WO2021225399A1 - 암 치료를 위한 키메라 항원 수용체 - Google Patents

암 치료를 위한 키메라 항원 수용체 Download PDF

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(주)에스엠티바이오
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Abstract

본 발명은 신규한 키메라 항원 수용체와, 이의 용도로 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

암 치료를 위한 키메라 항원 수용체
본 발명은 신규한 키메라 항원 수용체와, 이의 용도로 암의 치료에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체(이하 본 명세서에서는 이를 「CAR」라 약칭하는 경우가 있다)를 발현하는 T 세포(이하 본 명세서에서는 이를 「CAR-T 세포」라 약칭하는 경우가 있다)는, 암 세포의 표면에 특이적으로 발현되는 암 세포 표면 항원을 인식하는 수용체를 코딩하는 유전자를 T 세포에 도입하여 암 세포를 사멸시킬 수 있도록 유전자가 재조합된 T 세포를 의미한다. 이스라엘의 Weizmann Institute of Science의 화학자이면서 면역학자인 Dr. Zelig Eshhar 등이 암 세포에서 특이적으로 발현하는 항원과 결합하는 수용체를 갖는 T 세포를 인위적으로 만들면 암 세포만 표적하여 면역반응을 일으켜 암 세포를 죽일 수 있다는 지견을 도출하여, 키메라 항원 수용체를 장착한 T 세포를 만드는데 성공하였고 1989년 PNAS에 발표한 바 있다.
그러나, 초창기에 제조된 CAR-T 세포, 즉 1 세대 CAR-T 세포는 신호 전달 도메인으로서 CD3ζ만을 이용하였는데, 그 치료 효과가 미미했고, 또한, 지속 시간도 짧다는 단점이 있었다. 이에, CAR-T 세포의 반응성을 향상시키기 위한 노력이 행해졌으며, 보조 자극 도메인(CD28 또는 CD137/4-1BB)과 CD3ζ를 결합한 2세대 CAR-T 세포가 제조되었는데 1세대 CAR-T 세포와 비교하여 체내에 잔존하는 CAR-T 세포의 수가 현저히 증가하였다. 한편, 2세대 CAR-T 세포는 한 가지의 보조 자극 도메인을 이용하였는데, 두 가지의 보조 자극 도메인을 이용하는 CAR-T 세포를 3세대 CAR-T라 지칭하며, 현재 연구는 2세대 및 3세대 CAR-T 세포에 집중되어 있다.
CAR-T 세포를 이용해서 암을 치료하는 방법과 관련하여, 3명의 말기 만성림프성백혈병(CCL, chronic lymphoid leukemia) 환자에게 CD19를 인지할 수 있도록 변형된 세포독성 T 세포(Cytotoxic T cell)를 주사하였더니, 그 중 2명에서 백혈병이 완전히 치료되었고, 그 상태가 10개월 정도 지속되었다는 보고가 있었다(N. Engl J Med 2011; 365:725-733 August 25, 2011, Sic. Transl. Med 2011 Aug 10;3(95):95ra73). 여기에서 사용된 CAR-T 세포는 2세대에 해당되는 것으로서 보조 자극 도메인으로서 4-1BB를, 신호 전달 도메인으로서 CD3ζ를 이용한 것이다. 상기 CAR-T 세포의 항원 결합 도메인은 백혈병 암세포의 표면에서 발견되는 CD19를 항원으로 인식한다.
또한, 급성 백혈병 환자에게 CTL019를 투여하여 치료하였더니, 환자 30명 중 27명이 완전 관해를 경험하였고, 전체 환자의 67%가 2년 동안 완전 관해, 78%가 2년간 생존하였다는 보고가 있으며, 대상 환자가 재발성 혹은 불응성 환자였음을 고려한다면, 이는 매우 놀라운 것이다(N Engl J Med 2014; 371:1507-1517, October 16, 2014).
현재, 다양한 CAR-T 세포를 이용한 치료법에 대하여 림프종(lymphoma), 골수종(myeloma) 등 다양한 암을 대상으로 임상 시험이 진행중에 있고, 사용 가능한 의약품으로서의 CAR-T 세포가 시장에 등장할 것으로 예상된다. CAR-T 세포를 이용한 암 치료는 자가 유래 방식이어서 대량 생산되는 제품은 아니지만, 환자 맞춤형으로서 그 치료효과가 기존의 항암제와 비교할 수 없을 정도로 높다.
한편, CEA (Carcino Embryonic Antigen) 항원은 1965년 결장암과 태아결장점막에 공통적으로 존재하는 항원 물질로 발견된 당 단백인데, 이 CEA 항원은 대장암, 소화기암, 췌장암, 폐암 등 여러 장기 유래 암에 폭 넓게 발현되므로 혈액을 이용한 종양 표지 검사의 한 표지자로 사용되기도 한다. CAR-T 세포를 이용하는 암의 치료에는 이용하고자 하는 CAR-T 세포가 타겟으로 하는 항원에 따라 다양한 암에 적용할 수 있는데 현재 CEA를 타겟으로 하는 CAR-T 세포 치료제의 개발은 없다.
본 발명의 일 목적은 암 세포, 특히는 암 배아 항원(Carcino Embryonic Antigen, CEA)을 발현하는 암 세포를 타겟으로 하는 신규한 키메라 항원 수용체를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 암, 특히는 암 배아 항원(CEA)을 발현하는 암의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 것으로 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 면역 세포를 이용하여 암, 특히는 암 배아 항원(CEA)을 발현하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 암 배아 항원(Carcino Embryonic Antigen, CEA) 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 암 배아 항원 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 VH 도메인 및 서열번호 2로 표시되는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 암 배아 항원 결합 도메인은 가요성 링커를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 가요성 링커는 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 키메라 항원 수용체는 힌지 영역 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 힌지 영역은 CD8, CD28, 4-1BB, OX40, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 힌지 영역은 서열번호 4로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 막통과 도메인을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인은 T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인은 서열번호 5로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 보조자극 도메인을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 4-1BB (CD137); OX40; CD27; CD28; CD30; CD40; PD-1; CD2; CD7; CD258; 자연살해 그룹 2 멤버 C (NKG2C); 자연살해 그룹 2 멤버 (NKG2D); B7-H3; CD83; ICAM-1; LFA-1 (CD11a/CD18) 또는 ICOS에 결합하는 리간드; 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 서열번호 6으로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 전부 또는 일부, 공통 FcR 감마 (FcER1G), Fc감마RIIIa, FcR베타 (Fc 엡실론립), CD3감마, CD3델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DNAX- 활성화 단백질 10 (DAP10), DNAX- 활성화 단백질 12 (DAP12) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 서열번호 7로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 키메라 항원 수용체는 신호 펩타이드를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 신호 펩타이드는 서열번호 8로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 키메라 항원 수용체는 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11 또는 12로 표시될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 발현 카세트는 프로모터를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 프로모터는 SFFV 프로모터, 연장 인자 1α(elongation factor 1a; EF 1a) 프로모터 또는 CAG 프로모터일 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 카세트는 절단된 EGFR 유전자(EGFRt)를 부가 유전자로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 절단된 EGFR 유전자는 절단 가능한 링커로 연결될 수 있다.
본 발명에서 상기 절단 가능한 링커는 T2A 리보솜 스킵 요소일 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 카세트는 서열번호 17 또는 18로 표시되는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 벡터는 플라스미드, 트랜스포손, 코스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에서 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAC) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 시미안 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 또는 센다이 바이러스 벡터, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 벡터 또는 HSV 벡터일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 벡터가 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩타이드는 서열번호 19 또는 20으로 표시되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 숙주 세포 또는 폴리펩타이드를 유효 성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 암은 암 배아 항원(CEA)을 발현하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 고형암일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 담관계암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으며, 바람직하게는 췌장암 또는 담관계암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 숙주 세포, 상기 숙주 세포로부터 발현되는 폴리펩타이드, 또는 상기 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 암은 암 배아 항원(CEA)을 발현하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 고형암일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 담관계암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으며, 바람직하게는 췌장암 또는 담관계암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체를 발현할 수 있도록 형질 전환된 면역 세포는 암 세포, 특히는 암 배아 항원(CEA)을 발현하는 암 세포를 특이적으로 인식하고, 그 사멸을 유도하여 최종적으로 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 항원 수용체의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 항원 수용체 카세트의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 벡터에 제한 효소 처리 후 전기 영동하여 제작 삽입된 키메라항원 수용체 카세트를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에서 유세포 분석을 통해 다양한 암 세포주에서 CEA 항원의 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 4에서 Lenti-X 293 FT 세포에 Lenti-anti-CEA-h(BBζ)-EGFRt-2nd-CAR 플라스미드(plasmid)로 형질 전환시킨 뒤 말초 혈액 유래 T 세포를 활성화시켜 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 5에서 HT29 세포에서 CEA 항원에 대한 면역 형광 염색 후 상기 CEA 항원의 발현 여부를 형광 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 5에서 CEA 항원을 타겟하는 키메라 항원 수용체 카세트가 삽입된 항-CEA CAR-T 세포가 HT29 세포를 사멸시키는 과정을 형광 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 5에서 CEA 항원을 타겟하는 키메라 항원 수용체 카세트가 삽입된 항-CEA CAR-T 세포의 CEA를 발현하는 HT29 세포주에 대한 공배양 비율에 따른 세포 사멸율의 변화를 확인하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 5에서 CEA 항원을 타겟하는 키메라 항원 수용체 카세트가 삽입된 항-CEA CAR-T 세포의 CEA를 발현하는 Capan1 세포주에 대한 공배양 비율에 따른 세포 사멸율의 변화를 확인하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 항원 수용체는 서열번호 9로 표시되는 폴리펩타이드로, CEA 결합 도메인-CD8 힌지-CD8 막통과 도메인-4-1BB-CD3ζ로 구성되거나 이를 포함할 수 있고, 혹은 서열번호 10으로 표시되는 신호 펩타이드-CEA 결합 도메인-CD8 힌지-CD8 막통과 도메인-4-1BB-CD3ζ로 구성되거나 이를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 항원 수용체는 암, 바람직하게는 암 배아 항원(CEA)을 발현하는 암의 예방, 개선 또는 치료의 용도로 사용할 수 있다.
본 발명에서 달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 위해 실행 시 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본 명세서에 기재된다. 본 발명의 기재 및 청구 시, 하기 정의가 이용될 것이다. 본 명세서에서 사용된 전문용어는 제한인 것으로 의도되지 않고, 오히려 특정한 실시형태를 기술할 목적을 위해 본 명세서에서 사용되는 것으로 또한 이해될 것이다. 관사 "하나" 및 "일"은 관사의 문법상 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나 또는 하나 이상)를 의미하도록 본 명세서에서 사용된다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 암 배아 항원(Carcino Embryonic Antigen, CEA) 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"이란 세포외 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 조작된 수용체를 의미한다. CAR의 가장 흔한 유형이 CD3ζ 사슬과 같은 T 세포 동시수용체의 막통과 및 세포내 도메인에 융합된 단일 클론 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하지만, 본 명세서에 기재된 본 발명은 이들 도메인으로 제한되지 않는다. 오히려, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 임의의 세포 내 신호전달 분자를 발현하도록 조작된 임의의 수용체 및 이들에 융합되거나 연결된 세포외 항원 결합 도메인을 의미한다.
본 발명에서 상기 결합 도메인은 암 배아 항원(Carcino Embryonic Antigen, CEA)을 특이적으로 인식할 수 있는 단쇄 가변 단편(scFv)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "단쇄 가변 단편" 또는 "scFv"란, VL과 VH 사이의 펩타이드 링커에 의한, 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)의 융합 단백질을 의미한다.
본 발명에서 상기 암 배아 항원 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 VH 도메인 및 서열번호 2로 표시되는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 VH 도메인과 VL 도메인은 가요성 링커를 통해 연결될 수 있다. 본 발명에서 상기 가요성 링커는 약 10개 내지 30개의 아미노산(예를 들어, 30개, 25개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 또는 5개의 아미노산)의 글라이신/세린 링커일 수 있고, 바람직하게는 15개의 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명에서 상기 링커 길이는 키메라 항원 수용체의 중요한 결정부위로 작용할 수 있어, 상기 범위보다 더 짧은 링커는 친화도를 증대시킬 수 있지만, 또한 세포내 다합체 형성을 발생시켜 CAR의 발현을 손상시킬 수 있는 반면, 상기 범위보다 더 긴 링커는 VL 및 VH CDR을 공간상 더 멀리 이동시킴으로써 항원 친화도를 감소시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 가요성 링커는 서열번호 3으로 표시되는 것이, 타겟으로 하는 암 배아 항원에의 결합 효율을 높일 수 있어 바람직하다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 힌지 영역 (또는 스페이서) 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 힌지 영역은 항원 결합 도메인과 막통과 도메인을 연결하는 부분으로 '스페이서'라고도 불리우는데, T 세포막 또는 NK 세포막으로부터 항원 결합 도메인을 확장하기 위한 목적을 갖는다.
본 발명에서 상기 힌지 영역은 예를 들어 인간 또는 그의 일부를 포함하는 임의의 속으로부터의 임의의 적합한 서열로부터 얻어질 수 있으며, 혹은 본 기술분야에서 통상적으로 사용하는 CD8, CD28, 4-1BB, OX40, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함한 인간 단백질의 힌지 영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 힌지 영역은 면역글로불린에 제한하지 않으면서 면역글로불린 (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD)으로부터 선택되는 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 힌지 영역은 서열번호 4로 표시되는 CD8 힌지 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 T 세포 내부에서 발견되거나 발견되도록 조작된 키메라 항원 수용체의 부분을 의미한다. 본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 T 세포의 혈장 막에서 키메라 항원 수용체를 고정하는 역할을 하는 막통과 도메인을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인은 동일한 단백질(예를 들어, CD3ζ)로부터 유래할 수 있고, 혹은 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인은 상이한 단백질(예를 들어, CD28의 막관통 도메인 및 CD3ζ 분자의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 그 반대)로부터 유래할 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인은 세포막에 걸친 소수성 폴리펩타이드를 포함한다. 특히, 막통과 도메인은 세포막의 한 면 (세포 외)에서 세포막의 다른 면 (세포 내 또는 세포질)을 통하여 걸쳐 있을 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인은 알파 나선 또는 베타 배럴, 또는 이들의 조합의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 막통과 도메인은 다수의 막통과 조각, 각 알파-나선형, 베타 시트, 또는 이들의 조합을 갖는 다원 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인으로는, 예를 들면 T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인으로 예를 들어 인공적으로 설계된 것은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 막 변이 도메인의 각 말단에서 발견될 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인은 서열번호 5로 표시되는 CD8 막통과 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인 사이에 적어도 하나의 보조자극 도메인을 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 보조자극 신호가 전달되는 부위로서 항원 결합 도메인과 결합한 특정 항원을 인식한 CAR-T 세포 또는 CAR-NK 세포가 면역반응을 일으키며 자가 증식을 돕고, 체내에 잔존하는 시간을 늘리도록 신호를 전달하는 역할을 할 수 있다.
본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 상기 보조자극 도메인은 4-1BB (CD137); OX40; CD27; CD28; CD30; CD40; PD-1; CD2; CD7; CD258; 자연살해 그룹 2 멤버 C (NKG2C); 자연살해 그룹 2 멤버 (NKG2D); B7-H3; CD83; ICAM-1; LFA-1 (CD11a/CD18) 또는 ICOS에 결합하는 리간드; 이들의 활성 단편; 이들의 기능 유도체; 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드로부터 유래한 기능 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 서열번호 6으로 표시되는 4-1BB일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 면역세포 신호전달 경로의 적어도 일부 면을 자극 또는 활성화시키기 위해 면역세포의 활성화를 제공하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 전부 또는 일부, 공통 FcR 감마 (FcER1G), Fc감마RIIIa, FcR베타 (Fc 엡실론 립), CD3감마, CD3델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DNAX- 활성화 단백질 10 (DAP10), DNAX- 활성화 단백질 12 (DAP12), 이의 활성 단편, 이의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드로부터 유래한 기능 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이러한 신호전달 도메인은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 서열번호 7로 표시되는 CD3 제타(ζ)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 신호 펩타이드(signal peptide)를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "신호 펩타이드"는 펩타이드 서열을 포함하는 데, 이는 임의의 분비된 또는 막통과 단백질의 일종 펩타이드로, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 세포막 및 세포 표면으로의 수송을 지시하고, 본 발명의 키메라 항원 수용체의 정확한 위치 선정을 제공할 수 있다. 특히, 본 발명에서 상기 신호 펩타이드는 본 발명의 키메라 항원 수용체를 세포막에 지지시키고, 그 점에서 상기 키메라 항원 수용체의 세포 외 부분이 세포 표면 상에 표시되며, 막통과 부분이 원형질 막에 걸쳐 있고, 활성 도메인은 세포질 부분, 또는 세포의 내부에 있게 된다.
본 발명에서 상기 신호 펩타이드로는 상기의 기능을 하는 펩타이드라면 제한없이 사용될 수 있지만, 예를 들면, 서열번호 8로 표시되는 n-터미널 CD8α 신호 펩타이드(n-terminal CD8α signal peptide)일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 항원 수용체의 구조를 개략적으로 나타낸 것으로, 상기 키메라 항원 수용체는 서열번호 9로 표시되는 폴리펩타이드로, CEA 결합 도메인-CD8 힌지-CD8 막통과 도메인-4-1BB-CD3ζ로 구성되거나 이를 포함할 수 있고, 혹은 서열번호 10으로 표시되는 신호 펩타이드-CEA 결합 도메인-CD8 힌지-CD8 막통과 도메인-4-1BB-CD3ζ로 구성되거나 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리 뉴클레오타이드는 임의의 재래적인 방법에 의해 특정된 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열로부터 용이하게 제조된다. 아미노산 서열을 부호화하는 염기 서열은 앞서 말한 NCBI RefSeq ID 또는 GenBenk의 가입 번호로부터 각 도메인의 아미노산 서열에 대해 얻을 수 있으며, 본 공개의 핵산은 표준 분자 생물학적 및/또는 화학적 절차를 사용하여 제작될 수 있다. 예를 들어, 염기 서열에 기초한 폴리 뉴클레오타이드는 합성될 수 있고, 중합효소연쇄반응 (PCR)을 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 얻은 DNA 단편을 조합하는 것을 통해 본 공개의 폴리뉴클레오타이드를 제조할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 유전자 또는 발현 또는 클로닝 카세트의 일부일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오티드의 사슬로서 정의된다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA 및 RNA를 포함한다. 더욱이, 핵산은 뉴클레오타이드의 중합체이다. 따라서, 여기서 사용된 핵산 및 폴리 누클레오티드는 상호 교환 가능하다. 당업계의 기술자는 핵산이 폴리뉴클레오타이드이고 이것이 단량체 "뉴클레오타이드"로 가수 분해될 수 있다는 일반적인 지식을 갖는다. 단량체 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드로 가수 분해될 수 있다. 여기서 사용된 폴리뉴클레오타이드는 제한없는 재조합 수단, 즉 통상적인 클로닝 기술 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 등을 사용한 재조합 라이브러리 또는 세포유전체로부터의 핵산 서열 클로닝을 포함하는 당업계에서 이용 가능한 임의의 수단 그리고 합성 수단에 의해 획득된 모든 핵산 서열을 포함 하나 그것에 국한되는 것이 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 9로 표시되는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11로 표시될 수 있고, 상기 서열번호 10으로 표시되는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트(cassette)에 관한 것이다.
본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절할 수 있는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결요소 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 등과 같은 발현 제어 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 프로모터로는 예를 들어, SFFV 프로모터, 연장 인자 1α(elongation factor 1a; EF 1a) 프로모터 또는 CAG (CMV 증강인자를 갖는 닭 베타-액틴 프로모터) 프로모터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발현 카세트는 그 발현을 모니터링하는 데 유용한 추가 서열로, 절단된 EGFR 유전자(EGFRt)를 부가 유전자로 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 EGFRt는 비-면역성 선별 툴(tool)로, 예를 들면, 비오티닐화된 세툭시맙(biotinylated cetuximab)과 항-비오틴 마이크로비드를 이용한 면역자기 선별(immunomagnetic selection) 시 EGFRt-를 포함하는 카세트가 형질 전환된 T 세포 또는 NK 세포를 선별하는 데에 활용할 수 있을 뿐만 아니라, T 세포 또는 NK 세포 추적을 위한 유세포 분석 시 추적 마커로 사용할 수 있으며, 세툭시맙/얼비툭스® 중재 항체 의존적 세포 상해 활성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 경로를 통한 자살 유전자로 활용될 수 있다.
본 발명에서 상기 절단된 EGFR 유전자(EGFRt)는 서열번호 13으로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자로 이루어지거나, 서열번호 14로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 절단된 EGFR 유전자(EGFRt)과 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 Fcγ 수용체 결합 도메인의 일 말단과 절단 가능한 링커인 리보솜 스킵 요소에 의해 연결될 수 있다.
본 발명에서 상기 "리보솜 스킵"이란 특이적 펩타이드가 새로운 삽입된 아미노산을 공유로 연결하는 것으로부터 세포의 리보솜을 막고, 대신에 이것이 계속해서 번역되는 것을 허용하여서 폴리단백질의 동시번역 절단을 생성시키는, 번역의 대안적인 기전을 의미한다. 이 과정은 "2A 리보솜 스킵" 요소 또는 시스 작용 하이드롤라제 요소(예를 들어, CHYSEL 서열)에 의해 유도된다. 몇몇 실시형태에서, 이 서열은 강한 알파 나선 경향을 가지는 비보존적 아미노산 서열, 이어서 공통 서열 -D(V/I)ExNPG P(여기서, x는 임의의 아미노산임)를 포함한다. G와 P 사이에 명확한 절단이 발생한다. 본 발명에서 상기 리보솜 스킵 요소는 2A 리보솜 스킵 요소일 수 있고, 바람직하게는 5' T2A 리보솜 스킵 요소일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 절단 가능한 링커는 서열번호 15로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자로 이루어지거나, 서열번호 16으로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 항원 수용체 카세트의 구조를 개략적으로 나타낸 것으로, 상기 키메라 항원 수용체 카세트는 서열번호 17로 표시되는 폴리뉴클레오타이드로, EF-1α 프로모터- n-터미널 CD8α 신호 펩타이드(signal peptide)-CEA 결합 도메인(scFv)-CD8 힌지 및 CD8 막통과 도메인(CD8 hinge and TM)-4-1BB-CD3ζ(CD3zeta)-T2A를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 구성되거나 이를 포함할 수 있고, 혹은 서열번호 18로 표시되는 폴리뉴클레오타이드로, EF-1α 프로모터- n-터미널 CD8α 신호 펩타이드(signal peptide)-CEA 결합 도메인(scFv)-CD8 힌지 및 CD8 막통과 도메인(CD8 hinge and TM)-4-1BB-CD3ζ(CD3zeta)-T2A-EGFRt를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 구성되거나 이를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 벡터로는 예를 들어, 플라스미드, 트랜스포손, 코스미드 또는 바이러스 벡터(예를 들면, 파아지, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터(온코레트로바이러스(oncoretrovirus) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 슈도 타입 벡터 포함), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAC) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 시미안 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 또는 센다이 바이러스 벡터, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 벡터 또는 HSV 벡터를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터 구조를 개략적으로 나타낸 것으로, 상기 벡터는 서열번호 18로 표시되는 폴리뉴클레오타이드로, EF-1α 프로모터- n-터미널 CD8α 신호 펩타이드(signal peptide)-CEA 결합 도메인(scFv)-CD8 힌지 및 CD8 막통과 도메인(CD8 hinge and TM)-4-1BB-CD3ζ(CD3zeta)-T2A-EGFRt를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 설계될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 벡터가 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "숙주 세포"란 발현 벡터를 함유할 수 있는 임의의 유형의 세포를 말한다. 숙주 세포는 진핵생물 세포(예를 들면, 식물, 동물, 진균 또는 조류(algae)), 원핵생물 세포(예를 들면, 세균 또는 원생동물) 또는 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 숙주 세포는 배양된 또는 "기성 제품(off-the-shelf)" 세포 또는 1차 세포(즉, 대상체로부터 직접 단리됨)일 수 있다. 숙주 세포는 부착성 세포 또는 현탁된 세포, 즉, 현탁액 중에서 성장하는 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, DH5α 이. 콜라이(E. coli) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포, 원숭이 VERO 세포, COS 세포, 및 HEK293 세포 등이 포함된다. 재조합 발현 벡터를 증폭시키거나 복제할 목적을 위해, 숙주 세포는 원핵 생물 세포, 예를 들면, DH5α 세포일 수 있다. 또한, 본 발명에서는 재조합체 CAR을 생산할 목적을 위해, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 임의의 세포 유형일 수 있고, 임의의 유형의 조직으로부터 유래될 수 있고, 임의의 발단 단계의 것으로, 예를 들면, 체액, 조직 또는 기관, 예를 들면, 혈액(말초혈, 제대혈 등) 또는 골수로부터 수집되거나, 단리되거나, 정제되거나, 또는 유도된 세포를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주 세포로는 면역 세포[T 세포, 수지상 세포, B 세포, 조혈 줄기세포, 대식세포, 단핵구, NK 세포 또는 조혈 세포(호중구, 호염구)], 말초혈액단핵구(PBMC), 제대혈 단핵구 세포, 섬유아세포, 전구체 지방세포, 간세포, 피부 각질세포, 간엽성 줄기세포, 지방 줄기세포, 또는 각종 암 세포주를 사용할 수 있고, 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포이거나, 보다 바람직하게는 CD4+, CD8+ T 세포, 및 이팩터 T 세포, 기억 T 세포, 또는 조절 T 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 포유동물 숙주 세포를 선택하는 방법 및 세포의 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 정제 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 형질 전환된 숙주 세포로부터 발현되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 숙주 세포로부터 발현되는 폴리펩타이드는 서열번호 19로 표시되는 CEA 결합 도메인(scFv)-CD8 힌지 및 CD8 막통과 도메인(CD8 hinge and TM)-4-1BB-CD3ζ(CD3zeta)-T2A-EGFRt로 구성되거나 이를 포함할 수 있고, 혹은 서열번호 20으로 표시되는 n-터미널 CD8α 신호 펩타이드(signal peptide)-CEA 결합 도메인(scFv)-CD8 힌지 및 CD8 막통과 도메인(CD8 hinge and TM)-4-1BB-CD3ζ(CD3zeta)-T2A-EGFRt로 구성되거나 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포로부터 발현되는 폴리펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 형질 전환된 숙주 세포는 암 세포에 존재하는 암 배아 항원(CEA)을 특이적으로 인식한 뒤 이를 사멸시켜 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 "암" 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 예방, 개선 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 고형 장기의 부위에 따라 암 배아 항원(CEA)을 발현하는 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 담관계암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있다.
본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 암의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 제제화할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 액제, 현탁제, 분산액, 유제, 겔제, 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 주사제가 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 주사제로 제제화하는 경우, 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 주사제는 안정화제 또는 용해 보조제와 함께 주사용수에 용해시킨 후, 멸균처리, 특히 고온감압멸균법 또는 무균여과법에 의해 멸균처리하여 제조될 수 있다. 상기 주사용수로는 주사용 증류수 또는 주사용 완충용액, 예를 들어 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨(NaH2PO4)-구연산 완충용액을 사용할 수 있다. 사용되는 인산염은 나트륨염 또는 칼륨염 형태이거나 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하고, 구연산 또는 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하다.
또한, 본 발명에서 사용되는 안정화제는 나트륨 피로설파이트(sodium pyrosulfite), 중아황산나트륨(NaHSO3), 메타중아황산나트륨(Na2S2O3) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)을 포함하고, 용해 보조제는 수산화나트륨(NaOH), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 탄산나트륨(NaCO3) 또는 수산화칼륨(KOH)과 같은 염기, 또는 염산(HCl) 또는 아세트산(CH3COOH)과 같은 산을 포함한다.
본 발명에 따른 주사제는 생체흡수성, 생체 분해성, 생체적합성으로 제형화될 수 있다. 생체흡수성이라 함은 주사제가 체내에서, 분산된 주사제의 분해 또는 분해 없이, 초기 적용에서 사라질 수 있음을 의미하는 것이다. 생체 분해성은 가수분해 또는 효소 분해에 의해 주사제가 체내에서 파쇄 또는 분해될 수 있음을 의미한다. 생체적 합성은 성분 모두가 체내에서 무독성임을 의미한다.
본 발명에 따른 주사제는 통상의 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제 등의 희석제, 또는 부형제 등을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 유효성분은 목적에 따라 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 피하, 자궁내 경막, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥내로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 유효성분은 주사 또는 카테터로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 유효성분의 투여량은 체중 60 kg 성인기준으로 상기 약학 조성물 내에 포함되는 형질 전환된 숙주 세포가 1 x 101 ~ 1 x 1050개/kg, 바람직하게는 1 x 101 ~ 1 x 1030개/kg, 보다 바람직하게는 1 x 105 ~ 1 x 1020개/kg, 가장 바람직하게는 1 x 107 ~ 1 x 109개/kg의 범위 내로 투여될 수 있도록 조절할 수 있다. 다만, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서 유효성분은, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 함유될 수 있다. 그러나 함량은 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 1종 이상의 항암제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 숙주 세포, 상기 숙주 세포로부터 발현되는 폴리펩타이드, 또는 상기 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "개체"는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 개체에 1종 이상의 항암제를 추가로 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서 상기 투여 용량, 투여 방법, 암 및 항암제의 정의 등은 상기 약학 조성물에 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하고자 이하 그 기재를 생략한다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1] Lenti-anti-CEA h(BBζ)-EGFRt-2nd-CAR의 제작
서열번호 18로 표시되는 EF-1α 프로모터-CD16의 세포 외 도메인-CD8 힌지-CD8 막통과 도메인-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRt로 구성되는 키메라 항원 수용체 카세트를 제작한 뒤, 도 3에서 보는 바와 같이 상기 카세트를 자가 불활성화되는 pCAR-EGFRt 렌티바이러스 벡터의 EF-1α 프로모터의 3 프라임(prime) 위치에 삽입시켰다. 이후 상기 키메라 항원 수용체 카세트가 벡터 내에 제대로 삽입되었는 지 확인하기 위하여 EcoR1/BamH1 제한 효소를 처리하여 절단한 뒤 겔 전기영동을 실시하면 삽입된 수용체 카세트가 절단되어 분리된 밴드를 확인할 수 있으며 이는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이 pCAR-EGFTt 벡터로 삽입시 제한 효소 사이트가 소멸되는 제한효소의 사용에 의해 EcoR1/BamH1 절단시 수용체-CD8-4-1BB-CD3제타-EGFRt일부가 함께 절단된 밴드가 확인됨을 볼 수 있다.
[실시예 2] 다양한 암 세포주에서의 CEA 항원의 발현 여부 분석
CEA 항원을 발현하는 인체 유래 암 세포 중 췌장암 세포인 Bxpc3, Capan2, Cfpac, Hpac, Miapaca2, Panc1과 담관계암 세포인 HuCCT1, SNU1196, 그리고 대장암 세포인 HT29, HCT119 세포주에 대하여 상기 실시예 1에서 제작된 키메라 항원 수용체가 타겟하는 CEA 세포막 항원이 발현되는 지 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. 상기한 각 암 세포주의 암 세포를 배양한 후 CEA 특이 항체를 1:500의 희석 배율로 희석하여 1차 부착시켰다. PBS 용액으로 3회 세척 후 Alexa488-conjugate항체를 2차 항체로 하여 유세포 분석 (flow cytometry)의 방법으로 CEA 항원의 발현의 정도를 측정해 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이, 췌장암, 담관계암 및 대장암 등 다양한 암 세포에서 CEA 항원이 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 이에 따라 본 발명에 따른 CEA 항원을 타겟으로 하는 CAR-T 또는 CAR-NK 세포를, CEA 항원을 발현하는 다양한 암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 목적으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 3] CEA 세포막 항원을 타겟으로 하는 키메라 항원 수용체가 발현된 T 세포(Anti-CEA CAR-T cell)의 제작
형질 도입(transduction)을 위해 사용할 렌티바이러스(lentivirus)의 생성을 위해 가장 수율이 높은 Lenti-X 293 FT 세포 (1X106)를 접종하여 밤새(overnight) 배양하였다. 배양 후 리포펙타민 3000 형질 도입 키트(lipofectamine 3000 transduction kit)를 이용하여 상기 실시예 1에서 제작한 Lenti-anti-CEA-h(BBζ)-EGFRt-2nd-CAR 플라스미드(plasmid)로 형질 전환을 시행하고 48 시간 동안 배양하여 293 FT 세포에서 렌티바이러스가 생성되도록 하였다.
말초혈액에서 분리된 T 세포를 CD3/CD28 macs 비드(bead)를 이용하여 활성화하여 24 시간을 배양하였고, 활성화 전, 후의 T 세포를 현미경으로 저배율(좌측)과 고배율(우측)로 관찰하여 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6의 아래 배열의 현미경 사진에서 나타낸 바와 같이, 플라스미드가 삽입되지 않아 활성화되지 않은 T 세포와는 달리, 도 6의 위 배열의 현미경 사진과 같이 많은 양의 활성화된 T 세포가 형질 도입되어 배양되는 것을 확인할 수 있다. 형질 도입의 수행 후 키메라 항원 수용체 카세트에 탑재된 EGFR 발현에 대한 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하여 EGFRt를 발현하는 세포를 확인할 수 있다.
[실시예 4] Lenti-anti-CEA-h(BBζ)-EGFRt-2nd-CAR 플라스미드(plasmid)로 형질 전환된 CAR-T 세포의 암 세포 살상능(cytotoxicity) 평가
1. 암 세포에서 CEA 세포막 항원의 발현 여부 분석
CEA 항원을 발현하는 암 세포주가 본 발명의 실시예에 따라 제작된 CAR-T 세포에 의하여 공격받아 사멸되는 과정을 형광 현미경으로 관찰하였다. 이를 관찰하기 위한 실험은 다음과 같다. 1 X 2 cm 챔버 슬라이드(chamber slide)에 대장암 세포주인 HT29 세포를 1 X 104 세포씩 분주하여 챔버 바닥에 부착을 유도한 후 면역 형광 염색(immunofluorescence stain)을 수행하였다. 이때, CEA 특이 항체를 1:500의 희석 배율로 실험하였으며 PBS 용액으로 3회 세척 후 FITC-컨쥬게이트 항체(FITC-conjugated antibody) (1:500)를 2차 항체로 하여 1차 항체와 결합을 유도한 후 형광 현미경으로 관찰하여 그 사진을 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, HT29 세포의 90% 이상에서 CEA가 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
2. 항암 효과 평가(1)
CEA 항원을 타겟하는 키메라 항원 수용체 카세트가 삽입된 항-CEA CAR-T 세포가 도 7에서 같은 세포인 HT29 세포에 대하여 암 세포를 사멸(파괴)시키는 과정을 형광 현미경으로 관찰하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군 T 세포(키메라 항원 수용체 카세트를 삽입하지 않은 T 세포)와 비교할 때, CEA 항원을 타겟으로 하는 키메라 항원 수용체 카세트가 삽입된 항-CEA CAR-T 세포의 암 세포 사멸률이 현저히 뛰어난 것을 확인할 수 있었다(붉은색 형광의 차이를 참조).
3. 항암 효과 평가(2)
또한, CEA를 발현하는 HT29 및 Capan1 세포주를 이용하여 Non-RI 세포 살상능 실험(cytotoxicity test)을 수행하였고, 그 결과를 도 9 및 10에 나타내었다.
도 9 및 10에서 보는 바와 같이, 항-CEA CAR-T 세포(Effector): 암 세포주(Target cell)를 1:5, 1:1, 5:1의 비율로 공배양한 결과, HT-29 암 세포주에서는 각 비율 당 세포 사멸율이 6.7%, 20.3%, 65.0%의 결과를 보였고, Capan-1 암 세포주에서는 각 비율 당 세포 사멸율이 0.6%, 35.60%, 99.20%의 결과를 보였는 바, 농도 의존적으로 세포 사멸율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상기한 실험 결과는, 대조군 T 세포에서 보인 미미한 세포 독성과는 대비되는 소견으로, 본 발명에 따르는 CEA를 타겟하는 항-CEA CAR-T 세포가 CEA 세포막 항원을 발현하는 암 세포주에 대하여 유효한 세포 독성을 가짐을 시사하고 있다.
실시예 1 내지 4의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 CEA 항원을 타겟하는 키메라 항원 수용체의 발현 카세트가 높은 순도의 T 세포에 안정적으로 삽입되어 키메라 항원 수용체로 발현되고 있음을 알 수 있었으며, 카세트가 삽입되지 않은 대조군 T 세포와 비교하여 CEA 세포막 항원을 발현하는 암 세포에 대한 살상능이 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 암 세포에 존재하는 암 배아 항원(Carcinoembryonic Antigen, CEA)을 타겟으로 하는 암 신규한 키메라 항원 수용체와, 이를 발현하는 세포, 및 이의 용도로 암의 예방, 개선 치료에 관한 것이다.

Claims (31)

  1. 암 배아 항원(Carcinoembryonic Antigen, CEA) 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 암 배아 항원 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 VH 도메인 및 서열번호 2로 표시되는 VL 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 암 배아 항원 결합 도메인은 가요성 링커를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 가요성 링커는 서열번호 3으로 표시되는 것인, 키메라 항원 수용체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는 힌지 영역 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 힌지 영역은 CD8, CD28, 4-1BB, OX40, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 또는 이들의 조합을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 힌지 영역은 서열번호 4로 표시되는, 키메라 항원 수용체.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 신호전달 도메인은 막통과 도메인을 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 막통과 도메인은 T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 또는 이들의 조합을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 막통과 도메인은 서열번호 5로 표시되는, 키메라 항원 수용체.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 신호전달 도메인은 보조자극 도메인을 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 보조자극 도메인은 4-1BB (CD137); OX40; CD27; CD28; CD30; CD40; PD-1; CD2; CD7; CD258; 자연살해 그룹 2 멤버 C (NKG2C); 자연살해 그룹 2 멤버 (NKG2D); B7-H3; CD83; ICAM-1; LFA-1 (CD11a/CD18) 또는 ICOS에 결합하는 리간드; 또는 이들의 조합을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 보조자극 도메인은 서열번호 6으로 표시되는, 키메라 항원 수용체.
  14. 제5항에 있어서,
    상기 신호전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 전부 또는 일부, 공통 FcR 감마 (FcER1G), Fc감마RIIIa, FcR베타 (Fc 엡실론 립), CD3감마, CD3델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DNAX- 활성화 단백질 10 (DAP10), DNAX- 활성화 단백질 12 (DAP12) 또는 이들의 조합을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  15. 제5항에 있어서,
    상기 신호전달 도메인은 서열번호 7로 표시되는, 키메라 항원 수용체.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는 서열번호 8로 표시되는 신호 펩타이드를 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11 또는 12로 표시되는, 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제19항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 SFFV 프로모터, 연장 인자 1α(elongation factor 1a; EF 1a) 프로모터 또는 CAG 프로모터를 더 포함하는, 발현 카세트.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 절단된 EGFR 유전자(EGFRt)를 더 포함하고,
    상기 폴리뉴클레오타이드와 상기 절단된 EGFR 유전자는 절단 가능한 링커로 연결되는, 발현 카세트.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 서열번호 17 또는 18로 표시되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 발현 카세트.
  24. 제20항의 발현 카세트를 포함하는, 벡터.
  25. 제24항의 벡터가 형질 전환된 숙주 세포.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포인, 형질 전환된 숙주 세포.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩타이드는 서열번호 19 또는 20으로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는, 형질 전환된 숙주 세포.
  28. 제25항의 숙주 세포를 유효 성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 암은 암 배아 항원(Carcinoembryonic Antigen, CEA)을 발현하는 것인, 약학 조성물.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 담관계암, 흑색종 또는 폐암인, 약학 조성물.
  31. 제25항의 숙주 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
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