WO2021211010A1 - Crispr/cas для выявления гена антибиотикоустойчивости bla vim-2 - Google Patents

Crispr/cas для выявления гена антибиотикоустойчивости bla vim-2 Download PDF

Info

Publication number
WO2021211010A1
WO2021211010A1 PCT/RU2020/050303 RU2020050303W WO2021211010A1 WO 2021211010 A1 WO2021211010 A1 WO 2021211010A1 RU 2020050303 W RU2020050303 W RU 2020050303W WO 2021211010 A1 WO2021211010 A1 WO 2021211010A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
blavim
crispr
cas
antibiotic resistance
resistance gene
Prior art date
Application number
PCT/RU2020/050303
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Василий Геннадьевич АКИМКИН
Александр Игоревич ТЮМЕНЦЕВ
Марина Алексеевна ТЮМЕНЦЕВА
Original Assignee
Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека filed Critical Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека
Publication of WO2021211010A1 publication Critical patent/WO2021211010A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Definitions

  • the invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, namely to guide RNAs that can be used in CRISPR-Casl2 systems as part of ribonucleoprotein complexes for the detection (detection, detection) of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 (metal-beta-lactamase class B VIM- 2) Pseudomonas aeruginosa, as well as methods of obtaining preparations of the ribonucleoprotein complex CRISPR / CAS and the preparations themselves.
  • blaVIM-2 metal-beta-lactamase class B VIM- 2
  • the invention allows in vitro detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • the guide RNAs described in this application can be used to detect the antibiotic resistance gene blaVIM-2 from Pseudomonas aeruginosa after specific amplification of a DNA fragment of the blaVIM-2 gene.
  • Amplification in this case can be carried out in various ways, including polymerase chain reaction (PCR); loop isothermal amplification (LAMP); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase-mediated amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); nucleic acid sequence based amplification (NASBA); transcription-mediated amplification (TMA); diving enzyme-mediated amplification (NEAR); circular amplification (RCA) and many other types of amplification.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LAMP loop isothermal amplification
  • HDA helicase-dependent amplification
  • RPA recombinase-mediated amplification
  • SDA strand displacement amplification
  • NASBA transcription-mediated amplification
  • TEAR
  • the guide RNAs described in this application can be used to develop highly sensitive and high-tech new generation diagnostic systems based on CRISPR technologies to combat the spread of antibiotic-resistant bacterial pathogens.
  • CRISPR / CAS genetic editing elements This technology is developing quite effectively in relation to the creation of drugs for the treatment of certain diseases, despite a number of difficulties associated with the occurrence of unforeseen mutations.
  • CRISPR / CAS system With in-depth studies in the field of application of the CRISPR / CAS system, it was found that it can be used for delicate diagnostic procedures in identifying the causative agent / s of infection in humans, as well as their genotyping.
  • the proposed platform combines Casl2a nuclease, its guide RNA, HPV nucleic acid specific, and fluorescent reporter molecule.
  • DETECTR technology is used to detect a target DNA target after preliminary amplification (Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA. CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27; 360 (6387): 436-439).
  • CRISPR / CAS system An equally important application of the CRISPR / CAS system is the identification of bacterial pathogens and the detection of specific bacterial genes. So, for example, using the SHERLOCK platform
  • the proposed analysis only in the future can be applied to samples with a low concentration of DNA - the proposed method describes the analysis with samples containing about 10 8 copies of plasmid DNA carrying antibiotic resistance genes (60 ng DNA, plasmid DNA 67 kb in size). - 220 kb).
  • the disadvantages of the described analysis are the need to use expensive high-tech equipment (specialized nanofluid biochips, an inverted fluorescence microscope with a magnification of at least 100x), as well as the need for complex analysis of the data obtained using specialized software.
  • the proposed technology is promising for a variety of applications, including quantitative determination of DNA / RNA, rapid multiplex expression detection, and other types of sensitive detection, for example, detection of contamination of samples with nucleic acids.
  • Technology based on CRISPR / CAS is a multifunctional, error-resistant DNA detection technology suitable for rapid diagnosis, including infectious diseases, and genotyping of infectious agents and identification of antibiotic resistance genes of bacterial pathogens.
  • the invention relates to new means - guide RNAs, which can be used in CRISPR-Casl2 systems for ultrasensitive detection, identification, detection or detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa in biological samples.
  • the technical objective of the proposed invention is the development of new means - guide RNAs that can be used in CRISPR-Casl2 systems with Casl2 proteins, for example, LbCpfl from Lachnospiraceae, for ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • an unexpected technical result is achieved - the possibility of ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa to single copies in one reaction.
  • EFFECT increased efficiency of detecting antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 1-5x 10 5 to 2-3 xl O 2 copies / ml.
  • the proposed invention makes it possible to increase the yield of the reaction product by obtaining the desired concentration of the final preparation of the guide RNA, and ensures the formation of the correct conformation of the hairpin contained in the guide RNA.
  • RNA hairpin which is recognized by the RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, ensuring the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • Lachnospiraceae obtained according to the method developed by the authors earlier (Patent RU2707542, 03/28/2019), to create ribonucleoprotein complexes (RPK) of the CRISPR / CAS system, suitable for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa in ultra-low concentrations (single copies).
  • RPK ribonucleoprotein complexes
  • the guide RNAs of the present invention correspond to highly conserved fragments of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene. Most preferred are guide RNAs recognized by the RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
  • oligonucleotides for carrying out preliminary amplification of a fragment of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene correspond to the highly conserved region of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene.
  • Most preferred are oligonucleotides characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
  • ribonucleoprotein complexes consisting of at least one guide RNA and an RNA-guided DNA nuclease of the CRISPR / CAS LbCpfl system from Lachnospiraceae, suitable for detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa in ultra-low concentrations (single copies).
  • PKK preparations are solutions containing a guide RNA selected from SEQ III NO: 1-5, combined with a CRISPR / CAS protein (LbCpfl from Lachnospiraceae) or freeze-dried PKK.
  • the resulting guide RNAs can be used as part of a kit for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa with instructions for use.
  • the kit may additionally include components for preliminary amplification of a highly conserved fragment of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene, including one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7. At least one guide
  • the RNA in the kit can be complexed with the CRISPR / CAS protein (LbCpfl from Lachnospiraceae) in one container or separately in different containers.
  • the method of obtaining the preparation of the ribonucleoprotein complex CRISPR / CAS includes:
  • step (ii) combining the CAS protein of the CRISPR / CAS family LbCpfl from Lachnospiraceae, into a complex with at least one guide RNA obtained in step (i), and if necessary
  • step (w) freeze-drying the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complex obtained in step (i), thereby obtaining a CRISPR / CAS ribonucleoprotein complex preparation.
  • the synthesis of guide RNAs can be carried out by in vitro transcription, followed by reprecipitation of the in vitro transcription reaction products from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 tM and an equal volume isopropyl alcohol.
  • the proposed method provides, immediately before combining with C AS -protein, heating the guide RNA at 90 ° C for 5 minutes and allowing it to cool slowly to room temperature, which ensures the formation of the correct conformation of the hairpin contained in the guide RNA.
  • the proposed preparation of the ribonucleoprotein complex CRISPR / CAS for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa which can be obtained by the method disclosed in this application.
  • the preparation contains a CAS protein of the CRISPR / CAS LbCpfl family from Lachnospiraceae in complex with at least one guide RNA with SEQ III NO: 1-5.
  • the drug can be presented both in liquid form - a solution of the specified ribonucleoprotein complex CRISPR / CAS, and in the form of a lyophilisate - a lyophilized powder of the specified ribonucleoprotein complex CRISPR / CAS.
  • a biological sample can be a sample of blood, serum or blood plasma, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, tissues of hematopoietic organs and other biological materials from a patient, which can be used to analyze for the presence of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • FIG. 1 Visualization of a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 and. O. (411 i.p.) after preliminary amplification using agarose gel electrophoresis, where numbers 1-8 indicate:
  • M - molecular weight standards from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 base pairs (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
  • FIG. 2 Visualization of PCR products encoding guide RNAs specific to the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa using agarose gel electrophoresis, where numbers 1-5 indicate:
  • M - molecular weight standards from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 base pairs (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
  • FIG. 3 Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 93 guide RNA and LbCpfl protein.
  • FIG. 4 Real-time fluorescence profile for pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 95 guide RNA and LbCpfl protein.
  • FIG. 5 Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 207 guide RNA and LbCpfl protein.
  • FIG. 6 Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 La285 guide RNA and LbCpfl protein.
  • FIG. 7 Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 K2366 guide RNA and LbCpfl protein.
  • FIG. 8 Endpoint fluorescence values (30 assay cycle, 30 minutes) for pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with ribonucleoportein complex containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 93, sgRNA blaVIM-2 N ° 95, sgRNA blaVIM-2 -2 * ⁇ ° 207, sgRNA blaVIM-2 JVb285 and sgRNA blaVIM-2 K2Z66.
  • FIG. 9 Endpoint fluorescence values (30 assay cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA N ° 93.
  • FIG. 10 Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 * G ° 95 guide RNA.
  • FIG. 11 Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for pre-amplified clinical samples blaVIM-2 targets of Pseudomonas aemginosa treated with a ribonucleoportein complex containing the sgRNA blaVIM-2 JVb207 guide RNA.
  • FIG. 12 Endpoint fluorescence values (30 assay cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aemginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 JVb285 guide RNA.
  • FIG. 13 Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aemginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 366 guide RNA.
  • Embodiments of the invention Example 1. Selection of target sequences in the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aemginosa to generate guide RNAs.
  • Table 1 List of regions in the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aemginosa with the theoretically calculated probability of their cleavage by LbCpfl from Lachnospiraceae.
  • the guide RNAs that specifically recognize the highly conserved antibiotic resistance site of blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are represented by the unique sequences SEQ III NO: 1-5.
  • Example 2 Preparation of material for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa by the method of preliminary amplification.
  • Plasmid DNA pGEM-T-blaVIM-2 containing a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 bp, is used as a model matrix of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa of a biological sample. (size 411 bp).
  • the preliminary amplification of the region corresponding to the fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 bp is carried out using specific oligonucleotides with SEQ ID NO: 6-7 shown in Table 2.
  • a PCR product encoding a fragment of the antibiotic resistance blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides For blaVIM-2 and Rev blaVIM-2 (GenTerra, Russia) ...
  • the size of the amplified blaVIM-2 fragment is 411 base pairs.
  • titration of the model matrix pGEM-T-blaVIM-2 is carried out by preparing serial dilutions (Table 3). Table 3. Serial dilutions of the model matrix samples containing the blaVIM-2 antibiotic resistance gene and clinical samples.
  • the obtained fragments of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are visualized using agarose gel electrophoresis (Fig. 1).
  • the material prepared by the described method is used for experiments on the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes LbCpfl from Lachnospiraceae containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 L ° 93, sgRNA blaVIM-2 JV blaB95, sgRNA sgRNA blaVIM-2 JV blb95, sgRNA sgRNA 2 JVb285 and sgRNA blaVIM-2 JV “366, without preliminary purification.
  • Example 3 Obtaining guide RNAs and creation of ribonucleoprotein complexes for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa. To obtain guide RNAs for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa, a set of specific oligonucleotides was developed, shown in Table 4.
  • the PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 93 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-93-Rev (GenTerra, Russia) ...
  • the size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 93 is 62 bp.
  • the PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 95 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-95-Rev (GenTerra, Russia) ...
  • the size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 95 is 62 base pairs.
  • the PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 207 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-207-Rev (GenTerra, Russia) ...
  • the size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 207 is 62 base pairs.
  • the PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 285 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-285-Rev (GenTerra, Russia) ...
  • the size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 285 is 62 base pairs.
  • the PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 366 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-366-Rev (GenTerra, Russia) ...
  • the size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 366 is 62 base pairs.
  • PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa were visualized by agarose gel electrophoresis (Fig. 2).
  • Purification of PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa is carried out using a commercially available ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, USA) according to the instructions manufacturer.
  • Purified PT IP products encoding guide RNAs specific to a fragment of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene are used as a template for the synthesis of guide RNAs.
  • the synthesis of guide RNAs specific to a fragment of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa is carried out by in vitro transcription using commercially available reagent kits (HiScribe TM T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the products of the in vitro transcription reaction are reprecipitated from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 tM and an equal volume of isopropyl alcohol.
  • Such modifications of the manufacturer's protocol, introduced by the authors, allow increasing the yield of the reaction product and obtaining the desired concentration of the final guide RNA preparation.
  • the guide RNA preparation (250 ygs) is heated at 90 ° C for 5 minutes and allowed to cool slowly to room temperature (incubation at room temperature for at least 10 minutes). This heating is necessary for the formation of the correct conformation of the hairpin contained in the guide RNA. Many manufacturers of commercial CAS protein preparations skip this step when preparing the ribonucleoprotein complex.
  • ribonucleoprotein complex 250 ygs of the LbCpfl CAS protein from Lachnospiraceae and the prepared guide RNA are mixed and incubated for 15 minutes at room temperature.
  • the ribonucleoprotein complex obtained in this way is ready for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • Example 4 Detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS using a model matrix as an example.
  • the pre-amplified material obtained by the method described in Example 2 is used as a template for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS obtained by the method described in Example 3.
  • reaction mixture is prepared containing the following components:
  • ribonucleoprotein complex LbCpfl from Lachnospiraceae and guide RNAs sgRNA blaVIM-2 N ° 93, sgRNA blaVIM-2 N ° 95, sgRNA blaVIM-2 jyr ° 207, sgRNA blaVIM-2 285 and sgRNA-2 bla6;
  • reaction mixtures containing all the necessary components are placed in a DTPrime 5 thermocycler (DNA-Technology, Russia) and the following reaction parameters are set:
  • CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes are capable of detecting single copies of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa.
  • Typical analysis results are shown using examples of real-time fluorescence profiles for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNAs sgRNA blaVIM-2 93, sgRNA blaVIM-2> 95, sgRNA blaVIM-2 20 2 JST2285 and sgRNA blaVIM-2> 366 and LbCpfl protein, in FIG. 3, FIG. 4, FIG. 5, Fig.
  • Example 5 Detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS on a limited panel of clinical samples.
  • the developed guide RNAs were tested on a limited panel of clinical samples (10 pcs.) Containing
  • PCR products encoding a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are obtained in an amplification reaction using PCR-mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) as described in Example 2, using the described temperature profile and duration of the amplification reaction.
  • PCR-mixture-2 blue FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia
  • the material obtained in this way is used as a template for the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS obtained by the method described in Example 3.
  • CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes are capable of detecting single copies (1.5 copies / reaction) of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa in DNA preparations isolated from clinical samples.
  • the signal value exceeded the value of "noise” (nonspecific fluorescence of the control sample containing no target) by three times, and by the 5-26 cycle (5-26 minutes) of the analysis - more than 5 times (wide range and difference in cycles are due to differences in guide RNAs used in the analysis, Table 5).
  • Typical assay results are exemplified by fluorescence endpoint values (30 assay cycle, 30 minutes) for Pseudomonas blaVIM-2 pre-amplified targets aeruginosa (10 independent clinical samples) treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNAs sgRNA blaVIM-2 N “93, sgRNA blaVIM-2 N“ 95, sgRNA blaVIM-2 N “207, sgRNA blaVIM-2 N“ 285 and sgRNA blaVIM- 2 N «366 and LbCpfl protein, in FIG. 9, Fig. 10, Fig. 11, Fig. 12 and FIG. 13 respectively.
  • the efficiency of detecting single copies of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene contained in DNA preparations isolated from clinical samples using various guide RNAs in the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpfl from Lachnospiraceae can be presented in the following descending order : sgRNA blaVIM-2 M207> sgRNA blaVIM-2 M93> sgRNA blaVIM-2 M285> sgRNA blaVIM-2 M366> sgRNA blaVIM-2 M95 (Table 5).
  • the developed guide RNAs allow ultrasensitive detection of single copies of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples after preliminary amplification in the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes.

Abstract

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств - направляющих РНК, рибонуклеопротеиновых комплексов системы CRISPR/CAS, содержащих направляющие РНК и наборам, содержащим рибонуклеопротеиновые комплексы системы CRISPR/CAS и специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации высоко консервативного участка гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Изобретение позволяет эффективно выявлять ген антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa после проведения специфической амплификации фрагмента этого гена. Направляющие РНК представлены последовательностями SEQ ID NO: 1-5, специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации представлены последовательностями SEQ Ш NO: 6 и SEQ ID NO: 7. Изобретение обеспечивает выявление единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

Description

CRISPR/CAS ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLA VIM-2
Область техники
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло- бета-лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa, а также к способам получения препаратов рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS и к самим препаратам.
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa после проведения специфической амплификации фрагмента ДНК гена blaVIM-2. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для борьбы с распространением антибиотикоустойчивых бактериальных патогенов.
Предшествующий уровень техники
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR/CAS. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR/CAS системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.
В 2018 году было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Casl2 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную, а также двухцепочечную ДНК. Такое свойство Casl2 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК- нацеленная эндонуклеаза CRISPR транс репортер). Впервые DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека (HPV). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Casl2a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте HPV, флуоресцентную репортерную молекулу. Технология DETECTR используется для обнаружения целевой ДНК-мишени после предварительной амплификации (Chen JS, Ма Е, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA. CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single- stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27;360(6387):436-439).
He менее важным приложением системы CRISPR/CAS является идентификация бактериальных патогенов и детекция специфических бактериальных генов. Так, например, с помощью платформы SHERLOCK
(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing - Специфичное Высокочувствительное Ферментативное Репортерное Разблокирование) удалось корректно генотипировать ряд штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa при низкой перекрестной реактивности. Кроме того, платформа SHERLOCK использована для дифференциации клинических изолятов Klebsiella pneumoniae с двумя различными генами антибиотикоустойчивости, что открывает значительные перспективы к созданию мультиплексных систем для одновременной идентификации бактериальных патогенов и выявления у них генов антибиотикоустойчивости.
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления генов антибиотикоустойчивости у бактериальных патогенов, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR/CAS.
В ходе изучения уровня техники были найдены научные статьи, описывающие разработку и получение направляющих РНК для выявления генов антибиотикоустойчивости у бактериальных патогенов с помощью технологии CRISPR/CAS (Muller, V., Rajer, F., Frykholm, К., Nyberg, L.K., Quaderi, S., Fritzsche, J., Kristiansson, E., Ambjornsson, T., Sandegren, L., Westerlund, F., 2016. Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping. Sci. Rep. 6. https://doi.org/10.1038/srep37938; Quan, J., Langelier, C., Kuchta, A., Batson, J., Teyssier, N., Lyden, A., Caldera, S., McGeever, A., Dimitrov, B., King, R., Wilheim, J., Murphy, M., Ares, L.P., Travisano, K.A., Sit, R., Amato, R., Mumbengegwi, D.R., Smith, J.L., Bennett, A., Gosling, R., Mourani, P.M., Calfee, C.S., Neff, N.F., Chow, E.D., Kim, P.S., Greenhouse, B., DeRisi, J.L., Crawford, E.D., 2019. FLASH: a next-generation CRISPR diagnostic for multiplexed detection of antimicrobial resistance sequences. Nucleic Acids Res. 47, e83. https://doi.org/10.1093/nar/gkz418).
Ближайшим аналогом изобретения является статья https://doi.org/10.1038/srep37938 (Muller, V., Rajer, F., Frykholm, К., Nyberg, L.K., Quaderi, S., Fritzsche, J., Kristiansson, E., Ambjornsson, T., Sandegren, L., Westerlund, F., 2016. Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping.
Sci. Rep. 6. https://doi.org/10.1038/srep37938), в которой описывается анализ, основанный на оптическом картировании ДНК отдельных плазмид, несущих гены антибиотикоустойчивости, бактериальных изолятов в наножидкостных каналах, который предоставляет подробную информацию об этих плазмидах, в том числе о наличии/отсутствии в них генов антибиотикоустойчивости. Описанный анализ позволяет идентифицировать гены антибиотикоустойчивости с использованием CRISPR/CAS9 и направляющих РНК, специфических к генам антибиотикоустойчивости (ЫаСТХ-М группа 1, ЫаСТХ-М группа 9, blaNDM и ЫаКРС). В ходе анализа рибонуклеопротеиновый комплекс CRISPR/CAS9 линеаризует кольцевые плазмиды в районе гена антибиотикоустойчивости, полученные линейные молекулы ДНК идентифицируется с помощью оптического картирования ДНК.
Предложенный анализ только в перспективе сможет быть применен к образцам с низкой концентрацией ДНК - предложенный способ, описывает проведение анализа с образцами, содержащими около 108 копий плазмидных ДНК, несущих гены антибиотикоустойчивости (60 нг ДНК, плазмидной ДНК размером 67 т.п.н. - 220 т.п.н.). Кроме того, недостатками описанного анализа является необходимость использования дорогостоящего высокотехнологичного оборудования (специализированные нанофлюидные биочипы, инвертированный флуоресцентный микроскоп с увеличением не менее 100х), а также необходимость проведения сложного анализа полученных данных с применением специализированного программного обеспечения.
Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета- лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa in vitro, а также в разработке способов получения препаратов рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS на их основе.
Раскрытие изобретения
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология основанная на CRISPR/CAS является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, и генотипирования инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:
- высокая чувствительность;
- возможность проведения диагностики у постели больного;
- возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;
- скорость и простота анализа;
- сниженная стоимость анализа;
- отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;
- отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.
Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в биологических образцах.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 с белками Casl2, например, LbCpfl из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa до единичных копий в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 1-5х 105 до 2-3 xl О2 копий/мл. Также предложенное изобретение позволяет увеличить выход продукта реакции, получив желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК, и обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.
Технический результат достигается за счет:
- разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 для ультрачувств ительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ Ш NO: 1-5, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК- эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
- применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеаз LbCpfl из
Lachnospiraceae, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент RU2707542, 28.03.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR/CAS, пригодных для детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях (единичные копии).
- разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ Ш NO: 6 и SEQ Ш NO: 7, для предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
- оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
- определения условий проведения ультрачувствительной детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa и установления последовательности стадий метода.
Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК -эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
- SEQ Ш NO: 1;
- SEQ Ш NO: 2;
- SEQ Ш NO: 3;
- SEQ Ш NO: 4;
- SEQ Ш NO: 5;
- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80% - 99,99%,
- или комплементарной любой из них,
- или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативному участку гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
- SEQ Ш NO: 6;
- SEQ Ш NO: 7;
- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80% - 99,99%,
- или комплементарной любой из них,
- или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-нуклеазы системы CRISPR/CAS LbCpfl из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях (единичные копии).
Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ Ш NO: 1-5, объединенную с белком системы CRISPR/CAS (LbCpfl из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с инструкцией по применению.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высоко консервативного фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ Ш NO: 6 и SEQ Ш NO: 7. При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR/CAS (LbCpfl из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.
Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS предусматривает:
(i) синтез направляющей РНК с SEQ Ш NO: 1-5,
(ii) объединение CAS-белка семейства CRISPR/CAS LbCpfl из Lachnospiraceae, в комплекс с по меньшей мере одной направляющей РНК, полученной на стадии (i), и при необходимости
(ш) лиофильную сушку рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS, полученного на стадии (и), с получением, таким образом, препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS.
В предложенном способе синтез направляющих РНК может быть проведен методом in vitro транскрипции с последующим переосаждением продуктов реакции in vitro транскрипции из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 тМ и равного объема изопропилового спирта.
Также предложенный способ предусматривает непосредственно перед объединением с С AS -белком прогрев направляющей РНК при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры, что обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.
Предложен препарат рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, который может быть получен раскрытым в настоящей заявке способом. Препарат содержит CAS-белок семейства CRISPR/CAS LbCpfl из Lachnospiraceae в комплексе с по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ Ш NO: 1-5.
Препарат может быть представлен как в жидкой форме - раствора указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS, так и в виде лиофилизата - лиофильно высушенного порошка указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих Pseudomonas aeruginosa. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Визуализация фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 и. о. (размером 411 и. о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:
1 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 1 иг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;
2 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,1 иг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;
3 - ПТ IP-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,01 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;
4 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,001 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;
5 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,0001 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;
6 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,00001 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;
7 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM- T-blaVIM-2;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 2. Визуализация ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к гену антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-5 обозначены:
1 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 N°93;
2 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 N°95;
3 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 N°207;
4 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 N°285;
5 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 N°366;
M - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 93 и белок LbCpfl.
Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 95 и белок LbCpfl.
Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 207 и белок LbCpfl.
Фиг. 6. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 Ла285 и белок LbCpfl.
Фиг. 7. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 К2З66 и белок LbCpfl.
Фиг. 8. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 N°93, sgRNA blaVIM-2 N°95, sgRNA blaVIM-2 *Г°207, sgRNA blaVIM-2 JVb285 и sgRNA blaVIM-2 К2З66.
Фиг. 9. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°93.
Фиг. 10. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 *G°95.
Фиг. 11. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aemginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 JVb207.
Фиг. 12. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aemginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 JVb285.
Фиг. 13. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aemginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 366.
Варианты осуществления изобретения Пример 1. Подбор последовательностей-мишеней в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aemginosa для создания направляющих РНК.
Для подбора последовательностей-мишеней в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aemginosa для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular- biology/). Был составлен перечень участков в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aemginosa с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1).
Таблица 1. Перечень участков в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aemginosa с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления LbCpfl из Lachnospiraceae.
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Направляющие РНК, специфически узнающие высоко консервативный участок антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, представлены уникальными последовательностями SEQ Ш NO: 1-5.
Пример 2. Подготовка материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa методом предварительной амплификации.
Подготовку материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa проводят методом предварительной амплификации. В качестве модельной матрицы гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa биологического образца используют плазмидную ДНК pGEM-T-blaVIM-2, содержащую в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о. (размером 411 п.о.).
Предварительную амплификацию участка, соответствующего фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о., проводят с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQ Ш NO: 6-7, приведенных в Таблице 2.
Таблица 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000016_0001
ПЦР-продукт, кодирующий фрагмент антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов For blaVIM-2 и Rev blaVIM-2 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента blaVIM-2 составляет 411 пар нуклеотидов.
Температурный профиль амплификации для получения ПНР -продукта, фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 и. о.: 1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2. 40 циклов амплификации:
95°С - 15 сек,
55°С - 45 сек,
72°С - 30 сек; 3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.
В ходе подготовки материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa методом предварительной амплификации проводят титрование модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2 путем приготовления серийных разведений (Таблица 3). Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной матрицы, содержащей ген антибиотикоустойчивости blaVIM-2, и клинических образцов.
Figure imgf000016_0002
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные фрагменты гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1). Подготовленный описанным способом материал используют для экспериментов по выявлению гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpfl из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 L°93, sgRNA blaVIM-2 JVb95, sgRNA blaVIM-2 JVb207, sgRNA blaVIM-2 JVb285 и sgRNA blaVIM-2 JV«366, без предварительной очистки.
Пример 3. Получение направляющих РНК и создание рибонуклеопротеиновых комплексов для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Для получения направляющих РНК для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 4.
Таблица 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР- продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к гену антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов:
1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (табл. 4), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым высоко консервативным участком гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae;
2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa;
3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa;
4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°93, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-93-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 N°93, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°95, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-95-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 N°95, составляет 62 пары нуклеотидов. ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°207, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-207-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 N°207, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°285, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-285-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 N°285, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°366, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-366-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 N°366, составляет 62 пары нуклеотидов.
Температурный профиль амплификации для получения ПНР -продуктов, кодирующих направляющие РНК:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2. 35 циклов амплификации:
95°С - 15 сек,
55°С - 45 сек,
72°С - 30 сек;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 2).
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, проводят с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПТ IP-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, используют в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, осуществляется методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждают из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 тМ и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.
Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR/CAS LbCpfl из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводят по стандартному протоколу с некоторыми модификациями (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014;546:1-20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5).
Непосредственно перед объединением с CAS-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 иг) прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов CAS-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 иг CAS-белка LbCpfl из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивают и инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Пример 4. Обнаружение единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS на примере модельной матрицы.
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, используют в качестве матрицы для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, полученных способом, описанным в Примере 3.
Для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:
- 10х буфер (100 mM TrisHCl pH 8,0, 1 М NaCl);
- 50 mM MgCb (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);
- 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpfl из Lachnospiraceae и направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 N°93, sgRNA blaVIM-2 N°95, sgRNA blaVIM-2 jyr°207, sgRNA blaVIM-2 285 и sgRNA blaVIM-2 366);
- 20 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);
- мишень (предварительно амплифицированный фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa);
- вода mQ.
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещают в амплификатор ДТПрайм 5 (ДНК-Технология, Россия) и задают следующие параметры реакции:
30-60 циклов:
37°С - 35 сек,
37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, сформированных на основе LbCpfl из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельной матрицы - плазмидной ДНК pGEM-T-blaVIM-2, содержащей в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM- 2 Pseudomonas aeruginosa c 37 no 447 п.о. размером 411 п.о. Показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS обладают способностью выявлять единичные копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 93, sgRNA blaVIM-2 >95, sgRNA blaVIM-2 207, sgRNA blaVIM-2 JST2285 и sgRNA blaVIM-2 >366 и белок LbCpfl, на Фиг. 3, Фиг. 4, Фиг. 5, Фиг. 6 и Фиг. 7 соответственно. Отметим, что уже на 30-ом цикле анализа (30 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,5 копий/реакция) гена blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум втрое.
В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе модельной матрицы, с использованием различных направляющих РНК. Показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS, сформированные на основе LbCpfl из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: sgRNA blaVIM-2 N°207 > sgRNA blaVIM-2 N°93 > sgRNA blaVIM-2 Ж 66 > sgRNA blaVIM-2 >285 > sgRNA blaVIM-2 >95 (Фиг. 8).
Пример 5. Обнаружение единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS на ограниченной панели клинических образцов.
Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (10 шт.), содержащих
Pseudomonas aeruginosa, несущую ген антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (ранее подтверждено микробиологическими методами и методом секвенирования следующего поколения).
Для обнаружения единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS была проведена предварительная амплификация фрагментов этого гена. Для проведения предварительной амплификации были подготовлены серийные (согласно Таблице 3) разведения препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов 10 пациентов с помощью коммерчески доступного набора DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, США) согласно инструкции производителя.
ПЦР-продукты, кодирующие фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации.
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, полученных способом, описанным в Примере 3.
Обнаружение единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM- 2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS проводят способом, описанным в Примере 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS обладают способностью выявлять единичные копии (1,5 копий/реакция) гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов. При этом уже на 2-15 цикле (2-15 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) втрое, а к 5-26 циклу (5-26 минут) анализа - более чем в 5 раз (широкий диапазон и разница в циклах обусловлены различиями использованных в анализе направляющих РНК, Таблица 5). Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa (10 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 N«93, sgRNA blaVIM-2 N«95, sgRNA blaVIM-2 N«207, sgRNA blaVIM-2 N«285 и sgRNA blaVIM-2 N«366 и белок LbCpfl, на Фиг. 9, Фиг. 10, Фиг. 11, Фиг. 12 и Фиг. 13 соответственно.
Таблица 5. Соотношения значений сигнала к значению «шума» при детекции единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в клинических образцах после предварительной амплификации с применением рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, содержащих разработанные направляющие РНК.
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Эффективность выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов, с использованием различных направляющих РНК в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, сформированных на основе LbCpfl из Lachnospiraceae, можно представить в следующем порядке по убыванию: sgRNA blaVIM-2 М207 > sgRNA blaVIM-2 M93 > sgRNA blaVIM-2 M285 > sgRNA blaVIM-2 M366 > sgRNA blaVIM-2 M95 (Таблица 5).
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в клинических образцах после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa, состоящий из стадий:
(i) синтеза направляющей РНК с SEQ Ш NO: 1-5;
(и) объединения CAS-белка семейства CRISPR/CAS LbCpfl из Lachnospiraceae в комплекс с по меньшей мере одной направляющей РНК, полученной на стадии (i); и при необходимости
(ш) лиофильной сушки рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS, полученного на стадии (и); с получением, таким образом, препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS.
2. Способ по п.1, где синтез направляющих РНК осуществляют методом in vitro транскрипции с последующим переосаждением продуктов реакции in vitro транскрипции из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 шМ и равного объема изопропилового спирта.
3. Способ по любому из п.п.1-2, где непосредственно перед объединением с CAS-белком направляющую РНК прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры, что обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.
4. Препарат рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, полученный способом по любому из п.п.1-3, содержащий CAS-белок семейства CRISPR/CAS LbCpfl из Lachnospiraceae в комплексе с по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ Ш NO: 1-5.
5. Препарат по п.4, где препарат представляет собой раствор указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS.
6. Препарат по п.4, где указанный препарат лиофилизирован.
PCT/RU2020/050303 2020-04-15 2020-10-28 Crispr/cas для выявления гена антибиотикоустойчивости bla vim-2 WO2021211010A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020114568 2020-04-15
RU2020114568A RU2745637C1 (ru) 2020-04-15 2020-04-15 Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas и препарат для выявления гена антибиотикоустойчивости bla VIM-2 (металло-бета-лактамаза класс B VIM-2) Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021211010A1 true WO2021211010A1 (ru) 2021-10-21

Family

ID=75353304

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2020/050303 WO2021211010A1 (ru) 2020-04-15 2020-10-28 Crispr/cas для выявления гена антибиотикоустойчивости bla vim-2

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2745637C1 (ru)
WO (1) WO2021211010A1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019126577A2 (en) * 2017-12-22 2019-06-27 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based multiplex diagnostics
RU2018101666A (ru) * 2015-06-18 2019-07-19 Те Брод Инститьют Инк. Новые ферменты и системы crispr

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2018101666A (ru) * 2015-06-18 2019-07-19 Те Брод Инститьют Инк. Новые ферменты и системы crispr
WO2019126577A2 (en) * 2017-12-22 2019-06-27 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based multiplex diagnostics

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN JS ET AL.: "CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity", SCIENCE, vol. 360, no. 6387, 2018, pages 436 - 439, XP055615609, DOI: 10.1126/science.aar6245 *
KUZNETSOVA M.B. ET AL.: "Poisk i izuchenie genov, kodiruiushchikh metalle-beta-laktamazy, u gospitalnykh shtammov PSEUDOMONAS AERUGINOSA", MIKROBIOLOGIA, 2011, pages 39 - 44 *
MULLER V ET AL.: "Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping", SCI. REP., vol. 6, 2016, pages 37938, XP055867315 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2745637C1 (ru) 2021-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2143805B1 (en) Asymmetric PCR amplification
JP2009502137A (ja) 核酸変種の迅速な同定および定量のための方法
RU2734520C1 (ru) Способ обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс B VIM-2) Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе
RU2743861C1 (ru) Система CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс B VIM-2) Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях
RU2745637C1 (ru) Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas и препарат для выявления гена антибиотикоустойчивости bla VIM-2 (металло-бета-лактамаза класс B VIM-2) Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях
EP2935617A1 (en) Probability-directed isolation of nucleotide sequences (pins)
RU2791879C1 (ru) Система CRISPR-Cas12 для выявления гена exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa, в ультранизких концентрациях
RU2791880C1 (ru) Способ обнаружения гена exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе
RU2782739C1 (ru) Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для выявления гена exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa
RU2782588C1 (ru) Способ обнаружения гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе
RU2747819C1 (ru) Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas и препарат для выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях
RU2782315C1 (ru) Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в ультранизких концентрациях
RU2747820C1 (ru) Система CRISPR-Cas для выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях
RU2782314C1 (ru) Система CRISPR-Cas12 для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в ультранизких концентрациях
RU2747880C1 (ru) Способ обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе
RU2720768C1 (ru) Система CRISPR-Cas для детекции провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях
RU2802783C1 (ru) Система CRISPR-Cas12 для выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультранизких концентрациях в ультранизких концентрациях
RU2720767C1 (ru) Способ обнаружения провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе
RU2720769C1 (ru) Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS и препарат для детекции провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях
RU2802781C1 (ru) Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas12 и препарат для выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультранизких концентрациях
Putra et al. A review of the development of Polymerase Chain Reaction technique and its uses in Scientific field
RU2802079C1 (ru) Способ обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе
RU2764023C1 (ru) Система CRISPR-Cas12 для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях
RU2764015C1 (ru) Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas12 и препарат для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях
RU2764024C1 (ru) Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas14 и препарат для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20931200

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20931200

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1