WO2021182885A1 - 플라보박테리움 속 tch3-2 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

플라보박테리움 속 tch3-2 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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flavobacterium
disease
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이선우
김지현
최수연
정은주
이평안
최기혁
이형주
송주연
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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/20—Flavobacterium

Definitions

  • the present invention relates to a composition for controlling plant diseases containing the TCH3-2 strain of the genus Flavobacterium as an active ingredient and uses thereof.
  • Chemical synthetic pesticides remain in soil, crops, or water, causing various problems such as environmental pollution and ecosystem disturbance.
  • chemical synthetic pesticides can become resistant to pathogens when used, and there is a risk of user poisoning.
  • social interest in these side effects increases, many studies on biological control methods using microorganisms are being attempted for various diseases that are difficult to control using chemical pesticides.
  • Microorganisms having an antibacterial effect on pathogens can be used for normal biological control, and systemic resistance (Induced Systemic Resistance, "ISR") ”) can be used.
  • ISR Induced Systemic Resistance
  • the latter method is evaluated as an effective control method in that it does not cause problems such as environmental pollution, weakness, or residual toxicity and its control effect lasts for a long time.
  • Brown stem rot (BSR) is caused by Phialophora gregata. inflicting serious damage. At present, brown stem rot is occurring only insignificantly in Korea, but a reliable control method must be devised to prevent its rapid spread.
  • TMV Tobacco Mosaic Virus
  • Korean Patent No. 0942228 discloses 'a plant disease control agent using Flavobacterium hercinium ipb-C313 strain'
  • Korean Patent Application Publication No. 2009-0116241 discloses 'Plant against red pepper blight'.
  • a soil rhizome Flavobacterium strain GSE09' that exhibits an antagonistic effect.
  • the 'composition for controlling plant diseases containing the TCH3-2 strain of the genus Flavobacterium as an active ingredient and use thereof' of the present invention has not yet been disclosed.
  • the present invention has been derived by the above requirements, and the present inventors have treated the Flavobacterium sp. TCH3-2 strain on peas ( Pisum sativum ) and tobacco ( Nicotiana tabacum ), respectively, when the strain
  • the present invention has been completed.
  • the present invention provides a composition for controlling plant diseases containing a Flavobacterium sp. TCH3-2 strain or a culture solution thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for controlling a plant disease, comprising the step of treating a plant, plant seed or plant planting soil with an effective amount of a Flavobacterium sp. TCH3-2 strain or a culture solution thereof.
  • the present invention provides a method for producing a composition for controlling plant diseases comprising the step of culturing a Flavobacterium sp. TCH3-2 strain.
  • Flavobacterium sp. TCH3-2 strain remarkably increases resistance to soybean brown stem rot and tobacco mosaic disease, thereby promoting the production of soybean and tobacco crops.
  • TCH3-2 strain of the present invention is treated.
  • Control A control treated with sterile water without treatment with the TCH3-2 strain.
  • 2 is a result of performing a PCR reaction using a set of six virus-specific primers on a sample of a diseased tobacco plant in order to confirm the type of virus infected with the tobacco plant.
  • TCH3-2 strain of the present invention is treated.
  • Control A control treated with sterile water without treatment with the TCH3-2 strain.
  • the present invention provides a composition for controlling plant diseases containing a Flavobacterium sp. TCH3-2 strain or a culture solution thereof as an active ingredient.
  • Flavobacterium TCH3-2 strain of the present invention was isolated from the rhizome soil of crops, and was deposited with the National Academy of Agricultural Sciences on November 20, 2015 (Accession No.: KACC92107P), and as of February 22, 2021 It was given an international accession number (accession number: KACC81154BP).
  • the plant disease may be a fungal plant disease or a viral plant disease, preferably, the fungal plant disease is brown stem rot, and the viral plant disease is Tobacco mosaic disease may be, but is not limited to.
  • the brown stem rot disease is caused by Phialophora gregata
  • tobacco mosaic disease is caused by tobacco mosaic virus (TMV).
  • composition for controlling plant diseases according to the present invention is prepared, for example, in the form of directly sprayable solutions, powders and suspensions or highly concentrated aqueous, oily or other suspensions, dispersions, emulsions, oily dispersions, pastes, dusts, scattering materials or granules can, but is not limited thereto.
  • composition for controlling plant diseases may be used by spraying, spraying, spraying, scattering or pouring. The form of use depends on the intended purpose, in all cases it should be such that the distribution of the composition according to the invention is as fine and uniform as possible.
  • composition for controlling plant diseases of the present invention can be formulated in various forms.
  • Such formulations may be prepared, for example, by adding solvents and/or carriers.
  • inert additives and surface-active substances such as emulsifiers or dispersants are mixed into the formulation.
  • Suitable surface-active substances are aromatic sulfonic acids (eg lignosulfonic acid, phenol-sulfonic acid, naphthalene- and dibutylnaphthalenesulfonic acid), fatty acids, alkyl- and alkylarylsulfonates, alkyl lauryl ethers, alkalis of fatty alcohol sulfates metals, alkaline earth metals, ammonium salts, sulfated hexa-, hepta- and octadecanols, salts of fatty alcohol glycolethers, sulfonates naphthalene and derivatives thereof, condensates of formaldehyde, naphthalene or naphthalenesulfonic acids, phenols and formaldehyde Condensate, polyoxyethyleneoctyl phenol ether, ethoxylated isooctyl-, octyl- or nonylphenol
  • Suitable solid carrier materials are, in principle, all porous and agriculturally acceptable carriers such as mineral earths (such as silica, silica gel, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bowls, ocher, clays, Dolomite, diatomaceous earth, calcium sulphate, magnesium sulphate, magnesium oxide, ground synthetics), fertilizers (e.g. ammonium sulphate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, urea), vegetable products (e.g. grain meal, bark meal, wood meal) and nutshell powder) or cellulose powder, but is not limited thereto.
  • the said solid carrier can also be used 1 type or in mixture of 2 or more types.
  • composition for controlling plant diseases of the present invention may be used as an active ingredient by using the Flavobacterium sp. TCH3-2 strain alone or in combination with two or more other antibacterial or antiviral substances.
  • composition for controlling plant diseases of the present invention can be mixed with a spreading agent and penetrating agent, or a surfactant in order to enhance the absorption and effect of crops.
  • the present invention also provides a method for controlling a plant disease, comprising the step of treating a plant, plant seed or plant planting soil with an effective amount of a Flavobacterium sp. TCH3-2 strain or a culture solution thereof.
  • a method of controlling the plant disease it can be carried out by immersing or irrigating the plant with an effective amount of the Flavobacterium genus TCH3-2 strain or a culture solution thereof, that is, spraying.
  • an effective amount of the Flavobacterium genus TCH3-2 strain or its culture solution is poured into the soil around the plant, or the seeds can be soaked in an effective amount of the Flavobacterium genus TCH3-2 strain or its culture solution. have.
  • the 'effective amount' of the present invention is an amount sufficient to cause beneficial or desired results, and in order to control plant diseases, the Flavobacterium TCH3-2 strain or a culture solution thereof is uniformly diluted with water, followed by appropriate spraying such as a power spreader. It can be sprayed on plants and cultivated land using the device.
  • the plant is a plant that can be infected with Pyalophora gregata or TMV, but is not limited thereto, but may be pea ( Pisum sativum ) or tobacco ( Nicotiana tabacum ).
  • TMV Pyalophora gregata
  • pea Pisum sativum
  • tobacco Nicotiana tabacum
  • the plant disease is as described above.
  • the present invention also provides a method for producing a composition for controlling plant diseases comprising the step of culturing a Flavobacterium sp. TCH3-2 strain.
  • the culturing method of the Flavobacterium sp. TCH3-2 strain and the preparation method of the composition for controlling plant diseases may use any method known in the art, and are not particularly limited to a specific method.
  • Tobacco mosaic disease caused by tobacco mosaic virus (TMV, Tobacco mosaic virus) when tobacco ( Nicotiana tabacum ) is treated with Flavobacterium sp. TCH3-2 strain (KACC81154BP) disease) was tested for resistance of plants. Tobacco seeds were immersed in a suspension of TCH3-2 strain adjusted to 10 9 CFU/ml (primary treatment), and after 11 days, the germinated seeds were transplanted into a 45 ⁇ 45 mm 2 pot containing a rich horticultural medium. Three days after transplantation, the TCH3-2 suspension adjusted to 10 9 CFU/ml was irrigated to 6 ⁇ 10 7 CFU/g soil (second treatment). As a control for the TCH3-2 strain treated group, plants treated with only sterile water twice were used.
  • TCH3-2 strain treated group plants treated with only sterile water twice were used.
  • the virus disease was confirmed in 6 out of 90 subjects (0, 6, 0 per repeat) in the TCH3-2 treatment group, whereas in the control group, 26 out of 90 subjects (7, 14 per repeat) , 5 subjects) was confirmed.
  • the incidence rate increased in both treatment groups compared to the first.
  • the increase was high with 17 out of 90 (3, 6, 8 per repeat), and 29 out of 90 in the control group. (8, 13, 8 subjects per repetition), which increased slightly (Table 1).
  • the results of the first and second rounds were evaluated by combining the results of the first and second rounds, as shown in FIG. 1 , the TCH3-2 treatment group developed a viral disease in 23 out of a total of 180 subjects, and in the control group, the disease was confirmed in 55 out of 180 subjects, There was a statistically significant difference.
  • TMV tobacco mosaic virus
  • TMVF 5'-CGACATCAGCCGATGCAGC-3'
  • TMVR 5'-ACCGTTTTCGAACCGAGACT-3'
  • PCR was carried out in AccuPower Pfu PCR PreMix (BIONEER) with 20 ⁇ l reaction including 2 ⁇ l of template cDNA, 1 ⁇ l of each 10 pmol forward and reverse primers, and 16 ⁇ l of sterile water.
  • the expected size of the PCR product is TMV-880 bp, ToMV -318 bp, TBTV-518 bp, TNV-280 bp, TSV-1,000 bp and TRSV-650 bp.
  • PCR conditions were as follows: initial denaturation 94° C., 5 min; The reaction was repeated 30 times, denaturation 94°C, 30 seconds, annealing 58°C, 45 seconds, elongation 72°C, 45 seconds; Last elongation 72°C for 5 minutes.
  • tobacco mosaic virus TMV; A-1 and B-1
  • TMV tobacco mosaic virus
  • C-1 and D tobacco mosaic virus
  • -1 and tomato mosaic virus ToMV; C-2 and D-2
  • the disease resistance enhancement effect of the 2 strains was confirmed.
  • Pea seeds were immersed in a suspension of TCH3-2 strain adjusted to 10 9 CFU/ml (primary treatment), and the germinated seeds after 5 days were transplanted into a 45 ⁇ 45 mm 2 pot containing a rich horticultural medium.
  • the suspension of the TCH3-2 strain adjusted to 10 9 CFU/ml was irrigated to 6 ⁇ 10 7 CFU per g soil (secondary treatment).
  • plants treated with only sterile water twice were used.
  • the plants were randomly planted in the field with 3 repetitions of the egg mass method.
  • the TCH3-2 strain treatment group and control group were each used for 40 weeks, and 4 months after planting, plants were grown and brown rot was maintained to occur naturally, and plants with browned above-ground stems and plants that died due to this were counted.
  • FIG. 3 in the control group not treated with the TCH3-2 strain, symptoms were observed in 16 subjects (4, 8, 4 subjects per repetition), whereas in the TCH3-2 strain treated group, a total of 40 Only 7 subjects (2, 3, 2 subjects per repeat) of the subjects developed the disease. Through this, it was confirmed that the TCH3-2 strain can confer resistance to brown stem rot that can occur naturally in legumes in the field.

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Abstract

본 발명은 플라보박테리움 속 TCH3-2 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주는 콩 갈색줄기썩음병 및 담배 모자이크병에 대한 저항성을 현저하게 증가시킴으로써, 완두콩 및 담배 작물의 생산을 촉진시킬 수 있다.

Description

플라보박테리움 속 TCH3-2 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 플라보박테리움 속 TCH3-2 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
화학합성농약은 토양, 작물, 또는 수중에 잔류하여 환경오염 및 생태계교란 등의 여러 가지 문제를 야기한다. 또한 화학합성농약은 사용 시 병원균에 내성이 생길 수 있으며, 사용자 중독 사고의 위험도 있다. 이러한 부작용에 대한 사회적 관심이 높아지면서 화학적 농약을 이용한 방제가 어려운 각종 병해를 대상으로 미생물을 이용한 생물학적 방제 방법에 관한 연구가 많이 시도되고 있다.
보통 생물학적 방제에는 병원균에 대해 항균 효과를 갖는 미생물을 이용할 수 있으며, 또한 병에 대한 저항성을 작물체에 유도할 목적으로 미생물을 미리 작물체에 선접종함으로써 작물체 내에 유도되는 전신저항성(Induced Systemic Resistance, "ISR")을 이용할 수 있다. 후자와 같은 방법은 환경오염, 약해, 또는 잔류독성 등의 문제를 야기시키지 않는다는 장점과 이의 방제 효과가 오래 지속된다는 면에서 효과적인 방제 방법으로 평가된다.
갈색줄기썩음병(Brown Stem Rot, BSR)은 피알로포라 그레가타( Phialophora gregata)에 의해 발병하는 것으로, 북미대륙 및 일본 특히 홋카이도 지역에서 갈색줄기썩음병이 심각하게 발생하고 있으며, 콩 수량의 감소로 인해 심각한 피해를 주고 있다. 현재 국내에서 갈색줄기썩음병이 미미하게 발생하고 있으나, 급속적인 확산을 막기 위하여 확실한 방제 방법을 강구해야 한다.
담배 모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus, TMV)는 감염으로 증상이 나타나기까지 일정한 시일이 소요되며, 감염 초기에는 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 없기 때문에 담배 모자이크 바이러스에 한번 감염이 되면 조기에 방제할 수 없어서 연초의 품질이 저하되고 수확량이 감소되어 막심한 손해가 발생하고 있으나 아직까지 뚜렷한 방제 대책이 없는 실정이다.
한편, 한국등록특허 제0942228호에는 '플라보박테리움 헤르시니움 이피비-씨313 균주를 이용한 식물병 방제제'에 대해 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2009-0116241호에는 '고추 역병에 대한 길항 효과를 나타내는 토양 근권세균 플라보박테리움 균주 GSE09'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '플라보박테리움 속 TCH3-2 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주를 완두콩( Pisum sativum) 및 담배( Nicotiana tabacum)에 각각 처리하였을 때, 상기 균주를 처리하지 않은 군에 비해 완두콩에서 갈색줄기썩음병(brown stem rot) 발병이 감소되고, 담배에서 담배 모자이크병(Tobacco mosaic disease) 발병이 감소되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물를 제공한다.
또한, 본 발명은 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 식물, 식물의 종자 또는 식물 식재 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병의 방제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주는 콩 갈색줄기썩음병 및 담배 모자이크병에 대한 저항성을 현저하게 증가시킴으로써, 콩 및 담배 작물의 생산을 촉진시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주를 처리하였을 때, 담배 모자이크병(Tobacco mosaic disease)에 대한 식물체의 저항성 증진 효과를 확인한 결과이다. Control: TCH3-2 균주를 처리하지 않고 멸균수를 처리한 대조군.
도 2는 담배 식물체에 감염된 바이러스 종류를 확인하기 위해 이병 담배 식물체 시료를 대상으로 6종의 바이러스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과이다.
도 3은 본 발명의 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주를 처리하였을 때, 갈색줄기썩음병(brown stem rot)에 대한 식물체의 저항성 증진 효과를 확인한 결과이다. Control: TCH3-2 균주를 처리하지 않고 멸균수를 처리한 대조군.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물를 제공한다.
본 발명의 플라보박테리움 속 TCH3-2 균주는 작물의 근권토양으로부터 분리하였으며, 국립농업과학원에 2015년 11월 20일자로 기탁된 균주이며(기탁번호: KACC92107P), 2021년 2월 22일자로 국제기탁번호를 부여받았다(기탁번호: KACC81154BP).
본 발명의 식물병 방제용 조성물에서, 상기 식물병은 진균성 식물병 또는 바이러스성 식물병일 수 있으며, 바람직하게는 상기 진균성 식물병은 갈색줄기썩음병(brown stem rot)이고, 바이러스성 식물병은 담배 모자이크병(Tobacco mosaic disease)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 갈색줄기썩음병은 피알로포라 그레가타( Phialophora gregata)에 의해 발병하고, 담배 모자이크병은 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus, TMV)에 의해 발병한다.
본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 예를 들어 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 식물병 방제용 조성물은 분사, 분무, 살포, 흩뿌림 또는 붓기에 의해 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도한 목적에 의존하는데, 모든 경우에 본 발명에 따른 조성물의 분포가 가능한 한 미세하고 균일하도록 해야 한다.
또한, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 유효성분으로서 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주를 단독으로, 또는 2종 이상의 다른 항균 또는 항바이러스성 물질 등과 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 작물체 흡수 및 효과를 증진시키기 위하여 확산제 및 침투제, 또는 계면활성제와도 혼용이 가능하다.
본 발명은 또한, 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 식물, 식물의 종자 또는 식물 식재 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병의 방제 방법을 제공한다.
상기 식물병을 방제하는 방법으로는 상기 플라보박테리움 속 TCH3-2 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 식물에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 상기 플라보박테리움 속 TCH3-2 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 플라보박테리움 속 TCH3-2 균주 또는 이의 배양액의 유효량에 담가둘 수 있다.
본 발명의 '유효량'은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양으로, 식물병을 방제하기 위해 상기 플라보박테리움 속 TCH3-2 균주 또는 이의 배양액을 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 식물체 및 경작지에 살포할 수 있다.
본 발명의 식물병의 방제 방법에서, 상기 식물은 피알로포라 그레가타 또는 TMV가 감염될 수 있는 식물로, 이에 제한되지 않으나, 완두콩( Pisum sativum) 또는 담배( Nicotiana tabacum)일 수 있다. 상기 식물병은 전술한 바와 같다.
본 발명은 또한, 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주의 배양 방법 및 식물병 방제용 조성물의 제조 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 담배 모자이크병에 대한 저항성 검정
담배( Nicotiana tabacum)를 대상으로 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주(KACC81154BP)를 처리하였을 때, 담배 모자이크 바이러스(TMV, Tobacco mosaic virus)에 의해 발병하는 담배 모자이크병(Tobacco mosaic disease)에 대한 식물체의 저항성 검정을 실시하였다. 담배 종자를 10 9 CFU/㎖로 조정된 TCH3-2 균주 현탁액에 침지하였고(1차 처리), 11일 뒤 발아한 종자는 부농 원예용 상토가 담긴 45×45 ㎟ 포트로 이식하였다. 이식 3일 후 10 9 CFU/㎖로 조정된 TCH3-2 현탁액을 토양 g당 6×10 7 CFU가 되도록 관주하였다(2차 처리). TCH3-2 균주 처리구에 대한 대조구(control)로는 멸균수만 2회 처리한 식물을 사용하였다. 2차 미생물 처리 3주 후, 포장에 이식하였으며, TCH3-2 균주 처리구와 대조구를 각각 30주씩 총 60주를 사용하였고, 동일한 시기에 3반복씩 2회 실시하였다(한 시기에 미생물 처리구 90주와 대조구 90주 등 180주를 사용. 한 반복수당 각 30주 사용. 이 세트를 2회 반복 실시). 포장에 정식 후 4개월간 식물을 생육하며 자연 발생적인 모자이크 병징이 관찰되는 담배 개체수를 계수하였다.
그 결과, 1회차 결과 TCH3-2 처리구에서 90개체 중 6개체(반복구 당 0, 6, 0개체)에서 바이러스 병이 확인된 반면, 대조구에서는 90개체 중 26개에(반복구 당 7, 14, 5개체)에서 발병이 확인되었다. 2회차 검정에서는 1회차에 비하여 두 처리구 모두 발병율이 증가하였는데, TCH3-2 처리구에서는 90개체 중 17개체(반복구 당 3, 6, 8개체)로 증가폭이 높았으며, 대조구 또한 90개체 중 29개체(반복구 당 8, 13, 8개체)로 소폭 증가하였다(표 1). 1 및 2회차 검정 결과를 합하여 평가하였을 때, 도 1에 개시한 바와 같이 TCH3-2 처리구는 총 180개체 중 23개체에서 바이러스병이 발생하였고, 대조구는 180개체 중 55개체에서 발병이 확인되었으며, 통계적으로 유의미한 차이를 보였다.
담배 모자이크병 발병 담배 개체 측정
시료 회차 반복수 TMV 발병 개체수
대조구 1 1 7
2 14
3 5
2 1 8
2 13
3 8
총 55
TCH3-2 처리구 1 1 0
2 6
3 0
2 1 3
2 6
3 8
총 23
또한, 담배 식물체에 발병한 식물 병원성 바이러스를 확인하기 위하여 이병 식물체 시료를 채취하여 액체 질소에 급속 냉각 후 마쇄하였고, 트리졸을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 HelixCript™ Easy cDNA Synthesis kit (NanoHelix)로 cDNA를 합성하였고, Inclone™ Gel & PCR Purification kit (Inclone Biotech)로 순화한 후 사용하였다. 담배에 감염된 병원체를 확인하기 위하여 주요 바이러스 병인 담배 모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus, TMV; TMVF, 5'-CGACATCAGCCGATGCAGC-3'(서열번호 1); TMVR, 5'-ACCGTTTTCGAACCGAGACT-3'(서열번호 2)), 토마토 모자이크바이러스(Tomato mosaic virus, ToMV, ToMVF, 5'-CGAGAGGGGCAACAAACAT-3'(서열번호 3); ToMVR, 5'-ACCTGTCTCCATCTCTTTGG-3'(서열번호 4)), Tobacco bushy top virus(TBTV; TBTVF, 5'-CCACCCAGAAGTCAAGGAAG-3'(서열번호 5); TBTVR, 5'-GCAGTTGTTGCATACCGATT-3'(서열번호 6)), 담배 괴사바이러스(Tobacco necrosis virus, TNV; TNVF, 5'-ACAATAGTCTCCAACTCGGAG-3'(서열번호 7); TNVR, 5'-ATCATAACCTGCGTAAGG-3'(서열번호 8)), 담배 줄무늬바이러스(Tobacco streak virus, TSV; TSVF, 5'-ATGAATAATTTGATCCAA RGTCCA-3'(서열번호 9 R, A 또는 G); TSVR, 5'-GCATCTGGTATAAAGGAGGCAT-3'(서열번호 10)) 및 담배 둥근무늬바이러스(Tobacco ringspot virus, TRSV; TRSVF, 5'-GCCTCTAAGGACGCAACTGTGACG-3'(서열번호 11); TRSVR, 5'-CACAAGCAGCTGACAGACAGACATTC-3'(서열번호 12)) 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. PCR은 AccuPower Pfu PCR PreMix(BIONEER)에 주형 cDNA 2㎕, 10 pmol 정방향 및 역방향 프라이머 각 1 ㎕, 멸균수 16㎕ 등 20㎕ 반응물로 실시하였으며, 예상 되는 PCR 산물의 크기는 TMV-880 bp, ToMV-318 bp, TBTV-518 bp, TNV-280 bp, TSV-1,000 bp 및 TRSV-650 bp이었다. PCR 조건은 다음과 같다: 초기 변성 94℃, 5분; 변성 94℃, 30초, 어닐링 58℃, 45초, 신장 72℃, 45초인 반응을 30회 반복; 마지막 신장 72℃ 5분. 전기영동을 통해 확인한 결과, 1회차 시료를 2회 반복 실시에서 모두 담배 모자이크바이러스(TMV; A-1 및 B-1)만 검출되었고, 2회차 시료는 담배 모자이크바이러스(TMV; C-1 및 D-1)와 토마토 모자이크바이러스(ToMV; C-2 및 D-2)가 검출되었다(도 2). 이를 통해, 실험에 자연발생한 바이러스병은 담배 모자이크 바이러스병인 것을 확인할 수 있었으며, TCH3-2 균주가 포장에서 담배 식물체에 자연발생할 수 있는 담배 모자이크병에 대한 저항성을 부여할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 콩 갈색줄기썩음병에 대한 저항성 검정
완두 품종인 A63( Pisum sativum)을 사용하여 피알로포라 그레가타( Phialophora gregata)에 의해 콩과 작물에 발생하는 갈색줄기썩음병(brown stem rot)에 대한 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주의 병 저항성 증진 효과를 확인하였다. 완두콩 종자는 10 9 CFU/㎖로 조정된 TCH3-2 균주 현탁액에 침지하였고(1차 처리), 5일 뒤 발아한 종자는 부농 원예용 상토가 담긴 45×45 ㎟ 포트로 이식하였다. 이식 2주 후 10 9 CFU/㎖로 조정된 TCH3-2 균주 현탁액을 토양 g당 6×10 7 CFU가 되도록 관주하였다(2차 처리). 대조구(control)로는 멸균수만 2회 처리한 식물을 사용하였다. 2차 TCH3-2 균주 처리 2주 후, 식물은 난괴법 3반복으로 무작위로 포장에 정식하였다. TCH3-2 균주 처리구와 대조구는 각각 40주씩 사용하였으며, 정식 4개월 후 식물을 생육하며 갈색썩음병이 자연발생하도록 유지하였고, 지상부 줄기가 갈변한 식물과 이로 인하여 고사한 식물 개체를 계수하였다. 그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 TCH3-2 균주를 처리하지 않은 대조구(control)는 16개체(반복당 4, 8, 4개체)에서 병징이 관찰된 반면, TCH3-2 균주 처리구에서는 총 40개체 중 7개체(반복당 2, 3, 2개체)만이 발병하였다. 이를 통해, TCH3-2 균주가 포장에서 콩과 식물체에 자연발생할 수 있는 갈색줄기썩음병에 대한 저항성을 부여할 수 있다는 것을 확인하였다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 농업생명공학연구원
수탁번호 : KACC81154BP
수탁일자 : 20210222
Figure PCTKR2021003018-appb-img-000001

Claims (8)

  1. 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KACC81154BP인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 식물병은 진균성 식물병 또는 바이러스성 식물병인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 진균성 식물병은 갈색줄기썩음병(brown stem rot)이고, 바이러스성 식물병은 담배 모자이크병(Tobacco mosaic disease)인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
  5. 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 식물, 식물의 종자 또는 식물 식재 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병의 방제 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물병은 진균성 식물병 또는 바이러스성 식물병인 것을 특징으로 하는 식물병의 방제 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 진균성 식물병은 갈색줄기썩음병(brown stem rot)이고, 바이러스성 식물병은 담배 모자이크병(Tobacco mosaic disease)인 것을 특징으로 하는 식물병의 방제 방법.
  8. 플라보박테리움 속( Flavobacterium sp.) TCH3-2 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조 방법.
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