발명에 따라 병용 투여 시 암의 진행을 더디게 하며, 암의 침윤, 전이 및 줄기세포능을 현저히 억제할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명은 암, 특히는 뇌암의 침윤성 또는 전이성을 억제하기 위한 약학적 조성물과 그 방법에 관한 것이다.

Claims (20)

  1. 알킬화제(Alkylating agent) 및 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)를 유효 성분으로 포함하는 암의 침윤성 또는 전이성 억제용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 알킬화제는 테모졸로마이드(Temozolomide), 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 메클로레타민(Mechlorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 멜팔란(Melphalan), 카무스틴(Carmustine, BCNU), 로무스틴(Lomustine, CCNU), 이포스파마이드(Ifosfamide), 프로카바진(Procarbazine), 다카바진(Dacarbazine, DTIC), 알트레타민(Altretamine), 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin) 및 옥살리플라틴(Oxaliplatin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 테모졸로마이드는 50 내지 1000μM의 농도로 포함되는 것인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)는 에토목실(Etomoxir), 옥스페니신(Oxfenicine), 퍼헥린(Perhexiline) 및 라놀라진(Ranolazine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 에토목실은 10 내지 500μM의 농도로 포함되는 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물 내에 상기 알킬화제 및 지방산 산화 억제제는 1~10:1의 농도비로 포함되는 것인, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 암은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 췌장암, 뇌암, 두부 또는 경부암, 혀암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 신장암, 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 것인, 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 암은 교모세포종인, 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 교모세포종은 교모세포종 종양구인, 약학적 조성물.
  10. 알킬화제(Alkylating agent) 및 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)를 유효 성분으로 포함하는 암의 줄기세포능 억제용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 알킬화제는 테모졸로마이드(Temozolomide), 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 메클로레타민(Mechlorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 멜팔란(Melphalan), 카무스틴(Carmustine, BCNU), 로무스틴(Lomustine, CCNU), 이포스파마이드(Ifosfamide), 프로카바진(Procarbazine), 다카바진(Dacarbazine, DTIC), 알트레타민(Altretamine), 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin) 및 옥살리플라틴(Oxaliplatin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 테모졸로마이드는 50 내지 1000μM의 농도로 포함되는 것인, 약학적 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)는 에토목실(Etomoxir), 옥스페니신(Oxfenicine), 퍼헥린(Perhexiline) 및 라놀라진(Ranolazine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 에토목실은 10 내지 500μM의 농도로 포함되는 것인, 약학적 조성물.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 약학적 조성물 내에 상기 알킬화제 및 지방산 산화 억제제는 1~10:1의 농도비로 포함되는 것인, 약학적 조성물.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 암은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 췌장암, 뇌암, 두부 또는 경부암, 혀암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 신장암, 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 것인, 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 암은 교모세포종인, 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 교모세포종은 교모세포종 종양구인, 약학적 조성물.
  19. 투여가 필요한 개체에게, 알킬화제(Alkylating agent) 및 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 침윤성 또는 전이성 억제 방법.
  20. 투여가 필요한 개체에게, 알킬화제(Alkylating agent) 및 지방산 산화 억제제(Fatty acid oxidation inhibitor)를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 줄기세포능 억제 방법.
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