WO2021153365A1 - 膵島含有カプセルの製造方法 - Google Patents

膵島含有カプセルの製造方法 Download PDF

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西村　益浩
菜穂 飯塚
浩史 田村
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株式会社大塚製薬工場
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Definitions

  • Islet transplantation is a treatment method for diabetes that has a relatively low burden on the human body, but strong immunosuppression may be required for the transplanted islets to survive for a long period of time.
  • a method of transplanting a large number of microencapsulated islets into the abdominal cavity has been investigated. In this case, immunosuppression is unnecessary, but sufficient therapeutic results have not yet been obtained.
  • One issue is to provide an improved method for producing islet-containing capsules.
  • Item 1 A step of preparing a sodium alginate solution A containing pancreatic islets at a concentration of 10,000 IEQ / mL or more.
  • B A step of dropping the sodium alginate solution into a divalent cation solution and recovering the gelled particles.
  • C A step of adding the particles recovered in the step (b) to the poly L-ornithine solution A, stirring the mixture, and then recovering the particles.
  • D The particles recovered in step (c) are added to the sodium alginate solution B, and after stirring, the particles are recovered, and the particles recovered in step (e) (d) are added to the sodium citrate solution.
  • a method for producing a pancreatic islet-containing capsule which comprises a step of collecting particles after stirring.
  • Item 2. Item 2. The method according to Item 1, wherein the islets are islets obtained from young pigs 1 to 3 weeks old.
  • Item 3. Item 2. The method according to Item 1 or 2, wherein the islet-containing capsule has an average diameter of 550 to 750 ⁇ m.
  • Item 4. Item 6. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the sodium alginate concentration of the sodium alginate solution A is 1 w / v% or more and 3 w / v% or less.
  • Item 5. Item 6.
  • Encapsulated islets with improved glucose responsiveness are provided.
  • the micrographs of the islets immediately after encapsulation and the islets cultured 25 days after encapsulation are shown.
  • a to d are immediately after encapsulation
  • e to h are after culturing for 25 days.
  • a and e were prepared using 8,000 IEQ / mL islets
  • b and f were prepared using 12,000 IEQ / mL islets
  • c and g were prepared using 16,000 IEQ / mL. It was prepared using islets
  • d and h were prepared using 20,000 IEQ / mL islets.
  • the results of measuring the sugar responsiveness of pancreatic islets cultured 25 days after encapsulation are shown.
  • the sugar responsiveness measured for islets cultured 25 days after encapsulation is shown as Stimulation Index (SI).
  • SI Stimulation Index
  • the results of measuring the glucose responsiveness of capsules containing islets of different sizes are shown.
  • the results of SI measurement for arelet-containing capsules of different sizes are shown.
  • the method for producing islet-containing capsules preferably includes the following steps (a) to (e): (A) A step of preparing a sodium alginate solution A containing pancreatic islets at a concentration of 10,000 IEQ / mL or more; (B) A step of dropping the sodium alginate solution into a divalent cation solution and recovering the gelled particles; (C) A step of adding the particles recovered in the step (b) to the poly L-ornithine solution A, stirring the mixture, and then recovering the particles; (D) The step of adding the particles recovered in the step (c) to the sodium alginate solution B, stirring and then recovering; and (e) adding the particles recovered in the step (d) to the sodium citrate solution and stirring. , The process of collecting.
  • the islets used in step (a) preferably contain insulin-producing ⁇ -cells, glucagon-containing ⁇ -cells, somatostatin-secreting delta cells, and pancreatic polypeptide-containing cells (PP cells). It is preferred that the islets are mostly insulin-producing ⁇ -cells.
  • the origin of the islets is not particularly limited, but is preferably human, pig, mouse, rat, monkey, or dog.
  • the islets are preferably derived from pigs, preferably arelets of juvenile pigs (eg, 3 days to 4 weeks old or 7 days to 3 weeks old).
  • Pancreatic islets can be obtained by optionally adopting methods known in the art. For example, a method using Liberase as a digestive enzyme (TJ Cavanagh et al. Transplantation Proceedings, 30, 367 (1998)) can be preferably used.
  • the size of the islets is preferably 50 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less.
  • the size of the islets can be measured using a microscope micrometer. It is preferable that the islets contain 10% or more of ⁇ cells as a characteristic. There is no particular upper limit on the proportion of ⁇ cells, but it is, for example, 80%.
  • the physical characteristics of sodium alginate constituting the sodium alginate solution A are not particularly limited.
  • the sodium alginate concentration of the sodium alginate solution A is not particularly limited, but is preferably 1 w / v% or more and 3 w / v% or less, for example.
  • the sodium alginate solution A contains islets at a concentration of 10,000 IEQ / mL or more from the viewpoint of improving the glucose responsiveness of the islets after encapsulation.
  • the IEQ means the number of islets based on a diameter of 150 ⁇ m.
  • the islet concentration is preferably 11,000 IEQ / mL or higher, or 12,000 IEQ / mL or higher.
  • the upper limit of the islet concentration is not particularly limited, but can be, for example, 30,000 IEQ / mL or less and 25,000 IEQ / mL or less.
  • sodium alginate solution A is prepared so as to contain the pancreatic islets at the above concentration
  • the specific preparation method thereof is not limited.
  • sodium alginate solution A can be obtained by dissolving an appropriate amount of sodium alginate in physiological saline, adding an appropriate amount of pancreatic islets to the solution, and stirring as necessary.
  • the divalent cation solution used in step (b) is not limited as long as gelled particles (capsules) containing pancreatic islets can be obtained by dropping the sodium alginate solution A therein.
  • the divalent cation constituting such a divalent cation solution include salts that liberate divalent metal ions in the aqueous solution (for example, calcium chloride, calcium lactate, barium chloride, strontium chloride, etc.). ..
  • the preferred salt is calcium chloride and the preferred divalent cation solution is calcium chloride solution.
  • the concentration of the divalent cation in the divalent cation solution is not particularly limited and can be set in the range of, for example, 50 to 500 mM.
  • the method of dropping the sodium alginate solution A into the divalent cation solution is not limited as long as the gelled particles containing the islets are obtained. In one embodiment, it is preferable to drop the sodium alginate solution A into the divalent cation solution through a needle of an appropriate size.
  • Recovery of the gelled particles is optional, and can be carried out, for example, by allowing the divalent cation solution in which the gelled particles are formed to stand for a certain period of time, removing the supernatant, or repeating this.
  • the poly-L-ornithine solution A used in the step (c) is not particularly limited as long as it can coat the gelled particles formed in the step (b).
  • it can be prepared by dissolving poly-L-ornithine in physiological saline.
  • the concentration of poly L-ornithine in the poly L-ornithine solution A is not particularly limited, but can be adjusted to, for example, 0.05 w / v% or more and 3.0 w / v% or less. In one embodiment, the concentration of poly-L-ornithine in the poly-L-ornithine solution A is preferably 0.1 w / v% or more and 2.0 w / v% or less.
  • the “addition of the particles recovered in the step (b) to the poly L-ornithine solution A” in the step (c) also includes an embodiment in which the poly L-ornithine solution A is added to the gelled particles recovered in the step (b). do.
  • the stirring speed and time in the step (c) are arbitrary, and for example, 1 minute to 20 minutes at 20 to 300 rpm is preferable.
  • the mode of recovery of the gelled particles in the step (c) is arbitrary.
  • the gelled particles can be recovered by allowing the poly L-ornithine solution A to stand for a certain period of time and removing the supernatant.
  • the recovered gelled particles preferably have a structure in which the surface of the gelled layer with alginic acid is coated with poly-L-ornithine.
  • the sodium alginate solution B used in the step (d) may have the same concentration as or different from the sodium alginate solution A used in the step (a).
  • the sodium alginate concentration of the sodium alginate solution B is preferably lower than the sodium alginate concentration of the sodium alginate solution A from the viewpoint of ease of coating operation.
  • the sodium alginate concentration of the sodium alginate solution B is 0.1 w / v% or more and 0.3 w / v% or less. Is preferable.
  • the "addition of the particles recovered in the step (c) to the sodium alginate solution B" in the step (d) also includes an embodiment in which the sodium alginate solution B is added to the gelled particles recovered in the step (c).
  • the stirring speed and time in the step (d) are arbitrary, and for example, stirring at 20 to 300 rpm for 1 minute to 15 minutes is preferable.
  • the mode of recovery of the gelled particles in the step (d) is arbitrary.
  • the gelled particles can be recovered by allowing the sodium alginate solution B to stand for a certain period of time and removing the supernatant. It is preferable that the surface of the gelled layer made of alginic acid is coated with polyL-ornithine, and the recovered gelled particles further have a gelled layer made of alginic acid on the surface.
  • the particles recovered in step (c) are added to poly L-ornithine solution B before being added to sodium alginate solution B, and after stirring, the particles are recovered and used in step (d). It is preferably added to the sodium alginate solution B.
  • the poly L-ornithine solution B may have the same concentration or different from that of the poly L-ornithine solution A.
  • the polyL-ornithine concentration of the polyL-ornithine solution B is preferably lower than the polyL-ornithine concentration of the polyL-ornithine solution A.
  • the polyL-ornithine concentration of the polyL-ornithine solution B is preferably 0.01 w / v% or more and less than 0.1 w / v%.
  • the sodium citrate solution used in the step (e) preferably contains sodium citrate at a concentration of 0.5 to 3 w / v%.
  • a sodium citrate solution is added for the purpose of chelating the cations in the gelled particles and bringing them closer to liquid from the gel to promote insulin release.
  • the "addition of the particles recovered in the step (d) to the sodium citrate solution" in the step (e) also includes an embodiment in which the sodium citrate solution is added to the gelled particles recovered in the step (d).
  • the stirring speed and time in the step (e) are arbitrary, and are preferably, for example, 1 minute to 15 minutes at 20 to 300 rpm.
  • the mode of collecting the gelled particles in the step (e) is arbitrary.
  • the gelled particles can be recovered by allowing the sodium citrate solution to stand for a certain period of time and removing the supernatant. It is considered that the recovered gelled particles are closer to liquid inside.
  • the gelled particles (capsules containing islets) recovered in the step (e) preferably have an average diameter of 2000 ⁇ m or less, preferably 1500 ⁇ m or less or 1000 ⁇ m, from the viewpoint of exhibiting good sugar responsiveness. The following is more preferable.
  • the lower limit of the size of the islet-containing capsule is not particularly limited, but is, for example, 100 ⁇ m or more, 200 ⁇ m or more, 300 ⁇ m or more, 400 ⁇ m or more, or 500 ⁇ m or more.
  • the average diameter is a value obtained by measuring the size of 20 to 50 islet-containing capsules with a micrometer of a microscope and calculating the average value.
  • the beads were collected, further added to 0.038 w / v% PLO solution, stirred for 6 minutes and recovered, added to 0.17 w / v% sodium alginate solution and stirred for 6 minutes, and finally 1.6%. It was added to a sodium citrate solution and stirred for 2 minutes to obtain encapsulated pancreatic islets.
  • the resulting encapsulated islets were cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 25 days.
  • encapsulated islets Immediately after encapsulation and 25 days after culturing, a small amount of encapsulated islets was taken from the flask and transferred to a 35 mm dish. The dish was observed with an inverted microscope (4 magnification), and the encapsulated islets were photographed (Fig. 1).
  • a to d in FIG. 1 are immediately after encapsulation, and e to h are 25 days after culturing.
  • a and e were prepared using 8,000 IEQ / mL islets
  • b and f were prepared using 12,000 IEQ / mL islets
  • c and g were prepared using 16,000 IEQ / mL. It was prepared using islets, and d and h were prepared using 20,000 IEQ / mL islets.
  • the average capsule diameter was about 600 ⁇ m.
  • Each encapsulated islet 500IEQ after culturing in RPMI 1640 medium supplemented with 2% porcine serum, 10 mM nicotinamide, and antibiotics for 25 days after encapsulation was 74 ⁇ m Netwell Insert (Corning). Made). After washing, the insert containing the islets was allowed to stand in a 500 mg / L low glucose medium for 1 hour, after which the medium was collected. Subsequently, the insert containing the encapsulated islets was allowed to stand in 3750 mg / L high glucose medium for 1 hour, and then the medium was collected. The insulin concentration in the recovered medium was measured using the ELISA method (Fig. 2).
  • the ratio of insulin concentration in high glucose medium to insulin concentration in low glucose medium was calculated as Stimulation Index (SI) (FIG. 3). As shown in FIG. 2, it was found that capsules made with higher concentrations of islets showed higher glucose responsiveness than capsules made with 8,000 IEQ / mL islets.
  • An encapsulated islet having a diameter of about 500 to 1800 ⁇ m was prepared by adjusting the air flow rate in the same procedure as in the above.
  • a 3000 ⁇ m encapsulated islet was prepared by connecting an outer cylinder of 18 G surflow to a syringe and dropping it.
  • Pancreatic islet-containing capsules were prepared using a suspension containing 16,000 IEQ / mL islets derived from immature pigs.
  • FIGS. 4 and 5 The results of evaluating the glucose responsiveness of the obtained islet-containing capsules in the same manner as in 2 above are shown in FIGS. 4 and 5. From these results, it was found that a capsule diameter of 2000 ⁇ m or less, 1800 ⁇ m or less, and 1500 ⁇ m or less is preferable for sugar responsiveness.

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Abstract

改良された膵島含有カプセルの製造方法を提供すること。 （ａ）膵島を１０，０００ＩＥＱ／ｍＬ以上の濃度で含有するアルギン酸ナトリウム溶液Ａを調製する工程、 （ｂ）該アルギン酸ナトリウム溶液を二価カチオン溶液 に滴下し、ゲル化した粒子を回収する工程、 （ｃ）工程（ｂ）で回収した粒子をポリＬ－オルニチン溶液Ａに添加し、撹拌後、粒子を回収する工程、 （ｄ）工程（ｃ）で回収した粒子をアルギン酸ナトリウム溶液Ｂに添加し、撹拌後、粒子を回収する工程、及び （ｅ）工程（ｄ）で回収した粒子をクエン酸ナトリウム溶液 に添加し、撹拌後、粒子を回収する工程 を含む、膵島含有カプセルの製造方法。

Description

膵島含有カプセルの製造方法
　カプセル化膵島に関する技術が開示される。
　膵島移植は人体への負荷が比較的少ない糖尿病の治療手段であるが、移植された膵島が長期生着するためには強力な免疫抑制が必要な場合がある。微小なマイクロカプセル化膵島を多数腹腔内へ移植する方法が検討されており、この場合、免疫抑制は不要であるが、未だ十分な治療成績は得られていない。
WO2001/052871
METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 137, 575-580, 1988 TRANSPLANTATION, Vol. 53, 1180-1183, No. 6, June 1992 Bioartificial Pancreas, Vol., 98, No. 6, 1996, 1417-1422 Drug Delivery System, Vol., 12, No. 2, 1997 JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH B: APPLIED BIOMATERIALS, 2013 VOL., 101B, ISSUE 2, 258-268
　改良された膵島含有カプセルの製造方法を提供することが一つの課題である。
　斯かる課題の解決手段として下記を包含する発明が提供される。
項１．
（ａ）膵島を１０，０００ＩＥＱ／ｍＬ以上の濃度で含有するアルギン酸ナトリウム溶液Ａを調製する工程、
（ｂ）該アルギン酸ナトリウム溶液を二価カチオン溶液に滴下し、ゲル化した粒子を回収する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で回収した粒子をポリＬ－オルニチン溶液Ａに添加し、撹拌後、粒子を回収する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で回収した粒子をアルギン酸ナトリウム溶液Ｂに添加し、撹拌後、粒子を回収する工程、及び
（ｅ）工程（ｄ）で回収した粒子をクエン酸ナトリウム溶液に添加し、撹拌後、粒子を回収する工程
を含む、膵島含有カプセルの製造方法。
項２．
膵島が、生後１～３週齢の幼若ブタから取得した膵島である、項１に記載の方法。
項３．
膵島含有カプセルの平均直径が５５０～７５０μｍである、項１又は２に記載の方法。
項４．
アルギン酸ナトリウム溶液Ａのアルギン酸ナトリウム濃度が１ｗ／ｖ％以上３ｗ／ｖ％以下である、項１～３のいずれかに記載の方法。
項５．
ポリＬ－オルニチン溶液ＡのポリＬ－オルニチン濃度が０．０５ｗ／ｖ％以上３ｗ／ｖ％以下である、項１～４のいずれかに記載の方法。
項６．
アルギン酸ナトリウム溶液Ｂのアルギン酸ナトリウム濃度が０．１ｗ／ｖ％以上０．３ｗ／ｖ％以下である、項１～５のいずれかに記載の方法。
項７．
工程（ｄ）において、工程（ｃ）で回収した粒子を、ポリＬ－オルニチン溶液Ｂに添加し、撹拌後、回収した後に、アルギン酸ナトリウム溶液Ｂに添加する、項１～６のいずれかに記載の方法。
項８．
ポリＬ－オルニチン溶液ＢのポリＬ－オルニチン濃度が０．０１ｗ／ｖ％以上０．１ｗ／ｖ％未満である、項７に記載の方法。
　糖応答性が改善されたカプセル化膵島が提供される。
カプセル化直後の膵島及びカプセル化後２５日培養した膵島の顕微鏡写真を示す。ａ～ｄはカプセル化直後であり、ｅ～ｈは２５日間培養後である。ａ及びｅは８，０００ＩＥＱ／ｍＬの膵島を用いて作製したものであり、ｂ及びｆは１２，０００ＩＥＱ／ｍＬの膵島を用いて作製したものであり、ｃ及びｇは１６，０００ＩＥＱ／ｍＬの膵島を用いて作製したものであり、ｄ及びｈは２０，０００ＩＥＱ／ｍＬの膵島を用いて作製したものである。 カプセル化後２５日培養した膵島の糖応答性を測定した結果を示す。 カプセル化後２５日培養した膵島について測定した糖応答性をＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ（ＳＩ）として示す。 サイズの異なる膵島含有カプセルについて糖応答性を測定した結果を示す。 サイズの異なる膵島含有カプセルについてＳＩを測定した結果を示す。
　膵島含有カプセルの製造方法は、下記の工程（ａ）～（ｅ）を含むことが好ましい：
（ａ）膵島を１０，０００ＩＥＱ／ｍＬ以上の濃度で含有するアルギン酸ナトリウム溶液Ａを調製する工程；
（ｂ）該アルギン酸ナトリウム溶液を二価カチオン溶液に滴下し、ゲル化した粒子を回収する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で回収した粒子をポリＬ－オルニチン溶液Ａに添加し、撹拌後、粒子を回収する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で回収した粒子をアルギン酸ナトリウム溶液Ｂに添加し、撹拌後、回収する工程；及び
（ｅ）工程（ｄ）で回収した粒子をクエン酸ナトリウム溶液に添加し、拌後、回収する工程。
　工程（ａ）で使用する膵島は、インスリン産生β細胞、グルカゴン含有α細胞、ソマトスタチン分泌デルタ細胞、及び膵臓ポリペプチド含有細胞（ＰＰ細胞）を含むことが好ましい。膵島は、その大部分がインスリン産生β細胞であることが好ましい。
　膵島の由来は、特に制限されないが、ヒト、ブタ、マウス、ラット、サル、又はイヌであることが好ましい。一実施形態において、膵島は、ブタ由来であることが好ましく、幼若ブタ（例えば、生後３日～４週間又は生後７日～３週間）の膵島であることが好ましい。膵島は、当該技術分野において知られている方法を任意に採用することにより得ることができる。例えば、消化酵素にＬｉｂｅｒａｓｅを用いる方法（Ｔ．Ｊ．Ｃａｖａｎａｇｈ　ｅｔ　ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３０，３６７（１９９８））を好ましく用いることができる。
　膵島のサイズは、５０μｍ以上４００μｍ以下であることが好ましい。膵島のサイズは、顕微鏡のマイクロメーターを用いて測定することができる。膵島は、β細胞を１０％以上含んでいることが特性として好ましい。β細胞の割合の上限は特にないが、例えば、８０％である。
　アルギン酸ナトリウム溶液Ａを構成するアルギン酸ナトリウムの物性は、特に限定されない。
　アルギン酸ナトリウム溶液Ａのアルギン酸ナトリウム濃度は、特に制限されないが、例えば、１ｗ／ｖ％以上３ｗ／ｖ％以下であることが好ましい。
　アルギン酸ナトリウム溶液Ａは、膵島を１０，０００ＩＥＱ／ｍＬ以上の濃度で含有することが、カプセル化後の膵島の糖応答性を良好にするという観点で好ましい。ここで、ＩＥＱとは、直径１５０μｍを基準とした膵島の数を意味する。膵島濃度は、１１，０００ＩＥＱ／ｍＬ以上、又は１２，０００ＩＥＱ／ｍＬ以上であることが好ましい。膵島濃度の上限は特に制限ないが、例えば、３０，０００ＩＥＱ／ｍＬ以下、２５，０００ＩＥＱ／ｍＬ以下とすることができる。
　アルギン酸ナトリウム溶液Ａは、膵島を上記のような濃度で含有するように調製される限り、その具体的な調製方法は制限されない。例えば、生理食塩水に適量のアルギン酸ナトリウムを溶解し、そこに適量に膵島を添加し、必要に応じて撹拌することにより、アルギン酸ナトリウム溶液Ａを得ることができる。
　工程（ｂ）で使用する二価カチオン溶液は、そこにアルギン酸ナトリウム溶液Ａを滴下することにより、膵島を包含したゲル化粒子（カプセル）が得られる限り制限されない。このような二価カチオン溶液を構成する二価カチオンとしては、水溶液中で二価の金属イオンを遊離する塩（例えば、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、塩化バリウム、及び塩化ストロンチウム等）を挙げることができる。一実施形態において、好ましい塩は塩化カルシウムであり、好ましい二価カチオン溶液は塩化カルシウム溶液である。
　二価カチオン溶液の二価カチオンの濃度は、特に制限されず、例えば、５０～５００ｍＭの範囲で設定することができる。
　二価カチオン溶液へのアルギン酸ナトリウム溶液Ａの滴下様式は、膵島を包含するゲル化粒子が得られる限り制限されない。一実施形態において、二価カチオン溶液に、アルギン酸ナトリウム溶液Ａを適当な大きさのニードルを通して滴下することが好ましい。
　ゲル化粒子の回収は、任意であり、例えば、ゲル化粒子が形成された二価カチオン溶液を一定時間静置させ、上清を除去すること又はこれを繰り返すことにより、実施することができる。
　工程（ｃ）で使用されるポリＬ－オルニチン溶液Ａは、工程（ｂ）で形成されたゲル化粒子をコーティングすることができるものであれば特に制限されない。例えば、ポリＬ－オルニチンを生理食塩水に溶解することで調製することができる。
　ポリＬ－オルニチン溶液ＡにおけるポリＬ－オルニチンの濃度は特に制限されないが、例えば、０．０５ｗ／ｖ％以上３．０ｗ／ｖ％以下に調製することができる。一実施形態において、ポリＬ－オルニチン溶液ＡにおけるポリＬ－オルニチンの濃度は０．１ｗ／ｖ％以上２．０ｗ／ｖ％以下であることが好ましい。
　工程（ｃ）の「工程（ｂ）で回収した粒子をポリＬ－オルニチン溶液Ａに添加」とは、工程（ｂ）で回収したゲル化粒子にポリＬ－オルニチン溶液Ａを添加する態様も包含する。工程（ｃ）における撹拌の速度及び時間は任意であり、例えば、２０～３００ｒｐｍで１分間～２０分間が好ましい。
　工程（ｃ）におけるゲル化粒子の回収の様式は任意であり、例えば、ポリＬ－オルニチン溶液Ａを一定時間静置させ、上清を除去することでゲル化粒子を回収できる。回収されたゲル化粒子は、アルギン酸によるゲル化層の表面がポリＬ－オルニチンでコーティングされた構造を有することが好ましい。
　工程（ｄ）で使用するアルギン酸ナトリウム溶液Ｂは、工程（ａ）で使用するアルギン酸ナトリウム溶液Ａと同一濃度であっても異なっていてもよい。一実施形態において、アルギン酸ナトリウム溶液Ｂのアルギン酸ナトリウム濃度は、コーティング操作の容易性という観点でアルギン酸ナトリウム溶液Ａのアルギン酸ナトリウム濃度よりも低いことが好ましい。例えば、アルギン酸ナトリウム溶液Ａのアルギン酸ナトリウム濃度が１ｗ／ｖ％以上３ｗ／ｖ％以下である場合、アルギン酸ナトリウム溶液Ｂのアルギン酸ナトリウム濃度は０．１ｗ／ｖ％以上０．３ｗ／ｖ％以下であることが好ましい。
　工程（ｄ）の「工程（ｃ）で回収した粒子をアルギン酸ナトリウム溶液Ｂに添加」とは、工程（ｃ）で回収したゲル化粒子にアルギン酸ナトリウム溶液Ｂを添加する態様も包含する。工程（ｄ）における撹拌の速度及び時間は任意であり、例えば、２０～３００ｒｐｍで１分間～１５分間撹拌することが好ましい。
　工程（ｄ）におけるゲル化粒子の回収の様式は任意であり、例えば、アルギン酸ナトリウム溶液Ｂを一定時間静置させ、上清を除去することでゲル化粒子を回収できる。回収されたゲル化粒子は、アルギン酸によるゲル化層の表面がポリＬ－オルニチンでコーティングされ、更にその上にアルギン酸によるゲル化層を有することが好ましい。
　一実施形態において、工程（ｃ）で回収した粒子を、アルギン酸ナトリウム溶液Ｂに添加する前に、ポリＬ－オルニチン溶液Ｂに添加し、撹拌後、粒子を回収し、それを工程（ｄ）のアルギン酸ナトリウム溶液Ｂに添加することが好ましい。ここで、ポリＬ－オルニチン溶液Ｂは、ポリＬ－オルニチン溶液Ａと同一濃度又は異なってよい。一実施形態において、ポリＬ－オルニチン溶液ＢのポリＬ－オルニチン濃度は、ポリＬ－オルニチン溶液ＡのポリＬ－オルニチン濃度よりも低いことが好ましい。例えば、ポリＬ－オルニチン溶液ＢのポリＬ－オルニチン濃度は０．０１ｗ／ｖ％以上０．１ｗ／ｖ％未満であることが好ましい。
　工程（ｅ）で使用するクエン酸ナトリウム溶液は、０．５～３ｗ／ｖ％の濃度でクエン酸ナトリウムを含有することが好ましい。ゲル化粒子内のカチオンをキレートし、ゲルから液状に近づけることでインスリン放出を促す目的でクエン酸ナトリウム溶液を添加する。
　工程（ｅ）の「工程（ｄ）で回収した粒子をクエン酸ナトリウム溶液に添加」とは、工程（ｄ）で回収したゲル化粒子にクエン酸ナトリウム溶液を添加する態様も包含する。工程（ｅ）における撹拌の速度及び時間は任意であり、例えば、２０～３００ｒｐｍで１分間～１５分間であることが好ましい。
　工程（ｅ）におけるゲル化粒子の回収の様式は任意であり、例えば、クエン酸ナトリウム溶液を一定時間静置させ、上清を除去することでゲル化粒子を回収できる。回収されたゲル化粒子は、内部がより液状に近づいていると考えられる。
　このようにして得られた膵島含有カプセルは、優れた糖応答性を有し、またそれを安定的に保持する。一実施形態において、工程（ｅ）で回収されたゲル化粒子（膵島含有カプセル）は、良好な糖応答性を示すという観点で、その平均直径が２０００μｍ以下であることが好ましく、１５００μｍ以下又は１０００μｍ以下であることがより好ましい。膵島含有カプセルのサイズの下限は特に制限されないが、例えば、１００μｍ以上、２００μｍ以上、３００μｍ以上、４００μｍ以上、又は５００μｍ以上である。平均直径とは、２０～５０個の膵島含有カプセルについてサイズを顕微鏡のマイクロメーターで測定し、その平均値を算出した値である。
　以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
１．カプセル化膵島の作製
　１．７ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウム溶液（Ｐｒｏｎｏｖａ）に生後１４日齢のブタから分離した幼若ブタ由来膵島を８，０００ＩＥＱ／ｍＬ、１２，０００ＩＥＱ／ｍＬ、１６，０００ＩＥＱ／ｍＬ、又は２０，０００ＩＥＱ／ｍＬの濃度で懸濁した。これをニードルに通し、エアフローにより懸濁液をカットしながら１０９ｍＭ塩化カルシウム溶液中に滴下させた。塩化カルシウム溶液から固化したアルギン酸ビーズを回収し、０．０７５ｗ／ｖ％のポリＬ－オルニチン（ＰＬＯ）（分子量５，０００～１５，０００）溶液に添加し、１０分間撹拌した。ビーズを回収し、さらに０．０３８ｗ／ｖ％ＰＬＯ溶液に添加し、６分間撹拌して回収し、０．１７ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウム溶液に添加して６分間撹拌し、最後に１．６％クエン酸ナトリウム溶液に添加して２間分撹拌させてカプセル化膵島を得た。得られたカプセル化膵島を３７℃でＣＯ２インキュベーター中で２５日間培養した。
　カプセル化直後及び培養２５日後にフラスコからカプセル化膵島を少量取り、３５ｍｍディッシュに移した。ディッシュを倒立顕微鏡（４倍率）で観察し、カプセル化膵島を撮影した（図１）。図１のａ～ｄはカプセル化直後であり、ｅ～ｈは培養２５日後である。ａ及びｅは８，０００ＩＥＱ／ｍＬの膵島を用いて作製したものであり、ｂ及びｆは１２，０００ＩＥＱ／ｍＬの膵島を用いて作製したものであり、ｃ及びｇは１６，０００ＩＥＱ／ｍＬの膵島を用いて作製したものであり、ｄ及びｈは２０，０００ＩＥＱ／ｍＬの膵島を用いて作製したものである。カプセル直径は平均で約６００μｍであった。
２．糖応答性評価
　カプセル化してから２５日間、ＲＰＭＩ１６４０培地に２％ブタ血清、１０ ｍＭニコチンアミド、及び抗生物質を添加した培地中で培養した後の各カプセル化膵島５００ＩＥＱを７４μｍネットウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に入れた。洗浄後、膵島の入ったインサートを５００ｍｇ／Ｌ低グルコース培地中で１時間静置させ、その後培地を回収した。続いて、カプセル化膵島の入ったインサートを３７５０ｍｇ／Ｌ高グルコース培地中有で１時間静置させ、その後培地を回収した。回収した培地中のインスリン濃度をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した（図２）。また、低グルコース培地中インスリン濃度に対する高グルコース培地中インスリン濃度比をＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ（ＳＩ）として算出した（図３）。図２に示されるとおり、８，０００ＩＥＱ／ｍＬの膵島で作成したカプセルよりも、より高い濃度の膵島を用いて作成したカプセルの方が、高い糖応答性を示すことが判明した。
３．カプセルサイズと糖応答性
　上記１．と同様の手順で、エアフローの速度を調整することで直径約５００～１８００μｍのカプセル化膵島を作製した。３０００μｍのカプセル化膵島はシリンジに１８Ｇサーフローの外筒を接続して滴下させ作製した。１６，０００ＩＥＱ／ｍＬの幼若ブタ由来膵島を含有する懸濁液を用いて膵島含有カプセルを作製した。
　得られた膵島含有カプセルについて、上記２と同様にして糖応答性を評価した結果を図４及び図５に示す。これらの結果から、カプセルの直径は２０００μ以下、１８００μｍ以下、又１５００μｍ以下が糖応答性に好ましいことが判明した。 

Claims (8)

  1. （ａ）膵島を１０，０００ＩＥＱ／ｍＬ以上の濃度で含有するアルギン酸ナトリウム溶液Ａを調製する工程、
    （ｂ）該アルギン酸ナトリウム溶液を二価カチオン溶液に滴下し、ゲル化した粒子を回収する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）で回収した粒子をポリＬ－オルニチン溶液Ａに添加し、撹拌後、粒子を回収する工程、
    （ｄ）工程（ｃ）で回収した粒子をアルギン酸ナトリウム溶液Ｂに添加し、撹拌後、粒子を回収する工程、及び
    （ｅ）工程（ｄ）で回収した粒子をクエン酸ナトリウム溶液に添加し、撹拌後、粒子を回収する工程
    を含む、膵島含有カプセルの製造方法。
  2. 膵島が、生後１～３週齢の幼若ブタから取得した膵島である、請求項１に記載の方法。
  3. 膵島含有カプセルの平均直径が５５０～７５０μｍである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. アルギン酸ナトリウム溶液Ａのアルギン酸ナトリウム濃度が１ｗ／ｖ％以上３ｗ／ｖ％以下である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. ポリＬ－オルニチン溶液ＡのポリＬ－オルニチン濃度が０．０５ｗ／ｖ％以上３ｗ／ｖ％以下である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. アルギン酸ナトリウム溶液Ｂのアルギン酸ナトリウム濃度が０．１ｗ／ｖ％以上０．３ｗ／ｖ％以下である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 工程（ｄ）において、工程（ｃ）で回収した粒子を、ポリＬ－オルニチン溶液Ｂに添加し、撹拌後、回収した後に、アルギン酸ナトリウム溶液Ｂに添加する、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. ポリＬ－オルニチン溶液ＢのポリＬ－オルニチン濃度が０．０１ｗ／ｖ％以上０．１ｗ／ｖ％未満である、請求項７に記載の方法。
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