WO2021175525A1 - Herstellung eines verbunds aus polymersubstraten und gesiegelte mikrofluidische kartusche - Google Patents

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WO2021175525A1
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Jan-Niklas Klatt
Tobias HUTZENLAUB
Stefan Hennig
Nils Paust
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Definitions

  • the present invention relates to methods for joining two polymer substrates, such as can be used, for example, for the production of sealed microfluidic cartridges, and relates to sealed microfluidic cartridges produced using such methods.
  • Microfluidics deals with the handling of liquids in the femtoliter to milliliter range.
  • Microfluidic systems are mostly single-use polymer cartridges, as these have great potential for inexpensive mass production.
  • Such cartridges are used with the intention of automating laboratory processes. Standard laboratory processes such as pipetting, centrifuging, mixing or aliquoting can be implemented in a microfluidic cartridge.
  • the cartridges contain channels for guiding the fluid as well as chambers for collecting liquids.
  • Microfluidics are used, among other things, in laboratory analysis and mobile diagnostics.
  • microfluidic systems has a number of advantages, such as low sample and reagent requirements and increased reaction rates. These advantages result primarily from the small size dimensions of microfluidic systems. However, these small dimensions and the associated large surface-to-volume ratios lead to an increased non-specific binding of biologically relevant analytes such as proteins, nucleic acids, peptides or bacteria. In particular, the unspecific binding of proteins to the substrate material of microfluidic polymer cartridges represents a particular challenge in the automation of protein-based assays, for which a satisfactory universal solution has not yet been found.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • Such coatings can be applied to many polymer substrates relevant in microfluidics, for example to polydimethylsiloxane (PDMS), polymethyl methacrylate (PMMA) or cycloolefin (co) polymers (COC / COP). It has been shown that they can significantly reduce the non-specific adsorption of proteins.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • CO cycloolefin
  • the coating process for this type of coating differs. However, these processes are usually also multi-stage processes that first require activation of the surfaces to be coated, for example with plasma.
  • self-assembling polypeptides are able to independently assemble at interfaces to form a polypeptide layer and thereby change the surface properties of the functionalized surface, such as the surface energy, the roughness / structure, the biocompatibility, the surface chemistry, etc.
  • Self-assembly is understood to mean that these polypeptides are able, under specific conditions, to independently form a defined structure which consists of several monomers of the polypeptide.
  • the self-assembly is based on interactions between the individual monomers of the polypeptide. In the case of some self-assembling polypeptides, interactions between the monomers and an interface also occur, which influence the self-assembly process. sen.
  • amyloid and fiber-forming polypeptides such as spider silk
  • fungal hydrophobins such as the hydrophobin SC3 from Schizophyllum commune
  • bacterial hydrophobins such as the BsIA protein from Bacillus subtilis
  • bacterial surface layer (S-layer) -) Proteins such as the S-layer protein SbsB from Geobacillus stearothermophilus
  • synthetic self-assembling polypeptides and combinations (natural, recombinant and synthetic combinations) of these polypeptides and other self-assembling polypeptides known to the person skilled in the art.
  • EP 1 848 733 B1 covers the production and use of hydrophobic fusion proteins, the class of which also includes the H * protein B.
  • microfluidic cartridges In the manufacture of microfluidic cartridges, substrates are usually sealed, whereby sealing can be understood to mean the fluid-tight connection of the substrates, through which fluid channels and fluid chambers are created or closed in the cartridge. It is known to seal microfluidic cartridges made of thermoplastics. Thermoplastics represent an important class of materials for the production of microfluidic cartridges, as they allow the production of inexpensive disposable cartridges for laboratory analysis. An essential step in the manufacture of microfluidic cartridges is the sealing of the substrates that contain the microfluidic structures. There are a number of approaches to sealing, which can basically be divided into indirect and direct sealing. The most important indirect sealing variant is adhesive bonding, in which the substrates are glued together. The simplicity of this approach is advantageous, as it allows substrates made of different materials to be connected. A disadvantage of this sealing technique, however, is that not all laboratory processes can be automated with adhesively sealed cartridges, since the adhesives used may inhibit biochemical reactions or subsequent analyzes.
  • Direct sealing processes avoid this problem by dispensing with adhesives and the resulting microfluidic structures have homogeneous chemical and mechanical properties.
  • An example of direct victory is thermodiffusion bonding.
  • thermal diffusion bonding the substrates to be connected are brought to a temperature close to or above the glass transition temperature of at least brought one of the two substrates.
  • a print is often also applied.
  • the combination of temperature and pressure leads to a diffusion of the polymer chains between the surfaces, which then leads to a permanent bond. Since this process dispenses with additional solvents, it is an important production process for sealing microfluidic cartridges, as the microfluidic channels that are created have homogeneous surface properties.
  • thermoplastic polymer microfluidics for various thermoplastics
  • DeVoe, DL "Bonding of thermoplastic polymer microfluidics", Microfluid Nanofluid 2009, 6, 1-16, described.
  • the object on which the present invention is based is to create a method for joining two polymer substrates which enables mass production of a composite which has functionalized surfaces. Another object is to provide a sealed microfluidic cartridge that can be mass-produced.
  • Examples of the present invention provide a method for producing a composite of at least two polymer substrates, having the following features: providing two polymer substrates, in particular thermoplastic substrates, each having a connecting surface, at least one of the polymer substrates being coated with at least one self-assembling polypeptide at least in the region of the connecting surface; and connecting the two polymer substrates by compressing the connecting surfaces under pressure and at a temperature which corresponds at least to the glass transition temperature of the material of one of the polymer substrates at the connecting surface, wherein a diffusion of polymer chains between the connecting surfaces takes place through the at least one self-assembling polypeptide and a solid connection is formed between the connecting surfaces.
  • one of the polymer substrates is a polymer cartridge and one of the polymer substrates is a sealing film, so that a sealed microfluidic cartridge is produced as the composite partner.
  • Examples of the present invention provide a sealed microfluidic cartridge which is manufactured using a corresponding method, wherein one of the two polymer substrates is a polymer cartridge and the other of the two polymer substrates is a sealing film.
  • Examples of the invention thus provide methods for producing sealed microfluidic cartridges which can have a coating of both the sealing film and the cartridge substrate with a self-assembling polypeptide.
  • surface areas of the polymer substrates outside the connection areas which come into contact with an analyte when the cartridge is used are also coated with the self-assembling polypeptide.
  • the self-assembling polypeptide is designed to change the interaction between surface and analyte in a targeted manner by functionalizing these surface areas.
  • the self-assembling polypeptide is designed to largely prevent the unspecific binding of analytes (such as biomolecules) to the surface areas.
  • the self-assembling polypeptide can be designed to specifically immobilize the analytes on the functionalized surface areas.
  • the polymer substrates are completely coated with the self-assembling polypeptide. It has been recognized that, despite such a coating with a self-assembling polypeptide, sealing by thermal diffusion bonding is possible while the biochemical functionality of the coating is maintained.
  • Examples of the present invention thus enable the sealing of polymer substrates, at least one of which is provided with one or more stable layers of self-assembling lated polypeptides using a thermodiffusive bonding process. Since the coating is still functional after the sealing process, coated microfluidic cartridges can be manufactured much more easily than with previously known methods. This is primarily due to the fact that the coating can now be applied before the sealing process, which makes the complex coating with several incubation and washing steps in already sealed cartridges superfluous. Furthermore, a high stability of the coating compared to conventional coatings such as BSA or PEG against solvents and temperatures, as well as long-term stability can be achieved. Thus, examples of the present disclosure lend themselves to mass production.
  • a functionalized surface which consists of self-assembled polypeptides, is still functional after a thermodiffusive bonding process in which temperatures above the glass softening temperature of the polymer substrate are used. This could not have been foreseen, since it would have been expected that the polypeptides would denature and the coating would change its properties through the process of thermal diffusion bonding. Furthermore, it was surprisingly recognized that, despite the coating with the self-assembling polypeptide on the connection surfaces, a sufficiently high sealing strength is achieved to process microfluidic cartridges without delamination and thus leaks.
  • FIG. 1A and 1B are schematic cross-sectional views of two polymer substrates before a connection and after a connection thereof, for explaining an example of a method according to the present disclosure
  • FIGS. 2A to 2C are schematic cross-sectional views for explaining a further example of a method according to the present disclosure
  • 3A and 3B are schematic representations of an example of a system for performing thermal diffusion bonding; and 4 shows a schematic representation of examples of possible scenarios in which the methods disclosed herein can be applied.
  • a polypeptide is understood to be a macromolecule that consists of 10 to 20,000 amino acids that are linked by peptide bonds.
  • Self-assembling polypeptides are polypeptides that can independently form layers at interfaces and thereby change certain properties of the interface.
  • the ability of a polypeptide to self-assemble at certain interfaces depends on the properties of the interface and of the self-assembling polypeptide.
  • stable layers for the hydrophobin H * protein B can preferably form on hydrophobic surfaces.
  • the self-assembling polypeptides are self-assembling with respect to the material of the interface to which the coating is applied.
  • the term analyte should be understood to mean those substances contained in a sample about which a statement should be made in a chemical analysis.
  • analytes can be, for example, proteins, peptides, nucleic acids, metabolites, secondary metabolites, vitamins, pigments, cells (human, plant or animal cells as well as fungi, bacteria or mycoplasmas) and viruses.
  • analyte also includes nanomaterials such as nanoparticles, quantum dots and carbon nano tubes.
  • thermal diffusion bonding or thermal diffusion bonding of polymer substrates is understood to mean a method that is based on one of the substrates to be connected being brought to a temperature close to or above the glass transition temperature. Due to the increased temperature and the pressing of the hot substrates together with pressure, sufficient mobility of the polymer chains is achieved, so that a diffusive process begins, through which the two substrates connect.
  • glass transition temperature refers to a temperature at which completely or partially amorphous polymers change from a brittle state to a highly viscous, flexible range. In the case of thermoplastics, this transition is reversible.
  • sealing film is to be understood as an unstructured substrate that is connected to a structured polymer substrate that contains a microfluidic structure and is also referred to herein as a polymer cartridge.
  • microfluidic structures, systems or cartridges are to be understood as meaning those that are designed, i.e. have appropriate dimensions, to handle liquids in the femtoliter to milliliter range.
  • a first polymer substrate 10 and a second polymer substrate 12 are provided. It should be pointed out at this point that hatching has been omitted in FIGS. 1A and 1B for purposes of illustration.
  • the first polymer substrate 10 has one or more connection surfaces 10a and the second polymer substrate 12 has one or more connection surfaces 12a.
  • the connection surfaces 10a and 12a are surfaces on which the polymer substrates 10 and 12 are to be connected.
  • the first polymer substrate 10 has a coating 20 of a self-assembling polypeptide at least in the region of the connecting surface 10a.
  • the second polymer substrate 12 has a coating 22 of a self-assembling polypeptide at least in the region of the connecting surface 12a. In other examples, only one of the polymer substrates 10, 12 has a coating with a self-assembling polypeptide.
  • the two polymer substrates 10 and 12 are completely coated with the self-assembling polypeptide. This can be done, for example, by immersing the polymer substrates 10 and 12 in a solution with the self-assembling polypeptide. In other examples, only the interfaces are coated with the self-assembling polypeptide. In other examples, the bonding surfaces and areas of the polymer substrates that come in contact with analytes in use are coated with the self-assembling polypeptide.
  • the two polymer substrates 10 and 12 are joined by compressing the joining surfaces 10a and 12a under pressure and at a temperature at least equal to the glass transition temperature of the material of one of the polymer substrates at the joining surface 10a, 12a.
  • a diffusion of polymer chains takes place between the connection surfaces 10a, 12a through the self-assembling polypeptide and a firm connection is formed between the connection surfaces 10a, 12a.
  • Thermal diffusion bonding thus takes place through the coatings 20 and 22.
  • the polymer substrate 10 has a recess 40, the surfaces of which are also provided with the coating 20. By connecting the polymer substrates 10, 12, this recess is covered by the polymer substrate 12.
  • the recess can, for example, represent fluidic structures such as one or more fluid channels and / or one or more fluid chambers.
  • the surfaces that define these fluidic structures are provided with the coating 20, 22, so that an interaction between the surfaces and analytes that come into contact with them can be changed in a targeted manner.
  • the two polymer substrates are planar on the side on which the bond occurs.
  • both polymer substrates can have recesses on the side on which the connection takes place.
  • the at least one polypeptide is a single polypeptide. In examples, the at least one polypeptide is a mixture of different self-assembling polypeptides.
  • two polymer substrates are bonded together.
  • a larger number of polymer substrates can also be correspondingly connected to one another.
  • a composite of a cartridge and two sealing foils, which can consist of different materials, can be produced.
  • the sealing films can, for example, close different areas of the cartridge, which can be on the same side or on different sides of the cartridge.
  • the pressure with which the polymer substrates 10, 12 are compressed is at least 1.2 bar and the compression takes place for a period of at least 1 second. This enables a secure connection to be established between the polymer substrates.
  • one of the two polymer substrates e.g., polymer substrate 10
  • the other of the two polymer substrates e.g., polymer substrate 12
  • the microfluidic polymer cartridge may have a fluidic structure, e.g., recess 40, that is open to the side to be connected to the other polymer substrate. When connecting, the fluidic structure can then be closed by the sealing film.
  • Examples thus create a method for producing a sealed microfluidic polymer cartridge or a microfluidic polymer cartridge produced by such a method, wherein a sealed, fully functionalized cartridge (all surfaces of the microfluidic structure are coated) can be obtained without the sealed cartridge after assembly the cartridge has to be treated in a further step (e.g. rinsing).
  • the polymer substrates 10, 12 have a material with a surface that enables self-assembly of the self-assembling polypeptide.
  • the polymer substrates are thermoplastic substrates made from a thermoplastic material.
  • both polymer substrates are made of the same material.
  • the polymer substrates consist of different materials.
  • the polymer substrates consist of a cycloolefin copolymer. Show examples the polymer substrates have a material selected from the group consisting of polydimethylsiloxane (PDMS), polymethyl methacrylate (PMMA) or cycloolefin (co) polymers (COC / COP).
  • the self-assembling polypeptides selected for the coating are those which are able to form robust polypeptide layers and which are not affected by the action of certain chemicals (eg acids, bases, detergents, organic solvents) and / or an elevated temperature the surface can be detached.
  • the polypeptide layers are selected to retain their properties even after exposure to these factors. It can thereby be achieved that the self-assembling polypeptides do not become detached from the surface during the sealing and the use of the microfluidic cartridge. In this way, contamination of a biological sample by self-assembling polypeptides (or their cleavage products) can advantageously be prevented.
  • the coating of the self-assembling polypeptide can be a monolayer, i.e. only one layer of polypeptides on the substrate, a bilayer, i.e. two layers of polypeptides on the substrate, or a multilayer, i.e. three or more layers of the polypeptide on the substrate.
  • the self-assembling polypeptides according to this disclosure are natural polypeptides (e.g. polypeptides isolated from natural organisms), recombinant polypeptides (e.g. polypeptides isolated from recombinant organisms), synthetic polypeptides (e.g.
  • polypeptides synthesized in a chemical synthesis process modified polypeptides (eg post-translationally modified polypeptides or chemically modified polypeptides) and a combination of these possibilities.
  • the coating is a monolayer, since this makes it possible to achieve greater reliability of the thermal diffusion process.
  • hydrophobins from filamentous fungi and their recombinant and synthetic derivatives are particularly advantageous for the above purposes.
  • Hydrophobins are comparatively small polypeptides (approx. 100 amino acids) with an amphiphilic protein structure, ie the protein has a hydrophilic and a hydrophobic surface domain. This makes hydrophobins one of the proteins with the highest surface activity.
  • the individual hydrophobin monomers interact both with the interface and with other monomers and thus form a stable polypeptide monolayer (self-assembly). Due to the amphiphilic character of the hydrophobins, the surface energy of the functionalized surface is changed.
  • hydrophobins are divided into two classes (class I and class II), with class I hydrophobins forming particularly stable protein layers that are not affected by the action of detergents, acids, alkalis or high temperatures the functionalized surface can be detached. Therefore, hydrophobins, in particular class I hydrophobins, are particularly advantageous for the present disclosure.
  • the self-assembling polypeptide is a recombinant hydrophobin and, in particular, the hydrophobin H * protein B.
  • a self-assembling polypeptide on the one hand, it is possible to reliably prevent analytes from being adsorbed on the surface that is coated with it, and on the other hand, a reliable Ther - Modiffusion process take place.
  • non-specific adsorption of analytes from a biological sample on the surface of a microfluidic cartridge can thus be prevented.
  • self-assembling polypeptides can be used.
  • amyloid and fiber-forming polypeptides such as spider silk
  • fungal hydrophobins such as the hydrophobin SC3 from Schizophyllum commune
  • bacterial hydrophobins such as the BsIA protein from Bacillus subtilis
  • bacterial surface layer S-layer
  • Proteins such as the S-layer protein SbsB from Geobacillus stearothermophilus
  • synthetic self-assembling polypeptides and combinations (natural, recombinant and synthetic combinations) of these polypeptides and other self-assembling polypeptides known to the person skilled in the art.
  • the self-assembling polypeptide is selected in order to alter an interaction between the surface coated with the same and the analytes in a targeted manner with regard to specific analytes. In examples, the self-assembling polypeptide is selected in order to prevent non-specific binding of the analytes to the surface. In examples, the self-assembling polypeptide is selected to effect immobilization of the analytes on the surface coated therewith.
  • At least one of the two polymer substrates has a first layer and a second layer, with the connection surface of this substrate on the second Layer is arranged, and wherein the second layer has a lower glass transition temperature than the first layer and wherein the temperature at which the compression takes place is higher than the glass transition temperature of the second layer.
  • the compression temperature may also be less than the glass transition temperature of the first layer.
  • FIGS. 2A to 2C schematically show cross-sectional views to explain such an example in which a first polymer substrate 50 and a second polymer substrate 52 are provided.
  • FIGS. 2A to 2C each show only sections of the polymer substrates 50 and 52.
  • the first polymer substrate 50 has a first layer 60 and a second layer 62.
  • the second polymer substrate 52 has a first layer 64 and a second layer 66.
  • the first polymer substrate 50 has one or more connection surfaces 50a and the second polymer substrate 52 has one or more connection surfaces 52a.
  • a coating 70 of a self-assembling polypeptide is provided on the first polymer substrate 50 and a coating 72 of a self-assembling polypeptide is provided on the second polymer substrate 52.
  • only one of the polymer substrates 50, 52 could be provided with a coating and the coating (s) could again be provided over the entire surface or in sections.
  • the first polymer substrate 50 in turn has a recess 40.
  • the polymer substrates 50, 52 are brought together so that the connecting surfaces 50a and 52a are aligned with one another, as shown in FIG. 2B.
  • the polymer substrates 50, 52 are then subjected to pressure and temperature in order to connect them by thermal diffusion.
  • the resulting structure, with the surfaces of the cavity covered by coatings 70, 72, is shown in Figure 2C.
  • Layers 60 and 64 can be composed of a first thermoplastic material and layers 62 and 66 can be composed of a second thermoplastic material.
  • the second thermoplastic material has a lower glass transition temperature than the first thermoplastic material.
  • the first thermoplastic material may have a glass transition temperature that is greater than the temperature used to bond the polymer substrates 50 and 52 together.
  • the polymer substrates can be parts of a microfluidic cartridge, so that a sealed microfluidic cartridge is obtained after the connection.
  • the first and the second polymer substrate 50, 52 can be multilayer COC films coated with the hydrophobin H * protein B, the polymer substrate 50 representing a polymer cartridge and the polymer substrate 52 representing a sealing film.
  • the microfluidic cartridge 50 consists of a composite of two cycloolefin copolymer layers 62 and 60 (COC 8007/6013) which differ in terms of their glass transition temperature (78 ° C./135 ° C.).
  • the sealing film 52 can consist of a composite of two cycloolefin copolymer layers 66 and 64 made of the same materials as the layers 62 and 60 or other materials.
  • the glass transition temperature of the carrier layer 60 or 64 is above the glass transition temperature of the connecting layer 62 or 64, which has the connecting surfaces, which can also be referred to as the sealing layer.
  • the combination of two layers or foils with different glass transition temperatures makes it possible to ensure sufficient mobility of the polymer chains in the connecting layer by carefully selecting the process temperature during the diffusive bonding process. At the same time, the dimensional stability of the microfluidic structures can be ensured by the carrier layer.
  • the process temperature Tp r0Z ess can be selected according to the following formula in order to be greater than the glass transition temperature TGsi eg ei layer and less than the glass transition temperature of the carrier layer TG-n-ager harsh:
  • the first and second polymer substrates can be coated as follows, for example if the substrates consist of a COC material.
  • a solution with a concentration of 1 g / l is prepared by dissolving 50 mg of H * protein B in 50 ml of DI water. The solution is stirred for 30 minutes at room temperature and then centrifuged for two minutes at 2000 g. The clear supernatant is transferred to a new reaction vessel and adjusted to a final concentration of 10 pg / ml in a 0.5-fold phosphate-buffered saline solution (PBS).
  • PBS 0.5-fold phosphate-buffered saline solution
  • the final concentration of the solution should be in the range of 1 pg / ml and 35 pg / ml.
  • the polymer substrates i.e. the cartridges and sealing films
  • Both cartridges and sealing foils can be rinsed with both PBS and water after coating in order to remove excess H * protein B.
  • a concentration of the solution in the range specified above can, on the one hand, reliably prevent the adsorption of proteins on the resulting coating and, on the other hand, result in a high seal strength.
  • thermal diffusion bonding The correspondingly coated polymer substrates can then be bonded to one another using thermal diffusion bonding.
  • the basic mode of operation of thermal diffusion bonding has already been explained above.
  • a specific example of a process for the thermal diffusion bonding of multilayer COC foils is shown in FIGS. 3A and 3B.
  • the coated polymer substrates (cartridge and sealing film) are correctly aligned with one another and then placed in a sealing system, as shown in FIG. 3A.
  • the sealing system has an upper sealing plate 100 and a receptacle 102.
  • the receptacle 102 has a recess 104 in which spring pins 106 are arranged.
  • the spring pins 106 protrude upward from the recess 104.
  • the upper seal plate 100 is heated to a temperature Tbaldei plate and the receptacle 102 can be heated to a temperature T un tere recording.
  • the temperature Têtei plate can be, for example, 115 ° C and the temperature Tuntere Aufna e can be, for example, 95 ° C.
  • the temperatures are chosen so that during the subsequent bonding the temperature of the connecting layers is brought to at least their glass transition temperature.
  • a pressure opening 108 is also provided in the receptacle 102, via which an overpressure can be generated in the recess 104. Furthermore, a vacuum can be generated in a chamber in which the sealing plate 100 and the receptacle 102 are arranged.
  • the arrangement 110 of cartridge and sealing film is placed on the spring pins, as shown in FIG. 3A.
  • the outer edges of the assembly 110 protrude from the outer edges of the recess 104.
  • the upper sealing plate 100 is lowered and presses the assembly 110 against the force of the spring pins 106 against the upper surface of the receptacle 102, as shown in FIG. 3B.
  • the arrangement 110 closes the recess 104 in the lower sealing plate 102 at the top, so that a closed cavity is generated in which an overpressure can be generated via the pressure opening 108.
  • the upper sealing plate 100 and the receptacle 102 are heated. In one example, the top plate is heated to 115 ° C.
  • the chamber is evacuated. Subsequently, overpressure is applied via the pressure opening 108 to the recess 104 closed at the top by the arrangement 110, so that a maximum contact pressure is achieved, for example a contact force of 15 kN.
  • the structured cartridge side is pressed against the sealing film under pressure, for example a pressure of 1.2 bar, in order to achieve uniform contact.
  • a pressing time which can be, for example, 5 seconds, the cartridge and sealing film were thermodiffusively connected, the chamber can be ventilated again and the sealed arrangement can be removed after the upper sealing plate 100 has been raised again.
  • FIG. 1 One possible application of the method described herein is the sealing of microfluidic polymer cartridges that have previously been coated with a self-assembling polypeptide, for example a hydrophobin.
  • Such sealed microfluidic cartridges can, as shown in FIG. 4, serve to process samples or reagents which can contain proteins, peptides, bacteria, cells, nucleic acids and / or buffers.
  • processing includes all steps that are necessary to carry out a bio-chemical assay.
  • the sealed microfluidic cartridge is coated in order to prevent, for example, the loss of the sample or the reagents in the microfluidic structure, in that the coating of the self-assembling polypeptide prevents the sample or analytes of the sample from adhering to the microfluidic structures.
  • the self-assembling polypeptides can be selected to provide a different functionality, for example to immobilize analytes in the microfluidic structures or certain areas of the microfluidic structures.
  • the microfluidic structures can form a fluidic network which is coated accordingly and through which the sample or the reagents are wholly or partially passed.
  • the cartridge can also be referred to as a microfluidic chip.
  • the aim of processing is, for example, to bring the processed sample to a detection area on the sealed microfluidic cartridge in which detection takes place, or to convey the processed sample to a suitable extraction interface, such as a chamber or a transition into a reaction vessel.
  • a suitable extraction interface such as a chamber or a transition into a reaction vessel.
  • the heat input during the sealing process means that the temperature of the substrate during the sealing process corresponds at least to the glass transition temperature of the substrate material, so that sufficient mobility of the molecules in the polymer substrate is created, so that when the substrates, of which at least one is appropriately coated, are brought together, a fixed one Connection of the substrates through the coating with the self-assembling polypeptide arises.
  • at least one of the two substrates can have a layer with a lower glass transition temperature and a layer with a higher glass transition temperature in order to greatly increase the mobility of the surface molecules when heated.
  • the second layer with a higher glass transition temperature can simultaneously maintain dimensional stability.
  • Examples of the present disclosure thus enable biofunctional polymer substrates to be connected permanently and inexpensively to form a functional microfluidic cartridge without restricting the functionality of the functionalized surface.
  • This is possible by coating with a self-assembling polypeptide before the polymer substrates, in particular made of a thermoplastic material, are connected through the coating made of self-assembling polypeptide by means of a thermodiffusion bonding process.
  • surfaces of microfluidic structures in microfluidic cartridges can be coated in that parts of the cartridge are completely coated accordingly, for example, and the parts of the cartridge are then connected by thermal diffusion bonding.
  • a structured polymer cartridge is connected to a sealing film in each of the above examples
  • other components of a cartridge can be connected to one another in alternative examples, for example a first structured part of the later cartridge with a second structured part of the later cartridge.
  • two structured or two unstructured polymer cartridge parts can also be connected to one another by a corresponding method.

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Abstract

Bei einem Verfahren zur Herstellung eines Verbunds aus zumindest zwei Polymersubstraten werden zwei Polymersubstrate bereitgestellt, die jeweils eine Verbindungsfläche aufweisen. Zumindest eines der Polymersubstrate ist zumindest im Bereich der Verbindungsfläche mit einem selbstassemblierenden Polypeptid beschichtet. Die beiden Polymersubstrate werden durch Zusammendrücken der Verbindungsflächen unter Druck und bei einer Temperatur, die mindestens der Glasübergangstemperatur des Materials von einem der Polymersubstrate an der Verbindungsfläche entspricht, verbunden, wobei eine Diffusion von Polymerketten zwischen den Verbindungsflächen durch das selbstassemblierende Polypeptid stattfindet und eine feste Verbindung zwischen den Verbindungsflächen gebildet wird. Eine gesiegelte mikrofluidische Kartusche weist eine Polymerkartusche und eine Siegelfolie auf, die durch ein solches Verfahren verbunden sind.

Description

Herstellung eines Verbunds aus Polymersubstraten und gesiegelte mikrofluidische
Kartusche
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Verbinden zweier Polymersubstrate, wie sie zum Beispiel zur Herstellung von gesiegelten mikrofluidischen Kartuschen verwendet werden können, und betrifft unter Verwendung solcher Verfahren hergestellte gesiegelte mikrofluidische Kartuschen.
Hintergrund
Die Mikrofluidik beschäftigt sich mit der Handhabung von Flüssigkeiten im Femtoliter- bis Milliliter-Bereich. Mikrofluidiksysteme sind meist Polymer-Einwegkartuschen, da diese großes Potential zur günstigen Massenfertigung besitzen. Solche Kartuschen werden verwendet, mit der Absicht, Laborprozesse zu automatisieren. Dabei können Standardlaborprozesse, wie Pipettieren, Zentrifugieren, Mischen oder Aliquotieren, in einer mikrofluidischen Kartusche implementiert werden. Zu diesem Zweck beinhalten die Kartuschen Kanäle für die Fluidführung sowie Kammern für das Auffangen von Flüssigkeiten. Anwendung findet die Mikrofluidik unter anderem in der Laboranalytik und in der mobilen Diagnostik.
Gerade in diesen Bereichen hat die Verwendung mikrofluidischer Systeme einige Vorteile, wie beispielsweise einen geringen Proben- und Reagenzienbedarf sowie erhöhte Reaktionsraten. Diese Vorteile resultieren in erster Linie aus den kleinen Größenabmessungen mikrofluidischer Systeme. Allerdings führen diese kleinen Dimensionen und die damit verbundenen großen Oberflächen-zu-Volumenverhältnisse zu einer verstärkten unspezifischen Anbindung von biologisch relevanten Analyten wie beispielsweise Proteinen, Nukleinsäuren, Peptiden oder Bakterien. Insbesondere die unspezifische Anbindung von Proteinen an das Substratmaterial von mikrofluidischen Polymerkartuschen stellt eine besondere Herausforderung bei der Automatisierung von proteinbasierten Assays dar, für die bis heute keine zufriedenstellende universelle Lösung gefunden wurde. Dies liegt unter anderem daran, dass es bis heute nur eingeschränkte Möglichkeiten gibt, biofunktionalisierte Polymersubstrate dauerhaft und kostengünstig zu einer funktionalen mikrofluidischen Kartusche zu verbinden, ohne die Funktionalität der funktionalisierten Oberfläche einzuschränken. Es sind Verfahren zur Reduktion einer unspezifischen Anbindung von Proteinen in mikro- fluidischen Systemen, zum Siegeln von mikrofluidischen Polymerkartuschen und zur Beschichtung von Substraten mit selbstassemblierenden Polypeptiden bekannt. Dabei wird im Folgenden auf gängige Passivierungsmethoden für mikrofluidischen Kartuschen zur Vermeidung einer Proteinadsorption eingegangen.
Um eine unspezifische Adsorption von biologisch relevanten Analyten in mikrofluidischen Systemen zu reduzieren, ist ein Blockieren der Oberflächen mit BSA, Bovine Serum Albumin, die gängigste Methode. Um die Oberflächen von mikrofluidischen Systemen mit BSA zu blockieren, wird in der Regel eine assemblierte mikrofluidische Kartusche mit einer BSA-haltigen Lösung gespült und inkubiert. Danach folgt mindestens ein weiterer Waschschritt, um ungebundenes BSA zu entfernen.
Ein anderer sehr verbreiteter Ansatz ist das Aufbringen von Polymerbeschichtungen wie beispielsweise Polyethylenglycol (PEG). Solche Beschichtungen können auf viele in der Mikrofluidik relevante Polymersubstrate aufgebracht werden, beispielsweise auf Polydime- thylsiloxan (PDMS), Polymethylmethacrylat (PMMA) oder Cycloolefin-(Co)polymere (COC/COP). Sie können die unspezifische Adsorption von Proteinen nachweislich deutlich verringern. Je nach Substratmaterial unterscheidet sich der Beschichtungsprozess für diese Art von Beschichtungen. Jedoch sind diese Prozesse in der Regel ebenfalls mehrstufige Prozesse, die zunächst eine Aktivierung der zu beschichteten Oberflächen, wie beispielsweise mit Plasma, benötigen.
Es ist ferner bekannt, dass selbstassemblierende Polypeptide in der Lage sind, an Grenzflächen selbstständig zu einer Polypeptid-Lage zu assemblieren und dabei die Oberflächeneigenschaften der funktionalisierten Oberfläche zu verändern, wie z.B. die Oberflächenenergie, die Rauheit/Struktur, die Biokompatibilität, die Oberflächenchemie usw.
Verschiedene selbstassemblierende Polypeptide sind in der Literatur beschrieben. Unter Selbstassemblierung wird dabei verstanden, dass diese Polypeptide in der Lage sind, unter spezifischen Bedingungen selbstständig eine definierte Struktur auszubilden, die aus mehreren Monomeren des Polypeptids besteht. Die Selbstassemblierung beruht dabei auf Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Monomeren des Polypeptids. Bei einigen selbstassemblierenden Polypeptiden treten zusätzlich Wechselwirkungen zwischen den Monomeren und einer Grenzfläche auf, die den Selbstassemblierungsprozess beeinflus- sen. Dazu zählen beispielsweise Amyloid- und Faser-bildende Polypeptide (wie z.B. Spinnenseide), pilzliche Hydrophobine (wie z.B. das Hydrophobin SC3 aus Schizophyllum commune), bakterielle Hydrophobine (wie z.B. das BsIA-Protein aus Bacillus subtilis), bakterielle Oberflächenschicht- (S-Layer-) Proteine (wie z.B. das S-Layer-Protein SbsB aus Ge- obacillus stearothermophilus) , synthetische selbstassemblierende Polypeptide, und Kombinationen (natürliche, rekombinante und synthetische Kombinationen) aus diesen Polypeptiden sowie weitere, dem Fachmann bekannte selbstassemblierende Polypeptide. Beispielsweise deckt die EP 1 848 733 B1 die Herstellung und Verwendung von Hydrophobinfusionsproteinen ab, zu deren Klasse auch das H*Protein B gehört. Aus B. von Vacano u.a., „Hydrophobin can prevent secondary protein adsorption on hydrophobic Substrates without exchange”, Anal Bioanal Chem (2011) 400:2031-2040, ist es bekannt, dass dieses rekombinate Hydrophobin eine sekundäre Proteinadsorption auf hydrophoben Substraten verhindern kann.
Bei der Herstellung mikrofluidischer Kartuschen werden in der Regel Substrate gesiegelt, wobei unter Siegeln das fluiddichte Verbinden der Substrate verstanden werden kann, durch das Fluidkanäle und Fluidkammern in der Kartusche erzeugt bzw. verschlossen werden. Es ist bekannt, mikrofluidische Kartuschen aus Thermoplasten zu siegeln. Thermoplaste stellen für die Herstellung mikrofluidischer Kartuschen eine wichtige Materialklasse dar, da sie die Herstellung kostengünstiger Einwegkartuschen für die Laboranalytik erlauben. Ein essenzieller Schritt bei der Herstellung mikrofluidischer Kartuschen ist das Siegeln der Substrate, die die mikrofluidischen Strukturen enthalten. Für das Siegeln existiert eine Vielzahl von Ansätzen, die grundsätzlich in indirektes und direktes Siegeln unterteilt werden können. Die wichtigste indirekte Siegelvariante ist ein adhäsives Bonden, bei dem die Substrate verklebt werden. Vorteilhaft ist die Einfachheit dieses Ansatzes, die es erlaubt, auch Substrate aus unterschiedlichen Materialien zu verbinden. Ein Nachteil dieser Siegeltechnik ist jedoch, dass nicht alle Laborprozesse mit adhäsiv gesiegelten Kartuschen automatisiert werden können, da die verwendeten Klebstoffe unter Umständen biochemische Reaktionen oder nachfolgende Analysen inhibieren.
Direkte Siegelverfahren umgehen diese Problematik, indem auf Klebstoffe verzichtet wird und die somit resultierenden mikrofluidischen Strukturen homogene chemische und mechanische Eigenschaften aufweisen. Ein Beispiel eines direkten Siegeins ist das Thermo- diffusionsbonden. Beim Thermodiffusionsbonden werden die zu verbindenden Substrate auf eine Temperatur nahe oder oberhalb der Glasübergangstemperatur von mindestens einem der beiden Substrate gebracht. Um den Kontakt zwischen den Substraten zu garantieren, wird dabei häufig zusätzlich ein Druck aufgeprägt. Die Kombination aus Temperatur und Druck führt zu einer Diffusion der Polymerketten zwischen den Oberflächen, was dann zu einer dauerhaften Verbindung führt. Da dieses Verfahren auf zusätzliche Lösemittel verzichtet, stellt es ein wichtiges Produktionsverfahren zum Siegeln von mikrofluidischen Kartuschen dar, da die entstehenden mikrofluidischen Kanäle homogene Oberflächeneigenschaften aufweisen. Die Verwendung von Thermodiffusionsbonden auf dem Gebiet der Mikrofluidik für verschiedene Thermoplaste ist beispielsweise bei Tsao, C.-W.; DeVoe, D. L., „Bonding of thermoplastic polymer microfluidics“, Microfluid Nanofluid 2009, 6, 1-16, beschrieben.
Das Passivieren zur Vermeidung von Adsorption von biologisch relevanten Analyten in mikrofluidischen Kartuschen erfordert eine Beschichtung des ursprünglichen Polymersubstrates. Diese Beschichtungen können unterschiedlicher Natur sein, wie beispielsweise bio- funktionalisierte Oberflächen (Blockieren mit BSA) oder auch Polymerbeschichtungen (PEG). Das Siegeln von derart beschichteten Kartuschen ist allerdings schwierig, da diese Beschichtungen unter typischen Prozessbedingungen für direkte Siegelungsverfahren, wie das Thermodiffusionsbonden, aufgrund der herrschenden Temperaturen und Drücke degradieren und somit nicht mehr funktional sind.
Die fehlende Möglichkeit, funktionalisierte Kartuschen massenfertigungstauglich zu siegeln, führt dazu, dass die Kartuschen erst nach erfolgter Siegelung beschichtet werden. Dies bedeutet, dass die komplette Kartusche mehrfach gespült werden muss, was die Massenproduktion schwierig macht.
Beschreibung der Erfindung
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zum Verbinden zweier Polymersubstrate zu schaffen, das eine Massenproduktion eines Verbunds, der funktionalisierte Oberflächen aufweist, ermöglicht. Eine weitere Aufgabe besteht darin, eine gesiegelte mikrofluidische Kartusche zu schaffen, die mittels einer Massenproduktion hergestellt werden kann.
Beispiele der vorliegenden Erfindung schaffen ein Verfahren zur Herstellung eines Verbunds aus zumindest zwei Polymersubstraten, mit folgenden Merkmalen: Bereitstellen zweier Polymersubstrate, insbesondere Thermoplastsubstrate, die jeweils eine Verbindungsfläche aufweisen, wobei zumindest eines der Polymersubstrate zumindest im Bereich der Verbindungsfläche mit zumindest einem selbstassemblierenden Polypeptid beschichtet ist; und Verbinden der beiden Polymersubstrate durch Zusammendrücken der Verbindungsflächen unter Druck und bei einer Temperatur, die mindestens der Glasübergangstemperatur des Materials von einem der Polymersubstrate an der Verbindungsfläche entspricht, wobei eine Diffusion von Polymerketten zwischen den Verbindungsflächen durch das zumindest eine selbstassemblierende Polypeptid stattfindet und eine feste Verbindung zwischen den Verbindungsflächen gebildet wird. Bei Beispielen ist eines der Polymersubstrate eine Polymerkartusche und eines der Polymersubstrate eine Siegelfolie, sodass als Verbundpartner eine gesiegelte mikrofluidische Kartusche hergestellt wird.
Beispiele der vorliegenden Erfindung schaffen eine gesiegelte mikrofluidische Kartusche, die unter Verwendung eines entsprechenden Verfahrens hergestellt ist, wobei eines der beiden Polymersubstrate eine Polymerkartusche ist und das andere der beiden Polymersubstrate eine Siegelfolie ist.
Beispiele der Erfindung schaffen somit Verfahren zum Herstellen von gesiegelten mikroflu- idischen Kartuschen, die eine Beschichtung von sowohl der Siegelfolie als auch des Kartuschensubstrats mit einem selbstassemblierenden Polypeptid aufweisen können. Bei Beispielen sind Oberflächen bereiche der Polymersubstrate außerhalb der Verbindungsflächen, die bei Benutzung der Kartusche mit einem Analyten in Berührung kommen, ebenfalls mit dem selbstassemblierenden Polypeptid beschichtet. Bei Beispielen ist das selbstassemblierende Polypeptid ausgelegt, um durch eine Funktionalisierung dieser Oberflächenbereiche die Interaktion zwischen Oberfläche und Analyten zielgerichtet zu verändern. Bei Beispielen ist das selbstassemblierende Polypeptid ausgelegt, um die unspezifische Anbindung von Analyten (wie z.B. Biomolekülen) an die Oberflächenbereiche weitgehend zu verhindern. Bei anderen Beispielen kann das selbstassemblierende Polypeptid ausgelegt sein, um die Analyten gezielt auf den funktionalisierten Oberflächenbereichen zu immobilisieren. Bei Beispielen sind die Polymersubstrate vollständig mit dem selbstassemblierenden Polypeptid beschichtet. Es wurde erkannt, dass trotz einer solchen Beschichtung mit einem selbstassemblierenden Polypeptid eine Siegelung durch ein Thermodiffusionsbonden möglich ist, während die biochemische Funktionalität der Beschichtung aufrechterhalten wird.
Beispiele der vorliegenden Erfindung ermöglichen somit das Siegeln von Polymersubstraten, von denen zumindest eines mit einer oder mehreren stabilen Lagen von selbstassemb- lierten Polypeptiden beschichtet wurde, unter Verwendung eines thermodiffusiven Bondprozesses. Da die Beschichtung nach dem Siegelprozess noch funktional ist, können beschichtete mikrofluidische Kartuschen deutlich leichter hergestellt werden als mit bislang bekannten Verfahren. Dies ist in erster Linie dadurch begründet, dass die Beschichtung nun vor dem Siegelprozess aufgebracht werden kann, was das aufwändige Beschichten mit mehreren Inkubations- und Waschschritten in bereits gesiegelten Kartuschen überflüssig macht. Des Weiteren kann eine hohe Stabilität der Beschichtung im Vergleich mit herkömmlichen Beschichtungen wie BSA oder PEG gegenüber Lösemitteln und Temperaturen, sowie eine Langzeitstabilität erreicht werden. Somit eignen sich Beispiele der vorliegenden Offenbarung für eine Massenfertigung.
Es wurde überraschend erkannt, dass eine funktionalisierte Oberfläche, die aus selbstas- semblierten Polypeptiden besteht, nach einem thermodiffusiven Bondprozess, bei dem Temperaturen über der Glaserweichungstemperatur des Polymersubstrats verwendet werden, noch funktional ist. Dies war nicht vorherzusehen, da zu erwarten gewesen wäre, dass die Polypeptide denaturieren und die Beschichtung durch den Prozess des Thermodiffusi- onsbondens ihre Eigenschaften ändert. Ferner wurde überraschend erkannt, dass trotz der Beschichtung mit dem selbstassemblierenden Polypeptid auf den Verbindungsoberflächen eine ausreichend hohe Siegelfestigkeit erreicht wird, um mikrofluidische Kartuschen zu prozessieren, ohne dass es zu einer Delamination und somit zu Undichtigkeiten kommt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Beispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend Bezug nehmend auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
Fig. 1A und 1B schematische Querschnittansichten zweier Polymersubstrate vor einer Verbindung und nach einer Verbindung derselben zur Erläuterung eines Beispiels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Offenbarung;
Fig. 2A bis 2C schematische Querschnittansichten zur Erläuterung eines weiteren Beispiels eines Verfahren gemäß der vorliegenden Offenbarung;
Fig. 3A und 3B schematische Darstellungen eines Beispiels einer Anlage zum Durchführen eines Thermodiffusionsbondens; und Fig. 4 eine schematische Darstellung von Beispielen möglicher Szenarien, bei denen hierin offenbarte Verfahren angewendet werden können.
Detaillierte Beschreibung
Im Folgenden werden Beispiele der vorliegenden Erfindung detailliert und unter Verwendung der beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es sei darauf hingewiesen, dass gleiche Elemente oder Elemente, die die gleiche Funktionalität aufweisen, mit gleichen oder ähnlichen Bezugszeichen versehen sein können, wobei eine wiederholte Beschreibung von Elementen, die mit dem gleichen oder einem ähnlichen Bezugszeichen versehen sind, typischerweise weggelassen wird. Beschreibungen von Elementen, die gleiche oder ähnliche Bezugszeichen aufweisen, sind gegeneinander austauschbar. In der folgenden Beschreibung werden viele Details beschrieben, um eine gründlichere Erklärung von Beispielen der Erfindung zu liefern. Es ist jedoch für Fachleute offensichtlich, dass andere Beispiele ohne diese spezifischen Details implementiert werden können. Merkmale der unterschiedlichen beschriebenen Beispiele können miteinander kombiniert werden, es sei denn, Merkmale einer entsprechenden Kombination schließen sich gegenseitig aus oder eine solche Kombination ist ausdrücklich ausgeschlossen.
Bevor auf Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung näher eingegangen wird, seien zunächst einige Begriffe erläutert.
Unter einem Polypeptid wird ein Makromolekül verstanden, das aus 10 bis 20.000 Aminosäuren besteht, die durch Peptidbindungen verbunden sind.
Als selbstassemblierende Polypeptide werden Polypeptide bezeichnet, die an Grenzflächen selbstständig Schichten ausbilden können und dabei bestimmte Eigenschaften der Grenzfläche verändern. Die Fähigkeit eines Polypeptids, sich an bestimmten Grenzflächen selbst zu assemblieren, hängt von der Eigenschaft der Grenzfläche und des selbstassemb- lierenden Polypeptids ab. Beispielswiese können sich für das Hydrophobin H*Protein B stabile Schichten bevorzugt an hydrophoben Oberflächen ausbilden. Entsprechend sind die selbstassemblierenden Polypeptide bezüglich des Materials der Grenzfläche, auf die die Beschichtung aufgebracht wird, selbstassemblierend. Unter dem Begriff Analyt sollen diejenigen in einer Probe enthaltenen Stoffe verstanden werden, über die bei einer chemischen Analyse eine Aussage getroffen werden soll. Relevante Analyten können beispielsweise Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Metabolite, Sekundärmetabolite, Vitamine, Pigmente, Zellen (humane, pflanzliche oder tierische Zellen sowie Pilze, Bakterien oder Mykoplasmen) sowie Viren sein. Im weiteren Sinne fallen unter den Begriff Analyt auch Nanomaterialien wie Nanopartikel, Quantum Dots und Carbon Nano Tubes.
Unter dem Begriff „thermodiffusives Bonden“ oder Thermodiffusionsbonden von Polymersubstraten wird ein Verfahren verstanden, das darauf beruht, dass eines der zu verbindenden Substrate auf eine Temperatur nahe oder über der Glasübergangstemperatur gebracht wird. Durch die erhöhte Temperatur und das Aneinanderpressen der heißen Substrate mit Druck wird eine ausreichende Mobilität der Polymerketten erreicht, sodass ein diffusiver Prozess einsetzt, durch den sich die beiden Substrate verbinden.
Der Begriff Glasübergangstemperatur bezeichnet eine Temperatur, bei deren Erreichen ganz oder teilweise amorphe Polymere von einem spröden Zustand in einen hochviskosen, flexiblen Bereich übergehen. Bei Thermoplasten ist dieser Übergang reversibel.
Unter dem Begriff „Siegelfolie“ ist ein unstrukturiertes Substrat zu verstehen, das mit einem strukturierten Polymersubstrat, das eine mikrofluidische Struktur enthält, und hierin auch als Polymerkartusche bezeichnet wird, verbunden wird.
Unter dem Begriff mikrofluidische Strukturen, System oder Kartuschen sind solche zu verstehen, die ausgebildet sind, d.h. entsprechende Abmessungen aufweisen, um Flüssigkeiten im Femtoliter- bis Milliliter-Bereich zu handhaben.
Wie in Fig. 1A gezeigt ist, werden bei einem Beispiel eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Offenbarung ein erstes Polymersubstrat 10 und ein zweites Polymersubstrat 12 bereitgestellt. Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass in den Figuren 1A und 1B Schraffuren zu Darstellungszwecken weggelassen sind. Das erste Polymersubstrat 10 weist eine oder mehrere Verbindungsflächen 10a auf und das zweite Polymersubstrat 12 weist eine oder mehrere Verbindungsflächen 12a auf. Die Verbindungsflächen 10a und 12a sind Flächen, an denen die Polymersubstrate 10 und 12 verbunden werden sollen. Das erste Polymersubstrat 10 weist zumindest im Bereich der Verbindungsfläche 10a eine Beschichtung 20 eines selbstassemblierenden Polypeptids auf. Das zweite Polymersubstrat 12 weist zumindest im Bereich der Verbindungsfläche 12a eine Beschichtung 22 eines selbstassemblierenden Polypeptids auf. Bei anderen Beispielen weist nur eines der Polymersubstrate 10, 12 eine Beschichtung mit einem selbstassemblierenden Polypeptid auf.
Bei dem gezeigten Beispiel sind die beiden Polymersubstrate 10 und 12 vollständig mit dem selbstassemblierenden Polypeptid beschichtet. Dies kann beispielsweise durch Eintauchen der Polymersubstrate 10 und 12 in eine Lösung mit dem selbstassemblierenden Polypeptid erfolgen. Bei anderen Beispielen sind nur die Verbindungsflächen mit dem selbstassemblierenden Polypeptid beschichtet. Bei anderen Beispielen sind die Verbindungsflächen und Bereiche der Polymersubstrate, in bei Benutzung in Berührung mit Analyten kommen, mit dem selbstassemblierenden Polypeptid beschichtet.
Wie in Fig. 1B gezeigt ist, werden die beiden Polymersubstrate 10 und 12 durch Zusammendrücken der Verbindungsflächen 10a und 12a unter Druck und bei einer Temperatur, die mindestens der Glasübergangstemperatur des Materials von einem der Polymersubstrate an der Verbindungsfläche 10a, 12a entspricht, verbunden. Dabei findet eine Diffusion von Polymerketten zwischen den Verbindungsflächen 10a, 12a durch das selbstassemb- lierende Polypeptid statt und eine feste Verbindung wird zwischen den Verbindungsflächen 10a, 12a gebildet. Somit findet ein Thermodiffusionsbonden durch die Beschichtungen 20 und 22 hindurch statt. Dadurch ergibt sich ein Verbindungsbereich 30, der in Fig. 1 B schraffiert dargestellt ist, in dem eine Diffusion von Polymerketten von zumindest einem der Polymersubstrate 10, 12 durch die Beschichtungen 20, 22 erfolgt, sodass in diesem Bereich die Polymersubstrate fest miteinander verbunden sind. In den übrigen Bereichen bleibt die Beschichtung 20, 22 unverändert bestehen.
Bei dem in den Figuren 1A und 1 B gezeigten Beispiel weist das Polymersubstrat 10 eine Ausnehmung 40 auf, deren Oberflächen ebenfalls mit der Beschichtung 20 versehen sind. Durch die Verbindung der Polymersubstrate 10, 12 wird diese Ausnehmung durch das Polymersubstrat 12 abgedeckt. Die Ausnehmung kann beispielsweise Fluidikstrukturen, wie z.B. einen oder mehrere Fluidkanäle und/oder eine oder mehrere Fluidkammern, darstellen. Wie in Fig. 1 B zu erkennen ist, sind die Oberflächen, die diese Fluidikstrukturen definieren, mit der Beschichtung 20, 22 versehen, sodass dadurch eine Interaktion zwischen den Oberflächen und Analyten, die damit in Berührung kommen, zielgerichtet verändert werden kann. Bei anderen Beispielen sind die beiden Polymersubstrate auf der Seite, auf der die Verbindung stattfindet, planar. Bei anderen Beispielen können beide Polymersubstrate auf der Seite, auf der die Verbindung stattfindet, Ausnehmungen aufweisen. Bei Beispielen handelt es sich bei dem zumindest einen Polypeptid um ein einzelnes Polypeptid. Bei Beispielen handelt es sich bei dem zumindest einen Polypeptid um ein Gemisch aus verschiedenen selbstassemblierenden Polypeptiden.
Bei Beispielen werden zwei Polymersubstrate miteinander verbunden. Bei anderen Beispielen kann auch eine größere Anzahl von Polymersubstraten entsprechend miteinander verbunden werden. Bei Bespielen kann ein Verbund aus einer Kartusche und zwei Siegelfolien, die aus verschiedenen Materialien bestehen können, hergestellt werden. Die Siegelfolien können beispielsweise unterschiedliche Bereiche der Kartusche verschließen, die auf der gleichen Seite oder unterschiedlichen Seiten der Kartuschen liegen können.
Bei Beispielen beträgt der Druck, mit dem die Polymersubstrate 10, 12 zusammengedrückt werden, zumindest 1 ,2 bar und das Zusammendrücken erfolgt für eine Zeitdauer von mindestens 1 Sekunde. Dadurch kann eine sichere Verbindung zwischen den Polymersubstraten hergestellt werden.
Bei Beispielen ist eines der beiden Polymersubstrate, z.B. das Polymersubstrat 10, eine mikrofluidische Polymerkartusche und das andere der beiden Polymersubstrate, z.B. das Polymersubstrat 12, ist eine unstrukturierte Siegelfolie. Die mikrofluidische Polymerkartusche kann eine Fluidikstruktur, z.B. die Ausnehmung 40, aufweisen, die zu der Seite, die mit dem anderen Polymersubstrat verbunden werden soll, offen ist. Beim Verbinden kann dann die Fluidikstruktur durch die Siegelfolie verschlossen werden. Beispiele schaffen somit ein Verfahren zum Herstellen einer gesiegelten mikrofluidischen Polymerkartusche bzw. eine durch ein solches Verfahren hergestellte mikrofluidische Polymerkartusche, wobei eine gesiegelte, vollständig funktionalisierte Kartusche (alle Oberflächen der mikrofluidischen Struktur sind beschichtet) erhalten werden kann, ohne dass die gesiegelte Kartusche nach dem Assemblieren der Kartusche noch in einem weiteren Schritt (beispielsweise Spülen) behandelt werden muss.
Die Polymersubstrate 10, 12 weisen ein Material mit einer Oberfläche auf, die eine Selbstassemblierung des selbstassemblierenden Polypeptids ermöglicht. Bei Beispielen sind die Polymersubstrate Thermoplastsubstrate, die aus einem thermoplastischen Material bestehen. Bei Beispielen bestehen beide Polymersubstrate aus dem gleichen Material. Bei Beispielen bestehen die Polymersubstrate aus unterschiedlichen Materialien. Bei Beispielen bestehen die Polymersubstrate aus einem Cycloolefin-Copolymer. Bei Beispielen weisen die Polymersubstrate ein Material auf, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polydi- methylsiloxan (PDMS), Polymethylmethacrylat (PMMA) oder Cycloolefin-(Co)polymere (COC/COP) besteht.
Bei Beispielen der vorliegenden Offenbarung werden als selbstassemblierende Polypeptide für die Beschichtung solche ausgewählt, die in der Lage sind, robuste Polypeptidlagen auszubilden und die durch die Einwirkung bestimmter Chemikalien (z.B. Säuren, Laugen, Detergenzien, organischen Lösungsmitteln) und/oder einer erhöhten Temperatur nicht von der Oberfläche abgelöst werden. Bei Beispielen sind die Polypeptidlagen ausgewählt, um ihre Eigenschaften auch nach Einwirkung dieser Faktoren beizubehalten. Dadurch kann erreicht werden, dass sich die selbstassemblierenden Polypeptide während der Siegelung und der Verwendung der mikrofluidischen Kartusche nicht von der Oberfläche ablösen. Vorteilhaft kann damit eine Kontamination einer biologischen Probe durch selbstassemblierende Polypeptide (oder deren Spaltprodukte) verhindert werden.
Bei Beispielen kann die Beschichtung des selbstassemblierenden Polypeptids eine Monolage, d.h. nur eine Lage Polypeptide auf dem Substrat, eine Bilage, d.h. zwei Lagen Polypeptide auf dem Substrat, oder eine Multilage, d.h. drei oder mehr Lagen des Polypeptids auf dem Substrat, sein. Es hat sich herausgestellt, dass für die obigen Zwecke die selbstassemblierenden Polypeptide gemäß dieser Offenbarung natürliche Polypeptide (z.B. aus natürlichen Organismen isolierte Polypeptide), rekombinante Polypeptide (z.B. aus rekom- binanten Organismen isolierte Polypeptide), synthetische Polypeptide (z.B. in einem chemischen Syntheseverfahren synthetisierte Polypeptide), modifizierte Polypeptide (z.B. post- translational modifizierte Polypeptide oder chemisch modifizierte Polypeptide) sowie eine Kombination aus diesen Möglichkeiten sein können. Bei Beispielen der Erfindung ist die Beschichtung eine Monolage, da dadurch eine höhere Zuverlässigkeit des Thermodiffusi- onsprozesses erreicht werden kann.
Es hat sich herausgestellt, dass für die obigen Zwecke insbesondere Hydrophobine aus filamentösen Pilzen sowie deren rekombinante und synthetische Derivate besonders vorteilhaft sind. Hydrophobine sind vergleichsweise kleine Polypeptide (ca. 100 Aminosäuren) mit einer amphiphilen Proteinstruktur, d.h. das Protein weist eine hydrophile und eine hydrophobe Oberflächendomäne auf. Dadurch zählen Hydrophobine zu den Proteinen mit der höchsten Oberflächenaktivität. An einer hydrophil-hydrophoben Grenzfläche interagieren die einzelnen Hydrophobin-Monomere sowohl mit der Grenzfläche als auch mit anderen Monomeren und bilden somit eine stabile Polypeptid-Monolage aus (Selbstassemblierung). Aufgrund des amphiphilen Charakters der Hydrophobine wird dabei u.a. die Oberflächenenergie derfunktionalisierten Oberfläche verändert. Anhand der Aminosäure-Sequenz und der Eigenschaften der Polypeptid-Monolagen werden Hydrophobine in zwei Klassen eingeteilt (Klasse I und Klasse II), wobei Klasse I Hydrophobine besonders stabile Proteinlagen ausbilden, die auch durch Einwirkung von Detergenzien, Säuren, Laugen oder hohen Temperaturen nicht von der funktionalisierten Oberfläche abgelöst werden können. Daher sind Hydrophobine, insbesondere Klasse I Hydrophobine, für die vorliegende Offenbarung besonders vorteilhaft.
Bei Beispielen ist das selbstassemblierende Polypeptid ein rekombinantes Hydrophobin und insbesondere das Hydrophobin H*Protein B. Mit einem solchen selbstassemblierenden Polypeptid kann zum einen zuverlässig verhindert werden, dass Analyten an der Oberfläche, die damit beschichtet ist, adsorbieren, um zum anderen kann eine zuverlässiger Ther- modiffusionsprozess erfolgen. In einer solchen Ausgestaltung der Offenbarung kann somit eine unspezifische Adsorption von Analyten aus einer biologischen Probe an der Oberfläche einer mikrofluidischen Kartusche unterbunden werden.
Bei anderen Beispielen können, abhängig von der zu erreichenden Funktionalität der Oberfläche, andere selbstassemblierende Polypeptide verwendet werden. Beispiele hierfür sind Amyloid- und Faser-bildende Polypeptide (wie z.B. Spinnenseide), pilzliche Hydrophobine (wie z.B. das Hydrophobin SC3 aus Schizophyllum commune), bakterielle Hydrophobine (wie z.B. das BsIA-Protein aus Bacillus subtilis), bakterielle Oberflächenschicht- (S-Layer) Proteine (wie z.B. das S-Layer-Protein SbsB aus Geobacillus stearothermophilus) , synthetische selbstassemblierende Polypeptide, und Kombinationen (natürliche, rekombinante und synthetische Kombinationen) aus diesen Polypeptiden sowie weitere, dem Fachmann bekannte selbstassemblierende Polypeptide.
Bei Beispielen ist das selbstassemblierende Polypeptid ausgewählt, um bezüglich spezieller Analyten eine Interaktion zwischen der mit demselben beschichteten Oberfläche und den Analyten zielgerichtet zu verändern. Bei Beispielen ist das selbstassemblierende Polypeptid ausgewählt, um eine unspezifische Anbindung der Analyten an der Oberfläche zu unterbinden. Bei Beispielen ist das selbstassemblierende Polypeptid ausgewählt, um eine Immobilisierung der Analyten an der damit beschichteten Oberfläche zu bewirken.
Bei Beispielen weist zumindest eines der beiden Polymersubstrate eine erste Schicht und eine zweite Schicht auf, wobei die Verbindungsfläche dieses Substrats auf der zweiten Schicht angeordnet ist, und wobei die zweite Schicht eine geringere Glasübergangstemperatur aufweist als die erste Schicht und wobei die Temperatur, bei der das Zusammendrücken erfolgt, höher als die Glasübergangstemperatur der zweiten Schicht. Bei solchen Beispielen kann ferner die Temperatur beim Zusammendrücken geringer sein als die Glasübergangstemperatur der ersten Schicht.
Die Figuren 2A bis 2C zeigen schematisch Querschnittansichten zur Erläuterung eines solchen Beispiels, bei dem ein erstes Polymersubstrat 50 und ein zweites Polymersubstrat 52 bereitgestellt werden. Dabei zeigen die Figuren 2A bis 2C jeweils nur Ausschnitte der Polymersubstrate 50 und 52. Das erste Polymersubstrat 50 weist eine erste Schicht 60 und eine zweite Schicht 62 auf. Das zweite Polymersubstrat 52 weist eine erste Schicht 64 und eine zweite Schicht 66 auf. Das erste Polymersubstrat 50 weist eine oder mehrere Verbindungsflächen 50a auf und das zweite Polymersubstrat 52 weist eine oder mehrere Verbindungsflächen 52a auf. Auf dem ersten Polymersubstrat 50 ist eine Beschichtung 70 eines selbstassemblierenden Polypeptids vorgesehen und auf dem zweiten Polymersubstrat 52 ist eine Beschichtung 72 eines selbstassemblierenden Polypeptids vorgesehen. Auch bei diesem Beispiel könnte nur eines der Polymersubstrate 50, 52 mit einer Beschichtung versehen sein und die Beschichtung(en) könnte(n) wiederum ganzflächig oder abschnittsweise vorgesehen sein. Das erste Polymersubstrat 50 weist wiederum eine Ausnehmung 40 auf.
Die Polymersubstrate 50, 52 werden zusammengebracht, so dass die Verbindungsflächen 50a und 52a miteinander ausgerichtet sind, wie in Fig. 2B gezeigt ist. Nachfolgend werden die Polymersubstrate 50, 52 mit Druck und Temperatur beaufschlagt, um dieselben durch Thermodiffusion zu verbinden. Die sich ergebende Struktur, bei der die Oberflächen des Hohlraums von den Beschichtungen 70, 72 bedeckt sind, ist in Fig. 2C gezeigt. Im Bereich der Verbindungsflächen 50a, 52a ergibt sich dadurch wiederum ein Verbindungsbereich 30, in dem die Polymersubstrate 50, 52 fest miteinander verbunden sind.
Die Schichten 60 und 64 können aus einem ersten thermoplastischen Material bestehen und die Schichten 62 und 66 können aus einem zweiten thermoplastischen Material bestehen. Das zweite thermoplastische Material weist eine geringere Glasübergangstemperatur auf als das erste thermoplastische Material. Das erste thermoplastischen Material kann eine Glasübergangstemperatur aufweisen, die über der Temperatur liegt, die verwendet wird, um die Polymersubstrate 50 und 52 miteinander zu verbinden. Dadurch kann während des Verbindens eine erhöhte Stabilität des Verbunds erhalten werden. Auch bei dem Bezug nehmend auf die Figuren 2A bis 2C erläuterten Verfahren können die Polymersubstrate Teile einer mikrofluidischen Kartusche sein, sodass nach dem Verbinden eine gesiegelte mikrofluidische Kartusche erhalten wird.
Bei Beispielen können das erste und das zweite Polymersubstrat 50, 52 mit dem Hydrophobin H*Protein B beschichtete mehrlagige COC-Folien sein, wobei das Polymersubstrat 50 eine Polymerkartusche und das Polymersubstrat 52 eine Siegelfolie darstellt. Bei diesem Beispiel besteht die mikrofluidische Kartusche 50 aus einem Verbund von zwei Cycloolefin- Copolymer-Schichten 62 und 60 (COC 8007/6013), die sich hinsichtlich ihrer Glasübergangstemperatur unterscheiden (78°C/135°C). Die Siegelfolie 52 kann aus einem Verbund von zwei Cycloolefin-Copolymer-Schichten 66 und 64 aus den gleichen Materialen wie die Schichten 62 und 60 oder anderen Materialen bestehen. Grundsätzlich liegt die Glasübergangstemperatur der Trägerschicht 60 bzw. 64 dabei über der Glasübergangstemperatur der Verbindungsschicht 62 bzw. 64, die die Verbindungsflächen aufweist, die auch als Siegelschicht bezeichnet werden kann. Die Kombination aus zwei Schichten bzw. Folien mit unterschiedlichen Glasübergangstemperaturen erlaubt es, durch gezielte Wahl der Prozesstemperatur während des diffusiven Bond prozesses eine ausreichende Mobilität der Polymerketten in der Verbindungsschicht sicherzustellen. Gleichzeitig kann die Formstabilität der mikrofluidischen Strukturen durch die Trägerschicht sichergestellt sein.
Die Prozesstemperatur Tpr0Zess kann dabei gemäß folgender Formel gewählt werden, um größer als die Glasübergangstemperatur TGsiegeischicht und kleiner als die Glasübergangstemperatur der Trägerschicht TG-n-agerschicht zu sein:
TG Siegelschicht < T P, rozess < TG Trägerschicht
Bei Beispielen kann die Beschichtung des ersten und zweiten Polymersubstrats wie folgt erfolgen, beispielsweise wenn die Substrate aus einem COC-Material bestehen. Zunächst wird eine Lösung mit einer Konzentration von 1 g/l hergestellt, indem 50 mg H*Protein B in 50 ml Dl Wasser gelöst werden. Die Lösung wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und danach für zwei Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Der klare Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und in einer 0,5-fachen Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) auf eine finale Konzentration von 10 pg/ml eingestellt. Bei Beispielen sollte die finale Konzentration der Lösung in einem Bereich von 1 pg/ml und 35 pg/ml liegen. Die Polymersubstrate, d.h. die Kartuschen sowie Siegelfolien, werden dann in die H*Protein B Lö- sung getaucht und bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten inkubiert. Sowohl Kartuschen als auch Siegelfolien können nach der Beschichtung sowohl mit PBS als auch mit Wasser gespült werden, um überschüssiges H*Protein B zu entfernen. Eine Konzentration der Lösung in dem oben angegebenen Bereich kann zum einen zuverlässig die Adsorption von Proteinen an die dadurch bewirkte Beschichtung verhindern und zum anderen eine hohe Siegelfestigkeit zur Folge haben.
Die entsprechend beschichteten Polymersubstrate können dann unter Verwendung eines Thermodiffusionsbondens miteinander verbunden werden. Die prinzipielle Funktionsweise des Thermodiffusionsbondens wurde bereits oben erläutert. Ein konkretes Beispiel eines Prozesses für das Thermodiffusionsbonden von mehrlagigen COC Folien ist in den Figuren 3A und 3B dargestellt.
Für einen beispielhaften Siegelprozess, der unter Verwendung des Thermodiffusionsbondens ausgeführt wird, werden die beschichteten Polymersubstrate (Kartusche und Siegelfolie) korrekt aneinander ausgerichtet und danach in eine Siegelanlage eingelegt, wie in Fig. 3A gezeigt ist. Die Siegelanlage weist eine obere Siegelplatte 100 und eine Aufnahme 102 auf. Die Aufnahme 102 weist eine Ausnehmung 104 auf, in der Federstifte 106 angeordnet sind. Die Federstifte 106 stehen nach oben aus der Ausnehmung 104 vor. Die obere Siegelplatte 100 ist auf eine Temperatur Tsiegei platte heizbar und die Aufnahme 102 ist auf eine Temperatur Tuntere Aufnahme heizbar. Die Temperatur Tsiegei platte kann beispielsweise 115°C betragen und die Temperatur Tuntere Aufna e kann beispielsweise 95°C betragen. Die Temperaturen sind so gewählt, dass beim nachfolgenden Bonden die Temperatur der Verbindungsschichten auf mindestens ihre Glasübergangstemperatur gebracht wird. In der Aufnahme 102 ist ferner eine Drucköffnung 108 vorgesehen, über die ein Überdruck in der Ausnehmung 104 erzeugt werden kann. Ferner kann in einer Kammer, in der die Siegelplatte 100 und die Aufnahme 102 angeordnet sind, ein Vakuum erzeugt werden.
Im Betrieb wird zum Siegeln der beschichteten Polymersubstrate die Anordnung 110 aus Kartusche und Siegelfolie auf die Federstifte aufgelegt, wie in Fig. 3A gezeigt ist. Die äußeren Ränder der Anordnung 110 stehen über die äußeren Ränder der Ausnehmung 104 vor. Die obere Siegelplatte 100 wird heruntergefahren und drückt die Anordnung 110 gegen die Kraft der Federstifte 106 gegen die obere Oberfläche der Aufnahme 102, wie in Fig. 3B gezeigt ist. Dabei schließt die Anordnung 110 die Ausnehmung 104 in der unteren Siegelplatte 102 nach oben ab, sodass ein geschlossener Hohlraum erzeugt wird, in dem über die Drucköffnung 108 ein Überdruck erzeugt werden kann. Die obere Siegelplatte 100 und die Aufnahme 102 werden aufgeheizt. Bei einem Beispiel wird die obere Platte auf 115°C und die Aufnahme auf 95°C aufgeheizt, um die COC-Verbundfolien der Anordnung 110 thermodiffusiv zu verbinden. Nach dem Herabfahren der oberen Siegelplatte 100 und dem Verschluss der Kammer wird die Kammer evakuiert. Nachfolgend wird über die Drucköffnung 108 ein Überdruck an die durch die Anordnung 110 nach oben verschlossene Ausnehmung 104 angelegt, so dass eine maximale Anpresskraft erreicht wird, beispielsweise eine Anpresskraft von 15 kN. Die strukturierte Kartuschenseite wird dabei unter Druck, beispielsweise einem Druck von 1,2 bar, gegen die Siegelfolie gedrückt, um einen gleichmäßigen Kontakt zu erreichen. Nach einer Anpresszeit, die beispielsweise 5 Sekunden betragen kann, wurden Kartusche und Siegelfolie thermodiffusiv verbunden, die Kammer kann wieder belüftet werden und die gesiegelte Anordnung kann entnommen werden, nachdem die obere Siegelplatte 100 wieder hochgefahren wurde.
Mögliche Anwendungen der hierein beschriebenen Verfahren sind in Fig. 4 schematisch dargestellt. Eine mögliche Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren ist die Siegelung mikrofluidischer Polymerkartuschen, die zuvor mit Einem selbstassemblierenden Polypeptid, z.B. einem Hydrophobin, beschichtet wurden. Solche gesiegelten mikrofluidischen Kartuschen können, wie in Fig. 4 dargestellt, zur Prozessierung von Proben bzw. Reagenzien dienen, die Proteine, Peptide, Bakterien, Zellen, Nukleinsäuren und/oder Puffer enthalten können. Der Begriff Prozessierung umfasst hierbei alle nötigen Schritte, die zur Durchführung eines bio-chemischen Assays notwendig sind. Die gesiegelte mikrofluidische Kartusche ist in einem solchen Szenario beschichtet, um beispielsweise den Verlust der Probe oder der Reagenzien in der mikrofluidischen Struktur zu verhindern, indem die Beschichtung aus dem selbstassemblierenden Polypeptid verhindert, dass die Probe oder Analyten der Probe an den mikrofluidischen Strukturen anhaften. Bei anderen Anwendungen können die selbstassemblierenden Polypeptide gewählt sein, um eine andere Funktionalität zu liefern, beispielsweise um Analyten in den mikrofluidischen Strukturen bzw. bestimmten Bereichen der mikrofluidischen Strukturen zu immobilisieren. Die mikrofluidischen Strukturen können dabei ein fluidisches Netzwerk bilden, das entsprechend beschichtet ist und durch das die Probe bzw. die Reagenzien ganz oder teilweise geleitet werden. Die Kartusche kann dabei auch als mikrofluidischer Chip bezeichnet werden. Ziel der Prozessierung ist es beispielsweise, die prozessierte Probe in einen Detektionsbereich auf der gesiegelten mikrofluidischen Kartusche zu bringen, in dem eine Detektion stattfindet, oder die prozessierte Probe in eine geeignete Entnahmeschnittstelle, wie z.B. eine Kammer oder einen Übergang in ein Reaktionsgefäß zu befördern. Beispiele der vorliegenden Offenbarung schaffen somit ein Verfahren, bei dem zwei Polymersubstrate, bei denen zumindest eines mit einem selbstassemblierenden Polypeptid beschichtet ist, unter Einwirkung von Temperatur thermodiffusiv miteinander verbunden werden. Bei Beispielen werden die beiden Substrate mit einem Druck von mindestens 1,2 bar gegeneinander gepresst für einen Zeitraum von mindestens 1 Sekunde. Der Wärmeeintrag während des Siegelprozesses führt dazu, dass die Temperatur des Substrates während des Siegelprozesses mindestens der Glasübergangstemperatur des Substratmaterials entspricht, sodass eine hinreichende Mobilität der Moleküle in dem Polymersubstrat entsteht, sodass beim Zusammenbringen der Substrate, von denen zumindest eines entsprechend beschichtet ist, eine feste Verbindung der Substrate durch die Beschichtung mit dem selbstassemblierenden Polypeptid hindurch entsteht. Bei Beispielen kann zumindest eines der beiden Substrate eine Schicht mit geringerer Glasübergangstemperatur und eine Schicht mit größerer Glasübergangstemperatur aufweisen, um die Mobilität der Oberflächenmoleküle bei Erhitzung stark zu erhöhen, Durch die zweite Schicht mit größerer Glasübergangstemperatur kann gleichzeitig die Formstabilität aufrechterhalten werden.
Beispiele der vorliegenden Offenbarung ermöglichen somit, biofunktionale Polymersubstrate dauerhaft und kostengünstig zu einer funktionalen mikrofluidischen Kartusche zu verbinden, ohne die Funktionalität der funktionalisierten Oberfläche einzuschränken. Dies ist möglich, indem eine Beschichtung mit einem selbstassemblierenden Polypeptid erfolgt, bevor die Polymersubstrate, insbesondere aus einem thermoplastischen Material, mittels eines thermodiffusionen Bondverfahrens durch die Beschichtung aus selbstassemblierenden Polypeptid hindurch verbunden werden. Somit können insbesondere Oberflächen von mikrofluidischen Strukturen in mikrofluidischen Kartuschen beschichtet werden, indem Teile der Kartusche beispielsweise vollständig entsprechend beschichtet werden und dann eine Verbindung der Teile der Kartusche durch Thermodiffusionsbonden stattfindet.
Obwohl bei den obigen Beispielen jeweils eine strukturierte Polymerkartusche mit einer Siegelfolie verbunden wird, können bei alternativen Beispielen andere Bestandteile einer Kartusche miteinander verbunden werden, beispielsweise ein erster strukturierter Teil der späteren Kartusche mit einem zweiten strukturierten Teil der späteren Kartusche. Somit können bei Beispielen durch ein entsprechendes Verfahren auch zwei strukturierte oder zwei nicht strukturierte Polymerkartuschenteile miteinander verbunden werden.
Obwohl einige Aspekte der vorliegenden Offenbarung als Merkmale im Zusammenhang mit einer Vorrichtung beschrieben wurden, ist klar, dass eine solche Beschreibung ebenfalls als eine Beschreibung entsprechender Verfahrensmerkmale betrachtet werden kann. Obwohl einige Aspekte als Merkmale im Zusammenhang mit einem Verfahren beschrieben wurden, ist klar, dass eine solche Beschreibung auch als eine Beschreibung entsprechender Merkmale einer Vorrichtung bzw. der Funktionalität einer Vorrichtung betrachtet werden kann.
Die vorhergehende Offenbarung stellt Veranschaulichungen und Beschreibungen bereit, es ist jedoch nicht beabsichtigt, dass dieselbe erschöpfend sind oder die Implementierungen auf die offenbarte präzise Form eingeschränkt sind. Modifikationen und Variationen sind im Hinblick auf die obige Offenbarung möglich oder können aus der Praxis der Implementierungen erhalten werden. Obwohl bestimmte Kombination von Merkmalen in den Patentansprüchen angeführt und/oder in der Beschreibung offenbart sind, ist es nicht beabsichtigt, dass diese Merkmale die Offenbarung möglicher Implementierungen einschränken. Tatsächlich können zahlreiche dieser Merkmale auf Weisen kombiniert werden, die nicht spe- zifisch in den Patentansprüchen angeführt und/oder in der Beschreibung offenbart sind. Obwohl jeder der unten angeführten abhängigen Patentansprüche möglicherweise nur von einem oder einigen Patentansprüchen direkt abhängt, umfasst die Offenbarung möglicher Implementierungen jeden abhängigen Patentanspruch in Kombination mit allen anderen Patentansprüchen in dem Satz von Patentansprüchen.
Die oben beschriebenen Beispiele sind nur darstellend für die Grundsätze der vorliegenden Offenbarung. Es ist zu verstehen, dass Modifikationen und Variationen der Anordnungen und der Einzelheiten, die beschrieben sind, für Fachleute offensichtlich sind. Es ist daher beabsichtigt, dass die Offenbarung nur durch die beigefügten Patentansprüche und nicht durch die spezifischen Einzelheiten, die zum Zweck der Beschreibung und Erklärung der Beispiele dargelegt sind, begrenzt ist.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Verbunds aus zumindest zwei Polymersubstraten (10, 12, 50, 52), mit folgenden Merkmalen:
Bereitstellen zweier Polymersubstrate (10, 12, 50, 52), die jeweils eine Verbindungsfläche (10a, 12a, 50a, 52a) aufweisen, wobei zumindest eines der Polymersubstrate (10, 12, 50, 52) zumindest im Bereich der Verbindungsfläche (10a, 12a, 50a, 52a) mit zumindest einem selbstassemblierenden Polypeptid (20, 22, 70, 72) beschichtet ist; und
Verbinden der beiden Polymersubstrate (10, 12, 50, 52) durch Zusammendrücken der Verbindungsflächen (10a, 12a, 50a, 52a) unter Druck und bei einer Temperatur, die mindestens der Glasübergangstemperatur des Materials von einem der Polymersubstrate (10, 12, 50, 52) an der Verbindungsfläche (10a, 12a, 50a, 52a) entspricht, wobei eine Diffusion von Polymerketten zwischen den Verbindungsflächen (10a, 12a, 50a, 52a) durch das zumindest eine selbstassemblierende Polypeptid (20, 22, 70, 72) stattfindet und eine feste Verbindung zwischen den Verbindungsflächen (10a, 12a, 50a, 52a) gebildet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem der Druck zumindest 1,2 bar beträgt und das Zusammendrücken für eine Zeitdauer von zumindest einer Sekunde erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem beide Polymersubstrate (10, 12, 50, 52) mit dem zumindest einen selbstassemblierenden Polypeptid (20, 22, 70, 72) beschichtet sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Bereitstellen der beiden Polymersubstrate (10, 12, 50, 52) ein Eintauchen von zumindest einem der Polymersubstrate (10, 12, 50, 52) in eine Lösung mit dem zumindest einen selbstassemblierenden Polypeptid umfasst, um das zumindest eine der Polymersubstrate (10, 12, 50, 52) mit dem zumindest einen selbstassemblierenden Polypeptid (20, 22, 70, 72) zu beschichten.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem zumindest eines der beiden Polymersubstrate (50, 52) eine erste Schicht (60, 64) und eine zweite Schicht (62, 66) aufweist, wobei die Verbindungsfläche (50a, 52a) dieses Substrats (50, 52) auf der zweiten Schicht (62, 66) angeordnet ist, und wobei die zweite Schicht (62, 66) eine geringere Glasübergangstemperatur aufweist als die erste Schicht (60, 64) und wobei die Temperatur, bei der das Zusammendrücken erfolgt, höher als die Glasübergangstemperatur der zweiten Schicht (62, 66) ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Temperatur, bei der das Zusammendrücken erfolgt, geringer ist als die Glasübergangstemperatur der ersten Schicht (60, 64).
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem zumindest eines der beiden Polymersubstrate (10, 12, 50, 52) eine mikrofluidische Polymerkartusche ist, in der zumindest eine Fluidikstruktur (40), die zu einer Seite der mikrofluidischen Polymerkartusche hin offen ist, gebildet ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem eines der beiden Polymersubstrate (10, 12, 50, 52) eine unstrukturierte Siegelfolie ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das andere der beiden Polymersubstrate (10, 12, 50, 52) eine oder die mikrofluidische Polymerkartusche ist, in der zumindest eine Fluidikstruktur (40), die zu der Seite der mikrofluidischen Polymerkartusche hin offen ist, auf der die Verbindungsfläche (10a, 50a) angeordnet ist, wobei bei dem Verbinden die zumindest eine Fluidikstruktur (40) durch die Siegelfolie verschlossen wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem das zumindest eine selbstassemblierende Polypeptid (20, 22, 70, 72) gewählt ist, um bezüglich spezieller Ana- lyten eine Interaktion zwischen der mit demselben beschichteten Oberfläche und den Ana- lyten zielgerichtet zu verändern.
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das zumindest eine selbstassemblierende Polypeptid (20, 22, 70, 72) gewählt ist, um eine unspezifische Anbindung der Analyten an der Oberfläche zu unterbinden oder eine Immobilisierung der Analyten an der Oberfläche zu bewirken.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem das zumindest eine selbstassemblierende Polypeptid (20, 22, 70, 72) ein natürliches Polypeptid, ein rekombi- nantes Polypeptid, ein synthetisches Polypeptid, ein modifiziertes Polypeptid oder eine Kombination dieser Polypeptide aufweist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das zumindest eine selbstassemblierende Polypeptid (20, 22, 70, 72) ein Hydrophobin aus filamentösen Pilzen oder ein rekombinan- tes oder synthetisches Derivat ist.
14. Gesiegelte mikrofluidische Kartusche, die unter Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 hergestellt wurde, wobei eines der beiden Polymersubstrate (10, 12, 50, 52) eine oder die Polymerkartusche ist und das andere der beiden Poly- mersubstrate (10, 12, 50, 52) eine oder die Siegelfolie ist.
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