WO2021156473A1 - Additif pour améliorer la stabilité protéique dans une boisson - Google Patents

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WO2021156473A1
WO2021156473A1 PCT/EP2021/052859 EP2021052859W WO2021156473A1 WO 2021156473 A1 WO2021156473 A1 WO 2021156473A1 EP 2021052859 W EP2021052859 W EP 2021052859W WO 2021156473 A1 WO2021156473 A1 WO 2021156473A1
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WO
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additive
protease
protein
drink
wine
Prior art date
Application number
PCT/EP2021/052859
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English (en)
Inventor
Sacha BAUDOIN
Julie RETTMAN
Amélie BREYSSE
Virginie Moine
Philippe LOUAZIL
Original Assignee
Oenotropic Innovation
Biolaffort
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to EP21705095.4A priority Critical patent/EP4100501A1/fr
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
    • C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation
    • C12G1/0203—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation by microbiological or enzymatic treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
    • C12H1/00—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages
    • C12H1/003—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages by a biochemical process

Definitions

  • the present invention relates to an additive for improving protein stability to heat, to temperature variations and / or to aging, in a drink based on vegetable must.
  • a subject of the present invention is also a process for improving protein stability to heat, to temperature variations and / or to aging, in a drink based on vegetable must.
  • the invention therefore lies in the field of products and processes for the preparation and preservation of beverages based on vegetable must, in particular wine.
  • Protein causes instability in drinks made from vegetable must, such as wine, beer, cider and fruit juices. Indeed, during sudden variations in temperature and / or during storage, depending on the duration and the conditions thereof, the heat-sensitive proteins present in the drink can flocculate or precipitate, causing the appearance of a cloudiness in the drink. which can be detrimental to its consumption.
  • the expression “protein breakage” designates the phenomenon in which the proteins in the drink precipitate and cause the appearance of a cloudiness.
  • protein instability is favored by the increase in the temperature of the wine during transport or storage. Present at low concentrations, from 15 to 300 mg.L -1 , in white wines, the proteins aggregate and precipitate.
  • the usual treatment, in particular for stabilizing white or rosé wines, is the elimination of proteins from the wine by means of a clay having colloidal properties, bentonite.
  • bentonite One of the main drawbacks linked to the use of bentonite is the loss of aromas, which is highly damaging to the organoleptic qualities of the wine.
  • the mode of operation of bentonite with respect to unstable proteins leads to high volumetric losses: the volumetric losses associated with the use of bentonite are estimated at nearly 200 million euros worldwide, or the equivalent of New Zealand's annual production of white wine (2.85 million hectoliters in 2017).
  • proteases hydrolyze wine proteins, thus reducing their precipitation during thermal changes. Flash pasteurization at 70-75 ° C for one minute, followed by cooling, is necessary, prior to the addition of 1 to 3 g / hl of proteases. This heating step makes it possible in particular to denature the proteins, the change in the conformation of the proteins thus making them more accessible to proteases. According to another approach, the addition of proteases followed by flash pasteurization was also tested.
  • proteases of plant origin constitute a preferred route for food drinks.
  • Commercial purified papain and bromelain have been used for protein stabilization in wine (Benucci et al, "Effect of free and immobiiised stem bromelain on protein haze in white wine", Australian Journal of Grape and Wine Research, Vol. 20, issue 3, pp 347-352, 2014), the bromelain being immobilized beforehand on a support consisting of chitosan.
  • Papain and bromelain are cysteine proteases. The results show that the activity of the enzyme is poorly controlled and results in a partial and limited reduction in the level of proteins.
  • Chitin-glucan is mainly used on white wines for the clarification of musts and wines, as well as the preventive treatment of protein breaks.
  • Chitosan is mainly used for the reduction of undesirable microorganisms of the Brettanomyces type. These two compounds precipitate and sediment, entraining unwanted compounds. Used simultaneously, they facilitate settling and clarification of musts and wines.
  • the mannoprotein MP32 is derived from a fragment of invertase of S. cerevisiae which would be generated during the autolysis of yeast lees by the combined action of beta-glucanase of the wall yeast cell and vacuolar protease.
  • the industrial production of MP32 would be possible by enzymatic digestion of the cell wall of yeasts using a commercial beta-glucanase, Glucanex TM. Laboratory tests were carried out and the extracted mannoproteins allowed a total reduction of the protein instability of a wine at ⁇ 40NTU (Nephelometric Turbidity Unit) but the mechanism of protection is not known. (V. Moine and D.
  • an additive according to the invention comprising at least one protease and characterized in that, in its presence, the protein profile of said drink is not modified, very appreciably improves the protein stability in a drink based on wort. plant at an economically reasonable cost and without the need for flash pasteurization.
  • an additive according to the invention makes it possible to reduce up to 80 or 90% of the cloudiness linked to protein breakage, as measured in a conventional heat cloudiness test carried out on white wine, which is the drink typically sensitive to protein breakage. This result is demonstrated with several different samples of wines particularly sensitive to protein breakage.
  • An additive according to the invention has the originality of inhibiting the precipitation of at least part of the proteins present in said drink without, however, causing hydrolysis of the proteins in the drink. This is demonstrated by the fact that in the presence of said additive, the protein profile of said drink is not modified. More particularly, the protease activity of the additive is different from an activity of the cysteine protease type. In other words, an additive according to the invention is characterized in that it comprises an active protease, different from a cysteine protease. Even more particularly, an additive according to the invention is characterized in that it comprises an active protease, different from a cysteine protease, and also exhibits invertase activity.
  • a subject of the present invention is also a method for improving the protein stability, to heat, to temperature variations and / or to aging, in a drink based on vegetable must, said method being devoid of any step of heating said drink. and comprising the addition of an additive comprising an active protease, the additive being characterized in that in its presence, the protein profile of said beverage is not modified. More particularly, a method according to the invention comprises the addition of an additive comprising at least one active protease which is not a cysteine protease. Even more particularly, a method according to the invention comprises the addition of an additive comprising an active protease, other than a cysteine protease, and further exhibiting invertase activity.
  • a subject of the invention is also the use, to improve protein stability, to heat, to temperature variations and / or to aging, in a drink based on vegetable must, of an additive comprising at least one active protease. , said additive being characterized in that in its presence the protein profile of said drink is not modified.
  • a use according to the invention comprises the addition of an additive comprising at least one active protease which is not a cysteine protease.
  • a use according to the invention comprises the addition of an additive comprising an active protease, different from a cysteine protease, and also exhibiting an invertase activity.
  • the invention relates to an additive for increasing the protein stability to heat, to temperature variations and / or to aging, in a drink based on vegetable must, said additive exerting an inhibitory activity on the precipitation of at least part of the proteins present in said drink and comprising at least one active protease, and characterized in that in its presence the protein profile of said drink is not modified, said protease not being a cysteine protease.
  • protein stability is understood to mean the fact that the proteins present in the drink do not precipitate and remain soluble, that is to say that no precipitate or little cloudiness is observed in the drink, in particular due to protein flocculation in the drink.
  • This cloudiness can be evaluated by any known method of measuring turbidity, observed with the naked eye or by a nephelometric technique which measures the content of suspended particles in a medium, and the result of which is expressed in units of turbidity.
  • nephelometric either UTN or NTU (Nephelometry Turbidity Unit) in English.
  • increase in protein stability is meant the decrease in the appearance of the cloudiness, characterized in particular by the comparison of the cloudiness in the drink, treated and untreated, as observed in a heat test during which said drink is subjected to a high temperature and then characterized for its turbidity.
  • protein profile is understood to mean the representation of the various proteins present in a sample and separated according to their molar mass. Such a representation can in particular be obtained by means of an analysis by electrophoresis under denaturing conditions, in particular of the SDS- type. PAGE (Sodium-Dodecyl-Sulfate PolyAmide Gel Electrophoresis) and / or by automatic electrophoresis using a device of the LabChip® type. The modification of the apparent molecular mass of one or more proteins indicates in particular the proteolytic degradation of said protein or proteins.
  • An additive according to the present invention improves protein stability, in other words, it inhibits the precipitation of at least part of the proteins present in the sample, without however causing a modification of the protein profile, witness to the degradation of said protein or proteins.
  • an additive according to the invention comprises at least one active protease.
  • active protease means an enzyme exhibiting a hydrolytic activity of the peptide bonds of a protein, which can be measured in vitro according to techniques well known to a person skilled in the art.
  • an additive according to the invention comprises at least one active protease and is characterized in that, in its presence, the protein profile of said drink is not modified.
  • an additive according to the invention exhibits protease-type activity, however, in the presence of a sample of a drink based on vegetable must, the hydrolysis of the proteins of said drink is not observed, in particular by electrophoresis.
  • the enzymatic activity of a protease of an additive according to the invention can be characterized by any means known to a person skilled in the art, such as for example a test for degradation of hemoglobin for 1 hour, at pH 3 and at 37 ° C.
  • the enzymatic activity of said active protease in an additive according to the invention is not inhibited by an inhibitor of cysteine proteases, such as for example iodoacetamide at a concentration of 1 or 5 mM, and / or this enzymatic activity is not improved in the presence of cysteine.
  • an active protease of an additive according to the invention is not a cysteine protease.
  • an additive according to the invention comprises at least one protease of eukaryotic or prokaryotic origin, more particularly a protease of fungal or plant origin. More particularly, an additive according to the invention comprises an enzymatic preparation of fungal or plant origin, this enzymatic preparation exhibiting at least one protease-type activity.
  • Saccharomyces in particular Saccharomyces cerevisiae
  • an additive according to the invention comprises a fungal additive obtained from Aspergillus oryzae exhibiting protease activity.
  • An additive according to the invention comprises an active protease, the protease activity of which is greater than 1 enzyme units (U) per gram of additive, preferably between 10 and 10,000,000 U per gram of additive, preferably between 100 and 1,000,000 U, preferably between 500 and 500,000 U per gram of additive.
  • U enzyme units
  • the enzymatic activity of a protease of an additive according to the invention can be characterized by any means known to a person skilled in the art, such as for example a test for degradation of hemoglobin for 1 h, at pH 3 and at 37. ° C.
  • An additive according to the invention has a protease activity of between approximately 10 and approximately 10,000,000 U per gram of additive, preferably of between between 100 and 1,000,000 U per gram of additive, in which each unit of enzyme degrades a 2% w / v hemoglobin solution in one hour, at pH 3 and 37 ° C.
  • an additive according to the invention comprises an active protease and is characterized in that, in its presence, the protein profile of said drink is not modified, said additive also exhibits at least one invertase enzymatic activity.
  • An additive according to the invention further exhibits invertase activity, the invertase activity of an additive according to the invention is greater than 1 unit of enzyme (U) per gram of additive, preferably between 1 and approximately 1,000.
  • U enzyme
  • 000 U per gram of additive preferably between 5 and 500,000 U, preferably between 10 and 100,000 U, preferably between 15 and 10,000 U, preferably between 20 and 5,000 U per gram of additive.
  • invertase enzymatic activity is easily characterized by a person skilled in the art, using conventional techniques, for example by spectrophotometric measurement of the degradation of sucrose to glucose at 40 ° C., pH 4.5.
  • An additive according to the invention therefore has an invertase activity of between approximately 1 and approximately 1,000,000 U per gram of additive, in which each unit of enzyme releases 1 pmole of glucose per minute, at pH 4.5 and at 40 ° C.
  • an additive according to the invention comprises an active protease, is characterized in that in its presence the protein profile of said drink is not modified, has an invertase enzymatic activity and an enzymatic activity chosen from among following: beta-glucanase, cellulase, xylanase and alpha-amylase.
  • an enzymatic activity chosen from among following: beta-glucanase, cellulase, xylanase and alpha-amylase.
  • an additive according to the invention comprises an active protease and at least one oligosaccharide or a polysaccharide. More particularly, an additive according to the invention comprises i) an active protease and also exhibits at least one enzymatic activity chosen from the following: beta-glucanase, cellulase, xylanase, alpha-amylase and invertase, and ii) at least one oligosaccharide or a polysaccharide.
  • oligosaccharide and “polysaccharide” is meant respectively an oligomer or a polymer formed from several oses, in particular fructose, galactose, glucose and / or mannose, linked by an alpha or beta glycosidic bond.
  • oligosaccharides and polysaccharides mention may be made of chitosan, chitosan oligosides and chitin-glucan.
  • an additive according to the invention comprises at least one active protease and exhibits invertase activity, and at least one oligosaccharide or a polysaccharide, chosen from chitosan and chitosan oligomers.
  • an additive according to the invention comprises at least one active protease, exhibits invertase activity, and also exhibits an activity chosen from: beta-glucanase, cellulase, xylanase and / or alpha-amylase, and comprises at least one oligosaccharide or a polysaccharide, chosen from chitosan and chitosan oligomers.
  • an additive according to the invention further comprises a composition comprising a mannoprotein or an invertase fragment.
  • said mannoprotein is preferably the MP32 protein, a protein with a molar mass of 32 kDa which corresponds to an invertase fragment of Saccharomyces cerevisiae.
  • mannoproteins means polysaccharides linked to proteins, derived from yeast and in particular obtained industrially by digestion of the walls of yeasts, in particular Saccharomyces cerevisiae.
  • an additive according to the invention comprises at least: i) an active protease, ii) chitosan and / or a chitosan oligoside, and also exhibits beta-glucanase, cellulase, xylanase activity, alpha-amylase and / or invertase.
  • an active protease ii) chitosan and / or a chitosan oligoside
  • beta-glucanase cellulase
  • xylanase activity e.g., alpha-amylase
  • invertase chitosan oligoside
  • the concentration in the additive of each of the aforementioned elements is compatible with a final concentration in said drink as indicated below: fungal additive between 0.01 and 2000 g / hectolitre, preferably between 0.1 and 200 g / hectolitre, preferably between 1 and 200 g / hectolitre, preferably between 10 and 100 g / hectolitre, preferably 20 g / hectolitre; oligoside between 1 and 200 g / hectolitre and preferably between 5 and 50 g / hectolitre; Mannoproteins between 1 and 200 g / hectolitre and preferably between 25 and 50 g / hectolitre.
  • the subject of the invention is an additive, a method and a use intended to improve the protein stability in wine, preferably white wine and rosé wine, produced from any known grape variety, and in particular Gewurztraminer. and Sauvignon.
  • the invention relates to a method for increasing the protein stability to heat, to temperature variations and / or to aging, in a drink based on vegetable must, said method being devoid of any step of heating said drink and comprising at least one step of adding to said drink an additive comprising at least one active protease, said additive being characterized in that, in its presence, the protein profile of the treated drink is not modified.
  • Said additive is characterized in that said protease is different from that of a cysteine protease.
  • a method according to the invention comprises the addition of an additive comprising an active protease, which is not a cysteine protease, is characterized in that in its presence the protein profile of said drink is not unmodified, said additive further exhibits enzymatic invertase activity.
  • process without any heating step is meant a process without heating of the “flash pasteurization” type, that is in particular heating to a temperature between 65 ° C and 75 ° C for a short time, in particular 1 minute, or an equivalent heating step.
  • a method according to the invention comprises the addition of a composition comprising an active protease and / or an oligosaccharide or a polysaccharide. More particularly, a method according to the invention comprises the addition of an oligosaccharide or a polysaccharide and of a composition comprising an active protease. Even more particularly, a method according to the invention comprises the addition of an oligosaccharide or a polysaccharide, and of a composition comprising an active protease, exhibiting invertase activity and exhibiting at least one other enzymatic activity such as beta-glucanase, cellulase, xylanase and alpha-amylase.
  • said composition comprising an active protease is chosen in particular from compositions of fungal origin comprising an active protease and optionally exhibiting at least one other enzymatic activity such as beta-glucanase, cellulase, xylanase, alpha-amylase and invertase, such a composition is in particular Sumizyme LPL®.
  • the compound (s) are added to in said drink at a respective final concentration of: composition comprising an active protease between 1 and 200 g / hectolitre, preferably between 5 and 50 g / hectolitre, preferably between 10 and 40 g / hectolitre and preferably 20 g / hectolitre; oligoside between 1 and 200 g / hectolitre and preferably between 5 and 50 g / hectolitre; mannoprotein between 1 and 200 g / hectolitre and preferably between 25 and 50 g / hectolitre.
  • the compound (s) are added to in said drink such that the final protease activity in said drink is between 1,000 and 10,000,000 U / hectolitre.
  • the compound (s) are added to in said drink such that the final protease activity in said drink is between 1,000 and 10,000,000 U / hectolitre and that the final invertase activity in said drink is between 200 and 5,000,000 units / hectolitre, preferably between 20 and 500,000 U / hectolitre.
  • the invention relates to the use for increasing the protein stability, in a drink based on vegetable must, to heat, to temperature variations and / or to aging, of an additive or of a composition. comprising at least one active protease, characterized in that in the presence of said additive the protein profile of said drink is not modified.
  • the subject of the invention is the use of an additive or of a composition comprising at least one active protease, other than a cysteine protease, and exhibiting invertase activity.
  • Figure 1 shows the result of SDS-PAGE analysis of different samples with, from left to right: marker (1), GW519 (2), GW519 and cysteine (3), GW510 and fungal additive with protease (4) , GW510, fungal additive with protease and cysteine (5), GW123B (6), GW123B and cysteine (7), GW123B and fungal additive with protease (8), GW123B and fungal additive with protease and cysteine (9).
  • FIGS. 2A and 2B respectively represent the result of the analysis by automatic electrophoresis of samples of Gewurztraminer GW123B or GW519 wine treated with a fungal additive.
  • the plots represent, from left to right, GW123B (blue), GW123B and cysteine (red), GW123B and fungal additive with protease (brown), GW123B, cysteine and fungal additive with protease (green).
  • the plots represent, from left to right, GW519 (blue), GW519 and cysteine (red), GW519 and fungal additive with protease (brown), GW519, cysteine and fungal additive with protease (green).
  • Example 1 Development of compositions for improving the protein stability of vegetable musts.
  • Gewurztraminer GW 1, GW 117, GW 520, GW 219, GW 123 B and GW 519, a sample of Sémillon and 2 samples of Sauvignon blanc: Sauvignon 1 and Sauvignon.
  • the wines are stored at 21 ° C.
  • the additives are evaluated after fermentation, on wines which have not undergone treatment with bentonite. The wines do not undergo any flash fermentation during the tests.
  • SDS-PAGE electrophoresis allows proteins to migrate under the influence of an electric current, in a 14% polyacrylamide gel, allowing the proteins to be separated according to their molecular weight.
  • the results are interpretable thanks to the use of a marker containing proteins from 14.4 to 97 kDa.
  • Automatic electrophoresis consists of determining the molecular weights of proteins by automatic electrophoresis using the LabChip® GR device from PerkinElmer. The samples are prepared according to the protocol described by the supplier and the fluorescence response during the measurement makes it possible to count the proteins present and their respective concentration.
  • the additives are prepared from compositions in granular or powder form, from which a stock solution is prepared on the day of the start of the incubation.
  • the additive is added to the wine, incubation without agitation for 24 to 48 hours at 21 ° C. is carried out.
  • the additives are added to obtain a final concentration in the wine which is preferably between 10 and 40 g / hL.
  • the additives tested are a fungal additive (according to the invention), additives known to the state of the art and additives exhibiting enzymatic activity.
  • a fungal additive according to the invention
  • additives known to the state of the art and additives exhibiting enzymatic activity.
  • the fungal additive is a granular enzyme preparation derived from Aspergillus oryzae, of the Sumizyme LPL® type, this preparation comprises an active protease as well as other enzymatic activities, observed when the fungal additive is present at a concentration in wine, respectively indicated in brackets: beta-glucanase (20 g / hL) cellulase (20 g / hL), xylanase (2 kg / hL), alpha amylase (200 g / hL) and invertase (20 g / hL) activities.
  • a stock solution of Sumizyme LPL® at 50 g.L-1 is prepared, then diluted during inoculation to a final concentration, for example, of 20 g / hL.
  • Other additives derived from Aspergillus oryzae, of the Sumizyme LPL® type, this preparation comprises an active protease as well as other enzymatic activities, observed when the
  • Powdered chitosan (Laffort) is prepared as a 5% W / v stock solution in purified water, which is then diluted as indicated.
  • Liquid chitosan pH 3.5 is prepared as a 5% W / v stock solution in purified water, the solution is prepared from powdered chitosan, diluted in HCl (solution of Concentrated HCl 36%) until a pH of 3.5 (MilliQ) is obtained.
  • Chitin-Glucan (Lallemand) is prepared as a 5% w / v stock solution in purified water. (MilliQ).
  • the MP32 mannoprotein is prepared in the form of a stock solution of MP32 mannoproteins according to the protocol described in international application WO 97/49794 at 1% w / v in purified water (MilliQ).
  • Protease AB enzyme Aspergillus Oryzae (Veron PS) (Addendum 6)
  • a heat test simulates the effect of time and the potential temperature variations to which a wine may be exposed during storage and transport. During this test, the wine is exposed to defined temperatures for a precise period, the tests are carried out in triplicate.
  • the standard test is carried out on samples of 50 ml of wine. The samples are filtered beforehand on a 0.45 micrometer polyether sulfone membrane. Turbidity, expressed in NTU (Nephelometric Turbidity Unit) and measured with a nephelometer, is measured before heating, then the samples are deposited as follows: 1) vials closed for 30 min in a water bath at 80 ° C, 2) vials opened for 30 min at room temperature, 3) vials closed for 15 min in a water bath at 20 ° C. Turbidity is then measured after these different heatings.
  • NTU Nephelometric Turbidity Unit
  • ANTU turbidity after heating - turbidity before heating thus the value of the heat cloudiness, representative of the protein instability of the wine.
  • GW Gewurztraminer
  • producers of GW wine set a limit of around 10 to 20 NTU to consider the wine protein stable.
  • the heat test is the only test in the world of oenology that validates the stability of a wine. Thus, in the context of the invention presented, it was used as a reference test to demonstrate the effectiveness of the additive improving protein stability and therefore reducing the DNTu in comparison with the control wine.
  • As wine is a complex matrix and evolves over time, especially in a wine that is unstable with protein, it is normal to observe slight variations between several data series, hence the importance of systematically including a control wine ( n ' having undergone no treatment whatsoever) in each series. Additional analyzes were also carried out, in particular for monitoring the proteins following the various treatments applied, in particular by SDS-PAGE electrophoresis and automatic electrophoresis.
  • the samples of the 2 GW were deposited on SDS-PAGE gel (FIG. 1), in order to follow the evolution of all the proteins of the wine during the reduction of the heat haze after addition of the fungal additive.
  • the control wines from wells 2 and 6 have a profile characteristic of white wines with in particular bands at 20, 32 and 70 KDa representing respectively the Thaumatin-Like proteins, the glucanases and the Invertases. Chitinases appear more diffuse and extensive between 10 and 35 kDa.
  • Wells 4 and 8 clearly show that the proteins in the wine are unchanged when the fungal additive is added. Additional bands corresponding to the proteins (enzymes) of the fungal preparation appear.
  • a second test aimed to evaluate the following additives for 5 different wines: the fungal additive (additive according to the invention), chitosan in the form of powder rehydrated in MilliQ water or in acidic liquid form (pH 3.5), chitin-glucan and finally mannoprotein MP32.
  • the results are shown in Table 3 below.
  • the fungal additive at 20 g / hL and the mannoprotein MP32 at 25 g / hL have a very significant effect on Sauvignon leading to a reduction in heat haze of 71 and 81% respectively.
  • Acidified chitosan appears to be more effective than pure chitosan, and leads to the greatest heat haze reductions for samples GW 219 and 519.
  • Chitin-glucan has a relatively similar effect to pure chitosan.
  • SDS-PAGE electrophoresis gels were carried out per wine (results not shown). In each gel, the appearance of additional bands corresponding respectively to MP 32 and to the proteins of the fungal preparation is noted for the lanes corresponding to the test conditions for MP 32 and for the fungal preparation.
  • the additives do not all have the same effectiveness on the same wine.
  • an additive according to the invention (1) Sigma invertase (3) and Danisco invertase (4), have a positive impact on the stability of GW117 since they reduce the haze by 48 to 63% then that the additives Protease AB (6) and Protease Novozyme (7) do not reduce haze; a reduction of 6% is considered not to be significant.
  • 1.2.5 Characterization of protease and invertase activity
  • the protease activity is measured by a test for degradation of hemoglobin for 1 hour, at pH 3 and at 37 ° C.
  • the invertase activity is characterized by a known spectrophotometric method: degradation of sucrose into glucose at 40 ° C, pH 4.5
  • the protease and invertase activities of the various additives are the data from the technical sheets (each of the technical sheets indicating the protocol used for the measurement of the enzymatic activity, to which are added the data measured in the laboratory
  • the invertase activities of additives 1, 6 and 7 were measured in the laboratory The results are shown in Table 5 below.
  • the fungal additive according to the invention contains an invertase activity 7200 times less than the additive “Invertase Novozyme” (2), respectively 20 and 144,000 units / g, yet it has the same efficacy on GW117. for a dose of 10 g / hL. This result is also observed for all the wines tested.
  • the combined presence of protease and invertase activity in an additive according to the invention is the key to heat stability. This result makes it possible to reduce the invertase activity to be used by 7200 times compared with an additive exhibiting only invertase activity.
  • the activity of the additives on the stability of GW1 wine is measured after a possible heating step.
  • the term "exotic Inv” denotes an invertase of Candida utilis.
  • the treatment by heating the additive consists of heating at 80 ° C for 10 minutes. The results are shown in Table 6 below.
  • Example 1 The compositions described in Example 1 are combined to test their effect on protein heat stability in Gewurztraminer samples. The various additives and the results obtained are presented in Table 7 below.
  • Example 1 The compositions described in Example 1 are then combined with an oligomer of chitosan, to compare the effect of an oligomer of chitosan and of chitosan in accordance with the Oenological Codex on protein stability to heat in different samples of Gewurztraminer.
  • Chitosan oligomers are prepared from GU3511 (Chitosan oligosaccharide, fungal origin, Glentham). A 5% w / v stock solution of chitosan oligomer is prepared and added directly to the wine to reach the desired concentration. The tests were carried out on GW 123B and Sauvignon wines. The results are presented in Table 6 below.

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Abstract

La présente demande a pour objet un additif pour augmenter la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal, ledit additif comprenant au moins une protéase active, caractérisé en ce qu'en présence dudit additif le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié. La présente demande a également pour objet un procédé pour augmenter la stabilité protéique dans une boisson à base de moût végétal, ledit procédé étant dépourvu de toute étape de chauffage.

Description

Additif pour améliorer la stabilité protéique dans une boisson
Domaine de l'invention
La présente invention a pour objet un additif pour améliorer la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal. La présente invention a également pour objet un procédé pour améliorer la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal. L'invention se situe donc dans le domaine des produits et procédés de préparation et de conservation de boissons à base de moût végétal, notamment le vin.
Etat de la technique
Les protéines sont à l'origine d'une instabilité dans les boissons à base de moût végétal, telles que le vin, la bière, le cidre et les jus de fruit. En effet, lors de variations brutales de température et/ou lors du stockage, selon la durée et les conditions de celui-ci, les protéines thermosensibles présentes dans la boisson peuvent floculer ou précipiter, occasionnant l'apparition d'un trouble dans la boisson qui peut être préjudiciable à sa consommation. En œnologie, l'expression « casse protéique » désigne le phénomène lors duquel les protéines de la boisson précipitent et provoquent l'apparition d'un trouble. Dans le cas du vin, l'instabilité protéique est favorisée par l'augmentation de la température du vin lors du transport ou du stockage. Présentes à faibles concentrations, de 15 à 300 mg.L-1, dans les vins blancs, les protéines s'agrègent et précipitent. Les risques afférant à l'instabilité protéique dépendent d'un grand nombre de facteurs tels que le cépage, Sauvignon et Gewurztraminer étant plus susceptibles d'instabilité, l'origine géographique et le millésime. Les vins issus de l'agriculture biologique sont également exposés. En France, 34% des vins blancs souffrent d'instabilité protéique.
Le traitement usuel, notamment pour stabiliser les vins blancs ou rosés, est l'élimination des protéines du vin au moyen d'une argile présentant des propriétés colloïdales, la bentonite. L'un des principaux inconvénients liés à l'utilisation de la bentonite est la perte d'arômes, fortement dommageable pour les qualités organoleptiques du vin. D'autre part, le mode de fonctionnement de la bentonite vis-à-vis des protéines instables mène à de fortes pertes volumétriques : les pertes volumétriques associées à l'emploi de bentonite sont estimées à près de 200 millions d'euros dans le monde, soit l'équivalent de la production annuelle néo- zélandaise de vin blanc (2,85 millions d'hectolitres en 2017).
De nombreuses alternatives à la bentonite ont été testées sans qu'aucune ne réponde de façon satisfaisante aux attentes des producteurs de vin. Parmi les alternatives possibles à la bentonite, l'emploi de protéases conduisant à l'hydrolyse des liaisons peptidiques des protéines pour les décomposer en différents peptides et acides aminés de moindre taille, a connu un vif intérêt. L'efficacité partielle de protéases fongiques utilisées de manière isolée a été montrée avec deux enzymes protéolytiques de type Apergillopepsine I et II (Marangon et al, « Dégradation of white wine haze proteins by Argillopepsin I and II during juice flash pasteurization », Food Chemistry, Vol. 135, issue 3, p. 1157-65, 2012). L'effet stabilisant de ces protéases est dû au fait qu'elles hydrolysent les protéines du vin, réduisant ainsi leur précipitation lors de changements thermiques. Une flash pasteurisation à 70-75°C pendant une minute, suivie d'un refroidissement, sont nécessaires, préalablement à l'ajout de 1 à 3 g/hl de protéases. Cette étape de chauffage permet notamment de dénaturer les protéines, le changement de la conformation des protéines les rendant ainsi plus accessibles aux protéases. Selon une autre approche, l'addition de protéases suivie d'une flash pasteurisation a également été testée.
Sous l'impulsion des attentes des consommateurs, les protéases d'origine végétale constituent une voie préférentielle pour les boissons alimentaires. La papaïne et la bromélaïne purifiées commerciales ont été utilisées pour la stabilisation protéique du vin (Benucci et al, « Effect of free and immobiiised stem bromelain on protein haze in white wine », Australian Journal of Grape and Wine Research, Vol. 20, issue 3, pp 347-352, 2014), la bromélaïne étant préalablement immobilisée sur un support constitué par du chitosan. La papaïne et la bromélaïne sont des protéases à cystéine. Les résultats montrent que l'activité de l'enzyme est peu maîtrisée et aboutit à une réduction partielle et limitée du taux de protéines.
La chitine-glucane est principalement utilisée sur les vins blancs pour la clarification des moûts et des vins, ainsi que le traitement préventif des casses protéiques. Le chitosan est majoritairement utilisé pour la réduction de micro organismes indésirables de types Brettanomyces. Ces deux composés précipitent et sédimentent, entraînant les composés indésirables. Utilisés de manière simultanée, ils facilitent le débourbage et la clarification des moûts et des vins.
La mannoprotéine MP32, d'un poids moléculaire de 31.8 KDa, est issue d'un fragment d'invertase de S. cerevisiae qui serait généré lors de l'autolyse des lies de levures par l'action combinée de béta-glucanase de la paroi cellulaire des levures et de protéase vacuolaire. La production industrielle de MP32 serait possible par digestion enzymatique de la paroi cellulaire de levures grâce à une béta-glucanase commerciale, la Glucanex™. Des essais en laboratoire ont été réalisés et les mannoprotéines extraites ont permis une réduction totale de l'instabilité protéique d'un vin à ~40NTU (Néphélometric Turbidity Unit) mais le mécanisme de protection n'est pas connu. (V. Moine et D. Dubourdieu, « An invertase fragment responsible for improving the protein stability of dry white wines » 1999, E. Waters « A Saccharomyces mannoprotein that protects wine from protein haze » 1994). Le procédé de production de la protéine MP32 est cependant extrêmement coûteux, l'utilisation de cette protéine en tant que telle n'est donc pas viable économiquement.
Actuellement, il n'existe donc aucune solution industrielle satisfaisante alternative à la bentonite, et aucune protéase n'agit de manière efficace sur le vin dans les conditions œnologiques sans nécessiter de traitement thermique de type flash pasteurisation.
Il existe donc un besoin d'un additif permettant de résoudre le problème de l'instabilité protéique dans les boissons à base de moût végétal. Il existe également le besoin de disposer d'un moyen simple permettant de disposer d'un procédé simplifié d'augmenter la stabilité protéique des boissons, en particulier un procédé ne requérant pas d'étape de chauffage de la boisson.
Exposé de l'invention
La présente invention répond à ces objectifs. Les inventeurs ont en effet mis au point un groupe d'additifs efficaces permettant d'améliorer la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal. De façon surprenante, un additif selon l'invention comprenant au moins une protéase et caractérisé en ce qu'en sa présence, le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié, améliore très sensiblement la stabilité protéique dans une boisson à base de moût végétal pour un coût économiquement raisonnable et sans nécessiter de flash pasteurisation. Par rapport aux compositions de l'état de l'art, un additif selon l'invention permet de réduire jusqu'à 80 ou 90 % du trouble lié à la casse protéique, tel que mesuré dans un test classique de trouble à la chaleur effectué sur du vin blanc, qui représente la boisson typiquement sensible à la casse protéique. Ce résultat est démontré avec plusieurs échantillons différents de vins particulièrement sensibles à la casse protéique.
Un additif selon l'invention présente l'originalité d'inhiber la précipitation d'au moins une partie des protéines présentes dans ladite boisson sans toutefois entraîner l'hydrolyse des protéines de la boisson. Ceci est mis en évidence par le fait qu'en présence dudit additif, le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié. Plus particulièrement, l'activité protéase de l'additif est différente d'une activité de type protéase à cystéine. Autrement dit, un additif selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une protéase active, différente d'une protéase à cystéine. Encore plus particulièrement, un additif selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une protéase active, différente d'une protéase à cystéine, et présente en outre une activité invertase.
La présente invention a également pour objet un procédé pour améliorer la stabilité protéique, à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal, ledit procédé étant dépourvu de toute étape de chauffage de ladite boisson et comprenant l'ajout d'un additif comprenant une protéase active, l'additif étant caractérisé en ce qu'en sa présence, le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié. Plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'ajout d'un additif comprenant au moins une protéase active qui n'est pas une protéase à cystéine. Encore plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'ajout d'un additif comprenant une protéase active, différente d'une protéase à cystéine, et présentant en outre une activité invertase.
L'invention a également pour objet l'utilisation, pour améliorer la stabilité protéique, à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal, d'un additif comprenant au moins une protéase active, ledit additif étant caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié. Plus particulièrement, une utilisation selon l'invention comprend l'ajout d'un additif comprenant au moins une protéase active qui n'est pas une protéase à cystéine. Encore plus particulièrement, une utilisation selon l'invention comprend l'ajout d'un additif comprenant une protéase active, différente d'une protéase à cystéine, et présentant en outre une activité invertase.
Exposé de l'invention
Selon un premier objet, l'invention concerne un additif pour augmenter la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal, ledit additif exerçant une activité inhibitrice de la précipitation d'au moins une partie des protéines présentes dans ladite boisson et comprenant au moins une protéase active, et caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié, ladite protéase n'étant pas une protéase à cystéine.
Par « stabilité protéique » on entend le fait que les protéines présentes dans la boisson ne précipitent pas et restent solubles, c'est-à-dire qu'on n'observe pas ou peu de précipité ou de trouble de la boisson notamment dû à la floculation des protéines dans la boisson. Ce trouble peut être évalué par toute méthode connue de mesure de la turbidité, observée à l'œil nu ou par une technique de néphélométrie qui mesure la teneur de particules en suspension d'un milieu, et dont le résultat est exprimé en unités de turbidité néphélométrique, soit UTN ou NTU (Nephelometry Turbidity Unit) en anglais.
Par « augmentation de la stabilité protéique » on entend la diminution de l'apparition du trouble, caractérisée notamment par la comparaison du trouble dans la boisson, traitée et non traitée, tel qu'observé dans un test à la chaleur au cours duquel ladite boisson est soumise à une température élevée puis caractérisée pour sa turbidité.
Par « profil protéique » on entend la représentation des différentes protéines présentes dans un échantillon et séparées en fonction de leur masse molaire. Une telle représentation peut notamment être obtenue grâce à une analyse par électrophorèse en conditions dénaturantes, notamment de type SDS- PAGE (Sodium-Dodecyl-Sulfate PolyAmide Gel Electrophoresis) et/ou par électrophorèse automatique mettant en oeuvre un dispositif de type LabChip®. La modification de la masse moléculaire apparente d'une ou plusieurs protéines indique notamment la dégradation protéolytique de ladite ou lesdites protéines.
Un additif selon la présente invention améliore la stabilité protéique, autrement dit, il inhibe la précipitation d'au moins une partie des protéines présentes dans l'échantillon, sans toutefois entraîner une modification du profil protéique, témoin de la dégradation ladite ou lesdites protéine.
Selon un premier aspect particulier, un additif selon l'invention comprend au moins une protéase active. Selon cet aspect, par « protéase active » on entend une enzyme présentant une activité hydrolytique des liaisons peptidiques d'une protéine, mesurable in vitro selon des techniques bien connues par un homme du métier. Plus particulièrement, un additif selon l'invention comprend au moins une protéase active et est caractérisé en ce qu'en sa présence, le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié. En d'autres termes, un additif selon l'invention présente une activité de type protéase cependant, en présence d'un échantillon d'une boisson à base de moût végétal, l'hydrolyse des protéines de ladite boisson n'est pas observée, notamment par électrophorèse.
L'activité enzymatique d'une protéase d'un additif selon l'invention peut être caractérisée par tout moyen connu d'une personne du métier, comme par exemple un test de dégradation de l'hémoglobine pendant 1 heure, à pH 3 et à 37°C.
Selon un aspect plus particulier, l'activité enzymatique de ladite protéase active dans un additif selon l'invention n'est pas inhibée par un inhibiteur de protéases à cystéines, comme par exemple l'iodoacétamide à une concentration de 1 ou 5 mM, et/ou cette activité enzymatique n'est pas améliorée en présence de cystéine. Selon cet aspect particulier, une protéase active d'un additif selon l'invention n'est pas une protéase à cystéine.
Selon un aspect particulier, un additif selon l'invention comprend au moins une protéase d'origine eucaryote ou procaryote, plus particulièrement une protéase d'origine fongique ou végétale. Plus particulièrement, un additif selon l'invention comprend une préparation enzymatique d'origine fongique ou végétale, cette préparation enzymatique présentant au moins une activité de type protéase.
Parmi les préparations enzymatiques d'origine fongique ou végétale, on peut citer les préparations obtenues à partir des microorganismes suivants :
- Les champignons du genre Aspergillus, en particulier Aspergillus oryzae,
- Les levures du genre Candida, en particulier Candida utilis.
- Les levures du genre Saccharomyces, en particulier Saccharomyces cerevisiae,
Parmi les préparations enzymatiques d'origine fongique ou végétale, on peut citer plus particulièrement :
- le produit vendu sous la dénomination de Sumizyme LPL®.
Plus particulièrement, parmi les protéases présentes dans une composition d'origine fongique, on peut citer les protéases présentes dans une préparation enzymatique d'origine fongique, plus particulièrement une préparation enzymatique obtenue à partir de Aspergillus oryzae, telle que notamment le produit vendu sous la dénomination de Sumizyme LPL®, sous forme granulaire ou sous forme de poudre. Ce produit présente une activité protéase et les activités béta-glucanase, cellulase, xylanase, alpha-amylase et invertase. Selon cet aspect, un additif selon l'invention comprend un additif fongique obtenu à partir de Aspergillus oryzae présentant une activité protéase.
Un additif selon l'invention comprend une protéase active, dont l'activité protéasique est supérieure à 1 unités d'enzyme (U) par gramme d'additif, de préférence comprise entre 10 et 10 000000 U par gramme d'additif, de préférence entre 100 et 1 000 000 U, de préférence centre 500 et 500 000 U par gramme d'additif.
L'activité enzymatique d'une protéase d'un additif selon l'invention peut être caractérisée par tout moyen connu d'une personne du métier, comme par exemple un test de dégradation de l'hémoglobine pendant lh, à pH 3 et à 37°C.
Un additif selon l'invention présente une activité protéasique comprise entre environ 10 et environ 10 000 000 U par gramme d'additif, de préférence comprise entre 100 et 1 000000 U par gramme d'additif, dans lequel chaque unité d'enzyme dégrade une solution à 2% en poids/volume d'hémoglobine en une heure, à pH 3 et à 37°C.
Selon un premier aspect particulier, un additif selon l'invention comprend une protéase active et est caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié, ledit additif présente en outre au moins une activité enzymatique invertase.
Un additif selon l'invention présente en outre une activité invertase, l'activité invertasique d'un additif selon l'invention est supérieure à 1 unité d'enzyme (U) par gramme d'additif, de préférence entre 1 et environ 1.000.000 U par gramme d'additif, de préférence entre 5 et 500.000 U, de préférence entre 10 et 100.000 U, de préférence entre 15 et 10.000 U, de préférence entre 20 et 5.000 U par gramme d'additif.
La présence de l'activité enzymatique invertase est aisément caractérisée par une personne du métier, mettant en oeuvre de techniques classiques, par exemple par la mesure spectrophotométrique de dégradation de sucrose en glucose à 40°C, pH 4,5.
Un additif selon l'invention présente donc une activité invertasique comprise entre environ 1 et environ 1.000.000 U par gramme d'additif, dans lequel chaque unité d'enzyme libère 1 pmole de glucose par minute, à pH 4,5 et à 40°C.
Selon un autre aspect particulier, un additif selon l'invention comprend une protéase active, est caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié, présente une activité enzymatique invertase et une activité enzymatique choisie parmi les suivantes : béta-glucanase, cellulase, xylanase et alpha-amylase. La présence de chacune de ces activités enzymatiques est aisément caractérisable par une personne du métier, suivant des techniques classiques.
Selon un autre aspect particulier, un additif selon l'invention comprend une protéase active et au moins un oligosaccharide ou un polyoside. Plus particulièrement, un additif selon l'invention comprend i) une protéase active et présente en outre au moins une activité enzymatique choisie parmi les suivantes : béta-glucanase, cellulase, xylanase, alpha-amylase et invertase, et ii) au moins un oligosaccharide ou un polyoside.
Selon cet aspect, par « oligosaccharide » et « polyoside » on entend respectivement un oligomère ou un polymère formé de plusieurs oses, notamment fructose, galactose, glucose et/ou mannose, liés par une liaison glycosidique alpha ou bêta. Parmi les oligosaccharides et les polyosides, on peut citer le chitosan, les oligosides de chitosan et la chitine-glucane.
Selon un aspect encore plus particulier, un additif selon l'invention comprend au moins une protéase active et présente une activité invertase, et au moins un oligosaccharide ou un polyoside, choisi parmi le chitosan et les oligomères de chitosan.
Selon un aspect encore plus particulier, un additif selon l'invention comprend au moins une protéase active, présente une activité invertase, et présente en outre une activité choisie parmi : béta-glucanase, cellulase, xylanase et/ou alpha- amylase, et comprend au moins un oligosaccharide ou un polyoside, choisi parmi le chitosan et les oligomères de chitosan.
Selon un autre aspect particulier, un additif selon l'invention comprend en outre une composition comprenant une mannoprotéine ou un fragment d'invertase. Dans un additif selon l'invention, ladite mannoprotéine est de préférence la protéine MP32, une protéine de masse molaire 32 kDa qui correspond à un fragment d'invertase de Saccharomyces cerevisiae. Par « mannoprotéines » on entend des polysaccharidiques liés à des protéines, issus de levure et notamment obtenus industriellement par digestion des parois de levures, en particulier Saccharomyces cerevisiae.
Selon un aspect encore plus particulier, un additif selon l'invention comprend au moins : i) une protéase active, ii) du chitosan et/ou un oligoside de chitosan, et et présente en outre une activité béta-glucanase, cellulase, xylanase, alpha-amylase et/ou invertase. Chacun des éléments dudit additif peut être ajouté de façon séparée à ladite boisson lors de sa préparation, ou bien au moins deux des additifs sont mélangés puis ajoutés simultanément à la boisson.
Selon ledit premier aspect de l'invention, la concentration dans l'additif de chacun des éléments précédemment cités est compatible avec une concentration finale dans ladite boisson telle qu'indiquée ci-dessous : additif fongique entre 0,01 et 2000 g/hectolitre, de préférence entre 0,1 et 200 g/hectolitre, de préférence entre 1 et 200 g/hectolitre, de préférence entre 10 et 100 g/hectolitre, de préférence 20 g/hectolitre ; oligoside entre 1 et 200 g/hectolitre et de préférence entre 5 et 50 g/hectolitre ; mannoprotéines entre 1 et 200 g/hectolitre et de préférence entre 25 et 50 g/hectolitre.
Par « boisson à base de moût végétal » on entend le moût, le vin, la bière, le cidre et les jus de fruit. Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un additif, un procédé et une utilisation destinés à améliorer la stabilité protéique dans le vin, de préférence le vin blanc et le vin rosé, produit à partir de tout cépage connu, et notamment Gewurztraminer et Sauvignon.
Selon un deuxième objet, l'invention concerne un procédé pour augmenter la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal, ledit procédé étant dépourvu de toute étape de chauffage de ladite boisson et comprenant au moins une étape d'ajout à ladite boisson d'un additif comprenant au moins une protéase active, ledit additif étant caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de la boisson traitée n'est pas modifié. Ledit additif est caractérisé en ce que ladite protéasique est différente de celle d'une protéase à cystéine.
Plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'ajout d'un additif comprenant une protéase active, qui n'est pas une protéase à cystéine, est caractérisé en ce qu'en sa présence le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié, ledit additif présente en outre une activité enzymatique invertase. Par « procédé dépourvu de toute étape de chauffage » on entend un procédé dépourvu d'un chauffage de type « flash pasteurisation », soit notamment un chauffage à une température comprise entre 65°C et 75°C pendant une courte durée, notamment de 1 minute, ou une étape de chauffage équivalente.
Selon un aspect particulier, un procédé selon l'invention comprend l'addition d'une composition comprenant une protéase active et/ou d'un oligosaccharide ou un polyoside. Plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'addition d'un oligosaccharide ou un polyoside et d'une composition comprenant une protéase active. Encore plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'addition d'un oligosaccharide ou un polyoside, et d'une composition comprenant une protéase active, présentant une activité invertase et présentant au moins une autre activité enzymatique telle que béta-glucanase, cellulase, xylanase et alpha-amylase. Dans un procédé selon l'invention, ladite composition comprenant une protéase active est notamment choisie parmi les compositions d'origine fongique comprenant une protéase active et éventuellement présentant au moins une autre activité enzymatique telle que béta-glucanase, cellulase, xylanase, alpha-amylase et invertase, une telle composition est notamment la Sumizyme LPL®.
Dans un procédé selon l'invention, le ou les composés sont ajoutés à dans ladite boisson à une concentration finale respective de : composition comprenant une protéase active entre 1 et 200 g/hectolitre, de préférence entre 5 et 50 g/hectolitre, de préférence entre 10 et 40 g/hectolitre et de préférence 20 g/hectolitre ; oligoside entre 1 et 200 g/hectolitre et de préférence entre 5 et 50 g/hectolitre ; mannoprotéine entre 1 et 200 g/hectolitre et de préférence entre 25 et 50 g/hectolitre.
Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, le ou les composés sont ajoutés à dans ladite boisson de telle sorte que l'activité protéasique finale dans ladite boisson soit comprise entre 1.000 et 10.000.000 U /hectolitre.
Encore plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, le ou les composés sont ajoutés à dans ladite boisson de telle sorte que l'activité protéasique finale dans ladite boisson soit comprise entre 1.000 et 10.000.000 U /hectolitre et que l'activité invertasique finale dans ladite boisson soit comprise entre 200 et 5.000.000 unités /hectolitre, de préférence entre 20 et 500.000 U /hectolitre.
Selon un troisième objet, l'invention concerne l'utilisation pour augmenter la stabilité protéique, dans une boisson à base de moût végétal, à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, d'un additif ou d'une composition comprenant au moins une protéase active, caractérisé en ce qu'en présence dudit additif le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié. Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation d'un additif ou d'une composition comprenant au moins une protéase active, différente d'une protéase à cystéine, et présentant une activité invertase.
Description des figures et modes de réalisation
D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l'examen de la description détaillé d'un mode de réalisation nullement limitatif, et des dessins annexés, dans lesquels :
La Figure 1 représente le résultat de l'analyse par SDS-PAGE de différents échantillons avec, de gauche à droite : marqueur (1), GW519 (2), GW519 et cystéine (3), GW510 et additif fongique avec protéase (4), GW510, additif fongique avec protéase et cystéine (5), GW123B (6), GW123B et cystéine (7), GW123B et additif fongique avec protéase (8), GW123B et additif fongique avec protéase et cystéine (9).
Les Figures 2A et 2B représentent respectivement le résultat de l'analyse par électrophorèse automatique d'échantillons de vin Gewurztraminer GW123B ou GW519 traités par un additif fongique. Sur la figure 2A, les tracés représentent, de gauche à droite, GW123B (bleu), GW123B et cystéine (rouge), GW123B et additif fongique avec protéase (marron), GW123B, cystéine et additif fongique avec protéase (vert). Sur la figure 2B, les tracés représentent, de gauche à droite, GW519 (bleu), GW519 et cystéine (rouge), GW519 et additif fongique avec protéase (marron), GW519, cystéine et additif fongique avec protéase (vert).
Il est bien entendu que les modes de réalisation qui seront décrits par la suite ne sont nullement limitatifs. On pourra notamment imaginer des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection de caractéristiques décrites par la suite isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à de l'état de la technique antérieur.
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants, qui sont donnés pour illustrer l'invention et non pour en limiter la portée.
EXEMPLES
Exemple 1 : Développement de compositions pour améliorer la stabilité protéique des moûts végétaux.
1.1. Matériel et méthodes
1.1.1. Boissons testées
Des tests de stabilité ont été réalisés sur trois cépages principaux connus pour leur forte instabilité protéique : 6 échantillons différents de cépages
Gewurztraminer (GW) : GW 1, GW 117, GW 520, GW 219, GW 123 B et GW 519, un échantillon de Sémillon et 2 échantillons de Sauvignon blanc : Sauvignon 1 et Sauvignon. Les vins sont stockés à 21°C. Les additifs sont évalués après fermentation, sur des vins n'ayant pas subi de traitement à la bentonite. Les vins ne subissent aucune flash fermentation au cours des tests.
L'électrophorèse SDS-PAGE permet de faire migrer des protéines sous l'influence d'un courant électrique, dans un gel de 14% de polyacrylamide, permettant la séparation des protéines selon leur poids moléculaire. Les résultats sont interprétables grâce à l'utilisation d'un marqueur contenant des protéines de 14,4 à 97 kDa. L'électrophorèse automatique consiste en la détermination des poids moléculaires de protéines par électrophorèse automatique grâce à l'appareil LabChip® GR de PerkinElmer. Les échantillons sont préparés selon le protocole décrit par le fournisseur et la réponse en fluorescence lors de la mesure permet de dénombrer les protéines présentes et leur concentration respective.
Le pH des vins a été rigoureusement noté mais n'a pas été ajusté après ajout des additifs. Il est connu que plus le pH de la boisson est élevé, plus les protéines précipitent. Il est connu que certaines molécules, comme la cystéine, sont connues pour leur capacité à modifier le pH du vin, selon leur concentration.
Les caractéristiques des échantillons sont définies dans le tableau 1 qui suit.
Figure imgf000016_0001
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Tableau 1
1.1.2. Additifs testés
Les additifs sont préparés à partir de compositions sous forme granulaire ou de poudre, à partir desquelles une solution mère est préparée le jour du lancement de l'incubation. L'additif est ajouté au vin, une incubation sans agitation pendant 24 à 48h à 21°C est réalisée. Les additifs sont ajoutés pour obtenir une concentration finale dans le vin qui est comprise de préférence entre 10 et 40 g/hL.
Les additifs testés sont un additif fongique (selon l'invention), des additifs connus de l'état de l'art et des additifs présentant une activité enzymatique. a. Additif fongique
L'additif fongique est une préparation enzymatique granulaire dérivée de Aspergillus oryzae, de type Sumizyme LPL®, cette préparation comprend une protéase active ainsi que d'autres activités enzymatiques, observées lorsque l'additif fongique est présent à une concentration dans le vin, respectivement indiquée entre parenthèses : activités béta-glucanase (20 g/hL) cellulase (20 g/hL), xylanase (2 kg/hL), alpha amylase (200 g/hL) et invertase (20 g/hL). Une solution mère de Sumizyme LPL® à 50 g.L-1 est préparée, puis diluée lors de l'inoculation pour une concentration finale, par exemple, de 20 g/hL. b. Autres additifs
Le chitosan en poudre (Laffort) est préparé sous forme d'une solution mère à 5% W/v dans de l'eau purifiée, qui est ensuite diluée comme indiqué.
Le chitosan liquide pH 3,5 est préparé sous forme d'une solution mère à 5% W/v dans de l'eau purifiée, la solution est préparée à partir de chitosan en poudre, dilué dans de l'HCI (solution d'HCI concentré 36%) jusqu'à obtention d'un pH 3,5 (MilliQ).
La chitine-glucane (Lallemand) est préparée sous forme d'une solution mère à 5% w/v dans de l'eau purifiée. (MilliQ). La mannoprotéine MP32 est préparée sous forme d'une solution mère de mannoprotéines MP32 selon le protocole décrit dans la demande internationale WO 97/49794 à 1% w/v dans de l'eau purifiée (MilliQ).
Selon les cas, de la cystéine en poudre est ajoutée, jusqu'à obtenir une concentration finale de 10 mM dans l'échantillon traité. c. Additifs à activité enzymatique
Invertase Novozyme (Additif 2)
Invertase Sigma de Sc (Additif 3)
Invertase Danisco liquide (Additif 4)
Invertase Sigma de Candida utilis (Additif 5)
Protéase : AB enzyme Aspergillus Oryzae (Veron PS) (Additif 6)
Protéase : Novozyme Aspergillus Oryzae (Flavourzyme exopeptidase) (Additif 7)
1.1.3. Test à la chaleur
Un test à la chaleur permet de simuler l'effet du temps et des potentielles variations de température auxquelles un vin peut être exposé pendant son stockage et son transport. Pendant ce test, le vin est exposé à des températures définies pendant une durée précise, les tests sont réalisés en triplicata. Le test standard est réalisé sur des échantillons de 50 ml de vin. Les échantillons sont préalablement filtrés sur une membrane polyéther sulfone 0,45 micromètre. La turbidité, exprimée en NTU (Néphélometric Turbidity Unit) et mesurée avec un néphélomètre, est mesurée avant chauffage, puis les échantillons sont déposés comme suit : 1) flacons fermés pendant 30 min dans un bain-marie à 80°C, 2) flacons ouverts pendant 30 min à température ambiante, 3) flacons fermés pendant 15 min dans un bain-marie à 20°C. La turbidité est ensuite mesurée après ces différents chauffages.
Le calcul du ANTU = turbidité après chauffage - turbidité avant chauffage ainsi la valeur du trouble à la chaleur, représentative de l'instabilité protéique du vin. Un vin de type Sauvignon Blanc est considéré stable pour un ANTU = 2 NTU maximum. Le cépage Gewurztraminer (GW) étant plus difficile à stabiliser, les producteurs de vin GW se fixent une limite d'environ 10 à 20 NTU pour considérer le vin stable protéiquement.
Un test miniaturisé a été développé et permet de réduire les volumes de vins utilisés en utilisant, grâce à une gamme étalon établie préalablement, la lecture en cuve de 1.5 mL de la Densité Optique à 600nm (ODeoonm). Les résultats sont exprimés en terme de % de diminution du trouble à la chaleur, soit (DNTII vin avec additif - DNTII vin témoin sans additif) / 100.
Le test à la chaleur est dans le monde de l'œnologie l'unique test qui permet de valider la stabilité d'un vin. Ainsi, dans le cadre de l'invention présentée, il a été utilisé comme test de référence pour démontrer l'efficacité de l'additif améliorant la stabilité protéique et réduisant donc le DNTu en comparaison avec le vin témoin. Le vin étant une matrice complexe et évoluant avec le temps, notamment chez un vin instable protéiquement, il est normal d'observer de légères variations entre plusieurs séries de données, d'où l'importance de systématiquement inclure un vin témoin (= n'ayant subi aucun traitement quel qu'il soit) à chaque série. Des analyses complémentaires ont été également réalisées pour notamment le suivi des protéines suite aux différents traitements appliqués, notamment par électrophorèse SDS-PAGE et électrophorèse automatique.
1.2. Résultats
1.2.1. Caractérisation de l'activité protéase dans l'additif fongique
Les résultats, obtenus en présence et en absence de cystéine, sont rassemblés dans le tableau 2 suivant.
Figure imgf000019_0001
Tableau 2
Les résultats obtenus en présence d'additif fongique à 20 g/hL montrent que cet additif permet une réduction du trouble à la chaleur sur les échantillons Sauvignon, GW 519 et GW 123B. L'ajout de cystéine n'améliore pas significativement la performance de l'additif fongique, car on considère comme négligeable l'écart entre 15 et 13 NTU. Les protéases contenues dans l'additif fongique n'ont donc pas besoin du cofacteur cystéine pour réduire le trouble à la chaleur des vins testés. Il est reconnu que plus le pH du vin est haut, plus les protéines ont tendance à précipiter à la chaleur. L'ajout de cystéine, faisant baisser le pH de 0.3 unités de pH, ne conduit pas à une chute de la turbidité. Sans être lié par une théorie particulière, comme l'exemple 1 montre qu'après ajout de l'additif fongique le profil protéique de la boisson n'est pas modifié, la réduction de trouble à la chaleur observée en présence de l'additif fongique ne serait donc pas majoritairement liée à une hydrolyse des protéines du vin.
On note une différence d'activité en fonction des vins, et même au sein d'un même cépage. En effet une réduction de 58% du trouble à la chaleur est observée lors de l'ajout de l'additif fongique au GW 123B contre une réduction de 39% sur le GW 519. Cette différence s'explique par une variation, entre cépage et au sein d'un même cépage, de la répartition et de la concentration des protéines de défense, mais également d'autres paramètres pouvant rentrer en compte dans le mécanisme de précipitation à la chaleur.
1.2.2. Caractérisation des protéines de l'échantillon après traitement
Des analyses complémentaires par électrophorèse SDS-PAGE et électrophorèse automatique sont réalisées pour caractériser les protéines présentes à la suite des différents traitements appliqués.
Les échantillons des 2 GW ont été déposés sur gel SDS-PAGE (Figure 1), pour suivre l'évolution de l'ensemble des protéines du vin lors de la diminution du trouble à la chaleur après ajout de l'additif fongique. Dans la figure 1, les vins témoins des puits 2 et 6 ont un profil caractéristique des vins blancs avec notamment des bandes à 20, 32 et 70 KDa représentant respectivement les protéines Thaumatin-Like, les glucanases et les Invertases. Les chitinases apparaissent de manière plus diffuse et étendue entre 10 et 35 kDa. Les puits 4 et 8 montrent bien que les protéines du vin sont inchangées lors de l'ajout de l'additif fongique. Des bandes supplémentaires correspondant aux protéines (enzymes) de la préparation fongique apparaissent.
Ces résultats montrent que l'additif fongique contenant plusieurs activités enzymatiques n'hydrolyse pas les protéines du vin. Il est envisageable que cet additif fongique agit probablement sur le mécanisme de précipitation des protéines du vin à la chaleur. Les échantillons ont également été analysés par électrophorèse automatique (LabChip®) selon les instructions données par le fournisseur (Figures 2A et 2B). Dans le cas des deux vins, on observe une faible différence dans les profils protéiques entre vins témoins et vins traités avec l'additif fongique. L'additif fongique étant notamment composé de protéases il est normal de constater une très faible diminution des pics de fluorescence associés aux protéines du vin, observable sur le profil obtenu par LabChip® du GW 123B, cette diminution n'étant même pas visible sur gel SDS-PAGE.
Il apparaît clairement, en comparaison avec ce qui a pu être présenté dans des études précédentes, que la réduction de 57 et 39% du trouble à la chaleur sur les GW 123B et GW 519 respectivement n'est pas liée à une hydrolyse totale des protéines. Cela vient confirmer les résultats précédemment trouvés sur gel SDS- PAGE : l'additif fongique agit probablement sur le mécanisme de précipitation des protéines du vin à la chaleur.
1.2.3. Résultats : comparaison de l'effet de différents additifs
Un deuxième essai a visé à évaluer pour 5 vins différents les additifs suivants : l'additif fongique (additif selon l'invention), le chitosan sous forme de poudre réhydratée dans de l'eau MilliQ ou sous forme liquide acide (pH 3.5), la chitine- glucane et enfin la mannoprotéine MP32. Les résultats sont montrés dans le tableau 3 suivant.
Figure imgf000021_0001
Tableau 3
Les résultats obtenus montrent une fois de plus une grande différence de comportement en fonction des vins. Chaque vin a une composition bien particulière, aussi bien au niveau des protéines, jusqu'à présent jugées responsables de l'instabilité des vins blancs et rosés à la chaleur, qu'au niveau des sucres, des tanins, des stilbènes et des anthocyanes, à titre d'exemple. Il existe un grand nombre de molécules entrant dans la composition du vin et certaines entrent en jeu dans le mécanisme de précipitation à la chaleur. D'un vin à l'autre ces molécules ne sont pas présentes dans les mêmes proportions.
Ainsi, l'additif fongique à 20 g/hL et la mannoprotéine MP32 à 25 g/hL ont un effet très important sur le Sauvignon menant respectivement à une réduction du trouble à la chaleur de 71 et 81%.
Le chitosan acidifié semble plus efficace que le chitosan pur, et mène à des réductions du trouble à la chaleur les plus importantes pour les échantillons GW 219 et 519. La chitine-glucane a un effet relativement similaire au chitosan pur. Plusieurs gels électrophorèse SDS-PAGE ont été réalisés par vin (résultats non montrés). Dans chaque gel on note, pour les pistes correspondant aux conditions de test à la MP 32 et à la préparation fongique, l'apparition de bandes supplémentaires correspondant respectivement à la MP 32 et aux protéines de la préparation fongique.
D'autre part, si l'on compare chacune des pistes correspondant au vin traité avec l'un de ces additifs avec la piste correspondant au vin témoin, que le vin soit traité à l'additif fongique, au chitosan, à la chitine ou à la MP32, les bandes protéiques du vin demeurent inchangées. Chacun de ces additifs, ayant un degré d'action notable mais différent sur le trouble à la chaleur des vins, agit donc sur le mécanisme de précipitation des protéines à la chaleur, et non pas sur les protéines elles-mêmes.
1.2.4. Effet d'additifs présentant une activité enzymatique
L'effet de différents additifs présentant une activité enzymatique sur la turbidité est comparé pour différents vins, les résultats sont présentés dans le tableau 4 suivant.
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Tableau 4
Les additifs ne présentent pas tous la même efficacité sur un même vin. Par exemple, un additif selon l'invention (1), l'invertase Sigma (3) et l'invertase Danisco (4), ont un impact positif sur la stabilité du GW117 puisqu'ils réduisent le trouble de 48 à 63% alors que les additifs Protéase AB (6) et Protéase Novozyme (7) ne réduisent pas le trouble ; on considère qu'une réduction de 6 % n'est pas significative. 1.2.5. Caractérisation de l'activité protéasique et invertasique
L'activité protéasique est mesurée par un test de dégradation de l'hémoglobine pendant lh, à pH 3 et à 37°C. L'activité invertasique est caractérisée par une méthode spectrophotométrique connue : dégradation du sucrose en glucose à 40°C, pH 4,5 Les activités protéasique et invertasique des différents additifs sont les données issues des fiches techniques (chacune des fiches techniques indiquant le protocole utilisé pour la mesure de l'activité enzymatique, auxquelles sont ajoutées les données mesurées en laboratoire. L'activités invertasique des additifs 1, 6 et 7 ont été mesurés au laboratoire. Les résultats sont présentés dans le tableau 5 ci- dessous.
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000024_0001
Tableau 5
Ces résultats permettent de comparer les additifs entre eux en terme d'efficacité sur vin en tenant compte des niveaux d'activités invertasique et protéasique et des doses associées.
Les additifs « Protéase AB enzyme » (6) et « Protéase Novozyme » (7) ne contenant qu'une activité protéasique, décrite et mesurée, ne sont pas efficaces sur la stabilité des vins.
L'additif fongique selon l'invention (additif 1) contient une activité invertasique 7200 fois moins importante que l'additif « Invertase Novozyme » (2), respectivement 20 et 144 000 unités/g, pourtant il présente la même efficacité sur le GW117 pour une dose de 10 g/hL. Ce résultat est également observé pour l'ensemble des vins testés.
La présence combinée d'une activité protéasique et invertasique dans un additif selon l'invention est la clef pour la stabilité à la chaleur. Ce résultat permet de réduire de 7200 fois l'activité invertasique à utiliser par rapport à un additif présentant uniquement une activité invertasique.
1.2.6. Caractérisation des additifs après chauffage
L'activité des additifs sur la stabilité du vin GW1 est mesurée après une étape éventuelle de chauffage. Le terme « Inv exotique » désigne une invertase de Candida utilis. Le traitement par chauffage de l'additif consiste en un chauffage à 80°C pendant 10 minutes. Les résultats sont présentés dans le tableau 6 ci- dessous.
Figure imgf000025_0001
Tableau 6
Les résultats montrent que le chauffage conduisant à l'inactivation des activités enzymatiques réduit très largement l'activité des additifs testés sur la stabilité des vins, passant de 80% à 25% dans le meilleur des cas. Exemple 2 : Développement d'additifs comprenant une ou plusieurs compositions
Les compositions décrites dans l'exemple 1 sont combinées pour tester leur effet sur la stabilité protéique à la chaleur dans des échantillons de Gewurztraminer. Les différents additifs et les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 7 suivant.
Figure imgf000026_0001
Tableau 7 Les résultats montrent que, d'une manière générale, il est possible d'arriver à une stabilisation quasiment totale en combinant l'ensemble des additifs, notamment pour les GW 520 et GW 219. Le GW 219, malgré un profil protéique identique aux trois autres GW, semble avoir un comportement différent des autres vins, il semble notamment moins affecté par la MP32. Si l'on regarde plus particulièrement la modalité « Chitosan pH 3.5 à 25 g/hL et additif fongique à lOg/hL », on peut noter que l'effet de ces deux additifs combinés (i.e 41 NTU pour le GW 520 et 57 NTU pour le GW 123B) n'est pas égal à la somme des effets des additifs utilisés séparément (36 + 32 = 67 NTU pour le GW 520 et 34 + 40 = 74 NTU pour le GW 123B). Il est envisageable que ces effets non cumulatifs s'expliquent, soit par des mécanismes d'action différents mais liés : l'additif fongique bloquerait une molécule entrant en jeu dans le mécanisme de précipitation des protéines et inhiberait l'action de la MP32, ou l'inverse, soit par des mécanismes compétitifs : l'additif fongique bloquerait une molécule entrant en jeu dans le mécanisme de précipitation des protéines ; la MP32 visant la même molécule deviendrait moins efficace de par l'indisponibilité partielle de sa cible. L'importance est de retenir ici une action conjuguée, même si elle n'est pas strictement additionnelle, de l'additif fongique et du chitosan. Exemple 3 : Développement d'additifs comprenant un oligomère du chitosan
Les compositions décrites dans l'exemple 1 sont ensuite combinées avec un oligomère du chitosan, pour comparer l'effet d'un oligomère du chitosan et du chitosan conforme au Codex œnologique sur la stabilité protéique à la chaleur dans différents échantillons de Gewurztraminer. Les oligomères de chitosan sont préparés à partir de GU3511 (Chitosan oligosaccharide, origine fongique, Glentham). Une solution mère à 5%w/v d'oligomère du chitosan est préparée et rajoutée directement dans le vin pour atteindre la concentration souhaitée. Les essais ont été réalisés sur les vins GW 123B et Sauvignon Les résultats sont présentés dans le tableau 6 suivant.
Figure imgf000028_0001
Tableau 8
Les résultats expérimentaux montrent que pour les combinaisons aux concentrations hautes (20 g/hL d'additif fongique et 25 g/hL de chitosan ou son oligomère), la réduction du trouble à la chaleur des deux vins lorsque les additifs sont utilisés de manière combinée est toujours inférieure (ou égale, dans un seul cas) à la réduction du trouble à la chaleur des additifs utilisés de manière isolée. Ces essais confirment la série précédente et montrent que le chitosan et son oligomère ont une action semblable sur la réduction du trouble à la chaleur. Une concentration de 25 g/hL dans les deux cas est nécessaire pour observer un effet sur la réduction du trouble à la chaleur.
Les échantillons traités ont été analysés sur SDS-PAGE, les résultats montrent que quel que soit l'additif utilisé, aucune hydrolyse des protéines n'est observée dans l'échantillon.

Claims

REVENDICATIONS
1. Additif pour augmenter la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal, ledit additif exerçant une activité inhibitrice de la précipitation d'au moins une partie des protéines présentes dans ladite boisson et comprenant au moins une protéase active, caractérisé en ce que ladite protéase n'est pas une protéase à cystéine et en ce que ledit additif présente en outre une activité enzymatique invertase.
2. Additif selon la revendication 1, ledit additif présentant en outre au moins une activité enzymatique choisie parmi les suivantes : béta-glucanase, cellulase, xylanase et alpha-amylase.
3. Additif selon la revendication 1 ou 2, ladite protéase active étant une protéase fongique.
4. Additif selon l'une des revendications 1 à 3, ledit additif comprenant en outre au moins un oligosaccharide ou un polyoside.
5. Additif selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit oligosaccharide ou polyoside est choisi parmi : le chitosan, les oligosides de chitosan et la chitine glucane.
6. Additif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une mannoprotéine et/ou un fragment d'invertase, ladite mannoprotéine étant de préférence la protéine MP32.
7. Procédé pour augmenter la stabilité protéique à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, dans une boisson à base de moût végétal, ledit procédé étant dépourvu de toute étape de chauffage de ladite boisson et comprenant une étape d'ajout à ladite boisson d'un additif comprenant une protéase active, l'additif étant caractérisé en ce qu'en sa présence, le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit additif comprend au moins une protéase active qui n'est pas une protéase à cystéine, et présente en outre une activité invertase.
9. Utilisation pour augmenter la stabilité protéique, dans une boisson à base de moût végétal, à la chaleur, aux variations de température et/ou au vieillissement, d'un additif comprenant une protéase active, l'additif étant caractérisé en ce qu'en sa présence, le profil protéique de ladite boisson n'est pas modifié.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit additif comprend au moins une protéase active qui n'est pas une protéase à cystéine, et présente en outre une activité invertase.
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