WO2021145552A1 - 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 지속형 결합체의 폐질환의 치료 용도 - Google Patents

글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 지속형 결합체의 폐질환의 치료 용도 Download PDF

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이상현
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조효상
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Definitions

  • the present invention relates to the prophylactic or therapeutic use of a triple activator and/or a conjugate thereof having activity on both glucagon, GLP-1 and GIP receptors for lung disease.
  • the lung is an organ mainly responsible for respiration, and lung diseases occur due to harmful substances, viruses, immune abnormalities, and the like. Since lung disease causes decreased lung function and respiratory discomfort, appropriate treatment is required according to the cause of the disease.
  • Lung-related diseases include interstitial lung disease, progressive fibrotic interstitial lung disease, idiopathic interstitial pneumonia, non-specific interstitial pneumonia, pulmonary fibrosis, interstitial pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, alveolitis, pneumonia, emphysema, bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), complex pulmonary fibrosis and emphysema (CPFE), asthma, and respiratory infections (eg, coronavirus infection (COVID-19)).
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • COVID-19 complex pulmonary fibrosis and emphysema
  • COVID-19 coronavirus infection
  • inflammatory cytokines eg, IL-1, IL-6, TNF- ⁇
  • alveolar macrophages e.g. IL-1, IL-6, TNF- ⁇
  • protease eg, elastase
  • Inflammation and fibrosis of the lungs precede the progression of many lung diseases, so they can be said to be fundamental mechanisms in the prevention and treatment of lung diseases.
  • Pulmonary fibrosis is a representative example of lung disease, and fibrosis is a disease in which excessive fibrous connective tissue is formed in an organ or tissue. Fibrosis refers to a state in which normal control is impossible during the wound healing process after tissue is damaged by various stresses (infection, chemical stimulation, radiation, etc.) in the human body. Fibrosis occurs in various organs such as the lungs, heart, and liver, and is one of the fields with high unmet demand as no fundamental treatment has yet been developed.
  • Idiopathic pulmonary fibrosis one of pulmonary fibrosis of unknown cause, is a chronic disease of fibrotic interstitial pneumonia of unknown etiology, in which fibrosis progresses due to continuous damage to alveolar epithelial cells.
  • Treatment methods according to the administration of pirfenidone and nintedanib have been studied, but side effects such as decreased appetite, weakness, digestive side effects, hepatotoxicity potential, and photosensitivity rash are known.
  • chronic obstructive pulmonary disease is a disease in which airway obstruction occurs gradually as the airway narrows due to an abnormal inflammatory response of the lungs by tobacco, air pollution, or toxic inhalation substances. It is broadly divided into chronic bronchitis and emphysema. In particular, smoking is known to be the main cause of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking acts as a strong irritant in the lung tissue, increasing the production of various pro-inflammatory factors, growth factors, oxidizing substances and chemotactic factors, and activating the inflammatory signaling system, leading to migration of many inflammatory cells including neutrophils and macrophages.
  • lung inflammation further aggravates lung inflammation, which in turn causes abnormal changes in lung tissue, such as airway wall thickening, lung fibrosis, and lowers lung function. Accordingly, improvement of lung inflammation is understood as a treatment method for the prevention and treatment of chronic obstructive pulmonary disease.
  • lung disease is lung damage caused by a new coronavirus (2019-nCoV or SARS-CoV-2) infection and acute respiratory disease (COVID-19).
  • the lung is known as the main vulnerable organ because the novel coronavirus, transmitted through the respiratory tract, penetrates into the cell through ACE2 and TMPRSS2, which are mainly expressed in type II alveolar epithelial cells.
  • the main symptoms include fever and cough, and healthy adults are more likely to recover over time.
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • drugs that suppress infection and proliferation of viruses or control lung inflammation are mainly used for COVID-19 treatment. Accordingly, improvement of lung inflammation and fibrosis is understood as a treatment method for the prevention and treatment of COVID-19.
  • lung inflammation and fibrosis are major causes of the onset and development of lung diseases
  • improvement of lung inflammation and fibrosis has been studied as a therapeutic mechanism for various lung diseases.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • GIP glycose-dependent insuliontropic polypeptide
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of pulmonary disease, comprising a peptide having activity against glucagon receptors, GLP-1 receptors and GIP receptors, or a long-acting conjugate of these peptides.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating lung disease, comprising administering to an individual in need thereof a composition comprising the peptide or a long-acting conjugate of the peptide.
  • Another object of the present invention is to provide the use of a composition comprising the peptide or a long-acting conjugate of the peptide in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of lung disease.
  • One aspect embodying the present invention is a glucagon receptor, GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) receptor, and GIP (Glucose-dependent insulinotropic polypeptide) receptors for the prevention or treatment of lung diseases comprising a peptide having activity.
  • GLP-1 Glucagon-like peptide-1
  • GIP Glucose-dependent insulinotropic polypeptide
  • the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of the lung disease comprises a pharmaceutically effective amount of a pharmaceutically acceptable excipient and a peptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 102. characterized.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the peptide is in the form of a long-acting conjugate, and the long-acting conjugate is characterized in that it is represented by the following formula (1):
  • X is a peptide of any one of SEQ ID NOs: 1 to 102;
  • L is a linker containing an ethylene glycol repeating unit
  • F is an immunoglobulin Fc region
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the peptide is amidated at its C-terminus.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the peptide is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21, 22, 42, 43, 50, 64, 66, 67, 70, 71, 76, 77, 96, 97 and 100 It is characterized in that it contains amino acids.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the peptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21, 22, 42, 43, 50, 77 and 96.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the peptide sequence is characterized in that amino acids 16 and 20 from the N-terminus form a ring with each other.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein F is an IgG Fc region.
  • the lung disease is interstitial lung disease (ILD), progressive fibrosing interstitial lung disease (PF-ILD), idiopathic interstitial pneumonia ( idiopathic interstitial pneumonias (IIP), non-specific interstitial pneumonia (NSIP), pulmonary fibrosis, fibrosing interstitial lung diseases (FILD), idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), alveolitis, pneumonia, emphysema, bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease, combined pulmonary fibrosis and emphysema (CPFE), It is characterized in that it is asthma, or a respiratory infection.
  • IIP interstitial interstitial pneumonias
  • NSIP non-specific interstitial pneumonia
  • FILD fibrosing interstitial lung diseases
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • alveolitis pneumonia
  • emphysema bronchitis
  • chronic obstructive pulmonary disease combined
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the respiratory infectious disease is a respiratory viral, bacterial, mycoplasma, or fungal infection.
  • composition according to any one of the preceding embodiments wherein the respiratory virus is adenovirus, vaccinia virus, herpes simplex virus, parainfluenza virus, rhinovirus ), varicella Zoster Virus, measle virus, respiratorysyncytial virus, Dengue virus, HIV (human immunodeficiency virus), influenza virus, coronavirus, severe It is characterized in that it is any one selected from the group consisting of severe acute respiratory syndrome associated virus (SARS-associated virus), and middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV).
  • SARS-associated virus severe acute respiratory syndrome associated virus
  • MERS-CoV middle east respiratory syndrome coronavirus
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the coronavirus is SARS-CoV-2.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein, upon administration, the pharmaceutical composition (i) inhibits macrophage activity, and/or (ii) IL-1 ⁇ , IL-6, IL-12, or TNF- It is characterized by reducing the expression of ⁇ .
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the pharmaceutical composition has at least one of the following properties upon administration:
  • EMT epithelial mesenchymal transition
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the pharmaceutical composition is characterized in that mucolytic agents or pharmaceutically acceptable salts thereof are additionally administered.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the mucolytic agent is ambroxol, N-acetylcysteine, N-acetylin, carbocysteine, sea bream. domiodol, fudosteine, bromhexine, erdosteine, letostine, lysozyme, mesna, sobrerol, stefronin (stepronin), thiopronin, tyloxapol, carbocisteine, dornase alfa, eprazinone, letosteine, neltenexine, and at least one selected from the group consisting of mecysteine.
  • the mucolytic agent is ambroxol, N-acetylcysteine, N-acetylin, carbocysteine, sea bream. domiodol, fudosteine, bromhexine, erdosteine, letostine,
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the peptide and the mucolytic agent or a pharmaceutically acceptable salt thereof are administered simultaneously, sequentially, or in reverse order.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the lung disease may be characterized in that the lung inflammation and fibrosis caused by coronavirus infection-19 (COVID-19).
  • COVID-19 coronavirus infection-19
  • composition according to any one of the preceding embodiments wherein the region F is a dimer consisting of two polypeptide chains, and one end of L is linked to only one of the two polypeptide chains.
  • Another aspect embodying the present invention is a method for preventing or treating lung disease, comprising administering the peptide or a composition comprising the same to an individual in need thereof.
  • Another aspect embodying the present invention is the use of the peptide or a composition comprising the same in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of lung disease.
  • Another aspect embodying the present invention is the use of the peptide or a composition comprising the same for the prevention or treatment of lung disease.
  • the triple activator or a long-acting conjugate thereof according to the present invention has activity against a glucagon receptor, a GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) receptor, and a GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide) receptor, thereby preventing lung disease Or it may exhibit a therapeutic effect.
  • a glucagon receptor a GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) receptor
  • a GIP glycose-dependent insulinotropic polypeptide
  • FIG. 1 is a view confirming the change in the level of inflammatory cytokine expression in lung tissue according to the triple activator long-acting conjugate treatment in vivo.
  • Figure 3 is a view confirming the change in the expression level of myofibroblast differentiation markers ( ⁇ -SMA, collagen1 ⁇ 1, fibronectin) in lung fibroblasts (lung fibroblast, MRC5 cell) according to the treatment of the triple activator long-acting conjugate.
  • myofibroblast differentiation markers ⁇ -SMA, collagen1 ⁇ 1, fibronectin
  • FIG. 4 is a diagram confirming the change in the expression level of epithelial mesenchymal transition (EMT) markers (collagen1 ⁇ 1, collagen1 ⁇ 3) in alveolar epithelial cells (lung alveolar epithelial cells, A549 cells) according to the treatment of the triple activator long-acting conjugate .
  • EMT epithelial mesenchymal transition
  • FIG. 5 is a diagram confirming in vivo the effect of improving the fibrosis of BLM mouse lung tissue by treatment with the triple activator long-acting conjugate.
  • FIG. 6 is a view confirming the change in the survival rate of BLM mice according to the triple activator long-acting conjugate treatment.
  • One aspect for implementing the present invention is a glucagon receptor, GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) receptor, and GIP (Glucose-dependent insulinotropic polypeptide) having activity on the receptor, including a peptide, of lung disease It is a pharmaceutical composition for prevention or treatment.
  • GLP-1 Glucagon-like peptide-1
  • GIP Glucose-dependent insulinotropic polypeptide
  • the peptide may include the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 102.
  • the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of lung disease is a pharmaceutical comprising a pharmaceutically acceptable excipient and a peptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 102 in a pharmaceutically effective amount It may be an enemy composition.
  • peptide having activity against glucagon receptor, GLP-1 receptor, and GIP receptor may be used interchangeably as the term “triple activator” in the present invention.
  • Such peptides include various substances with significant levels of activity on glucagon, GLP-1, and GIP receptors, such as various peptides.
  • the triple activator having a significant level of activity on the glucagon, GLP-1, and GIP receptors includes one or more receptors of glucagon, GLP-1, and GIP receptors, specifically two or more More specifically, the in vitro activity for all three receptors is about 0.001% or more, about 0.01% or more, compared to the native ligand (natural glucagon, native GLP-1, and native GIP) of the corresponding receptor, about 0.1% or more, about 1% or more, about 2% or more, about 3% or more, about 4% or more, about 5% or more, about 6% or more, about 7% or more, about 8% or more, about 9% or more, About 10% or more, about 20% or more, about 30% or more, about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 100% or more
  • the significantly increased range is included without limitation.
  • the activity of the receptors the in vitro activity against wild-type compared to the receptor at least 0.1%, at least 1%, 2% or more, at least 3%, more than 4%, 5%, 6%, 7% or more, 8% or more, 9% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more, about 200 % or more can be exemplified. However, it is not limited thereto.
  • the term "about” includes all ranges including ⁇ 0.5, ⁇ 0.4, ⁇ 0.3, ⁇ 0.2, ⁇ 0.1, etc., and includes all values in a range equal to or similar to the value following the term about, but not limited
  • the peptide possesses one or more, two or more, specifically three activities of the following i) to iii), specifically, it is characterized in that it possesses a significant activity:
  • activating the receptor means that the in vitro activity of the receptor compared to the native type is about 0.1% or more, about 1% or more, about 2% or more, about 3% or more, about 4% or more, about 5% or more, about 6 % or more, about 7% or more, about 8% or more, about 9% or more, about 10% or more, about 20% or more, about 30% or more, about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70 % or more, about 80% or more, about 90% or more, about 100% or more may be exemplified. However, it is not limited thereto.
  • the peptide may have an increased half-life in the body compared to any one of native GLP-1, native glucagon, and native GIP, but is not particularly limited thereto.
  • the peptide may be non-naturally occurring.
  • the peptide may be an analog of native glucagon, but is not particularly limited thereto.
  • the native glucagon analog includes peptides having one or more differences in amino acid sequence compared to native glucagon, peptides modified through modification of the native glucagon sequence, and mimics of native glucagon.
  • native glucagon may have the following amino acid sequence:
  • the peptide has at least one amino acid in the native glucagon sequence in which a modification selected from the group consisting of substitution, addition, deletion, modification, and combinations thereof has occurred. It may be an analog of glucagon, but is not particularly limited thereto.
  • substitution of amino acids includes both substitutions with amino acids and substitutions with non-natural compounds.
  • additions may be made at the N-terminus and/or C-terminus of the peptide.
  • the length of the amino acid to be added is not particularly limited thereto, and 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more amino acids may be added. and can broadly include the addition of a polypeptide, but is not particularly limited thereto.
  • the peptide is 1, 2, 3, 7, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 in the native glucagon amino acid sequence. times, 20 times, 21 times, 23 times, 24 times, 27 times, 28 times and 29 times, 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 More than, 9 or more, 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, or 20 amino acids may be substituted with other amino acids, and Independently or additionally, 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more amino acids may be added to the C-terminus thereof, It is not particularly limited thereto.
  • the peptide is 1, 2, 3, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 in the native glucagon amino acid sequence. 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 More than, 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 amino acids may be substituted with other amino acids, and also independently or additionally its C- 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, or 11 or more amino acids may be added to the terminal, but is not particularly limited thereto .
  • the peptide is 1, 2, 3, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 in the native glucagon amino acid sequence.
  • 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 More than, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 amino acids may be substituted with other amino acids, and independently or additionally 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more at the C-terminus thereof More than, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, or 11 or more amino acids may be added, but is not particularly limited thereto.
  • the peptide is 1, 2, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 27, 28 in the native glucagon amino acid sequence.
  • 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, or 14 amino acids may be substituted with other amino acids, and independently or additionally 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, at the C-terminus thereof, 10 or more, 11 or more amino acids may be added, but is not particularly limited thereto.
  • the introduced amino acid is from the group consisting of tyrosine, alpha-methyl-glutamic acid, Aib, methionine, glutamic acid, histidine, lysine, leucine, isoleucine, glutamine, valine, glycine, alanine, cysteine, serine, alanine, aspartic acid, and arginine. may be selected, but is not particularly limited thereto.
  • the added amino acid sequence may be one or more amino acid sequences derived from a native GLP-1, native GIP, or native exendin-4 amino acid sequence.
  • Such a peptide may include an intramolecular bridge (eg, a covalent bridge or a non-covalent bridge), and specifically may be in a form containing a ring, for example, between amino acids 16 and 20 of the peptide. It may be in a form in which a ring is formed, but is not particularly limited thereto.
  • an intramolecular bridge eg, a covalent bridge or a non-covalent bridge
  • Non-limiting examples of the ring may include a lactam bridge (or lactam ring).
  • the peptide includes all those modified to include an amino acid capable of forming a ring at a desired position to include a ring.
  • the pair of amino acids 16 and 20 of the peptide may be substituted with glutamic acid or lysine, each capable of forming a ring, but is not limited thereto.
  • Such a ring may be formed between amino acid side chains in the peptide, for example, a lactam ring may be formed between a lysine side chain and a glutamic acid side chain, but is not particularly limited thereto.
  • the amino acid sequence differs from native glucagon by one or more, and the alpha-carbon of the amino acid residue at the N-terminus has been removed, glucagon receptor, GLP-1 receptor, and activity against GIP receptor
  • peptides having a There are peptides having a .
  • the present invention is not limited thereto, and a combination of various methods for analog production can be used to prepare the peptides applied to the present invention.
  • amino acids may be substituted with other amino acids or non-natural compounds in order to avoid the recognition action of an activator degrading enzyme in order to increase the half-life in the body.
  • the peptide may be a peptide having an increased half-life in the body by avoiding the recognition action of the degrading enzyme through substitution of the second amino acid sequence among the amino acid sequence of the peptide, but amino acid substitution or alteration to avoid the recognition action of the degrading enzyme in the body included without limitation.
  • modifications for the preparation of peptides include modifications with L- or D-form amino acids, and/or non-naturally occurring amino acids; and/or modifying the native sequence by modifying, for example, modification of side chain functional groups, intramolecular covalent bonds, such as inter-side chain ring formation, methylation, acylation, ubiquitination, phosphorylation, aminohexylation, biotinylation, etc. includes all that
  • amino acids to be substituted or added may be atypical or non-naturally occurring amino acids as well as the 20 amino acids commonly found in human proteins.
  • Commercial sources of atypical amino acids include Sigma-Aldrich, ChemPep and Genzyme Pharmaceuticals. Peptides containing these amino acids and canonical peptide sequences can be synthesized and purchased from commercial peptide synthesis companies, for example, American peptide company or Bachem in the United States, or Anygen in Korea.
  • Amino acid derivatives can also be obtained in the same way, and to name just a few examples, 4-imidazoacetic acid and the like can be used.
  • the peptide according to the present invention is protected from proteolytic enzymes in vivo and its N-terminus and/or C-terminus is chemically modified or protected by an organic group, or amino acids are added to the peptide terminus to increase stability. It may be added and modified form.
  • the N-terminus is acetylated and/or the C-terminus is amidated to remove these charges.
  • it is not particularly limited thereto.
  • the peptide according to the present invention includes all forms of the peptide itself, a salt thereof (eg, a pharmaceutically acceptable salt of the peptide), or a solvate thereof.
  • the peptide may be in any pharmaceutically acceptable form.
  • the type of the salt is not particularly limited. However, it is preferably in a form that is safe and effective for an individual, such as a mammal, but is not particularly limited thereto.
  • pharmaceutically acceptable means a material that can be effectively used for a desired purpose without causing excessive toxicity, irritation, or allergic reaction within the scope of medical judgment.
  • salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
  • Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • solvate refers to a compound in which the peptide or a salt thereof according to the present invention forms a complex with a solvent molecule.
  • the peptide may include an amino acid sequence represented by the following general formula (1).
  • Xaa1 is histidine, 4-imidazoacetyl, or tyrosine;
  • Xaa2 is glycine, alpha-methyl-glutamic acid, or Aib;
  • Xaa3 is glutamic acid or glutamine
  • Xaa7 is threonine or isoleucine
  • Xaa10 is leucine, tyrosine, lysine, cysteine, or valine;
  • Xaa12 is lysine, serine, or isoleucine
  • Xaa13 is glutamine, tyrosine, alanine, or cysteine,
  • Xaa14 is leucine, methionine, or tyrosine
  • Xaa15 is cysteine, aspartic acid, glutamic acid, or leucine
  • Xaa16 is glycine, glutamic acid, or serine,
  • Xaa17 is glutamine, arginine, isoleucine, glutamic acid, cysteine, or lysine;
  • Xaa18 is alanine, glutamine, arginine, or histidine;
  • Xaa19 is alanine, glutamine, cysteine, or valine
  • Xaa20 is lysine, glutamine, or arginine
  • Xaa21 is glutamic acid, glutamine, leucine, cysteine, or aspartic acid;
  • Xaa23 is isoleucine or valine
  • Xaa24 is alanine, glutamine, cysteine, asparagine, aspartic acid, or glutamic acid,
  • Xaa27 is valine, leucine, or lysine
  • Xaa28 is cysteine, lysine, alanine, asparagine, or aspartic acid
  • Xaa29 is cysteine, glycine, glutamine, threonine, glutamic acid, or histidine;
  • Xaa30 is cysteine, glycine, lysine, or histidine, or is absent;
  • R1 is cysteine, GKKNDWKHNIT (SEQ ID NO: 106), m-SSGAPPPS-n (SEQ ID NO: 107), or m-SSGQPPPS-n (SEQ ID NO: 108), or is absent;
  • m is -Cys-, -Pro-, or -Gly-Pro-;
  • n is -Cys-, -Gly-, -Ser-, or -His-Gly-, or absent.
  • triple activator examples include those comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 102, SEQ ID NOs: 1 to 11, those comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of 13 to 102, SEQ ID NOs: 1 to 11, and may be (essentially) composed of an amino acid sequence selected from the group consisting of 13 to 102, but is not limited thereto.
  • the triple activator has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21, 22, 42, 43, 50, 64, 66, 67, 70, 71, 76, 77, 96, 97 and 100 It may be (essentially) composed of, but is not limited thereto.
  • the triple activator may be (essentially) composed of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21, 22, 42, 43, 50, 66, 67, 77, 96, 97 and 100
  • the present invention is not limited thereto.
  • the triple activator may be (essentially) composed of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21, 22, 42, 43, 50, 77 and 96, but is not limited thereto.
  • Xaa14 may be leucine or methionine
  • Xaa15 may be cysteine, aspartic acid, or leucine.
  • a peptide examples include, but are not particularly limited to, a peptide comprising or (essentially) consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 11, 14 to 17, and 21 to 102.
  • Such a peptide may significantly activate one or more of a glucagon receptor, a GLP-1 receptor, and a GIP receptor, but is not particularly limited thereto. Specifically, it may significantly activate GLP-1, or further significantly activate glucagon receptor and/or GIP receptor, but is not particularly limited thereto.
  • Xaa2 is glycine, alpha-methyl-glutamic acid, or Aib;
  • Xaa7 is threonine
  • Xaa10 is tyrosine, cysteine, or valine
  • Xaa12 is lysine or isoleucine
  • Xaa13 is tyrosine, alanine, glutamine, or cysteine,
  • Xaa14 is leucine, cysteine, or methionine
  • Xaa15 is cysteine, leucine, glutamic acid, or aspartic acid,
  • Xaa17 is glutamine, arginine, isoleucine, cysteine, glutamic acid, or lysine,
  • Xaa18 is alanine, glutamine, arginine, or histidine;
  • Xaa19 is alanine, glutamine, valine, or cysteine
  • Xaa20 is lysine, arginine, or glutamine
  • Xaa21 is glutamic acid, glutamine, leucine, cysteine, or aspartic acid;
  • Xaa23 is isoleucine or valine
  • Xaa24 is cysteine, alanine, glutamine, asparagine, glutamic acid, or aspartic acid;
  • Xaa27 may be a peptide, which is leucine or lysine, but is not particularly limited thereto.
  • Xaa2 is glycine, alpha-methyl-glutamic acid, or Aib;
  • Xaa7 is threonine
  • Xaa10 is tyrosine, cysteine, or valine
  • Xaa12 is lysine or isoleucine
  • Xaa13 is tyrosine, alanine, or cysteine
  • Xaa14 is leucine or methionine
  • Xaa15 is cysteine or aspartic acid
  • Xaa17 is glutamine, arginine, isoleucine, cysteine, or lysine,
  • Xaa18 is alanine, arginine, or histidine
  • Xaa19 is alanine, glutamine, or cysteine
  • Xaa20 is lysine or glutamine
  • Xaa21 is glutamic acid, cysteine, or aspartic acid
  • Xaa23 is valine
  • Xaa24 is alanine, glutamine, cysteine, asparagine, or aspartic acid
  • Xaa27 may be leucine or lysine, but is not particularly limited thereto.
  • Xaa2 is alpha-methyl-glutamic acid or Aib
  • Xaa7 is threonine
  • Xaa10 is tyrosine or cysteine
  • Xaa12 is lysine or isoleucine
  • Xaa13 is tyrosine, alanine, or cysteine
  • Xaa14 is leucine or methionine
  • Xaa15 is cysteine or aspartic acid
  • Xaa16 is glutamic acid
  • Xaa17 is arginine, isoleucine, cysteine, or lysine,
  • Xaa18 is alanine, arginine, or histidine
  • Xaa19 is alanine, glutamine, or cysteine
  • Xaa20 is lysine or glutamine
  • Xaa21 is glutamic acid or aspartic acid
  • Xaa23 is valine
  • Xaa24 is glutamine, asparagine, or aspartic acid
  • Xaa27 is leucine
  • Xaa28 may be cysteine, alanine, asparagine, or aspartic acid.
  • Xaa1 is histidine or 4-imidazoacetyl
  • Xaa2 is alpha-methyl-glutamic acid or Aib
  • Xaa3 is glutamine
  • Xaa7 is threonine
  • Xaa10 is tyrosine
  • Xaa12 is isoleucine
  • Xaa13 is alanine or cysteine
  • Xaa14 is methionine
  • Xaa15 is aspartic acid
  • Xaa16 is glutamic acid
  • Xaa17 is isoleucine or lysine
  • Xaa18 is alanine or histidine
  • Xaa19 is glutamine or cysteine
  • Xaa20 is lysine
  • Xaa21 is aspartic acid
  • Xaa23 is valine
  • Xaa24 is asparagine
  • Xaa27 is leucine
  • Xaa28 is alanine or asparagine
  • Xaa29 is glutamine or threonine
  • Xaa30 may be cysteine or lysine or absent.
  • Xaa2 is glycine, alpha-methyl-glutamic acid, or Aib;
  • Xaa3 is glutamine
  • Xaa7 is threonine
  • Xaa10 is tyrosine, cysteine, or valine
  • Xaa12 is lysine
  • Xaa13 is tyrosine
  • Xaa14 is leucine
  • Xaa15 is aspartic acid
  • Xaa16 is glycine, glutamic acid, or serine,
  • Xaa17 is glutamine, arginine, cysteine, or lysine
  • Xaa18 is alanine, arginine, or histidine
  • Xaa19 is alanine or glutamine
  • Xaa20 is lysine or glutamine
  • Xaa21 is glutamic acid, cysteine, or aspartic acid
  • Xaa23 is valine
  • Xaa24 is alanine, glutamine, or cysteine
  • Xaa27 is leucine or lysine
  • Xaa29 may be glycine, glutamine, threonine, or histidine, but is not particularly limited thereto.
  • These peptides have significant activation levels of GLP-1 receptors and glucagon receptors, and are higher than those of GIP receptors;
  • the degree of activation of the GLP-1 receptor, the glucagon receptor and the GIP receptor is all significant;
  • the degree of activation of the GLP-1 receptor and the GIP receptor is significant and may correspond to a case where the activation level of the glucagon receptor is higher than that of the glucagon receptor, but is not particularly limited thereto.
  • Examples of such a peptide include SEQ ID NOs: 8, 9, 21 to 37, 39, 42, 43, 49 to 61, 64 to 83, 85, 86, 88, 89, 91 to 93, selected from the group consisting of 95 to 102 and a peptide comprising or (essentially) consisting of an amino acid sequence, but is not particularly limited thereto.
  • the peptide may include an amino acid sequence represented by the following general formula (2).
  • Xaa1 is 4-imidazoacetyl, histidine, or tyrosine;
  • Xaa2 is glycine, alpha-methyl-glutamic acid, or Aib;
  • Xaa10 is tyrosine or cysteine
  • Xaa13 is alanine, glutamine, tyrosine, or cysteine;
  • Xaa14 is leucine, methionine, or tyrosine
  • Xaa15 is aspartic acid, glutamic acid, or leucine
  • Xaa16 is glycine, glutamic acid, or serine
  • Xaa17 is glutamine, arginine, isoleucine, glutamic acid, cysteine, or lysine;
  • Xaa18 is alanine, glutamine, arginine, or histidine;
  • Xaa19 is alanine, glutamine, cysteine, or valine;
  • Xaa20 is lysine, glutamine, or arginine
  • Xaa21 is cysteine, glutamic acid, glutamine, leucine, or aspartic acid;
  • Xaa23 is isoleucine or valine
  • Xaa24 is cysteine, alanine, glutamine, asparagine, or glutamic acid
  • Xaa28 is lysine, cysteine, asparagine, or aspartic acid
  • Xaa29 is glycine, glutamine, cysteine, or histidine
  • Xaa30 is cysteine, glycine, lysine, or histidine
  • Xaa31 is proline or cysteine
  • Xaa40 is cysteine or absent.
  • Xaa13 is alanine, tyrosine, or cysteine
  • Xaa15 is aspartic acid or glutamic acid
  • Xaa17 is glutamine, arginine, cysteine, or lysine
  • Xaa18 is alanine, arginine, or histidine
  • Xaa21 is cysteine, glutamic acid, glutamine, or aspartic acid
  • Xaa23 is isoleucine or valine
  • Xaa24 is cysteine, glutamine, or asparagine
  • Xaa28 is cysteine, asparagine, or aspartic acid
  • Xaa29 is glutamine, cysteine, or histidine
  • Xaa30 may be cysteine, lysine, or histidine.
  • Examples of such a peptide include an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21, 22, 42, 43, 50, 64 to 77, and 95 to 102, more specifically SEQ ID NOs: 21, 22, 42, 43, 50, 64 to 77, and a peptide comprising or (essentially) consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of 96 to 102, but is not particularly limited thereto.
  • the peptide may include an amino acid sequence of the following general formula (3).
  • Xaa1 is histidine or tyrosine
  • Xaa2 is alpha-methyl-glutamic acid or Aib
  • Xaa13 is alanine, tyrosine or cysteine
  • Xaa17 is arginine, cysteine, or lysine
  • Xaa18 is alanine or arginine
  • Xaa19 is alanine or cysteine
  • Xaa21 is glutamic acid or aspartic acid
  • Xaa24 is glutamine or asparagine
  • Xaa28 is cysteine or aspartic acid
  • Xaa29 is cysteine, histidine, or glutamine
  • Xaa30 is cysteine or histidine
  • Xaa31 is proline or cysteine
  • Xaa40 may be cysteine or absent.
  • a peptide examples include a peptide comprising or (essentially) consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21, 22, 42, 43, 50, 64 to 71, 75 to 77, and 96 to 102. However, it is not particularly limited thereto.
  • R1 is cysteine, GKKNDWKHNIT (SEQ ID NO: 106), CSSGQPPPS (SEQ ID NO: 109), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 110), GPSSGAPPPSC (SEQ ID NO: 111), PSSGAPPPS (SEQ ID NO: 112), PSSGAPPPSG (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 110) 113), PSSGAPPPSHG (SEQ ID NO: 114), PSSGAPPPSS (SEQ ID NO: 115), PSSGQPPPS (SEQ ID NO: 116), or PSSGQPPPSC (SEQ ID NO: 117), or absent, but is not particularly limited thereto.
  • the length of the peptide of the present invention can be synthesized by a method well known in the art, for example, an automatic peptide synthesizer, or it can be produced by a genetic engineering technique.
  • the peptides of the present invention can be prepared by standard synthetic methods, recombinant expression systems, or any other method in the art.
  • the peptides according to the invention can be synthesized in a number of ways, including, for example, those comprising:
  • a method for obtaining a fragment of a peptide by any combination of (a), (b) and (c), and then ligating the fragments to obtain a peptide, and recovering the peptide.
  • the peptide having activity on the glucagon receptor, the GLP-1 receptor, and the GIP receptor is biocompatible to increase the in vivo half-life of the peptide having activity on the glucagon receptor, the GLP-1 receptor, and the GIP receptor.
  • the substance may be in the form of a bound, long-acting binder.
  • the biocompatible material may be mixed with a carrier.
  • the conjugate of the peptide may exhibit increased potency and durability compared to the peptide to which the carrier is not bound, and in the present invention, such a conjugate is referred to as a "persistent conjugate".
  • the combination may be non-naturally occurring.
  • the long-acting conjugate may be one represented by the following formula (1), but is not limited thereto:
  • X is a peptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 102;
  • L is a linker containing ethylene glycol repeating units
  • F is an immunoglobulin Fc fragment or derivative thereof
  • F is X, that is, a peptide having activity on the glucagon receptor, the GLP-1 receptor, and the GIP receptor, specifically, the half-life of a peptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 102.
  • X that is, a peptide having activity on the glucagon receptor, the GLP-1 receptor, and the GIP receptor, specifically, the half-life of a peptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 102.
  • a material that can be used it corresponds to one component of the moiety constituting the binder of the present invention.
  • the F may be bonded to each other through a covalent chemical bond or a non-covalent chemical bond with X, and F and X may be bonded to each other through L through a covalent chemical bond, a non-covalent chemical bond, or a combination thereof.
  • L may be a non-peptidyl linker, for example, a linker containing an ethylene glycol repeating unit.
  • non-peptidyl linker includes a biocompatible polymer in which two or more repeating units are bonded. The repeating units are linked to each other through any covalent bond other than a peptide bond.
  • the non-peptidyl linker may be one component constituting a moiety of the conjugate of the present invention, and corresponds to L in Formula 1 above.
  • the non-peptidyl linker that can be used in the present invention may be used without limitation as long as it is a polymer resistant to in vivo protease.
  • the non-peptidyl linker may be used in combination with a non-peptidyl polymer.
  • non-peptidyl linker may be a linker containing an ethylene glycol repeating unit, for example, polyethylene glycol, and also derivatives thereof known in the art and easily at the level of skill in the art. Derivatives that can be prepared are also included in the scope of the present invention.
  • the repeating unit of the non-peptidyl linker may be an ethylene glycol repeating unit, and specifically, the non-peptidyl linker may include an ethylene glycol repeating unit and a functional group used in the preparation of the conjugate at the terminal thereof.
  • the long-acting conjugate according to the present invention may be in a form in which X and F are linked through the functional group, but is not limited thereto.
  • the non-peptidyl linker may include two, or three or more functional groups, and each functional group may be the same or different from each other, but is not limited thereto.
  • the linker may be polyethylene glycol (PEG) represented by the following formula (2), but is not limited thereto:
  • the PEG moiety in the long-acting conjugate may include not only the -(CH 2 CH 2 O) n -structure, but also an oxygen atom intervening between the linking element and the -(CH 2 CH 2 O) n -, but this It is not limited.
  • the conjugate may have a structure in which the peptide (X) comprising the amino acid sequence of Formula 1 and the immunoglobulin Fc region (F) are covalently linked through a linker containing an ethylene glycol repeating unit.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the polyethylene glycol is a term that encompasses all forms of ethylene glycol homopolymer, PEG copolymer, or monomethyl-substituted PEG polymer (mPEG), but is not particularly limited thereto.
  • the non-peptidyl linker that can be used in the present invention may be used without limitation as long as it is a polymer including an ethylene glycol repeating unit that is resistant to proteolytic enzymes in vivo.
  • the molecular weight of the non-peptidyl polymer is, but is not limited to, greater than 0 in the range of about 100 kDa, in the range of about 1 to about 100 kDa, specifically in the range of about 1 to about 20 kDa, or in the range of about 1 to about 10 kDa.
  • the non-peptidyl linker of the present invention coupled to the polypeptide corresponding to F not only one type of polymer but also a combination of different types of polymers may be used.
  • both ends of the non-peptidyl linker may be bound to an amine or thiol group of F, such as an immunoglobulin Fc region, and an amine or thiol group of X, respectively.
  • the non-peptidyl polymer has a reactive group capable of binding to F (eg, immunoglobulin Fc region) and X at both ends, specifically, the N-terminus of X, or F (eg, immunoglobulin Fc region). Or it may include a reactive group capable of bonding to an amine group located on lysine, or a thiol group of cysteine, but is not limited thereto.
  • the reactive group of the non-peptidyl polymer capable of binding to F may be selected from the group consisting of an aldehyde group, a maleimide group and a succinimide derivative, but is not limited thereto.
  • the aldehyde group may be exemplified by a propion aldehyde group or a butyl aldehyde group, but is not limited thereto.
  • succinimidyl valerate succinimidyl methylbutanoate, succinimidyl methylpropionate, succinimidyl butanoate, succinimidyl propionate, N-hydroxysuccini Mead, hydroxy succinimidyl, succinimidyl carboxymethyl or succinimidyl carbonate may be used, but not limited thereto.
  • the non-peptidyl linker may be connected to X and F through such a reactive group, but is not particularly limited thereto.
  • the final product resulting from reductive amination by aldehyde bonds is much more stable than those linked by amide bonds.
  • the aldehyde reactive group selectively reacts with the N-terminus at a low pH, and can form a covalent bond with a lysine residue at a high pH, for example, pH 9.0.
  • the reactive groups at both ends of the non-peptidyl linker may be the same or different from each other, for example, a maleimide group at one end and an aldehyde group, a propionaldehyde group, or a butyl aldehyde group at the other end.
  • F specifically, an immunoglobulin Fc region and X can be bound to each end of the non-peptide linker, it is not particularly limited thereto.
  • one end of the non-peptidyl linker may include a maleimide group as a reactive group, and an aldehyde group, a propionaldehyde group, or a butyl aldehyde group at the other end of the non-peptidyl linker.
  • the hydroxyl group can be activated into the various reactive groups by a known chemical reaction, or a commercially available polyethylene glycol having a modified reactive group is used.
  • the long-acting protein conjugate of the invention can be prepared.
  • the non-peptidyl polymer may be linked to a cysteine residue of X, more specifically, a -SH group of cysteine, but is not limited thereto.
  • cysteine residue 10 cysteine 13, cysteine 15, cysteine 17, cysteine 19, cysteine 21, cysteine 24, cysteine 28, 29
  • the non-peptidyl polymer may be linked to cysteine residue No. 30, cysteine residue 30, cysteine 31, cysteine 40, or cysteine 41, but is not particularly limited thereto.
  • a reactive group of the non-peptidyl polymer may be linked to the -SH group of the cysteine residue, and all of the above descriptions apply to the reactive group.
  • maleimide-PEG-aldehyde is used, the maleimide group is linked to the -SH group of X by a thioether bond, and the aldehyde group is F, specifically, the -NH 2 group of immunoglobulin Fc by reductive amination reaction may be connected through, but is not limited thereto, and this corresponds to one example.
  • the reactive group of the non-peptidyl polymer may be linked to -NH 2 located at the N-terminus of the immunoglobulin Fc region, but this corresponds to one example.
  • F may be an immunoglobulin Fc region, and more specifically, the immunoglobulin Fc region may be derived from IgG, but is not particularly limited thereto.
  • immunoglobulin Fc region refers to a region including heavy chain constant region 2 (CH2) and/or heavy chain constant region 3 (CH3), excluding the heavy and light chain variable regions of immunoglobulin.
  • the immunoglobulin Fc region may be one component constituting a moiety of the conjugate of the present invention.
  • the immunoglobulin Fc region may be used interchangeably with “immunoglobulin Fc fragment”.
  • the Fc region not only the native sequence obtained from papain digestion of immunoglobulin, but also derivatives thereof, such as one or more amino acid residues in the native sequence, are converted by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, resulting in a native natural sequence. It encompasses and includes sequences that differ from the type.
  • F is a structure in which two polypeptide chains are connected by a disulfide bond, and may be a structure in which only one of the two chains is connected through a nitrogen atom, but is not limited thereto.
  • the linkage via the nitrogen atom may be linked through reductive amination to the epsilon amino atom or the N-terminal amino group of lysine.
  • Reductive amination reaction means a reaction in which an amine group or an amino group of a reactant reacts with an aldehyde (i.e., a functional group capable of reductive amination) of another reactant to form an amine and then forms an amine bond by a reduction reaction, It is an organic synthesis reaction well known in the art.
  • the F may be connected through the nitrogen atom of the N-terminal proline, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region is one component constituting a moiety of the conjugate of Formula 1 of the present invention, and specifically, may correspond to F in Formula 1 above.
  • the immunoglobulin Fc region may include a hinge region in the heavy chain constant region, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region may include a specific hinge sequence at the N-terminus.
  • flankinge sequence refers to a region that is located on a heavy chain and forms a dimer of an immunoglobulin Fc region through an inter disulfide bond.
  • the hinge sequence may be mutated to have only one cysteine residue by deleting a part of the hinge sequence having the following amino acid sequence, but is not limited thereto:
  • the hinge sequence may include only one cysteine residue by deleting the 8th or 11th cysteine residue in the hinge sequence of SEQ ID NO: 119.
  • the hinge sequence of the present invention may be composed of 3 to 12 amino acids, including only one cysteine residue, but is not limited thereto.
  • the hinge sequence of the present invention may have the following sequences: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 120), Glu-Ser- Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 121), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser (SEQ ID NO: 122), Glu- Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro (SEQ ID NO: 123), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser (SEQ ID NO: 124), Glu-Ser-Lys- Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO: 125), Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO
  • Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro SEQ ID NO: 131
  • Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro SEQ ID NO: 132
  • Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys SEQ ID NO: 133
  • Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro SEQ ID NO: 134
  • Glu-Ser-Lys-Pro-Ser- Cys-Pro SEQ ID NO: 135)
  • Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro SEQ ID NO: 136
  • Glu-Pro-Ser-Cys SEQ ID NO: 137
  • Ser-Cys-Pro SEQ ID NO: 138
  • the hinge sequence may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129 (Pro-Ser-Cys-Pro) or SEQ ID NO: 138 (Ser-Cys-Pro), but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention may have a form in which two molecules of an immunoglobulin Fc chain form a dimer due to the presence of a hinge sequence, and in the conjugate of Formula 1, one end of the linker is a dimer immunoglobulin It may be in a form linked to one chain of the Fc region, but is not limited thereto.
  • N-terminus refers to the amino terminus of a protein or polypeptide, and 1, 2, 3, 4, 5, 6, It may include up to 7, 8, 9, or 10 or more amino acids.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention may include a hinge sequence at the N-terminus, but is not limited thereto.
  • part or all of the heavy chain constant region 1 (CH1) and/or light chain constant region except for only the heavy and light chain variable regions of immunoglobulin 1 (CL1) may be an extended Fc region. It may also be a region in which some fairly long amino acid sequences corresponding to CH2 and/or CH3 have been removed.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention comprises 1) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain, 2) a CH1 domain and a CH2 domain, 3) a CH1 domain and a CH3 domain, 4) a CH2 domain and a CH3 domain, 5) a combination of one or two or more of the CH1 domain, the CH2 domain, the CH3 domain and the CH4 domain with an immunoglobulin hinge region (or a part of the hinge region), 6) heavy chain constant region each domain and the light chain constant region may be a dimer .
  • the immunoglobulin Fc region F is a dimer (dimer) consisting of two polypeptide chains, wherein the Fc region dimers F and X are ethylene glycol repeats They are covalently linked through one and the same linker L containing the units.
  • X is covalently linked via a linker L to only one of the two polypeptide chains of this Fc region dimer F.
  • only one molecule of X is covalently linked via L to one of the two polypeptide chains of the Fc region dimer F to which X is linked.
  • F is a homodimer.
  • the long-acting conjugate of the present invention it is also possible for two molecules of X to bind symmetrically to one Fc region in a dimeric form.
  • the immunoglobulin Fc and X may be linked to each other by a non-peptide linker.
  • a non-peptide linker it is not limited to the examples described above.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention includes a native amino acid sequence as well as a sequence derivative thereof.
  • An amino acid sequence derivative means that one or more amino acid residues in a native amino acid sequence have a different sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322, or 327 to 331 known to be important for binding may be used as suitable sites for modification.
  • various types of derivatives are possible, such as a site capable of forming a disulfide bond is removed, some amino acids at the N-terminus of native Fc are removed, or a methionine residue may be added to the N-terminus of native Fc do.
  • the complement binding site eg, the C1q binding site
  • the ADCC antibody dependent cell mediated cytotoxicity
  • the above-described Fc derivative may exhibit biological activity equivalent to that of the Fc region of the present invention, and may have increased structural stability against heat, pH, etc. of the Fc region.
  • the Fc region may be obtained from a native type isolated in vivo from animals such as humans, cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats or guinea pigs, or obtained from transformed animal cells or microorganisms. It may be recombinant or a derivative thereof.
  • the method of obtaining from the native type may be a method of obtaining whole immunoglobulins by treatment with proteolytic enzymes after isolating whole immunoglobulins from a living body of a human or animal. When treated with papain, it is cleaved into Fab and Fc, and when treated with pepsin, it is cleaved into pF'c and F(ab) 2 .
  • Fc or pF'c may be separated using size-exclusion chromatography or the like.
  • a recombinant immunoglobulin Fc region obtained from a human-derived Fc region from a microorganism.
  • the immunoglobulin Fc region may be in the form of a native sugar chain, an increased sugar chain compared to the native type, a decreased sugar chain compared to the native type, or a form in which the sugar chain is removed.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms may be used for the increase or decrease or removal of such immunoglobulin Fc sugar chains.
  • the immunoglobulin Fc region from which the sugar chain is removed from the Fc has significantly reduced binding to complement (c1q) and reduced or eliminated antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity, so that unnecessary immune responses in vivo are not induced. does not In this regard, a form more suitable for the original purpose as a drug carrier will be an immunoglobulin Fc region in which sugar chains are removed or non-glycosylated.
  • deglycosylation refers to an Fc region from which sugars are removed by an enzyme
  • aglycosylation refers to an Fc region that is not glycosylated by production in prokaryotes, in a more specific embodiment, in E. coli. .
  • the immunoglobulin Fc region may be of human or animal origin such as cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, and guinea pigs, and in a more specific embodiment, it is of human origin.
  • the immunoglobulin Fc region may be an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE, or IgM, a combination thereof, or a hybrid thereof. In a more specific embodiment, it is derived from IgG or IgM, which is most abundant in human blood, and in a more specific embodiment, it is derived from IgG, which is known to enhance the half-life of ligand binding proteins. In an even more specific embodiment, the immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region, and in the most specific embodiment, the immunoglobulin Fc region is a non-glycosylated Fc region derived from human IgG4, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc fragment is a fragment of human IgG4 Fc, and is a homologue in which two monomers are linked through a disulfide bond (inter-chain form) between cysteine, amino acid 3 of each monomer. It may be in the form of a dimer, wherein each monomer of the homodimer is independently an internal disulfide bond between cysteines at positions 35 and 95 and an internal disulfide bond between cysteines at positions 141 and 199, that is, two internal disulfide bonds. (intra-chain form) and/or may have.
  • the number of amino acids of each monomer may consist of 221 amino acids, and the amino acids forming a homodimer may consist of a total of 442 amino acids, but is not limited thereto.
  • two monomers having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 139 (consisting of 221 amino acids) form a homodimer through a disulfide bond between cysteine, the 3rd amino acid of each monomer, and the monomer of the homodimer may each independently form an internal disulfide bond between cysteines at positions 35 and 95 and an internal disulfide bond between cysteines at positions 141 and 199, but is not limited thereto.
  • the term "combination" with respect to an immunoglobulin Fc region means that when a dimer or multimer is formed, a polypeptide encoding a single-chain immunoglobulin Fc region of the same origin binds to a single-chain polypeptide of a different origin.
  • dimers or multimers can be prepared from two or more fragments selected from the group consisting of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE Fc fragments.
  • hybrid is a term that means that sequences corresponding to immunoglobulin Fc fragments of two or more different origins exist in a single-chain immunoglobulin constant region.
  • various types of hybrids are possible. That is, a hybrid of domains consisting of 1 to 4 domains from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc and IgD Fc is possible, and may include a hinge.
  • IgG can also be divided into subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, and in the present invention, a combination thereof or hybridization thereof is also possible. Specifically, it is an IgG2 and IgG4 subclass, and most specifically, an Fc fragment of IgG4 having little effector function such as complement dependent cytotoxicity (CDC).
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • the above-described conjugate may have an increased duration of effect compared to native GLP-1, GIP, or glucagon, or compared to X that is not modified with F, and such a conjugate is not only in the above-described form, but also in biodegradable nano Including all of the form encapsulated in the particles, but is not limited thereto.
  • the above-described conjugate may have an increased duration of effect compared to native GLP-1, GIP, or glucagon, or compared to unmodified F, and such a conjugate is not only in the form described above, but also biodegradable nanoparticles Including all enclosed forms, etc.
  • a composition comprising the peptide may be used for preventing or treating lung disease.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of lung disease by administration of the peptide (eg, the peptide itself or a long-acting conjugate to which a biocompatible material is bound) or a composition comprising the same.
  • treatment refers to any action in which the symptoms of lung disease are improved or beneficial by administration of the peptide (eg, the peptide itself or a long-acting conjugate to which a biocompatible material is bound) or a composition comprising the same.
  • the term "administration” means introducing a predetermined substance to a patient by any suitable method, and the route of administration of the composition is not particularly limited thereto, but any general route through which the composition can reach an in vivo target It may be administered through, for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, or rectal administration.
  • routes of administration of the composition is not particularly limited thereto, but any general route through which the composition can reach an in vivo target It may be administered through, for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, or rectal administration.
  • a triple activator having activity on both glucagon, GLP-1 and GIP receptors of the present invention or a long-acting conjugate thereof reduces the number of administrations to chronic patients who have to be administered daily due to a dramatic increase in the blood half-life and the sustained effect in vivo. It has the great advantage of improving the quality of life of patients by reducing it, which is a great help in the treatment of lung diseases.
  • the triple activator or a long-acting conjugate thereof has an effect in preventing lung disease, such as delaying the recurrence period of symptoms of lung disease, and/or significantly reducing symptoms of lung disease, such as prevention and / or a great help in treatment.
  • the term "pulmonary disease” refers to any disease in which an abnormality occurs in tissues or functions of the lung, and specifically, the triple activator of the present invention or a long-acting conjugate thereof can inhibit inflammation and fibrotic reactions.
  • the lung disease is a disease accompanying lung inflammation and fibrosis or a disease accompanying fibrosis, for example, interstitial lung disease (ILD), progressive fibrotic interstitial lung disease (Progressive Fibrosing Interstitial Lung Disease (PF-ILD), idiopathic interstitial pneumonias (IIP), Non-specific interstitial pneumonia (NSIP), pulmonary fibrosis, interstitial fibrosing interstitial lung diseases (FILD), idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), alveolitis, pneumonia, emphysema, bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease, may include, but are not limited to, combined pulmonary fibrosis and emphys
  • the triple activator of the present invention inhibits the activity of macrophages, a major mechanism of lung inflammation, and inhibits the differentiation of fibroblasts into myofibroblasts and the epithelial mesenchymal transition of alveolar epithelial cells, which are the main mechanisms of pulmonary fibrosis. It may show a preventive or therapeutic effect on a disease, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered by (i) inhibiting macrophage activity, and/or (ii) reducing the expression of IL-1 ⁇ , IL-6, IL-12, or TNF- ⁇ . It may be to suppress inflammation, but is not limited thereto. Also, although not limited thereto, the pharmaceutical composition of the present invention may have one or more of the following characteristics upon administration:
  • EMT epithelial mesenchymal transition
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be to inhibit fibrosis, but is not limited thereto.
  • elastase that decomposes elastin, a type of fiber that constitutes lung tissue and is involved in elasticity, is secreted. It is known that the elastin, which is an elastic tissue of the alveoli, is damaged by the elastase, and eventually the alveoli are also damaged, leading to fibrosis of the tissue. Inflammation and fibrosis in the lungs themselves become lung diseases, but the progression and deepening of inflammation and fibrosis can lead to other lung diseases, and therefore, it is important to inhibit inflammation and fibrosis in the prevention and treatment of lung diseases. is required
  • the characteristics of the triple activator as described above of the present invention mean the effect of inhibiting and improving lung inflammation and fibrosis, which also suggests a preventive or therapeutic effect on lung diseases accompanying inflammation or fibrosis of the lung.
  • chronic obstructive pulmonary disease refers to a disease showing irreversible airway obstruction, and it is known that the destruction of the lung parenchyma and pulmonary fibrosis due to chronic inflammation and damage occur.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • Infiltration of various inflammatory cells is observed in the airways of patients with chronic obstructive pulmonary disease, and in particular, the number of macrophages is known to increase according to the severity of the disease, suggesting that inflammation plays an important role in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. do.
  • chronic obstructive pulmonary disease When harmful substances are inhaled, innate immunity responds and epithelial cells secrete many inflammatory mediators, which act to activate alveolar macrophages and neutrophils, so control of the inflammatory response is an important factor in the treatment of chronic obstructive pulmonary disease. .
  • chronic obstructive pulmonary disease is divided into two types of emphysema and chronic bronchitis, but it is known that emphysema and chronic bronchitis coexist in many cases in actual patients.
  • chronic bronchitis is chronic bronchitis, which causes enlargement and increase of mucous glands in the airways, or structural damage due to inflammation. As a result, the mucus layer thickens and ciliary movement decreases, blocking air flow. Respiratory diseases that cause difficulty breathing, etc.
  • emphysema refers to a disease in which the bronchial tubes or lungs are inflamed due to various causes, thereby secreting proteases, destroying the basic skeleton of the alveoli, and damaging the vascular structure, resulting in loss of gas exchange function.
  • alveolitis refers to a disease in which the alveoli, which are responsible for oxygen exchange, are inflamed. If macrophages accumulate in the alveoli due to mold, dust, petroleum, toluene, acetone, chemicals, etc. and the alveolar septum thickens, it can progress to alveolitis. As the alveolitis progresses, the alveoli are destroyed, scarring, hardening, and breathing. It is known to cause trouble.
  • asthma is an inflammatory airway obstructive disease that exhibits a reversible lesion, unlike chronic obstructive pulmonary disease, and causes respiratory distress induced by airway inflammation. It is known that the airways of asthma patients secrete a lot of cytokines such as IL-4, IL-5, and IL-13, and the proliferation and thickening of bronchial smooth muscle is remarkable. As with chronic obstructive pulmonary disease, control of the inflammatory response is important in treatment.
  • the term pneumonia refers to a disease in which the parenchymal tissue of the lung or the alveoli are inflamed. Bacterial infection, virus, protozoa, fungus, and chemicals are the causes, and it is a high-risk disease that can accompany various complications. It is known that the immune mechanism (typically alveolar macrophages) of the respiratory organs against the pathogen does not function properly, or the level of the pathogen exceeds the limit that can be defended by a normal immune mechanism, leading to the onset of pneumonia. It is known that patients with chronic lung diseases such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, and bronchiectasis are more likely to develop pneumonia. In the present invention, pulmonary inflammation or pneumonia may include, but is not limited to, pulmonary inflammation or pneumonia caused by or accompanying other lung diseases.
  • the term "respiratory infectious disease” refers to a respiratory disease caused by infection with a pathogen (virus, bacteria, fungus, etc.). Respiratory infections can be classified according to pathogens that cause them. Representative respiratory infections include respiratory viruses, bacteria, mycoplasma, fungi, and the like. Since inflammation is accompanied by a respiratory infection caused by infection with the pathogen, a therapeutic effect through improvement of inflammation can be expected.
  • respiratory viral infection disease refers to a respiratory disease caused by a pathogenic virus infection, which can cause severe upper respiratory tract infections from mild upper respiratory tract infections to severe lower respiratory tract infections accompanied by pneumonia and bronchitis.
  • the infection is known to be fatal.
  • Respiratory virus infection causes inflammation in the respiratory tract, including the lungs, and if inflammation is not suppressed for a long period of time, it leads to fibrosis, which leads to more serious lung disease. Therefore, it is important to treat respiratory viral infections while suppressing inflammation and fibrosis.
  • the respiratory viruses that cause respiratory viral infections include adenovirus, vaccinia virus, herpes simplex virus, parainfluenza virus, rhinovirus, chickenpox.
  • Virus varianta Zoster Virus
  • measle virus measle virus
  • respiratory syncytial virus respiratorysyncytial virus
  • Dengue virus Dengue virus
  • human immunodeficiency virus HIV
  • influenza virus coronavirus
  • coronavirus severe acute respiratory syndrome virus
  • SARS-associated virus severe acute respiratory syndrome associated virus
  • MERS-CoV middle east respiratory syndrome coronavirus
  • coronavirus may be SARS-CoV-2, and SARS-CoV-2 infection may cause coronavirus disease 2019 (COVID-19).
  • coronavirus disease 2019 is a viral infectious disease caused by a coronavirus (2019-nCoV or SARS-CoV-2) infection, and the clear source and route of infection are still confirmed
  • coronavirus disease 2019 2019 (COVID-19) is a viral infectious disease caused by a coronavirus (2019-nCoV or SARS-CoV-2) infection, and the clear source and route of infection are still confirmed
  • Corona virus is a virus that can infect humans and various animals. It is an RNA virus with a gene size of 27 to 32 kb and is known to mainly exhibit respiratory symptoms such as cough with fever, shortness of breath, shortness of breath, and sputum.
  • the reason that severe pneumonia accompanies COVID-19 is that the coronavirus attacks bronchial ciliary epithelial cells or Type II alveolar epithelial cells (type 2 epithelial cells in the alveoli). These cells have a large amount of enzyme receptors that make the corona virus stick well. Receptors such as 'ACE2' and 'TMPRSS2' enhance the ability of corona virus to penetrate cells.
  • Ciliated epithelial cells as their name suggests, have a large number of cilia, and they discharge pathogens including coronaviruses attached to the mucous membrane in the direction of the mouth and nose.
  • pathogens including coronaviruses attached to the mucous membrane in the direction of the mouth and nose.
  • Smoking, dust, dry weather, and low temperatures also reduce ciliary motility. In dry, cold winters, ciliary movement is lowered, so influenza viral infections, including coronavirus infection-19, increase.
  • coronaviruses seize the host cell's resources and systems, proliferate vigorously, and are ejected out of infected cells. At this time, the exponentially proliferated viruses escape and rapidly infiltrate into surrounding healthy ciliated epithelial cells and Type II alveolar epithelial cells. Infected cells secrete cytokines that cause strong inflammation and turn into inflammatory cells.
  • Type II alveolar epithelial cells The original function of Type II alveolar epithelial cells is to secrete surfactant to keep the alveoli taut and to facilitate gas exchange through Type I alveolar epithelial cells.
  • Type II alveolar epithelial cells attacked by the coronavirus transform into inflammatory cells and lose their main function, causing inflammation (pneumonia) in the lungs, resulting in secondary symptoms (fever, cough, shortness of breath, etc.).
  • the triple activator of the present invention can inhibit the inflammatory response by inhibiting macrophage activity and/or reducing the expression level of inflammatory cytokines (IL-1 ⁇ , IL-6, IL-12, or TNF- ⁇ ) in lung tissue. Therefore, it can exhibit a preventive or therapeutic effect on pulmonary diseases caused by or accompanied by inflammation (eg, alveolitis, pneumonia, emphysema, bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, or respiratory infection diseases).
  • inflammatory cytokines eg, alveolitis, pneumonia, emphysema, bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, or respiratory infection diseases.
  • fibrosis is a disease that forms excessive fibrous connective tissue in an organ or tissue.
  • Fibrosis refers to a state in which normal control is impossible during the wound healing process after a tissue in the human body is damaged by an inflammatory reaction caused by various causes (infection, chemical stimulation, radiation, etc.).
  • inflammation of the lungs occurs and lasts for a long time in an untreated state, leading to fibrosis that is hardened without tissue regeneration, leading to serious lung disease in many cases.
  • immunosuppressive agents eg, steroids, cytoxane
  • Fibrosis may be used interchangeably with fibrosis herein.
  • pulmonary fibrosis refers to a condition in which proliferation of fibrous connective tissue occurs in the lungs, resulting in destruction of normal lung structures and hardening and devastation of lung tissue.
  • pulmonary fibrosis is particularly problematic, in which proliferation of fibrous connective tissue appears around the alveolar wall and bronchioles.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • various cells such as alveolar macrophages, activated alveolar epithelial cells, fibroblasts, and myofibroblasts, and fibroblast proliferation and macrophages and fibroblasts
  • Pulmonary fibrosis of the present invention may include, but is not limited to, pulmonary fibrosis caused by or accompanying other lung diseases.
  • CPFE combined pulmonary fibrosis and emphysema
  • interstitial lung disease is also known as diffuse parenchymal lung disease (DPLD), proliferation of the lung interstitial compartment, infiltration of inflammatory cells and It is a generic term for diseases that are accompanied by fibrosis and show abnormal collagen deposition.
  • DPLD diffuse parenchymal lung disease
  • the interstitial lung disease is classified into occupational, environmental, anthropogenic, connective tissue disease, or idiopathic according to the cause.
  • PF-ILD Progressive Fibrosing Interstitial Lung Disease
  • IIP idiopathic interstitial pneumonia
  • NSIP Non-specific interstitial pneumonia
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • idiopathic pulmonary fibrosis is the most common disease among idiopathic interstitial pneumonia, and is defined as pulmonary fibrosis for which the exact cause is not identified.
  • pulmonary fibrosis After alveolar epithelial cells are damaged by repeated inflammatory reactions by various exposures, fibrosis is induced without normal wound healing, and pulmonary fibrosis is caused by complex interactions between genetic predisposition, environmental factors, and lung infection. known to go on.
  • fibroblasts/myofibroblasts proliferation of fibroblasts/myofibroblasts in the lungs by various factors secreted from damaged alveolar epithelial cells and infiltrated inflammatory cells, secretion and accumulation of collagen, and extracellular matrix (ECM) Excessive deposition is known as the pathogenesis.
  • ECM extracellular matrix
  • the triple activator of the present invention inhibits (i) myofibroblast differentiation; (ii) decreased expression of ⁇ -SMA, collagen1 ⁇ 1, or fibronectin; (iii) inhibition of epithelial mesenchymal transition (EMT) of alveolar epithelial cells; and (iv) reduced expression of collagen1 ⁇ 1 or collagen1 ⁇ 3, so it can inhibit and improve fibrosis, and lung diseases caused by or accompanied by fibrosis (eg, interstitial lung disease, progressive fibrotic epilepsy) It may have a preventive or therapeutic effect in sexual pulmonary disease, idiopathic interstitial pneumonia, non-specific interstitial pneumonia, pulmonary fibrosis, interstitial pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, complex pulmonary fibrosis and emphysema).
  • the triple activator according to the present invention can exhibit a therapeutic effect on coronavirus infection-19, and it is known that the pulmonary fibrosis symptom remains as a sequelae after being cured of coronavirus infection-19, and the triple activator of the present invention shows an effect of improving pulmonary fibrosis, so the triple activator may exhibit efficacy against pulmonary inflammation and/or pulmonary fibrosis caused by coronavirus infection-19.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in addition to mucolytic agents or a pharmaceutically acceptable salt thereof, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition is for co-administration of the triple active agent and the mucolytic agent, and the triple active agent and the mucolytic agent may be administered simultaneously, sequentially, or in reverse order, but is not limited thereto.
  • the term "combination" is to be understood as indicating simultaneous, separate or sequential administration. If the administration is sequential or separate, the interval between administration of the second component should be such that the beneficial effect of the combination is not lost.
  • the triple active agent and the mucolytic agent may be administered in combination as follows, but is not limited thereto:
  • the triple active agent and the mucolytic agent or a pharmaceutically acceptable salt thereof are in separate forms, the triple active agent and the mucolytic agent or a pharmaceutically acceptable salt thereof are formulated into separate formulations simultaneously, separately, sequentially, or in reverse order It may be administered as
  • combined administration does not only mean simultaneous administration, but also the triple active agent and the mucolytic agent or a pharmaceutically acceptable salt thereof act together on the subject so that each substance has a level equal to or higher than its original function. It should be understood as a dosage form capable of carrying out
  • the triple active agent and the mucolytic agent or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be mixed and administered together as one formulation, or the triple active agent and the mucolytic agent or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be separately administered. It may be formulated to be administered concurrently, sequentially, or in reverse order, but is not limited thereto. When formulated separately and administered in combination, each formulation may be administered by different routes, but is not limited thereto. In addition, although not limited thereto, the triple active agent and the mucolytic agent or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be separately formulated and included in one kit.
  • Pharmaceutically acceptable salts of mucolytic agents include salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases.
  • suitable acids include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
  • Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • mucolytic agents refers to drugs that promote the secretion, liquefaction, or discharge of sputum, sputum or mucus from the respiratory tract, in particular, until the mucus in the lungs is decomposed to dilute the respiratory secretions. A drug that only works.
  • the mucolytic agent may be used in combination with an expectorant.
  • mucolytic agent of the present invention include ambroxol, N-acetylcysteine, N-acetylin, carbocysteine, domiodol, fudosteine, bromhexine, erdosteine, letostine, lysozyme, mesna, sobrerol, stepronin, thio Pronin, tyloxapol, carbocisteine, dornase alfa, eprazinone, letosteine, neltenexine, and mecysteine ) may be any one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the combined administration of the triple activator and the mucolytic agent may exhibit a therapeutic effect on respiratory infectious diseases (eg, coronavirus infection-19). Since the triple activator of the present invention exhibits an effect of improving lung inflammation and pulmonary fibrosis, the combined administration of the triple activator and a mucolytic agent is a respiratory infection disease (eg, coronavirus infection-19 (COVID-19)), or It may show efficacy against pulmonary inflammation and pulmonary fibrosis.
  • a respiratory infection disease eg, coronavirus infection-19 (COVID-19)
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or diluent may be non-naturally occurring.
  • the term "pharmaceutically acceptable” means a sufficient amount to exhibit a therapeutic effect and does not cause side effects, and the type of disease, the patient's age, weight, health, sex, and the patient's sensitivity to the drug , administration route, administration method, frequency of administration, treatment period, combination or drugs used at the same time can be easily determined by those skilled in the art according to factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition including the peptide of the present invention may include a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the excipient is not particularly limited thereto, but in the case of oral administration, a binder, a lubricant, a disintegrant, a solubilizer, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a color, a fragrance, etc. may be used, and in the case of an injection, a buffer, a preservative, An analgesic agent, a solubilizer, an isotonic agent, a stabilizer, etc. may be mixed and used, and in the case of topical administration, a base, excipient, lubricant, preservative, etc. may be used.
  • the formulation of the composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with the pharmaceutically acceptable excipients as described above.
  • it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like, and in the case of injections, it may be prepared in the form of unit dose ampoules or multiple doses.
  • it can be formulated as a solution, suspension, tablet, pill, capsule, sustained-release preparation, and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil may be used.
  • it may further include a filler, an anti-aggregating agent, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, a preservative, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, freeze-dried preparations and suppositories may have the form of
  • composition is formulated in a dosage form suitable for administration in a patient's body according to a conventional method in the pharmaceutical field, specifically, a formulation useful for administration of a protein drug, and administration commonly used in the art.
  • the conjugate can be used by mixing with various pharmaceutically acceptable carriers such as physiological saline or organic solvents, and carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, ascorbic acid (ascorbic acid) in order to increase stability or absorption. acid) or antioxidants such as glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers, etc. may be used as agents.
  • pharmaceutically acceptable carriers such as physiological saline or organic solvents, and carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, ascorbic acid (ascorbic acid) in order to increase stability or absorption. acid) or antioxidants such as glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers, etc.
  • the prevention of lung disease comprising administering to an individual a pharmaceutical composition containing a peptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 102 or a long-acting conjugate thereof in a pharmaceutically effective amount treatment methods are provided.
  • the dosage and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as the active ingredient, along with several related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease.
  • the composition of the present invention may include, but is not limited to, the triple active agent or a long-acting conjugate including the same in a pharmaceutically effective amount.
  • the inclusion of the peptide or the long-acting conjugate in a pharmaceutically effective amount means the degree to which the desired pharmacological activity (for example, prevention, improvement or treatment of lung disease) can be obtained due to the triple activator or the long-acting conjugate, and , It may also mean a pharmaceutically acceptable level as a level that does not cause toxicity or side effects in the administered subject or is insignificant, but is not limited thereto. Such a pharmaceutically effective amount may be determined by comprehensively considering the number of administration, patient, formulation, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the component (active ingredient) in an amount of 0.01 to 99% by weight to volume.
  • the total effective amount of the composition of the present invention may be administered to a patient as a single dose, and may be administered by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered for a long period of time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the severity of the disease.
  • the preferred total dose of the triple active agent or long-acting conjugate thereof of the present invention may be about 0.0001 mg to 500 mg per kg of body weight of the patient per day.
  • the dose of the triple activator or its conjugate is determined by considering various factors such as the age, weight, health status, sex, severity of disease, diet and excretion rate of the patient as well as the administration route and number of treatments of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited in its formulation, administration route and administration method as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has excellent in vivo persistence and potency, and can significantly reduce the number and frequency of administration of the pharmaceutical preparation of the present invention.
  • Another aspect embodying the present invention is the triple activator (peptide) and / or a long-acting conjugate of the triple activator, or a composition comprising the same, comprising administering to an individual in need thereof, lung disease
  • a method of preventing or treating is provided.
  • triple activator and/or a long-acting conjugate of the triple activator, or a composition comprising the same, lung disease, prevention and treatment are the same as described above.
  • the subject is a subject suspected of lung disease
  • the subject suspected of lung disease refers to mammals including mice, livestock, etc. including humans that have or may develop the disease, but the triple activity of the present invention
  • Subjects that can be treated with the body and/or conjugate, or the composition comprising the same, are included without limitation.
  • it may be an individual having inflammation and/or fibrosis in the lung, or an individual having a pulmonary disease caused by or accompanied by inflammation and/or fibrosis, but is not limited thereto.
  • the term "administration” means introducing a predetermined substance to a patient by any suitable method, and the route of administration of the composition is not particularly limited thereto, but any general route through which the composition can reach an in vivo target It may be administered through, for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, or rectal administration.
  • routes of administration of the composition is not particularly limited thereto, but any general route through which the composition can reach an in vivo target It may be administered through, for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, or rectal administration.
  • the method of the present invention may include administering a pharmaceutical composition comprising the triple active agent or a long-acting conjugate thereof in a pharmaceutically effective amount.
  • a suitable total daily amount may be determined by the treating physician within the scope of sound medical judgment, and may be administered once or divided into several doses.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient depends on the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used, if necessary, the specific composition, the patient's age, weight, general health, It is preferable to apply differently depending on various factors including sex and diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, drugs used together or concurrently with a specific composition, and similar factors well known in the pharmaceutical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered once a week, once every 2 weeks, or once every 4 weeks, but is not limited thereto.
  • a triple active agent (peptide) and/or a long-acting conjugate of the triple active agent, or a composition comprising the same, and a mucolytic agent or a pharmaceutically acceptable salt thereof are simultaneously administered. , sequentially, or in the reverse order, but is not limited thereto.
  • the combined administration is the same as described above.
  • Another embodiment embodying the present invention is the use of a composition comprising the triple active agent or a long-acting conjugate thereof in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of lung disease.
  • triple activator and/or its conjugate, or a composition comprising the same, lung disease, prevention and treatment are the same as described above.
  • Another aspect embodying the present invention is to provide the use of the triple active agent or a long-acting conjugate thereof, or a composition comprising the same for the prevention or treatment of lung disease.
  • triple activator and/or its conjugate, or a composition comprising the same, lung disease, prevention and treatment are the same as described above.
  • the use of the present invention for the prevention or treatment of lung diseases is for the combined administration of a triple active agent (peptide) and/or a long-acting conjugate of the triple active agent, or a composition comprising the same, and a mucolytic agent or a pharmaceutically acceptable salt thereof. may be used, but is not limited thereto.
  • the combined administration is the same as described above.
  • an amino acid denoted by X is a non-natural amino acid Aib (2-aminoisobutyric acid), and an underlined amino acid means that the underlined amino acids form a ring with each other.
  • CA means 4-imidazoacetyl (4-imidazoacetyl)
  • Y means tyrosine.
  • reaction was performed under an environment in which 20 to 60% isopropanol was added to 50 mM Tris buffer (pH 7.5). After completion of the reaction, the reaction solution was applied to SP Sepharose HP (GE healthcare, USA) to purify the tri-activator mono-pegylated to cysteine.
  • SP Sepharose HP GE healthcare, USA
  • the purified mono-pegylated tri-activator and immunoglobulin Fc (homodimer of SEQ ID NO: 139) were mixed at a molar ratio of 1:1 to 5 and a protein concentration of 10 to 50 mg/ml at 4 to 8°C. reacted for 12 to 18 hours.
  • the reaction was carried out in an environment in which 10 to 50 mM sodium cyanoborohydride and 10 to 30% isopropanol as reducing agents were added to 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0).
  • This purified long-acting conjugate has a structure in which a triple active peptide, a polyethylene glycol (PEG) linker and an Fc dimer are covalently linked in a molar ratio of 1:1:1, and the PEG linker is one of the two polypeptide chains of the Fc dimer. connected to only one chain.
  • PEG linker is one of the two polypeptide chains of the Fc dimer. connected to only one chain.
  • two monomers having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 139 form a homodimer through a disulfide bond between cysteine, which is the 3rd amino acid of each monomer, and the monomer of the homodimer Each independently formed an internal disulfide bond between cysteines at positions 35 and 95 and an internal disulfide bond between cysteines at positions 141 and 199.
  • a conjugate in which the triple activator of SEQ ID NO: 21 and immunoglobulin Fc are linked through a PEG linker was termed a 'conjugate comprising SEQ ID NO: 21 and immunoglobulin Fc' or a 'continuous conjugate of SEQ ID NO: 21'. It may be used interchangeably herein.
  • conjugate in which the triple activator of SEQ ID NO: 22 and the immunoglobulin Fc are linked through a PEG linker was designated as a 'conjugate comprising SEQ ID NO: 22 and immunoglobulin Fc' or a 'continuous conjugate of SEQ ID NO: 22', which It may be used interchangeably herein.
  • conjugate in which the triple activator of SEQ ID NO: 42 and the immunoglobulin Fc are linked via PEG was designated as a 'conjugate comprising SEQ ID NO: 42 and immunoglobulin Fc' or a 'continuous conjugate of SEQ ID NO: 42'. may be used interchangeably.
  • conjugate in which the triple activator of SEQ ID NO: 43 and the immunoglobulin Fc are linked through PEG was designated as a 'conjugate comprising SEQ ID NO: 43 and immunoglobulin Fc' or a 'continuous conjugate of SEQ ID NO: 43'.
  • a 'conjugate comprising SEQ ID NO: 43 and immunoglobulin Fc' or a 'continuous conjugate of SEQ ID NO: 43'.
  • a conjugate in which the triple activator of SEQ ID NO: 50 and immunoglobulin Fc are linked via PEG was designated as a 'conjugate comprising SEQ ID NO: 50 and immunoglobulin Fc' or a 'continuous conjugate of SEQ ID NO: 50'. may be used interchangeably.
  • conjugate in which the triple activator of SEQ ID NO: 77 and the immunoglobulin Fc are linked through PEG was designated as a 'conjugate comprising SEQ ID NO: 77 and an immunoglobulin Fc' or a 'persistent conjugate of SEQ ID NO: 77'.
  • a 'conjugate comprising SEQ ID NO: 77 and an immunoglobulin Fc' or a 'persistent conjugate of SEQ ID NO: 77'.
  • conjugate in which the triple activator of SEQ ID NO: 96 and the immunoglobulin Fc are linked through PEG was designated as a 'conjugate comprising SEQ ID NO: 96 and immunoglobulin Fc' or a 'continuous conjugate of SEQ ID NO: 96'. may be used interchangeably.
  • Each of the above cell lines was transformed to express human GLP-1 receptor, human GCG receptor and human GIP receptor genes in Chinese hamster ovary (CHO), respectively, and is suitable for measuring the activities of GLP-1, GCG and GIP. Therefore, the activity for each part was measured using each transformed cell line.
  • Human GLP-1 was serially diluted from 50 nM to 0.000048 nM by 4 times to measure the GLP-1 activity of the triple activator and its long-acting conjugate prepared in Examples 1 and 2, and in Examples 1 and 2
  • the prepared triple activator and its long-acting conjugate were serially diluted from 400 nM to 0.00038 nM by 4 times.
  • the culture medium was removed from the cultured CHO cells expressing the human GLP-1 receptor, 5 ⁇ l of each serially diluted substance was added to the cells, and then 5 ⁇ l of a buffer containing cAMP antibody was added for 15 minutes. during incubation at room temperature.
  • Human GCG was serially diluted from 50 nM to 0.000048 nM by 4 times in order to measure the GCG activity of the triple activator and the long-acting conjugate prepared in Examples 1 and 2, and the triple activity prepared in Examples 1 and 2
  • the sieve and its long-acting conjugate were serially diluted from 400 nM to 0.00038 nM in 4-fold increments.
  • the culture medium was removed from the cultured CHO cells expressing the human GCG receptor, 5 ⁇ l of each serially diluted substance was added to the cells, and 5 ⁇ l of a buffer containing cAMP antibody was added thereto, followed by room temperature for 15 minutes.
  • human GIP was serially diluted from 50 nM to 0.000048 nM by 4 times, and the triple activity prepared in Examples 1 and 2 above.
  • the sieve and its long-acting conjugate were serially diluted from 400 nM to 0.00038 nM in 4-fold increments.
  • the culture medium was removed from the cultured CHO cells expressing the human GIP receptor, 5 ⁇ l of each serially diluted substance was added to the cells, and 5 ⁇ l of a buffer containing cAMP antibody was added thereto, followed by room temperature for 15 minutes.
  • the novel triple activator long-acting conjugate prepared above has a function as a triple activator capable of activating all of the GLP-1 receptor, GIP receptor and glucagon receptor, and thus can be used as a therapeutic agent for lung diseases.
  • C57BL/6 mice (ORIENT Bio, Busan, Korea) treated with ELA 0.2U/mouse were treated with an excipient control group, the long-acting conjugate of SEQ ID NO: 42 (hereinafter, triple-activator long-acting conjugate; 6.5 nmol/kg) , Q2D, subcutaneous) administration group, and anti-inflammatory and COPD treatment roflumilast (10 mg/kg, QD, oral) administration group, and repeated administration was performed for 3 weeks. Thereafter, the degree of change in the expression of inflammatory cytokines in the lung tissue according to the administration of the excipient, the triple-activator long-acting conjugate, and roflumilast was confirmed through qPCR.
  • Statistical treatment evaluated the efficacy of triple-activator long-acting conjugates using one-way ANOVA (* ⁇ ** p ⁇ 0.05 ⁇ 0.01).
  • the triple activator long-acting conjugate of the present invention has the effect of suppressing and improving inflammation in the lungs.
  • the present inventors tried to confirm whether the triple activator long-acting conjugate could exhibit in vivo therapeutic effects on emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD), which are typical lung diseases and diseases caused by lung inflammation.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • an animal model in which chronic obstructive pulmonary disease was induced by damage to lung tissue by intratracheal administration of elastase was used.
  • C57BL/6 mice (ORIENT Bio, Busan, Korea) treated with elastase at 0.2 U/meat were treated with COPD mice as excipient control group, triple activator long-acting conjugate (6.5 nmol/kg, Q2D, subcutaneous) administration group.
  • the triple activator long-acting conjugate of the present invention exhibits an effect of improving inflammation and emphysema in lung tissue, thereby having excellent therapeutic efficacy for chronic obstructive pulmonary disease.
  • the triple activator long-acting conjugate according to the present invention also has an effect of improving lung fibrosis. Therefore, the effect on the differentiation of lung fibroblasts into myofibroblasts and the epithelial mesenchymal transition (EMT) of alveolar epithelial cells, which are known to be important in the lung fibrosis process, was confirmed.
  • EMT epithelial mesenchymal transition
  • the MRC5 cell line which is a lung fibroblast
  • the A549 cell line which is an alveolar epithelial cell
  • MRC5 cells which are lung fibroblasts, were divided into a vehicle-treated group and a triple activator long-acting conjugate-treated group, and TGF- ⁇ 1 was co-treated to induce differentiation into myofibroblasts.
  • TGF- ⁇ 1 was co-treated to induce differentiation into myofibroblasts.
  • a negative control group a group that was not treated with both TGF- ⁇ 1 and the triple activator long-acting conjugate was used.
  • A549 cells were divided into an excipient-treated group and a triple-activator long-acting conjugate-treated group and pre-treated, followed by sequential treatment with TGF- ⁇ 1 and LPS to induce EMT.
  • a negative control group a group not treated with the triple activator long-acting conjugate, TGF- ⁇ 1, and LPS was used.
  • bleomycin mice were used.
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • BLM bleomycin mice
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • bleomycin mice were used.
  • bleomycin When bleomycin is administered intratracheally, it is known that an epithelial-mesenchymal transition occurs by damaging the DNA of alveolar epithelial cells, and idiopathic fibrosis is induced.
  • the survival rate of the mouse is reduced due to severe lung damage due to idiopathic fibrosis.
  • IPF mice treated with BLM 1.5U/head in C57BL/6 mice were treated with a vehicle control group, a triple activator long-acting conjugate (3.9 nmol/kg, Q2D, subcutaneous) group, and pirfenidone (pirfenidone). ; 300 mg/kg, QD, oral) administration group, and ambroxol (45 mg/kg, BID, intraperitoneal) administration group, and repeated administration was performed for 2 weeks. After repeated administration for 2 weeks, lung tissue of each mouse was taken as an autopsy, and the degree of fibrosis in the lung tissue was evaluated by masson trichrome staining. Statistical treatment evaluated the efficacy of triple-activator long-acting conjugates using one-way ANOVA (* ⁇ *** p ⁇ 0.05 ⁇ 0.001)
  • IPF mice treated with BLM 3.0U/head to C57BL/6 mice were treated with a vehicle control group, a triple activator long-acting conjugate (3.9 nmol/kg, Q2D, subcutaneous) administration group, pirfeni It was divided into a don (300 mg/kg, QD, oral) administration group and amboroxol (45 mg/kg, BID, intraperitoneal) administration group, and repeated administration was performed for 2 weeks, and the survival rate during repeated administration was confirmed.
  • the long-acting conjugate of the triple activator had a therapeutic effect on pulmonary fibrosis or idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), thereby improving the survival rate.
  • the triple activator long-acting conjugate according to the present invention can improve lung fibrosis by inhibiting myofibroblast differentiation of pulmonary fibroblasts and EMT of alveolar epithelial cells, and also in vivo through the effect of improving lung fibrosis. It was confirmed that fibrosis, particularly idiopathic pulmonary fibrosis, could be effective in preventing and treating.
  • the triple activator conjugates of the present invention can effectively prevent or treat related lung diseases through improvement of lung inflammation and pulmonary fibrosis, meaning that they can be provided as new therapeutic agents for lung diseases. do.

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Abstract

본 발명은 글루카곤, GLP-1 및 GIP 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체 및/또는 이의 결합체의 폐 질환에 대한 예방 또는 치료적 용도에 관한 것이다.

Description

글루카곤, GLP-1 및 GIP 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 지속형 결합체의 폐질환의 치료 용도
본 발명은 글루카곤, GLP-1 및 GIP 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체 및/또는 이의 결합체의 폐질환에 대한 예방 또는 치료적 용도에 관한 것이다.
폐는 호흡을 주로 담당하는 기관으로서, 유해 물질, 바이러스, 면역 이상 등으로 인해 폐 질환이 발병한다. 폐 질환은 폐 기능 감소와 호흡 불편 등을 야기하기 때문에 발병 원인에 따른 적절한 치료가 요구된다.
폐와 관련된 질환으로는 간질성폐질환, 진행성 섬유화 간질성 폐 질환, 특발성 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴, 폐섬유증, 간질성 폐섬유증, 특발성 폐섬유증, 폐포염, 폐렴, 폐기종, 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 복합 폐 섬유화와 폐기종(CPFE), 천식, 그리고 호흡기 감염 질환(예를 들어, 코로나 바이러스 감염증 (COVID-19))을 들 수 있다. 이러한 폐 질환은 서로 연관되어 여러 증상이 혼재되어 나타나므로, 치료제 선택에 주의가 필요하다고 알려져 있다. 폐 질환의 주요 발병 기전으로는 폐 손상 및 염증 반응, 그리고 섬유화를 들 수 있다.
구체적으로, 폐에서 바이러스, 미생물, 유해 물질 등으로 인한 염증 반응이 일어나면 폐포의 대식세포에 의한 염증 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6, TNF- α) 분비, 호중구의 유인, 프로테아제 분비 등이 진행되고, 폐 조직을 구성하는 섬유를 분해하는 프로테아제(예를 들어, 엘라스타제)의 분비로 인해 폐 조직의 탄력성 및 구조가 손상되어 폐의 섬유화로 이어지는 것으로 알려져 있다. 폐의 염증과 섬유화는 많은 폐질환의 진행 과정에서 선행되므로, 폐질환의 예방 및 치료에 있어 근본적인 기전이라 할 수 있다.
폐 섬유증은 폐 질환의 대표적인 예로서, 섬유증 (fibrosis)은 기관 또는 조직에서 과도한 섬유질 결합조직을 형성하는 질환이다. 섬유증은 인체 내에서 조직이 여러 가지 스트레스 (감염, 화학적 자극, 방사선 등)에 의한 손상을 받은 후 창상 치유(wound healing) 과정 중에 정상적인 통제가 불가능한 상태를 말한다. 섬유증은 폐, 심장, 간 등 다양한 장기에 발생하며 아직까지 근본적인 치료제가 개발되지 않아 미충족 수요가 높은 분야 중 하나다.
원인 불명의 섬유성 간질성 폐렴이 만성적으로 진행되는, 원인이 알려지지 않은 폐섬유증 중 하나인 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)은 폐포 상피세포의 지속적인 손상에 의한 섬유화가 진행되는 질병으로 피르페니돈(pirfenidone)과 닌테다닙(nintedanib) 약물 투여에 따른 치료 방법이 연구되어 왔으나, 식욕 감소, 위약감, 소화기계 부작용, 간독성 가능성, 광과민성 발진 등의 부작용이 알려져 있다.
또한, 폐질환의 다른 대표적인 예인 만성 폐쇄성　폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease,　COPD)은　담배, 대기 오염 또는 독성 흡입 물질에 의해 폐의 비정상적인 염증 반응으로 기도가 좁아지면서 서서히 기도 폐쇄가 일어나는 질환을 의미하며 크게 만성 기관지염과 폐기종(emphysema)으로 나뉜다. 특히 흡연이 만성 폐쇄성　폐 질환의 주요 원인으로 알려져 있다. 흡연은　폐 조직 내 강력한 자극물질로 작용하여, 다양한 전염증 인자, 성장 인자, 산화 물질 및 화학주성 인자들의 생성을 증가시키며, 염증성 신호 전달 체계를 활성화시켜 호중구 및 대식세포를 비롯한 많은 염증세포의 유주를 촉진시켜　폐염증을 더욱 악화시키고 이는 결국　폐조직의 비정상적인 변화, 이를테면 기도벽의 비후,　폐섬유화를 야기하여　폐기능을 저하시킨다. 이에, 만성폐쇄성　폐질환의 예방 및　치료를 위해 폐 염증 개선이 하나의 치료 방법으로서 이해되고 있다.
폐질환의 다른 대표적인 예로는 최근 발병하고 있는 신종 코로나 바이러스(2019-nCoV 혹은 SARS-CoV-2) 감염에 따른 폐손상 및 이에 따른 급성 호흡기 질환(COVID-19)이 있다. 호흡기를 통해 전파되는 신종 코로나 바이러스는 type II 폐포 상피세포에서 주로발현하는 ACE2, TMPRSS2를 통해 세포내로 침투하기 때문에 폐가 주요 취약 장기 (organ)로 알려져있다. 주요증상으로는 발열, 기침 등이 있고 건강한 성인은 시간이 지나면 회복될 가능성이 크다. 하지만, 초기 면역력이 떨어져 폐에 해당 바이러스 감염이 심하게 일어난 경우에는 폐 손상에 따른 심각한 염증반응을 유발, 섬유화 진행이 촉진되어 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 및 폐혈증 등과 같은 증상을 수반할 수 있다고 알려져있다. 현재 COVID-19 치료는 바이러스의 감염 및 증식을 억제시키거나, 폐 염증을 조절하는 약물이 주로 사용되고 있다. 이에 COVID-19의 예방 및　치료를 위해 폐 염증 및 섬유화 개선이 하나의 치료 방법으로서 이해되고 있다.
이와 같이 폐 염증 및 섬유화는 폐 질환의 발병 및 발전의 주요한 원인이 되므로, 폐 염증 및 섬유화 개선은 여러 폐 질환의 치료 기전으로서 연구되어 오고 있다.
한편, GLP-1(Glucagon-like peptide-1) 및 GIP(Glucose-dependent insuliontropic polypeptide)는 대표적인 위장 호르몬이자 신경 호르몬으로서 음식물 섭취에 따른 혈중 당성분 조절에 관여하는 물질이다. 글루카곤(Glucagon)은 췌장에서 분비되는 펩타이드 호르몬으로 전술한 두 물질과 함께 혈중 당 농도 조절 작용에 관여한다. GLP-1 수용체, GIP 수용체, 및 글루카곤 수용체에 각각 또는 동시에 활성을 나타낼 수 있는 약물을 이용한 치료제 개발이 이루어 지고 있다 (US 10,370,426, US 10,400,020).
현재까지 폐질환에 대한 다양한 연구가 진행되고 있으나, 실질적이고 효과적인 치료제의 개발은 미비한 상태인 바, 지속적인 치료제의 개발의 필요성이 있다.
본 발명의 하나의 목적은 글루카곤 수용체, GLP-1 수용체 및 GIP 수용체에 대해 활성을 갖는 펩타이드 또는 이러한 펩타이드의 지속형 결합체를 포함하는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 이러한 펩타이드의 지속형 결합체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폐 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 상기 펩타이드 또는 이러한 펩타이드의 지속형 결합체를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 글루카곤 수용체, GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) 수용체, 및 GIP (Glucose-dependent insulinotropic polypeptide) 수용체에 대해 활성을 갖는 펩타이드를 포함하는 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.
하나의 구체예로서, 상기 폐 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물은, 약학적으로 허용되는 부형제와 서열번호 1 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 약학적 유효량으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물로서, 상기 펩타이드는 지속형 결합체의 형태이고, 상기 지속형 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
X - L - F
단 이 때 X는 서열번호 1 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열의 펩타이드이고;
L은 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커이며,
F는 면역글로불린 Fc 영역이고,
-는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타낸다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 펩타이드는 그 C-말단이 아미드화된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 펩타이드는 이의 C-말단이 아미드화되거나 또는 자유 카르복실기(-COOH)를 갖는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 펩타이드는 서열번호 21, 22, 42, 43, 50, 64, 66, 67, 70, 71, 76, 77, 96, 97과 100으로 이루어진 군으로부터 선택하는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 펩타이드는 서열번호 21, 22, 42, 43, 50, 77과 96으로 이루어진 군으로부터 선택하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 펩타이드 서열은 N-말단으로부터 16번 아미노산과 20번 아미노산은 서로 고리를 형성하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 L 내의 에틸렌글리콜 반복 단위 부분의 화학식량은 1 내지 100 kDa 범위에 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 F는 IgG Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 폐 질환은 간질성 폐질환(interstitial lung disease, ILD), 진행성 섬유화 간질성 폐 질환(progressive fibrosing Interstitial Lung Disease, PF-ILD), 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonias, IIP), 비특이성 간질성 폐렴(non-specific interstitial pneumonia, NSIP), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 간질성 폐섬유증(fibrosing interstitial lung diseases, FILD), 특발성 폐섬유증 (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), 폐포염 (alveolitis), 폐렴(pneumonia), 폐기종(emphysema), 기관지염(bronchitis), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 복합 폐 섬유화와 폐기종(combined pulmonary fibrosis and emphysema, CPFE), 천식(asthma), 또는 호흡기 감염 질환인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 호흡기 감염 질환은 호흡기 바이러스, 세균, 마이코플라즈마(mycoplasma), 또는 진균 감염 질환인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 호흡기 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 헤르페스 단순 바이러스(herpes simplex virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 라이노 바이러스(rhinovirus), 수두바이러스(varicella Zoster Virus), 홍역 바이러스(measle virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratorysyncytial virus), 뎅기바이러스(Dengue virus), HIV(human immunodeficiency virus), 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스(coronavirus), 중증급성 호흡기 증후군 바이러스(severe acute respiratory syndrome associated virus; SARS-associated virus), 및 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(middle east respiratory syndrome coronavirus; MERS-CoV)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 투여시 (i) 대식세포(macrophage) 활성 저해, 및/또는 (ii) IL-1β, IL-6, IL-12, 또는 TNF-α 의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 투여 시 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 한다:
(i) 근섬유아세포(myofibroblast) 분화 저해;
(ii) α-SMA, collagen1α1, 또는 fibronectin의 발현 감소; 또는
(iii) 폐포상피세포(alveolar epithelial cell)의 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition, EMT) 저해; 및
(iv) collagen1α1, 또는 collagen1α3의 발현 감소
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 점액용해제(mucolytic agents) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 추가로 투여되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 점액용해제는 암브록솔(ambroxol), N-아세틸시스테인(N-acetylcystein), N-아세틸린(N-acetylin), 카르보시스테인(carbocysteine), 도미오돌 (domiodol), 푸도스테인(fudosteine), 브롬헥신(bromhexine), 엘도스테인(erdosteine), 레토스틴 (letostine), 리소자임 (lysozyme), 메스나 (mesna), 소브레롤 (sobrerol), 스테프로닌 (stepronin), 티오프로닌 (tiopronin), 틸록사폴 (tyloxapol), 카보시스테인(carbocisteine), 도르나제 알파 (dornase alfa), 에프라지논 (eprazinone), 레토스테인 (letosteine), 넬테넥신 (neltenexine), 및 메시스테인(mecysteine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 펩타이드와 점액용해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 동시, 순차, 또는 역순으로 투여되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 폐 질환은 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)에 의한 폐 염증 및 섬유증인 것을 특징으로 할 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 영역 F는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이합체이며, L의 한 말단이 상기 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩티드 사슬에만 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐 질환의 예방 또는 치료 방법이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 폐 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 상기 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물의 용도이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 폐 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물의 용도이다.
본 발명에 따른 삼중 활성체 또는 이의 지속형 결합체는 글루카곤 수용체, GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) 수용체, 및 GIP (Glucose-dependent insulinotropic polypeptide) 수용체에 대해 활성을 가져, 폐 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 삼중활성체 지속형 결합체 처리에 따른 폐 조직 내 염증성 사이토카인 발현 수준 변화를 in vivo에서 확인한 도이다.
도 2는 삼중활성체 지속형 결합체 처리에 따른 폐기종 개선 효과를 in vivo에서 확인한 도이다.
도 3은 삼중활성체 지속형 결합체의 처리에 따른 폐섬유아세포(lung fibroblast, MRC5 cell)에서의 근섬유아세포(myofibroblast) 분화 마커(α-SMA, collagen1α1, fibronectin) 발현 수준 변화를 확인한 도이다.
도 4는 삼중활성체 지속형 결합체의 처리에 따른 폐포상피세포(lung alveolar epithelial cell, A549 cell)에서의 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition, EMT) 마커(collagen1α1, collagen1α3) 발현 수준 변화를 확인한 도이다.
도 5는 삼중활성체 지속형 결합체 처리에 따른 BLM 마우스 폐 조직 섬유화 개선 효과를 in vivo에서 확인한 도이다.
도 6은 삼중활성체 지속형 결합체 처리에 따른 BLM 마우스의 생존률 변화를 확인한 도이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib (2-아미노이소부티르산, 2-aminoisobutyric acid), Sar (N-methylglycine), 알파-메틸-글루탐산 (α-methyl-glutamic acid) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
알라닌 Ala, A 아르기닌 Arg,R
아스파라긴 Asn, N 아스파르트산 Asp, D
시스테인 Cys, C 글루탐산 Glu, E
글루타민 Gln, Q 글리신 Gly, G
히스티딘 His, H 이소류신 Ile, I
류신 Leu, L 리신 Lys, K
메티오닌 Met, M 페닐알라닌 Phe, F
프롤린 Pro, P 세린 Ser, S
트레오닌 Thr, T 트립토판 Trp, W
티로신 Tyr, Y 발린 Val, V
본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는 글루카곤 수용체, GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) 수용체, 및 GIP (Glucose-dependent insulinotropic polypeptide) 수용체에 대해 활성을 갖는, 펩타이드를 포함하는, 폐 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.
하나의 구현예로, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또 하나의 구현예로, 상기 폐 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제와 서열번호 1 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 약학적 유효량으로 포함하는 약학적 조성물일 수 있다.
상기 "글루카곤 수용체, GLP-1 수용체, 및 GIP 수용체에 대해 활성을 갖는, 펩타이드"는 본 발명에서 "삼중 활성체”라는 명칭으로도 혼용되어 사용될 수 있다.
이러한 펩타이드는 글루카곤, GLP-1, 및 GIP 수용체에 대해 유의한 수준의 활성을 가지는 다양한 물질, 예컨대 다양한 펩타이드를 포함한다.
특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 글루카곤, GLP-1, 및 GIP 수용체에 대해 유의한 수준의 활성을 가지는 삼중 활성체는 글루카곤, GLP-1, 및 GIP 수용체 중 하나 또는 그 이상의 수용체, 구체적으로 둘 또는 그 이상의 수용체, 보다 구체적으로 세 개의 수용체 모두에 대해 in vitro 활성이 해당 수용체의 천연형 리간드 (천연형 글루카곤, 천연형 GLP-1, 및 천연형 GIP) 대비 약 0.001%이상, 약 0.01% 이상, 약 0.1% 이상, 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 3 % 이상, 약 4% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10 % 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50 % 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상을 나타낼 수 있으나, 유의적으로 증가한 범위는 제한 없이 포함된다.
여기서, 수용체에 대한 활성은, 천연형 대비 수용체에 대한 in vitro 활성이 0.1% 이상, 1% 이상, 2% 이상, 3 % 이상, 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10 % 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50 % 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90 % 이상, 100% 이상, 약 200% 이상을 나타내는 경우를 예로 들 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 삼중 활성체의 in vitro 활성을 측정하는 방법은 본원 명세서의 실험예 1을 참조할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 펩타이드는 하기 i) 내지 iii) 중 하나 이상, 둘 이상, 구체적으로 세 개의 활성을 보유하는 것, 구체적으로 유의한 활성을 보유하는 것을 특징으로 한다:
i) GLP-1 수용체의 활성화; ii) 글루카곤 수용체의 활성화; 및 iii) GIP 수용체의 활성화.
여기서, 수용체를 활성화시킨다는 것은, 천연형 대비 수용체에 대한 in vitro 활성이 약 0.1% 이상, 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 3 % 이상, 약 4% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10 % 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50 % 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90 % 이상, 약 100% 이상을 나타내는 경우를 예로 들 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 펩타이드는 천연형 GLP-1, 천연형 글루카곤 및 천연형 GIP 중 어느 하나 대비 체내 반감기가 증가된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 이러한 상기 펩타이드는 비자연적으로 발생된 (non-naturally occurring) 것일 수 있다.
상기 펩타이드는 천연형 글루카곤의 아날로그일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 천연형 글루카곤 아날로그는 천연형 글루카곤과 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 차이가 있는 펩타이드, 천연형 글루카곤 서열의 개질 (modification)을 통하여 변형시킨 펩타이드, 천연형 글루카곤의 모방체를 포함한다.
한편, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 천연형 글루카곤은 다음의 아미노산 서열을 가질 수 있다:
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (서열번호: 118)
구체적으로, 상기 펩타이드는 천연형 글루카곤 서열에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환 (substitution), 추가 (addition), 제거 (deletion), 수식 (modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난, 천연형 글루카곤의 아날로그일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 아미노산의 치환은 아미노산으로의 치환이나 비 천연형 화합물로의 치환을 모두 포함한다.
또한, 추가는 펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단에 이루어질 수 있다. 한편, 추가되는 아미노산의 길이는 특별히 이에 제한되지 않으며, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상의 아미노산이 추가될 수 있으며, 넓게는 폴리펩타이드의 추가를 포함하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 펩타이드는 천연형 글루카곤 아미노산 서열에서 1번, 2번, 3번, 7번, 10번, 12번, 13번, 14번, 15번, 16번, 17번, 18번, 19번, 20번, 21번, 23번, 24번, 27번, 28번 및 29번으로 이루어진 군에서 선택된, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 또는 20개의 아미노산이 다른 아미노산이 치환된 것일 수 있으며, 또한 독립적으로 또는 추가적으로 이의 C-말단에 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11개 이상의 아미노산이 추가된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 더 구체적으로 상기 펩타이드는 천연형 글루카곤 아미노산 서열에서 1번, 2번, 3번, 10번, 12번, 13번, 14번, 15번, 16번, 17번, 18번, 19번, 20번, 21번, 23번, 24번, 27번, 28번 및 29번으로 이루어진 군에서 선택된, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19개의 아미노산이 다른 아미노산이 치환된 것일 수 있으며, 또한 독립적으로 또는 추가적으로 이의 C-말단에 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 또는 11개 이상의 아미노산이 추가된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 더 구체적으로 상기 펩타이드는 천연형 글루카곤 아미노산 서열에서 1번, 2번, 3번, 10번, 13번, 14번, 15번, 16번, 17번, 18번, 19번, 20번, 21번, 23번, 24번, 28번 및 29번으로 이루어진 군에서 선택된, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17개의 아미노산이 다른 아미노산이 치환된 것일 수 있으며, 또한 독립적으로 또는 추가적으로 이의 C-말단에 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 또는 11개 이상의 아미노산이 추가된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 더 구체적으로 상기 펩타이드는 천연형 글루카곤 아미노산 서열에서 1번, 2번, 13번, 16번, 17번, 18번, 19번, 20번, 21번, 23번, 24번, 27번, 28번 및 29번으로 이루어진 군에서 선택된, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12이상, 13이상, 또는 14개의 아미노산이 다른 아미노산이 치환된 것일 수 있으며, 또한 독립적으로 또는 추가적으로 이의 C-말단에 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11개 이상의 아미노산이 추가된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 도입되는 아미노산은 티로신, 알파-메틸-글루탐산, Aib, 메티오닌, 글루탐산, 히스티딘, 리신, 류신, 이소류신, 글루타민, 발린, 글리신, 알라닌, 시스테인, 세린, 알라닌, 아스파르트산, 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 상기 추가되는 아미노산 서열은 천연형 GLP-1, 천연형 GIP, 또는 천연형 엑센딘-4 아미노산 서열에서 유래되는 1개 이상의 아미노산 서열일 수 있다.
이러한 펩타이드는 분자 내 가교 (intramolecular bridge)를 포함할 수 있으며 (예컨대, 공유결합적 가교 또는 비공유결합적 가교), 구체적으로 고리를 포함하는 형태일 수 있으며, 예컨대 펩타이드의 16번 및 20번 아미노산 사이에 고리가 형성된 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 고리의 비제한적인 예로 락탐 가교 (또는 락탐 고리)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 고리를 포함하도록, 목적하는 위치에 고리를 형성할 수 있는 아미노산을 포함하도록 변형된 것을 모두 포함한다.
예컨대, 펩타이드의 16번 및 20번 아미노산 쌍이 각각 고리를 형성할 수 있는 글루탐산 또는 리신으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 고리는 상기 펩타이드 내의 아미노산 곁 사슬 간에 형성될 수 있으며, 그 예로 리신의 곁 사슬과 글루탐산의 곁 사슬 간에 락탐 고리가 형성되는 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 방법들의 조합으로 제조되는 펩타이드의 예로, 천연형 글루카곤과 아미노산 서열이 하나 이상 다르고, N-말단의 아미노산 잔기의 알파-탄소가 제거된, 글루카곤 수용체, GLP-1 수용체, 및 GIP 수용체에 대해 활성을 보유한 펩타이드 등이 있으나, 이에 제한되지 않으며, 아날로그 제조를 위한 여러 방법들의 조합으로 본 발명에 적용되는 펩타이드를 제조할 수 있다.
또한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 펩타이드는 체내 반감기의 증가를 위해 활성체 분해 효소의 인식작용을 회피하기 위하여 일부 아미노산을 타 아미노산 혹은 비 천연형 화합물로 치환할 수 있다.
구체적으로, 상기 펩타이드의 아미노산 서열 중 두 번째 아미노산 서열의 치환을 통해 분해효소의 인식 작용을 회피하여 체내 반감기를 증가시킨 펩타이드일 수 있으나, 체내 분해 효소의 인식 작용을 회피하기 위한 아미노산 치환 또는 변경은 제한 없이 포함된다.
또한, 펩타이드 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질, 예를 들어 측쇄 작용기의 변형, 분자 내 공유결합, 예컨대, 측쇄 간 고리 형성, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 인산화, 아미노헥산화, 바이오틴화 등과 같이 개질함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.
또한, 천연형 글루카곤의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하다.
아미노산 유도체도 마찬가지 방식으로 입수할 수 있는데, 그 예를 일부만 들자면 4-이미다조아세트산 (4-imidazoacetic acid) 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 및/또는 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다.
특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화 (acetylation) 및/또는 C-말단을 아미드화 (amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 펩타이드 그 자체, 이의 염 (예컨대, 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함한다. 또한, 펩타이드는 약학적으로 허용되는 임의의 형태일 수 있다.
상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산，벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
하나의 구체예로서, 상기 펩타이드는 하기 일반식 1로 표시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Gly-Thr-Phe-Xaa7-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-R1 (일반식 1, 서열번호 103)
상기 일반식 1에서,
Xaa1은 히스티딘, 4-이미다조아세틸, 또는 티로신이고,
Xaa2는 글리신, 알파-메틸-글루탐산, 또는 Aib이며,
Xaa3은 글루탐산 또는 글루타민이고,
Xaa7은 트레오닌 또는 이소류신이며,
Xaa10은 류신, 티로신, 리신, 시스테인, 또는 발린이고,
Xaa12는 리신, 세린, 또는 이소류신이며,
Xaa13은 글루타민, 티로신, 알라닌, 또는 시스테인이고,
Xaa14는 류신, 메티오닌, 또는 티로신이며,
Xaa15는 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 또는 류신이며,
Xaa16은 글리신, 글루탐산, 또는 세린이고,
Xaa17은 글루타민, 아르기닌, 이소류신, 글루탐산, 시스테인, 또는 리신이며,
Xaa18은 알라닌, 글루타민, 아르기닌, 또는 히스티딘이고,
Xaa19는 알라닌, 글루타민, 시스테인, 또는 발린이며,
Xaa20은 리신, 글루타민, 또는 아르기닌이고,
Xaa21은 글루탐산, 글루타민, 류신, 시스테인, 또는 아스파르트산이며,
Xaa23은 이소류신 또는 발린이고,
Xaa24는 알라닌, 글루타민, 시스테인, 아스파라긴, 아스파르트산, 또는 글루탐산이며,
Xaa27은 발린, 류신, 또는 리신이고,
Xaa28은 시스테인, 리신, 알라닌, 아스파라긴, 또는 아스파르트산이며,
Xaa29는 시스테인, 글리신, 글루타민, 트레오닌, 글루탐산, 또는 히스티딘이고,
Xaa30은 시스테인, 글리신, 리신, 또는 히스티딘이거나, 부존재하며,
R1은 시스테인, GKKNDWKHNIT (서열번호 106), m-SSGAPPPS-n (서열번호 107), 또는 m-SSGQPPPS-n (서열번호 108)이거나, 부존재하며,
여기서,
m은 -Cys-, -Pro-, 또는 -Gly-Pro-이고,
n은 -Cys-, -Gly-, -Ser-, 또는 -His-Gly-이거나, 부존재함.
상기 삼중 활성체의 예로, 서열번호: 1 내지 102로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것, 서열번호: 1 내지 11, 13 내지 102로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것, 서열번호: 1 내지 11, 13 내지 102로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 (필수적으로) 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 구체예로, 상기 삼중 활성체는 서열번호 21, 22, 42, 43, 50, 64, 66, 67, 70, 71, 76, 77, 96, 97 및 100으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 (필수적으로) 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 구체예로, 상기 삼중 활성체는 서열번호 21, 22, 42, 43, 50, 66, 67, 77, 96, 97 및 100으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 (필수적으로) 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 구체예로, 상기 삼중 활성체는 서열번호 21, 22, 42, 43, 50, 77 및 96으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 (필수적으로) 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본원에서 특정 서열번호로 '구성되는' 펩타이드라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
이상의 내용은 본 발명의 다른 구체예 혹은 다른 양태에도 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 일반식 1에서 Xaa14는 류신 또는 메티오닌이며, Xaa15는 시스테인, 아스파르트산, 또는 류신일 수 있다.
이러한 펩타이드의 예로, 서열번호: 1 내지 11, 14 내지 17, 및 21 내지 102로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 (필수적으로) 구성된 펩타이드를 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 펩타이드는 글루카곤 수용체, GLP-1 수용체, 및 GIP 수용체 중 하나 이상을 유의하게 활성화시킬 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, GLP-1을 유의하게 활성화시키거나, 추가로 글루카곤 수용체 및/또는 GIP 수용체를 유의하게 활성화시키는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
보다 더 구체적으로,
상기 일반식 1에서,
Xaa2는 글리신, 알파-메틸-글루탐산, 또는 Aib이고,
Xaa7은 트레오닌이며,
Xaa10은 티로신, 시스테인, 또는 발린이고,
Xaa12는 리신 또는 이소류신이며,
Xaa13은 티로신, 알라닌, 글루타민, 또는 시스테인이고,
Xaa14는 류신, 시스테인, 또는 메티오닌이며,
Xaa15는 시스테인, 류신, 글루탐산, 또는 아스파르트산이고,
Xaa17은 글루타민, 아르기닌, 이소류신, 시스테인, 글루탐산, 또는 리신이며,
Xaa18은 알라닌, 글루타민, 아르기닌, 또는 히스티딘이고,
Xaa19는 알라닌, 글루타민, 발린, 또는 시스테인이며,
Xaa20은 리신, 아르기닌, 또는 글루타민이고,
Xaa21은 글루탐산, 글루타민, 류신, 시스테인, 또는 아스파르트산이며,
Xaa23은 이소류신 또는 발린이고,
Xaa24는 시스테인, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 글루탐산, 또는 아스파르트산이며,
Xaa27은 류신 또는 리신인, 펩타이드일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 더 구체적으로,
상기 일반식 1에서,
Xaa2는 글리신, 알파-메틸-글루탐산, 또는 Aib이고,
Xaa7은 트레오닌이며,
Xaa10은 티로신, 시스테인, 또는 발린이고,
Xaa12는 리신 또는 이소류신이며,
Xaa13은 티로신, 알라닌, 또는 시스테인이고,
Xaa14는 류신 또는 메티오닌이며,
Xaa15는 시스테인 또는 아스파르트산이고,
Xaa17은 글루타민, 아르기닌, 이소류신, 시스테인, 또는 리신이며,
Xaa18은 알라닌, 아르기닌, 또는 히스티딘이고,
Xaa19는 알라닌, 글루타민, 또는 시스테인이며,
Xaa20은 리신 또는 글루타민이고,
Xaa21은 글루탐산, 시스테인, 또는 아스파르트산이며,
Xaa23은 발린이고,
Xaa24는 알라닌, 글루타민, 시스테인, 아스파라긴, 또는 아스파르트산이며,
Xaa27은 류신 또는 리신일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
보다 더 구체적으로,
상기 일반식 1에서,
Xaa2는 알파-메틸-글루탐산 또는 Aib이고,
Xaa7은 트레오닌이며,
Xaa10은 티로신 또는 시스테인이고,
Xaa12는 리신 또는 이소류신이며,
Xaa13은 티로신, 알라닌, 또는 시스테인이고,
Xaa14는 류신 또는 메티오닌이며,
Xaa15는 시스테인 또는 아스파르트산이고,
Xaa16은 글루탐산이며,
Xaa17은 아르기닌, 이소류신, 시스테인, 또는 리신이고,
Xaa18은 알라닌, 아르기닌, 또는 히스티딘이며,
Xaa19는 알라닌, 글루타민, 또는 시스테인이고,
Xaa20은 리신 또는 글루타민이며,
Xaa21은 글루탐산 또는 아스파르트산이고,
Xaa23은 발린이며,
Xaa24는 글루타민, 아스파라긴, 또는 아스파르트산이고,
Xaa27은 류신이며,
Xaa28은 시스테인, 알라닌, 아스파라긴, 또는 아스파르트산일 수 있다.
구체적으로,
상기 일반식 1에서,
Xaa1은 히스티딘 또는 4-이미다조아세틸이고,
Xaa2는 알파-메틸-글루탐산 또는 Aib이며,
Xaa3은 글루타민이고,
Xaa7은 트레오닌이며,
Xaa10은 티로신이고,
Xaa12는 이소류신이며,
Xaa13은 알라닌 또는 시스테인이고,
Xaa14는 메티오닌이며,
Xaa15는 아스파르트산이고,
Xaa16은 글루탐산이며,
Xaa17은 이소류신 또는 리신이고,
Xaa18은 알라닌 또는 히스티딘이며,
Xaa19는 글루타민 또는 시스테인이고,
Xaa20은 리신이며,
Xaa21은 아스파르트산이고,
Xaa23은 발린이며,
Xaa24는 아스파라긴이고,
Xaa27은 류신이며,
Xaa28은 알라닌 또는 아스파라긴이고,
Xaa29는 글루타민 또는 트레오닌이며,
Xaa30은 시스테인 또는 리신이거나, 부존재할 수 있다.
보다 구체적으로,
상기 일반식 1에서,
Xaa2는 글리신, 알파-메틸-글루탐산, 또는 Aib이며,
Xaa3은 글루타민이고,
Xaa7은 트레오닌이며,
Xaa10은 티로신, 시스테인, 또는 발린이고,
Xaa12는 리신이며,
Xaa13은 티로신이고,
Xaa14는 류신이며,
Xaa15는 아스파르트산이며,
Xaa16은 글리신, 글루탐산, 또는 세린이고,
Xaa17은 글루타민, 아르기닌, 시스테인, 또는 리신이며,
Xaa18은 알라닌, 아르기닌, 또는 히스티딘이고,
Xaa19는 알라닌 또는 글루타민이며,
Xaa20은 리신 또는 글루타민이고,
Xaa21은 글루탐산, 시스테인, 또는 아스파르트산이며,
Xaa23은 발린이고,
Xaa24는 알라닌, 글루타민, 또는 시스테인이며,
Xaa27은 류신 또는 리신이고,
Xaa29는 글리신, 글루타민, 트레오닌, 또는 히스티딘일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 펩타이드는 GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체의 활성화 정도가 유의하고, GIP 수용체의 활성화 정도에 비해 높거나; GLP-1 수용체, 글루카곤 수용체 및 GIP 수용체의 활성화 정도가 모두 유의하거나; GLP-1 수용체 및 GIP 수용체의 활성화 정도가 유의하고, 글루카곤 수용체의 활성화에 비해 높은 경우에 해당할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
이러한 펩타이드의 예로, 서열번호: 8, 9, 21 내지 37, 39, 42, 43, 49 내지 61, 64 내지 83, 85, 86, 88, 89, 91 내지 93, 95 내지 102로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 (필수적으로) 구성된 펩타이드를 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 양태로서, 상기 펩타이드는 하기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
Xaa1-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31- Ser-Ser-Gly-Gln-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa40 (일반식 2, 서열번호 104)
상기 식에서,
Xaa1은 4-이미다조아세틸, 히스티딘, 또는 티로신이고;
Xaa2는 글리신, 알파-메틸-글루탐산, 또는 Aib이며;
Xaa10은 티로신, 또는 시스테인이며
Xaa13은 알라닌, 글루타민, 티로신, 또는 시스테인이며;
Xaa14는 류신, 메티오닌, 또는 티로신이고;
Xaa15는 아스파르트산, 글루탐산, 또는 류신이며;
Xaa16은 글리신, 글루탐산, 또는 세린이고;
Xaa17은 글루타민, 아르기닌, 이소류신, 글루탐산, 시스테인, 또는 리신이며;
Xaa18은 알라닌, 글루타민, 아르기닌, 또는 히스티딘이고;
Xaa19는 알라닌, 글루타민, 시스테인, 또는 발린이며;
Xaa20은 리신, 글루타민, 또는 아르기닌이고;
Xaa21은 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 류신, 또는 아스파르트산이며;
Xaa23은 이소류신 또는 발린이고;
Xaa24는 시스테인, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 또는 글루탐산이며;
Xaa28은 리신, 시스테인, 아스파라긴, 또는 아스파르트산이며;
Xaa29는 글리신, 글루타민, 시스테인, 또는 히스티딘이고;
Xaa30은 시스테인, 글리신, 리신, 또는 히스티딘이며;
Xaa31은 프롤린 또는 시스테인이며;
Xaa40은 시스테인이거나, 부존재함.
보다 구체적으로, 상기 일반식 2에서,
Xaa13은 알라닌, 티로신, 또는 시스테인이며;
Xaa15는 아스파르트산 또는 글루탐산이고,
Xaa17은 글루타민, 아르기닌, 시스테인, 또는 리신이며;
Xaa18은 알라닌, 아르기닌, 또는 히스티딘이고;
Xaa21은 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 또는 아스파르트산이며;
Xaa23은 이소류신 또는 발린이고;
Xaa24는 시스테인, 글루타민, 또는 아스파라긴이고,
Xaa28은 시스테인, 아스파라긴, 또는 아스파르트산이며;
Xaa29는 글루타민, 시스테인, 또는 히스티딘이고;
Xaa30은 시스테인, 리신, 또는 히스티딘일 수 있다.
이러한 펩타이드의 예로, 서열번호: 21, 22, 42, 43, 50, 64 내지 77, 및 95 내지 102로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 보다 구체적으로 서열번호: 21, 22, 42, 43, 50, 64 내지 77, 및 96 내지 102로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 (필수적으로) 구성된 펩타이드를 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 양태로서, 상기 펩타이드는 하기 일반식 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
Xaa1-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Glu-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Lys-Xaa21-Phe-Val-Xaa24-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Ser-Ser-Gly-Gln-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa40 (일반식 3, 서열번호 105),
상기 일반식 3에서,
Xaa1은 히스티딘 또는 티로신이고;
Xaa2는 알파-메틸-글루탐산 또는 Aib이며;
Xaa13은 알라닌, 티로신 또는 시스테인이고;
Xaa17은 아르기닌, 시스테인, 또는 리신이며;
Xaa18은 알라닌 또는 아르기닌이고;
Xaa19는 알라닌 또는 시스테인이며;
Xaa21은 글루탐산 또는 아스파르트산이고;
Xaa24는 글루타민 또는 아스파라긴이며,
Xaa28은 시스테인 또는 아스파르트산이며;
Xaa29는 시스테인, 히스티딘, 또는 글루타민이고;
Xaa30은 시스테인 또는 히스티딘이며;
Xaa31은 프롤린 또는 시스테인이며;
Xaa40은 시스테인 또는 부존재할 수 있다.
이러한 펩타이드의 예로, 서열번호: 21, 22, 42, 43, 50, 64 내지 71, 75 내지 77, 및 96 내지 102로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 (필수적으로) 구성된 펩타이드를 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 일반식 1에서 R1은 시스테인, GKKNDWKHNIT(서열번호 106), CSSGQPPPS (서열번호 109), GPSSGAPPPS (서열번호 110), GPSSGAPPPSC (서열번호 111), PSSGAPPPS (서열번호 112), PSSGAPPPSG (서열번호 113), PSSGAPPPSHG (서열번호 114), PSSGAPPPSS (서열번호 115), PSSGQPPPS (서열번호 116), 또는 PSSGQPPPSC (서열번호 117)이거나, 부존재할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 그 길이에 따라 이 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의하여 생산할 수도 있다.
구체적으로, 본 발명의 펩타이드는 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템, 또는 임의의 다른 당해 분야의 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는, 예를 들어 하기를 포함하는 방법을 포함하는 다수의 방법으로 합성될 수 있다:
(a) 펩타이드를 고체상 또는 액체상 방법의 수단으로 단계적으로 또는 단편 조립에 의해 합성하고, 최종 펩타이드 생성물을 분리 및 정제하는 방법; 또는
(b) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물을 숙주세포 내에서 발현시키고, 발현 생성물을 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 방법; 또는
(c) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관 내 발현을 수행하고, 발현 생성물을 회수하는 방법; 또는
(a), (b) 및 (c)의 임의의 조합으로 펩타이드의 단편을 수득하고, 이어서 단편을 연결시켜 펩타이드를 수득하고, 당해 펩타이드를 회수하는 방법.
또한, 상기 글루카곤 수용체, GLP-1 수용체, 및 GIP 수용체에 대해 활성을 갖는 펩타이드는, 글루카곤 수용체, GLP-1 수용체, 및 GIP 수용체에 대해 활성을 갖는 펩타이드에 이의 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 생체적합성 물질이 결합된, 지속형 결합체 형태일 수 있다. 본 명세서에서 상기 생체적합성 물질은 캐리어와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 상기 펩타이드의 결합체는 캐리어가 결합되지 않은 상기 펩타이드에 비하여 증가된 효력의 지속성을 나타낼 수 있으며, 본 발명에서는 이러한 결합체를 "지속형 결합체"로 지칭한다.
한편, 이러한 결합체는 비자연적인 (non-naturally occurring) 것일 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 지속형 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 1]
X - L - F
단 이 때 X는 서열번호 1 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고;
L은 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커 이며,
F는 면역글로불린 Fc 단편 또는 그 유도체 이고,
-는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타낸다.
상기 결합체에서 F는 X, 즉 글루카곤 수용체, GLP-1 수용체, 및 GIP 수용체에 대해 활성을 갖는 펩타이드, 구체적으로 서열번호 1 내지 102의 아미노산 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 펩타이드의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질로서, 본 발명의 상기 결합체를 구성하는 모이어티의 일 구성에 해당한다.
상기 F는 X와 공유 화학결합 또는 비공유 화학결합으로 서로 결합되는 것일 수 있으며, 공유 화학결합, 비공유 화학결합 또는 이들의 조합으로 L을 통하여 F와 X가 서로 결합되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 L은 비펩타이드성 링커, 예를 들어 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커일 수 있다.
본 발명에서 "비펩타이드성 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 포함한다. 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 상기 비펩타이드성 링커는 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있으며, 상기 화학식 1에서 L에 해당된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 링커는 생체 내 단백질 분해 효소에 저항성 있는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 비펩타이드성 링커는 비펩타이드성 중합체와 혼용되어 사용될 수 있다.
특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 비펩타이드성 링커는 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜일 수 있고, 또한, 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 비펩타이드성 링커의 반복 단위는 에틸렌글리콜 반복 단위일 수 있고, 구체적으로, 상기 비펩타이드성 링커는 에틸렌글리콜 반복 단위를 포함하면서, 결합체의 제조에 이용되는 작용기를 말단에 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 지속형 결합체는 상기 작용기를 통해 X와 F가 연결된 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 상기 비펩타이드성 링커는 2개, 또는 3개 이상의 작용기를 포함할 수 있고, 각 작용기는 동일하거나, 서로 상이할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 링커는 하기 화학식 2로 표시되는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2020016535-appb-I000001
여기서, n= 10 내지 2400, n= 10 내지 480, 또는 n = 50 내지 250이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 지속형 결합체에서 PEG 모이어티는, -(CH2CH2O)n-구조 뿐만 아니라 연결 요소와 이 -(CH2CH2O)n- 사이에 개재하는 산소 원자도 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 결합체는 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(X)와 면역글로불린 Fc 영역(F)이 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커를 통해 공유 결합으로 연결된 구조 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리에틸렌 글리콜은, 에틸렌 글리콜 동종 중합체, PEG 공중합체, 또는 모노메틸-치환된 PEG 중합체(mPEG)의 형태를 모두 포괄하는 용어이나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 링커는 생체 내 단백질 분해 효소에 저항성 있는 에틸렌글리콜 반복단위를 포함하는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체의 분자량은 0 초과 약 100 kDa 범위, 약 1 내지 약 100 kDa 범위, 구체적으로 약 1 내지 약 20 kDa 범위, 또는 약 1 내지 약 10 kDa 범위이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 F에 해당하는 폴리펩타이드와 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 링커는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 링커의 양 말단은 각각 F, 예컨대 면역글로불린 Fc 영역의 아민기 또는 티올기 및 X의 아민기 또는 티올기에 결합할 수 있다.
구체적으로, 상기 비펩타이드성 중합체는 양쪽 말단에 각각 F (예컨대, 면역글로불린 Fc 영역) 및 X와 결합될 수 있는 반응기, 구체적으로는 X, 혹은 F (예컨대, 면역글로불린 Fc 영역)의 N-말단 또는 리신에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 티올기와 결합될 수 있는 반응기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, F, 예컨대 면역글로불린 Fc 영역 및 X와 결합될 수 있는, 상기 비펩타이드성 중합체의 반응기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석시니미드 유도체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 알데히드기로 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기를 예로서 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 발레르에이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피온에이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, N-하이드록시석시니미드, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
비펩타이드성 링커는 이러한 반응기를 통하여 X와 F에 연결될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 알데히드 결합에 의한 환원성 아민화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 리신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
또한, 상기 비펩타이드성 링커의 양쪽 말단의 반응기는 서로 동일하거나 또는 서로 상이할 수 있으며, 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드기를, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온 알데히드기, 또는 부틸 알데히드기를 가질 수 있다. 그러나, 비펩타이드성 링커의 각 말단에 F, 구체적으로 면역글로불린 Fc 영역과 X가 결합될 수 있다면, 특별히 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 상기 비펩타이드성 링커의 한쪽 말단에는 반응기로서 말레이미드 기를 포함하고, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기 등을 포함할 수 있다.
양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 지속형 단백질 결합체를 제조할 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 중합체는 X의 시스테인 잔기, 보다 구체적으로 시스테인의 -SH 기에 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 X에 해당하는 펩타이드에서 10번 시스테인 잔기, 13번 시스테인 잔기, 15번 시스테인 잔기, 17번 시스테인 잔기, 19번 시스테인 잔기, 21번 시스테인 잔기, 24번 시스테인 잔기, 28번 시스테인 잔기, 29번 시스테인 잔기, 30번 시스테인 잔기, 31번 시스테인 잔기, 40번 시스테인 잔기, 또는 41번 시스테인 잔기에 상기 비펩타이드성 중합체가 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 시스테인 잔기의 -SH 기에 비펩타이드성 중합체의 반응기가 연결될 수 있으며, 반응기에 대해서는 앞서 기술한 내용이 모두 적용된다. 만약, 말레이미드-PEG-알데히드를 사용하는 경우, 말레이미드 기는 X의 -SH 기와 티오에테르(thioether) 결합으로 연결하고, 알데히드기는 F, 구체적으로 면역글로불린 Fc의 -NH2기와 환원적 아민화 반응을 통해 연결할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이는 하나의 일례에 해당한다.
또한, 상기 결합체에서, 비펩타이드성 중합체의 반응기가 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 위치한 -NH2와 연결된 것일 수 있으나, 이는 하나의 일례에 해당한다.
한편, 상기 F는 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG 유래 일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 “면역글로불린 Fc 단편”과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 Fc 영역이라고 하면 면역글로불린의 파파인 소화에서 얻는 천연형 서열뿐 아니라 그 유도체, 예컨대 천연 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 변환되어 천연형과 상이하게 된 서열까지 망라하여 포함된다.　
상기 F는, 2개의 폴리펩타이드 사슬이 이황화결합으로 연결되어 있는 구조이며, 상기 두 사슬 중 한 사슬의 질소 원자를 통해서만 연결되어 있는 구조일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 질소 원자를 통한 연결은 리신의 입실론 아미노 원자나 N-말단 아미노기에 환원적 아민화를 통하여 연결될 수 있다.
환원적 아민화 반응이란 반응물의 아민기 또는 아미노기가 다른 반응물의 알데히드 (즉, 환원적 아민화가 가능한 작용기)와 반응하여 아민을 생성한 다음, 환원 반응에 의해 아민 결합을 형성시키는 반응을 의미하여, 당해 기술 분야에 널리 알려져 있는 유기합성 반응이다.
하나의 구체예로, 상기 F는 그 N-말단 프롤린의 질소 원자를 통하여 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 화학식 1의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성으로, 구체적으로, 상기 화학식 1에서 F에 해당할 수 있다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 면역글로불린 Fc 영역은 N-말단에 특정 힌지 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "힌지 서열"은 중쇄에 위치하여 이황화결합(inter disulfide bond)를 통하여 면역글로불린 Fc 영역의 이량체를 형성하는 부위를 의미한다.
본 발명에서, 상기 힌지 서열은 하기의 아미노산 서열을 갖는 힌지 서열 중 일부가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 119).
상기 힌지 서열은 서열번호 119의 힌지 서열 중 8번째 또는 11번째 시스테인 잔기가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 힌지 서열은 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는, 3 내지 12개의 아미노산으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 힌지 서열은 다음과 같은 서열을 가질 수 있다: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 120), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro(서열번호 121), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(서열번호 122), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro(서열번호 123), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(서열번호 124), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 125), Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 126), Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 127), Glu-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 128), Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 129), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 130), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 131), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 132), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 133), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro(서열번호 134), Glu-Ser-Lys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 135), Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 136), Glu-Pro-Ser-Cys(서열번호 137), Ser-Cys-Pro(서열번호 138).
더욱 구체적으로는 상기 힌지 서열은 서열번호 129(Pro-Ser-Cys-Pro)또는 서열번호 138(Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열의 존재로 면역글로불린 Fc 사슬 두 분자가 이량체를 형성한 형태일 수 있고, 또한, 본 발명의 화학식 1의 결합체는 링커의 일 말단이 이량체의 면역글로불린 Fc 영역의 한 사슬에 연결된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "N-말단"은 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 말단을 의미하는 것으로, 아미노 말단의 최말단, 또는 최말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상의 아미노산까지 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열을 N-말단에 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
예컨대, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 지속형 결합체의 하나의 실시 형태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역 F는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이합체(이량체 dimer)이며, 이 때 상기 Fc 영역 이합체 F와 X는 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 하나의 동일한 링커 L을 통하여 공유결합적으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 한 구체예에서, X는 이러한 Fc 영역 이합체 F의 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩타이드 사슬에만 링커 L을 통하여 공유결합으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 더욱 구체적인 예시에서, 이러한 Fc 영역 이합체 F의 두 폴리펩타이드 사슬 중 X가 연결된 하나의 폴리펩타이드 사슬에는 한 분자의 X만이 L을 통하여 공유결합적으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 가장 구체적인 예시에서 상기 F는 동종이합체(homodimer)이다.
본 발명의 지속형 결합체의 다른 실시 형태에서는, 이합체 형태의 하나의 Fc 영역에 X 두 분자가 대칭적으로 결합하는 것 역시 가능하다. 이때 상기 면역글로불린 Fc와 X는 비펩타이드성 링커에 의해 서로 연결될 수 있다. 그러나, 상기 기술된 예에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 더 구체적인 실시 형태에서는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며, 보다 더 구체적인 실시 형태에서는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이며, 가장 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 하나의 구체적인 실시 형태에서, 면역글로불린 Fc 절편은 인간 IgG4 Fc의 단편으로서, 각 단량체(monomer)의 3번 아미노산인 시스테인 사이의 이황화 결합(inter-chain 형태)을 통해 2개의 단량체가 연결된 동종이합체(homodimer) 형태일 수 있으며, 이 때 동종이합체의 각 단량체는 독립적으로 35번 및 95번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합 및 141번 및 199번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합, 즉 2개의 내부의 이황화 결합(intra-chain 형태)을 가지거나/가질 수 있다. 각 단량체의 아미노산 수는 221개의 아미노산으로 구성될 수 있므며, 동종이합체를 형성하는 아미노산은 전체 442개의 아미노산으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 면역글로불린 Fc 절편은 서열번호 139의 아미노산 서열 (221개의 아미노산으로 구성됨)을 갖는 단량체 2개가 각 단량체의 3번 아미노산인 시스테인 사이에 이황화 결합을 통해 동종이합체를 형성하고, 상기 동종이합체의 단량체는 각각 독립적으로 35번 및 95번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합 및 141번 및 199번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합을 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명에서 면역글로불린 Fc 영역과 관련된 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 불변영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 구체적으로는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 구체적으로는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 절편이다.
또한, 상술한 결합체는 효력의 지속성이 천연형 GLP-1, GIP, 혹은 글루카곤에 비해, 또는 F가 수식되지 않은 X에 비해 증가된 것일 수 있으며, 이러한 결합체는 상술한 형태뿐만 아니라, 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태 등을 모두 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상술한 결합체는 효력의 지속성이 천연형 GLP-1, GIP, 혹은 글루카곤에 비해, 또는 F가 수식되지 않은에 비해 증가된 것일 수 있으며, 이러한 결합체는 상술한 형태뿐만 아니라, 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태 등을 모두 포함한다.
상기 펩타이드 (예컨대 상기 펩타이드 자체 또는 이에 생체적합성 물질이 결합된 지속형 결합체 형태)를 포함하는 조성물은 폐 질환의 예방 또는 치료용일 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"은 상기 펩타이드 (예컨대 상기 펩타이드 자체 또는 이에 생체적합성 물질이 결합된 지속형 결합체 형태) 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 폐 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 펩타이드 (예컨대 상기 펩타이드 자체 또는 이에 생체적합성 물질이 결합된 지속형 결합체 형태) 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 폐 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 조성물이 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 등이 될 수 있다.
본 발명의 글루카곤, GLP-1 및 GIP 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체 또는 이의 지속형 결합체의 사용은 혈중 반감기 및 생체 내 효력 지속 효과의 획기적인 증가로 인해 매일 투여되야 하는 만성환자에게 투여 횟수를 감소시켜 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 큰 장점이 있어 폐 질환의 치료에 큰 도움을 준다. 더욱이, 상기 삼중 활성체 또는 이의 지속형 결합체는 폐 질환의 증상의 재발 시기를 지연시키는 등 폐 질환의 예방 효과 및/또는 폐 질환의 증상을 유의적으로 감소시키는 효과가 있는 등 폐 질환의 예방 및/또는 치료에 큰 도움을 준다.
본 발명에서 용어, "폐 질환"은, 폐의 조직이나 기능에 이상이 생기는 모든 질환을 의미하며, 구체적으로, 본 발명의 삼중 활성체 또는 이의 지속형 결합체는 염증 및 섬유화 반응을 저해할 수 있으므로, 본 발명의 목적상 상기 폐 질환은 폐 염증 및 섬유화를 수반하는 질병 또는 섬유화에 진행에 따른 질병, 예를 들어, 간질성 폐질환 (interstitial lung disease, ILD), 진행성 섬유화 간질성 폐 질환(Progressive Fibrosing Interstitial Lung Disease, PF-ILD), 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonias, IIP), 비특이성 간질성 폐렴(Non-specific interstitial pneumonia, NSIP), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 간질성 폐섬유증(fibrosing interstitial lung diseases, FILD), 특발성 폐섬유증 (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), 폐포염 (alveolitis), 폐렴(pneumonia), 폐기종(emphysema), 기관지염(bronchitis), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 복합 폐 섬유화와 폐기종(combined pulmonary fibrosis and emphysema, CPFE), 천식(asthma), 또는 호흡기 감염 질환 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 삼중 활성체는 폐 염증의 주요 기전인 대식세포(macrophage)의 활성을 저해하고, 폐섬유증의 주요 기전인 섬유아세포의 근섬유아세포로의 분화 및 폐포상피세포의 상피간엽이행을 저해함으로써 폐 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 투여 시 (i) 대식세포(macrophage) 활성 저해, 및/또는 (ii) IL-1β, IL-6, IL-12, 또는 TNF-α 의 발현을 감소시킴으로써 염증을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 약학적 조성물은 투여 시 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 것일 수 있다:
(i) 근섬유아세포(myofibroblast) 분화 저해;
(ii) α-SMA, collagen1α1, 또는 피브로넥틴(fibronectin)의 발현 감소;
(iii) 폐포상피세포(alveolar epithelial cell)의 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition, EMT) 저해;
(iv) collagen1α1, 또는 collagen1α3의 발현 감소. 이를 통해, 본 발명의 약학적 조성물은 섬유화를 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
폐에서의 염증 반응에서는 폐포의 대식세포가 관여하며 상기 대식세포가 분비하는 염증 사이토카인 (IL-1, IL-6, TNF-α)로 인해 호중구가 유인되고, 프로테아제가 분비된다. 특히, 폐 조직을 구성하고 탄력성에 관여하는 섬유의 한 종류인 엘라스틴을 분해하는 엘라스타제(elastase)가 분비된다. 상기 엘라스타제에 의해 폐포의 탄성 조직인 엘라스틴이 손상되어 결국 폐포 역시 손상되며, 조직의 섬유화로 이어지는 것으로 알려져 있다. 폐에서의 염증 및 섬유화는 그 자체로도 폐질환이 되지만, 염증 및 섬유화의 진행 및 심화로 인해 다른 폐질환으로도 이어질 수 있으며, 따라서, 폐질환의 예방 및 치료에서는 염증 및 섬유화를 억제하는 것이 요구된다.
본 발명의 상기와 같은 삼중 활성체의 특성은 폐의 염증 및 섬유화 억제 및 개선 효과를 의미하고, 이는 폐의 염증 또는 섬유화를 수반하는 폐 질환에 대한 예방 또는 치료 효과 역시 시사한다.
본 발명에서 용어, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)은 비가역적인 기도 폐쇄를 보이는 질환을 의미하며, 만성적인 염증과 손상에 따른 폐실질의 파괴, 폐섬유화가 나타나는 것으로 알려져 있다. 만성 폐쇄성 폐질환 환자의 기도에서는 다양한 염증세포의 침윤이 관찰되며, 특히 대식세포의 수가 질환의 중증도에 따라 증가하는 것으로 알려져 있으므로, 이는 만성 폐쇄성 폐질환의 발병 기전에 염증이 중요한 역할을 함을 시사한다. 유해 물질이 흡입되었을 때 선천 면역이 반응하여 상피세포가 많은 염증 매개 물질을 분비하고, 이는 폐포 대식세포와 호중구를 활성화시키는 역할을 하므로, 염증 반응의 제어는 만성 폐쇄성 폐질환 치료에 있어 중요한 요인이다. 일반적으로 만성 폐쇄성 폐질환은 폐기종과 만성 기관지염의 두 가지 유형으로 구별하지만, 실제 환자에서는 폐기종과 만성 기관지염이 동시에 존재하는 경우가 많은 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, 만성 기관지염은 만성적으로 기관지에 염증이 생겨 기도 내 점액샘의 비대 및 증가가 유발되거나 염증으로 인한 구조 손상이 일어나고, 그 결과 점액층이 두꺼워지고 섬모운동이 저하되면서 공기의 흐름을 막아 호흡 곤란 등을 일으키는 호흡기 질환을 의미한다.
본 발명에서 용어, 폐기종은 여러 원인에 의해서 기관지나 폐에 염증이 생기고, 이로 인하여 프로테아제가 분비되고, 폐포의 기본 골격이 파괴되고 혈관 구조가 손상되면서 기체 교환 기능을 상실하게 되는 질환을 의미한다.
본 발명에서 용어, 폐포염은 산소교환을 담당하는 폐포에 염증이 생긴 질환을 의미한다. 곰팡이, 먼지, 석유, 톨루엔, 아세톤, 화학 약품 등으로 인해 폐포 내에 대식세포가 축적되어 폐포의 중격이 두꺼워 지면 폐포염으로 진행될 수 있으며, 폐포염의 진행에 따라 폐포는 파괴되고 흉터가 생겨 딱딱해지고 호흡 곤란이 발생하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, 천식(asthma)은 만성 폐쇄성 폐질환과 달리 가역적인 병변을 나타내는, 기도 염증에 의해 유발되는 호흡 곤란을 일으키는 염증성 기도 폐쇄 질환이다. 천식 환자의 기도에서는 IL-4, IL-5, IL-13 등의 사이토카인 분비가 많이 이루어지며, 기관지 평활근의 증식 및 비후가 현저한 것으로 알려져 있다. 만성 폐쇄성 폐질환과 마찬가지로 염증 반응의 제어가 치료에 있어 중요하다.
본 발명에서 용어, 폐렴은 폐의 실질조직 또는 폐포에 염증이 생기는 질병을 의미한다. 세균 감염, 바이러스, 원충, 곰팡이, 화학물질 등이 원인이 되며, 여러 합병증을 동반할 수 있는 위험성이 큰 질환이다. 호흡 기관이 갖고 있는 병원체에 대한 면역 기전(대표적으로 폐포대식세포)이 제대로 기능하지 않거나, 병원체의 수준이 정상적인 면역 기전으로 방어할 수 있는 한도를 초과하여 폐렴이 발병하는 것으로 알려져 있다. 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐기종, 기관지확장증 등 만성폐질환자에서 폐렴 발병 가능성이 높은 것으로 알려져 있다. 본 발명에서, 폐염증 또는 폐렴은 다른 폐질환에 기인하거나, 또는 다른 폐질환과 동반하는 폐염증 또는 폐렴을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, 호흡기 감염 질환은 병원체(바이러스, 세균, 진균 등) 감염에 의한 호흡기 질환을 의미한다. 호흡기 감염 질환은 원인이 되는 병원체에 따라 구별될 수 있는데, 대표적인 호흡기 감염 원인으로는 호흡기 바이러스, 세균, 마이코플라즈마(mycoplasma), 진균(fungi) 등을 들 수 있다. 상기 병원체의 감염에 따른 호흡기 감염 질환에는 염증이 수반되므로, 염증 개선을 통한 치료 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에서 용어, 호흡기 바이러스 감염 질환은 병원성 바이러스 감염에 의한 호흡기 질환을 의미하며, 경증의 상기도 감염에서부터 폐렴과 기관지염을 동반하는 심한 하기도 감염을 유발할 수 있고, 심폐기능이 저하된 사람은 호흡기 바이러스 감염이 치명적인 것으로 알려져 있다. 호흡기 바이러스에 감염되면, 폐를 포함한 호흡기에 염증이 일어나고 오랜 기간 염증이 억제되지 못하면 섬유화로 이어져 더 심각한 폐질환으로 이어지게 되므로, 염증 및 섬유화를 억제하면서 호흡기 바이러스 감염 질환을 치료하는 것이 중요하다.
호흡기 바이러스 감염 질환의 원인이 되는 상기 호흡기 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 헤르페스 단순 바이러스(herpes simplex virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 라이노 바이러스(rhinovirus), 수두바이러스(varicella Zoster Virus), 홍역 바이러스(measle virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratorysyncytial virus), 뎅기바이러스(Dengue virus), HIV(human immunodeficiency virus), 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스(coronavirus), 중증급성 호흡기 증후군 바이러스(severe acute respiratory syndrome associated virus; SARS-associated virus), 또는 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(middle east respiratory syndrome coronavirus; MERS-CoV)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 코로나 바이러스의 제한되지 않는 한 예로, SARS-CoV-2를 들 수 있으며, SARS-CoV-2 감염으로 코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)이 발병할 수 있다.
본 발명에서 용어, 코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)은 코로나 바이러스 (2019-nCoV 또는 SARS-CoV-2) 감염으로 인한 바이러스 감염성 질환으로, 아직까지 명확한 감염원과 감염경로는 확인되지 않았으나, 전파력이 매우 강해 전세계적인 팬데믹 사태를 일으켰다. 코로나 바이러스는 사람과 다양한 동물에 감염될 수 있는 바이러스로서 유전자 크기 27~32kb의 RNA 바이러스로, 발열을 동반한 기침, 호흡곤란, 숨가쁨, 가래 등 호흡기 증상을 주로 나타내는 것으로 알려져 있다.
특히, 코로나바이러스감염증-19에 심한 폐렴이 동반되는 이유는 코로나 바이러스가 기관지의 섬모상피세포나 TypeⅡ 폐포상피세포(폐포 안의 2형 상피세포)를 공격하기 때문이다. 이 세포들에는 코로나 바이러스가 잘 달라붙도록 만드는 효소수용체가 다량으로 존재한다. 'ACE2', 'TMPRSS2' 등의 수용체가 코로나 바이러스의 세포 내 침투능력을 강화해준다.
숨을 쉬는 동안 침투한 이물질이나 병원균은 기관지의 섬모상피세포에 있는 점막에 붙는다. 섬모상피세포는 이름 그대로 다수의 섬모들을 가지고 있어, 점막에 붙어있는 코로나 바이러스를 비롯한 병원균들을 입과 코의 방향으로 배출시킨다. 그러나 섬모상피세포의 섬모운동만으로 한꺼번에 많은 바이러스를 내쫒기에는 한계가 있다. 또 흡연, 먼지, 건조한 날씨, 낮은 온도 등은 섬모운동을 저하시킨다. 건조하고 추운 겨울은 섬모운동이 저하되기 때문에 코로나바이러스감염증-19를 비롯한 인플루엔자 바이러스성 감염병이 증가한다.
다른 바이러스와 마찬가지로 코로나 바이러스는 숙주 세포의 자원과 시스템을 탈취하여 왕성하게 증식하며 감염된 세포 밖으로 분출된다. 이때 기하급수적으로 증식된 바이러스들이 빠져나와 주변의 건강한 섬모상피세포와 TypeⅡ 폐포상피세포들로 급속히 침투한다. 감염된 세포들은 강한 염증을 유발하는 사이토카인 물질을 분비하며 염증세포로 변하게 된다.
TypeⅡ 폐포상피세포의 본래 기능은 계면활성제(surfactant)를 분비하여 폐포를 팽팽하게 유지하는 동시에 TypeⅠ 폐포상피세포를 통한 가스교환이 원활하도록 만드는 데 있다. 코로나 바이러스는의 공격을 받은 TypeⅡ 폐포상피세포들이 염증세포로 변하고, 주기능을 상실하면서 폐에 염증(폐렴)이 생기고, 이에 따라 이차적 증상(열, 기침, 호흡곤란 등)이 발생하는 것이다.
본 발명의 삼중 활성체는 대식세포 활성 저해 및/또는 폐 조직에서 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, IL-12, 또는 TNF-α)의 발현 수준 감소를 통해 염증 반응을 억제할 수 있으므로, 염증에 기인하거나 염증을 동반하는 폐 질환(예를 들어, 폐포염, 폐렴, 폐기종, 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환, 천식, 또는 호흡기 감염 질환)에 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
한편, 섬유증은 기관 또는 조직에서 과도한 섬유질 결합조직을 형성하는 질환이다. 섬유증은 인체 내에서 조직이 여러 가지 원인 (감염, 화학적 자극, 방사선 등)에 의한 염증반응으로 손상을 받은 후 창상치유(wound healing) 과정 중에 정상적인 통제가 불가능한 상태를 의미한다. 특히 폐에서는, 폐의 염증이 발생하여 치료되지 않은 상태로 오래 지속되면서 조직이 재생되지 못하고 굳는 섬유화로 이어져 심각한 폐질환으로 이어지는 경우가 많다. 이에, 섬유증 치료에는 염증을 억제하여 섬유화의 진행을 막는 것이 필요하다고 알려져 있으므로, 치료제 역시 면역억제제(예를 들어, 스테로이드제, 사이톡산) 등이 이용된다. 본원에서 섬유증은 섬유화와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, 폐섬유증은 폐에 섬유성 결합조직의 증식이 일어나 정상 폐구조의 파괴, 폐조직의 경화ㆍ황폐를 초래한 상태를 말한다. 실질성, 간질성 및 혼합형이 있으나, 특히 문제가 되는 것은 간질성 폐섬유증으로 폐포벽, 세기관지 주위에 섬유성결합직의 증식이 나타난다. 일반적으로, TGF-β(Transforming growth factor-β)가 폐포 대식세포(alveolar macrophage), 활성화된 폐포상피세포, 섬유아세포, 근섬유아세포와 같은 다양한 세포에서 생성되고, 섬유아세포 증식 및 대식세포와 섬유아세포의 이동을 유도하고, TNF-α, PDGF, IL-1β, IL-13과 같은 염증성 및 섬유성 사이토 카인의 발현을 자극하여 섬유화 반응을 더욱 강화시키는 것으로 알려져 있다 (Proc Am Thorac Soc., 9(3):111-116 (2012)). 본 발명의 폐섬유증은 다른 폐질환에 기인하거나, 또는 다른 폐질환과 동반하는 폐섬유증을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, 복합 폐 섬유화와 폐기종(combined pulmonary fibrosis and emphysema; CPFE)은 폐기종에 섬유화가 같이 공존하는 대표적인 질환이다.　
본 발명에서 용어, 간질성 폐질환 (interstitial lung disease, ILD)은 미만성 간질성 폐질환(diffuse parenchymal lung disease, DPLD)으로도 알려져 있으며, 폐 간질부(interstitial compartment)의 증식, 염증세포의 침윤 및 섬유화(fibrosis)가 동반되어 비정상적인 콜라겐 침착을 나타내는 질환들을 총칭한다. 상기 간질성폐질환은 원인에 따라 직업성, 환경성, 의인성, 결체조직질환, 또는 특발성 등으로 분류된다.
본 발명에서 용어, 진행성 섬유화 간질성 폐 질환(Progressive Fibrosing Interstitial Lung Disease, PF-ILD)은 진행성 표현형을 나타내는 만성 섬유성 간질성폐질환을 의미하며, 자가면역성 간질성 폐질환, 전싱경화증연관 간질성 폐질환, 혼합성 결합조직질환 연관 간질성 폐질환, 비특이성 특발성 간질성 폐렴, 분류되지 않은 특발성 간질성 폐렴 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 간질성 폐질환 중 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonias, IIP)은 원인이 알려지지 않았으며, 폐간질을 침범하는 조직학적 형태로 구분되는 폐질환들을 의미하며 대표적으로 비특이성 간질성 폐렴(Non-specific interstitial pneumonia, NSIP), 및 특발성 폐섬유증 (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)을 들 수 있다.
본 발명에서 용어, 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)은 특발성 간질성 폐렴 중 가장 흔한 질병으로서, 정확한 원인이 확인되지 않는 폐섬유화로 정의된다. 폐포상피세포가 다양한 노출에 의해 반복적인 염증반응으로 손상을 받은 후 정상적으로 상처가 치유되지 않으면서 섬유화가 유발되어 발병하며, 유전적 소인, 환경적 인자, 폐 감염 사이에 복잡한 상호작용으로 폐 섬유화가 진행되는 것으로 알려져 있다. 구체적으로는 손상된 폐포상피세포 및 침윤된 염증세포에서 분비된 다양한인자에 의한 폐 내 섬유모세포/근섬유모세포의 증식과 그로 인한 아교질(collagen)의 분비 및 축적, 및 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 과도한 침착 등이 발병 기전으로 알려져 있다.
본 발명의 삼중 활성체는 (i) 근섬유아세포(myofibroblast) 분화 저해; (ii) α-SMA, collagen1α1, 또는 피브로넥틴(fibronectin)의 발현 감소; (iii) 폐포상피세포(alveolar epithelial cell)의 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition, EMT) 저해; 및 (iv) collagen1α1, 또는 collagen1α3의 발현 감소 중 하나 이상의 특성을 가지므로, 섬유화를 억제하고 개선할 수 있으며, 섬유화에 기인하거나 섬유화를 동반하는 폐 질환(예를 들어, 간질성폐질환, 진행성 섬유화 간질성 폐 질환, 특발성 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴, 폐섬유증, 간질성 폐섬유증, 특발성 폐섬유증, 복합 폐섬유화와 폐기종)에 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 삼중활성체는 코로나바이러스감염증-19에 치료 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 코로나바이러스감염증-19은 완치 후에도 후유증으로 폐섬유화 증상이 남는 것으로 알려져 있고, 본 발명의 삼중활성체는 폐섬유화 개선 효과를 나타내므로, 삼중활성체는 코로나바이러스감염증-19에 의한 폐염증 및/또는 폐섬유증에 대해 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 점액용해제(mucolytic agents)또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 추가로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 약학적 조성물은 삼중활성체 및 점액용해제를 병용 투여하기 위한 것으로, 삼중활성체 및 점액용해제가 동시, 순차, 또는 역순으로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서, "병용"이란 용어가 사용될 경우 이는 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다. 삼중활성체 및 점액용해제의 병용 투여는 다음과 같은 형태로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
a) (i) 삼중활성체 또는 이의 결합체 및 (ii) 점액용해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 혼합된 하나의 혼합물(mixture)로 투여되는 것이거나; 또는
b) (i) 삼중활성체 또는 이의 결합체 및 (ii) 점액용해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 분리된 형태로 투여됨.
삼중활성체 및 점액용해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 분리된 형태일 경우, 삼중활성체 및 점액용해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 별개의 제제로 제제화되어 동시, 개별, 순차, 또는 역순으로 투여될 수 있는 것일 수 있다.
본 발명에서, 병용 투여는 단지 동시의 투여를 의미하는 것뿐만이 아니라, 삼중활성체 및 점액용해제또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 개체에 함께 작용하여 각 물질이 본연의 기능과 동등하거나 그 이상의 수준을 수행할 수 있는 투여 형태로 이해되어야 한다.
구체적인 한 예로, 삼중활성체 및 점액용해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 혼합되어 하나의 제제로 병용 투여되는 것일 수 있고, 또는, 삼중활성체 및 점액용해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 개별적으로 제제화되어 동시, 순차, 또는 역순으로 병용 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 개별적으로 제제화되어 병용 투여될 경우에 각 제제는 서로 다른 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 이에 제한되지 않으나, 삼중활성체 및 점액용해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 개별적으로 제제화되어 하나의 키트에 포함될 수 있다. 점액용해제의 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산，벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “점액용해제(mucolytic agents)”는 호흡기로부터 객담, 가래 또는 점액의 분비, 액화 또는 배출을 촉진하는 약물을 의미하며, 특히, 폐에 있는 점액을 분해하여 호흡기 분비물을 묽게 만드는 데까지만 역할을 하는 약을 의미한다. 본 발명에서, 점액용해제는 거담제와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 점액용해제의 구체적인 예로는, 암브록솔(ambroxol), N-아세틸시스테인(N-acetylcystein), N-아세틸린(N-acetylin), 카르보시스테인(carbocysteine), 도미오돌 (domiodol), 푸도스테인(fudosteine), 브롬헥신(bromhexine), 엘도스테인(erdosteine), 레토스틴 (letostine), 리소자임 (lysozyme), 메스나 (mesna), 소브레롤 (sobrerol), 스테프로닌 (stepronin), 티오프로닌 (tiopronin), 틸록사폴 (tyloxapol), 카보시스테인(carbocisteine), 도르나제 알파 (dornase alfa), 에프라지논 (eprazinone), 레토스테인 (letosteine), 넬테넥신 (neltenexine), 및 메시스테인(mecysteine)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 삼중활성체 및 점액용해제의 병용 투여는 호흡기 감염 질환(예를 들어, 코로나바이러스감염증-19)에 치료 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 삼중활성체는 폐 염증 및 폐섬유화 개선 효과를 나타내므로, 삼중활성체와 점액용해제의 병용 투여는 호흡기 감염 질환(예를 들어, 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)), 또는 이에 의한 폐염증 및 폐섬유증에 대해 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 포함한 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 상기 부형제는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제, 구체적으로는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 결합체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타티온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트제, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는 서열번호 1 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 그 지속형 결합체를 약학적 유효량으로 함유하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량과 횟수는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 상기 삼중 활성체 또는 이를 포함하는 지속형 결합체를 약학적 유효량으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 펩타이드 또는 지속형 결합체를 약학적 유효량으로 포함하는 것은, 삼중 활성체 또는 지속형 결합체로 인한 목적하는 약리 활성(예를 들어, 폐 질환의 예방, 개선 또는 치료)을 얻을 수 있는 정도를 의미하고, 또한 투여되는 개체에서 독성 또는 부작용이 일어나지 않거나 미미한 수준으로서 약학적으로 허용되는 수준을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 같은 약학적 유효량은 투여 횟수, 환자, 제형 등을 종합적으로 고려하여 결정될 수 있다.
특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기 성분 (유효성분)을 0.01 내지 99% 중량 대 부피로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 삼중 활성체 또는 이의 지속형 결합체의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 삼중 활성체 또는 이의 결합체의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하여, 본 발명의 약학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 삼중활성체(펩타이드) 및/또는 삼중활성체의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 삼중활성체 및/또는 삼중활성체의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물, 폐 질환, 예방 및 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 상기 개체는 폐 질환이 의심되는 개체로서, 상기 폐 질환 의심 개체는 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나, 본 발명의 삼중 활성체 및/또는 결합체, 또는 이를 포함하는 상기 조성물로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다. 특히, 폐에 염증 및/또는 섬유증이 있는 개체일 수 있고, 또는 염증 및/또는 섬유증에 기인하거나 염증 및/또는 섬유증을 동반하는 폐질환을 갖는 개체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 조성물이 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 등이 될 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 삼중 활성체 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
이에 제한되지 않으나, 본 발명의 약학적 조성물은 1주에 1회, 2주에 1회, 또는 4주에 1회 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 폐 질환의 예방 또는 치료 방법의 한 구체적인 예로, 삼중활성체(펩타이드) 및/또는 삼중활성체의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물과 점액용해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 동시, 순차, 또는 역순으로 병용 투여하는 방법이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 병용 투여는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 폐 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 상기 삼중 활성체 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 조성물의 용도이다.
상기 삼중 활성체 및/또는 이의 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물, 폐 질환, 예방 및 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 폐 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 삼중 활성체 또는 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
상기 삼중 활성체 및/또는 이의 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물, 폐 질환, 예방 및 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 폐 질환의 예방 또는 치료를 위한 용도는 삼중활성체(펩타이드) 및/또는 삼중활성체의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물과 점액용해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 병용 투여를 위한 용도일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 병용 투여는 앞서 설명한 바와 같다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 삼중 활성체의 제조
GLP-1, GIP 및 글루카곤 수용체에 모두 활성을 나타내는 삼중 활성체를 제조하여, 하기 표 1에 이의 서열을 나타냈다.
서열번호 서열 정보
1 H X Q G T F T S D V S S Y L D G Q A A K E F I A W L V K G C
2 H X Q G T F T S D V S S Y L D G Q A Q K E F I A W L V K G C
3 H X Q G T F T S D V S S Y L L G Q A A K Q F I A W L V K G G G P S S G A P P P S C
4 H X Q G T F T S D V S S Y L L G Q Q Q K E F I A W L V K G C
5 H X Q G T F T S D V S S Y L L G Q Q Q K E F I A W L V K G G G P S S G A P P P S C
6 H X Q G T F T S D V S S Y L D G Q A A K E F V A W L L K G C
7 H X Q G T F T S D V S K Y L D G Q A A K E F V A W L L K G C
8 H X Q G T F T S D V S K Y L D G Q A A Q E F V A W L L K G C
9 H X Q G T F T S D V S K Y L D G Q A A Q E F V A W L L A G C
10 H X Q G T F T S D V S K Y L D G Q A A Q E F V A W L L A G G G P S S G A P P P S C
11 CA G E G T F T S D L S K Y L D S R R Q Q L F V Q W L K A G G P S S G A P P P S H G
12 CA G E G T F I S D L S K Y M D E Q A V Q L F V E W L M A G G P S S G A P P P S H G
13 CA G E G T F I S D Y S I Q L D E I A V Q D F V E W L L A Q K P S S G A P P P S H G
14 CA G Q G T F T S D Y S I Q L D E I A V R D F V E W L K N G G P S S G A P P P S H G
15 CA G Q G T F T S D L S K Q M D E E A V R L F I E W L K N G G P S S G A P P P S H G
16 CA G Q G T F T S D L S K Q M D S E A Q Q L F I E W L K N G G P S S G A P P P S H G
17 CA G Q G T F T S D L S K Q M D E E R A R E F I E W L L A Q K P S S G A P P P S H G
18 CA G Q G T F T S D L S K Q M D S E R A R E F I E W L K N T G P S S G A P P P S H G
19 CA G Q G T F T S D L S I Q Y D S E H Q R D F I E W L K D T G P S S G A P P P S H G
20 CA G Q G T F T S D L S I Q Y E E E A Q Q D F V E W L K D T G P S S G A P P P S H G
21 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E C R A K E F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
22 Y X Q G T F T S D Y S K C L D E K R A K E F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
23 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E C R A K E F V Q W L L A Q K G K K N D W K H N I T 고리 형성
24 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E C R A K E F V Q W L K N G G P S S G A P P P S 고리 형성
25 H X Q G T F T S D C S K Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S
26 H X Q G T F T S D C S K Y L D S R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S
27 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E R A C Q D F V Q W L L D Q G G P S S G A P P P S
28 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R A Q E F V C W L L A Q K G K K N D W K H N I T
29 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K A A K E F V Q W L L N T C 고리 형성
30 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K A Q K E F V Q W L L D T C 고리 형성
31 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K A C K E F V Q W L L A Q 고리 형성
32 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K A C K D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S 고리 형성
33 H X Q G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L A Q K C 고리 형성
34 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V N W L L A Q K C 고리 형성
35 H X Q G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L N T K C 고리 형성
36 H X Q G T F T S D Y S K Y L C E K R Q K E F V Q W L L N G G P S S G A P P P S G 고리 형성
37 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E C R Q K E F V Q W L L N G G P S S G A P P P S G 고리 형성
38 CA X Q G T F T S D K S S Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S S
39 H X Q G T F T S D Y S K Y L D G Q H A Q C F V A W L L A G G G P S S G A P P P S
40 H X Q G T F T S D K S K Y L D E R A C Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S
41 H X Q G T F T S D K S K Y L D E C A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S
42 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R A K E F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S C 고리 형성
43 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R A K E F V Q W L L D H H C S S G Q P P P S 고리 형성
44 H G Q G T F T S D C S K Q L D G Q A A Q E F V A W L L A G G P S S G A P P P S
45 H G Q G T F T S D C S K Y M D G Q A A Q D F V A W L L A G G P S S G A P P P S 　
46 H G Q G T F T S D C S K Y L D E Q H A Q E F V A W L L A G G P S S G A P P P S
47 H G Q G T F T S D C S K Y L D G Q R A Q E F V A W L L A G G P S S G A P P P S
48 H G Q G T F T S D C S K Y L D G Q R A Q D F V N W L L A G G P S S G A P P P S
49 CA X Q G T F T S D Y S I C M D E I H Q K D F V N W L L N T K 고리 형성
50 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R A K E F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S C 고리 형성
51 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V Q W L L N T C 고리 형성
52 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V Q W L L D T C 고리 형성
53 H X E G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L A Q C 　 고리 형성
54 H X E G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V D W L L A E C 　 고리 형성
55 H X Q G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L A Q C 고리 형성
56 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V N W L L A Q C 고리 형성
57 H X Q G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L N T C 고리 형성
58 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V Q W L L N T K C 고리 형성
59 CA X Q G T F T S D Y S I C M D E K H Q K D F V N W L L N T K 고리 형성
60 CA X Q G T F T S D Y S I A M D E K H C K D F V N W L L N T K 고리 형성
61 CA X Q G T F T S D Y S I A M D E I A C K D F V N W L L N T K 고리 형성
62 CA X Q G T F T S D K S K Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S
63 CA X Q G T F T S D C S K Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S
64 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E C A A K E F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성　
65 H X Q G T F T S D Y S K C L D E K R A K E F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
66 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E C R A K D F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
67 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E C A A K D F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
68 Y X Q G T F T S D Y S K C L D E K A A K E F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
69 Y X Q G T F T S D Y S K C L D E R A A K E F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
70 Y X Q G T F T S D Y S K C L D E K R A K D F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
71 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E R A C K D F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
72 Y X Q G T F T S D C S K Y L D E R A A K D F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
73 CA X Q G T F T S D Y S K Y L D E C R A K E F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
74 CA X Q G T F T S D Y S K C L D E K R A K E F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S 고리 형성
75 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E K A A K E F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S C 고리 형성
76 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R A K D F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S C 고리 형성
77 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E K A A K D F V Q W L L D H H P S S G Q P P P S C 고리 형성
78 H X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V Q W L L D T K C 고리 형성
79 H X E G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L A Q K C 고리 형성
80 H X E G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V D W L L A E K C 고리 형성
81 CA X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V Q W L L N T C 고리 형성
82 CA X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V Q W L L D T C 고리 형성
83 CA X E G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L A Q C 고리 형성
84 CA X E G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V D W L L A E C 고리 형성
85 CA X Q G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L A Q C 고리 형성
86 CA X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V N W L L A Q C 고리 형성
87 CA X Q G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L N T C 　 고리 형성
88 CA X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V Q W L L N T K C 고리 형성
89 CA X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V Q W L L D T K C 고리 형성
90 CA X E G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L A Q K C 　 고리 형성
91 CA X E G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V D W L L A E K C 　 고리 형성
92 CA X Q G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L A Q K C 고리 형성
93 CA X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R Q K E F V N W L L A Q K C 고리 형성
94 CA X Q G T F T S D Y S I A M D E I H Q K D F V N W L L N T K C 고리 형성
95 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R A K E F V Q W L L C H H P S S G Q P P P S 고리 형성
96 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R A K E F V Q W L L D H C P S S G Q P P P S 고리 형성
97 Y X Q G T F T S D Y S K Y L D E K R A K E F V Q W L L D C H P S S G Q P P P S 고리 형성
98 Y X Q G T F T S D Y S K A L D E K A A K E F V N W L L D H H P S S G Q P P P S C 고리 형성
99 Y X Q G T F T S D Y S K A L D E K A A K D F V N W L L D H H P S S G Q P P P S C 고리 형성
100 Y X Q G T F T S D Y S K A L D E K A A K E F V Q W L L D Q H P S S G Q P P P S C 고리 형성
101 Y X Q G T F T S D Y S K A L D E K A A K E F V N W L L D Q H P S S G Q P P P S C 고리 형성
102 Y X Q G T F T S D Y S K A L D E K A A K D F V N W L L D Q H P S S G Q P P P S C 고리 형성
상기 표 1에 기재된 서열에서 X로 표기된 아미노산은 비천연형 아미노산인 Aib (2-aminoisobutyric acid)이며, 밑줄로 표시된 아미노산은 밑줄로 표시된 아미노산들이 서로 고리를 형성하는 것을 의미한다. 또한, 상기 표 1에서 CA는 4-이미다조아세틸(4-imidazoacetyl)을, Y는 티로신을 의미한다.
실시예 2: 삼중 활성체의 지속형 결합체 제조
양 말단에 각각 말레이미드기 및 알데히드기를 가지는 10 kDa의 PEG, 즉 말레이미드-PEG-알데히드 (10kDa, NOF, 일본)를 실시예 1의 삼중활성체 (서열번호 21, 22, 42, 43, 50, 77, 및 96)의 시스테인 잔기에 페길화시키기 위하여, 삼중활성체와 말레이미드-PEG-알데히드의 몰비를 1 : 1 내지 3, 단백질의 농도를 1 내지 5 ㎎/㎖로 하여 저온에서 0.5 내지 3 시간 동안 반응시켰다. 이때, 반응은 50 mM Tris 완충액(pH 7.5)에 20 내지 60% 아이소프로판올이 첨가된 환경 하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SP 세파로스 HP(GE healthcare, 미국)에 적용하여 시스테인에 모노-페길화된 삼중활성체를 정제하였다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 삼중활성체와 면역글로불린 Fc(서열번호 139의 동종이합체)를 몰 비 1 : 1 내지 5, 단백질의 농도 10 내지 50 ㎎/㎖로 하여 4 내지 8℃에서 12 내지 18시간 동안 반응시켰다. 반응은 100 mM 인산칼륨 완충액 (pH 6.0)에 환원제인 10 내지 50 mM 소디움 시아노보로하이드라이드와 10 내지 30 % 아이소프로판올이 첨가된 환경 하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 부틸 세파로스 FF 정제 컬럼(GE healthcare, 미국)과 Source ISO 정제 컬럼(GE healthcare, 미국)에 적용하여, 삼중활성체와 면역글로불린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다. 정제된 이 지속형 결합체는 분자 내에서 삼중활성체 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커와 Fc 이합체가 1:1:1의 몰 비로 공유결합 연결된 구조이며, PEG 링커는 Fc 이합체의 두 폴리펩타이드 사슬 중 한 사슬에만 연결되어 있다.
한편, 상기 면역글로불린 Fc는 서열번호 139의 아미노산 서열 (221개의 아미노산으로 구성됨)을 갖는 단량체 2개가 각 단량체의 3번 아미노산인 시스테인 사이에 이황화 결합을 통해 동종이합체를 형성하고, 상기 동종이합체의 단량체는 각각 독립적으로 35번 및 95번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합 및 141번 및 199번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합이 형성된 것이다.
제조 후 역상 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피로 분석한 순도는 95 % 이상이었다.
여기서, 서열번호 21의 삼중활성체 및 면역글로불린 Fc가 PEG 링커를 통하여 연결된 결합체를, '서열번호 21과 면역글로불린 Fc를 포함하는 결합체' 혹은 '서열번호 21의 지속형 결합체'로 명명하였고, 이들은 본원에서 혼용되어 사용될 수 있다.
여기서, 서열번호 22의 삼중활성체 및 면역글로불린 Fc가 PEG 링커를 통하여 연결된 결합체를, '서열번호 22와 면역글로불린 Fc를 포함하는 결합체' 혹은 '서열번호 22의 지속형 결합체'로 명명하였고, 이들은 본원에서 혼용되어 사용될 수 있다.
여기서, 서열번호 42의 삼중활성체 및 면역글로불린 Fc가 PEG를 통하여 연결된 결합체를, '서열번호 42와 면역글로불린 Fc를 포함하는 결합체' 혹은 '서열번호 42의 지속형 결합체'로 명명하였고, 이들은 본원에서 혼용되어 사용될 수 있다.
여기서, 서열번호 43의 삼중활성체 및 면역글로불린 Fc가 PEG를 통하여 연결된 결합체를, '서열번호 43과 면역글로불린 Fc를 포함하는 결합체' 혹은 '서열번호 43의 지속형 결합체'로 명명하였고, 이들은 본원에서 혼용되어 사용될 수 있다
여기서, 서열번호 50의 삼중활성체 및 면역글로불린 Fc가 PEG를 통하여 연결된 결합체를, '서열번호 50과 면역글로불린 Fc를 포함하는 결합체' 혹은 '서열번호 50의 지속형 결합체'로 명명하였고, 이들은 본원에서 혼용되어 사용될 수 있다.
여기서, 서열번호 77의 삼중활성체 및 면역글로불린 Fc가 PEG를 통하여 연결된 결합체를, '서열번호 77와 면역글로불린 Fc를 포함하는 결합체' 혹은 '서열번호 77의 지속형 결합체'로 명명하였고, 이들은 본원에서 혼용되어 사용될 수 있다
여기서, 서열번호 96의 삼중활성체 및 면역글로불린 Fc가 PEG를 통하여 연결된 결합체를, '서열번호 96과 면역글로불린 Fc를 포함하는 결합체' 혹은 '서열번호 96의 지속형 결합체'로 명명하였고, 이들은 본원에서 혼용되어 사용될 수 있다.
실험예 1: 삼중 활성체 및 이의 지속형 결합체의 in vitro 활성 측정
상기 실시예 1 및 2에서 제조된 삼중활성체와 이의 지속형 결합체의 활성을 측정하기 위해 GLP-1 수용체, 글루카곤(GCG) 수용체, 및 GIP 수용체가 각각 형질전환된 세포주를 이용하여 in vitro에서 세포 활성을 측정하는 방법을 이용하였다.
상기 각 세포주는 CHO (chinese hamster ovary)에 인간 GLP-1 수용체, 인간 GCG 수용체 및 인간 GIP 수용체 유전자를 각각 발현하도록 형질 전환된 것으로서, GLP-1, GCG 및 GIP의 활성을 측정하기에 적합하다. 따라서, 각 부분에 대한 활성을 각각의 형질 전환 세포주를 이용하여 측정하였다.
상기 실시예 1과 2에서 제조된 삼중활성체와 이의 지속형 결합체의 GLP-1 활성 측정을 위해 인간 GLP-1을 50 nM 부터 4배씩 0.000048 nM까지 연속적으로 희석하고, 상기 실시예 1과 2에서 제조된 삼중활성체와 이의 지속형 결합체를 400 nM 부터 4배씩 0.00038 nM까지 연속적으로 희석하였다. 상기 배양된 인간 GLP-1 수용체가 발현된 CHO 세포에서 배양액을 제거하고 연속적으로 희석된 각 물질들을 5㎕씩 상기 세포에 첨가한 다음, cAMP 항체가 포함된 완충액을 5㎕씩 추가 한 뒤 15분 동안 상온에서 배양하였다. 그런 다음 세포용해완충액 (cell lysis buffer)이 포함된 detection mix를 10㎕씩 가하여 세포를 용해시키고, 90분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 반응이 완료된 세포용해물을 LANCE cAMP kit (PerkinElmer, USA)에 적용하여 축적된 cAMP를 통해 EC50값을 산출한 후, 상호 비교하였다. 인간 GLP-1 대비 상대 역가는 하기 표 2와 표 3에 나타내었다.
상기 실시예 1과 2에서 제조된 삼중활성체와 이의 지속형 결합체의 GCG 활성 측정을 위해 인간 GCG을 50 nM 부터 4배씩 0.000048 nM까지 연속적으로 희석하고, 상기 실시예 1과 2에서 제조된 삼중활성체와 이의 지속형 결합체를 400 nM 부터 4배씩 0.00038 nM까지 연속적으로 희석하였다. 상기 배양된 인간 GCG 수용체가 발현된 CHO 세포에서 배양액을 제거하고 연속적으로 희석된 각 물질들을 5㎕씩 상기 세포에 첨가한 다음, cAMP 항체가 포함된 완충액을 5㎕씩 추가한 뒤 15분 동안 상온에서 배양하였다. 그런 다음 세포용해완충액(cell lysis buffer)이 포함된 detection mix를 10㎕씩 가하여 세포를 용해시키고, 90분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 반응이 완료된 세포용해물을 LANCE cAMP kit (PerkinElmer, USA)에 적용하여 축적된 cAMP를 통해 EC50값을 산출한 후, 상호 비교하였다. 인간 GCG 대비 상대 역가는 하기 표 2와 표 3에 나타내었다.
상기 실시예 1과 2에서 제조된 삼중활성체와 이의 지속형 결합체의 GIP 활성 측정을 위해 인간 GIP을 50 nM 부터 4배씩 0.000048 nM까지 연속적으로 희석하고, 상기 실시예 1과 2에서 제조된 삼중활성체와 이의 지속형 결합체를 400 nM 부터 4배씩 0.00038 nM까지 연속적으로 희석하였다. 상기 배양된 인간 GIP 수용체가 발현된 CHO 세포에서 배양액을 제거하고 연속적으로 희석된 각 물질들을 5㎕씩 상기 세포에 첨가한 다음, cAMP 항체가 포함된 완충액을 5㎕씩 추가 한 뒤 15분 동안 상온에서 배양하였다. 그런 다음 세포용해완충액(cell lysis buffer)이 포함된 detection mix를 10㎕씩 가하여 세포를 용해시키고, 90분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 반응이 완료된 세포용해물을 LANCE cAMP kit (PerkinElmer, USA)에 적용하여 축적된 cAMP를 통해 EC50값을 산출한 후, 상호 비교하였다. 인간 GIP 대비 상대 역가는 하기 표 2와 표 3에 나타내었다.
삼중활성체의 상대적 역가 비율
천연형 펩타이드 대비in vitro 활성 (%)
서열번호 vs GLP-1 vs Glucagon vs GIP
1 3.2 <0.1 <0.1
2 5.9 <0.1 <0.1
3 1.8 <0.1 <0.1
4 8.5 <0.1 <0.1
5 42.1 <0.1 <0.1
6 17.0 <0.1 <0.1
7 13.7 <0.1 <0.1
8 14.2 0.10 <0.1
9 32.1 0.13 <0.1
10 46.0 <0.1 <0.1
11 1.4 <0.1 <0.1
12 0.4 <0.1 <0.1
13 < 0.1 < 0.1 < 0.1
14 28.0 < 0.1 < 0.1
15 79.2 <0.1 <0.1
16 2.1 < 0.1 < 0.1
17 0.2 < 0.1 < 0.1
18 <0.1 <0.1 <0.1
19 <0.1 <0.1 <0.1
20 <0.1 <0.1 <0.1
21 17.8 267 22.7
22 20.1 140 59.7
23 4.01 9.3 <0.1
24 41.2 9.3 < 0.1
25 82.6 0.1 <0.1
26 64.5 0.2 <0.1
27 83.1 0.8 0.9
28 17.2 1.6 <0.1
29 38.5 6.0 <0.1
30 142 0.7 0.8
31 135 2.2 2.4
32 151 1.7 8.8
33 24.5 <0.1 10.4
34 19.1 0.92 0.6
35 7.5 <0.1 1.3
36 37.4 0.39 0.2
37 236 6.21 2.2
38 2.3 - -
39 13.9 0.53 <0.1
40 75.2 <0.1 <0.1
41 34.3 <0.1 <0.1
42 33.9 205.8 7.8
43 12.6 88.4 3.70
44 1.3 <0.1 <0.1
45 6.6 < 0.1 < 0.1
46 1.4 < 0.1 < 0.1
47 2.4 < 0.1 < 0.1
48 1.5 < 0.1 < 0.1
49 29.8 <0.1 3.3
50 67.4 50.5 2.7
51 14.4 2.0 0.1
52 44.1 7.5 0.3
53 161 8.4 1.3
54 30.6 1.4 0.1
55 27.1 0.7 2.4
56 57.9 4.9 0.8
57 11.7 <0.1 0.3
58 39.1 2.6 0.2
59 40.3 <0.1 4.0
60 106.2 <0.1 8.2
61 59.8 <0.1 2.8
62 5.2 <0.1 <0.1
63 15.3 <0.1 <0.1
64 64.6 60.1 92.9
65 95.4 25.2 11.6
66 15.8 172 17.2
67 28.5 46.2 39.8
68 27.9 8.8 107
69 24.3 9.6 62.8
70 15.1 71.3 64.4
71 90.1 12.7 94.7
72 11.5 1.0 1.6
73 22.6 5.4 3.0
74 12.9 0.9 1.0
75 35.1 8.5 18.0
76 10.3 47.6 11.7
77 38.7 12.2 35.5
78 51.0 14.0 0.12
79 41.5 4.9 1.4
80 8.1 0.0 0.1
81 7.8 0.3 <0.1
82 9.5 1.1 <0.1
83 47.3 1.3 0.4
84 4.2 <0.1 <0.1
85 4.3 <0.1 0.3
86 28.4 0.4 0.2
87 0.9 <0.1 <0.1
88 9.6 0.3 <0.1
89 7.1 0.7 <0.1
90 7.4 <0.1 <0.1
91 31.9 16.8 0.3
92 0.8 <0.1 0.4
93 5.7 0.3 0.7
94 0.5 <0.1 <0.1
95 2.1 0.4 <0.1
96 34.4 194.8 5.2
97 10.5 62.8 2.6
98 28.1 8.2 47.1
99 20.9 14.9 57.7
100 42.2 12.7 118.5
101 23.2 13.9 40.1
102 23.3 29.5 58.0
삼중활성체 지속형 결합체의 상대적 역가 비율
지속형 결합체 천연형 펩타이드 대비in vitro 활성 (%)
vs GLP-1 vs Glucagon vs GIP
21 0.1 1.6 0.2
22 0.1 0.9 0.5
42 3.1 23.1 1.2
43 2.1 13.5 0.6
50 15.4 6.9 0.7
77 6.7 1.7 6.6
96 0.3 4.0 0.3
상기에서 제조한 신규한 삼중활성체 지속형 결합체는 GLP-1 수용체, GIP 수용체 및 글루카곤 수용체를 모두 활성화시킬 수 있는 삼중 활성체로 기능을 가지는 바, 폐 질환의 치료제 물질로 이용될 수 있다.
실험예 2: 삼중 활성체 지속형 결합체의 폐에서의 염증 개선 효과 확인
상기 실시예에서 제조된 본 발명에 따른 삼중 활성체 지속형 결합체가 폐에서의 염증 개선 효과를 나타내는지 엘라스타제(elastase, ELA)가 투여된 마우스를 이용하여 확인하였다.
구체적으로, C57BL/6 마우스(ORIENT Bio, Busan, Korea)에 ELA 0.2U/마리를 처리한 마우스를 부형제 대조군, 서열번호 42의 지속형 결합체(이하, 삼중활성체 지속형 결합체; 6.5 nmol/kg, Q2D, 피하) 투여군, 항염증제이자 COPD 치료제인 로플루밀라스트(roflumilast)(10 mg/kg, QD, 경구) 투여군으로 나누었고, 3주간 반복투여를 진행하였다. 이후 부형제, 삼중활성체 지속형 결합체 및 로플루밀라스트 투여에 따른 폐 조직 내 염증성 사이토카인의 발현 변화 정도를 qPCR을 통해 확인하였다. 통계 처리는 1원 ANOVA를 사용하여 삼중활성체 지속형 결합체의 효능을 평가하였다(* ~ **p<0 .05 ~ 0.01).
그 결과, 삼중활성체 지속형 결합체 반복투여 시, 부형제 대조군 및 로플루밀라스트 투여군 대비, 폐 조직 내 IL-1β, IL-6, IL-12, 그리고 TNF-α 발현이 유의적 및 동등이상으로 각각 감소되었음을 확인하였다(도 1).
이를 통해 본 발명의 삼중활성체 지속형 결합체가 폐에서의 염증을 억제하고 개선하는 효과를 갖는 사실을 확인하였다.
실험예 3: 삼중 활성체 지속형 결합체의 폐기종 및 만성 폐쇄성 폐질환 치료 효과 확인
본 발명자들은 삼중활성체 지속형 결합체가 대표적인 폐질환이자, 폐 염증에 의한 질환인 폐기종과 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 치료 효과를 in vivo에서 나타낼 수 있는지 확인하고자 하였다.
이를 위해, 엘라스타제의 기관내 (intratracheal) 투여로 폐 조직을 손상시켜 만성 폐쇄성 폐질환이 유발된 동물 모델을 사용하였다. 구체적으로, C57BL/6 마우스(ORIENT Bio, Busan, Korea)에 엘라스타제를 0.2U/마리로 처리한 COPD 마우스를 부형제 대조군, 삼중 활성체 지속형 결합체 (6.5 nmol/kg, Q2D, 피하) 투여군, 로플루밀라스트 (10 mg/kg, QD, 경구) 투여군으로 나누었고, 3주간 반복투여를 진행하였다. 3주 반복투여 후 부검으로 각 마우스의 폐조직을 취하였고, H&E staining을 통해 폐 조직의 폐기종 정도를 평가하였다.
그 결과, 삼중 활성체 지속형 결합체를 반복투여 시, 부형제 대조군 및 COPD 치료제로 알려진 로플루밀라스트 투여군 대비, 우수한 폐기종 개선효능을 확인할 수 있었다 (* ~ **p<0 .05 ~ 0.01) (도 2).
이를 통해 본 발명의 삼중 활성체 지속형 결합체는 폐 조직 내 염증 및 폐기종 개선 효과를 나타내며, 이를 통해 만성 폐쇄성 폐질환에 대해 우수한 치료 효능을 갖는 것을 확인하였다.
실험예 4: 삼중 활성체 지속형 결합체의 폐 섬유화 개선 효과 확인
상기 실시예에서 확인한 폐 조직 내 염증 개선 효과에 더해, 본 발명에 따른 삼중활성체 지속형 결합체가 폐섬유화 개선 효과도 갖는지 확인하고자 하였다. 이에, 폐섬유화 과정에 중요하다고 알려져 있는 폐섬유아세포(lung fibroblast)의 근섬유아세포(myofibroblast)로의 분화 및 폐포상피세포(alveolar epithelial cell)의 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition, EMT)에 미치는 영향을 확인하고자 폐섬유아세포인 MRC5 세포주와 폐포 상피세포인 A549 세포주를 사용하였다.
실험예 4-1: 폐섬유아세포의 근섬유아세포 분화 억제 효과 확인
먼저, 폐섬유아세포인 MRC5 세포를 부형제(vehicle) 처리군과 삼중활성체 지속형 결합체 처리군으로 나누고, 근섬유아세포로의 분화를 유도하기 위해 TGF-β1을 동시 처리 하였다. 음성 대조군으로는 TGF-β1 및 삼중활성체 지속형 결합체를 모두 처리하지 않은 군을 사용하였다.
48 ~ 72시간 동시처리 후, 각각의 군에서 근섬유아세포 분화 마커인 α-SMA, collagen1α1, 및 피브로넥틴(fibronectin)의 발현 정도를 정량적(quantitative) PCR을 통해 확인하였다. 통계 처리는 1원 ANOVA를 사용하여 삼중 활성체 지속형 결합체의 효능을 평가하였다. (* ~ ** p <0 .05 ~ 0.01)
그 결과, 삼중 활성체 지속형 결합체를 TGF-β1과 동시 처리 시, 근섬유아세포 분화 마커의 발현이 부형제 처리 군 대비 감소한 것을 확인하였다 (도 3).
실험예 4-2: 폐포상피세포의 상피간엽이행(EMT) 억제 효과 확인
다음으로, A549 세포를 부형제 처리군과 삼중활성체 지속형 결합체 처리군으로 나누어 전처리한 후, TGF-β1 및 LPS를 순차적으로 처리하여 EMT를 유도하였다. 음성 대조군으로는 삼중활성체 지속형 결합체, TGF-β1, 및 LPS를 모두 처리하지 않은 군을 사용하였다.
48시간 후, 각각의 군에서 EMT 마커인 collagen1α1 및 collagen3α1의 발현 정도를 정량적 PCR을 통해 확인하였다. 통계 처리는 1원 ANOVA를 사용하여 삼중 활성체 지속형 결합체의 효능을 평가하였다. (* ~ *** p <0 .05 ~ 0.001)
그 결과, 삼중 활성체 지속형 결합체 전처리 시, 폐포 상피세포의 EMT 마커 발현이 부형제 처리 군 대비 유의적으로 감소한 것을 확인하였다 (도 4).
실험예 4-3: 섬유화 개선의 in vivo 효과 확인
상기 실시예에서 제조된 삼중활성체 지속형 결합체의 폐섬유증, 특히 대표적 폐섬유증인 특발성 폐섬유증 (IPF) 개선효능을 in vivo 에서 확인코자, 블레오마이신(bleomycin, BLM) 마우스를 사용하였다. 블레오마이신은 기관내 투여 시 폐포 상피세포의 DNA를 손상시킴으로써 상피 간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition)이 발생하여, 특발성 섬유화가 유도되는 것으로 알려져 있다. 또한 BLM 처리 용량을 일정수준 이상으로 증량 시, 특발성 섬유화에 따른 심각한 폐손상으로 해당마우스의 생존률이 저하된다고 알려져 있다.
이에, BLM을 처리한 마우스에서 삼중활성체 지속형 결합체의 폐섬유화 개선 효과를 확인하고, 더 나아가 폐섬유화 개선을 통해 생존률을 높일 수 있는지 확인하였다.
C57BL/6 마우스(ORIENT Bio, Busan, Korea)에 BLM 1.5U/head를 처리한 IPF 마우스를 부형제 대조군, 삼중 활성체 지속형 결합체 (3.9 nmol/kg, Q2D, 피하) 투여군, 피르페니돈(pirfenidone; 300 mg/kg, QD, 경구) 투여군, 암브록솔(ambroxol; 45 mg/kg, BID, 복강) 투여군으로 나누었고, 2주간 반복투여를 진행하였다. 2주 반복투여 후 부검으로 각 마우스의 폐조직을 취하였고, 폐조직 내 섬유화 정도를 masson trichrome staining으로 평가하였다. 통계 처리는 1원 ANOVA를 사용하여 삼중활성체 지속형 결합체의 효능을 평가하였다 (* ~ ***p<0 .05 ~ 0.001)
그 결과, 삼중 활성체 지속형 결합체를 반복투여 시, 부형제 대조군 및 IPF 치료제로 알려진 피르페니돈 투여군 대비, 우수한 폐 조직내 masson trichrome staining positive area 감소효능을 확인할 수 있었다 (* ~ ***p<0 .05 ~ 0.001). 또한, 진해 거담 제거제로 알려진 암브록솔의 경우, 삼중 활성체의 지속형 결합체와 동등한 수준의 효능을 보임을 확인하였다 (도 5)
또한, C57BL/6 마우스(ORIENT Bio, Busan, Korea)에 BLM 3.0U/head를 처리한 IPF 마우스를 부형제 대조군, 삼중 활성체의 지속형 결합체 (3.9 nmol/kg, Q2D, 피하) 투여군, 피르페니돈(300 mg/kg, QD, 경구) 투여군, 암보록솔(45 mg/kg, BID, 복강) 투여군으로 나누어 2주간 반복투여를 진행하였고, 반복투여 중 생존률을 확인하였다.
그 결과, 삼중 활성체의 지속형 결합체를 반복투여 시, 부형제 대조군, 피르페니돈 투여군 및 암브록솔 투여군 대비, 우수한 생존률을 보임을 확인할 수 있었다(도 6).
이를 통해 삼중 활성체의 지속형 결합체가 폐섬유증 또는 특발성 폐섬유증 (IPF)에 치료 효과를 갖고, 이에 따른 생존률 개선에 효능이 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 삼중 활성체 지속형 결합체가 폐섬유아세포의 근섬유아세포 분화 및 폐포상피세포의 EMT를 억제함으로써 폐섬유화를 개선할 수 있음을 확인하였을 뿐만 아니라, in vivo에서도 폐섬유화 개선 효과를 통해 폐섬유증, 특히 특발성 폐섬유증 예방 및 치료에 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
종합하면, 상기와 같은 결과들은 본 발명의 삼중 활성체 결합체들이 효과적으로 폐 염증 및 폐섬유화 개선을 통해 관련된 폐 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 시사하는 것으로, 새로운 폐 질환 치료제로 제공될 수 있음을 의미한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. 폐 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로서,
    약학적으로 허용되는 부형제와
    서열번호 1 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 약학적 유효량으로 포함하는 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 지속형 결합체의 형태이고, 상기 지속형 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    X - L - F
    단 이 때 X는 서열번호 1 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열의 펩타이드이고;
    L은 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커이며,
    F는 면역글로불린 Fc 영역이고,
    -는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타낸다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 그 C-말단이 아미드화된 약학적 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 21, 22, 42, 43, 50, 64, 66, 67, 70, 71, 76, 77, 96, 97과 100으로 이루어진 군으로부터 선택하는 아미노산 서열을 포함하는 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 21, 22, 42, 43, 50, 77과 96으로 이루어진 군으로부터 선택하는 아미노산 서열을 포함하는 약학적 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩타이드 서열은 N-말단으로부터 16번 아미노산과 20번 아미노산은 서로 고리를 형성하는, 약학적 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 L 내의 에틸렌글리콜 반복 단위 부분의 화학식량은 1 내지 100 kDa 범위에 있는 약학적 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 F는 IgG Fc 영역인, 약학적 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폐 질환은 간질성폐질환 (interstitial lung disease, ILD), 진행성 섬유화 간질성 폐 질환(progressive fibrosing Interstitial Lung Disease, PF-ILD), 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonias, IIP), 비특이성 간질성 폐렴(non-specific interstitial pneumonia, NSIP), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 간질성 폐섬유증(fibrosing interstitial lung diseases, FILD), 특발성 폐섬유증 (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), 폐포염 (alveolitis), 폐렴(pneumonia), 폐기종(emphysema), 기관지염(bronchitis), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 복합 폐 섬유화와 폐기종(combined pulmonary fibrosis and emphysema, CPFE), 천식(asthma), 또는 호흡기 감염 질환인, 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 호흡기 감염 질환은 호흡기 바이러스, 세균, 마이코플라즈마(mycoplasma), 또는 진균 감염 질환인 것인, 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 호흡기 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 헤르페스 단순 바이러스(herpes simplex virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 라이노 바이러스(rhinovirus), 수두바이러스(varicella Zoster Virus), 홍역 바이러스(measle virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratorysyncytial virus), 뎅기바이러스(Dengue virus), HIV(human immunodeficiency virus), 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스(coronavirus), 중증급성 호흡기 증후군 바이러스(severe acute respiratory syndrome associated virus; SARS-associated virus), 및 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(middle east respiratory syndrome coronavirus; MERS-CoV)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2인, 약학적 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 투여 시 (i) 대식세포(macrophage) 활성 저해, 또는 (ii) IL-1β, IL-6, IL-12, 또는 TNF-α 의 발현을 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 투여 시 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 것인, 약학적 조성물:
    (i) 근섬유아세포(myofibroblast) 분화 저해;
    (ii) α-SMA, collagen1α1, 또는 피브로넥틴(fibronectin)의 발현 감소;
    (iii) 폐포상피세포(alveolar epithelial cell)의 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition, EMT) 저해; 및
    (iv) collagen1α1, 또는 collagen1α3의 발현 감소.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 점액용해제(mucolytic agents) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 추가로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 점액용해제는 암브록솔(ambroxol), N-아세틸시스테인(N-acetylcystein), N-아세틸린(N-acetylin), 카르보시스테인(carbocysteine), 도미오돌 (domiodol), 푸도스테인(fudosteine), 브롬헥신(bromhexine), 엘도스테인(erdosteine), 레토스틴 (letostine), 리소자임 (lysozyme), 메스나 (mesna), 소브레롤 (sobrerol), 스테프로닌 (stepronin), 티오프로닌 (tiopronin), 틸록사폴 (tyloxapol), 카보시스테인(carbocisteine), 도르나제 알파 (dornase alfa), 에프라지논 (eprazinone), 레토스테인 (letosteine), 넬테넥신 (neltenexine), 및 메시스테인(mecysteine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 펩타이드와 점액용해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 동시, 순차, 또는 역순으로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  18. 제9항에 있어서, 상기 폐 질환은 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)에 의한 폐렴(폐염증) 또는 폐섬유증인, 약학적 조성물.
  19. 제 2항에 있어서, 상기 영역 F는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이합체이며, L의 한 말단이 상기 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩티드 사슬에만 연결되어 있는 약학적 조성물.
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